MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit

Transcription

C
MagNA Pure 96 DNA and
Viral NA Large Volume Kit
y Version 04
Content version: May 2012
Kit for 3 ⫻ 96 reactions
I 06 374 891 001
English
Deutsch
Dansk
Español
Français
Italiano
Norsk
Svenska
www.roche-applied-science.com
C
y Version 04
Content version: May 2012
Prefilled reagents for the MagNA Pure 96 Instrument. This kit is used for isolation
of genomic DNA and viral nucleic acids (NA) from up to 1,000 ␮l whole blood,
plasma or serum, or from up to 25 mg fresh-frozen tissue, and from up to 1 × 106
cultured cells, as well as for isolation of bacterial, fungal, and viral nucleic acids
from up to 1,000 ␮l human sample material.
I 06 374 891 001
r Store at ⫹15 to ⫹25°C
 Keep the kit away from light.
 Keep the kit away from magnets.
Kit for 3 ⫻ 96 reactions
Table of Contents
1.
2.
3.
4.
INTENDED USE ................................................................................................................ 3
EXPLANATION OF THE KIT ............................................................................................ 3
PRINCIPLE/SUMMARY ................................................................................................. 3
REAGENTS - WORKING SOLUTIONS .......................................................................... 4
4.1
4.2
Number of Tests
Kit/Contents
4
4
5.
PRECAUTIONS AND WARNINGS ................................................................................. 6
5.1
5.2
5.3
5.4
Precautions
Handling Requirements
Laboratory Procedures
Waste Handling
6
7
8
8
6.
STORAGE AND STABILITY ............................................................................................ 9
6.1
6.2
6.3
Kit and Reagents
Specimen Collection and Storage of Sample Material
Storage of Purified Nucleic Acids and Eluates
9
9
10
7.
MATERIALS .................................................................................................................... 11
7.1
7.2
Materials Provided
Materials and Devices Required but Not Provided
8.
ASSAY PROCEDURES .................................................................................................. 12
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
Purification Protocols
Sample Materials and Pre-Isolation Steps
Quality Control
Isolation Procedure
Ending a Run
9.
10.
LIMITATIONS AND INTERFERENCES ........................................................................ 20
PERFORMANCE DATA ................................................................................................. 21
10.1
10.2
10.3
10.4
10.5
10.6
Precision of Purification Efficiency
Analytical Performance
Precision Analysis
Interfering Substances
Testing for Cross Contamination
Method Comparison
11
11
12
13
18
18
19
21
22
25
28
29
30
11.
SUPPLEMENTARY INFORMATION ............................................................................ 34
11.1
11.2
Symbols
Changes to Previous Version
12.
13.
14.
TRADEMARKS ............................................................................................................... 34
DISCLAIMER OF LICENSE ........................................................................................... 34
REGULATORY DISCLAIMER ....................................................................................... 35
2
y Version 04, EN
34
34
INTENDED USE
1.
INTENDED USE
The MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit is a reagent kit that
is used in combination with the MagNA Pure 96 System for isolation and purification of total nucleic acids (DNA/RNA) from biological specimens for in
vitro diagnostic purposes.
Any IVD application using the sample preparation procedure in conjunction
with any downstream IVD nucleic acid testing should be evaluated with regard
to the individual IVD parameters.
2.
EXPLANATION OF THE KIT
The MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit is specifically
designed to isolate:
• Nucleic acid from up to 1,000 ␮l whole blood, plasma, or serum.
• Bacterial, fungal, and viral nucleic acid from up to 1,000 ␮l sample material or
lysate of human origin.
• Nucleic acid from up to 1 × 106 cultured cells.
• Nucleic acid from up to 25 mg fresh-frozen tissue.
The isolated nucleic acids meet the quality standards required for highly sensitive quantitative PCR/RT-PCR analysis.
3.
PRINCIPLE/SUMMARY
The nucleic acid isolation procedure is based on the MagNA Pure Magnetic
Glass Particle (MGP) Technology. 
The key steps of a MagNA Pure 96 NA isolation procedure are:
1. Sample material is lysed, nucleic acids are released, and nucleases are
denatured.
2. Nucleic acids bind to the silica surface of the added MGPs due to the chaotropic salt conditions and the high ionic strength of the lysis/binding buffer.
3. MGPs with bound nucleic acids are magnetically separated from the residual lysed sample.
4. Unbound substances, such as proteins, cell debris, and PCR inhibitors are
removed by several washing steps.
5. Purified nucleic acids are eluted from the MGPs.
3
y Version 04, EN
REAGENTS - WORKING SOLUTIONS
4.
4.1
Number of Tests
4.2
The kit is designed to perform
• 3 × 96 isolations of genomic DNA and viral NA from up to 500 ␮l whole
blood, plasma, serum or from up to 1 × 106 cultured cells or
• 3 × 96 isolations of bacterial, fungal and viral NA from 500 ␮l sample material of human origin or
• 3 × 96 isolations from up to 25 mg fresh-frozen tissue or
• 3 × 48 isolations from 1,000 ␮l whole blood, plasma or serum or
• 3 × 48 isolations of bacterial, fungal and viral NA from 1,000 ␮l sample material of human origin.
Kit/Contents
Component Label
Contents/Function
Tray 1
Reagent Tray 1
3 trays per kit
Container 1
Wash Buffer I
• 160 ml
• < 6 M Guanidine hydrochloride, 
< 50% EtOH, < 30 mM Tris HCl
• for removing impurities
Container 2
Wash Buffer I
• 80 ml
• < 6 M Guanidine hydrochloride, 
Container 3
Lysis/Binding
Buffer
• 80 ml
• < 6 M Guanidine thiocyanate, 
< 30% Triton X-100, < 60 mM Tris HCl
• for cell/virus lysis and binding of
nucleic acids
Tray 2
Reagent Tray 2
3 trays per kit
Container 1
4
empty
Container 2
Proteinase K
• 15 ml
• 2% Proteinase K, 50% Glycerol
• for digestion of proteins
Container 3
Elution Buffer
• 80 ml
• < 60 mM Tris-HCl buffer
• for elution of nucleic acid
y Version 04, EN
Container 4
Wash Buffer III
• 160 ml
• < 20 mM Na-acetate buffer
Bottle 1
Magnetic Glass 
Particles
• 6 bottles, 18 ml each
• MGP suspension containing isopropanol
• for binding nucleic acids
 The MagNA Pure 96 System Fluid (Internal/External)* serves as Wash Buf-
fer II for this kit.
 All kit components are ready-to-use.
5
y Version 04, EN
PRECAUTIONS AND WARNINGS
5.
5.1
Precautions
 Several buffers in the MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit
contain dangerous or hazardous compounds. For detailed information, see
Figure 1 (Reagent Tray 1), Figure 2 (Reagent Tray 2), and Table 1. Do not
allow these reagents to touch the skin, eyes, or mucous membranes. If
contact does occur, wash the affected area immediately with large
amounts of water. If the reagents are spilled, dilute the spill with water
before wiping it up.
 Do not allow reagents containing guanidine thiocyanate to contact sodium
hypochlorite (bleach) solution or acids. These mixtures produce a highly
toxic gas. This precaution is particularly important to be aware of when
cleaning the MagNA Pure 96 Waste Cover.
Fig. 1: Reagent Tray 1
Component Label
6
Fig. 2: Reagent Tray 2
Dangerous and Hazardous 
Compounds
Tray 1
Reagent Tray 1
Container 1
Wash Buffer I
• guanidine hydrochloride
• ethanol
Container 2
Wash Buffer I
• guanidine hydrochloride
• ethanol
Container 3
Lysis/Binding Buffer
• guanidine thiocyanate
y Version 04, EN
Tray 2
Reagent Tray 2
Container 1
Empty
Container 2
Proteinase K
Container 3
Elution Buffer
Container 4
Wash Buffer III
Bottle 1
Magnetic Glass 
Particles
• proteinase K
• isopropanol
Table 1: Reagent listing of dangerous and hazardous compounds
5.2
Handling Requirements
• Wear disposable gloves and change them frequently.
• Do not use the kit after its expiration date.
In addition, to minimize the risk of carryover contamination which may result in
false positive results, follow these guidelines:
• Perform sample preparation, PCR/RT-PCR setup, and PCR/RT-PCR in separate locations.
• Discard pipette tips in sealed containers to prevent airborne contamination.
Nuclease-contaminated reagents and reaction vessels will degrade template
NA. Follow these guidelines to minimize the risk of contamination:
• Avoid touching surfaces or materials that could cause nuclease carryover.
• Use only reagents provided in this kit. Substitutions may introduce nucleases.
• Clean and decontaminate work areas and instruments, including pipettes,
with commercially available decontamination reagents.
• Use only new nuclease-free aerosol-blocking pipette tips and microcentrifuge tubes.
• Use a work area specifically designated for RNA work. If possible, use reaction vessels and pipettors dedicated only for work with template RNA.
7
y Version 04, EN
5.3
Laboratory Procedures
• All human sourced material and all resulting waste should be considered
potentially infectious. Thoroughly clean and disinfect all work surfaces with
disinfectants recommended by the local authorities.
• As the sensitivity and titer of potential pathogens in the sample material can
vary, the operator must optimize pathogen inactivation and follow the appropriate measures according to local safety regulations.
• Do not eat, drink, or smoke in the laboratory work area.
• Do not pipet by mouth.
• Wear protective disposable gloves, laboratory coats, and eye protection when
handling specimens and kit reagents.
• Avoid microbial and nuclease contamination of reagents when removing aliquots from reagent bottles. Use sterile disposable pipette tips.
• Wash hands thoroughly after handling specimens and kit reagents.
5.4
Waste Handling
• Material Safety Data Sheets (MSDS) are available online at 
www.e-labdoc.roche.com, or upon request from the local Roche office.
• Discard unused reagents and waste in accordance with country, federal,
state, and local regulations.
• Wear protective disposable gloves, laboratory coats, and eye protection when
discarding samples and kit reagents.
• To discard the reagents from the containers, follow the procedure below:
1. Pierce the foil in the corner of one container in the reagent tray with a
solid plastic disposable, such as a cell culture pipette.
2. Fold back the foil and discard the liquid into a designated waste container.
3. Repeat steps 1 and 2 until all containers are empty.
8
y Version 04, EN
STORAGE AND STABILITY
6.
6.1
Kit and Reagents
• The kit is shipped at ambient temperature.
• The kit components are stable at +15 to +25°C until the expiration date
printed on the label.
 Keep the kit away from light and away from magnets.
• Reagents can be stored for 32 hours at +15 to +25°C on the stage of the
MagNA Pure 96 Instrument.
• One set of reagent trays (Tray 1 and Tray 2) can be used for up to four individual runs. Once opened, the reagent trays can be used for additional runs
on the same MagNA Pure 96 Instrument within 28 days, with proper sealing
using a MagNA Pure 96 Sealing Foil* and storage at +2 to +8°C. Equilibrate
kit components at +15 to +25°C for one hour before use.
 It is only possible to reuse partially used reagent cartridges on the same
MagNA Pure 96 Instrument. The MagNA Pure 96 Software for each instrument tracks inventory using reagent barcodes, and recognizes partially
used reagents and tip trays, handling them appropriately in the next run.
 When reagent trays are not properly sealed, evaporation may occur. Inappropriate storage conditions can negatively impact the performance of the
isolation process.
6.2
Specimen Collection and Storage of Sample Material
For sensitive nucleic acid detection, it is important to ensure proper storage of
the samples (⫺15 to ⫺25°C for DNA or ⫺60 to ⫺80°C for RNA). DNA or RNA
may be degraded if the samples are not stored appropriately.
 Do not use plasma or blood containing heparin.
 Do not use sample material that has been stored extensively at higher
temperatures.
 If samples were stored frozen, thaw under slight agitation using, for example, a laboratory roller.
9
y Version 04, EN
6.3
Storage of Purified Nucleic Acids and Eluates
To ensure greatest possible stability of the eluted nucleic acid, proceed immediately with PCR/RT-PCR setup. Do not store the eluted nucleic acid on the
MagNA Pure 96 stage.
For storage, close the output plate with a MagNA Pure 96 Sealing Foil* and
store at ⫺15 to ⫺25°C for DNA or ⫺60 to ⫺80°C for RNA. Store the purified
nucleic acid in aliquots to avoid repeated freezing and thawing.
When storing output plates containing eluates outside the MagNA Pure 96
Instrument, seal the plates with a MagNA Pure 96 Sealing Foil*.
 For further processing, the sealing foil must be removed. Do not remove
the sealing foil too abruptly, as this may lead to cross-contamination by
creating aerosols and carryover from well to well.
 If eluates were stored frozen, mix gently after thawing by pipetting up and
down ten times before performing any downstream steps, such as PCR/
RT-PCR or OD measurements. The mixing volume should be at least half
of the eluate volume. When nucleic acids are not premixed and distributed
evenly/homogenously in solution, results may not be reproducible in subsequent assays.
 For long-term storage, we recommend transferring eluates to an archive
plate.
10
y Version 04, EN
MATERIALS
7.
MATERIALS
7.1
Materials Provided
See Section 4: Reagents and Working Solutions
7.2
Materials and Devices Required but Not Provided
•
•
•
•
•
•
•
•
•
MagNA Pure 96 Instrument (Cat. No. 06 541 089 001)
MagNA Pure 96 System Fluid (Internal) (Cat. No. 06 430 112 001)
MagNA Pure 96 System Fluid (External) (Cat. No. 06 640 729 001)
MagNA Pure 96 Filter Tips (1000 μl) (Cat. No. 06 241 620 001)
MagNA Pure 96 Processing Cartridge (Cat. No. 06 241 603 001)
MagNA Pure 96 Output Plate (Cat. No. 06 241 611 001)
MagNA Pure 96 Internal Control Tube (Cat. No. 06 374 905 001)
MagNA Pure 96 Sealing Foil (Cat. No. 06 241 638 001)
Optional reagents:
• MagNA Pure 96 External Lysis Buffer (Cat. No. 06 374 913 001)
• MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer (for the isolation of bacterial, fungal, and viral nucleic acid using the Pathogen Universal Protocol, if external lysis is required) (Cat. No. 06 374 921 001)
• MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer (Cat. No. 06 640 702 001)
• Proteinase K, PCR grade, Activity (+37°C) b 0.6 U/␮l 
(e.g., Cat. No. 03 115 828 001)
• Optional, MagNA Lyser Instrument (Cat. No. 003 358 968 001 as of 
SN 40467540, Cat. No. 03 358 976 001 as of SN 40405218)
• Optional, MagNA Lyser Green Beads (Cat. No. 03 358 941 001)
• Standard laboratory equipment
• Pipettes and nuclease-free, aerosol-preventive tips, such as extra-long
tips of 10 cm length, to pre-dispense samples into the MagNA Pure 96
Processing Cartridge.
• Optional, centrifuge for tubes.
11
y Version 04, EN
ASSAY PROCEDURES
8.
ASSAY PROCEDURES
8.1
Purification Protocols
Different MagNA Pure 96 Instrument purification protocols are available for
nucleic acid isolations with the MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit. Each protocol is optimized for specific sample materials.
 Run protocols only with specified sample materials, otherwise the performance of the isolation process may be negatively affected. Improper use
may lead to clumping and loss of MGPs, cross-contamination of samples,
or even damage to the instrument. Only the specified types of sample
material can be combined in the same run.
For in vitro diagnostic purposes, the following protocols can be used with the
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit. For each protocol, the
sample volume and the elution volume can be chosen from the software
menu.
Protocol Name
Sample Material
Elution Volume1
DNA Blood LV
500 ␮l whole blood
 Do not use more than 1 × 107
blood cells/ml.
100 or 200 ␮l
DNA Blood LV 1000* 1,000 ␮l whole blood
blood cells/ml.
100 or 200 ␮l
DNA Blood ext lys LV 1,000 ␮l lysate (from 500 ␮l whole 100 or 200 ␮l
blood)
blood cells/ml.
Viral NA Plasma LV
500 ␮l EDTA plasma
50 or 100 ␮l
Viral NA Plasma LV
1000*
1,000 ␮l EDTA plasma
50 or 100 ␮l
Viral NA Plasma 
ext lys LV
1,000 ␮l lysate (from 500 ␮l 
plasma or serum)
50 or 100 ␮l
Viral NA Universal 
LV
500 ␮l sample (recommended 
for citrate plasma and serum)
50 or 100 ␮l
LV 1000*
1,000 ␮l sample (recommended 
for citrate plasma and serum)
50 or 100 ␮l
Pathogen Universal2 500 ␮l sample or 500 ␮l lysate
500
12
50 or 100 ␮l
y Version 04, EN
ASSAY PROCEDURES
Pathogen Universal2 1,000 ␮l sample or 1,000 ␮l lysate
1000*
DNA Cells LV
50 or 100 ␮l
Up to 1 × 106 cultured cells resus- 100 or 200 ␮l
pended in 200 ␮l PBS
 100 μl is not
recommended
for cultured
cells with a
high DNA content
DNA Tissue LV
Up to 25 mg homogenized 
tissue in a volume of 200 μl
100 or 200 ␮l
 When using
more than 5
mg tissue we
recommend to
elute in 200 ␮l
1 The
concentration of nucleic acid in the eluate, and the sensitivity of downstream
applications can be increased by choosing a low elution volume. However, the elution
efficiency, and the overall nucleic acid yield may be lower compared to that of using a
higher elution volume.
2 The Pathogen Universal Protocols are designed for the isolation of bacterial, fungal,
and viral nucleic acid from many different sample types of human origin. The protocols
can be used directly for 500 ␮l or 1,000 ␮l sample material or for 500 ␮l or
1,000 ␮l lysate. Use an elution volume of 50 μl for liquid samples of low cell content,
such as urine.
 For protocols marked with an asterisk (*), the sample volume is divided to
produce two samples, and processed in two separate wells of the MagNA
Pure 96 Processing Cartridge. When using an internal control, internal
control is added to each well separately. This means that the total amount
of internal control added per sample is 40 ␮l instead of 20 ␮l. Therefore,
double the volume of the internal control loaded to the instrument. In addition, double the number of „Tests“ in the „Edit Internal Control Barcode“
dialog box. For some applications dilution of the internal control may be
required.
8.2
Sample Materials and Pre-Isolation Steps
To obtain optimal results in downstream procedures, especially in real-time
RT-PCR assays, for example, using the LightCycler® Instruments, do not process samples with higher volume than the selected purification protocol is
designed to handle. Doing so will affect the performance of the isolation process, and may lead to clumping and loss of MGPs, cross-contamination of
samples, or even damage to the instrument.
 Treat all samples as potentially infectious.
13
y Version 04, EN
ASSAY PROCEDURES
I. Whole blood
Fresh or frozen whole blood can be used without any pretreatment.
 If the blood cell count is above 1 × 107 blood cells/ml, dilute the whole
blood with PBS prior to use to avoid clumping.
 Ensure that there are no clots in anticoagulated whole blood samples.
II. Plasma/ Serum
Fresh or frozen plasma or serum can be used without any pretreatment.
 If precipitates have formed, perform a centrifugation step for 10 min at
1,900 × g for 10 ml tubes. Use only the supernatant as sample.
III. Lysates (for external lysis protocols)
Whole blood, plasma, or serum mixed with MagNA Pure 96 External Lysis Buffer*.
 Ensure that the MagNA Pure 96 External Lysis Buffer* is equilibrated to
+15 to +25°C before use.
Add 500 ␮l of whole blood, plasma, or serum to 500 ␮l MagNA Pure 96 External Lysis Buffer* and mix by pipetting.
 Use 1,000 ␮l lysate directly in combination with the respective external
lysis protocol, or store at ⫺15 to ⫺25°C for DNA or ⫺60 to ⫺80°C for RNA
until further processing.
 When lysates have been stored frozen, thaw on ice. Before transfer to a
MagNA Pure 96 Processing Cartridge, mix thoroughly by vortexing three
times for 10 s, and spin down briefly.
IV. Various sample materials and lysates for Pathogen Universal 500
and 1000 Protocol.
Lysis of bacteria in many different sample types of human origin can be performed. The following sample materials may be suitable for the Pathogen Universal 500 and 1000 protocol: urine, bronchoalveolar lavage (BAL), sputum,
cerebrospinal fluid (CSF), swabs, stool, whole blood, plasma, serum, and bacterial cultures.
 Due to the great variety of sample materials, no single universally applicable procedure is possible. The preparation steps for a semi-liquid sample
(BAL, sputum, stool, etc.) for nucleic acid isolation will depend on the type
of sample material, sample viscosity, and particle type and content.
 Any sample material using this sample preparation procedure in conjunction with any downstream IVD nucleic acid testing shall be validated with
regard to the individual IVD parameters.
 Depending on the sample viscosity, and particle type and content, samples
may be used without any pretreatment.
14
y Version 04, EN
ASSAY PROCEDURES
Lysis Protocol using MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer* (BLB)
햲
 Do not use 1,000 μl sample input volume for very viscous and
cell-rich samples, such as sputum or stool.
Liquefaction (optional step for very viscous samples, e.g., BAL or sputum)
• Prepare a fresh DTT (dithiothreitol) stock solution (e.g., 5× conc. =
0.75%).
• Adjust final DTT concentration in sample to 0.15% by adding DTT
stock solution.
• Incubate sample while shaking at 850 rpm for 30 min at +37°C until
it can be easily pipetted.
햳
Addition of BLB
• Add 250 ␮l (or 500 ␮l) BLB to 250 ␮l (or 500 ␮l) sample, and mix
thoroughly.
 If the sample volume is less than 250 ␮l (or 500 ␮l), add BLB to
make a final volume of 500 ␮l (or 1,000 ␮l).
햴
Proteinase K Digestion
• Add 50 ␮l (or 100 ␮l) Proteinase K to 500 ␮l (or 1,000 ␮l) sample/
BLB mixture, and mix thoroughly.
• Incubate for 10 min at +65°C.
햵
Boiling (for difficult sample materials, such as sputum or stool
samples)
 Perform boiling step to inactivate pathogenic organisms in the
sample. This may also enhance lysis of cell walls for some bacterial
species. To prevent leakage, perform this step in screw-capped
reaction tubes.
 For isolation of RNA omit the boiling step, because this could negatively affect the integrity of the RNA.
• Incubate samples at +95°C for 10 min.
• Chill samples on ice. Then centrifuge briefly to collect the complete
sample volume on the bottom of the tube.
• Transfer 500 ␮l (or 1,000 ␮l) to a MagNA Pure 96 Processing Cartridge.
15
y Version 04, EN
ASSAY PROCEDURES
Pretreatment of Stool Samples
햲
Use a pea-sized amount of stool sample and suspend in 550 ␮l of PBS.
 To avoid clogging the reaction tips with solid particles centrifuge
for 5 s at 500 × g.
 For the isolation of viral RNA, a PBS/STAR Buffer mixture (1:1 mixture) may be used as an alternative to suspend stool samples, in
order to reduce possible inhibition.
햳
Transfer 250 ␮l supernatant to a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube;
add 250 ␮l BLB and 50 ␮l Proteinase K.
햴
Incubate for 10 min at +65°C while shaking at 850 rpm in a thermomixer, followed by 10 min incubation at +95°C.
 For isolation of RNA omit incubation at +95°C.
햵
Transfer 500 ␮l of the lysate to a MagNA Pure 96 Processing Cartridge.
Pretreatment of Swabs
햲
Suspend a dry swab in 500 ␮l (or 1,000 ␮l) BLB; add 50 μl (or 100 ␮l)
Proteinase K. 
For swabs in transport medium use 250 ␮l (or 500 ␮l) transport
medium, add 250 ␮l (or 500 ␮l) BLB and 50 ␮l (or 100 ␮l) Proteinase K.
햳
Squeeze and remove the swab.
햴
Incubate the liquid sample at +65°C for 10 min, followed by 10 min
incubation at +95°C.
 For isolation of RNA omit incubation at +95°C.
햵
Transfer 500 ␮l (or 1,000 ␮l) liquid sample to a MagNA Pure 96 Processing Cartridge.
V. Cultured cells
Cultured cells resuspended in 200 ␮l phosphate buffered saline (PBS) can be
used.
For DNA isolation from cultured cells grown in suspension, gently spin down
the cultured cells for 5 min at 300 × g. If necessary, wash the cell pellet using
PBS.
 The cell pellet can be stored at ⫺15 to ⫺25°C. 
Remove the culture media (or PBS) and resuspend cells in cold PBS by
pipetting or shaking the tube until the cell pellet is resuspended. 
16
y Version 04, EN
ASSAY PROCEDURES
Monolayer cultured cells should be collected by standard trypsinization
using the procedure described above. The required sample volume is
200 ␮l.
 Do not use more than 1 × 106 cells/200 ␮l, otherwise the performance of
the isolation process will be negatively affected.
VI. Fresh-frozen tissue
Up to 25 mg fresh-frozen tissue sample can be used after homogenization.
Tissue Homogenization by Proteinase K Digestion
햲
Add up to 25 mg tissue sample into a reaction tube, such as a 1.5 ml
centrifuge tube.
햳
Add 180 ␮l MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer* and 20 ␮l Proteinase K to the tissue sample, then mix.
햴
Incubate at +55°C until complete dissolution of the tissue (usually
three hours to overnight).
 This homogenization method results in a high DNA yield and integrity.
Tissue Homogenization using the MagNA Lyser Instrument
햲
Transfer up to 25 mg tissue sample into a MagNA Lyser Green Beads
Tube.
햳
Add 200 ␮l MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer.
햴
Homogenize the tissue in the MagNA Lyser Instrument for 30 to 40
seconds. If homogenization is not yet complete, repeat this step.
 This method is fast, however, due to mechanical shearing, the DNA
may be partially fragmented.
17
y Version 04, EN
ASSAY PROCEDURES
8.3
Quality Control
 Always run appropriate controls.
To control the complete process, starting from sample preparation to analysis,
perform the following controls:
• Positive control using a sample material positive for the target.
• Negative control using PBS in place of the sample.
• Extraction control using a sample material negative for the target.
• Internal control (IC) by adding a defined amount of a control template to all
samples to be purified.
 For applications that could produce false negative results, such as the
detection of pathogens, the use of an appropriate internal control (IC) is
mandatory. The IC is added during nucleic acid isolation, preferably using
the automated IC function of the MagNA Pure 96 System. The IC can also
be added manually to the sample. In this case, the IC must be stable in the
sample material, and a nuclease-sensitive IC, such as unprotected RNA,
should not be used for this purpose.
Internal Control
The MagNA Pure 96 System is able to automatically add an internal control
(IC) to each sample from the MagNA Pure 96 Internal Control Tube. The internal control volume is fixed to 20 ␮l per isolation. To use this function, select an
internal control from the Internal Control list, when creating an order. Add the
indicated volume of internal control to the IC tube, and position the tube on
the stage.
 Due to mechanical limitations, the required internal control volume is
higher than simply multiplying the number of samples by 20 ␮l:
Number of
Samples
8
16
24
32
IC Amount
(␮l)
650 800 1000 1350
40
48
56
64
1500 1650 2300 2450
72
80
88
96
2600 2800 2950 3100
 For some 1,000 ␮l protocols, the sample volume is divided to produce two
samples, and is processed in two separate wells of the MagNA Pure 96
Processing Cartridge. When using an internal control, internal control is
added to each well separately. This means that the total amount of internal
control added per sample is 40 ␮l instead of 20 ␮l. Therefore, double the
volume of the internal control loaded into the instrument and double the
number of „Tests“ in the „Edit Internal Control Barcode“ dialog box.
8.4
Isolation Procedure
 It is the user's responsibility to validate system performance for any proce-
dures used in the laboratory.
18
y Version 04, EN
ASSAY PROCEDURES
The MagNA Pure 96 Instrument is designed to simultaneously process 96
samples. When sample numbers other than multiples of 8 are used, the instrument will fill up the empty positions until the next multiple of 8 is reached.
For a detailed description of how to perform instrument setup and a purification run, refer to the MagNA Pure 96 User Training Guide (Software Version
2.0).
 Pipet samples to the bottom of the wells of the processing cartridge. Avoid
placing drops of sample material on the walls of the wells. Use the Sample
Transfer function to automatically pipet the samples into the wells of
another processing cartridge. This will ensure a transfer without the danger of contaminating the walls of the wells with sample materials. For
more details, refer to the MagNA Pure 96 Operator's Guide (Software Version 2.0).
 Ensure that the instructions are followed regarding type and amount of
sample material (see section 8.2 Sample Materials and Pre-Isolation
Steps). Using the wrong types and amounts of sample material may cause
clumping, which may lead to low yield and purity of nucleic acid, as well as
cross-contamination and inhibition of downstream assays, such as PCR
and RT-PCR. Aqueous sample material, such as nucleic acids dissolved in
water or in liquids without biological buffer, may result in bad purification
performance. In this case, we recommend adding 10× PBS to a final concentration of 1× PBS, or a carrier nucleic acid, such as Poly A RNA.
 When reagents have been stored at temperatures below +15 to +25°C,
equilibrate kit components at +15 to +25°C for at least one hour before
use.
 Ensure that all containers are inserted correctly into the reagent trays prior
to placing them on the stage.
 It is possible to use two reagent sets of the same lot within one purification
run. In this case, we recommend using two sets of external controls, one
for each reagent set.
8.5
Ending a Run
After the run has finished, carefully inspect the instrument for any signs of
spillage. If spillage occurred, clean and decontaminate the instrument as
described in the MagNA Pure 96 System Operator´s Guide.
 Clean and decontaminate the waste cover after each run, as described in
the MagNA Pure 96 System User Training Guide. Do not use sodium
hypochlorite (bleach) solution or acids for the first cleaning step, because
this may produce highly toxic gas in combination with reagents containing
guanidine thiocyanate.
 Residual amounts of magnetic particles in the output plate do not affect
PCR and RT-PCR assays on LightCycler® Instruments or conventional
thermal block cyclers.
19
y Version 04, EN
LIMITATIONS AND INTERFERENCES
9.
LIMITATIONS AND INTERFERENCES
1. Reliable results are dependent on adequate specimen collection, transport,
storage, and processing procedures.
2. Use of this product should be limited to personnel trained in nucleic acid
purification, isolation, and PCR techniques.
3. False negative results may occur if a specimen is improperly collected,
transported, stored, or handled. False negative results may also occur if
inadequate numbers of organisms are present in the specimen.
4. Any IVD application using the sample preparation procedure in conjunction
with any downstream IVD nucleic acid testing should be evaluated with
regard to the individual IVD parameters.
5. To minimize the risk of a negative impact on the results, adequate controls
for downstream applications must be used.
6. Storage conditions (temperature, time) for lysates, pellets of cultured cells
and eluates, shall be validated with regard to the individual IVD parameter.
7. The MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit and its reagents
are intended to be used in combination with the MagNA Pure 96 System for
isolation and purification of total nucleic acids (DNA/RNA) from biological
specimens for in vitro diagnostic purposes. Appropriate performance characteristics have to be established by the user in particular in conjunction
with any downstream application. Any result shall be interpreted within the
context of all relevant clinical and laboratory findings. As the analyte concentration can vary broadly amongst different specimen types, we recommend establishing cross-contamination performance, for example, by
so-called checkerboard experiments (high positive next to negative samples) before going into routine testing.
20
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
10. PERFORMANCE DATA
 The MagNA Pure 96 Kits and its reagents are used in combination with
the MagNA Pure 96 System for isolation and purification of total nucleic
acids (DNA/RNA) from biological specimens for in vitro diagnostic purposes. 
Representative performance data are shown below. The data show exemplarily the performance of the most common sample materials in order to
demonstrate the state of the art performance of the system. As results
obtained may differ depending on sample and parameter, appropriate performance characteristics have to be established by the user. For diagnostic
purposes the results shall always be assessed in conjunction with the relevant application and other findings. 
For sample preparation using the MagNA Pure 96 Instrument, both the
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit and the
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit were used to
produce the performance data shown below.
10.1
Precision of Purification Efficiency
To determine the precision of the purification efficiency, genomic DNA was
purified from whole blood. Yield and purity of the isolated nucleic acid were
determined by OD measurement. The experimental setup and the results are
described below.
Kit Type
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA SV Kit
Purification Protocol
DNA Blood SV
Sample Type
Whole blood (7.6 × 106 white blood cells/ml)
Sample Input Volume
200 ␮l
Elution Volume
100 ␮l
Replicates per Run
24
Table 2: Experimental setup to perform analysis of yield and purity
Yield (␮g)
CV (%)
OD 260/280
CV (%)
Run 1
5.6
3.9
1.9
2.5
Run 2
5.6
5.5
1.9
4.4
Run 3
5.5
6.5
1.9
1.8
Table 3: Results (mean values) for DNA yield and purity, for genomic DNA purified from
whole blood
 Yield strongly depends on the blood cell count and therefore can vary
from donor to donor.
21
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
10.2
Analytical Performance
Real-time qPCR/RT-PCR was performed on the LightCycler® 480 Instrument
using 5 ␮l eluate in a total PCR volume of 20 ␮l. Quantification standards and
control samples were added directly before starting the PCR.
Parameter
Parvo B19 Virus
Sample Type EDTA plasma spiked
with Parvo B19 virus
Hepatitis A Virus (HAV)
Cyclophilin A (CycA)
EDTA plasma spiked with
Hepatitis A virus
Whole blood pooled from
different donors
(7.6 × 106 white blood
cells/ml)
Target
In-house Parvo B19 virus In-house Hepatitis A virus
stock material
stock material
Human genomic DNA
Kit used 
for PCR 
Analysis
LightCycler® Parvo B19 LightCycler® Hepatitis A
Quantification Kit 
(available in-house 
(available in-house only)
only)
LightCycler® CycA
in-house assay:
LightCycler® FastStart
DNA MasterPLUS HybProbe and Cyclophilin A
specific primers and
probes
Eluate Vol5 ␮l
ume per PCR
5 ␮l
5 ␮l
PCR Volume 20 ␮l
20 ␮l
20 ␮l
PCR 
Instrument
LightCycler®
Instrument
480 
LightCycler®
Instrument
480 
LightCycler® 480 
Instrument
Table 4: Summary of the assays used to produce the performance data shown below.
Linear Range and The linear range and the limit of detection (LoD), that can be achieved using
Limit of Detection the MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid Kits for automated nucleic
acid purification in combination with the MagNA Pure 96 Instrument was eval(LoD)
uated, using virus stock material from Parvo B19 virus and from Hepatitis A
virus (both available in-house only).
The experimental setup to determine the linear range and the limit of detection of the chosen parameters and the results are described below.
Parameter
Parvo B 19 Virus
Kit Type
MagNA Pure 96 DNA and Viral MagNA Pure 96 DNA and Viral NA
NA LV Kit
LV Kit
Viral NA Universal LV
Sample Type
EDTA plasma
EDTA plasma
22
Hepatitis A Virus
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
Sample Input Volume
500 ␮l
500 ␮l
Elution Volume
50 ␮l
50 ␮l
Dilution series
8 different virus titers 
2×101 to 5×107 copies/ml
8 different virus titers 
Overall data points avail- 172
able
176
Table 5: Experimental setup to determine the linear range and LoD.
Parameter
Parvo B 19 Virus
Hepatitis A Virus
Linear Range
2×102
Limit of Detection*
(LoD_95)
68 copies/ml
confidence interval: 
48 to 156 copies/ml
to
5×106
copies/ml
119 copies/ml
confidence interval: 
75 to 279 copies/ml
Table 6: Results determined for linear range and LoD.
* All data were statistically evaluated by Probit analysis; LoD was calculated for the 95% confidence interval
(LoD_95).
 Sensitivity and the limit of detection are highly dependent on the PCR
assay
Linear Range Parvo B19 Virus
Figure 1: Linear range using the Viral NA Universal LV protocol to purify Parvo
B19 virus from EDTA plasma. The linear range for this application is 2×102 to 5×106
copies/ml. SVT/ml spiked virus titer/ml, MVT/ml: measured virus titer/ml.
23
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
Linear Range Hepatitis A Virus
(HAV)
Figure 2: Linear range using the Viral NA Universal LV protocol to purify HAV
from EDTA plasma. The linear range for this application is 3×103 to 1×109 copies/ml.
SVT/ml spiked virus titer/ml, MVT/ml: measured virus titer/ml.
Limit of Detection
for Parvo B19
Virus
Figure 3: Limit of detection for Parvo B19 virus determined using the Viral NA
Universal LV protocol to purify a viral dilution series from EDTA plasma. The
LoD_95 is 68 copies/ml. The related confidence interval is 48 to 156 copies/ml.
_____
Probit Regression, - - - - lower 95 % limit, . . . . . . upper 95 % limit, o LoD_95.
24
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
Limit of Detection
for Hepatitis A
Virus (HAV)
Figure 4: Limit of detection for HAV determined using the Viral NA Universal LV
protocol to purify a viral dilution series from EDTA plasma. 
The LoD_95 is 119 copies/ml. The related confidence interval is 75 to 279 copies/ ml.
_____ Probit Regression, - - - - lower 95 % limit, . . . . . . upper 95 % limit, o LoD_95.
10.3
Precision Analysis
Standard deviations (SD) and coefficients of variations (CVs) were determined
for dilution series within the linear range using the following parameters:
Parvo B19 virus, Hepatitis A virus and Cyclophilin A.
To determine the intra-assay precision, all data were produced in a single run.
To determine the inter-assay precision three runs were performed by different
operators, on different instruments, in different labs. Lot-to-lot precision was
determined using six different lots.
The experimental setup to perform precision analysis and the corresponding
results are described below.
Parameter
Parvo B19 Virus
Kit Type
MagNA Pure 96 DNA MagNA Pure 96 DNA and
Viral NA SV Kit
and Viral NA SV Kit
Hepatitis A Virus (HAV)
MagNA Pure 96 DNA
and Viral NA SV Kit
Purification 
Protocol(s)
Viral NA Universal SV Viral NA Universal SV
DNA Blood SV
Sample Type
EDTA plasma
EDTA plasma
Whole blood (7.6 × 106
white blood cells/ml)
Sample Input
Volume
200 ␮l
200 ␮l
200 ␮l
25
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
Elution Volume 50 ␮l
Dilution Series
1×103
Replicates
8
50 ␮l
1×106
to
copies/ml

1×103
100 ␮l
to
1×106
copies/ml
8
Not applicable
24
LightCycler 480
Instrument
LightCycler 480 
Instrument
Instrument
Intra-run 
precision
32
32
24
Inter-run 
precision
96
96
72
Lot to lot 
precision
160
160
144
Data Points
®
®
Table 7: Experimental setup to perform precision analysis.
Parvo B19 Virus
Intra-Run Precision
Concentration (copies/ml)
Mean (Cp)
SD (Cp)
CV (%)
1 × 106
18.0
0.14
0.78
1×
105
21.5
0.21
1.00
1×
104
24.9
0.31
1.23
1×
103
28.5
0.39
1.37
Parvo B19 Virus
Inter-Run Precision
1 × 106
18.2
0.34
1.89
1×
105
21.6
0.32
1.49
1×
104
25.2
0.44
1.73
1 × 103
28.7
0.38
1.34
Parvo B19 Virus
Lot to lot Precision*
1×
106
18.2
0.16
0.90
1×
105
21.7
0.21
0.97
1 × 104
25.1
0.39
1.55
3
28.6
0.38
1.32
1 × 10
Table 8: Results for intra-assay, inter-assay and lot-to-lot precision determined using
Parvo B19 virus material spiked in EDTA plasma.
* mean over 6 different lots
26
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
Hepatitis A Virus
Intra-Run Precision
Concentration (copies/ml)
Mean (Cp)
SD (Cp)
CV (%)
1×
106
19.4
0.18
0.94
1×
105
23.0
0.28
1.23
1×
104
26.2
0.12
0.45
1 × 103
29.7
0.12
0.41
Hepatitis A Virus
Inter-Run Precision
1×
106
19.4
0.26
1.33
1×
105
22.9
0.21
0.92
1 × 104
26.2
0.12
0.45
103
29.6
0.32
1.07
1×
Hepatitis A Virus
106
19.7
0.22
1.10
1 × 105
23.1
0.15
0.67
1×
104
26.6
0.39
1.46
1×
103
30.0
0.26
0.87
1×
Table 9: Results for intra-assay, inter-assay and lot-to-lot precision determined using
HAV spiked in EDTA plasma.
CycA Assay
Reference sample
Intra-Run Precision
Mean (Cp)
SD (Cp)
CV (%)
18.1
0.20
1.12
CycA Assay
Reference sample
Inter-Run Precision
18.0
CycA Assay
Reference sample
0.21
1.15
17.9
0.16
0.87
Table 10: Results for intra-assay, inter-assay and lot-to-lot precision for the CycA assay
performed with DNA isolated from whole blood.
27
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
10.4
The influence of interfering substances was evaluated using sample material
spiked with Parvo B19 virus, and with an increasing concentration series of the
following prevalent substances: Hemoglobin (Hemoglobin human, SigmaAldrich Co. LLC), bilirubin (Sigma-Aldrich Co. LLC) and lipids (Intralipid 20 %
emulsion, Sigma-Aldrich Co. LLC).
The experimental setup to evaluate the influence of interfering substances and
the corresponding results are described below:
Parameter
Parvo B19 Virus
Kit Type
Viral NA Universal SV
Sample Type
Whole blood
Sample Input Volume
200 ␮l
Elution Volume
50 ␮l
Virus concentration
1 × 105 copies/ml
Hemoglobin, bilirubin and lipids used in 
different concentrations
Replicates per inhibitor 3
concentration
Table 11: Experimental setup to evaluate the influence of the interfering substances
hemoglobin, bilirubin and lipids.
Results
Hemoglo- Cp
bin (mg/dl)
Bilirubin (mg/dl)
Cp
Lipids (mg/dl) Cp
0
21.0
0
20.8
0
21.6
100
21.3
6.6
21.0
200
21.6
200
21.2
13.2
21.2
400
21.5
300
21.2
19.8
20.9
600
21.9
400
21.1
26.4
21.0
800
21.9
500
21.1
33.0
21.3
1000
21.8
600
21.0
39.5
21.4
1200
21.5
700
21.1
46.1
21.3
1400
21.6
800
21.3
52.8
21.0
1600
21.3
900
21.5
59.4
21.0
1800
21.2
1000
n.d.*
66.0
21.5
2000
21.1
Mean
21.1
Mean
20.8
Mean
21.6
Table 12: Crossing point (Cp) results for samples spiked with interfering substances.
* not determined due to pipetting error.
28
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
None of the interfering substances showed an influence on the crossing
points. The obtained range of crossing points is a 0.8.
10.5
Testing for Cross Contamination
The risk of cross contamination was evaluated using the Parvo B 19 test. During the first two runs only negative samples were processed to test the
MagNA Pure 96 System for possible contamination. In three runs, a checkerboard pattern of alternating positive and negative samples was processed.
With the last run, only negative samples were processed. A sample was identified as negative, when no detection signal is obtained after 45 PCR cycles.
The experimental setup to test the MagNA Pure 96 System for possible contamination and the corresponding results are described below.
Parameter
Parvo B19 Virus
Kit Type
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA LV Kit
Purification Protocol Viral NA Universal LV
Sample Input Volume 500 ␮l
Elution Volume
50 ␮l
Positive samples
5 × 107 copies/ml in EDTA plasma
Negative samples
negative EDTA plasma
Number of runs
A) 2 runs only with negative samples
B) 3 runs with checkerboard pattern
C) 1 run only with negative samples
PCR Analysis
LightCycler® Parvo B19 Quantification Kit using a
384 well plate on LightCycler® 480 Instrument
Table 13: Experimental setup to evaluate the risk of cross contamination.
29
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
Run
Mean Cp of 
positive samples
Standard deviation Positive Rate
Negative
Rate
1
n/a
n/a
0/96
96/96
2
n/a
n/a
0/96
96/96
3
17.8
0.20
48/96
48/96
4
20.0
0.22
48/96
48/96
5
18.6
0.12
48/96
48/96
6
n/a
n/a
0/96
96/96
Table 14: Results of the cross-contamination experiments based on mean crossing
points and call rates.
As shown in Table 14, under the above described conditions, no cross contamination was detected.
10.6
Method Comparison
JAK2 Mutation
Detection
Method comparison was obtained using the MagNA Pure 96 System to test
whole blood samples for the allele JAK2-V617F. This method compares the
mutation ratio to the wild type. DNA was isolated using the MagNA Pure 96
System, and the established manual QIAamp DNA Blood Mini Kit method.
PCR analysis was performed using JAK2 MutaQuant®Kit, according to the
manufacturer's instructions.
Parameter
Jak2 V617F
Kit Type
DNA Blood SV
Sample Type
Whole blood
Sample Input Volume
200 ␮l
Elution Volume
50 ␮l
Samples tested*
50
PCR Analysis
JAK2 MutaQuant®Kit (MQPP-02-CE/MQPP-03CE), Ipsogen SA; 
Marseille on the Rotor-Gene 3000 Instrument
Comparator Method
Sample preparation
QIAamp DNA Blood Mini Kit 
(Elution volume 85 μl)
Table 15: The experimental setup for testing whole blood samples for the allele
JAK2-V617F.
* Fifty blinded clinical samples (spare samples) were obtained from routine diagnostic
procedures, and measured in parallel.
30
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
Comparator
Negative
Positive
JAK2_V617F
Total
Negative
33
0
33
Positive
JAK2_V617F
0
17
17
Total
33
17
50
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 50 samples
Table 16: Altogether, 50 samples were included in this analysis. Agreement for identifying positive and negative samples was 100% between the automated MagNA Pure 96
method and the manual QIAamp DNA Blood Mini Kit.
Figure 5: The method comparison was based on the final ratio mutation to WT (wild
type) between the purification using the MagNA Pure 96 DNA and Viral NA SV kit compared to that of the QIAamp DNA Blood Mini Kit.
……….. Identity Line, - - - - - Bablok Regression (1.02x); Pearson r= 0.989
31
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
Pneumocystis
jiroveci DNA
Method comparison data obtained using the MagNA Pure 96 System were
assessed by testing bronchoalveolar lavage (BAL) samples for Pneumocystis
jiroveci DNA.
The following experimental setup was performed:
Parameter
Pneumocystis jiroveci DNA
Kit Type
Purification Protocol Pathogen Universal LV
Sample Type
Bronchoalveolar lavage (BAL)
Sample Input Volume 500 ␮l
Elution Volume
100 ␮l
Samples tested*
96
PCR Analysis**
In-house real-time qPCR assay in combination
with LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe
LoD: <50 copies/ reaction
Linear range: 103 - 108 copies/ml
Samples > 104 copies/ml are assessed as positive
Comparator Method
Sample preparation
QIAamp DNA Mini Kit:
Sample volume: 500 ␮l
Elution volume: 200 ␮l
Table 17: Experimental setup for testing bronchoalveolar lavage (BAL) samples for
Pneumocystis jiroveci DNA.
* Ninety-six blinded clinical samples (spare samples) were obtained from routine diagnostic procedures, and measured in parallel.
**The PCR assay was developed and validated by the Institute of Medical Microbiology
and Hygiene, University Hospital Regensburg.
Comparator
Negative
Positive
P.jiroveci DNA
Total
Negative
70
1
71
Positive
P.jiroveci DNA
0
25
25
Total
70
26
96
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 96 samples
Table 18: Altogether, 26 samples out of 96 were assessed positive. The positive agreement for the positives was 25 out of 26 (96%). The positive agreement for the negatives
was 70 out of 70 (100%).
32
y Version 04, EN
PERFORMANCE DATA
Figure 6: The method comparison for the positive samples based on the crossing points
measured in 2 consecutive runs performing the Pneumocystis jiroveci in-house real-time
qPCR assay.
…….. Identity Line, - - - - - Bablok Regression (1.01x+0.91); Pearson r= 0.9312 
(Run 1: ×) _______ Bablok Regression (1.01x +1.07); Pearson r= 0.9304 (Run 2: o)
33
y Version 04, EN
SUPPLEMENTARY INFORMATION
11. SUPPLEMENTARY INFORMATION
11.1
Symbols
In this document, the following symbols are used to highlight important information
Symbol
Description

Important Note

Information Note
C
For in vitro diagnostic use.
I
Catalog Number
B
Batch Code
s
Use by
r
Temperature Limitations (Store at)
n
Distributor
t
Manufacturer
)
Store protected from sunlight. (Outer packaging of disposables)
2
11.2
Do not reuse. (Outer packaging of disposables).
v
The kit complies with the requirements of the
IVD directive 98/79/EC.
*
available from Roche Applied Science
Changes to Previous Version
Editorial changes.
12. TRADEMARKS
LIGHTCYCLER and MAGNA PURE are trademarks of Roche.
All other product names and trademarks are the property of their respective
owners.
13. DISCLAIMER OF LICENSE
This is a product licensed under patents owned by Qiagen.
34
y Version 04, EN
REGULATORY DISCLAIMER
14. REGULATORY DISCLAIMER
For in vitro diagnostic use.
35
y Version 04, EN
v
Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim,
Germany, +49 621 7590
Manufactured in Germany
_________________________________________________________________
0512.06671934001➃
t
n Distributed in USA by Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA
Roche Diagnostics GmbH
Roche Applied Science
68298 Mannheim
Germany
C
y Version 04
Letzte Aktualisierung des Inhalts: Mai 2012
Vorgefüllte Reagenzien für das MagNA Pure 96 Instrument. Dieses Kit dient zur
Isolierung von genomischer DNA und viralen Nukleinsäuren (NA) aus bis zu
1.000 ␮l Vollblut, Plasma oder Serum, aus bis zu 25 mg frisch gefrorenem
Gewebe oder aus bis zu 1 × 106 Zellen in Kultur sowie zur Isolierung von
bakteriellen, von Pilzen stammenden und viralen Nukleinsäuren aus bis zu
1.000 ␮l humanem Probenmaterial.
I 06 374 891 001
r Bei ⫹15 bis ⫹25 °C lagern
 Kit lichtgeschützt aufbewahren.
 Kit von Magneten fernhalten.
Kit für 3 ⫻ 96 Reaktionen
Table of Contents
1.
2.
3.
4.
VERWENDUNGSBEREICH .............................................................................................. 3
BESCHREIBUNG DES KITS ............................................................................................ 3
TESTPRINZIP/ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................ 3
REAGENZIEN UND GEBRAUCHSLÖSUNGEN ............................................................ 4
4.1
4.2
Anzahl der Tests
Kit/Inhalt
5.
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN ............................................... 6
5.1
5.2
5.3
5.4
Vorsichtsmaßnahmen
Handhabung
Laborverfahren
Handhabung von Abfall
4
4
6
7
8
9
6.
LAGERUNG UND HALTBARKEIT ................................................................................ 10
6.1
6.2
6.3
Kit und Reagenzien
Probengewinnung und Lagerung von Probenmaterial
Lagerung aufgereinigter Nukleinsäuren und Eluate
10
10
11
7.
MATERIALIEN ................................................................................................................ 12
7.1
7.2
Mitgelieferte Materialien
Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte
12
12
8.
TESTVERFAHREN .......................................................................................................... 13
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
Aufreinigungsprotokolle
Probenmaterialien und Schritte zur Isolierungsvorbereitung
Qualitätskontrolle
Isolierung
Beenden eines Laufs
9.
10.
GRENZEN DER METHODE UND STÖREINFLÜSSE ................................................. 23
LEISTUNGSDATEN ........................................................................................................ 24
10.1
10.2
10.3
10.4
10.5
10.6
Präzision der Aufreinigungseffizienz
Analytische Leistung
Präzisionsanalyse
Störsubstanzen
Untersuchung von Kreuzkontaminationen
Methodenvergleich
13
15
20
21
22
24
25
29
31
33
34
11.
ZUSATZINFORMATIONEN .......................................................................................... 38
11.1
11.2
Symbole
Änderungen gegenüber der Vorversion
12.
13.
14.
MARKEN ......................................................................................................................... 38
LIZENZAUSSCHLUSS ................................................................................................... 38
REGULATORISCHER HINWEIS/HAFTUNGSAUSSCHLUSS .................................. 39
2
38
38
y Version 04, DE
VERWENDUNGSBEREICH
1.
VERWENDUNGSBEREICH
Das MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit ist ein Reagenzkit,
das im Bereich der In-vitro-Diagnostik in Verbindung mit dem MagNA Pure 96
System zur Isolierung und Aufreinigung von Gesamtnukleinsäuren (DNA/
RNA) aus Proben biologischen Ursprungs verwendet wird.
Jede IVD-Applikation, für die dieses Probenaufarbeitungsverfahren in
Verbindung mit einem in-vitro-diagnostischen Downstream-Nukleinsäuretest
zum Einsatz kommt, ist im Hinblick auf die einzelnen IVD-Parameter zu
evaluieren.
2.
BESCHREIBUNG DES KITS
Das MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit dient zur Isolierung
von:
• Nukleinsäure aus bis zu 1.000 ␮l Vollblut, Plasma oder Serum.
• Bakterieller, von Pilzen stammender und viraler Nukleinsäure aus bis zu
1.000 ␮l Probenmaterial oder Lysat menschlichen Ursprungs.
• Nukleinsäure aus bis zu 1 × 106 Zellen in Kultur.
• Nukleinsäure aus bis zu 25 mg frisch gefrorenem Gewebe.
Die isolierten Nukleinsäuren erfüllen die Qualitätsanforderungen für
hochempfindliche quantitative PCR-/RT-PCR-Analysen.
3.
TESTPRINZIP/ZUSAMMENFASSUNG
Die Nukleinsäure-Isolierung basiert auf der MagNA Pure Technologie der
magnetischen Glaspartikel (MGP). 
Die MagNA Pure 96 Nukleinsäure-Isolierung läuft in den folgenden Schritten
ab:
1. Das Probenmaterial wird lysiert, die Nukleinsäuren werden freigesetzt und
die Nukleasen werden denaturiert.
2. Die Nukleinsäuren binden aufgrund der Eigenschaften des chaotropen
Salzes und der hohen Ionenstärke des Lyse-/Bindungspuffers an die
Kieselgeloberfläche der zugegebenen magnetischen Glaspartikel.
3. Die magnetischen Glaspartikel mit den daran gebundenen Nukleinsäuren
werden durch magnetische Anziehung vom Rest der lysierten Probe
getrennt.
4. Ungebundene Substanzen, wie z. B. Proteine, Zelltrümmer und PCRInhibitoren, werden in mehreren Waschschritten entfernt.
5. Die aufgereinigten Nukleinsäuren werden von den magnetischen
Glaspartikeln eluiert.
3
y Version 04,DE
REAGENZIEN UND GEBRAUCHSLÖSUNGEN
4.
4.1
Anzahl der Tests
Das Kit ist für folgende Reaktionen ausgelegt:
• 3 × 96 Isolierungen von genomischer DNA und viralen Nukleinsäuren aus
bis zu 500 ␮l Vollblut, Plasma oder Serum oder aus bis zu 1 × 106 Zellen in
Kultur oder
• 3 × 96 Isolierungen von bakteriellen, von Pilzen stammenden und viralen
Nukleinsäuren aus 500 ␮l Probenmaterial menschlichen Ursprungs oder
• 3 × 96 Isolierungen aus bis zu 25 mg frisch gefrorenem Gewebe oder
• 3 × 48 Isolierungen aus 1.000 ␮l Vollblut, Plasma oder Serum oder
• 3 × 48 Isolierungen von bakteriellen, von Pilzen stammenden und viralen
Nukleinsäuren aus 1.000 ␮l Probenmaterial menschlichen Ursprungs.
4.2
Kit/Inhalt
Komponente Beschriftung
Inhalt/Funktion
Tray 1
Reagenztray 1
3 Trays pro Kit
Behälter 1
Wash Buffer I
• 160 ml
• < 6 M Guanidinhydrochlorid, 
< 50 % EtOH, < 30 mM Tris-HCl
• zur Entfernung von Verunreinigungen
Behälter 2
Wash Buffer I
• 80 ml
• < 6 M Guanidinhydrochlorid, 
Behälter 3
Lysis/Binding
Buffer
• 80 ml
• < 6 M Guanidinthiozyanat, 
< 30 % Triton X-100, < 60 mM
Tris-HCl
• zur Zell-/Viruslyse und Bindung der
Nukleinsäuren
Tray 2
Reagenztray 2
3 Trays pro Kit
Behälter 1
4
leer
Behälter 2
Proteinase K
• 15 ml
• 2 % Proteinase K, 50 % Glyzerin
• für den Proteinverdau
Behälter 3
Elution Buffer
• 80 ml
• < 60 mM Tris-HCl-Puffer
• für die Elution der Nukleinsäuren
y Version 04, DE
Behälter 4
Wash Buffer III
• 160 ml
• < 20 mM Natriumacetatpuffer
Flasche 1
Magnetic Glass 
Particles
• 6 Flaschen à 18 ml
• Isopropanolhaltige Suspension der
magnetischen Glaspartikel
• zur Bindung der Nukleinsäuren
 Die MagNA Pure 96 Systemflüssigkeit (intern/extern)* dient als
Waschpuffer II für dieses Kit.
 Alle Komponenten des Kits sind gebrauchsfertig.
5
y Version 04,DE
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
5.
5.1
Vorsichtsmaßnahmen
 Mehrere Puffer im MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit
enthalten gefährliche oder schädliche Substanzen. Weitere Informationen
finden Sie in Abbildung 1 (Reagenztray 1), Abbildung 2 (Reagenztray 2)
und Tabelle 1. Diese Reagenzien dürfen nicht mit der Haut, den Augen
oder den Schleimhäuten in Berührung kommen. Falls es doch zu einem
Kontakt kommt, waschen Sie die betroffene Stelle sofort mit reichlich
Wasser ab. Verschüttete Reagenzien müssen mit Wasser verdünnt
werden, bevor sie aufgewischt werden.
 Reagenzien, die Guanidinthiozyanat enthalten, dürfen nicht mit
Natriumhypochloritlösung (Bleichlösung) oder Säuren in Kontakt
kommen, da bei diesen Gemischen hochgradig giftige Dämpfe entstehen.
Dieser Hinweis ist besonders wichtig, wenn die Abdeckung des Abflusses
für Flüssigabfälle des MagNA Pure 96 Instruments gereinigt wird.
Abb. 1: Reagenztray 1
Komponente Beschriftung
6
Abb. 2: Reagenztray 2
Gefährliche und schädliche 
Substanzen
Tray 1
Reagenztray 1
Behälter 1
Wash Buffer I
• Guanidinhydrochlorid
• Ethanol
Behälter 2
Wash Buffer I
• Guanidinhydrochlorid
• Ethanol
y Version 04, DE
Behälter 3
Tray 2
Reagenztray 2
Behälter 1
Leer
Behälter 2
Proteinase K
Behälter 3
Elution Buffer
Behälter 4
Wash Buffer III
Flasche 1
Magnetic Glass 
Particles
• Guanidinthiozyanat
• Proteinase K
• Isopropanol
Tabelle 1: Gefährliche und schädliche Substanzen in Reagenzien
5.2
Handhabung
• Tragen Sie Einweghandschuhe und wechseln Sie diese in regelmäßigen
Abständen.
• Das Kit darf nach Ablauf seines Haltbarkeitsdatums nicht mehr verwendet
werden.
Verschleppungen können zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Befolgen
Sie daher die folgenden Richtlinien, um das Risiko einer
Verschleppungskontamination zu minimieren:
• Führen Sie die Probenaufarbeitung, die PCR-/RT-PCR-Vorbereitung und die
PCR/RT-PCR nicht am gleichen Ort durch.
• Entsorgen Sie Pipettenspitzen in geschlossenen Behältern, um
Verunreinigungen durch die Luft zu vermeiden.
Mit Nuklease kontaminierte Reagenzien und Reaktionsgefäße führen zur
Zersetzung der Template-Nukleinsäure. Gehen Sie nach den folgenden
Anweisungen vor, um das Risiko einer Kontamination auf ein Minimum zu
reduzieren:
7
y Version 04,DE
• Berühren Sie keine Oberflächen oder Materialien, die mit Nuklease
verunreinigt sein könnten, um eine Verschleppung zu vermeiden.
• Verwenden Sie ausschließlich die in diesem Kit enthaltenen Reagenzien.
Durch die Verwendung anderer Reagenzien können Nukleasen verschleppt
werden.
• Reinigen und dekontaminieren Sie alle Arbeitsbereiche und Geräte,
einschließlich der Pipetten mit handelsüblichen Dekontaminationsreagenzien.
• Verwenden Sie ausschließlich neue nukleasefreie AerosolfilterPipettenspitzen und Mikrozentrifugenröhrchen.
• Arbeiten Sie in einer speziell für RNA-Anwendungen vorgesehenen
Umgebung. Verwenden Sie möglichst Reaktionsgefäße und Pipettoren, die
ausschließlich für die Arbeit mit Template-RNA vorgesehen sind.
5.3
Laborverfahren
• Alle Materialien menschlichen Ursprungs und Abfälle davon sind als
potenziell infektiös zu betrachten. Reinigen Sie deshalb alle Arbeitsflächen
gründlich und desinfizieren Sie sie mit einem Desinfektionsmittel gemäß den
Empfehlungen der örtlichen Behörden.
• Da die Sensitivität und Konzentration von potenziellen Erregern im
Probenmaterial unterschiedlich sein kann, muss der Anwender für eine
optimale Inaktivierung von Erregern sorgen und geeignete Maßnahmen
gemäß den örtlichen Sicherheitsvorschriften treffen.
• Im Laborbereich ist Essen, Trinken und Rauchen nicht gestattet.
• Pipettieren mit dem Mund ist nicht zulässig.
• Tragen Sie beim Umgang mit Proben und Kitreagenzien EinwegSchutzhandschuhe, einen Laborkittel und einen Augenschutz.
• Achten Sie beim Entnehmen von Aliquoten aus Reagenzflaschen darauf,
Kontaminationen durch Mikroorganismen oder Nuklease zu vermeiden.
Verwenden Sie daher sterile Einweg-Pipettenspitzen.
• Waschen Sie sich nach dem Umgang mit Proben und Kitreagenzien
gründlich die Hände.
8
y Version 04, DE
5.4
Handhabung von Abfall
• Sicherheitsdatenblätter (Material Safety Data Sheets, MSDS) sind online
unter 
www.e-labdoc.roche.com oder auf Anfrage bei Ihrer Roche Vertretung vor
Ort erhältlich.
• Entsorgen Sie unbenutzte Reagenzien und Abfall gemäß den nationalen und
örtlichen Bestimmungen.
• Tragen Sie beim Entsorgen von Proben und Kitreagenzien
Einweg-Schutzhandschuhe, einen Laborkittel und einen Augenschutz.
• Gehen Sie zur Entsorgung der Reagenzien aus den Behältern wie folgt vor:
1. Durchstechen Sie die Folie in der Ecke eines Behälters im Reagenztray
mit Hilfe eines stabilen Einwegprodukts aus Kunststoff, wie z. B. einer
Zellkulturpipette.
2. Schlagen Sie die Folie um und entsorgen Sie die Flüssigkeit in einem
geeigneten Abfallbehälter.
3. Wiederholen Sie die Schritte 1 und 2, bis alle Behälter leer sind.
9
y Version 04,DE
LAGERUNG UND HALTBARKEIT
6.
6.1
Kit und Reagenzien
• Der Versand des Kits erfolgt bei Umgebungstemperatur.
• Die Komponenten des Kits sind bei +15 bis +25 °C bis zu dem auf dem
Etikett aufgedruckten Haltbarkeitsdatum stabil.
 Halten Sie das Kit von Magneten fern und bewahren Sie es lichtgeschützt
auf.
• Die Reagenzien können bei +15 bis +25 °C bis zu 32 Stunden auf der
Plattform des MagNA Pure 96 Instruments aufbewahrt werden.
• Ein Set Reagenztrays (Tray 1 und Tray 2) kann für bis zu vier Läufe verwendet
werden. Die Reagenztrays können nach dem Öffnen innerhalb von 28 Tagen
für weitere Läufe auf demselben MagNA Pure 96 Instrument verwendet
werden, vorausgesetzt, sie werden korrekt mit MagNA Pure 96
Versiegelungsfolie* versiegelt und bei +2 bis +8 °C gelagert. Lassen Sie die
Komponenten des Kits eine Stunde vor dem Gebrauch auf +15 bis +25 °C
äquilibrieren.
 Trays mit teilweise verbrauchten Reagenzien können nur auf demselben
MagNA Pure 96 Instrument erneut verwendet werden. Mit der MagNA
Pure 96 Software wird der Bestand für jedes Gerät mit Hilfe der
Reagenzbarcodes überwacht. Dabei werden teilweise verbrauchte
Reagenzien und Spitzentrays erkannt, so dass beim nächsten Lauf die
entsprechend angepassten Mengen angezeigt werden.
 Wenn die Reagenztrays nicht korrekt versiegelt sind, kann es zu
Verdunstungen kommen. Ungeeignete Lagerungsbedingungen können
den Isolierungsvorgang beeinträchtigen.
6.2
Probengewinnung und Lagerung von Probenmaterial
Zur Gewährleistung eines empfindlichen Nukleinsäurenachweises müssen
die Proben adäquat gelagert werden (DNA bei ⫺15 bis ⫺25 °C und RNA bei
⫺60 bis ⫺80 °C). Wenn die Proben nicht adäquat gelagert werden, kann sich
die DNA oder RNA zersetzen.
 Heparinhaltiges Plasma oder Blut darf nicht verwendet werden.
 Probenmaterial, das für längere Zeit bei höheren Temperaturen gelagert
wurde, darf nicht verwendet werden.
 Wenn die Proben im Gefrierschrank gelagert wurden, tauen Sie sie unter
leichtem Schütteln auf, z. B. mit Hilfe eines Rotationsmischers.
10
y Version 04, DE
6.3
Lagerung aufgereinigter Nukleinsäuren und Eluate
Damit die eluierten Nukleinsäuren möglichst stabil bleiben, fahren Sie sofort
mit der PCR-/RT-PCR-Vorbereitung fort. Die eluierte Nukleinsäure darf nicht
auf der MagNA Pure 96 Plattform gelagert werden.
Decken Sie die Ausgabeplatte zur Lagerung mit MagNA Pure 96
Versiegelungsfolie* ab und lagern Sie diese bei ⫺15 bis ⫺25 °C (DNA) oder
⫺60 bis ⫺80 °C (RNA). Lagern Sie die aufgereinigte Nukleinsäure in
Aliquoten, um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.
Wenn Ausgabeplatten mit Eluaten außerhalb des MagNA Pure 96 Instruments
gelagert werden sollen, versiegeln Sie die Platten mit MagNA Pure 96
Versiegelungsfolie*.
 Zur weiteren Bearbeitung muss die Versiegelungsfolie wieder entfernt
werden. Ziehen Sie die Versiegelungsfolie jedoch nicht zu schnell ab, da
dies durch die Bildung von Aerosolen und Verschleppungen zwischen
den einzelnen Kavitäten zu Kreuzkontamination führen kann.
 Wenn die Eluate im Gefrierschrank gelagert wurden, mischen Sie sie nach
dem Auftauen durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren, bevor Sie
Downstream-Schritte, wie z. B. PCR/RT-PCR oder OD-Messungen,
durchführen. Als Angabe für das Pipettiervolumen sollte mindestens die
Hälfte des Eluatvolumens verwendet werden. Wenn die Nukleinsäuren
nicht vorgemischt werden und in der Lösung nicht gleichmäßig/homogen
verteilt sind, sind die Ergebnisse in nachfolgenden Tests u. U. nicht
reproduzierbar.
 Zur
Langzeitlagerung empfehlen wir, die Eluate in eine
Archivierungsplatte zu überführen.
11
y Version 04,DE
MATERIALIEN
7.
MATERIALIEN
7.1
Mitgelieferte Materialien
Siehe Abschnitt 4: Reagenzien und Gebrauchslösungen
7.2
Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte
• MagNA Pure 96 Instrument (Bestell-Nr. 06 541 089 001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (Internal) [Systemflüssigkeit (intern)]
(Bestell-Nr. 06 430 112 001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (External) [Systemflüssigkeit (extern)]
(Bestell-Nr. 06 640 729 001)
• MagNA Pure 96 Filter Tips (Filterspitzen) (1000 μl) (Bestell-Nr. 06 241 620
001)
• MagNA Pure 96 Processing Cartridge (Bearbeitungsplatte) (Bestell-Nr. 06
241 603 001)
• MagNA Pure 96 Output Plate (Ausgabeplatte) (Bestell-Nr. 06 241 611 001)
• MagNA Pure 96 Internal Control Tube (Röhrchen für die interne Kontrolle)
(Bestell-Nr. 06 374 905 001)
• MagNA Pure 96 Sealing Foil (Versiegelungsfolie) (Bestell-Nr. 06 241 638
001)
• Optionale Reagenzien:
• MagNA Pure 96 External Lysis Buffer (Bestell-Nr. 06 374 913 001)
• MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer (zur Isolierung von bakterieller, von
Pilzen stammender und viraler Nukleinsäure nach dem Pathogen
Universal-Protokoll, wenn eine externe Lyse erforderlich ist) (Bestell-Nr.
06 374 921 001)
• MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer (Bestell-Nr. 06 640 702 001)
• Proteinase K, PCR-Qualität, Aktivität bei +37 °C b 0,6 U/␮l 
(z. B. Bestell-Nr. 03 115 828 001)
• Optional: MagNA Lyser Instrument (Bestell-Nr. 003 358 968 001 ab
Serien-Nr. 40467540, Bestell-Nr. 03 358 976 001 ab Serien-Nr. 40405218)
• Optional: MagNA Lyser Green Beads (Bestell-Nr. 03 358 941 001)
• Standardlaborausrüstung
• Pipetten und nukleasefreie Aerosolfilter-Spitzen, wie z. B. extralange
Spitzen mit 10 cm Länge zur Dispensierung von Proben in die MagNA
Pure 96 Bearbeitungsplatte
• Optional: Röhrchenzentrifuge.
12
y Version 04, DE
TESTVERFAHREN
8.
TESTVERFAHREN
8.1
Aufreinigungsprotokolle
Für die Isolierung von Nukleinsäuren mit dem MagNA Pure 96 DNA and Viral
NA Large Volume Kit sind unterschiedliche Aufreinigungsprotokolle für das
MagNA Pure 96 Instrument verfügbar. Jedes Protokoll ist für ein bestimmtes
Probenmaterial optimiert.
 Die Protokolle dürfen nur für das jeweils angegebene Probenmaterial
verwendet werden, da anderenfalls der Isolierungsvorgang beeinträchtigt
werden kann. Ein unsachgemäßer Gebrauch kann zur Verklumpung und
zum Verlust von magnetischen Glaspartikeln, zur Kreuzkontamination der
Proben oder sogar zur Beschädigung des Gerätes führen. Es dürfen nur
die angegebenen Arten von Probenmaterial in einem Lauf miteinander
kombiniert werden.
Die folgenden Protokolle können für in-vitro-diagnostische Zwecke mit dem
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit verwendet werden.
Proben- und Elutionsvolumen können für jedes Protokoll im Softwaremenü
ausgewählt werden.
Protokollname
Probenmaterial
Elutions-
volumen1
DNA Blood LV
500 ␮l Vollblut
 Nicht mehr als 1 × 107
Blutzellen/ml verwenden
100 oder 200 ␮l
DNA Blood LV 1000* 1.000 ␮l Vollblut
100 oder 200 ␮l
DNA Blood ext lys LV 1.000 ␮l Lysat (aus 500 ␮l Vollblut) 100 oder 200 ␮l
Viral NA Plasma LV
500 ␮l EDTA-Plasma
50 oder 100 ␮l
Viral NA Plasma LV
1000*
1.000 ␮l EDTA-Plasma
50 oder 100 ␮l
Viral NA Plasma 
ext lys LV
1.000 ␮l Lysat (aus 500 ␮l 
Plasma oder Serum)
50 oder 100 ␮l
LV
500 ␮l Probe (wird für Citratplasma 50 oder 100 ␮l
und -serum empfohlen)
13
y Version 04,DE
TESTVERFAHREN
LV 1000*
1.000 ␮l Probe (wird für
Citratplasma und -serum
empfohlen)
Pathogen Universal2 500 ␮l Probe oder 500 ␮l Lysat
500
50 oder 100 ␮l
50 oder 100 ␮l
Pathogen Universal2 1.000 ␮l Probe oder 1.000 ␮l Lysat 50 oder 100 ␮l
1000*
DNA Cells LV
Bis zu 1 × 106 Zellen in Kultur,
resuspendiert in 200 ␮l PBS
100 oder 200 ␮l
DNA Tissue LV
Bis zu 25 mg homogenisiertes
Gewebe in einem Volumen von
200 μl
100 oder 200 ␮l
 100 μl werden
für Zellen in
Kultur mit
einem hohen
DNA-Gehalt
nicht
empfohlen.
 Bei
Verwendung
von mehr als
5 mg Gewebe
wird eine
Elution in
200 ␮l
empfohlen.
1 Die
Konzentration der Nukleinsäure im Eluat und die Sensitivität der
Downstream-Applikationen kann durch die Wahl eines niedrigen Elutionsvolumens
erhöht werden. Die Wirksamkeit der Elution und die Nukleinsäure-Gesamtausbeute ist
in diesem Fall jedoch u. U. niedriger als bei der Verwendung eines höheren
Elutionsvolumens.
2 Pathogen Universal-Protokolle dienen zur Isolierung von bakteriellen, von Pilzen
stammenden und viralen Nukleinsäuren aus vielen verschiedenen Probenmaterialien
menschlichen Ursprungs. Die Protokolle können direkt für 500 ␮l oder 1.000 ␮l
Probenmaterial oder für 500 ␮l oder 1.000 ␮l Lysat verwendet werden. Verwenden Sie
für flüssige Proben mit einem geringen Zellgehalt, wie z. B. Urin, ein Elutionsvolumen
von 50 μl.
 Bei Protokollen, die mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet sind, wird das
Probenvolumen in zwei Proben aufgeteilt und in zwei separaten Kavitäten
der MagNA Pure 96 Bearbeitungsplatte verarbeitet. Bei Verwendung einer
internen Kontrolle wird diese separat in jede Kavität zugegeben. Die
Gesamtmenge der internen Kontrolle, die zu jeder Probe zugegeben wird,
beträgt also nicht 20 ␮l, sondern 40 ␮l. Daher muss das Volumen der
internen Kontrolle, die in das Gerät geladen wird, verdoppelt werden.
Außerdem muss auch die Anzahl der Tests im Dialogfeld Edit Internal
Control Barcode verdoppelt werden. Bei einigen Applikationen muss die
interne Kontrolle u. U. verdünnt werden.
14
y Version 04, DE
TESTVERFAHREN
8.2
Probenmaterialien und Schritte zur Isolierungsvorbereitung
Die Proben dürfen nicht in einem größerem Volumen verarbeitet werden als
dem, für das das ausgewählte Aufreinigungsprotokoll vorgesehen ist, um bei
Downstream-Verfahren optimale Ergebnisse zu erzielen, insbesondere bei
Real-Time-PCR-Tests, z. B. unter Verwendung des LightCycler®
Analysesystems. Ansonsten wird der Isolierungsvorgang beeinträchtigt oder
es kann zu Verklumpungen oder Verlusten von magnetischen Glaspartikeln,
zur Kreuzkontamination der Proben oder sogar zur Beschädigung des Gerätes
kommen.
 Alle Proben sind als potenziell infektiös zu behandeln.
I. Vollblut
Frisches oder gefrorenes Vollblut kann ohne Vorbehandlung verwendet
werden.
 Wenn die Zellzahl des Blutes über 1 × 107 Blutzellen/ml liegt, verdünnen
Sie das Vollblut vor dem Gebrauch mit PBS, um eine Verklumpung zu
vermeiden.
 Stellen Sie sicher, dass sich in den antikoagulierten Vollblutproben keine
Gerinnsel gebildet haben.
II. Plasma/Serum
Frisches oder gefrorenes Plasma oder Serum kann ohne Vorbehandlung
verwendet werden.
 Wenn sich Präzipitate gebildet haben, zentrifugieren Sie die
10-ml-Röhrchen 10 Minuten lang bei 1.900 × g. Verwenden Sie als Probe
nur den Überstand.
III. Lysate (für externe Lyseprotokolle)
Vollblut, Plasma oder Serum in einer Mischung mit MagNA Pure 96 External
Lysis Buffer*.
 Vor der Verwendung muss das Reagenz MagNA Pure 96 External Lysis
Buffer* auf eine Temperatur von +15 bis +25 °C gebracht werden.
Geben Sie 500 ␮l Vollblut, Plasma oder Serum zu 500 ␮l MagNA Pure 96
External Lysis Buffer* und mischen Sie durch Pipettieren.
 Verwenden Sie 1.000 ␮l Lysat in Verbindung mit dem entsprechenden
externen Lyseprotokoll direkt oder lagern Sie es bis zur weiteren
Verarbeitung bei ⫺15 bis ⫺25 °C (DNA) oder ⫺60 bis ⫺80 °C (RNA).
 Wenn die Lysate im Gefrierschrank gelagert wurden, tauen Sie sie auf Eis
auf. Mischen Sie sie vor der Überführung in eine MagNA Pure 96
Bearbeitungsplatte gründlich, indem Sie sie dreimal 10 Sekunden lang auf
dem Vortexer mischen und kurz zentrifugieren.
15
y Version 04,DE
TESTVERFAHREN
IV. Verschiedene Probenmaterialien und Lysate für die Protokolle
Pathogen Universal 500 und 1000
Die Lyse von Bakterien kann in vielen verschiedenen Probenmaterialien
menschlichen Ursprungs durchgeführt werden. Für die Protokolle Pathogen
Universal 500 und 1000 sind u. U. die folgenden Probenmaterialien geeignet:
Urin, bronchoalveoläre Lavage (BAL), Sputum, Liquor cerebrospinalis (CSF),
Abstriche, Stuhl, Vollblut, Plasma, Serum und Bakterienkulturen.
 Aufgrund der großen Vielfalt der möglichen Probenmaterialien existiert
kein universell anwendbares Verfahren. Die Aufarbeitung von
zähflüssigen Proben (BAL, Sputum, Stuhl usw.) für die
Nukleinsäure-Isolierung richtet sich nach der Art des Probenmaterials, der
Viskosität der Probe sowie Art und Gehalt der Partikel.
 Alle Probenmaterialien, für die dieses Probenaufarbeitungsverfahren in
Verbindung
mit
einem
in-vitro-diagnostischen
DownstreamNukleinsäuretest zum Einsatz kommt, sind im Hinblick auf die einzelnen
IVD-Parameter zu evaluieren.
 Je nach Viskosität der Probe, Partikelart und -gehalt können die Proben
ohne Vorbehandlung verwendet werden.
16
y Version 04, DE
TESTVERFAHREN
Lyseprotokoll unter Verwendung von MagNA Pure 96 Bacterial Lysis
Buffer* (BLB)
햲
 Für sehr viskose, zellreiche Proben wie Sputum oder Stuhl darf kein
Probenaufgabevolumen von 1.000 μl verwendet werden.
Verflüssigung (optionaler Schritt für sehr viskose Proben, z. B. BAL
oder Sputum)
• Setzen Sie eine frische DTT (Dithiothreitol)-Stammlösung an (z. B.
5-fache Konz. = 0,75 %).
• Stellen Sie die endgültige DTT-Konzentration der Probe auf 0,15 %
ein, indem Sie DTT-Stammlösung zugeben.
• Inkubieren Sie die Probe und schütteln Sie sie dabei 30 Minuten
lang bei +37 °C und 850 U/min, bis sie sich leicht pipettieren lässt.
햳
Zugabe von BLB
• Geben Sie 250 ␮l (oder 500 ␮l) Bacterial Lysis Buffer zu 250 ␮l
(oder 500 ␮l) Probe hinzu und mischen Sie gründlich.
 Probenvolumina von weniger als 250 ␮l (oder 500 ␮l) füllen Sie mit
Bacterial Lysis Buffer auf ein Endvolumen von 500 ␮l (oder
1.000 ␮l) auf.
햴
Proteinase-K-Verdau
• Geben Sie 50 ␮l (oder 100 ␮l) Proteinase K zu 500 ␮l (oder 1.000 ␮l)
des Gemischs aus Probe und Bacterial Lysis Buffer hinzu und
mischen Sie gründlich.
• Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei +65 °C.
햵
Abkochen (bei schwierigen Probenmaterialien, wie z. B.
Sputum- oder Stuhlproben)
 Kochen Sie die Probe ab, um Krankheitserreger in der Probe zu
inaktivieren. Dadurch wird bei einigen Bakterien auch die Lyse der
Zellwände verbessert. Führen Sie diesen Schritt in
Reaktionsröhrchen mit Schraubverschluss durch, um ein
Verschütten von Flüssigkeit zu vermeiden.
 Bei der Isolierung von RNA wird der Abkochschritt ausgelassen, da
dieser die Integrität der RNA beeinträchtigen könnte.
• Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei +95 °C.
• Kühlen Sie die Proben auf Eis. Zentrifugieren Sie dann kurz, damit
sich das gesamte Probenvolumen unten im Röhrchen absetzt.
• Überführen Sie 500 ␮l (oder 1.000 ␮l) in eine MagNA Pure 96
Bearbeitungsplatte.
17
y Version 04,DE
TESTVERFAHREN
Vorbehandlung von Stuhlproben
햲
Suspendieren Sie eine erbsengroße Menge der Stuhlprobe in 550 ␮l
PBS.
 Zentrifugieren Sie 5 Sekunden lang bei 500 × g, um eine
Verstopfung der Reaktionsspitzen mit festen Partikeln zu
vermeiden.
 Bei der Isolierung von viraler RNA können Sie zum Suspendieren
von Stuhlproben auch eine Mischung (1:1) aus PBS und
STAR-Puffer verwenden, um das Risiko einer Inhibition zu
minimieren.
햳
Überführen Sie 250 ␮l Überstand in ein frisches
1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 250 ␮l Bacterial
Lysis Buffer und 50 ␮l Proteinase K zu.
햴
Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei +65 °C und schütteln
Sie sie währenddessen mit 850 U/min in einem Thermomixer.
Inkubieren Sie sie dann 10 Minuten lang bei +95 °C.
 Bei der Isolierung von RNA lassen Sie die Inkubation bei +95 °C
aus.
햵
Überführen Sie 500 ␮l Lysat in eine MagNA Pure 96
Bearbeitungsplatte.
Vorbehandlung von Abstrichen
18
햲
Suspendieren Sie einen trockenen Abstrichtupfer in 500 ␮l (oder
1.000 ␮l) Bacterial Lysis Buffer und geben Sie 50 μl (oder 100 ␮l)
Proteinase K zu. 
Für Abstrichtupfer in einem Transportmedium verwenden Sie 250 ␮l
(oder 500 ␮l) Transportmedium und geben 250 ␮l (oder 500 ␮l)
Bacterial Lysis Buffer und 50 ␮l (oder 100 ␮l) Proteinase K zu.
햳
Drücken Sie den Abstrichtupfer aus und verwerfen Sie ihn.
햴
Inkubieren Sie die flüssige Probe 10 Minuten lang bei +65 °C und
inkubieren Sie sie dann 10 Minuten lang bei +95 °C.
 Bei der Isolierung von RNA lassen Sie die Inkubation bei +95 °C
aus.
햵
Überführen Sie 500 ␮l (oder 1.000 ␮l) der flüssigen Probe in eine
MagNA Pure 96 Bearbeitungsplatte.
y Version 04, DE
TESTVERFAHREN
V. Zellen in Kultur
Es können Zellen in Kultur verwendet werden, die in 200 ␮l
phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert wurden.
Zur Isolierung von DNA aus Zellen, die in Suspension kultiviert wurden,
zentrifugieren Sie die Zellen in Kultur vorsichtig 5 Minuten lang bei 300 × g.
Waschen Sie das Zellpellet bei Bedarf mit PBS.
 Das Zellpellet kann bei ⫺15 bis ⫺25 °C gelagert werden. 
Entfernen Sie das Kulturmedium (oder die PBS) und resuspendieren Sie
die Zellen in kalter PBS, indem Sie pipettieren oder das Röhrchen
schütteln, bis das Zellpellet resuspendiert ist. 
Monolayer-Zellkulturen sind mittels Standardtrypsinierung nach der im
Folgenden beschriebenen Methode vorzubereiten. Dafür wird ein
Probenvolumen von 200 ␮l benötigt.
 Es dürfen höchstens 1 × 106 Zellen/200 ␮l verwendet werden, da
anderenfalls der Isolierungsvorgang beeinträchtigt wird.
VI. Frisch gefrorenes Gewebe
Als Probe können bis zu 25 mg frisch gefrorenes Gewebe verwendet werden,
nachdem es homogenisiert wurde.
Gewebehomogenisierung mittels Proteinase-K-Verdau
햲
Geben Sie max. 25 mg Gewebe in ein Reaktionsröhrchen, z. B. in ein
1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
햳
Geben Sie 180 ␮l MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer* und 20 ␮l
Proteinase K zur Gewebeprobe zu und mischen Sie.
햴
Inkubieren Sie sie bei +55 °C, bis das Gewebe vollständig aufgelöst ist
(in der Regel dauert dies drei Stunden bis zu einer Nacht).
 Diese Homogenisierungsmethode führt zu einer hohen
DNA-Ausbeute und schont die DNA.
Gewebehomogenisierung mit dem MagNA Lyser Instrument
햲
Überführen Sie max. 25 mg Gewebe in ein Röhrchen mit MagNA
Lyser Green Beads.
햳
Geben Sie 200 ␮l MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer zu.
햴
Homogenisieren Sie das Gewebe 30 bis 40 Sekunden lang im MagNA
Lyser Instrument. Wenn danach noch keine vollständige
Homogenisierung erzielt wurde, wiederholen Sie diesen Schritt.
 Diese Methode ist zwar schnell, die DNA kann jedoch wegen der
hohen Scherkräfte teilweise fragmentiert werden.
19
y Version 04,DE
TESTVERFAHREN
8.3
Qualitätskontrolle
 Führen Sie stets geeignete Kontrollen mit.
Damit der gesamte Prozess von der Probenaufarbeitung bis hin zur Analyse
effektiv überwacht wird, sind folgende Kontrollen durchzuführen:
• Positivkontrolle. Hier wird Probenmaterial verwendet, das die Zielsequenz
enthält.
• Negativkontrolle. Hier wird anstelle der Probe eine Phosphatpufferlösung
verwendet.
• Extraktionskontrolle. Hier wird Probenmaterial verwendet, das die
Zielsequenz nicht enthält.
• Interne Kontrolle (IC). Hier wird allen aufzureinigenden Proben eine
festgelegte Menge Kontroll-Template zugegeben.
 Bei Applikationen, bei denen die Gefahr falsch-negativer Ergebnisse
besteht, wie z. B. der Nachweis von Erregern, ist die Verwendung einer
geeigneten internen Kontrolle (IC) obligatorisch. Die IC wird während der
Nukleinsäure-Isolierung zugegeben, idealerweise unter Verwendung der
automatisierten IC-Funktion des MagNA Pure 96 Systems. Alternativ kann
die IC auch manuell zu den Proben zugegeben werden. In diesem Fall
muss die IC im Probenmaterial stabil sein, daher sollte zu diesem Zweck
keine auf Nuklease empfindliche IC, wie z. B. ungeschützte RNA,
verwendet werden.
Interne Kontrolle
Mit dem MagNA Pure 96 System kann vom MagNA Pure 96 Röhrchen für die
interne Kontrolle automatisch eine interne Kontrolle zu jeder Probe zugegeben
werden. Das Volumen der internen Kontrolle ist auf 20 ␮l pro Isolierung
festgelegt. Um mit dieser Funktion zu arbeiten, wählen Sie bei der Erstellung
einer Anforderung aus der Liste Internal Control eine interne Kontrolle aus.
Geben Sie das angegebene Volumen an interner Kontrolle zum Röhrchen für
die interne Kontrolle zu und positionieren Sie das Röhrchen auf der Plattform.
 Das erforderliche Volumen an interner Kontrolle ist infolge mechanischer
Beschränkungen größer als das Produkt aus der Anzahl der Proben (n)
und 20 ␮l (d. h. n x 20 ml):
Anzahl
Proben
8
Menge int.
Kontr. (␮l)
650 800 1000 1350
16
24
32
40
48
56
64
1500 1650 2300 2450
72
80
88
96
2600 2800 2950 3100
 Bei einigen 1.000-␮l-Protokollen wird das Probenvolumen in zwei Proben
aufgeteilt und in zwei separaten Kavitäten der MagNA Pure 96
Bearbeitungsplatte verarbeitet. Bei Verwendung einer internen Kontrolle
wird diese separat in jede Kavität zugegeben. Die Gesamtmenge der
internen Kontrolle, die zu jeder Probe zugegeben wird, beträgt also nicht
20 ␮l, sondern 40 ␮l. Daher müssen das Volumen der internen Kontrolle,
die in das Gerät geladen wird, und die Anzahl der Tests im Dialogfeld Edit
Internal Control Barcode verdoppelt werden.
20
y Version 04, DE
TESTVERFAHREN
8.4
Isolierung
 Die Validierung der Systemleistung für alle im Labor verwendeten
Verfahren obliegt dem Benutzer.
Das MagNA Pure 96 Instrument ist für die gleichzeitige Verarbeitung von 96
Proben vorgesehen. Wenn eine Anzahl von Proben verwendet wird, die kein
Vielfaches von 8 ist, werden die leeren Positionen vom Gerät aufgefüllt, bis das
nächste Vielfache von 8 erreicht ist.
Detaillierte Informationen zum Einrichten des Gerätes und zur Vorbereitung
eines Aufreinigungslaufs finden Sie im MagNA Pure 96 Schulungshandbuch
für Anwender (Softwareversion 2.0).
 Pipettieren Sie die Proben unten in die Kavitäten der Bearbeitungsplatte.
Achten Sie darauf, dass keine Tropfen des Probenmaterials an die
Seitenwände der Kavitäten gelangen. Verwenden Sie die Funktion zur
Probenüberführung, um die Proben automatisch in die Kavitäten einer
anderen Bearbeitungsplatte zu pipettieren. Auf diese Weise wird
verhindert, dass die Seitenwände der Kavitäten beim Überführen mit
Probenmaterial kontaminiert werden. Weitere Informationen hierzu finden
Sie im MagNA Pure 96 Benutzerhandbuch (Softwareversion 2.0).
 Achten Sie darauf, dass die Anweisungen bezüglich der Art und Menge
des Probenmaterials befolgt werden (siehe Abschnitt 8.2,
„Probenmaterialien und Schritte zur Isolierungsvorbereitung“). Die
Verwendung des falschen Probenmaterials oder der falschen Menge an
Probenmaterial kann Verklumpungen verursachen, die wiederum zu einer
geringen Ausbeute und Reinheit der Nukleinsäuren sowie zu einer
Kreuzkontamination und Inhibition von Downstream-Verfahren, wie z. B.
PCR und RT-PCR, führen können. Wässriges Probenmaterial, wie z. B.
Nukleinsäuren, die ohne biologischen Puffer in Wasser oder Flüssigkeiten
aufgelöst sind, kann zu einer unzureichenden Aufreinigung führen. Wir
empfehlen in diesem Fall die Zugabe von 10× PBS zur Herstellung einer
Endkonzentration von 1× PBS oder die Zugabe einer Trägernukleinsäure,
wie z. B. Poly-A-RNA.
 Wenn die Reagenzien bei Temperaturen unterhalb von +15 bis +25 °C
gelagert wurden, lassen Sie die Komponenten des Kits vor dem Gebrauch
mindestens eine Stunde lang bei +15 bis +25 °C äquilibrieren.
 Vergewissern Sie sich, dass alle Behälter korrekt in die Reagenztrays
eingesetzt wurden, bevor diese auf die Plattform gebracht werden.
 In einem Aufreinigungslauf können zwei Reagenzsets der gleichen
Charge verwendet werden. In diesem Fall sollten zwei Sets von externen
Kontrollen verwendet werden: ein Set für jedes Reagenzset.
21
y Version 04,DE
TESTVERFAHREN
8.5
Beenden eines Laufs
Untersuchen Sie das Gerät nach Abschluss eines Laufs gründlich auf
verschüttete Flüssigkeiten. Wenn Flüssigkeiten verschüttet wurden, reinigen
und dekontaminieren Sie das Gerät gemäß den Anweisungen im
Benutzerhandbuch des MagNA Pure 96 Systems.
 Reinigen und dekontaminieren Sie die Abdeckung des Abflusses für
Flüssigabfälle nach jedem Lauf gemäß den Anweisungen im
Schulungshandbuch für Anwender des MagNA Pure 96 Systems.
Verwenden Sie keinesfalls Natriumhypochloritlösung (Bleichlösung) oder
Säuren im ersten Reinigungsschritt, da diese in Kombination mit
Reagenzien, die Guanidinthiozyanat enthalten, hochgiftige Gase bilden
können.
 Rückstände von magnetischen Glaspartikeln in der Ausgabeplatte führen
nicht zu einer Beeinträchtigung der PCR- bzw. RT-PCR-Tests auf
LightCycler® Analysesystemen oder herkömmlichen Thermocyclern.
22
y Version 04, DE
GRENZEN DER METHODE UND STÖREINFLÜSSE
9.
GRENZEN DER METHODE UND STÖREINFLÜSSE
1. Zuverlässige Ergebnisse werden nur erzielt, wenn alle Vorgaben für Probengewinnung, Transport, Lagerung und Probenbearbeitung eingehalten
werden.
2. Dieses Produkt darf nur von Labormitarbeitern verwendet werden, die in der
Aufreinigung und Isolierung von Nukleinsäuren sowie in der Durchführung
von PCR-Methoden geschult wurden.
3. Wenn Entnahme, Transport, Lagerung oder Handhabung der Proben nicht
fachgerecht ausgeführt werden, kann dies zu falsch-negativen Ergebnissen
führen. Falsch-negative Ergebnisse können außerdem auftreten, wenn die
Anzahl der Organismen in der Probe zu gering ist.
4. Jede IVD-Applikation, für die dieses Probenaufarbeitungsverfahren in
Verbindung
mit
einem
in-vitro-diagnostischen
DownstreamNukleinsäuretest zum Einsatz kommt, ist im Hinblick auf die einzelnen
IVD-Parameter zu evaluieren.
5. Um das Risiko einer Beeinträchtigung der Ergebnisse auf ein Minimum zu
beschränken, müssen geeignete Kontrollen für Downstream-Applikationen
verwendet werden.
6. Die Lagerungsbedingungen (Temperatur, Zeiten) für Lysate,
Zellkulturpellets und Eluate sind hinsichtlich der einzelnen IVD-Parameter
zu validieren.
7. Das MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit und die
zugehörigen Reagenzien sind in Verbindung mit dem MagNA Pure 96
System zur Isolierung und Aufreinigung von Gesamtnukleinsäuren (DNA/
RNA) aus biologischen Proben biologischen Ursprungs für die
In-vitro-Diagnostik vorgesehen. Die Leistungsdaten sind insbesondere in
Bezug auf Downstream-Applikationen vom Benutzer zu validieren. Bei der
Auswertung der Ergebnisse müssen alle relevanten klinischen und
labortechnischen Daten berücksichtigt werden. Da sich die
Analytkonzentrationen von Probenmaterial zu Probenmaterial stark
unterscheiden können, sollten vor dem Beginn der Routine
Untersuchungen von Kreuzkontaminationen durchgeführt werden, z. B.
anhand so genannter Schachbrettmuster-Assays (hoch positive Proben
direkt neben negativen Proben).
23
y Version 04,DE
LEISTUNGSDATEN
10. LEISTUNGSDATEN
 MagNA Pure 96 Kits und die zugehörigen Reagenzien sind in Verbindung
mit dem MagNA Pure 96 System zur Isolierung und Aufreinigung von
Gesamtnukleinsäuren (DNA/RNA) aus Proben biologischen Ursprungs für
die In-vitro-Diagnostik vorgesehen. 
Im Folgenden sind repräsentative Leistungsdaten aufgeführt. Sie zeigen
die Leistung am Beispiel der gängigsten Probenmaterialien und dienen als
Nachweis für die extrem hohe Leistungsfähigkeit des Systems. Da sich die
erzielten Ergebnisse je nach Probe und Parameter unterscheiden können,
müssen geeignete Leistungsdaten vom Benutzer erhoben werden. Die
Ergebnisse müssen für diagnostische Zwecke stets in Verbindung mit der
jeweiligen Applikation und anderen Erkenntnissen betrachtet werden. 
Die
im
Folgenden
dargestellten
Leistungsdaten
für
die
Probenaufarbeitung mit dem MagNA Pure 96 Instrument wurden unter
Verwendung des MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume
Kit und des MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit
ermittelt.
10.1
Präzision der Aufreinigungseffizienz
Um die Präzision der Aufreinigungseffizienz zu bestimmen, wurde
genomische DNA aus Vollblut aufgereinigt. Ausbeute und Reinheit der
isolierten Nukleinsäure wurden anhand von OD-Messungen bestimmt. Die
Versuchsanordnung und die Ergebnisse sind im Folgenden beschrieben.
Art des Kits
Aufreinigungsprotokoll
DNA Blood SV
Probenmaterial
Vollblut (7,6 × 106 Leukozyten/ml)
Probenaufgabevolumen
200 ␮l
Elutionsvolumen
100 ␮l
Replikate pro Lauf
24
Tabelle 2: Versuchsanordnung zur Bestimmung von Ausbeute und Reinheit
Ausbeute (␮g)
VK (%)
OD 260/280
VK (%)
Lauf 1
5,6
3,9
1,9
2,5
Lauf 2
5,6
5,5
1,9
4,4
Lauf 3
5,5
6,5
1,9
1,8
Tabelle 3: Ergebnisse (Mittelwerte) für DNA-Ausbeute und -Reinheit bei genomischer,
aus Vollblut aufgereinigter DNA
 Die Ausbeute hängt in hohem Maße von der Zellzahl des Blutes ab und
kann sich daher von Spender zu Sender unterscheiden.
24
y Version 04, DE
LEISTUNGSDATEN
10.2
Analytische Leistung
Es wurde eine Real-Time-qPCR/RT-PCR mit dem LightCycler® 480
Analysesystem durchgeführt. Dabei wurden 5 ␮l Eluat in einem
PCR-Gesamtvolumen von 20 ␮l verwendet. Die Quantifizierungsstandards
und Kontrollproben wurden direkt vor dem Start der PCR zugegeben.
Parameter
Parvo-B19-Virus
Hepatitis-A-Virus (HAV)
Proben-
material
EDTA-Plasma mit Zusatz EDTA-Plasma mit Zusatz von Gepooltes Vollblut von
Hepatitis A-Virus
verschiedenen Spendern
von Parvo-B19-Virus
(7,6 × 106 Leukozyten/ml)
Zielsequenz
Parvo-B19-Virus aus
Roche-Beständen
Hepatitis-A-Virus aus
Roche-Beständen
Humane genomische
DNA
LightCycler® Parvo B19
Für die 
PCR verwen- Quantification Kit 
(nur bei Roche intern 
detes Kit
erhältlich)
LightCycler® Hepatitis A
(nur bei Roche intern 
erhältlich)
LightCycler® CycA Assay
(Roche-intern):
DNA MasterPLUS
HybProbe und
Cyclophilin-A-spezifische
Primer und Sonden
Eluatvolumen 5 ␮l
pro PCR
5 ␮l
5 ␮l
PCR-
Volumen
20 ␮l
20 ␮l
20 ␮l
PCR-
System
Analysesystem
Analysesystem
Analysesystem
Tabelle 4: Zusammenfassung der Tests, die zur Ermittlung der folgenden Leistungsdaten verwendet wurden
Linearitäts-
bereich und
Nachweisgrenze
(LOD)
Es wurden der Linearitätsbereich und die Nachweisgrenze (LOD = limit of
detection) bestimmt, die bei der automatisierten Nukleinsäureaufreinigung mit
MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid Kits in Verbindung mit dem
MagNA Pure 96 Instrument erreicht werden können. Für diese Bestimmung
wurden Parvo-B19- und Hepatitis-A-Viren aus eigenen Beständen (beide nur
bei Roche intern verfügbar) verwendet.
Die Versuchsanordnung zur Bestimmung des Linearitätsbereichs und der
Nachweisgrenze für die ausgewählten Parameter sowie die Ergebnisse sind
im Folgenden beschrieben.
25
y Version 04,DE
LEISTUNGSDATEN
Parameter
Parvo-B19-Virus
Art des Kits
LV Kit
NA LV Kit
Hepatitis-A-Virus
Aufreinigungsprotokoll
Probenmaterial
EDTA-Plasma
EDTA-Plasma
Probenaufgabevolumen
500 ␮l
500 ␮l
Elutionsvolumen
50 ␮l
50 ␮l
Verdünnungsreihen
8 verschiedene Virustiter 
2×101 bis 5×107 Kopien/ml
8 verschiedene Virustiter 
Datenpunkte insgesamt
172
176
Tabelle 5: Versuchsanordnung zur Bestimmung des Linearitätsbereichs und der Nachweisgrenze
Parameter
Parvo-B19-Virus
Hepatitis-A-Virus
Linearitätsbereich
2×102
Nachweisgrenze*
(LOD_95)
68 Kopien/ml
Konfidenzintervall: 
48 bis 156 Kopien/ml
bis
5×106
Kopien/ml
119 Kopien/ml
Konfidenzintervall: 
75 bis 279 Kopien/ml
Tabelle 6: Ergebnisse der Bestimmung von Linearitätsbereich und Nachweisgrenze
* Alle Daten wurden mittels Probit-Analyse statistisch ausgewertet. Die Nachweisgrenze wurde für das
95 %-Konfidenzintervall (LOD_95) berechnet.
 Sensitivität und Nachweisgrenze hängen in hohem Maße vom PCR-Test
ab.
26
y Version 04, DE
LEISTUNGSDATEN
Linearitäts-
bereich Parvo-B19-Virus
Abbildung 1: Linearitätsbereich bei Verwendung des Protokolls „Viral NA
Universal LV“ zur Aufreinigung des Parvo-B19-Virus aus EDTA-Plasma. Der
Linearitätsbereich beträgt für diese Applikation 2×102 bis 5×106 Kopien/ml. SVT/ml:
Spiked Virus Titer (Titer zugesetztes Virus)/ml, MVT/ml: Measured Virus Titer (Titer
gemessenes Virus)/ml.
Linearitäts-
bereich Hepatitis-A-Virus
(HAV)
Abbildung 2: Linearitätsbereich bei Verwendung des Protokolls „Viral NA
Universal LV“ zur Aufreinigung des Hepatitis-A-Virus aus EDTA-Plasma. Der
Linearitätsbereich beträgt für diese Applikation 3×103 bis 1×109 Kopien/ml. SVT/ml:
Spiked Virus Titer (Titer zugesetztes Virus)/ml, MVT/ml: Measured Virus Titer (Titer
gemessenes Virus)/ml.
27
y Version 04,DE
LEISTUNGSDATEN
Nachweisgrenze
für das
Parvo-B19-Virus
Abbildung 3: Nachweisgrenze für das Parvo-B19-Virus, die bei der
Aufreinigung einer Virusverdünnungsreihe aus EDTA-Plasma unter
Verwendung des Protokolls „Viral NA Universal LV“ bestimmt wurde. Die
Nachweisgrenze LOD_95 beträgt 68 Kopien/ml. Das zugehörige Konfidenzintervall liegt
bei 48 bis 156 Kopien/ml.
_____ Probit-Regression, - - - - untere Grenze (95 %), . . . . . . obere Grenze (95 %), o LOD_95.
Nachweisgrenze
für das
Hepatitis-A-Virus
(HAV)
Abbildung 4: Nachweisgrenze für das Hepatitis-A-Virus, die bei der
Aufreinigung einer Virusverdünnungsreihe aus EDTA-Plasma unter
Verwendung des Protokolls „Viral NA Universal LV“ bestimmt wurde. 
Die Nachweisgrenze LOD_95 beträgt 119 Kopien/ml. Das zugehörige
Konfidenzintervall liegt bei 75 bis 279 Kopien/ml. _____ Probit-Regression, - - - - untere
Grenze (95 %), . . . . . . obere Grenze (95 %), o LOD_95.
28
y Version 04, DE
LEISTUNGSDATEN
10.3
Präzisionsanalyse
Die Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten (VK) wurden für
Verdünnungsreihen innerhalb des Linearitätsbereichs anhand der folgenden
Parameter bestimmt: Parvo-B19-Virus, Hepatitis-A-Virus und Cyclophilin A.
Zur Bestimmung der Präzision innerhalb der Testreihe wurden alle Daten
eines einzelnen Laufs erfasst. Zur Bestimmung der Präzision zwischen den
Testreihen wurden drei Läufe von unterschiedlichen Anwendern auf
unterschiedlichen Systemen und in unterschiedlichen Laboren durchgeführt.
Die Präzision zwischen den Chargen wurde anhand sechs unterschiedlicher
Chargen bestimmt.
Die Versuchsanordnung zur Bestimmung der Präzision und die erzielten
Ergebnisse sind im Folgenden beschrieben.
Parameter
Parvo-B19-Virus
Art des Kits
Viral NA SV Kit
and Viral NA SV Kit
Hepatitis-A-Virus (HAV)
MagNA Pure 96 DNA
and Viral NA SV Kit
Aufreinigungs- Viral NA Universal SV Viral NA Universal SV
protokoll
DNA Blood SV
Probenmaterial EDTA-Plasma
EDTA-Plasma
Vollblut (7,6 × 106
Leukozyten/ml)
Probenaufgabe- 200 ␮l
volumen
200 ␮l
200 ␮l
Elutionsvolumen 50 ␮l
Verdünnungs-
reihen
1×103
50 ␮l
1×106
bis
Kopien/ml

1×103
100 ␮l
bis
1×106
Kopien/ml Keine
Replikate
8
8
24
Datenpunkte
LightCycler® 480
Analysesystem
Analysesystem
Analysesystem
Präzision 
innerhalb des
Laufs
32
32
24
Präzision 
zwischen den
Läufen
96
96
72
Präzision 
zwischen den
Chargen
160
160
144
Tabelle 7: Versuchsanordnung zur Bestimmung der Präzision
29
y Version 04,DE
LEISTUNGSDATEN
Parvo-B19-Virus
Konzentration (Kopien/ml)
Präzision innerhalb des Laufs
Mittelwert (Cp) SD (Cp)
VK (%)
1×
106
18,0
0,14
0,78
1×
105
21,5
0,21
1,00
1×
104
24,9
0,31
1,23
1 × 103
28,5
0,39
1,37
Parvo-B19-Virus
Präzision zwischen den Läufen
1×
106
18,2
0,34
1,89
1×
105
21,6
0,32
1,49
1 × 104
25,2
0,44
1,73
103
28,7
0,38
1,34
1×
Parvo-B19-Virus
Präzision zwischen den Chargen*
106
18,2
0,16
0,90
1 × 105
21,7
0,21
0,97
1×
104
25,1
0,39
1,55
1×
103
28,6
0,38
1,32
1×
Tabelle 8: Ergebnisse für Präzision innerhalb der Testreihe, Präzision zwischen den
Testreihen und Präzision zwischen den Chargen für EDTA-Plasma, das mit dem
Parvo-B19-Virus versetzt wurde
* Mittelwert über 6 verschiedene Chargen
Hepatitis-A-Virus
Konzentration (Kopien/ml)
Mittelwert
(Cp)
SD (Cp)
VK (%)
1 × 106
19,4
0,18
0,94
1×
105
23,0
0,28
1,23
1×
104
26,2
0,12
0,45
3
29,7
0,12
0,41
1 × 10
Hepatitis-A-Virus
1 × 106
19,4
0,26
1,33
5
22,9
0,21
0,92
1 × 10
30
y Version 04, DE
LEISTUNGSDATEN
1 × 104
26,2
0,12
0,45
103
29,6
0,32
1,07
1×
Hepatitis-A-Virus
106
19,7
0,22
1,10
1 × 105
23,1
0,15
0,67
1×
104
26,6
0,39
1,46
1×
103
30,0
0,26
0,87
1×
Testreihen und Präzision zwischen den Chargen für EDTA-Plasma, das mit dem
Hepatitis-A-Virus versetzt wurde
CycA-Assay
Referenzprobe
Mittelwert (Cp)
SD (Cp)
VK (%)
18,1
0,20
1,12
CycA-Assay
Referenzprobe
18,0
CycA-Assay
Referenzprobe
0,21
1,15
17,9
0,16
0,87
Testreihen und Präzision zwischen den Chargen für den CycA-Assay von DNA, die aus
Vollblut isoliert wurde
10.4
Störsubstanzen
Der Einfluss von Störsubstanzen wurde anhand von Probenmaterial
untersucht, das mit dem Parvo-B19-Virus versetzt wurde, und unter
Verwendung einer Verdünnungsreihe, die die folgenden häufig
anzutreffenden Substanzen in steigenden Konzentrationen enthielt:
Hämoglobin (Hemoglobin human von Sigma-Aldrich Co. LLC), Bilirubin
(Sigma-Aldrich Co. LLC) und Lipide (Intralipid 20 % emulsion, Sigma-Aldrich
Co. LLC).
Die Versuchsanordnung zur Bestimmung des Einflusses von Störsubstanzen
und die erzielten Ergebnisse sind im Folgenden beschrieben:
31
y Version 04,DE
LEISTUNGSDATEN
Parameter
Parvo-B19-Virus
Art des Kits
Aufreinigungsprotokoll Viral NA Universal SV
Probenmaterial
Vollblut
Probenaufgabevolumen 200 ␮l
Elutionsvolumen
50 ␮l
Viruskonzentration
1 × 105 Kopien/ml
Störsubstanzen
Hämoglobin, Bilirubin und Lipide in 
unterschiedlichen Konzentrationen
Replikate pro
Inhibitorkonzentration
3
Tabelle 11: Versuchsanordnung zur Bestimmung des Einflusses von Störsubstanzen
(Hämoglobin, Bilirubin und Lipide)
Ergebnisse
Hämoglobi
n (mg/dl)
Cp
Bilirubin (mg/dl)
Cp
Lipide (mg/dl) Cp
0
21,0
0
20,8
0
21,6
100
21,3
6,6
21,0
200
21,6
200
21,2
13,2
21,2
400
21,5
300
21,2
19,8
20,9
600
21,9
400
21,1
26,4
21,0
800
21,9
500
21,1
33,0
21,3
1000
21,8
600
21,0
39,5
21,4
1200
21,5
700
21,1
46,1
21,3
1400
21,6
800
21,3
52,8
21,0
1600
21,3
900
21,5
59,4
21,0
1800
21,2
1000
n.b.*
66,0
21,5
2000
21,1
Mittelwert
21,1
Mittelwert
20,8
Mittelwert
21,6
Tabelle 12: Schnittpunkt (Cp) für Proben, die mit den Störsubstanzen versetzt wurden
* infolge eines Pipettierfehlers nicht bestimmt
Bei keiner der Störsubstanzen war ein Einfluss auf die Schnittpunkte zu
verzeichnen. Der ermittelte Schnittpunktbereich ist a 0,8.
32
y Version 04, DE
LEISTUNGSDATEN
10.5
Untersuchung von Kreuzkontaminationen
Das Risiko von Kreuzkontaminationen wurde unter Verwendung des
Parvo-B19-Tests untersucht. Bei den ersten beiden Läufen wurden zum
Testen des MagNA Pure 96 Systems auf mögliche Kontaminationen
ausschließlich negative Proben verarbeitet. In drei Läufen wurde ein
Schachbrettmuster verarbeitet, bei dem positive und negative Proben
abwechselnd nebeneinander platziert waren. Im letzten Lauf wurden nur
negative Proben verarbeitet. Eine Probe wurde als negativ eingestuft, wenn
nach 45 PCR-Zyklen kein Signal detektiert wurde.
Die Versuchsanordnung zum Testen des MagNA Pure 96 Systems auf
mögliche Kontaminationen und die erzielten Ergebnisse sind im Folgenden
beschrieben.
Parameter
Parvo-B19-Virus
Art des Kits
Aufreinigungs-
protokoll
Probenaufgabe-
volumen
500 ␮l
Elutionsvolumen
50 ␮l
Positive Proben
5 × 107 Kopien/ml in EDTA-Plasma
Negative Proben
Negatives EDTA-Plasma
Anzahl der Läufe
A) 2 Läufe ausschließlich mit negativen Proben
B) 3 Läufe mit einem Schachbrettmuster
C) 1 Lauf ausschließlich mit negativen Proben
PCR-Analyse
LightCycler® Parvo B19 Quantification Kit mit
einer Platte mit 384 Kavitäten auf dem
LightCycler® 480 Analysesystem
Tabelle 13: Versuchsanordnung
Kreuzkontaminationen
zur
Untersuchung
des
Risikos
von
Lauf
Mittlerer Cp für 
positive Proben
Standardabweichu Positiv-treffer
ng
quote
Negativ-tr
efferquote
1
n.v.
n.v.
0/96
96/96
2
n.v.
n.v.
0/96
96/96
3
17,8
0,20
48/96
48/96
4
20,0
0,22
48/96
48/96
5
18,6
0,12
48/96
48/96
6
n.v.
n.v.
0/96
96/96
33
y Version 04,DE
LEISTUNGSDATEN
Tabelle 14: Ergebnisse der Kreuzkontaminationsuntersuchung auf der Grundlage der
Schnittpunkte und Trefferquoten
Wie die Daten in Tabelle 14 veranschaulichen, wurde unter den oben
beschriebenen Bedingungen keine Kreuzkontamination festgestellt.
10.6 Methodenvergleich
Nachweis von
Es wurde ein Methodenvergleich mit dem MagNA Pure 96 System
JAK2-Mutationen durchgeführt, bei dem Vollblutproben auf das Allel JAK2-V617F getestet
wurden. Bestimmt wurde dabei das Verhältnis zwischen Mutation und
Wildtyp. Die DNA wurde mit dem MagNA Pure 96 System und der bewährten
manuellen Methode des QIAamp DNA Blood Mini Kits isoliert. Die
PCR-Analyse wurde nach den Anweisungen des Herstellers mit dem JAK2
MutaQuant®Kit durchgeführt.
Parameter
Jak2 V617F
Art des Kits
Aufreinigungsprotokoll DNA Blood SV
Probenmaterial
Vollblut
Probenaufgabe-
volumen
200 ␮l
Elutionsvolumen
50 ␮l
Getestete Proben*
50
PCR-Analyse
JAK2 MutaQuant®Kit (MQPP-02-CE/
MQPP-03-CE), Ipsogen SA; 
Marseille auf dem Rotor-Gene 3000 Instrument
Vergleichsmethode
Probenaufarbeitung
(Elutionsvolumen: 85 μl)
Tabelle 15: Versuchsanordnung beim Testen von Vollblutproben auf das Allel
JAK2-V617F
* Fünfzig klinische Proben, die bei der Routinediagnostik übrig blieben, wurden
verblindet und parallel gemessen.
34
y Version 04, DE
LEISTUNGSDATEN
Vergleichsmethode
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 50 Proben
Negativ
Positiv auf
JAK2_V617F
Gesamt
Negativ
33
0
33
Positiv auf
JAK2_V617F
0
17
17
Gesamt
33
17
50
Tabelle 16: Bei dieser Analyse wurden insgesamt 50 Proben getestet. Die
Übereinstimmung zwischen der automatisierten MagNA Pure 96 Methode und der
manuellen Methode mit dem QIAamp DNA Blood Mini Kit betrug hinsichtlich der
Erkennung positiver und negativer Proben 100 %.
Abbildung 5: Der Methodenvergleich basierte auf dem endgültigen Verhältnis von
Mutation zu Wildtyp (WT) der Ergebnisse, die bei der Aufreinigung mit dem MagNA
Pure 96 DNA and Viral NA SV Kit einerseits und der Aufreinigung mit dem QIAamp
DNA Blood Mini Kit andererseits erzielt wurden.
………..
Identitätslinie, - - - - - Bablok-Regression (1,02x); Pearson r = 0,989
35
y Version 04,DE
LEISTUNGSDATEN
Pneumocystis-
jiroveci-DNA
Die mit dem MagNA Pure 96 System ermittelten Daten des
Methodenvergleichs wurden durch Tests von bronchoalveolären
Lavageproben auf Pneumocystis-jiroveci-DNA evaluiert.
Es kam die folgende Versuchsanordnung zum Einsatz:
Parameter
Pneumocystis-jiroveci-DNA
Art des Kits
Aufreinigungspro-
tokoll
Pathogen Universal LV
Probenmaterial
Bronchoalveoläre Lavage (BAL)
Probenaufgabe-
volumen
500 ␮l
Elutionsvolumen
100 ␮l
Getestete Proben*
96
PCR-Analyse**
Real-Time-qPCR-Test (Roche-intern) in
Verbindung mit LightCycler® FastStart DNA
Master HybProbe
LOD: <50 Kopien/Reaktion
Linearitätsbereich: 103 - 108 Kopien/ml
Proben > 104 Kopien/ml werden als positiv
eingestuft.
Vergleichsmethode
Probenaufarbeitung
Probenvolumen: 500 ␮l
Elutionsvolumen: 200 ␮l
Tabelle 17: Versuchsanordnung für den Test von bronchoalveolären Lavageproben auf
Pneumocystis-iroveci-DNA
* Sechsundneunzig klinische Proben, die bei der Routinediagnostik übrig blieben,
wurden verblindet und parallel gemessen.
** Der PCR-Test wurde vom Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene des
Universitätsklinikums Regensburg entwickelt und validiert.
36
y Version 04, DE
LEISTUNGSDATEN
Vergleichsmethode
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 96 Proben
Negativ
Positiv auf
P.-jiroveci-DNA
Gesamt
Negativ
70
1
71
Positiv auf
P.-jiroveci-DNA
0
25
25
Gesamt
70
26
96
Tabelle 18: Von den 96 Proben wurden insgesamt 26 Proben positiv getestet. Für die
Positivproben wurde bei 25 von 26 Proben (96 %) eine positive Übereinstimmung
gefunden. Für die Negativproben wurde bei 70 von 70 Proben (100 %) eine positive
Übereinstimmung gefunden.
Abbildung 6: Methodenvergleich für die positiven Proben auf der Basis der
Schnittpunkte, die in 2 aufeinander folgenden Läufen mit dem Pneumocystis
jiroveci-Real-Time-qPCR-Test (Roche-intern) gemessen wurden
…….. Identitätslinie, - - - - - Bablok-Regression (1,01x + 0,91); Pearson r = 0,9312 
(Lauf 1: ×) _______ Bablok-Regression (1,01x +1,07); Pearson r = 0,9304 (Lauf 2: o)
37
y Version 04,DE
ZUSATZINFORMATIONEN
11. ZUSATZINFORMATIONEN
11.1
Symbole
In diesem Dokument werden die folgenden Symbole verwendet, um Sie auf
wichtige Informationen hinzuweisen:
Symbol
Beschreibung

Wichtiger Hinweis

Hinweis
C
Für die In-vitro-Diagnostik
I
Bestellnummer
B
Chargenbezeichnung
s
Verwendbar bis
r
Temperaturbegrenzung (Aufbewahrung bei)
n
Vertrieb
t
Hersteller
)
Vor Sonnenlicht geschützt aufbewahren
(Außenverpackung von
Verbrauchsmaterialien)
2
11.2
Nur einmal verwenden (Außenverpackung
von Verbrauchsmaterialien)
v
Das Kit erfüllt die Anforderungen der
Richtlinie 98/79/EG für In-vitro-Diagnostika.
*
Von Roche Applied Science erhältlich
Änderungen gegenüber der Vorversion
Redaktionelle Änderungen
12. MARKEN
LIGHTCYCLER und MAGNA PURE sind Marken von Roche.
Alle anderen Produktnamen und Marken sind Eigentum ihrer jeweiligen
Inhaber.
13. LIZENZAUSSCHLUSS
Dieses Produkt ist unter Patenten lizenziert, die Eigentum von Qiagen sind.
38
y Version 04, DE
REGULATORISCHER HINWEIS/HAFTUNGSAUSSCHLUSS
14. REGULATORISCHER HINWEIS/HAFTUNGSAUSSCHLUSS
Für die In-vitro-Diagnostik
39
y Version 04,DE
v
Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116, 68305 Mannheim,
Deutschland, +49 621 7590
In Deutschland hergestellt
_________________________________________________________________
0512.06671934001➃
t
n Vertrieb in den USA über Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA
68298 Mannheim
Deutschland
C
y version 04
Indholdsversion: Maj 2012
Præfyldte reagenser til MagNA Pure 96-instrumentet. Dette kit anvendes til isolation af genomisk DNA og virusnukleinsyrer (NA) fra op til 1000 ␮l fuldblod,
plasma eller serum, eller fra op til 25 mg frisk frosset væv og fra op til 1×106 dyrkede celler samt til isolation af nukleinsyrer fra bakterier, svampe og virus fra op
til 1000 ␮l prøvemateriale af human oprindelse.
I 06 374 891 001
r opbevares ved ⫹15 til ⫹25°C
 Hold kittet væk fra lys.
 Hold kittet væk fra magneter.
Kit til 3 ⫻ 96 reaktioner
Table of Contents
1.
2.
3.
4.
TILSIGTET BRUG ............................................................................................................. 3
BESKRIVELSE AF KITTET ............................................................................................... 3
PRINCIP/OVERSIGT ........................................................................................................ 3
REAGENSER – ARBEJDSOPLØSNINGER .................................................................... 4
4.1
4.2
Antal test
Kit/indhold
5.
FORHOLDSREGLER OG ADVARSLER ......................................................................... 6
5.1
5.2
5.3
5.4
Forholdsregler
Sikkerhedsforanstaltninger for håndtering
Laboratorieprocedurer
Håndtering af affald
4
4
6
7
8
8
6.
OPBEVARING OG HOLDBARHED ................................................................................ 9
6.1
6.2
6.3
Kit og reagenser
Prøvetagning og opbevaring af prøvemateriale
Opbevaring af oprensede nukleinsyrer og eluater
9
9
10
7.
MATERIALER .................................................................................................................. 11
7.1
7.2
Leverede materialer
Nødvendige materialer og enheder, der ikke medfølger
11
11
8.
ANALYSEPROCEDURER .............................................................................................. 12
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
Oprensningsprotokoller
Prøvematerialer og præisolationstrin
Kvalitetskontrol
Isolationsprocedure
Afslutning på en kørsel
9.
10.
BEGRÆNSNINGER OG INTERFERENS ...................................................................... 20
PERFORMANCE-DATA ................................................................................................ 21
10.1
10.2
10.3
10.4
10.5
10.6
Præcision af oprensningseffektivitet
Analytisk performance
Præcisionsanalyse
Interfererende stoffer
Test for krydskontaminering
Metodesammenligning
12
13
17
18
19
21
22
25
28
29
31
11.
SUPPLERENDE OPLYSNINGER .................................................................................. 35
11.1
11.2
Symboler
Ændringer i forhold til tidligere version
12.
13.
14.
VAREMÆRKER .............................................................................................................. 35
LICENSFRASKRIVELSE ................................................................................................ 35
LOVGIVNINGSMÆSSIG FRASKRIVELSE .................................................................. 36
2
35
35
y version 04, DA
TILSIGTET BRUG
1.
TILSIGTET BRUG
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit er et reagenskit, der bruges sammen med MagNA Pure 96-systemet til isolation og oprensning af de
totale nukleinsyrer (DNA/RNA) fra biologiske prøver til in vitro-diagnostik.
Enhver IVD-applikation, der bruger prøveforberedelsesproceduren sammen
med efterfølgende IVD-nukleinsyretest, skal vurderes med hensyn til de
enkelte IVD-parametre.
2.
BESKRIVELSE AF KITTET
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit er specifikt udviklet til at
isolere:
• Nukleinsyrer fra op til 1000 ␮l fuldblod, plasma eller serum.
• Nukleinsyrer fra bakterier, svampe og virus fra op til 1000 ␮l prøvemateriale
eller lysat af human oprindelse.
• Nukleinsyrer fra op til 1×106 dyrkede celler.
• Nukleinsyrer fra op til 25 mg frisk frosset væv.
De isolerede nukleinsyrer overholder de kvalitetsstandarder, der kræves for
meget sensitive, kvantitative PCR/RT-PCR-analyser.
3.
PRINCIP/OVERSIGT
Proceduren til at isolere nukleinsyrer er baseret på MagNA Pure-teknologien
med magnetiske glaspartikler (MGP). 
De vigtigste trin i en MagNA Pure 96 NA-isolationsprocedure er:
1. Prøvemateriale lyseres, nukleinsyrer frigøres, og nukleaser denatureres.
2. Nukleinsyrer bindes til glasoverfladen på de tilsatte MGP'er på grund af de
kaotropiske saltforhold og den høje ioniske styrke i lyses-/bindingsbufferen.
3. MGP'er med bundne nukleinsyrer adskilles magnetisk fra den resterende
lyserede prøve.
4. Ubundne stoffer, som f.eks. proteiner, cellemateriale og PCR-inhibitorer,
fjernes ved flere vasketrin.
5. Oprensede nukleinsyrer elueres fra MGP'erne.
3
y version 04, DA
REAGENSER – ARBEJDSOPLØSNINGER
4.
4.1
Antal test
Kittet er udviklet til at udføre
• 3×96 isolationer af genomisk DNA og viral NA fra op til 500 ␮l fuldblod,
plasma, serum eller fra op til 1×106 dyrkede celler eller
• 3×96 isolationer af NA fra bakterier, svampe og virus fra 500 ␮l prøvemateriale af human oprindelse eller
• 3×96 isolationer fra op til 25 mg frisk frosset væv eller
• 3×48 isolationer fra 1000 ␮l fuldblod, plasma eller serum eller
• 3×48 isolationer af NA fra bakterier, svampe og virus fra 1000 ␮l prøvemateriale af human oprindelse
4.2
Kit/indhold
Komponent Mærkat
Bakke 1
Reagensbakke 1 3 bakker pr. kit
Beholder 1
Wash Buffer I
• 160 ml
• < 6 M guanidinhydrochlorid, 
• til fjernelse af urenheder
Beholder 2
Wash Buffer I
• 80 ml
• < 6 M guanidinhydrochlorid, 
Beholder 3
Lysis/Binding
Buffer
• 80 ml
• < 6 M guanidinthiocyanat, 
< 30 % Triton X-100, < 60 mM
Tris-HCl
• til celle-/viruslysering og binding af
nukleinsyrer
Bakke 2
Reagensbakke 2 3 bakker pr. kit
Beholder 1
4
Indhold/funktion
tom
Beholder 2
Proteinase K
• 15 ml
• 2 % proteinase K, 50 % glycerol
• til nedbrydning af proteiner
Beholder 3
Elution Buffer
• 80 ml
• < 60 mM Tris-HCl-buffer
• til eluering af nukleinsyre
y version 04, DA
Beholder 4
Wash Buffer III
• 160 ml
• < 20 mM Na-acetatbuffer
Flaske 1
Magnetic Glass 
Particles
• 6 flasker, 18 ml hver
• MGP-suspension med isopropanol
• til binding af nukleinsyrer
 MagNA Pure 96-systemvæske (intern/ekstern)* fungerer som Wash Buf-
fer II til dette kit.
 Alle kit-komponenter er klar til brug.
5
y version 04, DA
FORHOLDSREGLER OG ADVARSLER
5.
5.1
Forholdsregler
 Flere buffere i MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit inde-
holder farlige eller skadelige forbindelser. Se detaljerede oplysninger i
figur 1 (reagensbakke 1), figur 2 (reagensbakke 2) og tabel 1. Disse reagenser må ikke komme i kontakt med huden, øjnene eller slimhinderne.
Ved kontakt skylles det berørte område straks med store mængder vand.
Hvis reagenserne spildes, skal de fortyndes med vand, før de tørres op.
 Reagenser, der indeholder guanidinthiocyanat, må ikke blandes med
natriumhypochloritopløsning (blegemiddel) eller syre. Disse blandinger
kan udvikle en meget giftig gas. Denne forholdsregel skal man især være
opmærksom på, når man rengør MagNA Pure 96-wastecover'et.
Fig. 1: Reagensbakke 1
Komponent Mærkat
6
Fig. 2: Reagensbakke 2
Farlige og skadelige 
forbindelser
Bakke 1
Reagensbakke 1
Beholder 1
Wash Buffer I
• guanidinhydrochlorid
• ethanol
Beholder 2
Wash Buffer I
• guanidinhydrochlorid
• ethanol
Beholder 3
• guanidinthiocyanat
y version 04, DA
Bakke 2
Reagensbakke 2
Beholder 1
Tom
Beholder 2
Proteinase K
Beholder 3
Elution Buffer
Beholder 4
Wash Buffer III
Flaske 1
Magnetiske glaspartik- • isopropanol
ler 
(MGP)
• proteinase K
Tabel 1: Reagensliste over farlige og skadelige forbindelser
5.2
Sikkerhedsforanstaltninger for håndtering
• Brug engangshandsker, og skift dem jævnligt.
• Brug ikke kittet efter udløbsdatoen.
For at minimere risikoen for krydskontaminering, hvilket kan medføre
falsk-positive resultater, skal man desuden følge disse retningslinjer:
• Udfør prøveforberedelse, PCR/RT-PCR-opsætning og PCR/RT-PCR på
adskilte steder.
• Bortskaf pipettespidser i forseglede beholdere for at forebygge luftbåren
kontaminering.
Nukleasekontaminerede reagenser og reaktionsrør vil nedbryde template-NA.
Følg disse retningslinjer for at minimere risikoen for kontaminering:
• Undgå at røre ved overflader eller materialer, der kan medføre nukleasekontaminering.
• Brug kun de reagenser, der medfølger i dette kit. Erstatninger kan indeholde
nukleaser.
• Rengør og dekontaminer arbejdsområder og instrumenter, herunder pipettespidser, med kommercielt tilgængelige dekontamineringsreagenser.
• Brug kun nye nukleasefrie aerosolblokerende pipettespidser og mikrocentrifugerør.
• Brug et arbejdsområde, der er specifikt indrettet til RNA-arbejde. Brug om
muligt reaktionsrør og pipettespidser, der kun er beregnet til arbejde med
template-RNA.
7
y version 04, DA
5.3
• Alt materiale af human oprindelse og alt resulterende affald skal håndteres
som potentielt smittefarligt. Rengør og desinficer alle arbejdsoverflader grundigt med desinfektionsmidler, der anbefales af de lokale myndigheder.
• Da sensitiviteten og titeren i potentielle patogener i prøvematerialet kan variere, skal brugeren optimere patogeninaktiveringen og tage de nødvendige
forholdsregler i overensstemmelse med gældende sikkerhedsbestemmelser.
• Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområde.
• Man må ikke pipettere med munden.
• Brug engangsbeskyttelseshandsker, laboratoriekittel og beskyttelsesbriller
ved håndtering af prøver og kit-reagenser.
• Undgå bakterie- og nukleasekontaminering af reagenser ved fjernelse af alikvoter fra reagensflasker. Brug sterile engangspipettespidser.
• Vask hænderne grundigt efter håndtering af prøver og kit-reagenser.
5.4
Håndtering af affald
• Sikkerhedsdatablade (MSDS) fås online på 
www.e-labdoc.roche.com eller ved bestilling fra det lokale Roche-kontor.
• Ubrugte reagenser og affald skal bortskaffes i overensstemmelse med gældende nationale, regionale og lokale regler.
• Brug engangsbeskyttelseshandsker, laboratoriekittel og beskyttelsesbriller
ved bortskaffelse af prøver og kit-reagenser.
• For at bortskaffe reagenserne fra beholderne skal man følge nedenstående
procedure:
1. Prik hul i hjørnet i folien på en af beholderne i reagensbakken med en
solid engangspipette i plastik, som f.eks. en pipette til cellekultur.
2. Fold folien tilbage, og bortskaf væsken i en beholder, der er beregnet til
affald.
3. Gentag trin 1 og 2, indtil alle beholdere er tomme.
8
y version 04, DA
OPBEVARING OG HOLDBARHED
6.
6.1
Kit og reagenser
• Kittet leveres ved den omgivende temperatur.
• Kit-komponenterne er holdbare ved +15 til +25°C indtil den udløbsdato, der
er angivet på mærkaten.
 Hold kittet væk fra lys og magneter.
• Reagenser kan opbevares i 32 timer ved +15 til +25°C på arbejdsområdet i
MagNA Pure 96-instrumentet.
• Ét sæt reagensbakker (bakke 1 og bakke 2) kan anvendes til op til fire individuelle kørsler. Når de er åbnet, kan reagensbakkerne anvendes til yderligere
kørsler på det samme MagNA Pure 96-instrument inden for 28 dage med
korrekt forsegling med MagNA Pure 96-forseglingsfolien* og opbevaring ved
+2 til +8°C. Lad kit-komponenterne stå ved en temperatur på +15 til +25°C
i en time før brug.
 Det er kun muligt at genbruge delvist brugte reagensbakker på det
samme MagNA Pure 96-instrument. MagNA Pure 96-softwaren i hvert
instrument registrerer reagenslageret ved hjælp af reagensstregkoder, og
genkender derved delvist brugte reagenser og pipettespidsbakker, dette
sikrer korrekt brug i næste kørsel.
 Hvis reagensbakkerne ikke er korrekt forseglet, kan der opstå fordampning. Forkerte opbevaringsforhold kan påvirke isolationsprocessen negativt.
6.2
Prøvetagning og opbevaring af prøvemateriale
Ved sensitiv detektion af nukleinsyrer er det vigtigt at sikre korrekt opbevaring
af prøverne (⫺15 til ⫺25°C for DNA eller ⫺60 til ⫺80°C for RNA). DNA eller
RNA kan nedbrydes, hvis prøverne ikke opbevares korrekt.
 Brug ikke plasma eller blod, der indeholder heparin.
 Brug ikke prøvemateriale, der har været opbevaret i længere tid ved højere
temperaturer.
 Hvis prøverne har været opbevaret i frossen tilstand, skal man optø dem
under let omrystning f.eks. ved hjælp af en laboratorieprøvevender.
9
y version 04, DA
6.3
Opbevaring af oprensede nukleinsyrer og eluater
For at sikre længst mulig holdbarhed i de eluerede nukleinsyrer skal man
straks gå videre med PCR-/RT-PCR-opsætningen. Opbevar ikke de eluerede
nukleinsyrer i MagNA Pure 96-arbejdsområdet.
Ved opbevaring skal man lukke output-pladen med en MagNA Pure 96-forseglingsfolie* og opbevare den ved ⫺15 til ⫺25°C for DNA eller ⫺60 til ⫺80°C
for RNA. Opbevar de oprensede nukleinsyrer i alikvoter for at undgå gentagen
nedfrysning og optøning.
Ved opbevaring af output-plader, der indeholder eluater, uden for MagNA
Pure 96-instrumentet skal man forsegle pladerne med en MagNA Pure 96-forseglingsfolie*.
 For yderligere behandling skal forseglingsfolien fjernes. Forseglingsfolien
må ikke fjernes for hurtigt, da dette kan medføre krydskontaminering ved
at danne aerosoler og kontaminering fra brønd til brønd.
 Hvis eluaterne har været opbevaret i frossen tilstand, skal man blande dem
forsigtigt efter optøning ved at pipettere op og ned ti gange, før man udfører downstream trin, som f.eks. PCR-/RT-PCR- eller OD-målinger. Blandingsvolumen skal være mindst det halve af elueringsvolumen. Hvis
nukleinsyrer ikke blandes på forhånd og distribueres jævnt/homogent i
opløsningen, bliver resultaterne måske ikke reproducerbare i efterfølgende analyser.
 Ved opbevaring i længere tid anbefales det at overføre eluaterne til en
arkiveringsplade.
10
y version 04, DA
MATERIALER
7.
MATERIALER
7.1
Leverede materialer
Se afsnit 4: Reagenser og arbejdsopløsninger
7.2
Nødvendige materialer og enheder, der ikke medfølger
• MagNA Pure 96 Instrument (-instrumentet) (kat.-nr. 06 541 089 001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (Internal) (intern systemvæske) (kat.-nr. 06 430
112 001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (External) (ekstern systemvæske) (kat.-nr. 06
640 729 001)
• MagNA Pure 96 Filter Tips (1000 μl) (filterpipettespidser) (kat.-nr. 06 241 620
001)
• MagNA Pure 96 Processing Cartridge (behandlingskassette) (kat.-nr. 06 241
603 001)
• MagNA Pure 96 Output Plate (output-plade) (kat.-nr. 06 241 611 001)
• MagNA Pure 96 Internal Control Tube (rør til intern kontrol) (kat.-nr. 06 374
905 001)
• MagNA Pure 96 Sealing Foil (forseglingsfolie) (kat.-nr. 06 241 638 001)
• Valgfrie reagenser:
• MagNA Pure 96 External Lysis Buffer (kat.-nr. 06 374 913 001)
• MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer (til isolation af nukleinsyrer fra bakterier, svampe og virus ved hjælp af Pathogen Universal-protokollen, hvis
der kræves ekstern lysering) (kat.-nr. 06 374 921 001)
• MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer (kat.-nr. 06 640 702 001)
• Proteinase K, PCR-kvalitet, aktivitet (+37°C) b 0,6 U/␮l 
(f.eks. kat.-nr. 03 115 828 001)
• Valgfrit MagNA Lyser Instrument (kat.-nr. 003 358 968 001 som i 
SN 40467540, kat.-nr. 03 358 976 001 som i SN 40405218)
• Valgfrie MagNA Lyser Green Beads (kat.-nr. 03 358 941 001)
• Standardlaboratorieudstyr
• Pipetter og nukleasefrie aerosolresistente pipettespidser, som f.eks. ekstra
lange pipettespidser på 10 cm, til prædispensering af prøver i MagNA
Pure 96-processing cartridge'en.
• Valgfrit: centrifuge til rør.
11
y version 04, DA
ANALYSEPROCEDURER
8.
ANALYSEPROCEDURER
8.1
Der findes forskellige oprensningsprotokoller til MagNA Pure 96-instrumentet
til nukleinsyreisolation med MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume
Kit. Hver protokol er optimeret for specifikke prøvematerialer.
 Kør kun protokoller med angivne prøvematerialer, ellers kan det påvirke
isolationsprocessen negativt. Forkert brug kan medføre klumper og tab af
MGP'er, krydskontaminering af prøver eller endda beskadigelse af instrumentet. Kun de angivne typer prøvemateriale kan kombineres i den
samme kørsel.
Til in vitro-diagnostik kan de følgende protokoller bruges i forbindelse med
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit. For hver protokol kan
prøvevolumen og elueringsvolumen vælges fra softwaremenuen.
Protokolnavn
Prøvemateriale
Elueringsvolum
en1
DNA Blood LV
500 ␮l fuldblod
100 eller 200 ␮l
 Brug ikke mere end 1×107 blodceller/ml.
DNA Blood LV 1000* 1.000 ␮l fuldblod
100 eller 200 ␮l
7
DNA Blood ext lys LV 1.000 ␮l lysat (fra 500 ␮l fuldblod) 100 eller 200 ␮l
Viral NA Plasma LV
500 ␮l EDTA-plasma
50 eller 100 ␮l
Viral NA Plasma LV
1000*
1.000 ␮l EDTA-plasma
50 eller 100 ␮l
Viral NA Plasma 
ext lys LV
1.000 ␮l lysat (fra 500 ␮l 
plasma eller serum)
50 eller 100 ␮l
LV
500 ␮l prøve (anbefales 
til citratplasma og serum)
50 eller 100 ␮l
LV 1000*
1.000 ␮l prøve (anbefales 
til citratplasma og serum)
50 eller 100 ␮l
Pathogen Universal2 500 ␮l prøve eller 500 ␮l lysat
500
12
50 eller 100 ␮l
y version 04, DA
ANALYSEPROCEDURER
Pathogen Universal2 1.000 ␮l prøve eller 1.000 ␮l lysat
1000*
DNA Cells LV
50 eller 100 ␮l
Op til 1×106 dyrkede celler resus- 100 eller 200 ␮l
penderet i 200 ␮l PBS
 100 μl anbefa-
les ikke til dyrkede celler
med et højt
DNA-indhold
DNA Tissue LV
Op til 25 mg homogeniseret 
væv i en volumen på 200 μl
100 eller 200 ␮l
 Ved brug af
mere end 5 mg
væv anbefales
det at eluere i
200 ␮l
1 Koncentrationen
af nukleinsyrer i eluatet og sensitiviteten i efterfølgende applikationer
kan øges ved at vælge en lav elueringsvolumen. Elueringseffektiviteten og det overordnede nukleinsyreudbytte kan dog være lavere sammenlignet med udbyttet af en
højere elueringsvolumen.
2
Pathogen Universal-protokollerne er beregnet til isolation af nukleinsyrer fra bakterier,
svampe og virus fra mange forskellige prøvetyper af human oprindelse. Protokollerne
kan anvendes direkte til 500 ␮l eller 1000 ␮l prøvemateriale eller til 500 ␮l eller
1000 ␮l lysat. Brug en elueringsvolumen på 50 μl til flydende prøver med lavt celleindhold, som f.eks. urin.
 For protokoller, der er markeret med en stjerne (*), opdeles prøvevolumen
for at generere to prøver og behandles i to separate brønde i MagNA Pure
96-processing cartridge'en. Når en intern kontrol anvendes, tilsættes en
intern kontrol separat til hver brønd. Dette betyder, at den samlede
mængde af intern kontrol, der tilsættes pr. prøve, er 40 ␮l i stedet for 20 ␮l.
Derfor fyldes instrumentet med den dobbelte volumen af den interne kontrol. Derudover skal antallet af „Tests“ i dialogboksen „Edit Internal Control
Barcode“ fordobles. I nogle applikationer kan det være nødvendigt at fortynde den interne kontrol.
8.2
Prøvematerialer og præisolationstrin
For at opnå optimale resultater i de efterfølgende procedurer især i
real-time-RT-PCR-analyser, f.eks. ved hjælp af LightCycler®-instrumenterne,
må man ikke ekstrahere prøver med højere volumen, end den valgte oprensningsprotokol er udviklet til at håndtere. Hvis man gør det, vil det påvirke isolationsprocessen, og det kan medføre klumper og tab af MGP'er,
krydskontaminering af prøver eller endda beskadigelse af instrumentet.
 Alle prøver skal behandles som potentielt smittefarlige.
I. Fuldblod
Frisk eller frosset fuldblod kan anvendes uden nogen forbehandling.
 Hvis antallet af blodceller er over 1×107 blodceller/ml, skal man fortynde
fuldblodet med PBS før brug for at undgå klumper.
13
y version 04, DA
ANALYSEPROCEDURER
 Sørg for, at der ikke er nogen klumper i de antikoagulerede fuldblodsprø-
ver.
II. Plasma/serum
Frisk eller frosset plasma eller serum kan anvendes uden nogen forbehandling.
 Hvis der er dannet bundfald, skal man udføre et centrifugeringstrin i 10
min. ved 1900×g for 10 ml-rør. Brug kun supernatanten som prøve.
III. Lysater (til eksterne lyseringsprotokoller)
Fuldblod, plasma eller serum blandet med MagNA Pure 96 External Lysis Buffer*.
 Sørg for, at MagNA Pure 96 External Lysis Buffer* har en temperatur på
+15 til +25°C før brug.
Tilsæt 500 ␮l fuldblod, plasma eller serum til 500 ␮l MagNA Pure 96 External
Lysis Buffer*, og bland ved pipettering.
 Brug 1000 ␮l lysat direkte sammen med den pågældende eksterne lyseringsprotokol, eller opbevar det ved ⫺15 til ⫺25°C for DNA eller ⫺60 til
⫺80°C for RNA indtil yderligere behandling.
 Når lysater har været opbevaret i frossen tilstand, skal de optøs på is. Før
overførsel til en MagNA Pure 96-processing cartridge skal de blandes
grundigt i en vortexmixer tre gange i 10 sek. og centrifugeres kort.
IV. Forskellige prøvematerialer og lysater til Pathogen Universal 500og 1000-protokoller
Lysering af bakterier i mange forskellige typer af human oprindelse kan udføres. Følgende prøvematerialer kan være egnede til Pathogen Universal 500- og
1000-protokoller: urin, bronkoalveolær skyllevæske (BAL), sputum, cerebrospinalvæske (CSV), podninger, fæces, fuldblod, plasma, serum og bakteriekulturer.
 På grund af den store variation af prøvematerialer er det ikke muligt at
udarbejde en enkelt universelt anvendelig procedure. Klargørelsen af en
halvt-flydende prøve (BAL, sputum, fæces osv.) til isolation af nukleinsyrer
afhænger af typen af prøvemateriale, prøveviskositeten, partikeltypen og
indholdet.
 Ethvert prøvemateriale fra denne prøveforberedelsesprocedure sammen
med efterfølgende IVD-nukleinsyretest skal valideres med hensyn til de
 Afhængigt af prøveviskositeten samt partikeltypen og indholdet kan prøverne bruges uden forbehandling.
14
y version 04, DA
ANALYSEPROCEDURER
Lyseringsprotokol med MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer* (BLB)
햲
 Brug ikke 1000 μl prøveinputvolumen til meget tyktflydende og cel-
lerige prøver, som f.eks. sputum eller fæces.
Flydendegørelse (valgfrit trin for meget tyktflydende prøver, f.eks. BAL
eller sputum)
• Forbered en frisk DTT-stock-opløsning (dithiothreitol) (f.eks. 5×
konc. = 0,75 %).
• Juster den endelige DTT-koncentration i prøven til 0,15 % ved at tilsætte DTT-stock-opløsning.
• Inkuber prøven, mens den oprystes ved 850 rpm i 30 min. ved
+37°C, indtil den let kan pipetteres.
햳
Tilsætning af BLB
• Tilsæt 250 ␮l (eller 500 ␮l) BLB til 250 ␮l (eller 500 ␮l) prøve, og
bland det grundigt.
 Hvis prøvevolumen er mindre end 250 ␮l (eller 500 ␮l), skal man
tilsætte BLB for at få en slutvolumen på 500 ␮l (eller 1000 ␮l).
햴
Proteinase K-nedbrydning
• Tilsæt 50 ␮l (eller 100 ␮l) proteinase K til 500 ␮l (eller 1000 ␮l)
prøve/BLB-blanding, og bland det grundigt.
• Inkuber i 10 min. ved +65°C.
햵
Kogning (for svære prøvematerialer, som f.eks. sputum- eller
fæcesprøver)
 Udfør kogningstrin for at inaktivere patogene organismer i prøven.
Dette kan også forstærke lyseringen af cellevægge hos nogle bakteriearter. For at forhindre lækage skal man udføre dette trin i reaktionsrør med skruelåg.
 Ved isolation af RNA skal man udelade kogetrinnet, da dette kan
påvirke integriteten af RNA negativt.
• Inkuber prøverne ved +95°C i 10 min.
• Afkøl prøverne på is. Derefter skal de centrifugeres kortvarigt for at
opsamle hele prøvevolumen i bunden af røret.
• Overfør 500 ␮l (eller 1000 ␮l) til en MagNA Pure 96-processing
cartridge.
15
y version 04, DA
ANALYSEPROCEDURER
Forbehandling af fæcesprøver
햲
Brug en mængde fæcesprøve på størrelse med en ært, og suspendér
den i 550 ␮l PBS.
 For at undgå at tilstoppe reaktionspipettespidser med faste partikler skal man centrifugere i 5 sek. ved 500 × g.
 Til isolationen af viral RNA kan man bruge en PBS-/STAR-bufferblanding (blandingsforhold 1:1) som et alternativ til at suspendere
fæcesprøver for at reducere en mulig hæmning.
햳
Overfør 250 ␮l supernatant til et frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør; tilsæt
250 ␮l BLB og 50 ␮l proteinase K.
햴
Inkuber i 10 min. ved +65°C, mens der omrystes ved 850 rpm i en
thermomixer, efterfulgt af 10 min. inkubation ved +95°C.
 Ved isolation af RNA skal man udelade inkubation ved +95°C.
햵
Overfør 500 ␮l lysat til en MagNA Pure 96-processing cartridge.
Forbehandling af podninger
햲
Suspendér en tør podning i 500 ␮l (eller 1000 ␮l) BLB, tilsæt 50 μl
(eller 100 ␮l) proteinase K. 
For podninger i et transportmedium skal man bruge 250 ␮l (eller 500
␮l) transportmedium og tilsætte 250 ␮l (eller 500 ␮l) BLB og 50 ␮l
(eller 100 ␮l) proteinase K.
햳
Klem og fjern podningen.
햴
Inkuber væskeprøven ved +65°C i 10 min., efterfulgt af 10 min. inkubation ved +95°C.
 Ved isolation af RNA skal man udelade inkubation ved +95°C.
햵
Overfør 500 ␮l (eller 1000 ␮l) væskeprøve til en MagNA Pure 96-processing cartridge.
V. Dyrkede celler
Dyrkede celler resuspenderet i 200 ␮l fosfatbufferet saltvand (PBS) kan
anvendes.
Ved DNA-isolation fra dyrkede celler, der er dyrket i en resuspension, skal
man forsigtigt centrifugere de dyrkede celler i 5 min. ved 300 × g. Om nødvendigt skal man vaske cellepelleten i PBS.
 Cellepelleten kan opbevares ved ⫺15 til ⫺25°C. 
Fjern dyrkningsmediet (eller PBS), og resuspendér cellerne i kold PBS ved
at pipettere eller omryste røret, indtil cellepelleten er resuspenderet. 
16
y version 04, DA
ANALYSEPROCEDURER
Dyrkede celler i enkeltlag skal opsamles med standardtrypsinbehandling
ved hjælp af den procedure, der er beskrevet ovenfor. Den nødvendige
prøvevolumen er 200 ␮l.
 Brug ikke mere end 1×106 celler/200 ␮l, da isolationsprocessen ellers vil
blive påvirket negativt.
VI. Frisk frosset væv
Op til 25 mg frisk frossen vævsprøve kan anvendes efter homogenisering.
Vævshomogenisering med proteinase K-nedbrydning
햲
Tilsæt op til 25 mg vævsprøve i et reaktionsrør, som f.eks. et 1,5 ml
centrifugeringsrør.
햳
Tilsæt 180 ␮l MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer* og 20 ␮l proteinase K til vævsprøven, og bland det derefter.
햴
Inkuber ved +55°C, indtil vævet er helt opløst (som regel tre timer til
natten over).
 Denne homogeniseringsmetode medfører et stort DNA-udbytte
med en høj integritet.
Vævshomogenisering ved hjælp af MagNA Lyser-instrumentet
8.3
햲
Overfør op til 25 mg vævsprøve til et MagNA Lyser Green Beads-rør.
햳
Tilsæt 200 ␮l MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer.
햴
Homogeniser vævet i MagNA Lyser-instrumentet i 30 til 40 sekunder.
Hvis homogeniseringen endnu ikke er komplet, skal man gentage
dette trin.
 Denne metode er hurtig, men på grund af mekanisk fragmentering
kan DNA'et blive delvist nedbrudt.
Kvalitetskontrol
 Udfør altid relevante kontroller.
For at kontrollere den komplette proces skal man fra start af prøveforberedelse til analyse udføre følgende kontroller:
• Positiv kontrol, anvend prøvemateriale, der er positivt for target.
• Negativ kontrol, anvend PBS i stedet for prøven.
• Ekstraktionskontrol, anvend prøvemateriale, der er negativt for target.
• Intern kontrol (IC), anvend ved at tilsætte en angiven mængde af en kontrol-template til alle de prøver, der skal oprenses.
 Ved applikationer, der kan give falsk-negative resultater, som f.eks. detektionen af patogener, er brugen af en relevant intern kontrol (IC) påkrævet.
17
y version 04, DA
ANALYSEPROCEDURER
IC tilsættes under nukleinsyreisolation, helst ved hjælp af den automatiserede IC-funktion i MagNA Pure 96-systemet. IC'en kan også tilsættes
manuelt til prøven. I dette tilfælde skal IC'en være stabil i prøvematerialet,
og en nuklease-sensitiv IC, som f.eks. ubeskyttet RNA, må ikke anvendes
til dette formål.
Intern kontrol
Antal prøver
MagNA Pure 96-systemet kan også automatisk tilsætte en intern kontrol (IC)
til hver prøve fra MagNA Pure 96-systemets interne kontrolrør. Den interne
kontrolvolumen er fastsat til 20 ␮l pr. isolation. For at åbne denne funktion skal
man vælge en intern kontrol på listen Internal Control ved oprettelse af en
ordre. Tilsæt den angivne volumen af intern kontrol til IC-røret, og placer røret
i arbejdsområdet.
 På grund af mekaniske begrænsninger er den påkrævede interne kontrolvolumen højere end ved simpelthen at gange antallet af prøver med 20 ␮l:
8
16
24
32
IC-mængde 650 800 1000 1350
(␮l)
40
48
56
64
1500 1650 2300 2450
72
80
88
96
2600 2800 2950 3100
 For nogle 1000 ␮l protokoller opdeles prøvevolumen for at generere to
prøver, og de behandles i to separate brønde i MagNA Pure 96-processing
cartridge'en. Når en intern kontrol anvendes, tilsættes en intern kontrol
separat til hver brønd. Dette betyder, at den samlede mængde intern kontrol, der er tilsat pr. prøve, er 40 ␮l i stedet for 20 ␮l. Derfor skal man fordoble volumen i den interne kontrol, der er påfyldt instrumentet, og
fordoble antallet af „Tests“ i dialogboksen „Edit Internal Control Barcode“.
8.4
Isolationsprocedure
 Det er brugerens ansvar at validere systemets performance for alle de pro-
cedurer, der anvendes i laboratoriet.
MagNA Pure 96-instrumentet er udviklet til at behandle 96 prøver samtidigt.
Hvis der bruges prøveantal, der ikke kan deles med 8, udfylder instrumentet
de tomme positioner, indtil det næste tal, der er deleligt med 8, opnås.
For at få en detaljeret beskrivelse af, hvordan man udfører instrumentopsætningen og en oprensningskørsel, henvises til MagNA Pure 96 – Vejledning til
brugeruddannelse (softwareversion 2.0).
 Pipettér prøverne ned i bunden af brøndene i processing cartridge'en.
Undgå at placere dråber med prøvemateriale på væggene i brøndene.
Brug prøveoverførselsfunktionen til automatisk at pipettere prøverne i
brøndene fra en anden processing cartridge. Dette vil sikre en overførsel
uden fare for kontaminering af væggene i brøndene med prøvematerialer.
Se flere detaljer i Brugermanual til MagNA Pure 96 (softwareversion 2.0).
 Kontrollér, at instruktionerne følges med hensyn til typen og mængden af
prøvematerialet (se afsnit 8.2 Prøvematerialer og præisolationstrin). Brug
18
y version 04, DA
ANALYSEPROCEDURER
af forkerte typer og mængder af prøver kan medføre klumper, som kan
føre til et lavt udbytte og dårlig renhed af nukleinsyrer samt krydskontaminering og hæmning af efterfølgende analyser, som f.eks. PCR og RT-PCR.
Vandigt prøvemateriale, som f.eks. nukleinsyrer, der er opløst i vand eller i
væsker uden biologisk buffer, kan medføre dårlig oprensning. I dette tilfælde anbefales det at tilsætte 10× PBS til en endelig koncentration på 1×
PBS eller en bærer af nukleinsyrer, som f.eks. Poly A RNA.
 Når reagenser er blevet opbevaret ved temperaturer under +15 til +25°C,
skal man lade kit-komponenterne stå ved en temperatur på +15 til +25°C
i mindst én time før brug.
 Kontrollér, at alle beholdere er indsat korrekt i reagensbakkerne, før de
placeres i arbejdsområdet.
 Man kan bruge to reagenssæt fra samme lot i en oprensningskørsel. I
dette tilfælde anbefales det at bruge to sæt eksterne kontroller, én for
hvert reagenssæt.
8.5
Afslutning på en kørsel
Når kørslen er afsluttet, skal man omhyggeligt kontrollere instrumentet for
tegn på spild. Hvis der er spild, skal man rengøre og dekontaminere instrumentet som beskrevet i MagNA Pure 96-systemets brugermanual.
 Rengør og dekontaminer waste cover'et efter hver kørsel som beskrevet i
MagNA Pure 96 – Vejledning til brugeruddannelse. Brug ikke natriumhypochlorit (blegemiddel) eller syre til det første rengøringstrin, da dette kan
udvikle en meget giftig gas i kombination med reagenser, der indeholder
guanidinthiocyanat.
 Resterende mængder af magnetiske partikler i output-pladen påvirker
ikke PCR- og RT-PCR-analyser på LightCycler®-instrumenter eller almindelige termocyclerblokke.
19
y version 04, DA
BEGRÆNSNINGER OG INTERFERENS
9.
BEGRÆNSNINGER OG INTERFERENS
1. Pålidelige resultater afhænger af korrekt prøvetagning, transport, opbevaring og behandlingsprocedurer.
2. Brug af dette produkt skal begrænses til personale, der er uddannet i
oprensning og isolation af nukleinsyrer samt PCR-teknikker.
3. Der kan forekomme falsk-negative resultater, hvis en prøve udtages, transporteres, opbevares eller håndteres forkert. Der kan også forekomme
falsk-negative resultater, hvis der ikke findes tilstrækkelige organismer i
prøven.
4. Enhver IVD-applikation, der bruger prøveforberedelsesproceduren sammen
med efterfølgende IVD-nukleinsyretest, skal vurderes med hensyn til de
5. For at minimere risikoen for en negativ indvirkning på resultaterne skal man
udføre tilstrækkelige kontroller for efterfølgende applikationer.
6. Opbevaringsforhold (temperatur, tid) for lysater, pellets fra dyrkede celler og
eluater skal valideres med hensyn til den enkelte IVD-parameter.
7. MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit og deres reagenser er
beregnet til at anvendes sammen med MagNA Pure 96-systemet til isolation
og oprensning af de totale nukleinsyrer (DNA/RNA) fra biologiske prøver til
in vitro-diagnostik. Brugeren skal sørge for passende performance-karakteristika især i forbindelse med en efterfølgende applikation. Ethvert resultat
skal fortolkes i sammenhæng med alle relevante kliniske observationer og
laboratorieundersøgelser. Da analytkoncentrationen kan variere meget
blandt forskellige prøvetyper, anbefales det at fastlægge krydskontameringen f.eks. ved hjælp af såkaldte checkerboard-forsøg (meget positive prøver
ved siden af negative prøver), før man går i gang med rutinemæssige forsøg.
20
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
10. PERFORMANCE-DATA
 MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit og deres reagenser
anvendes sammen med MagNA Pure 96-systemet til isolation og oprensning af de totale nukleinsyrer (DNA/RNA) fra biologiske prøver til in
vitro-diagnostik. 
Repræsentative performance-data vises nedenfor. Dataene viser et
eksempel på testens performance ved de mest almindelige prøvematerialer for at demonstrere systemets høje kvalitet. Da opnåede resultater kan
variere afhængigt af prøve og parameter, skal brugeren fastlægge passende performance-karakteristika. I forbindelse med diagnostik skal resultaterne altid vurderes i sammenhæng med den relevante applikation og
andre observationer. 
Til forberedelsen af prøver ved hjælp af MagNA Pure 96-instrumentet blev
både MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit samt
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit brugt til at
generere de performance-data, der vises nedenfor.
10.1
Præcision af oprensningseffektivitet
For at fastlægge præcisionen af oprensningseffektiviteten blev genomisk DNA
oprenset fra fuldblod. Udbyttet og renheden af de isolerede nukleinsyrer blev
fastlagt af OD-målingen. Forsøgsopsætningen og resultaterne beskrives
nedenfor.
Kit-type
Oprensningsprotokol
DNA Blood SV
Prøvetype
Fuldblod (7,6×106 hvide blodceller/ml)
Prøveinputvolumen
200 ␮l
Elueringsvolumen
100 ␮l
Gentagelser pr. kørsel
24
Tabel 2: Forsøgsopsætning til udførelse af analyse af udbytte og renhed
Udbytte (␮g)
CV (%)
OD 260/280
CV (%)
Kørsel 1
5,6
3,9
1,9
2,5
Kørsel 2
5,6
5,5
1,9
4,4
Kørsel 3
5,5
6,5
1,9
1,8
Tabel 3: Resultater (gennemsnitsværdier) for DNA-udbytte og renhed for genomisk
DNA, der er oprenset fra fuldblod
 Udbyttet afhænger i høj grad af antallet af blodceller og kan derfor variere
fra donor til donor.
21
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
10.2
Analytisk performance
Real-time qPCR/RT-PCR blev udført på LightCycler® 480-instrumentet ved
hjælp af 5 ␮l eluat i en samlet PCR-volumen på 20 ␮l. Kvantificeringsstandarder og kontrolprøver blev tilsat direkte, før PCR-kørslen blev startet.
Parameter
Parvovirus B19
Prøvetype
EDTA-plasma tilsat par- EDTA-plasma tilsat hepatitis Fuldblod fra forskellige
vovirus B19
A-virus
donorer
(7,6 × 106 hvide blodceller/ml)
Hepatitis A-virus (HAV)
Mål
In-house parvovirus
B19-stock-materiale
Kit, der er
anvendt 
til PCR
-analyse
(kun tilgængeligt
(kun tilgængeligt in-house)
in-house)
In-house hepatitis
A-virus-stock-materiale
Humant genomisk DNA
LightCycler® CycA
in-house-analyse:
DNA MasterPLUS-specifikke HybProbe- og Cyclophilin A-primere og
-prober
Elueringsvo- 5 ␮l
lumen pr.
PCR
5 ␮l
5 ␮l
PCR-volumen 20 ␮l
20 ␮l
20 ␮l
PCR
-instrument
LightCycler®
-instrument
480
LightCycler®
-instrument
480
LightCycler® 480
-instrument
Tabel 4: Oversigt over de analyser, der anvendes til at generere de performance-data, der er vist nedenfor.
Lineært område
og detektions-
grænse (LoD)
Det lineære område og detektionsgrænsen (LoD), der kan opnås ved hjælp af
MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid Kits til automatisk oprensning af
nukleinsyrer i kombination med MagNA Pure 96-instrumentet, blev evalueret
ved hjælp af virus-stock-materiale fra parvovirus B19 og fra hepatitis A-virus
(begge er kun tilgængelige in-house).
Forsøgsopsætningen, der bestemmer det lineære område og detektionsgrænsen for de valgte parametre og resultaterne, er beskrevet nedenfor.
Parameter
Parvovirus B 19
Kit-type
LV Kit
NA LV Kit
Oprensningsprotokol
22
Hepatitis A-virus
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
Prøvetype
EDTA-plasma
EDTA-plasma
Prøveinputvolumen
500 ␮l
500 ␮l
Elueringsvolumen
50 ␮l
50 ␮l
Fortyndingsserie
8 forskellige virustitere 
2×101 til 5×107 kopier/ml
8 forskellige virustitere 
Overordnede tilgængelige datapunkter
172
176
Tabel 5: Forsøgsopsætning, der bestemmer det lineære område og LoD.
Parameter
Parvovirus B 19
Hepatitis A-virus
Lineært område
Detektionsgrænse*
(LoD_95)
68 kopier/ml
konfidensinterval: 
48 til 156 kopier/ml
119 kopier/ml
konfidensinterval: 
Tabel 6: Resultater, der er bestemt for det lineære område og LoD.
* Alle data blev statistisk evalueret ved hjælp af probitanalyse, LoD blev beregnet for 95 %-konfidensintervallet
(LoD_95).
 Sensitivitet og detektionsgrænsen afhænger i høj grad af PCR-analysen
Lineært område –
parvovirus B19
Figur 1: Lineært område bestemt ved brug af Viral NA Universal LV-protokollen
til oprensning af parvovirus B19 fra EDTA-plasma. Det lineære område for denne
applikation er 2×102 til 5×106 kopier/ml. SVT/ml tilsat virustiter/ml, MVT/ml: målt virustiter/ml.
23
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
Lineært område –
hepatitis A-virus
(HAV)
Figur 2: Lineært område bestemt ved brug af Viral NA Universal LV-protokollen
til oprensning af HAV fra EDTA-plasma. Det lineære område for denne applikation
er 3×103 til 1×109 kopier/ml. SVT/ml tilsat virustiter/ml, MVT/ml: målt virustiter/ml.
Detektions-
grænsen for
parvovirus B19
Figur 3: Detektionsgrænsen for parvovirus B19 bestemt ved brug af Viral NA
Universal LV-protokollen til oprensning af en viral fortyndingsserie fra
EDTA-plasma. LoD_95 er 68 kopier/ml. Det relaterede konfidensinterval er 48 til 156
kopier/ml.
_____ probitregression, - - - - nedre 95 %-grænse, . . . . . . øvre 95 %-grænse, o LoD_95.
24
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
Detektions-
grænse for
hepatitis A-virus
(HAV)
Figur 4: Detektionsgrænsen for HAV bestemt ved brug af Viral NA Universal
LV-protokollen til oprensning af en viral fortyndingsserie fra EDTA-plasma. 
LoD_95 er 119 kopier/ml. Det relaterede konfidensinterval er 75 til 279 kopier/ ml. _____
probitregression, - - - - nedre 95 %-grænse, . . . . . . øvre 95 %-grænse, o LoD_95.
10.3
Præcisionsanalyse
Standardafvigelser (SD) og variationskoefficienter (CVs) blev bestemt for fortyndingsserier inden for det lineære område ved hjælp af følgende parametre:
Parvovirus B19, hepatitis A-virus og cyclophilin A.
For at kunne bestemme den intra-serielle præcision blev alle dataene produceret i en enkelt kørsel. For at kunne bestemme den inter-serielle præcision
blev tre kørsler udført af forskellige brugere, på forskellige instrumenter og i
forskellige laboratorier. Lot-til-lot-præcisionen blev bestemt ved hjælp af seks
forskellige lots.
Forsøgsopsætningen til præcisionsanalyser og de tilsvarende resultater er
beskrevet nedenfor.
25
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
Parameter
Parvovirus B19
Kit-type
Viral NA SV Kit
and Viral NA SV Kit
Hepatitis A-virus (HAV)
MagNA Pure 96 DNA
and Viral NA SV Kit
DNA Blood SV
Prøvetype
EDTA-plasma
EDTA-plasma
Fuldblod (7,6×106 hvide
blodceller/ml)
Prøveinput-
volumen
200 ␮l
200 ␮l
200 ␮l
Eluerings-
volumen
50 ␮l
50 ␮l
100 ␮l
Fortyndingsserie 1×103 til 1×106 
kopier/ml
Ikke relevant
Gentagelser
8
8
24
Datapunkter
LightCycler®
LightCycler®
480-instrument
-instrument
-instrument
Intra-seriel 
præcision
32
32
24
Inter-seriel 
præcision
96
96
72
Lot-til-lot-
præcision
160
160
144
480
Tabel 7: Forsøgsopsætning til præcisionsanalyse.
Parvovirus B19
Intra-seriel præcision
Koncentration (kopier/ml)
Gennemsnit
(Cp)
SD (Cp)
CV (%)
1 × 106
18,0
0,14
0,78
1 × 105
21,5
0,21
1,00
104
24,9
0,31
1,23
3
28,5
0,39
1,37
1×
1 × 10
Parvovirus B19
18,2
0,34
1,89
5
21,6
0,32
1,49
1 × 10
26
Inter-seriel præcision
1 × 106
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
1 × 104
25,2
0,44
1,73
103
28,7
0,38
1,34
1×
Parvovirus B19
Lot-til-lot-præcision*
106
18,2
0,16
0,90
1 × 105
21,7
0,21
0,97
1×
104
25,1
0,39
1,55
1×
103
28,6
0,38
1,32
1×
Tabel 8: Resultater for intra-seriel, inter-seriel og lot-til-lot-præcision bestemt ved hjælp
af parvovirus B19-materiale tilsat i EDTA-plasma.
* gennemsnit over 6 forskellige lots
Hepatitis A-virus
Koncentration (kopier/ml)
Gennemsnit SD (Cp)
(Cp)
CV (%)
1 × 106
19,4
0,18
0,94
105
23,0
0,28
1,23
1 × 104
26,2
0,12
0,45
103
29,7
0,12
0,41
1×
1×
Hepatitis A-virus
106
19,4
0,26
1,33
1 × 105
22,9
0,21
0,92
1×
104
26,2
0,12
0,45
1×
103
29,6
0,32
1,07
1×
Hepatitis A-virus
1 × 106
19,7
0,22
1,10
1×
105
23,1
0,15
0,67
1×
104
26,6
0,39
1,46
1×
103
30,0
0,26
0,87
Tabel 9: Resultater for intra-seriel, inter-seriel og lot-til-lot-præcision bestemt ved hjælp
af HAV tilsat i EDTA-plasma.
27
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
CycA-analyse
Referenceprøve
Gennemsnit (Cp) SD (Cp)
CV (%)
18,1
1,12
CycA-analyse
Referenceprøve
18,0
CycA-analyse
Referenceprøve
0,20
0,21
1,15
17,9
0,16
0,87
Tabel 10: Resultater for intra-seriel, inter-seriel og lot-til-lot-præcision for CycA-analyse, der blev udført med DNA isoleret fra fuldblod.
10.4
Indflydelsen fra interfererende stoffer blev evalueret ved hjælp af prøvemateriale tilsat parvovirus B19 og en stigende koncentrationsserie af følgende
udbredte stoffer: Hæmoglobin (human hæmoglobin, Sigma-Aldrich Co. LLC),
bilirubin (Sigma-Aldrich Co. LLC) og lipider (Intralipid 20 % emulsion,
Sigma-Aldrich Co. LLC).
Forsøgsopsætningen, der blev brugt til at evaluere indflydelsen af interfererende stoffer og de tilsvarende resultater, er beskrevet nedenfor:
Parameter
Parvovirus B19
Kit-type
Oprensningsprotokol
Prøvetype
Fuldblod
Prøveinputvolumen
200 ␮l
Elueringsvolumen
50 ␮l
Viruskoncentration
1 × 105 kopier/ml
Hæmoglobin, bilirubin og lipider brugt i 
forskellige koncentrationer
Gentagelser pr. inhibitorkoncentration
3
Tabel 11: Forsøgsopsætning, der blev brugt til at evaluere indflydelsen af de interfererende stoffer hæmoglobin, bilirubin og lipider.
28
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
Resultater
Hæmoglo- Cp
bin (mg/dl)
Bilrubin (mg/dl)
Cp
Lipider 
(mg/dl)
Cp
0
21,0
0
20,8
0
21,6
100
21,3
6,6
21,0
200
21,6
200
21,2
13,2
21,2
400
21,5
300
21,2
19,8
20,9
600
21,9
400
21,1
26,4
21,0
800
21,9
500
21,1
33,0
21,3
1000
21,8
600
21,0
39,5
21,4
1200
21,5
700
21,1
46,1
21,3
1400
21,6
800
21,3
52,8
21,0
1600
21,3
900
21,5
59,4
21,0
1800
21,2
1000
n.d.*
66,0
21,5
2000
21,1
Gennemsnit
21,1
Gennemsnit
20,8
Gennemsnit
21,6
Tabel 12: Crossing point (Cp)-resultatet for prøver tilsat interfererende stoffer.
* ikke bestemt på grund af pipetteringsfejl.
Ingen af de interfererende stoffer viste nogen indflydelse på crossing points.
Det opnåede crossing point-område er a 0,8.
10.5
Test for krydskontaminering
Risikoen for krydskontaminering blev evalueret ved hjælp af parvo B
19-testen. Under de første to kørsler blev kun negative prøver behandlet for at
teste MagNA Pure 96-systemet for mulig kontaminering. I tre kørsler blev et
checkerboard-mønster af skiftende positive og negative prøver behandlet. I
den sidste kørsel blev kun negative prøver behandlet. En prøve blev identificeret som negativ, når der ikke kom noget detektionssignal efter 45 PCR-cyklusser.
Forsøgsopsætningen til at teste MagNA Pure 96-systemet for mulig kontaminering og de tilsvarende resultater er beskrevet nedenfor.
29
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
Parameter
Parvovirus B19
Kit-type
Oprensningsprotokol Viral NA Universal LV
Prøveinputvolumen
500 ␮l
Elueringsvolumen
50 ␮l
Positive prøver
5 × 107 kopier/ml i EDTA-plasma
Negative prøver
negativ EDTA-plasma
Antal kørsler
A) 2 kørsler kun med negative prøver
B) 3 kørsler med checkerboard-mønster
C) 1 kørsel kun med negative prøver
PCR-analyse
LightCycler® Parvo B19 Quantification Kit ved
hjælp af en 384-brønds plade på LightCycler®
480-instrumentet
Tabel 13: Forsøgsopsætning til evaluering af risikoen for krydskontaminering.
Kørsel
Gennemsnitl. Cp
for 
positive prøver
Standardafvigelser Positiv rate
Negativ
rate
1
n/a
n/a
0/96
96/96
2
n/a
n/a
0/96
96/96
3
17,8
0,20
48/96
48/96
4
20,0
0,22
48/96
48/96
5
18,6
0,12
48/96
48/96
6
n/a
n/a
0/96
96/96
Tabel 14: Resultaterne af krydskontamineringsforsøgene baseret på gennemsnitlige
crossing points og call-rater.
Som vist i tabel 14 blev der ikke fundet nogen krydskontaminering under de
ovennævnte forhold.
30
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
10.6
Metodesammenligning
JAK2-Mutations- Metodesammenligning blev udført ved hjælp af MagNA Pure 96-systemet til
at teste fuldblodsprøver for allel JAK2-V617F. Denne metode sammenligner
detektion
mutationsforholdet med vildtypen. DNA blev isoleret ved hjælp af MagNA
Pure 96-systemet og den manuelle QIAamp DNA Blood Mini Kit-metode.
PCR-analyse blev udført ved hjælp af JAK2 MutaQuant®Kit i henhold til producentens instruktioner.
Parameter
Jak2 V617F
Kit-type
Oprensningsprotokol
DNA Blood SV
Prøvetype
Fuldblod
Prøveinputvolumen
200 ␮l
Elueringsvolumen
50 ␮l
Testede prøver*
50
PCR-analyse
Marseille på Rotor-Gene 3000-instrumentet
Sammenligningsmetode
Forberedelse af prøver
(elueringsvolumen 85 μl)
Tabel 15: Forsøgsopsætningen til test af fuldblodsprøver for allel JAK2-V617F.
* Halvtreds blindede kliniske prøver (ekstra prøver) blev udtaget fra rutinemæssig diagnostik og målt parallelt.
Komparator
Negativ
Positiv
JAK2_V617F
Total
Negativ
33
0
33
Positiv
JAK2_V617F
0
17
17
Samlet
33
17
50
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 50 prøver
Tabel 16: Der indgik i alt 50 prøver i denne analyse. Der blev opnået 100 % enighed i
identifikation af positive og negative prøver mellem den automatiske MagNA Pure
96-metode og den manuelle QIAamp DNA Blood Mini Kit-metode.
31
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
Figur 5: Metodesammenligningen var baseret på det endelige mutationsforhold ift. WT
(vildtype) mellem oprensningen ved hjælp af MagNA Pure 96 DNA and Viral NA SV Kit
sammenlignet med QIAamp DNA Blood Mini Kit.
……….. Identitetslinje, - - - - - Bablok-regression (1,02x); Pearson r= 0,989
32
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
Pneumocystis
jiroveci DNA
Metodesammenligningsdata, der blev registreret ved hjælp af MagNA Pure
96-systemet, blev vurderet ved at teste prøver af bronkoalveolær skyllevæske
(BAL) for Pneumocystis jiroveci DNA.
Følgende forsøgsopsætning blev udført:
Parameter
Kit-type
Oprensningsprotokol Pathogen Universal LV
Prøvetype
Bronkoalveolær skyllevæske (BAL)
Prøveinputvolumen
500 ␮l
Elueringsvolumen
100 ␮l
Testede prøver*
96
PCR-analyse**
In-house real-time qPCR-analyse i kombination
med LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe
LoD: <50 kopier/reaktion
Lineært område: 103 – 108 kopier/ml
Prøver > 104 kopier/ml vurderes som positive
Sammenligningsme- QIAamp DNA Mini Kit:
Prøvevolumen: 500 ␮l
tode
Forberedelse af prø- Elueringsvolumen: 200 ␮l
ver
Tabel 17: Forsøgsopsætning til test af prøver af bronkoalveolær skyllevæske (BAL) for
Pneumocystis jiroveci DNA.
* Seksoghalvfems blindede kliniske prøver (ekstra prøver) blev udtaget fra rutinemæssig
diagnostik og målt parallelt.
**PCR-analysen blev udviklet og godkendt af Institute of Medical Microbiology and
Hygiene, University Hospital Regensburg.
Komparator
Negativ
Positiv
P.jiroveci DNA
Samlet
Negativ
70
1
71
Positiv
P.jiroveci DNA
0
25
25
Samlet
70
26
96
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 96 prøver
33
y version 04, DA
PERFORMANCE-DATA
Tabel 18: I alt blev 26 prøver ud af 96 fundet positive. Den positive overensstemmelse
for de positive prøver var 25 ud af 26 (96 %). Den positive overensstemmelse for de
negative prøver var 70 ud af 70 (100 %).
Figur 6: Metodesammenligningen for de positive prøver baseret på crossing point-analyse målt i 2 på hinanden følgende kørsler på Pneumocystis jiroveci in-house real-time
qPCR-analyse.
…….. Identitetslinje, - - - - - Bablok-regression (1,01x+0,91); Pearson r= 0,9312 
(kørsel 1: ×) _______ Bablok-regression (1,01x +1,07); Pearson r= 0,9304 (kørsel 2: o)
34
y version 04, DA
SUPPLERENDE OPLYSNINGER
11. SUPPLERENDE OPLYSNINGER
11.1
Symboler
I dette dokument anvendes følgende symboler til at fremhæve vigtige oplysninger:
11.2
Symbol
Beskrivelse

Vigtig bemærkning

Informationsnote
C
Til brug ved in vitro-diagnostik.
I
Katalognummer
B
Lotnummer
s
Holdbar til
r
Temperaturbegrænsning (opbevares ved)
n
Distributør
t
Producent
)
Opbevares beskyttet mod sollys. (Udvendig
indpakning af engangsmaterialer)
2
Må kun anvendes én gang. (Udvendig indpakning af engangsmaterialer)
v
Kittet opfylder kravene i IVD-direktivet 98/79/
EF.
*
fås hos Roche Applied Science
Ændringer i forhold til tidligere version
Redaktionelle ændringer.
12. VAREMÆRKER
LIGHTCYCLER og MAGNA PURE er varemærker tilhørende Roche.
Alle andre produktnavne og varemærker tilhører de respektive ejere.
13. LICENSFRASKRIVELSE
Dette er et produkt, som er licenseret under patenter ejet af Qiagen.
35
y version 04, DA
LOVGIVNINGSMÆSSIG FRASKRIVELSE
14. LOVGIVNINGSMÆSSIG FRASKRIVELSE
Til brug ved in vitro-diagnostik.
36
y version 04, DA
v
Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim,
Tyskland, +49 621 7590
Fremstillet i Tyskland
_________________________________________________________________
0512.06671934001➃
t
n Distribueret i USA af Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA
68298 Mannheim
Tyskland
C
y Versión 04
Versión del contenido: mayo de 2012
Reactivos previamente rellenados en el equipo MagNA Pure 96. Este kit se utiliza
para el aislamiento de ADN genómico y ácidos nucleicos (NA) virales
provenientes de hasta 1.000 ␮l de sangre total, plasma o suero, o de 25 mg de
tejido reciente/congelado y de hasta 1 × 106 células cultivadas, así como para el
aislamiento de ácidos nucleicos bacterianos, fúngicos y virales provenientes de
hasta 1.000 ␮l de material de muestras humanas.
I 06 374 891 001
Kit para 3 ⫻ 96 reacciones
r Almacenar a una temperatura comprendida entre ⫹15 °C y ⫹25 °C
 Mantenga el kit alejado de la luz.
 Mantenga el kit alejado de los imanes.
Table of Contents
1.
2.
3.
4.
USO PREVISTO ................................................................................................................ 3
EXPLICACIÓN DEL KIT ................................................................................................... 3
PRINCIPIO/RESUMEN ................................................................................................... 3
REACTIVOS Y SOLUCIONES DE TRABAJO ................................................................ 4
4.1
4.2
Número de pruebas
Kit/Contenido
4
4
5.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS ............................................................................ 6
5.1
5.2
5.3
5.4
Precauciones
Requisitos de manipulación
Procedimientos de laboratorio
Manipulación de los residuos
6
7
8
8
6.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD ......................................................................... 9
6.1
6.2
6.3
Kit y reactivos
Recogida de especímenes y almacenamiento del material de muestras
Almacenamiento de eluidos y ácidos nucleicos purificados
7.
MATERIALES .................................................................................................................. 11
7.1
7.2
Materiales suministrados
Materiales y dispositivos requeridos pero no suministrados
8.
PROCEDIMIENTOS DEL ENSAYO .............................................................................. 12
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
Protocolos de purificación
Materiales de muestras y pasos previos al aislamiento
Control de calidad
Procedimiento de aislamiento
Finalización de un experimento
9.
10.
LIMITACIONES E INTERFERENCIAS ......................................................................... 21
DATOS DE RENDIMIENTO ........................................................................................... 22
10.1
10.2
10.3
10.4
10.5
10.6
Precisión de la eficacia de purificación
Rendimiento analítico
Análisis de precisión
Sustancias interferentes
Pruebas de contaminación cruzada
Comparación de métodos
11.
INFORMACIÓN ADICIONAL ....................................................................................... 36
11.1
11.2
Símbolos
Cambios respecto a la versión anterior
12.
13.
14.
MARCAS REGISTRADAS ............................................................................................. 36
RENUNCIA DE RESPONSABILIDAD DE LA LICENCIA ........................................... 36
RENUNCIA DE RESPONSABILIDAD REGULADORA .............................................. 37
2
9
9
10
11
11
12
13
18
19
20
22
23
27
29
31
32
36
36
y Versión 04, ES
USO PREVISTO
1.
USO PREVISTO
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit es un kit de reactivos
que se utiliza en combinación con el sistema MagNA Pure 96 para el
aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos totales (ADN/ARN) a partir
de especímenes biológicos para propósitos de diagnóstico in vitro.
Es necesario evaluar cualquier aplicación de IVD que utilice el procedimiento
de preparación de muestras junto con cualquier prueba de ácidos nucleicos
de IVD de fase posterior con respecto a los parámetros de IVD individuales.
2.
EXPLICACIÓN DEL KIT
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit está específicamente
diseñado para aislar
• Ácidos nucleicos provenientes de hasta 1.000 ␮l de sangre total, plasma o
suero
• Ácidos nucleicos bacterianos, fúngicos y virales provenientes de hasta 1.000
␮l de material de muestras o lisado de origen humano
• Ácidos nucleicos provenientes de hasta 1 × 106 células cultivadas
• Ácidos nucleicos provenientes de hasta 25 mg de tejido reciente/congelado
Los ácidos nucleicos aislados cumplen los estándares de calidad requeridos
para los análisis de PCR/RT-PCR cuantitativos de gran especificidad.
3.
PRINCIPIO/RESUMEN
El procedimiento de aislamiento de los ácidos nucleicos se basa en la
tecnología de partículas de cristal magnéticas (MGP) de MagNA Pure. 
Los pasos básicos del procedimiento de aislamiento de los ácidos nucleicos
de MagNA Pure 96 son:
1. Se lisa el material de muestras, se liberan los ácidos nucleicos y se
desnaturalizan las nucleasas.
2. Los ácidos nucleicos se unen a la superficie de sílice de las MGP añadidas
debido a las condiciones de las sales caotrópicas y a la alta potencia iónica
del buffer de lisis/unión.
3. Las MGP con ácidos nucleicos unidos se separan magnéticamente de la
muestra lisada residual.
4. Las sustancias que no se han unido, como proteínas, residuos celulares e
inhibidores de la PCR, se eliminan mediante diversos pasos de lavado.
5. Los ácidos nucleicos purificados se eluyen de las MGP.
3
y Versión 04, ES
REACTIVOS Y SOLUCIONES DE TRABAJO
4.
4.1
Número de pruebas
4.2
El kit está diseñado para realizar
• 3 × 96 aislamientos de ADN genómico y ácidos nucleicos virales
provenientes de hasta 500 ␮l de sangre total, plasma, suero o provenientes
de hasta 1 × 106 células cultivadas; o
• 3 × 96 aislamientos de ácidos nucleicos bacterianos, fúngicos o virales
provenientes de 500 ␮l de material de muestras de origen humano; o
• 3 × 96 aislamientos provenientes de hasta 25 mg de tejido reciente/
congelado; o
• 3 × 48 aislamientos provenientes de 1.000 ␮l de sangre total, plasma o
suero; o
• 3 × 48 aislamientos de ácidos nucleicos bacterianos, fúngicos o virales
provenientes de 1.000 ␮l de material de muestras de origen humano.
Kit/Contenido
4
Componente Denominación
s
Contenido/Función
Cubeta 1
3 cubetas por kit
Reagent Tray 1
Contenedor 1 Wash Buffer I
• 160 ml
• < 6 M de hidrocloruro de guanidinio, 
< 50% de EtOH, < 30 mM de Tris HCl
• Para la eliminación de impurezas
• 80 ml
• < 6 M de hidrocloruro de guanidinio, 
< 50% de EtOH, < 30 mM de Tris HCl
Contenedor 3 Lysis/Binding
Buffer
• 80 ml
• < 6 M de tiocianato de guanidinio, 
< 30% de Triton X-100, < 60 mM de
Tris HCl
• Para la lisis de células/virus y la unión
de los ácidos nucleicos
Cubeta 2
3 cubetas por kit
Reagent Tray 2
Contenedor 1
Vacío
Contenedor 2 Proteinase K
• 15 ml
• Proteinasa K al 2%, glicerol al 50%
• Para la digestión de proteínas
y Versión 04, ES
Contenedor 3 Elution Buffer
• 80 ml
• < 60 mM de buffer Tris-HCl
• Para la elución de ácidos nucleicos
Contenedor 4 Wash Buffer III
• 160 ml
• < 20 mM de buffer Na-acetato
Botella 1
Magnetic Glass 
Particles
• 6 botellas, 18 ml cada una
• Suspensión MGP con isopropanol
• Para la unión de ácidos nucleicos
 Los fluidos del sistema MagNA Pure 96 (internos/externos)* funcionan
como buffer de lavado II para este kit.
 Todos los componentes del kit están listos para utilizar.
5
y Versión 04, ES
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
5.
5.1
Precauciones
 Varios buffers de MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit
contienen compuestos peligrosos. Para obtener más información, consulte
la ilustración 1 (Reagent Tray 1), la ilustración 2 (Reagent Tray 2) y la tabla
1. Evite que estos reactivos entren en contacto con la piel, los ojos o las
membranas mucosas. En caso de producirse contacto, lave
inmediatamente la zona afectada con abundante agua. Si se derraman los
reactivos, dilúyalos con agua antes de limpiarlos.
 No permita que los reactivos que contengan tiocianato de guanidinio
entren en contacto con la solución de hipoclorito de sodio (lejía) ni con
ácidos. Estas mezclas producen un gas altamente tóxico. Es
especialmente importante tener en cuenta esta precaución cuando se
limpia la cubierta de residuos MagNA Pure 96.
Ilustr. 1: Reagent Tray 1
Componente Denominación
s
Cubeta 1
6
Ilustr. 2: Reagent Tray 2
Compuestos peligrosos
Reagent Tray 1
• Hidrocloruro de guanidinio
• Etanol
• Hidrocloruro de guanidinio
• Etanol
y Versión 04, ES
Contenedor 3 Lysis/Binding Buffer
Cubeta 2
• Tiocianato de guanidinio
Reagent Tray 2
Contenedor 1 Vacío
Contenedor 2 Proteinase K
• Proteinasa K
Contenedor 3 Elution Buffer
Contenedor 4 Wash Buffer III
Botella 1
Magnetic Glass 
Particles
• Isopropanol
Tabla 1: listado de los reactivos con compuestos peligrosos
5.2
Requisitos de manipulación
• Utilice guantes desechables y cámbielos con frecuencia.
• No utilice el kit después de la fecha de caducidad.
Asimismo, para minimizar el riesgo de contaminación carry-over, que podría
derivar en la obtención de resultados de falso positivo, siga estas directrices:
• Realice la preparación de muestras, la configuración de la PCR/RT-PCR y la
PCR/RT-PCR en diferentes ubicaciones.
• Deseche las puntas de pipeta en contenedores sellados para evitar la
contaminación atmosférica.
Los recipientes de reacción y reactivos contaminados con nucleasas
degradan los ácidos nucleicos del molde. Siga estas directrices para minimizar
el riesgo de contaminación:
• Evite tocar superficies o materiales que puedan provocar carry-over de
nucleasas.
• Utilice sólo los reactivos suministrados en este kit. Las sustituciones pueden
conllevar la introducción de nucleasas.
• Limpie y descontamine las áreas y los equipos de trabajo, incluidas las
pipetas, con reactivos descontaminantes disponibles en el mercado.
• Utilice únicamente puntas de pipeta resistentes a los aerosoles y sin
nucleasas y tubos de microcentrífuga nuevos.
• Utilice un área de trabajo específicamente designada para trabajar con ARN.
Si es posible, utilice recipientes de reacción y pipeteadores dedicados
exclusivamente a trabajar con el ARN del molde.
7
y Versión 04, ES
5.3
Procedimientos de laboratorio
• Todo el material originario de humanos y todos los residuos resultantes se
deben considerar potencialmente infecciosos. Limpie y desinfecte en
profundidad todas las superficies de trabajo con los desinfectantes
recomendados por las autoridades locales.
• Dado que la sensibilidad y el título de los patógenos potenciales del material
de muestras pueden variar, el usuario debe optimizar la inactivación de
patógenos y seguir las medidas adecuadas según las normativas de
seguridad locales.
• No está permitido comer, beber ni fumar en las zonas de trabajo del
laboratorio.
• No pipetee con la boca.
• Utilice guantes de protección desechables, batas de laboratorio y protección
ocular durante la manipulación de muestras y reactivos del kit.
• Evite la contaminación microbiana y de nucleasas de los reactivos cuando
elimine alícuotas de botellas de reactivos. Utilice puntas de pipetas
desechables estériles.
• Lávese las manos cuidadosamente después de manipular especímenes y
reactivos del kit.
5.4
Manipulación de los residuos
• Encontrará Hojas de datos de seguridad del material (MSDS) disponibles en
línea en 
www.e-labdoc.roche.com, o bien puede solicitarlas a la oficina local de
Roche.
• Deseche los reactivos no utilizados y los residuos de acuerdo con las
normativas del país, federales, estatales y locales.
• Utilice guantes de protección desechables, batas de laboratorio y protección
ocular durante la eliminación de muestras y reactivos del kit.
• Para desechar los reactivos de los contenedores, siga el procedimiento que
se indica a continuación:
1. Perfore una esquina de la lámina de metal de un contenedor de la
cubeta de reactivos con un elemento desechable de plástico sólido,
como una pipeta de cultivo celular.
2. Doble hacia atrás la lámina y deseche el líquido en un contenedor
designado para residuos.
3. Repita los pasos 1 y 2 hasta que todos los contenedores estén vacíos.
8
y Versión 04, ES
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
6.
6.1
Kit y reactivos
• El kit se suministra a temperatura ambiente.
• Los componentes del kit permanecen estables a una temperatura
comprendida entre +15 °C y +25 °C hasta la fecha de caducidad impresa en
la etiqueta.
 Mantenga el kit alejado de la luz y de los imanes.
• Los reactivos se pueden almacenar durante 32 horas a una temperatura
comprendida entre +15 °C y +25 °C en la plataforma del equipo MagNA
Pure 96.
• Se puede utilizar un conjunto de cubetas de reactivos (cubeta 1 y cubeta 2)
para realizar hasta cuatro experimentos individuales. Una vez abiertas, las
cubetas de reactivos se pueden utilizar para realizar experimentos
adicionales en el mismo equipo MagNA Pure 96 en el plazo de 28 días,
sellándolas de forma apropiada con una lámina de metal hermética MagNA
Pure 96* y almacenándolas a una temperatura entre +2 °C y +8 °C. Equilibre
los componentes del kit a una temperatura comprendida entre +15 °C y +25
°C durante una hora antes de utilizarlos.
 Sólo es posible reutilizar bandejas de reactivos usadas parcialmente en el
mismo equipo MagNA Pure 96. El programa MagNA Pure 96 realiza el
seguimiento del inventario en cada equipo mediante códigos de barras de
reactivos, y reconoce las cubetas de puntas y los reactivos usados
parcialmente, que manipula en el experimento siguiente de la forma
adecuada.
 Si las cubetas de reactivos no están correctamente selladas, el contenido
podría evaporarse. Unas condiciones de almacenamiento inapropiadas
pueden afectar negativamente al rendimiento del proceso de aislamiento.
6.2
Recogida de especímenes y almacenamiento del material de muestras
Para realizar una detección de ácidos nucleicos específica, es importante
asegurarse de almacenar correctamente las muestras (de ⫺15 °C a ⫺25 °C
para el ADN o de ⫺60 °C a ⫺80 °C para el ARN). El ADN o ARN podría
degradarse si las muestras no se almacenan de la forma adecuada.
 No utilice plasma ni sangre con heparina.
 No utilice material de muestras que haya sido almacenado durante mucho
tiempo a altas temperaturas.
 Si las muestras se han almacenado congeladas, descongélelas mediante
una leve agitación utilizando, por ejemplo, un mezclador de rodillos de
laboratorio.
9
y Versión 04, ES
6.3
Almacenamiento de eluidos y ácidos nucleicos purificados
Para asegurar la mayor estabilidad posible de los ácidos nucleicos eluidos,
proceda inmediatamente con la configuración de la PCR/RT-PCR. No
almacene los ácidos nucleicos eluidos en la plataforma MagNA Pure 96.
Para almacenarlos, cierre la placa de salida con una lámina de metal
hermética MagNA Pure 96* y almacénelos a una temperatura comprendida
entre ⫺15 °C y ⫺25 °C para el ADN o ⫺60 °C y ⫺80 °C para el ARN.
Almacene los ácidos nucleicos purificados en alícuotas para evitar la
repetición del ciclo de congelación y descongelación.
Cuando almacene placas de salida que contengan eluidos fuera del equipo
MagNA Pure 96, selle las placas con una lámina de metal hermética MagNA
Pure 96*.
 Para continuar con el procesamiento, es necesario retirar la lámina de
metal hermética. No la retire de forma demasiado abrupta, ya que podría
provocar contaminación cruzada mediante la creación de aerosoles y
carry-over de pocillo a pocillo.
 Si los eluidos se han almacenado congelados, mézclelos suavemente
pipeteando diez veces hacia arriba y hacia abajo antes de realizar ningún
paso de la fase posterior, como la PCR/RT-PCR o las mediciones de OD. El
volumen para la mezcla debe ser, como mínimo, la mitad del volumen de
los eluidos. Si los ácidos nucleicos no se mezclan previamente ni se
distribuyen de modo uniforme/homogéneo en la solución, es posible que
los resultados no se puedan reproducir en los ensayos siguientes.
 Para el almacenamiento a largo plazo, recomendamos transferir los
eluidos a una placa de archivado.
10
y Versión 04, ES
MATERIALES
7.
MATERIALES
7.1
Materiales suministrados
Consultar el apartado 4: Reactivos y soluciones de trabajo
7.2
Materiales y dispositivos requeridos pero no suministrados
• MagNA Pure 96 Instrument (Equipo MagNA Pure 96) (n.º de cat. 06 541 089
001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (Internal) (Fluidos del sistema MagNA Pure 96,
internos) (n.º de cat. 06 430 112 001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (External) (Fluidos del sistema MagNA Pure
96, externos) (n.º de cat. 06 640 729 001)
• MagNA Pure 96 Filter Tips (Puntas con filtro MagNA Pure 96), 1.000 μl 
(n.º de cat. 06 241 620 001)
• MagNA Pure 96 Processing Cartridge (Cartucho de procesamiento MagNA
Pure 96) (n.º de cat. 06 241 603 001)
• MagNA Pure 96 Output Plate (Placa de salida MagNA Pure 96) (n.º de 
cat. 06 241 611 001)
• MagNA Pure Internal Control Tube (Tubo de control interno MagNA Pure
96) (n.º de cat. 06 374 905 001)
• MagNA Pure 96 Sealing Foil (Lámina de metal hermética MagNA Pure 96)
(n.º de cat. 06 241 638 001)
• Reactivos opcionales:
• MagNA Pure 96 External Lysis Buffer (n.º de cat. 06 374 913 001)
• MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer (para el aislamiento de ácidos
nucleicos bacterianos, fúngicos y virales mediante el protocolo Pathogen
Universal, si se requiere lisis externa) (n.º de cat. 06 374 921 001)
• MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer (n.º de cat. 06 640 702 001)
• Proteinasa K, grado de la PCR, actividad (+37 °C) b 0,6 U/␮l 
(p. ej., n.º de cat. 03 115 828 001)
• Opcional, equipo MagNA Lyser (n.º de cat. 003 358 968 001 a partir del 
n.º de serie 40467540, n.º de cat. 03 358 976 001 a partir del n.º de serie
40405218)
• Opcional, MagNA Lyser Green Beads (n.º de cat. 03 358 941 001)
• Equipo de laboratorio estándar
• Pipetas y puntas resistentes a los aerosoles y sin nucleasas, como las
puntas extralargas de 10 cm de longitud, para dispensar previamente las
muestras en el cartucho de procesamiento MagNA Pure 96
• Opcional, centrífuga para tubos
11
y Versión 04, ES
PROCEDIMIENTOS DEL ENSAYO
8.
8.1
Protocolos de purificación
Hay diversos protocolos de purificación del equipo MagNA Pure 96
disponibles para realizar los aislamientos de ácidos nucleicos con MagNA
Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit. Cada protocolo está optimizado
para materiales de muestras específicos.
 Ejecute los protocolos sólo con los materiales de muestras especificados,
en caso contrario, el rendimiento del proceso de aislamiento puede verse
afectado negativamente. Un uso inadecuado puede conllevar la
acumulación y pérdida de MGP, la contaminación cruzada de muestras o
incluso daños en el equipo. Sólo los tipos especificados de material de
muestras se pueden combinar en el mismo experimento.
Para fines de diagnóstico in vitro, puede utilizar los siguientes protocolos con
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit. Cada protocolo permite
seleccionar el volumen de la muestra y el volumen de la elución en el menú
del programa.
12
Nombre del
protocolo
Material de la muestra
Volumen de la
elución1
DNA Blood LV
500 ␮l de sangre total
 No utilice más de 1 × 107
células sanguíneas/ml.
100 ó 200 ␮l
DNA Blood LV 1000* 1.000 ␮l de sangre total
100 ó 200 ␮l
DNA Blood ext lys LV 1.000 ␮l de lisado (de 500 ␮l de
sangre total)
100 ó 200 ␮l
Viral NA Plasma LV
500 ␮l de plasma EDTA
50 ó 100 ␮l
Viral NA Plasma LV
1000*
1.000 ␮l de plasma EDTA
50 ó 100 ␮l
Viral NA Plasma 
ext lys LV
1.000 ␮l de lisado (de 500 ␮l 
de plasma o suero)
50 ó 100 ␮l
LV
500 ␮l de muestra (recomendado  50 ó 100 ␮l
para suero y plasma con citrato)
LV 1000*
1.000 ␮l de muestra (recomendado 50 ó 100 ␮l
para suero y plasma con citrato)
y Versión 04, ES
Pathogen Universal2 500 ␮l de muestra o 500 ␮l de
500
lisado
50 ó 100 ␮l
Pathogen Universal2 1.000 ␮l de muestra o 1.000 ␮l de
1000*
lisado
50 ó 100 ␮l
100 ó 200 ␮l
DNA Cells LV
Hasta 1 × 106 células cultivadas
resuspendidas en 200 ␮l de PBS
DNA Tissue LV
Hasta 25 mg de tejido 
100 ó 200 ␮l
homogeneizado en un volumen de  Cuando utilice
más de 5 mg
200 μl
 No se
recomienda
utilizar 100 μl
para células
cultivadas con
un alto
contenido de
ADN.
de tejido,
recomendamos
eluir en 200 ␮l.
1 La
concentración de ácidos nucleicos en el eluido y la sensibilidad de las aplicaciones
de fase posterior se pueden aumentar seleccionando un volumen de elución bajo. No
obstante, la eficacia de la elución y los ácidos nucleicos totales generados pueden ser
menores en comparación con los obtenidos de un volumen de elución superior.
2
Los protocolos Pathogen Universal están diseñados para el aislamiento de ácidos
nucleicos bacterianos, fúngicos y virales provenientes de muchos tipos de muestras
diferentes de origen humano. Los protocolos se pueden utilizar directamente para 500
␮l o 1.000 ␮l de material de muestras o para 500 ␮l o 1.000 ␮l de lisado. Utilice un
volumen de elución de 50 μl para las muestras líquidas de contenido celular bajo,
como la orina.
 Para los protocolos marcados con un asterisco (*), el volumen de la
muestra se divide para producir dos muestras y se procesa en dos pocillos
distintos del cartucho de procesamiento MagNA Pure 96. Cuando se
utiliza un control interno, éste se añade a cada pocillo de forma individual.
Esto significa que la cantidad total de control interno añadido por muestra
es de 40 ␮l en lugar de 20 ␮l. Por lo tanto, debe doblar el volumen del
control interno cargado en el equipo. Asimismo, doble el número de Tests
en el cuadro de diálogo Edit Internal Control Barcode. Para algunas
aplicaciones, es posible que sea necesario diluir el control interno.
8.2
Materiales de muestras y pasos previos al aislamiento
Para obtener resultados óptimos en los procedimientos de fase posterior,
especialmente en los ensayos de RT-PCR, por ejemplo, mediante equipos
LightCycler®, no procese muestras con un volumen superior al que el
protocolo de purificación seleccionado puede gestionar. En caso contrario, el
rendimiento del proceso de aislamiento se verá afectado y puede conllevar la
acumulación y pérdida de MGP, la contaminación cruzada de las muestras o
incluso daños en el equipo.
 Trate todas las muestras como si fueran potencialmente infecciosas.
13
y Versión 04, ES
I. Sangre total
La sangre total reciente o congelada se puede utilizar sin ningún tratamiento
previo.
 Si el recuento de células sanguíneas supera las 1 × 107 células
sanguíneas/ml, diluya la sangre total con PBS antes de utilizarla para
evitar la acumulación.
 Asegúrese de que no hay coágulos en las muestras de sangre total
anticoagulada.
II. Plasma/Suero
El plasma o suero reciente o congelado se puede utilizar sin ningún
tratamiento previo.
 Si se han formado condensaciones, realice un paso de centrifugación
durante 10 min a 1.900 × g para los tubos de 10 ml. Utilice como muestra
únicamente el sobrenadante.
III. Lisados (para protocolos de lisis externa)
Sangre total, plasma o suero mezclados con MagNA Pure 96 External Lysis
Buffer*.
 Asegúrese de que MagNA Pure 96 External Lysis Buffer* esté equilibrado
a una temperatura entre +15 °C y +25 °C antes de utilizarlo.
Añada 500 ␮l de sangre total, plasma o suero a 500 ␮l de MagNA Pure 96
External Lysis Buffer* y mezcle la muestra mediante pipeteo.
 Utilice 1.000 ␮l de lisado directamente en combinación con el respectivo
protocolo de lisis externa, o bien almacénelos a una temperatura entre
⫺15 °C y ⫺25 °C para el ADN o ⫺60 °C y ⫺80 °C para el ARN hasta que
se vuelva a realizar otro procesamiento.
 Cuando los lisados se han almacenado congelados, deben descongelarse
en hielo. Antes de realizar la transferencia a un cartucho de
procesamiento MagNA Pure 96, mézclelos con detenimiento agitándolos
tres veces durante 10 s y gírelos hacia abajo brevemente.
IV. Diversos materiales de muestras y lisados para los protocolos
Pathogen Universal 500 y 1000
Se puede realizar la lisis de bacterias en muchos tipos de muestras diferentes
de origen humano. Los siguientes materiales de muestras pueden ser
adecuados para los protocolos Pathogen Universal 500 y 1000: orina, lavado
broncoalveolar (LBA), esputo, fluido cerebroespinal (FCE), hisopos,
deposición, sangre total, plasma, suero y cultivos bacteriológicos.
 Debido a la gran variedad de materiales de muestras, no es posible aplicar
un único procedimiento de forma universal. Los pasos de preparación de
una muestra semilíquida (LBA, esputo, deposición, etc.) para el
14
y Versión 04, ES
aislamiento de los ácidos nucleicos dependen del tipo de material y la
viscosidad de la muestra, el tipo de partículas y el contenido.
 Es necesario validar cualquier material de muestras que utilice este
procedimiento de preparación de muestras junto con cualquier prueba de
ácidos nucleicos de IVD de fase posterior con respecto a los parámetros
de IVD individuales.
 En función de la viscosidad de la muestra, el tipo de partículas y el
contenido, las muestras se pueden utilizar sin ningún tratamiento previo.
Protocolo de lisis mediante MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer*
(BLB)
햲
 No utilice un volumen de entrada de muestras de 1.000 μl para
muestras muy viscosas y ricas en células como los esputos o las
deposiciones.
Licuefacción (paso opcional para muestras muy viscosas, p. ej., LBA o
esputos)
• Prepare una solución de stock nueva de DTT (ditiotreitol) (p. ej., 5×
conc. = 0,75%).
• Ajuste la concentración de DTT final de la muestra en 0,15%
añadiendo solución de stock de DTT.
• Incube la muestra mientras la agita a 850 rpm durante 30 min a +37
°C hasta que se pueda pipetear fácilmente.
햳
Adición de BLB
• Añada 250 ␮l (o 500 ␮l) de BLB a 250 ␮l (o 500 ␮l) de muestra y
mézclela concienzudamente.
 Si el volumen de la muestra es menor a 250 ␮l (o 500 ␮l), añada
BLB para obtener un volumen final de 500 ␮l (o 1.000 ␮l).
햴
Digestión de proteinasa K
• Añada 50 ␮l (o 100 ␮l) de proteinasa K a 500 ␮l (o 1.000 ␮l) de
muestra/mezcla BLB y mézclela concienzudamente.
• Incube la muestra durante 10 min a +65 °C.
15
y Versión 04, ES
햵
Ebullición (para materiales de muestras difíciles, como
muestras de esputos o deposiciones)
 Realice un paso de ebullición para inactivar los organismos
patogénicos de la muestra. Esto también puede aumentar la lisis de
las paredes celulares de muchas especies de bacterias. Para evitar
fugas, realice este paso en tubos de reacción con tapón de rosca.
 Para el aislamiento del ARN, omita el paso de ebullición, ya que
podría afectar negativamente la integridad del ARN.
• Incube las muestras a +95 °C durante 10 min.
• Enfríe las muestras en hielo. A continuación, centrifúguelas
brevemente para recoger el volumen completo de la muestra de la
parte inferior del tubo.
• Transfiera 500 ␮l (o 1.000 ␮l) a un cartucho de procesamiento
MagNA Pure 96.
Tratamiento previo de las muestras de deposiciones
햲
Utilice una cantidad de muestra de deposición del tamaño de un
guisante y suspéndala en 550 ␮l de PBS.
 Para evitar la obstrucción de las puntas de reacción con partículas
sólidas, centrifugue durante 5 s a 500 × g.
 Para el aislamiento del ARN viral, se puede utilizar una mezcla de
buffer PBS/STAR (mezcla 1:1) como alternativa a la suspensión de
las muestras de deposiciones para reducir la posible inhibición.
햳
Transfiera 250 ␮l de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de
1,5 ml reciente; añada 250 ␮l de BLB y 50 ␮l de proteinasa K.
햴
Incube la mezcla durante 10 min a +65 °C mientras la agita a 850 rpm
en un termomezclador y, a continuación, incúbela durante 10 min a
+95 °C.
 Para el aislamiento del ARN, omita la incubación a +95 °C.
햵
Transfiera 500 ␮l del lisado a un cartucho de procesamiento MagNA
Pure 96.
Tratamiento previo de los hisopos
16
햲
Resuspenda un hisopo seco en 500 ␮l (o 1.000 ␮l) de BLB; añada 50
μl (o 100 ␮l) de proteinasa K. 
Para los hisopos suministrados en un medio de transporte, utilice 250
␮l (o 500 ␮l) de medio de transporte, añada 250 ␮l (o 500 ␮l) de BLB y
50 ␮l (o 100 ␮l) de proteinasa K.
햳
Escurra el hisopo y retírelo.
y Versión 04, ES
햴
Incube la muestra líquida a +65 °C durante 10 min y, a continuación,
incúbela durante 10 min a +95 °C.
 Para el aislamiento del ARN, omita la incubación a +95 °C.
햵
Transfiera 500 ␮l (o 1.000 ␮l) de muestra líquida a un cartucho de
procesamiento MagNA Pure 96.
V. Células cultivadas
Se pueden utilizar células cultivadas resuspendidas en 200 ␮l de solución
salina de buffer de fosfatos (PBS).
Para el aislamiento del ADN proveniente de células cultivadas que han
crecido en suspensión, gire las células cultivadas suavemente hacia abajo
durante 5 min a 300 × g. Si es necesario, lave el sedimento celular mediante
PBS.
 El sedimento celular se puede almacenar a una temperatura entre ⫺15 °C
y ⫺25 °C. 
Retire el medio de cultivo (o PBS) y resuspenda las células en una
solución PBS fría pipeteando o agitando el tubo hasta que el sedimento
celular quede resuspendido. 
Las células cultivadas monocapa se deben recoger mediante
tripsinización estándar con el procedimiento descrito anteriormente. El
volumen de la muestra requerido es de 200 ␮l.
 No utilice más de 1 × 106 células/200 ␮l, ya que el rendimiento del
proceso de aislamiento se verá afectado negativamente.
VI. Tejido reciente/congelado
Se pueden utilizar hasta 25 mg de tejido de muestras reciente/congelado tras
la homogeneización.
Homogeneización de tejidos mediante la digestión de la proteinasa K
햲
Añada hasta 25 mg de muestras de tejido a un tubo de reacción,
como un tubo de centrifugación de 1,5 ml.
햳
Añada 180 ␮l de MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer* y 20 ␮l de
proteinasa K a la muestra de tejidos y, a continuación, mézclela.
햴
Incube la muestra a +55 °C hasta que el tejido se disuelva
completamente (suele tardar entre tres horas y una noche).
 Este método de homogeneización provoca que se genere mucho
ADN de gran integridad.
17
y Versión 04, ES
Homogeneización de tejidos mediante el equipo MagNA Lyser
햲
8.3
Transfiera hasta 25 mg de muestras de tejido a un tubo MagNA Lyser
Green Beads.
햳
Añada 200 ␮l de MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer.
햴
Homogeneice el tejido en el equipo MagNA Lyser durante 30 ó 40
segundos. Si la homogeneización todavía no se ha completado, repita
este paso.
 Este método es rápido, sin embargo, debido al corte mecánico, el
ADN puede fragmentarse parcialmente.
Control de calidad
 Ejecute siempre los controles apropiados.
Para controlar el proceso completo, desde la preparación de muestras al
análisis, aplique los controles siguientes:
• Control positivo, con un material de muestras positivo para el objetivo.
• Control negativo, con PBS en lugar de la muestra.
• Control de extracción, con un material de muestras negativo para el objetivo.
• Control interno (IC), añadiendo una cantidad definida de un molde de
control a todas las muestras que desee purificar.
 Para las aplicaciones que pueden producir resultados de falso negativo,
como la detección de patógenos, es obligatorio el uso de un control
interno adecuado (IC). El IC se añade durante el aislamiento de los ácidos
nucleicos, preferiblemente con la función de IC automatizada del sistema
MagNA Pure 96. El IC también se puede añadir a la muestra de forma
manual. En este caso, el IC debe permanecer estable en el material de
muestras, y no debe utilizarse un IC sensible a las nucleasas (como el
ARN sin protección) para este propósito.
Control interno
18
El sistema MagNA Pure 96 puede añadir automáticamente un control interno
(IC) a cada muestra desde el tubo de control interno MagNA Pure 96. El
volumen de control interno está fijado en 20 ␮l por aislamiento. Para utilizar
esta función, seleccione un control interno de la lista Internal Control cuando
cree un pedido. Añada el volumen indicado de control interno al tubo de IC y
coloque el tubo en la plataforma.
 Debido a ciertas limitaciones mecánicas, el volumen de control interno
requerido es superior al resultado de multiplicar simplemente el número
de muestras por 20 ␮l:
y Versión 04, ES
Número de 8
muestras
16
24
32
40
48
56
64
72
80
88
96
Cantidad de 650 800 1.000 1.350 1.500 1.650 2.300 2.450 2.600 2.800 2.950 3.100
IC (␮l)
 En algunos protocolos de 1.000 ␮l, el volumen de la muestra se divide para
producir dos muestras y se procesa en dos pocillos distintos del cartucho
de procesamiento MagNA Pure 96. Cuando se utiliza un control interno,
éste se añade a cada pocillo de forma individual. Esto significa que la
cantidad total de control interno añadida por muestra es de 40 ␮l en lugar
de 20 ␮l. Por lo tanto, debe doblar el volumen del control interno cargado
en el equipo y doblar el número de Tests en el cuadro de diálogo Edit
Internal Control Barcode.
8.4
Procedimiento de aislamiento
 Es responsabilidad del usuario validar el rendimiento del sistema para
cualquier procedimiento que se utilice en el laboratorio.
El equipo MagNA Pure 96 está diseñado para procesar simultáneamente 96
muestras. Cuando se utilizan números de muestras que no son múltiplos de 8,
el equipo rellena las posiciones vacías hasta alcanzar el siguiente múltiplo de
8.
Para obtener una descripción detallada de cómo realizar la configuración del
equipo y un experimento de purificación, consulte el Manual de formación del
usuario de MagNA Pure 96 (versión del programa 2.0).
 Pipetee las muestras al fondo de los pocillos del cartucho de
procesamiento. Evite que caigan gotas del material de muestras en las
paredes de los pocillos. Utilice la función Sample Transfer para pipetear
automáticamente las muestras a los pocillos de otro cartucho de
procesamiento. Esto garantiza una transferencia sin riesgo de contaminar
las paredes de los pocillos con los materiales de las muestras. Para
obtener más detalles, consulte el Manual de usuario de MagNA Pure 96
(versión del programa 2.0).
 Asegúrese de que se siguen las instrucciones referentes al tipo y la
cantidad del material de muestras (consulte el apartado 8.2 Materiales de
muestras y pasos previos al aislamiento). Si utiliza tipos y cantidades
erróneas de material de muestras puede provocar acumulaciones, que
pueden derivar en una producción baja y de poca pureza de los ácidos
nucleicos, así como en contaminación cruzada e inhibición de los ensayos
de fase posterior, como la PCR y RT-PCR. El material de muestras acuoso,
como los ácidos nucleicos disueltos en agua o en líquidos sin buffer
biológico, puede obtener un rendimiento de purificación bajo. En este
caso, recomendamos añadir 10× PBS a una concentración final de 1×
PBS, o bien un portador de ácidos nucleicos, como el ARN de poli A.
19
y Versión 04, ES
 Cuando los reactivos se han almacenado a temperaturas por debajo de
+15 °C a +25 °C, equilibre los componentes del kit de +15 °C a +25 °C
durante al menos una hora antes de utilizarlos.
 Asegúrese de que todos los contenedores están correctamente insertados
en las cubetas de reactivos antes de colocarlos en la plataforma.
 Es posible utilizar dos conjuntos de reactivos del mismo lote en un
experimento de purificación. En este caso, recomendamos utilizar dos
conjuntos de controles externos, uno para cada conjunto de reactivos.
8.5
Finalización de un experimento
Una vez finalizado el experimento, inspeccione cuidadosamente el equipo
para comprobar si hay signos de derrames. Si se ha producido un derrame,
limpie y descontamine el equipo tal como se describe en el Manual de usuario
del sistema MagNA Pure 96.
 Limpie y descontamine la cubierta de residuos después de cada
experimento, tal como se describe en el Manual de formación del usuario
del sistema MagNA Pure 96. No utilice solución de hipoclorito de sodio
(lejía) ni ácidos para el primer paso de limpieza, ya que podrían producir
gases altamente tóxicos en combinación con reactivos que contengan
tiocianato de guanidinio.
 Las cantidades residuales de partículas magnéticas de la placa de salida
no afectan a los ensayos de PCR y RT-PCR de los equipos LightCycler® ni
de los termocicladores de bloque convencionales.
20
y Versión 04, ES
LIMITACIONES E INTERFERENCIAS
9.
LIMITACIONES E INTERFERENCIAS
1. La fiabilidad de los resultados depende de que la recogida de especímenes,
el transporte, el almacenamiento y los procedimientos de procesado se
realicen de forma adecuada.
2. El uso de este producto debe estar limitado al personal con formación en
técnicas de purificación de ácidos nucleicos, aislamiento y PCR.
3. Pueden obtenerse resultados de falso negativo si un espécimen se recoge,
transporta, almacena o manipula incorrectamente. Pueden obtenerse
resultados de falso negativo si el espécimen presenta cantidades
inadecuadas de organismos.
4. Es necesario evaluar cualquier aplicación de IVD que utilice el
procedimiento de preparación de muestras junto con cualquier prueba de
ácidos nucleicos de IVD de fase posterior con respecto a los parámetros de
IVD individuales.
5. Para minimizar el riesgo de un impacto negativo en los resultados, es
necesario utilizar los controles adecuados para las aplicaciones de fase
posterior.
6. Las condiciones de almacenamiento (temperatura, tiempo) de los lisados,
los sedimentos de células cultivadas y los eluidos deben validarse con
respecto al parámetro de IVD individual.
7. MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit y sus reactivos están
diseñados para su uso en combinación con el sistema MagNA Pure 96 para
el aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos totales (ADN/ARN) a
partir de especímenes biológicos para propósitos de diagnóstico in vitro. El
usuario debe establecer particularmente las características de rendimiento
adecuadas junto con cualquier aplicación de fase posterior. Los resultados
deben interpretarse dentro del contexto de todos los datos clínicos y de
laboratorio correspondientes. Dado que la concentración de analitos puede
variar ampliamente entre los diferentes tipos de especímenes,
recomendamos establecer la realización de pruebas de contaminación
cruzada, por ejemplo, mediante los denominados experimentos de tablero
de chequeo (muestras de alto positivo junto a muestras negativas), antes de
realizar las pruebas rutinarias.
21
y Versión 04, ES
DATOS DE RENDIMIENTO
10. DATOS DE RENDIMIENTO
 Los kits MagNA Pure 96 y sus reactivos se utilizan en combinación con el
sistema MagNA Pure 96 para el aislamiento y la purificación de ácidos
nucleicos totales (ADN/ARN) a partir de especímenes biológicos para
propósitos de diagnóstico in vitro. 
A continuación, se muestran los datos representativos del rendimiento.
Dichos datos muestran una ejemplificación del rendimiento de los
materiales de muestras más comunes a fin de demostrar el rendimiento
avanzado del sistema. Los resultados obtenidos pueden diferir en función
de la muestra y los parámetros, por lo que el usuario debe establecer las
características de rendimiento apropiadas. Para propósitos de diagnóstico,
los resultados siempre se deben evaluar junto con la aplicación y el resto
de datos correspondientes. 
Para la preparación de muestras con el equipo MagNA Pure 96, se utilizó
tanto MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit como
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit para producir
los datos de rendimiento que se muestran a continuación.
10.1
Precisión de la eficacia de purificación
Para determinar la precisión de la eficacia de purificación, el ADN genómico
se purificó a partir de sangre total. La producción y pureza de los ácidos
nucleicos aislados se determinó mediante una medición de OD. A
continuación, se describen la configuración experimental y los resultados.
Tipo de kit
Protocolo de purificación DNA Blood SV
Tipo de muestra
Sangre total (7,6 × 106 leucocitos/ml)
Volumen de entrada de
muestras
200 ␮l
Volumen de la elución
100 ␮l
Réplicas por experimento 24
Tabla 2: configuración experimental para realizar el análisis de la producción y la
pureza
Experimento 1
Producción (␮g)
CV (%)
OD 260/280
CV (%)
22
5,6
3,9
1,9
2,5
Experimento
2
5,6
5,5
1,9
4,4
Experimen
to 3
5,5
6,5
1,9
1,8
y Versión 04, ES
Tabla 3: resultados (valores medios) de producción y pureza del ADN, para ADN
genómico purificado proveniente de sangre total
 La producción depende en gran medida del recuento de células
sanguíneas y, por lo tanto, puede variar según el donante.
10.2
Rendimiento analítico
Se realizó una qPCR/RT-PCR en tiempo real en el equipo LightCycler® 480
con 5 ␮l de eluido en un volumen de PCR total de 20 ␮l. Los estándares de
cuantificación y las muestras de control se añadieron directamente antes de
iniciar la PCR.
Parámetro
Virus Parvo B19
Virus de la hepatitis A
(VHA)
Ciclofilina A (CicA)
Tipo de
muestra
Plasma EDTA
Plasma EDTA enriquecido
Sangre total reunida de
enriquecido con el virus con el virus de la hepatitis A diferentes donantes
Parvo B19
(7,6 × 106 leucocitos/ml)
Objetivo
Material de stock interno Material de stock interno del ADN genómico humano
del virus Parvo B19
virus de la hepatitis A
Kit utilizado 
para el
análisis 
de PCR
(sólo disponible 
internamente)
(sólo disponible
internamente)
Ensayo interno
LightCycler® CycA:
DNA MasterPLUS
HybProbe y primers y
sondas específicos para la
ciclofilina A
Volumen de
eluido por
PCR
5 ␮l
5 ␮l
5 ␮l
Volumen de
PCR
20 ␮l
20 ␮l
20 ␮l
Equipo 
para la PCR
Equipo LightCycler® 
480
480
480
Tabla 4: resumen de los ensayos utilizados para generar los datos de rendimiento que se muestran a
continuación
Intervalo lineal y
límite de
detección (LoD)
El intervalo lineal y el límite de detección (LoD), que se pueden alcanzar
mediante los kits MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid para la
purificación de ácidos nucleicos automatizada en combinación con el equipo
MagNA Pure 96, se evaluaron mediante material de stock de virus proveniente
del virus Parvo B19 y del virus de la hepatitis A (ambos disponibles sólo
internamente).
23
y Versión 04, ES
A continuación, se describen la configuración experimental para determinar el
intervalo lineal y el límite de detección de los parámetros seleccionados y los
resultados obtenidos.
Parámetro
Virus Parvo B 19
Tipo de kit
LV Kit
NA LV Kit
Protocolo de purificación Viral NA Universal LV
Tipo de muestra
Plasma EDTA
Plasma EDTA
Volumen de entrada de
muestras
500 ␮l
500 ␮l
50 ␮l
50 ␮l
Serie de dilución
8 títulos de virus diferentes 
De 2×101 a 5×107 copias/ml
8 títulos de virus diferentes 
Puntos de datos
generales disponibles
172
176
Tabla 5: configuración experimental para determinar el intervalo lineal y el LoD
Parámetro
Virus Parvo B 19
2×102
a
5×106
copias/ml
Intervalo lineal
De
Límite de detección*
(LoD_95)
Intervalo de confianza
de 68 copias/ml: 
De 48 a 156 copias/ml
Intervalo de confianza
de 119 copias/ml: 
De 75 a 279 copias/ml
Tabla 6: resultados determinados para el intervalo lineal y el LoD
* Todos los datos se evaluaron estadísticamente mediante un análisis Probit; el LoD se calculó para el intervalo
de confianza del 95% (LoD_95).
 La sensibilidad y el límite de detección dependen en gran medida del
ensayo de la PCR.
24
y Versión 04, ES
Intervalo lineal Virus Parvo B19
Ilustración 1: intervalo lineal con el protocolo Viral NA Universal LV para
purificar el virus Parvo B19 proveniente de plasma EDTA. El intervalo lineal de
esta aplicación es de 2×102 a 5×106 copias/ml. SVT/ml: título de virus enriquecido/ml,
MVT/ml: título de virus medido/ml.
Intervalo lineal Virus de la
hepatitis A (VHA)
Ilustración 2: intervalo lineal con el protocolo Viral NA Universal LV para
purificar el VHA proveniente de plasma EDTA. El intervalo lineal de esta aplicación
es de 3×103 a 1×109 copias/ml. SVT/ml: título de virus enriquecido/ml, MVT/ml: título
de virus medido/ml.
25
y Versión 04, ES
Límite de
detección del
virus Parvo B19
Ilustración 3: límite de detección del virus Parvo B19 determinado con el
protocolo Viral NA Universal LV para purificar una serie de dilución viral
realizada a partir de plasma EDTA. El LoD_95 es de 68 copias/ml. El intervalo de
confianza relacionado es de 48 a 156 copias/ml.
_____ Regresión Probit - - - - límite del 95% inferior, . . . . . . límite del 95% superior, o
LoD_95.
Límite de
detección del
virus de la
hepatitis A (VHA)
Ilustración 4: límite de detección del VHA determinado con el protocolo Viral
NA Universal LV para purificar una serie de dilución viral realizada a partir de
plasma EDTA. 
El LoD_95 es de 119 copias/ml. El intervalo de confianza relacionado es de 75 a 279
copias/ ml. _____ Regresión Probit, - - - - límite del 95 % inferior, . . . . . . límite del 95%
superior, o LoD_95.
26
y Versión 04, ES
10.3
Análisis de precisión
Se determinaron las desviaciones estándares (SD) y las variaciones de
coeficientes (CV) para las series de dilución dentro del intervalo lineal con los
parámetros siguientes: virus Parvo B19, virus de la hepatitis A y ciclofilina A.
Para determinar la precisión del ensayo, todos los datos se produjeron en un
único experimento. Para determinar la precisión entre ensayos, diferentes
usuarios realizaron tres experimentos en equipos y laboratorios distintos. La
precisión entre lotes se determinó utilizando seis lotes diferentes.
A continuación, se describen la configuración experimental para realizar un
análisis de precisión y los resultados correspondientes.
Parámetro
Virus Parvo B19
(VHA)
Tipo de kit
and Viral NA SV Kit
Viral NA SV Kit
MagNA Pure 96 DNA
and Viral NA SV Kit
Protocolo(s) 
de purificación
DNA Blood SV
Tipo de muestra Plasma EDTA
Ciclofilina A (CicA)
Plasma EDTA
Sangre total (7,6 × 106
leucocitos/ml)
Volumen de
entrada de
muestras
200 ␮l
200 ␮l
200 ␮l
Volumen de la
elución
50 ␮l
50 ␮l
100 ␮l
Serie de
dilución
De 1×103 a 1×106 
copias/ml
De 1×103 a 1×106 copias/ml No aplicable
Réplicas
8
8
®
Puntos de datos Equipo LightCycler
480
24
Equipo LightCycler 
480
480
®
Precisión 
del experimento
32
32
24
Precisión 
entre
experimentos
96
96
72
Precisión 
entre lotes
160
160
144
Tabla 7: configuración experimental para realizar un análisis de precisión
27
y Versión 04, ES
Virus Parvo B19
Precisión del experimento
Concentración (copias/ml) Media (Cp)
1×
106
1×
105
1×
104
1 × 103
SD (Cp)
CV (%)
18,0
0,14
0,78
21,5
0,21
1,00
24,9
0,31
1,23
28,5
0,39
1,37
Virus Parvo B19
Precisión entre experimentos
1×
106
18,2
0,34
1,89
1×
105
21,6
0,32
1,49
1 × 104
25,2
0,44
1,73
103
28,7
0,38
1,34
1×
Virus Parvo B19
Precisión entre lotes*
106
18,2
0,16
0,90
1 × 105
21,7
0,21
0,97
1×
104
25,1
0,39
1,55
1×
103
28,6
0,38
1,32
1×
Tabla 8: resultados de la precisión del ensayo, entre ensayos y entre lotes determinados
con material de virus Parvo B19 enriquecido en plasma EDTA
* Media de 6 lotes diferentes
Concentración (copias/ml) Media (Cp)
SD (Cp)
CV (%)
19,4
0,18
0,94
23,0
0,28
1,23
4
26,2
0,12
0,45
3
29,7
0,12
0,41
6
1 × 10
1 × 105
1 × 10
1 × 10
19,4
0,26
1,33
5
22,9
0,21
0,92
4
26,2
0,12
0,45
1 × 10
1 × 10
28
1 × 106
y Versión 04, ES
1 × 103
29,6
0,32
1,07
1×
106
19,7
0,22
1,10
1×
105
23,1
0,15
0,67
1 × 104
26,6
0,39
1,46
103
30,0
0,26
0,87
1×
Tabla 9: resultados de la precisión del ensayo, entre ensayos y entre lotes determinados
con VHA enriquecido en plasma EDTA
Ensayo de CicA
Media (Cp)
Muestra de referencia 18,1
Ensayo de CicA
SD (Cp)
CV (%)
0,20
1,12
Ensayo de CicA
0,21
1,15
0,16
0,87
Tabla 10: resultados de la precisión del ensayo, entre ensayos y entre lotes del ensayo
de CicA realizado con ADN aislado a partir de sangre total
10.4
Sustancias interferentes
La influencia de sustancias interferentes se evaluó con material de muestras
enriquecido con el virus Parvo B19 y con una serie de concentración creciente
de las siguientes sustancias prevalentes: hemoglobina (hemoglobina humana,
Sigma- Aldrich Co. LLC), bilirrubina (Sigma-Aldrich Co. LLC) y lípidos
(emulsión de intralípidos al 20%, Sigma-Aldrich Co. LLC).
A continuación, se describen la configuración experimental para evaluar la
influencia de las sustancias interferentes y los resultados correspondientes:
Parámetro
Virus Parvo B19
Tipo de kit
Protocolo de
purificación
Tipo de muestra
Sangre total
29
y Versión 04, ES
Volumen de entrada de 200 ␮l
muestras
50 ␮l
Concentración del virus 1 × 105 copias/ml
Sustancias
interferentes
Hemoglobina, bilirrubina y lípidos utilizados en 
concentraciones diferentes
Réplicas por
concentración de
inhibidor
3
Tabla 11: configuración experimental para evaluar la influencia de las siguientes
sustancias interferentes: hemoglobina, bilirrubina y lípidos
Resultados
Hemoglobi
na (mg/dl)
Cp
Bilirrubina (mg/
dl)
Cp
Lípidos (mg/
dl)
Cp
0
21,0
0
20,8
0
21,6
100
21,3
6,6
21,0
200
21,6
200
21,2
13,2
21,2
400
21,5
300
21,2
19,8
20,9
600
21,9
400
21,1
26,4
21,0
800
21,9
500
21,1
33,0
21,3
1.000
21,8
600
21,0
39,5
21,4
1.200
21,5
700
21,1
46,1
21,3
1.400
21,6
800
21,3
52,8
21,0
1.600
21,3
900
21,5
59,4
21,0
1.800
21,2
1.000
n.d.*
66,0
21,5
2.000
21,1
Media
21,1
Media
20,8
Media
21,6
Tabla 12: resultados del punto de cruce (Cp) de las muestras enriquecidas con
sustancias interferentes
* No determinado debido a un error de pipeteo
No se observó que ninguna de las sustancias interferentes influyera en los
puntos de cruce. El intervalo de puntos de cruce obtenido es a 0,8.
30
y Versión 04, ES
10.5
Pruebas de contaminación cruzada
El riesgo de contaminación cruzada se evaluó mediante la prueba del virus
Parvo B 19. Durante los dos primeros experimentos sólo se procesaron
muestras negativas para detectar una posible contaminación en el sistema
MagNA Pure 96. Después se realizaron tres experimentos, en los que se
procesó un patrón de tablero de chequeo de muestras positivas y negativas
alternativamente. En el último experimento, sólo se procesaron muestras
negativas. Una muestra se identificaba como negativa si no se obtenía una
señal de detección después de 45 ciclos de PCR.
A continuación, se describen la configuración experimental para detectar una
posible contaminación en el sistema MagNA Pure 96 y los resultados
correspondientes.
Parámetro
Virus Parvo B19
Tipo de kit
Protocolo de
purificación
Volumen de entrada
de muestras
500 ␮l
Volumen de la
elución
50 ␮l
Muestras positivas
5 × 107 copias/ml en plasma EDTA
Muestras negativas
Plasma EDTA negativo
Número de
experimentos
A) 2 experimentos sólo con muestras negativas
B) 3 experimentos con patrón de tablero de
chequeo
C) 1 experimento sólo con muestras negativas
Análisis de PCR
LightCycler® Parvo B19 Quantification Kit con una
placa de 384 pocillos en el equipo LightCycler®
480
Tabla 13: configuración experimental para evaluar el riesgo de contaminación cruzada
Experi
mento
Media de Cp de  Desviación
las muestras
estándar
positivas
Tasa positiva
Tasa
negativa
1
n/a
n/a
0/96
96/96
2
n/a
n/a
0/96
96/96
3
17,8
0,20
48/96
48/96
4
20,0
0,22
48/96
48/96
31
y Versión 04, ES
5
18,6
0,12
48/96
48/96
6
n/a
n/a
0/96
96/96
Tabla 14: resultados de los experimentos de contaminación cruzada basados en los
puntos de cruce medios y las tasas de llamadas.
Tal como se indica en la tabla 14, no se detectó contaminación cruzada bajo
las condiciones descritas anteriormente.
10.6
Comparación de métodos
Detección de la
mutación JAK2
La comparación de métodos se obtuvo mediante el sistema MagNA Pure 96,
con el que se realizaron las pruebas a partir de muestras de sangre total del
alelo JAK2-V617F. Este método compara la proporción de mutaciones y tipos
normales. El ADN se aisló mediante el sistema MagNA Pure 96 y el método
manual QIAamp DNA Blood Mini Kit establecido. El análisis de PCR se realizó
mediante JAK2 MutaQuant®Kit, según las instrucciones del fabricante.
Parámetro
Jak2 V617F
Tipo de kit
Protocolo de
purificación
DNA Blood SV
Tipo de muestra
Sangre total
Volumen de entrada de 200 ␮l
muestras
50 ␮l
Muestras probadas*
50
Análisis de PCR
Marsella en el equipo Rotor-Gene 3000
Método comparador:
preparación de la
muestra
(Volumen de la elución: 85 μl)
Tabla 15: la configuración experimental para realizar las pruebas a partir de sangre
total del alelo JAK2-V617F
* Se obtuvieron cincuenta muestras clínicas ciegas (muestras adicionales) mediante
procedimientos de diagnóstico rutinarios, y se midieron en paralelo.
32
y Versión 04, ES
Comparador
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 50 muestras
Negativas
Positivas para
JAK2_V617F
Total
Negativas
33
0
33
Positivas para
JAK2_V617F
0
17
17
Total
33
17
50
Tabla 16: en total, se incluyeron 50 muestras en este análisis. La coincidencia en la
identificación de muestras positivas y negativas fue del 100% entre el método
automatizado MagNA Pure 96 y el método manual QIAamp DNA Blood Mini Kit.
Ilustración 5: la comparación de métodos se basó en la proporción final de
mutaciones y tipos normales entre la purificación mediante MagNA Pure 96 DNA and
Viral NA SV Kit y mediante QIAamp DNA Blood Mini Kit.
……….. Línea de identidad, - - - - - Regresión Bablok (1,02x); Pearson r= 0,989
33
y Versión 04, ES
ADN
Pneumocystis
jiroveci
Los datos de la comparación de métodos obtenidos mediante el sistema
MagNA Pure 96 se evaluaron mediante la realización de pruebas a muestras
de lavado broncoalveolar (LBA) para la detección de ADN Pneumocystis
jiroveci.
Se aplicó la siguiente configuración experimental:
Parámetro
ADN Pneumocystis jiroveci
Tipo de kit
Protocolo de
purificación
Tipo de muestra
Lavado broncoalveolar (LBA)
Volumen de entrada
de muestras
500 ␮l
Volumen de la
elución
100 ␮l
Muestras probadas*
96
Análisis de PCR**
Ensayo de qPCR interno en tiempo real
combinado con LightCycler® FastStart DNA
Master HybProbe
LoD: <50 copias/reacción
Intervalo lineal: 103 - 108 copias/ml
Las muestras > 104 copias/ml se valoran como
positivas
Método comparador: QIAamp DNA Mini Kit:
preparación de la
Volumen de muestra: 500 ␮l
muestra
Volumen de elución: 200 ␮l
Tabla 17: configuración experimental para la realización de pruebas a muestras de
lavado broncoalveolar (LBA) para la detección de ADN Pneumocystis jiroveci
* Se obtuvieron noventa y seis muestras clínicas ciegas (muestras adicionales) mediante
procedimientos de diagnóstico rutinarios, y se midieron en paralelo.
**El ensayo de PCR fue desarrollado y validado por el Instituto de Higiene y
Microbiología Médica del Hospital Universitario de Regensburg.
34
y Versión 04, ES
Comparador
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 96 muestras
Negativas
Positivas para
ADN P.jiroveci
Total
Negativas
70
1
71
Positivas para
ADN P.jiroveci
0
25
25
Total
70
26
96
Tabla 18: en total, se evaluaron como positivas 26 muestras de un total de 96. La
coincidencia positiva de las muestras positivas fue de 25 de un total de 26 (96%). La
coincidencia positiva de las muestras negativas fue de 70 de un total de 70 (100%).
Ilustración 6: la comparación de métodos de las muestras positivas se basó en los
puntos de cruce medidos en 2 experimentos consecutivos que llevaron a cabo el ensayo
de qPCR interno en tiempo real para la detección de Pneumocystis jiroveci.
…….. Línea de identidad, - - - - - Regresión Bablok (1,01x+0,91); Pearson r= 0,9312 
(Experimento 1: ×) _______ Regresión Bablok (1,01x +1,07); Pearson r= 0,9304
(Experimento 2: o)
35
y Versión 04, ES
INFORMACIÓN ADICIONAL
11. INFORMACIÓN ADICIONAL
11.1
Símbolos
En este documento, se utilizan los símbolos siguientes para destacar
información importante:
Símbolo
Descripción

Nota importante

Nota informativa
C
Para diagnóstico in vitro
I
Número de catálogo
B
Código de lote
s
Fecha de caducidad
r
Límite de temperatura (Conservar a)
n
Distribuidor
t
Fabricante
)
Almacenar protegido de la luz solar
(embalaje exterior del material fungible)
2
11.2
Utilizar una sola vez (embalaje exterior del
material fungible)
v
El kit cumple los requisitos de la Directiva
IVD 98/79/CE.
*
Disponible en Roche Applied Science
Cambios respecto a la versión anterior
Se han realizado cambios editoriales.
12. MARCAS REGISTRADAS
LIGHTCYCLER y MAGNA PURE son marcas registradas de Roche.
El resto de nombres de productos y marcas registradas son propiedad de sus
respectivos propietarios.
13. RENUNCIA DE RESPONSABILIDAD DE LA LICENCIA
Este es un producto con licencia registrada conforme a patentes propiedad de
Qiagen.
36
y Versión 04, ES
RENUNCIA DE RESPONSABILIDAD REGULADORA
14. RENUNCIA DE RESPONSABILIDAD REGULADORA
Para diagnóstico in vitro
37
y Versión 04, ES
v
Alemania, +49 621 7590
Fabricado en Alemania
_________________________________________________________________
0512.06671934001➃
t
n Distribuido en EE.UU. por Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EE.UU.
68298 Mannheim
Alemania
C
y Version 04
Version du document : Mai 2012
Réactifs pré-remplis pour l'instrument MagNA Pure 96. Ce kit est utilisé pour
l'extraction de l'ADN génomique et des acides nucléiques viraux à partir d'un
volume maximum de 1 000 ␮L de sang total, plasma ou sérum ou à partir d'un
volume maximum de 25 mg de tissus frais/congelés, et à partir d'un maximum de
1 × 106 cellules en culture, de même que pour l'extraction d'acides nucléiques
bactériens, fongiques et viraux à partir d'un volume maximum de 1 000 ␮L
d'échantillon d'origine humaine.
I 06 374 891 001
Kit prévu pour 3 ⫻ 96 réactions
r Conserver à une température comprise entre ⫹15 et ⫹25 °C
 Conserver le kit à l'abri de la lumière.
 Conserver le kit à l'abri de toute source magnétique.
Table of Contents
1.
2.
3.
4.
USAGE PRÉVU ................................................................................................................. 3
PRÉSENTATION DU KIT ................................................................................................. 3
PRINCIPE/RÉCAPITULATIF ........................................................................................... 3
RÉACTIFS - SOLUTIONS PRÉPARÉES ......................................................................... 4
4.1
4.2
Nombre de tests
Kit/Contenu
4
4
5.
PRÉCAUTIONS ET AVERTISSEMENTS ........................................................................ 6
5.1
5.2
5.3
5.4
Précautions
Précautions d'utilisation
Procédures de laboratoire
Traitement des déchets
6
7
8
8
6.
STOCKAGE ET STABILITÉ .............................................................................................. 9
6.1
6.2
6.3
Kit et réactifs
Collecte de spécimens et stockage des échantillons
Stockage des acides nucléiques extraits et des éluats
9
9
10
7.
MATÉRIEL ....................................................................................................................... 11
7.1
7.2
Matériel fourni
Matériel et dispositifs requis, mais non fournis
8.
PROCÉDURES DE DOSAGE ......................................................................................... 12
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
Protocoles d'extraction
Types d'échantillon et étapes préalables à l'extraction
Contrôle qualité
Procédure d'extraction
Fin d'un cycle
9.
10.
LIMITES ET INTERFÉRENCES ...................................................................................... 21
DONNÉES DE PERFORMANCES ................................................................................. 22
10.1
10.2
10.3
10.4
10.5
10.6
Précision de l'efficacité de l'extraction
Performances analytiques
Analyse de précision
Substances interférentes
Test de contamination croisée
Comparaison de méthodes
11
11
12
13
18
19
20
22
23
27
29
31
32
11.
INFORMATIONS SUPPLÉMENTAIRES ...................................................................... 36
11.1
11.2
Symboles
Modifications de la version précédente
12.
13.
14.
MARQUES ....................................................................................................................... 36
LIMITATION DE LICENCE ............................................................................................ 36
AVIS DE NON RESPONSABILITÉ ............................................................................... 37
2
36
36
y Version 04, FR
USAGE PRÉVU
1.
USAGE PRÉVU
Le MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit est un kit de réactifs
utilisé conjointement avec le système MagNA Pure 96 pour l'extraction et la
purification des acides nucléiques totaux (ADN/ARN) à partir de spécimens
biologiques à des fins de diagnostic in vitro.
Toute application de diagnostic in vitro utilisant la procédure de préparation
des échantillons conjointement à un test en aval d'acides nucléiques IVD quel
qu'il soit doit être évaluée en fonction des paramètres IVD individuels.
2.
PRÉSENTATION DU KIT
Le MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit est spécifiquement
conçu pour l'extraction :
• D'acide nucléique provenant d'un volume maximum de 1 000 ␮L de sang
total, plasma ou sérum
• D'acide nucléique bactérien, fongique et viral provenant d'un volume maximum de 1 000 ␮L d'échantillon ou de lysat d'origine humaine
• D'acide nucléique provenant d'un maximum de 1 × 106 cellules en culture
• D'acide nucléique provenant d'un volume maximum de 25 mg de tissus frais/
congelés.
Les acides nucléiques répondent aux normes de qualité requises pour une
analyse quantitative de PCR/RT-PCR haute sensibilité.
3.
PRINCIPE/RÉCAPITULATIF
La procédure d'extraction d'acide nucléique est basée sur la technologie
MagNA Pure de particules de verre magnétiques (PVM). 
Les étapes principales d'une procédure d'extraction d'acide nucléique avec le
système MagNA Pure 96 sont les suivantes :
1. L'échantillon est lysé, les acides nucléiques sont libérés et les nucléases
sont dénaturées.
2. Les acides nucléiques se lient à la surface de verre (silice) des particules de
verre magnétiques ayant été ajoutées, en raison des conditions de sels
chaotropiques et de la concentration ionique élevée du tampon de lyse/de
liaison.
3. Le complexe de particules de verre magnétiques et d'acides nucléiques liés
est séparé du reste de l'échantillon lysé.
4. Les substances non liées, comme les protéines, débris cellulaires et inhibiteurs de PCR sont supprimées lors de plusieurs étapes de lavage.
5. Les acides nucléiques extraits sont élués des PVM.
3
y Version 04, FR
RÉACTIFS - SOLUTIONS PRÉPARÉES
4.
4.1
Nombre de tests
Le kit est conçu pour la réalisation de
• 3 × 96 extractions d'ADN génomique et d'acide nucléique viral à partir d'un
volume maximal de 500 ␮L de sang total, plasma ou sérum ou à partir d'un
volume maximal de 1 × 106 cellules en culture, ou
• 3 × 96 extractions d'acide nucléique bactérien, fongique et viral à partir d'un
volume maximal de 500 ␮L d'échantillon d'origine humaine, ou
• 3 × 96 extractions à partir d'un volume maximal de 25 mg de tissus frais/
congelés, ou
• 3 × 48 extractions à partir de 1 000 ␮L de sang total, de plasma ou de sérum,
ou
• 3 × 48 extractions d'acide nucléique bactérien, fongique et viral à partir d'un
volume maximal de 1 000 ␮L d'échantillon d'origine humaine.
4.2
Kit/Contenu
Composant
Désignation
Plateau 1
Plateau de réac- 3 plateaux par kit
tifs 1
Conteneur 1
Wash Buffer I
• 160 mL
• < Chlorhydrate de guanidine 6 M, 
< 50 % EtOH, < 30 mM Tris HCl
• pour éliminer les impuretés
Conteneur 2
Wash Buffer I
• 80 mL
• < Chlorhydrate de guanidine 6 M, 
Conteneur 3
Lysis/Binding
Buffer
• 80 mL
• < Thiocyanate de guanidine 6 M, 
< 30 % Triton X-100, < 60 mM Tris HCl
• pour la lyse des cellules/virus et la liaison des acides nucléiques
Plateau 2
Plateau de réac- 3 plateaux par kit
tifs 2
Conteneur 1
Conteneur 2
4
Contenu/Fonction
vide
Proteinase K
• 15 mL
• 2 % protéinase K, 50 % glycérol
• pour la digestion des protéines
y Version 04, FR
Conteneur 3
Elution Buffer
• 80 mL
• < Tampon 60 mM Tris-HCl
• pour l'élution des acides nucléiques
Conteneur 4
Wash Buffer III
• 160 mL
• < Tampon 20 mM acétate de sodium
Flacon 1
Magnetic Glass 
Particles
• 6 flacons de 18 mL chacun
• Suspension de PVM contenant de l'isopropanol
• pour la liaison des acides nucléiques
 Le tampon système MagNA Pure 96 (interne/externe)* sert de tampon de
lavage Wash Buffer II pour ce kit.
 Tous les composants du kit sont prêts à l'emploi.
5
y Version 04, FR
PRÉCAUTIONS ET AVERTISSEMENTS
5.
5.1
Précautions
 Plusieurs tampons du MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume
Kit contiennent des composants dangereux ou présentant un risque biologique. Pour de plus amples informations, consultez la Figure 1 (Plateau de
réactifs 1), la Figure 2 (Plateau de réactifs 2) et le Tableau 1. Évitez tout
contact de ces réactifs avec la peau, les yeux ou les muqueuses. En cas de
contact, rincez immédiatement et abondamment à l'eau la zone affectée.
En cas de projection de réactifs, diluez avec de l'eau avant d'essuyer.
 Ne laissez pas les réactifs contenant du thiocyanate de guanidine entrer
en contact avec une solution à l'hypochlorite de sodium (eau de Javel) ou
des acides. Ces mélanges produisent un gaz hautement toxique. Cette
précaution est particulièrement importante lors du nettoyage du couvercle
du portoir de déchets du système MagNA Pure 96.
Fig. 1 : Plateau de réactifs 1
6
Fig. 2 : Plateau de réactifs 2
Composants dangereux 
et présentant un risque biologique
Composant
Désignation
Plateau 1
Plateau de réactifs 1
Conteneur 1
Wash Buffer I
• chlorhydrate de guanidine
• éthanol
Conteneur 2
Wash Buffer I
• chlorhydrate de guanidine
• éthanol
y Version 04, FR
Conteneur 3
Plateau 2
Plateau de réactifs 2
Conteneur 1
Vide
Conteneur 2
Proteinase K
Conteneur 3
Elution Buffer
Conteneur 4
Wash Buffer III
Flacon 1
Magnetic Glass 
Particles
• thiocyanate de guanidine
• protéinase K
• isopropanol
Tableau 1 : Liste des réactifs contenant des composants dangereux et présentant un risque biologique
5.2
Précautions d'utilisation
• Portez des gants jetables et changez-les fréquemment.
• N'utilisez pas le kit après la date de péremption.
De même, pour minimiser le risque de contamination croisée pouvant occasionner des résultats faussement positifs, suivez les instructions suivantes :
• Procédez à la préparation des échantillons, la configuration de PCR/RT-PCR
et la PCR/RT-PCR dans des endroits séparés.
• Jetez les embouts de pipettes dans des conteneurs fermés hermétiquement
afin d'éviter toute contamination atmosphérique.
Les tubes de réaction et les réactifs contaminés aux nucléases dégradent la
matrice. Suivez les instructions suivantes pour minimiser le risque de
contamination :
• Évitez tout contact avec les surfaces ou substances risquant de causer une
contamination aux nucléases.
• N'utilisez que les réactifs fournis dans ce kit. L'utilisation de substituts risque
d'introduire des nucléases.
• Nettoyez et décontaminez les instruments et surfaces de travail, notamment
les pipettes, à l'aide de réactifs de décontamination disponibles dans le commerce.
• N'utilisez que des tubes de microcentrifugeuse et embouts de pipettes
anti-aérosols stériles exempts de nucléases.
• Utilisez une surface de travail spécifiquement conçue pour travailler avec de
l'ARN. Si possible, utilisez des tubes de réaction et pipeteurs spécialement
conçus pour la matrice d'ARN.
7
y Version 04, FR
5.3
Procédures de laboratoire
• Toutes les substances d'origine humaine et tous les déchets qui en résultent
doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Nettoyez et
désinfectez consciencieusement toutes les surfaces de travail à l'aide de
désinfectants recommandés par les autorités locales.
• La sensibilité et le titre d'éventuels pathogènes dans l'échantillon étant
variables, l'utilisateur doit optimiser l'inactivation des pathogènes et de suivre
les mesures appropriées conformément aux réglementations en vigueur.
• Évitez de manger, de boire ou de fumer dans la zone de travail du laboratoire.
• Ne pipetez jamais de substances à la bouche.
• Portez des gants de protection jetables, des blouses de laboratoire et des
lunettes de protection lors de la manipulation d'échantillons ou de réactifs de
kit.
• Évitez toute contamination microbienne et aux nucléases des réactifs lors du
retrait d'aliquots de flacons de réactifs. Utilisez des embouts de pipettes
jetables stériles.
• Lavez-vous consciencieusement les mains après avoir manipulé des spécimens et réactifs de kit.
5.4
Traitement des déchets
• Les fiches de sécurité des produits (Material Safety Data Sheets ou MSDS)
sont disponibles en ligne sur le site www.e-labdoc.roche.com ou sur
demande auprès de votre représentant Roche local.
• Éliminez les déchets et réactifs non utilisés conformément aux réglementations nationales, régionales et locales.
• Portez des gants de protection jetables, des blouses de laboratoire et des
lunettes de protection lors de l'élimination d'échantillons et de réactifs de kit.
• Pour éliminer les réactifs des conteneurs, suivez la procédure ci-dessous :
1. Percez le film dans le coin d'un conteneur du plateau de réactifs à l'aide
d'un consommable en plastique solide, tel qu'une pipette de culture de
cellules.
2. Repliez le film et éliminez le liquide dans un conteneur prévu pour les
déchets.
3. Répétez les étapes 1 et 2 jusqu'à ce que tous les conteneurs soient
vides.
8
y Version 04, FR
STOCKAGE ET STABILITÉ
6.
6.1
Kit et réactifs
• Le kit est conditionné à température ambiante.
• Les composants du kit restent stables à une température comprise entre
+15 et +25 °C jusqu'à la date de péremption figurant sur l'étiquette.
 Conservez le kit à l'abri de la lumière et de toute source magnétique.
• Les réactifs peuvent être conservés pendant 32 heures à une température
comprise entre +15 et +25 °C sur la plateforme de l'instrument MagNA Pure
96.
• Un ensemble de plateaux de réactifs (plateau 1 et plateau 2) peut être utilisé
pour un maximum de quatre cycles individuels. Une fois ouverts, les plateaux
de réactifs peuvent être utilisés pour des analyses supplémentaires au sein
du même instrument MagNA Pure 96 dans un délai de 28 jours, à condition
qu'ils soient fermés hermétiquement à l'aide d'un film de protection MagNA
Pure 96* et conservés à une température comprise entre +2 et +8 °C. Équilibrez les composants du kit à une température comprise entre +15 et +25 °C
pendant une heure avant toute utilisation.
 Vous ne pouvez réutiliser les plateaux de réactifs partiellement usagés que
sur le même instrument MagNA Pure 96. Le logiciel MagNA Pure 96
recherche l'inventaire de chaque instrument à l'aide des codes-barres de
réactifs, reconnaît les réactifs et plateaux d'embouts partiellement usagés
et les traite en conséquence lors du cycle suivant.
 Il existe un risque d'évaporation si les plateaux de réactifs ne sont pas fermés hermétiquement. Des conditions de stockage inappropriées peuvent
avoir un impact négatif sur les performances de la procédure d'extraction.
6.2
Collecte de spécimens et stockage des échantillons
Pour une détection sensible des acides nucléiques, il est important de garantir
un stockage approprié des échantillons (de ⫺15 à ⫺25 °C pour l'ADN ou de
⫺60 à ⫺80 °C pour l'ARN). Il existe un risque de dégradation de l'ADN ou de
l'ARN si les échantillons ne sont pas stockés de manière adéquate.
 N'utilisez pas de plasma ou de sang contenant de l'héparine.
 N'utilisez pas d'échantillon ayant été exposé à des températures élevées
pour une période excessive.
 Si les échantillons ont été conservés par congélation, décongelez-les en
les agitant légèrement, par exemple à l'aide d'un mélangeur à rouleaux de
laboratoire.
9
y Version 04, FR
6.3
Stockage des acides nucléiques extraits et des éluats
Pour garantir une stabilité maximum des acides nucléiques élués, procédez
immédiatement à la configuration de PCR/RT-PCR. Ne conservez pas les
acides nucléiques élués sur la plateforme du système MagNA Pure 96.
Pour le stockage, fermez hermétiquement la plaque de sortie à l'aide d'un film
de protection MagNA Pure 96* et conservez à une température comprise
entre ⫺15 et ⫺25 °C pour l'ADN ou entre ⫺60 et ⫺80 °C pour l'ARN. Conservez les acides nucléiques extraits en aliquots afin d'éviter des congélations et
décongélations à répétitions.
Lors d'un stockage des plaques de sortie contenant des éluats hors de l'instrument MagNA Pure 96, fermez hermétiquement les plaques à l'aide d'un film
de protection MagNA Pure 96*.
 Pour poursuivre le traitement, vous devez retirer le film de protection. Ne
retirez pas trop brusquement le film de protection, vous risqueriez d'entraîner une contamination croisée due à la formation d'aérosols et à leur propagation dans les différents puits.
 Si les éluats ont été stockés congelés, mélangez-les doucement après
décongélation en pipetant dix fois avant d'effectuer toute autre étape en
aval, notamment des PCR/RT-PCR ou des mesures de D.O. Le volume de
mélange doit correspondre au moins à la moitié du volume d'éluats. Si les
acides nucléiques ne sont pas pré-mélangés et distribués de façon homogène dans la solution, il se peut que les résultats ne soient pas reproductibles pour des analyses ultérieures.
 Pour une longue conservation, il est recommandé de transférer les éluats
dans une plaque d'archivage.
10
y Version 04, FR
MATÉRIEL
7.
MATÉRIEL
7.1
Matériel fourni
Voir la Section 4 : Réactifs et solutions préparées
7.2
Matériel et dispositifs requis, mais non fournis
• MagNA Pure 96 Instrument (Instrument MagNA Pure 96) (n° de réf. 06 541
089 001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (Internal) (Tampon système (interne) MagNA
Pure 96) (n° de réf. 06 430 112 001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (External) (Tampon système (externe) MagNA
Pure 96) (n° de réf. 06 640 729 001)
• MagNA Pure 96 Filter Tips (Embouts à filtre MagNA Pure 96) (1000 μL) (n°
de réf. 06 241 620 001)
• MagNA Pure 96 Processing Cartridge (Cartouche de traitement MagNA
Pure 96) (n° de réf. 06 241 603 001)
• MagNA Pure 96 Output Plate (Plaque de sortie MagNA Pure 96) (n° de réf.
06 241 611 001)
• MagNA Pure 96 Internal Control Tube (Tube de contrôle interne MagNA
Pure 96) (n° de réf. 06 374 905 001)
• MagNA Pure 96 Sealing Foil (Film de protection MagNA Pure 96) (n° de réf.
06 241 638 001)
• Réactifs facultatifs :
• MagNA Pure 96 External Lysis Buffer (n° de réf. 06 374 913 001)
• MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer (pour l'extraction d'acide nucléique
bactérien, fongique et viral à l'aide du protocole Pathogen Universal, si
une lyse externe est requise) (n° de réf. 06 374 921 001)
• MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer (n° de réf. 06 640 702 001)
• Protéinase K, niveau de PCR, activité (+37 °C) b 0,6 U/␮L 
(par exemple n° de réf. 03 115 828 001)
• Facultatif, instrument MagNA Lyser (n° de réf. 003 358 968 001 à partir de 
SN 40467540, n° de réf. 03 358 976 001 à partir de SN 40405218)
• Facultatif, MagNA Lyser Green Beads (Cat. No. 03 358 941 001)
• Équipement de laboratoire standard
• Pipettes et embouts anti-aérosols exempts de nucléases, tels que des
embouts extra longs de 10 cm, pour la pré-distribution d'échantillons
dans la cartouche de traitement MagNA Pure 96.
• Facultatif, centrifugeuse pour les tubes.
11
y Version 04, FR
PROCÉDURES DE DOSAGE
8.
8.1
Protocoles d'extraction
Divers protocoles d'extraction pour l'instrument MagNA Pure 96 sont disponibles pour l'extraction d'acide nucléique à l'aide du MagNA Pure 96 DNA and
Viral NA Large Volume Kit. Chaque protocole est optimisé pour correspondre
à des échantillons spécifiques.
 N'utilisez les protocoles que pour les échantillons spécifiés, sans quoi les
performances de la procédure d'extraction risquent d'être affectées. Une
utilisation inappropriée risque d'occasionner la formation d'amas et la
perte de particules de verre magnétiques, une contamination croisée des
échantillons, voire un endommagement de l'instrument. Seuls les types
d'échantillon spécifiés peuvent être utilisés conjointement au cours d'un
même cycle.
Pour des applications de diagnostic in vitro, les protocoles suivants peuvent
être utilisés conjointement au MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large
Volume Kit. Pour chaque protocole, le volume d'échantillon et le volume d'élution peuvent être sélectionnés dans le menu du logiciel.
12
Nom du protocole
Échantillon
Volume
d'élution1
DNA Blood LV
500 ␮L de sang total
 N'utilisez pas plus de 1 × 107
cellules sanguines/mL.
100 ou 200 ␮L
DNA Blood LV 1000* 1 000 ␮L de sang total
100 ou 200 ␮L
DNA Blood ext lys LV 1 000 ␮L de lysat (à partir de 500
␮L de sang total)
100 ou 200 ␮L
Viral NA Plasma LV
500 ␮L de plasma EDTA
50 ou 100 ␮L
Viral NA Plasma LV
1000*
1 000 ␮L de plasma EDTA
50 ou 100 ␮L
Viral NA Plasma 
ext lys LV
1 000 ␮L de lysat (à partir de
500 ␮L de plasma ou de sérum)
50 ou 100 ␮L
LV
500 ␮L d'échantillon (recommandé 50 ou 100 ␮L
pour le plasma et le sérum citraté)
y Version 04, FR
LV 1000*
1 000 ␮L d'échantillon (recom50 ou 100 ␮L
mandé 
pour le plasma et le sérum citraté)
Pathogen Universal2 500 ␮L d'échantillon ou 500 ␮L de 50 ou 100 ␮L
500
lysat
Pathogen Universal2 1 000 ␮L d'échantillon ou 1 000 ␮L 50 ou 100 ␮L
1000*
de lysat
DNA Cells LV
Jusqu'à 1 × 106 cellules en culture 100 ou 200 ␮L
re-suspendues dans 200 ␮L de PBS  Un volume de
100 μl n'est pas
recommandé
pour les cellules en culture
à haute teneur
en ADN
DNA Tissue LV
Jusqu'à 25 mg de tissu 
homogénéisé dans un volume de
200 μl
100 ou 200 ␮L
 En cas d'utilisation de plus de
5 mg de tissus,
nous recommandons
d'éluer dans
200 ␮L
1 Vous
pouvez augmenter la concentration en acides nucléiques dans l'éluat de même
que la sensibilité d'applications en aval en sélectionnant un faible volume d'élution.
Cependant, l'efficacité de l'élution et le rendement global d'acide nucléique risquent
d'être inférieurs par rapport à une analyse utilisant un volume d'élution plus élevé.
2 Les protocoles Pathogen Universal sont conçus pour l'extraction d'acide nucléique
bactérien, fongique et viral à partir d'une grande diversité de types d'échantillons d'origine humaine. Les protocoles peuvent être utilisés directement pour 500 ␮L ou
1 000 ␮L d'échantillon ou pour 500 ␮L ou 1 000 ␮L de lysat. Utilisez un volume d'élution de 50 μl pour les échantillons liquides à faible contenu cellulaire, par exemple
l'urine.
 Pour les protocoles marqués d'un astérisque (*), le volume d'échantillon
est divisé en deux échantillons et traité dans deux puits séparés de la cartouche de traitement MagNA Pure 96. En cas d'utilisation d'un contrôle
interne, celui-ci est ajouté à chaque puits séparément. La quantité totale
de contrôle interne ajoutée à chaque échantillon est donc de 40 ␮L au lieu
de 20 ␮L. Il vous faut donc doubler le volume de contrôle interne chargé
sur l'instrument. De même, multipliez par deux le nombre de « tests » dans
la boîte de dialogue « Edit Internal Control Barcode ». Une dilution du
contrôle interne peut être nécessaire pour certaines applications.
8.2
Types d'échantillon et étapes préalables à l'extraction
Pour obtenir un résultat optimal lors des procédures en aval, notamment dans
la cadre de dosages de RT-PCR en temps réel, par exemple à l'aide d'instruments LightCycler®, ne traitez pas les échantillons avec un volume supérieur à
13
y Version 04, FR
celui que le protocole d'extraction sélectionné est capable de manipuler. Vous
risquez sinon d'affecter les performances de la procédure d'extraction et
d'occasionner la formation d'amas et la perte de particules de verre magnétiques, une contamination croisée des échantillons, voire un endommagement
de l'instrument.
 Traitez tous les échantillons comme des échantillons potentiellement
infectieux.
I. Sang total
Vous pouvez utiliser du sang total frais ou congelé sans aucun traitement préalable.
 Si la formule hématologique dépasse 1 × 107 cellules sanguines/mL,
diluez le sang total à l'aide d'une solution saline tamponnée au phosphate
(PBS) avant l'utilisation afin d'éviter la formation d'amas.
 Assurez-vous que les échantillons de sang total avec anticoagulant ne
présentent pas de caillots.
II. Plasma/Sérum
Vous pouvez utiliser du plasma ou sérum frais ou congelé sans aucun traitement préalable.
 S'il y a eu formation de précipités, une étape de centrifugation est requise
pendant 10 min à 1 900 × g pour des tubes de 10 mL. N'utilisez que le surnageant comme échantillon.
III. Lysats (pour les protocoles de lyse externe)
Sang total, plasma ou sérum mélangé à du tampon de lyse externe MagNA
Pure 96 External Lysis Buffer*.
 Assurez-vous que le MagNA Pure 96 External Lysis Buffer* est équilibré à
une température comprise entre +15 et +25 °C avant toute utilisation.
Ajoutez 500 ␮L de sang total, plasma ou sérum aux 500 ␮L de MagNA Pure
96 External Lysis Buffer* et mélangez en pipetant.
 Utilisez 1 000 ␮L de lysat directement avec le protocole de lyse externe
correspondant ou stockez à une température comprise entre ⫺15 et
⫺25 °C pour l'ADN ou entre ⫺60 et ⫺80 °C pour l'ARN jusqu'aux étapes
suivantes du traitement.
 Lorsque les lysats ont été stockés congelés, décongelez sur de la glace.
Avant le transfert dans une cartouche de traitement MagNA Pure 96,
mélangez soigneusement en agitant trois fois (vortex) pendant 10 s. Centrifugez ensuite brièvement.
14
y Version 04, FR
IV. Divers lysats et types d'échantillon pour les protocoles Pathogen
Universal 500 et 1000.
Une lyse bactérienne peut être réalisée sur de nombreux types d'échantillons
différents d'origine humaine. Les types d'échantillon suivants peuvent être utilisés pour les protocoles Pathogen Universal 500 et 1000 : urine, lavage
broncho-alvéolaire, crachat, liquide céphalorachidien, écouvillons, selles, sang
total, plasma, sérum et cultures bactériennes.
 Étant donné la grande diversité des échantillons, il n'existe pas de procédure unique applicable de façon universelle. Les étapes de préparation
d'un échantillon semi-liquide (lavage broncho-alvéolaire, crachat, selles,
etc.) pour l'extraction d'acides nucléiques dépend du type de l'échantillon,
de sa viscosité, du type de particule et de la teneur en particules.
 Tout échantillon utilisant cette procédure de préparation des échantillons
conjointement à un test en aval d'acides nucléiques IVD quel qu'il soit doit
être validé en fonction des paramètres IVD individuels.
 Selon la viscosité de l'échantillon et en fonction du type de particule et de
la teneur en particules, certains échantillons peuvent être utilisés sans
aucun traitement préalable.
Protocole de lyse à l'aide de MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer*
햲
 N'utilisez pas un volume de 1 000 μl d'échantillon de départ pour
les échantillons très visqueux et riches en cellules, comme des
échantillons de crachat ou de selles.
Liquéfaction (étape facultative pour les échantillons très visqueux, par
exemple de lavage broncho-alvéolaire ou de crachat)
• Préparez une solution de base fraîche de dithiothréitol (par exemple,
5× conc. = 0,75 %).
• Ajustez la concentration finale de dithiothréitol dans l'échantillon à
0,15 % en ajoutant la solution de base de dithiothréitol.
• Incubez l'échantillon en centrifugeant à 850 rpm pendant 30 min à
une température de +37 °C jusqu'à permettre un pipetage facile.
햳
Ajout de tampon de lyse bactérienne
• Ajoutez 250 ␮L (ou 500 ␮L) de tampon de lyse bactérienne à
250 ␮L (ou 500 ␮L) d'échantillon et mélangez soigneusement.
 Si le volume d'échantillon est inférieur à 250 ␮L (ou 500 ␮L), ajoutez du tampon de lyse bactérienne pour obtenir un volume final de
500 ␮L (ou 1 000 ␮L).
햴
Digestion de protéinase K
• Ajoutez 50 ␮L (ou 100 ␮L) de protéinase K à 500 ␮L (ou 1 000 ␮L)
de mélange d'échantillon et de tampon de lyse bactérienne, puis
mélangez soigneusement.
• Laissez incuber pendant 10 minutes à une température de +65 °C.
15
y Version 04, FR
햵
Ébullition (concernant les échantillons difficiles tels que les
échantillons de crachat et de selles)
 Procédez à l'étape d'ébullition afin d'inactiver les organismes
pathogènes présents dans l'échantillon. Cette procédure peut également permettre d'améliorer la lyse des parois cellulaires pour certains types de bactéries. Pour éviter tout risque de fuite, procédez à
cette étape à l'aide de tubes de réaction fermés par des bouchons
à vis.
 Ignorez cette étape d'ébullition concernant l'extraction d'ARN, la
procédure risquant d'affecter l'intégrité de l'ARN.
• Incubez les échantillons à une température de +95 °C pendant 10
min.
• Laissez refroidir les échantillons sur de la glace. Centrifugez ensuite
brièvement afin de collecter le volume d'échantillon total au fond du
tube.
• Transférez 500 ␮L (ou 1 000 ␮L) vers une cartouche de traitement
MagNA Pure 96.
Traitement préalable des échantillons de selles
16
햲
Utilisez une quantité d'échantillon de selles de la taille d'un petit pois
que vous suspendez dans 550 ␮L de solution saline tamponnée au
phosphate (PBS).
 Pour éviter que des particules solides ne bouchent les embouts des
tubes de réaction, centrifugez pendant 5 s. à 500 × g.
 Pour l'extraction d'ARN viral, un mélange de solution saline tamponnée au phosphate et de tampon S.T.A.R (Stool Transport and
Recovery) (mélange 1:1) peut être utilisé comme alternative pour
suspendre les échantillons de selles afin de réduire le risque d'inhibition.
햳
Transférez 250 ␮L de surnageant dans un tube de microcentrifugeuse
frais de 1,5 mL et ajoutez 250 ␮L de tampon de lyse bactérienne et
50 ␮L de protéinase K.
햴
Incubez pendant 10 min à une température de +65 °C en centrifugeant à 850 rpm dans un thermomixeur, puis 10 min à une température de +95 °C.
 Pour l'extraction d'ARN, ignorez la phase d'incubation à +95 °C.
햵
Transférez 500 ␮L du lysat vers une cartouche de traitement MagNA
Pure 96.
y Version 04, FR
Traitement préalable d'écouvillons
햲
Procédez à la suspension d'un écouvillon sec dans 500 ␮L (ou
1 000 ␮L) de tampon de lyse bactérienne ; ajoutez 50 μl (ou 100 ␮L)
Proteinase K. 
Pour les écouvillons en milieu de transport, utilisez 250 ␮L (ou 500 ␮L)
de milieu de transport, ajoutez 250 ␮L (ou 500 ␮L) de tampon de lyse
bactérienne et 50 ␮L (ou 100 ␮L) de protéinase K.
햳
Pressez et retirez l'écouvillon.
햴
Incubez l'échantillon liquide pendant 10 min à une température de
+65 °C, puis 10 min à une température de +95 °C.
 Pour l'extraction d'ARN, ignorez la phase d'incubation à +95 °C.
햵
Transférez 500 ␮L (ou 1 000 ␮L) d'échantillon liquide vers une cartouche de traitement MagNA Pure 96.
V. Cellules en culture
Il est possible d'utiliser des cellules en culture re-suspendues dans 200 ␮L de
solution saline tamponnée au phosphate.
Pour l'extraction d'ADN à partir de cellules en culture cultivées en suspension,
centrifugez doucement les cellules en culture pendant 5 min à 300 × g. Au
besoin, lavez la pastille cellulaire à l'aide de solution saline tamponnée au
phosphate.
 La pastille cellulaire peut être conservée à une température comprise
entre ⫺15 et ⫺25 °C. 
Retirez le milieu de culture (ou la solution saline tamponnée au phosphate) et procédez à une nouvelle suspension des cellules dans une solution saline tamponnée au phosphate froide en pipetant ou en agitant le
tube jusqu'à ce que la pastille cellulaire soit re-suspendue. 
Les cellules en culture monocouche doivent être collectées par trypsinisation standard en suivant la procédure décrite ci-dessus. Le volume
d'échantillon requis est de 200 ␮L.
 N'utilisez pas plus de 1 × 106 cellules/200 ␮L, sans quoi les performances
de la procédure d'extraction risquent d'être affectées.
VI. Tissus frais/congelés
Il est possible d'utiliser jusqu'à 25 mg d'échantillon de tissus frais/congelés
après homogénéisation.
Homogénéisation de tissus par digestion de protéinase K
햲
Ajoutez jusqu'à 25 mg d'échantillon de tissus dans un tube de réaction, par exemple un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
17
y Version 04, FR
햳
Ajoutez 180 ␮L de MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer* et 20 ␮L
de protéinase K à l'échantillon de tissus, puis mélangez.
햴
Incubez à +55 °C jusqu'à dissolution complète des tissus (le plus souvent entre trois heures et une nuit entière).
 Cette méthode d'homogénéisation permet d'obtenir une intégrité et
un rendement élevés de l'ADN.
Homogénéisation de tissus à l'aide de l'instrument MagNA Lyser
8.3
햲
Transférez jusqu'à 25 mg d'échantillon de tissus dans un tube de
MagNA Lyser Green Beads.
햳
Ajoutez 200 ␮L de MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer.
햴
Procédez à l'homogénéisation des tissus dans l'instrument MagNA
Lyser pendant 30 à 40 secondes. Si l'homogénéisation n'est pas complète, répétez cette étape.
 Cette méthode est rapide. Cependant, en raison d'un dédoublement mécanique, il se peut que l'ADN se trouve partiellement fragmenté.
Contrôle qualité
 Effectuez toujours les contrôles appropriés.
Pour une vérification de l'ensemble de la procédure, de la préparation des
échantillons à l'analyse, effectuez les contrôles suivants :
• Contrôle positif à l'aide d'un échantillon positif à la cible.
• Contrôle négatif à l'aide d'une solution saline tamponnée au phosphate
comme substituant de l'échantillon.
• Contrôle d'extraction à l'aide d'un échantillon négatif à la cible.
• Contrôle interne en ajoutant une quantité définie de matrice de contrôle à
tous les échantillons devant être extraits.
 Pour les applications risquant d'occasionner des résultats faussement
négatifs, notamment la détection de pathogènes, l'utilisation d'un contrôle
interne approprié est indispensable. Le contrôle interne est ajouté au
cours de l'extraction d'acide nucléique, de préférence à l'aide de la fonction de contrôle interne automatique du système MagNA Pure 96. Il est
également possible d'ajouter le contrôle interne à l'échantillon manuellement. Le cas échéant, le contrôle interne doit être stable dans l'échantillon.
De plus, un contrôle interne sensible aux nucléases (ARN non protégé par
exemple) ne doit pas être utilisé dans ce contexte.
18
y Version 04, FR
Contrôle interne
Le système MagNA Pure 96 peut ajouter automatiquement un contrôle
interne à chaque échantillon à partir du tube de contrôle interne MagNA Pure
96. Le volume de contrôle interne est fixé à 20 ␮L par extraction. Pour utiliser
cette fonction, sélectionnez un contrôle interne dans la liste intitulée Internal
Control lors de la création d'un ordre. Ajoutez le volume indiqué de contrôle
interne au tube de contrôle interne, puis placez le tube sur la plateforme.
 En raison de limites d'ordre mécanique, le volume de contrôle interne
requis est supérieur à une simple multiplication du nombre d'échantillons
par 20 ␮L :
Nombre
d'échantillons
8
Volume de
CI (␮L)
650 800 1000 1350
16
24
32
40
48
56
64
1500 1650 2300 2450
72
80
88
96
2600 2800 2950 3100
 Pour certains protocoles de 1 000 ␮L, le volume d'échantillon est divisé en
deux échantillons et traité dans deux puits séparés de la cartouche de traitement MagNA Pure 96. En cas d'utilisation d'un contrôle interne, celui-ci
est ajouté à chaque puits séparément. En d'autres termes, la quantité
totale de contrôle interne ajoutée par échantillon est de 40 ␮L au lieu de
20 ␮L. Il vous faut donc doubler le volume de contrôle interne chargé sur
l'instrument et également multiplier par deux le nombre « tests » dans la
boîte de dialogue « Edit Internal Control Barcode ».
8.4
Procédure d'extraction
 L'utilisateur est responsable de la validation des performances du système
concernant toutes les procédures utilisées au sein du laboratoire.
L'instrument MagNA Pure 96 est conçu pour traiter simultanément
96 échantillons. Lors de l'utilisation d'un nombre d'échantillons autre qu'un
multiple de 8, l'instrument remplit les positions libres jusqu'à atteindre le prochain multiple de 8.
Pour une description détaillée de la configuration de l'instrument et de l'exécution d'un cycle d'extraction, consultez le manuel de formation de l'utilisateur
MagNA Pure 96 (version logicielle 2.0).
 Pipetez les échantillons pour les transférer dans le fond des puits de la
cartouche de traitement. Évitez les gouttes d'échantillon sur les parois des
puits. Utilisez la fonction de transfert d'échantillons pour que les échantillons soient automatiquement pipetés dans les puits d'une autre cartouche
de traitement. Cela permet de garantir un transfert sans danger de contamination des parois des puits par les échantillons. Pour plus d'informations, consultez le manuel de l'opérateur MagNA Pure 96 (version
logicielle 2.0).
 Assurez-vous de bien suivre les instructions concernant le type et la quantité d'échantillon (voir la section 8.2 Types d'échantillon et étapes préa-
19
y Version 04, FR
lables à l'extraction). Une utilisation inadaptée des quantités et types
d'échantillon risque d'occasionner la formation d'amas, pouvant entraîner
un faible rendement et une faible pureté de l'acide nucléique, avec risque
de contamination croisée et d'inhibition de dosages en aval, notamment
de PCR et de RT-PCR. Les échantillons aqueux, comme les acides
nucléiques dissous dans l'eau ou dans des liquides sans tampon biologique, risquent d'occasionner des performances d'extraction insuffisantes.
Le cas échéant, nous recommandons d'ajouter 10× PBS à une concentration finale de 1× PBS, ou un acide nucléique entraîneur, par exemple de
l'ARN Poly A.
 Si les réactifs ont été stockés à une température inférieure à +15 °C, équilibrez les composants du kit à une température comprise entre +15 et
+25 °C pendant au moins une heure avant toute utilisation.
 Assurez-vous que tous les conteneurs ont été insérés correctement dans
les plateaux de réactifs avant de les placer sur la plateforme.
 Il est possible d'utiliser deux ensembles de réactifs d'un même lot dans le
cadre d'un cycle d'extraction unique. Dans ce cas, nous recommandons
d'utiliser deux ensembles de contrôles externes, un pour chaque ensemble
de réactifs.
8.5
Fin d'un cycle
Une fois le cycle terminé, inspectez soigneusement l'instrument et vérifiez
qu'aucun liquide n'a été renversé. En cas de déversement, nettoyez et décontaminez l'instrument en suivant les instructions décrites dans le manuel d'utilisation du système MagNA Pure 96.
 Nettoyez et décontaminez le couvercle du portoir de déchets après
chaque cycle, tel qu'il est décrit dans le manuel de formation de l'utilisateur du système MagNA Pure 96. N'utilisez pas de solution d'hypochlorite
de sodium (eau de Javel) ou d'acides lors de la première étape de nettoyage, car ceux-ci pourraient être à l'origine de gaz hautement toxiques
en combinaison avec les réactifs contenant du thiocyanate de guanidine.
 Les résidus de particules magnétiques dans la plaque de sortie n'affectent
pas les dosages de PCR et de RT-PCR sur les instruments LightCycler® ou
les blocs thermiques traditionnels.
20
y Version 04, FR
LIMITES ET INTERFÉRENCES
9.
LIMITES ET INTERFÉRENCES
1. Des résultats fiables dépendent de procédures appropriées de collecte, de
transport, de stockage et de traitement des spécimens.
2. L'utilisation de ce produit doit être limitée au personnel formé aux techniques de purification, d'extraction et de PCR d'acide nucléique.
3. Des résultats faussement positifs risquent de survenir si un spécimen est
collecté, transporté, stocké ou manipulé de façon inappropriée. De même,
des résultats faussement positifs risquent de survenir si une quantité
d'organismes inadéquate est présente dans un spécimen.
4. Toute application de diagnostic in vitro utilisant la procédure de préparation
des échantillons conjointement à un test en aval d'acides nucléiques IVD
quel qu'il soit doit être évaluée en fonction des paramètres IVD individuels.
5. Pour réduire le risque d'un impact négatif sur les résultats, les contrôles
appropriés doivent être utilisés pour des applications en aval.
6. Les conditions de stockage (température, durée) de lysats, pastilles de cellules en culture et éluats doivent être validées en fonction des paramètres
IVD individuels.
7. Le MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit et ses réactifs sont
conçus pour être utilisés conjointement avec le système MagNA Pure 96
pour l'extraction et la purification des acides nucléiques totaux (ADN/ARN)
à partir de spécimens biologiques à des fins de diagnostic in vitro. Les
caractéristiques de performances appropriées doivent être établies par l'utilisateur, en particulier lors d'une utilisation conjointe avec une application
en aval. Tout résultat doit être interprété dans le contexte de l'ensemble des
conclusions cliniques et de laboratoires adéquates. Étant donné que la
concentration d'analyte peut varier de façon significative selon les divers
types de spécimens, nous recommandons d'établir les performances de
contamination croisée par exemple à l'aide d'une méthode dite de damier
(hauts positifs comparés aux échantillons négatifs), avant de passer aux
tests de routine.
21
y Version 04, FR
DONNÉES DE PERFORMANCES
10. DONNÉES DE PERFORMANCES
 Les kits MagNA Pure 96 et ses réactifs sont utilisés conjointement avec le
système MagNA Pure 96 pour l'extraction et la purification des acides
nucléiques totaux (ADN/ARN) à partir de spécimens biologiques à des
fins de diagnostic in vitro. 
Les données représentatives des performances sont indiquées ci-dessous.
Ces données illustrent, à titre d'exemple, les performances des échantillons les plus communs afin de démontrer les performances de pointe du
système. Les résultats obtenus étant variables selon les échantillons et les
paramètres, les caractéristiques de performances appropriées doivent être
établies par l'utilisateur. Pour des applications de diagnostic, les résultats
doivent toujours être évalués dans le contexte de l'application correspondante et d'autres conclusions. 
Pour une préparation des échantillons à l'aide de l'instrument MagNA
Pure 96, le MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit et le
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit ont tous les
deux été utilisés pour produire les données de performances indiquées
ci-dessous.
10.1
Précision de l'efficacité de l'extraction
Pour déterminer la précision de l'efficacité de l'extraction, l'ADN génomique a
été purifié à partir de sang total. Le rendement et la pureté de l'acide
nucléique extrait ont été déterminés par mesure de D.O. La configuration
expérimentale et les résultats sont décrits ci-dessous.
Type de kit
Protocole d'extraction
DNA Blood SV
Type d'échantillon
Sang total (7,6 × 106 leucocytes/mL)
Volume d'échantillon de
départ
200 ␮L
Volume d'élution
100 ␮L
Réitérations par cycle
24
Tableau 2 : Configuration expérimentale pour analyser le rendement et la pureté
Rendement (␮g)
CV (%)
DO 260/280
CV (%)
22
Cycle 1
5,6
3,9
1,9
2,5
Cycle 2
5,6
5,5
1,9
4,4
Cycle 3
5,5
6,5
1,9
1,8
y Version 04, FR
Tableau 3 : Résultats (valeurs moyennes) de rendement et de pureté de l'ADN pour
l'ADN génomique extrait de sang total
 Le rendement dépend fortement de la formule hématologique et peut
donc varier d'un donneur à l'autre.
10.2
Performances analytiques
Une PCR/RT-PCR a été réalisée sur l'instrument LightCycler® 480 à l'aide de
5 ␮L d'éluat dans un volume de PCR total de 20 ␮L. Les standards de quantification et les échantillons de contrôle ont été ajoutés juste avant de commencer la PCR.
Paramètre
Virus Parvo B19
Virus de l'hépatite A (VHA) Cyclophiline A (CycA)
Type d'échan- Plasma EDTA étudié en Plasma EDTA étudié en solu- Sang total mis en comtion avec le virus de l'hépatite mun à partir de différents
tillon
solution avec le virus
Parvo B19
A
donneurs
(7,6 × 106 leucocytes/mL)
Cible
Substance de base de Substance de base de virus
virus Parvo B19 fournie de l'hépatite A fournie en
interne
en interne
ADN génomique humain
Kit utilisé
pour l'
analyse de 
PCR
(disponible en interne 
uniquement)
(disponible en interne uniquement)
Dosage LightCycler® en
interne de CycA :
DNA MasterPLUS HybProbe et amorces et
pipettes spécifiques à la
cyclophiline A
Volume
d'éluat par
PCR
5 ␮L
5 ␮L
5 ␮L
Volume de
PCR
20 ␮L
20 ␮L
20 ␮L
Instrument 
de PCR
Instrument 
LightCycler® 480
Instrument 
LightCycler® 480
Instrument 
LightCycler® 480
Tableau 4 : Récapitulatif des dosages utilisés pour produire les données de performances indiquées ci-dessous.
Intervalle linéaire L'intervalle linéaire et la limite de détection, pouvant être obtenus à l'aide des
kits MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid Kit pour l'extraction automaet limite de
tique d'acide nucléique conjointement avec l'instrument MagNA Pure 96 ont
détection
été évalués à l'aide de substances de base de virus Parvo B19 et de virus de
l'hépatite A (disponibles en interne uniquement).
23
y Version 04, FR
La configuration expérimentale utilisée pour déterminer l'intervalle linéaire et
la limite de détection des paramètres choisis est décrite ci-dessous, de même
que les résultats.
Paramètre
Virus Parvo B19
Virus de l'hépatite A
Type de kit
LV Kit
NA LV Kit
Type d'échantillon
Plasma EDTA
Plasma EDTA
Volume d'échantillon de
départ
500 ␮L
500 ␮L
Volume d'élution
50 ␮L
50 ␮L
Gamme de dilution
8 différents titres de virus de 
2×101 à 5×107 copies/mL
8 différents titres de virus de 
3×101 à 1×109 copies/mL
Total global de points de 172
données disponibles
176
Tableau 5 : Configuration expérimentale utilisée pour déterminer l'intervalle linéaire et la limite de détection.
Paramètre
Virus Parvo B19
2
5×106
Intervalle linéaire
2×10de à
copies/mL
Limite de détection*
(LoD_95)
68 copies/mL
Intervalle de confiance : 
de 48 à 156 copies/mL
3×10de 3 à 1×109 copies/mL
119 copies/mL
Intervalle de confiance : 
de 75 à 279 copies/mL
Tableau 6 : Résultats déterminés pour l'intervalle linéaire et la limite de détection.
* Toutes les données ont été évaluées statistiquement à l'aide de la méthode Probit Analysis. La limite de détection a été calculée pour l'intervalle de confiance de 95 % (LoD_95).
 La sensibilité et la limite de détection dépendent largement du dosage de
PCR
24
y Version 04, FR
- Virus Parvo B19
Figure 1 : Intervalle linéaire établi à l'aide du protocole Viral NA Universal LV
pour l'extraction de virus Parvo B19 à partir de plasma EDTA. L'intervalle linéaire
pour cette application est de 2×102 à 5×106 copies/mL. SVT/mL : titre de virus étudié
en solution (spiked virus titer)/mL, MVT/mL : titre de virus mesuré (measured virus
titer)/mL.
- Virus de
l'hépatite A
(VHA)
Figure 2 : Intervalle linéaire établi à l'aide du protocole Viral NA Universal LV
pour l'extraction de virus VHA à partir de plasma EDTA. L'intervalle linéaire pour
cette application est de 3×103 à 1×109 copies/mL. SVT/mL : titre de virus étudié en
solution (spiked virus titer)/mL, MVT/mL : titre de virus mesuré (measured virus titer)/
mL
25
y Version 04, FR
Limite de
détection pour le
virus Parvo B19
Figure 3 : Limite de détection pour le virus Parvo B19 déterminé à l'aide du protocole Viral NA Universal LV pour extraire une gamme de dilution virale à partir
de plasma EDTA. La limite de détection LoD_95 est de 68 copies/mL. L'intervalle de
confiance correspondant est de 48 à 156 copies/mL.
_____
Régression Probit, - - - - limite 95 % inférieure, . . . . . . limite 95 % supérieure, o
LoD_95.
Limite de
détection pour le
virus de l'hépatite
A (VHA)
Figure 4 : Limite de détection pour le virus VHA déterminé à l'aide du protocole
Viral NA Universal LV pour extraire une gamme de dilution virale à partir de
plasma EDTA. 
La limite de détection LoD_95 est de 119 copies/mL. L'intervalle de confiance correspondant est de 75 à 279 copies/mL. _____ Régression Probit, - - - - limite 95 % inférieure,
......
limite 95 % supérieure, o LoD_95.
26
y Version 04, FR
10.3
Analyse de précision
Les déviations standard (DS) et coefficients de variations (CV) ont été déterminés pour la gamme de dilution dans l'intervalle linéaire à l'aide des paramètres
suivants : virus Parvo B19, virus de l'hépatite A et cyclophiline A.
Pour déterminer la précision intra-dosage, toutes les données ont été produites à partir d'un cycle individuel. Pour déterminer la précision inter-dosage,
trois cycles ont été effectués par divers utilisateurs, sur des instruments différent et au sein de plusieurs laboratoires distincts. La précision d'un lot à l'autre
a été déterminée en utilisant six lots différents.
La configuration expérimentale pour effectuer l'analyse de précision et les
résultats correspondants sont décrits ci-dessous.
Paramètre
Virus Parvo B19
(VHA)
Cyclophiline A (CycA)
Type de kit
Viral NA SV Kit
and Viral NA SV Kit
MagNA Pure 96 DNA
and Viral NA SV Kit
Protocole(s) 
de purification
DNA Blood SV
Type d'échantil- Plasma EDTA
lon
Plasma EDTA
Sang total (7,6 × 106 leucocytes/mL)
200 ␮L
Volume
d'échantillon de
départ
200 ␮L
200 ␮L
Volume d'élution 50 ␮L
50 ␮L
3
Gamme de dilu- 1×10de à
tion
copies/mL
1×106

100 ␮L
3
1×10de à
1×106
copies/mL N/A
Réitérations
8
8
24
Points de données
Instrument LightCycler® 480
Instrument 
LightCycler® 480
Instrument 
LightCycler® 480
Précision 
intra-dosage
32
32
24
Précision 
inter-dosage
96
96
72
Précision 
d'un lot à l'autre
160
160
144
Tableau 7 : Configuration expérimentale pour effectuer l'analyse de précision.
27
y Version 04, FR
Virus Parvo B19
Précision intra-dosage
Concentration (copies/mL) Moyenne (Cp) DS (Cp)
CV (%)
1×
106
18,0
0,14
0,78
1×
105
21,5
0,21
1,00
1×
104
24,9
0,31
1,23
1 × 103
28,5
0,39
1,37
Virus Parvo B19
Précision inter-dosage
1×
106
18,2
0,34
1,89
1×
105
21,6
0,32
1,49
1 × 104
25,2
0,44
1,73
103
28,7
0,38
1,34
1×
Virus Parvo B19
Précision d'un lot à l'autre*
106
18,2
0,16
0,90
1 × 105
21,7
0,21
0,97
1×
104
25,1
0,39
1,55
1×
103
28,6
0,38
1,32
1×
Tableau 8 : Les résultats de précision intra-dosage, inter-dosage et d'un lot à l'autre ont
été déterminés à l'aide de substance virale Parvo B19 étudiée en solution dans du
plasma EDTA.
* sur 6 lots différents
Concentration (copies/mL) Moyenne
(Cp)
DS (Cp)
CV (%)
1 × 106
19,4
0,18
0,94
1×
105
23,0
0,28
1,23
1×
104
26,2
0,12
0,45
3
29,7
0,12
0,41
1 × 10
1 × 106
19,4
0,26
1,33
5
22,9
0,21
0,92
1 × 10
28
y Version 04, FR
1 × 104
26,2
0,12
0,45
103
29,6
0,32
1,07
1×
106
19,7
0,22
1,10
1 × 105
23,1
0,15
0,67
1×
104
26,6
0,39
1,46
1×
103
30,0
0,26
0,87
1×
Tableau 9 : Les résultats de précision intra-dosage, inter-dosage et d'un lot à l'autre ont
été déterminés à l'aide de substance virale VHA étudiée en solution dans du plasma
EDTA.
Dosage CycA
Échantillon de référence
Moyenne (Cp)
DS (Cp)
CV (%)
18,1
0,20
1,12
Dosage CycA
18,0
Dosage CycA
0,21
1,15
17,9
0,16
0,87
Tableau 10 : Résultats de précision intra-dosage, inter-dosage et d'un lot à l'autre pour
le dosage de CycA réalisé à base d'ADN extrait de sang total.
10.4
L'influence de substances interférentes a été évaluée à l'aide d'un échantillon
étudié en solution avec le virus Parvo B19 et d'une série à concentration croissante des substances prévalentes suivantes : hémoglobine (hémoglobine
humaine fournie par Sigma- Aldrich Co. LLC), bilirubine (Sigma-Aldrich Co.
LLC) et lipides (émulsion d'intralipide 20 %, Sigma-Aldrich Co. LLC).
La configuration expérimentale pour évaluer l'influence des substances interférentes et les résultats correspondants sont décrits ci-dessous :
29
y Version 04, FR
Paramètre
Virus Parvo B19
Type de kit
Type d'échantillon
Sang total
Volume d'échantillon
de départ
200 ␮L
Volume d'élution
50 ␮L
Concentration de virus
1 × 105 copies/mL
Hémoglobine, bilirubine et lipides utilisés à 
différentes concentrations
Réitérations par
concentration d'inhibiteur
3
Tableau 11 : Configuration expérimentale pour évaluer l'influence des substances
interférentes : hémoglobine, bilirubine et lipides.
Résultats
Hémoglobine 
(mg/dL)
Cp
Bilirubine 
(mg/dL)
Cp
Lipides 
(mg/dL)
Cp
0
21,0
0
20,8
0
21,6
100
21,3
6,6
21,0
200
21,6
200
21,2
13,2
21,2
400
21,5
300
21,2
19,8
20,9
600
21,9
400
21,1
26,4
21,0
800
21,9
500
21,1
33,0
21,3
1 000
21,8
600
21,0
39,5
21,4
1 200
21,5
700
21,1
46,1
21,3
1 400
21,6
800
21,3
52,8
21,0
1 600
21,3
900
21,5
59,4
21,0
1 800
21,2
1 000
n.d.*
66,0
21,5
2 000
21,1
Moyenne
21,1
Moyenne
20,8
Moyenne
21,6
Tableau 12 : Résultat des points de croisement (Cp ou Crossing Points) pour les
échantillons étudiés en solution avec des substances interférentes.
* non déterminé en raison d'erreurs de pipetage.
Aucune substance interférente n'a démontré d'influence sur les points de croisement. L'intervalle de points de croisement obtenu est de a 0,8.
30
y Version 04, FR
10.5
Test de contamination croisée
Le risque de contamination croisée a été évalué à l'aide du test de virus Parvo
B19. Au cours des deux premiers cycles, seuls les échantillons négatifs ont été
traités pour tester une éventuelle contamination sur le système MagNA Pure
96. Sur trois cycles, les échantillons positifs et négatifs ont été traités alternativement par système de damier. Au cours du dernier cycle, seuls les échantillons négatifs ont été traités. Un échantillon a été identifié comme étant négatif
lorsqu'aucun signal de détection n'a été obtenu au bout de 45 cycles de PCR.
La configuration expérimentale utilisée pour tester le système MagNA Pure 96
quant à une éventuelle contamination et les résultats correspondants sont
décrits ci-dessous.
Paramètre
Virus Parvo B19
Type de kit
Volume d'échantillon 500 ␮L
de départ
Volume d'élution
50 ␮L
Échantillons positifs
5 × 107 copies/mL dans du plasma EDTA
Échantillons négatifs Plasma EDTA négatif
Nombre de cycles
A) 2 cycles uniquement avec des échantillons
négatifs
B) 3 cycles avec système de damier
C) 1 cycle uniquement avec des échantillons
négatifs
Analyse de PCR
LightCycler® Parvo B19 Quantification Kit avec
une plaque de 384 puits sur l'instrument LightCycler® 480
Tableau 13 : Configuration expérimentale utilisée pour évaluer le risque de contamination croisée.
Cycle
Moyenne de Cp
des échantillons
positifs
Déviation standard Taux de 
positivité
Taux de
négativité
1
n/a
n/a
0/96
96/96
2
n/a
n/a
0/96
96/96
3
17,8
0,20
48/96
48/96
4
20,0
0,22
48/96
48/96
5
18,6
0,12
48/96
48/96
6
n/a
n/a
0/96
96/96
31
y Version 04, FR
Tableau 14 : Résultats d'expériences de contamination croisée basés sur la moyenne
des points de croisement et des taux de réaction.
Comme illustré dans le Tableau 14, dans les conditions décrites ci-dessus,
aucune contamination croisée n'a été détectée.
10.6
Comparaison de méthodes
Détection de la
mutation JAK2
Une comparaison de méthodes a été effectuée à l'aide du système MagNA
Pure 96 System pour tester la présence de l'allèle JAK2-V617F dans des
échantillons de sang total. Cette méthode consiste à comparer le taux de
mutation au type sauvage. L'ADN a été extrait à l'aide du système MagNA
Pure 96 et en utilisant la méthode manuelle établie du QIAamp DNA Blood
Mini Kit. L'analyse de PCR a été effectuée à l'aide du JAK2 MutaQuant®Kit, en
fonction des instructions du fabricant.
Paramètre
Jak2 V617F
Type de kit
DNA Blood SV
Type d'échantillon
Sang total
Volume d'échantillon
de départ
200 ␮L
Volume d'élution
50 ␮L
Échantillons testés*
50
Analyse de PCR
JAK2 MutaQuant®Kit (MQPP-02-CE/MQPP-03CE), Ipsogen SA ; Marseille sur l'instrument
Rotor-Gene 3000
Méthode de compara- QIAamp DNA Blood Mini Kit 
(volume d'élution de 85 μl)
teur
Préparation des échantillons
Tableau 15 : Configuration expérimentale utilisée pour tester la présence de l'allèle
JAK2-V617F dans des échantillons de sang total.
* Cinquante échantillons cliniques à l'aveugle (échantillons de substitution) ont été
obtenus par le biais de procédures de diagnostic de routine et mesurés en parallèle.
32
y Version 04, FR
Comparateur
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 50 échantillons
Négatif
Positif à
JAK2_V617F
Total
Négatif
33
0
33
Positive à
JAK2_V617F
0
17
17
Total
33
17
50
Tableau 16 : Au total, 50 échantillons ont été inclus dans cette analyse. La concordance d'identification des échantillons positifs et négatifs était de 100 % entre la
méthode MagNA Pure 96 automatisée et la méthode manuelle du QIAamp DNA Blood
Mini Kit.
Figure 5 : La comparaison de méthodes était basée sur le taux de mutation final par
rapport au type sauvage entre l'extraction à l'aide du MagNA Pure 96 DNA and Viral NA
SV Kit et l'extraction à l'aide du QIAamp DNA Blood Mini Kit.
……….. Ligne d'identité, - - - - - Régression de Bablok (1,02x) ; Pearson r= 0,989
33
y Version 04, FR
ADN
Pneumocystis
jiroveci
Les données de comparaison de méthodes obtenues à l'aide du système
MagNA Pure 96 ont été évaluées en testant la présence d'ADN Pneumocystis
jiroveci dans des échantillons de lavage broncho-alvéolaire.
La configuration expérimentale suivante a été utilisée :
Paramètre
ADN Pneumocystis jiroveci
Type de kit
Type d'échantillon
Lavage broncho-alvéolaire
Volume d'échantillon 500 ␮L
de départ
Volume d'élution
100 ␮L
Échantillons testés*
96
Analyse de PCR**
Dosage qPCR en temps réel en interne conjointement avec le LightCycler® FastStart DNA Master
HybProbe
Limite de détection : <50 copies/réaction
Intervalle linéaire : 103 - 108 copies/mL
Échantillons > 104 copies/mL évalués comme
étant positifs
Méthode de compa- QIAamp DNA Mini Kit :
rateur
Volume d’échantillon : 500 ␮L
Volume d'élution : 200 ␮L
Préparation des
échantillons
Tableau 17 : Configuration expérimentale utilisée pour tester la présence d'ADN Pneumocystis jiroveci dans des échantillons de lavage broncho-alvéolaire.
* Quatre-vingt-seize échantillons cliniques à l'aveugle (échantillons de substitution) ont
été obtenus par le biais de procédures de diagnostic de routine et mesurés en parallèle.
**Le dosage de PCR a été développé et validé par l'Institute of Medical Microbiology and
34
y Version 04, FR
Comparateur
Négatif
Positif à
P.jiroveci DNA
Total
Négatif
70
1
71
Positif
à l'ADN P.jiroveci
0
25
25
Total
70
26
96
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 96 échantillons
Tableau 18 : Au total, 26 échantillons sur 96 ont été évalués comme étant positifs. La
concordance positive pour les échantillons positifs était de 25 sur 26 (96 %). La concordance positive pour les échantillons négatifs était de 70 sur 70 (100 %).
Figure 6 : Comparaison de méthodes pour les échantillons positifs basée sur les points
de croisement mesurés au cours de 2 cycles consécutifs de dosage de qPCR en interne
en temps réel de Pneumocystis jiroveci.
…….. Ligne d'identité, - - - - - Régression de Bablok (1,01x+0,91) ; Pearson r= 0,9312 
(Cycle 1 : ×) _______ Régression de Bablok (1,01x +1,07) ; Pearson r= 0,9304 (Cycle 2 :
o)
35
y Version 04, FR
INFORMATIONS SUPPLÉMENTAIRES
11. INFORMATIONS SUPPLÉMENTAIRES
11.1
Symboles
Les symboles suivants sont utilisés dans ce document pour souligner les informations importantes :
11.2
Symbole
Description

Remarque importante

Information importante
C
Destiné au diagnostic in vitro.
I
Référence du catalogue
B
Code du lot
s
Utiliser jusque
r
Limites de température (Conservation à)
n
Distributeur
t
Fabricant
)
Conserver à l'abri de la lumière du soleil
(emballage externe de consommables)
2
À usage unique (emballage externe de
consommables)
v
Le kit répond aux exigences de la directive
98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de
diagnostic in vitro.
*
disponible auprès de Roche Applied Science
Modifications de la version précédente
Modifications d'ordre rédactionnel.
12. MARQUES
LIGHTCYCLER et MAGNA PURE sont des marques de Roche.
Tous les autres noms de produits et marques sont détenues par leur propriétaire respectif.
13. LIMITATION DE LICENCE
Ce produit est accordé sous licence selon les brevets appartenant à Qiagen.
36
y Version 04, FR
AVIS DE NON RESPONSABILITÉ
14. AVIS DE NON RESPONSABILITÉ
Destiné au diagnostic in vitro.
37
y Version 04, FR
v
Allemagne, +49 621 7590
Fabriqué en Allemagne
_________________________________________________________________
0512.06671934001➃
t
n Distribué aux États-Unis par Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA
68298 Mannheim
Allemagne
C
y Versione 04
Versione del contenuto: Maggio 2012
Reagenti preriempiti per lo strumento MagNA Pure 96. Il kit è destinato all'isolamento del DNA genomico e degli acidi nucleici (NA) virali prelevati da un massimo di 1.000 ␮l di sangue intero, plasma o siero oppure da un massimo di 25 mg
di tessuto congelato fresco o da un massimo di 1 × 106 cellule in coltura, oltre
che all'isolamento degli acidi nucleici di batteri, funghi e virus da un massimo di
1000 ␮l di materiale campione umano.
I 06 374 891 001
Kit per 3 ⫻ 96 reazioni
r Conservare a una temperatura compresa tra ⫹15 e ⫹25°C
 Conservare il kit al riparo dalla luce.
 Conservare il kit lontano dai magneti.
Table of Contents
1.
2.
3.
4.
USO PREVISTO ................................................................................................................ 3
SPIEGAZIONE DEL KIT ................................................................................................... 3
PRINCIPIO/RIEPILOGO .................................................................................................. 3
REAGENTI E SOLUZIONI DI LAVORO ......................................................................... 4
4.1
4.2
Numero di test
Kit/Contenuto
5.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI ..................................................................................... 6
5.1
5.2
5.3
5.4
Precauzioni
Requisiti per la manipolazione
Procedure di laboratorio
Manipolazione dei materiali di scarto
4
4
6
7
8
8
6.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ ................................................................................... 9
6.1
6.2
6.3
Kit e reagenti
Raccolta dei campioni e conservazione del materiale campione
Conservazione di acidi nucleici purificati ed eluati
9
9
10
7.
MATERIALI ..................................................................................................................... 11
7.1
7.2
Materiali forniti
Materiali e dispositivi necessari ma non forniti
8.
PROCEDURE DI ANALISI ............................................................................................. 12
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
Protocolli di purificazione
Materiali campione e fasi di pre-isolamento
Controllo della qualità
Procedura di isolamento
Fine di una seduta
9.
10.
LIMITAZIONI E INTERFERENZE .................................................................................. 21
DATI SULLE PRESTAZIONI ......................................................................................... 22
10.1
10.2
10.3
10.4
10.5
10.6
Precisione dell'efficienza della purificazione
Prestazioni analitiche
Analisi della precisione
Sostanze interferenti
Test della cross-contaminazione
Confronto tra i metodi
11
11
12
13
18
19
20
22
23
27
29
31
32
11.
INFORMAZIONI SUPPLEMENTARI ........................................................................... 36
11.1
11.2
Simboli
Modifiche rispetto alla versione precedente
12.
13.
14.
MARCHI .......................................................................................................................... 36
LIMITAZIONE DELLA LICENZA .................................................................................. 36
LIMITAZIONE NORMATIVA ........................................................................................ 37
2
36
36
y Versione 04, IT
USO PREVISTO
1.
USO PREVISTO
Il prodotto MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit è un kit di
reagenti usato con il sistema MagNA Pure 96 per l'isolamento e la purificazione degli acidi nucleici totali (DNA/RNA) da campioni biologici, per finalità
di diagnostica in vitro.
Le applicazioni IVD che utilizzano la procedura di preparazione dei campioni
in combinazione con qualsiasi test IVD degli acidi nucleici downstream vanno
valutate tenendo in considerazione i singoli parametri IVD.
2.
SPIEGAZIONE DEL KIT
Il prodotto MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit è specificamente progettato per isolare:
• Acido nucleico da un massimo di 1000 ␮l di sangue intero, plasma o siero.
• Acido nucleico di batteri, funghi e virus da un massimo di 1000 ␮l di materiale campione o lisato di origine umana.
• Acido nucleico da un massimo di 1 × 106 cellule in coltura.
• Acido nucleico da un massimo di 25 mg di tessuto congelato fresco.
Gli acidi nucleici isolati rispondono agli standard di qualità richiesti dalle analisi PCR/RT-PCR quantitative ad elevata sensibilità.
3.
PRINCIPIO/RIEPILOGO
La procedura di isolamento degli acidi nucleici si basa sulla tecnologia a biglie
magnetiche MagNA Pure. 
Le fasi principali della procedura di isolamento degli acidi nucleici MagNA
Pure 96 sono le seguenti:
1. Il materiale campione viene lisato, gli acidi nucleici rilasciati e le nucleasi
denaturate.
2. Grazie all'azione del sale caotropico e all'elevata forza ionica del tampone di
lisi e/o di legame, gli acidi nucleici si legano alla superficie di silice delle
biglie magnetiche aggiunte.
3. Le biglie magnetiche con gli acidi nucleici legati vengono separate magneticamente dal campione lisato residuo.
4. Le sostanze non legate come le proteine, i detriti cellulari e gli inibitori della
PCR vengono rimossi grazie a ripetuti cicli di lavaggio.
5. Gli acidi nucleici purificati vengono eluiti dalle biglie magnetiche.
3
y Versione 04, IT
REAGENTI E SOLUZIONI DI LAVORO
4.
4.1
Numero di test
4.2
Il kit è destinato ad eseguire
• 3 × 96 isolamenti di DNA genomico e acidi nucleici virali da un massimo di
500 ␮l di sangue intero, plasma, siero o da un massimo di 1 × 106 cellule in
coltura, oppure
• 3 × 96 isolamenti di acidi nucleici di batteri, funghi e virus da 500 ␮l di materiale campione di origine umana, oppure
• 3 × 96 isolamenti da un massimo di 25 mg di tessuto congelato fresco,
oppure
• 3 × 48 isolamenti da 1000 ␮l di sangue intero, plasma o siero, oppure
• 3 × 48 isolamenti di acidi nucleici di batteri, funghi e virus da 1000 ␮l di
materiale campione di origine umana.
Kit/Contenuto
4
Componente Etichetta
Contenuto/Funzione
Vassoio 1
3 vassoi per kit
Reagent Tray 1
Contenitore 1 Wash Buffer I
• 160 ml
• < 6 M Guanidina idrocloruro, 
• Per la rimozione delle impurità
• 80 ml
• < 6 M Guanidina idrocloruro, 
Contenitore 3 Lysis/Binding
Buffer
• 80 ml
• < 6 M Guanidina tiocianato, 
< 30% Triton X-100, < 60 mM Tris HCl
• Per lisi di cellule o virus e legame degli
acidi nucleici
Vassoio 2
3 vassoi per kit
Reagent Tray 2
Contenitore 1
Vuoto
Contenitore 2 Proteinase K
• 15 ml
• 2% Proteinasi K, 50% Glicerolo
• Per la digestione delle proteine
Contenitore 3 Elution Buffer
• 80 ml
• < 60 mM di tampone Tris-HCl
• Per l'eluizione degli acidi nucleici
y Versione 04, IT
Contenitore 4 Wash Buffer III
Flacone 1
Magnetic Glass 
Particles
• 160 ml
• < 20 mM di tampone acetato di sodio
• 6 flaconi, 18 ml cadauno
• Sospensione delle biglie magnetiche
contenente isopropanolo
• Per legare gli acidi nucleici
 Il liquido di sistema MagNA Pure 96 (interno/esterno)* agisce come Wash
Buffer II per questo kit.
 Tutti i componenti del kit sono pronti per l'uso.
5
y Versione 04, IT
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
5.
5.1
Precauzioni
 Alcuni tamponi del prodotto MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large
Volume Kit contengono sostanze pericolose o nocive. Per informazioni
dettagliate, vedere la Figura 1 (Vassoio per reagenti 1), la Figura 2 (Vassoio
per reagenti 2) e la Tabella 1. Evitare il contatto tra questi reagenti e la
pelle, gli occhi o le membrane mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente e accuratamente la parte interessata con acqua. In caso di
fuoriuscita dei reagenti, diluire il liquido fuoriuscito con acqua prima di
pulire.
 Evitare che i reagenti contenenti guanidina tiocianato entrino in contatto
con la soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina) o con acidi. Tali
miscele producono un gas fortemente tossico. È particolarmente importante rispettare questa precauzione durante la pulizia del coperchio dei
liquidi di scarto MagNA Pure 96.
Fig. 1: Vassoio per reagenti 1
Componente Etichetta
Vassoio 1
6
Fig. 2: Vassoio per reagenti 2
Sostanze 
pericolose e nocive
Reagent Tray 1
• Guanidina idrocloruro
• Etanolo
• Guanidina idrocloruro
• Etanolo
y Versione 04, IT
Contenitore 3 Lysis/Binding Buffer
Vassoio 2
• Guanidina tiocianato
Reagent Tray 2
Contenitore 1 Vuoto
Contenitore 2 Proteinase K
• Proteinasi K
Contenitore 3 Elution Buffer
Contenitore 4 Wash Buffer III
Flacone 1
Magnetic Glass 
Particles
• Isopropanolo
Tabella 1 - Elenco delle sostanze pericolose e nocive nei reagenti
5.2
Requisiti per la manipolazione
• Indossare guanti monouso e cambiarli frequentemente.
• Non usare il kit dopo la data di scadenza.
Inoltre, per ridurre il rischio di contaminazione da carryover, che può dare
luogo a risultati falsi positivi, attenersi alle seguenti linee guida:
• Eseguire la preparazione dei campioni, l'allestimento della PCR/RT-PCR e
l'analisi PCR/RT-PCR in luoghi distinti.
• Smaltire i puntali di pipettamento in contenitori sigillati al fine di prevenire
contaminazioni per via aerea.
I reagenti e i contenitori di reazione contaminati da nucleasi degradano gli
acidi nucleici templato. Attenersi alle seguenti indicazioni per limitare il rischio
di contaminazione:
• Evitare di toccare le superfici e i materiali che possono causare carryover
delle nucleasi.
• Usare solo i reagenti forniti in questo kit. L'uso di reagenti sostitutivi può
introdurre nucleasi.
• Pulire e decontaminare le aree di lavoro e gli strumenti, incluse le pipette,
con reagenti di decontaminazione disponibili in commercio.
• Usare solo puntali di pipettamento e provette per microcentrifughe nuovi,
anti-aerosol e privi di nucleasi.
• Usare un'area di lavoro specificamente studiata per lavorare sull'RNA. Se
possibile, usare contenitori di reazione e pipettatori riservati esclusivamente
per l'RNA templato.
7
y Versione 04, IT
5.3
Procedure di laboratorio
• Tutto il materiale di origine umana e tutto il materiale di scarto prodotto
devono essere considerati come potenzialmente infettivi. Pulire e disinfettare
accuratamente tutte le superfici con disinfettanti consigliati dalle autorità
locali.
• Poiché la sensibilità e il titolo dei potenziali patogeni nel materiale campione
sono variabili, l'operatore deve ottimizzare l'inattivazione dei patogeni e adottare misure opportune in conformità con le normative di sicurezza vigenti a
livello locale.
• Evitare di consumare cibo e bevande o di fumare nelle aree di lavoro del
laboratorio.
• Evitare di pipettare con la bocca.
• Usare guanti di protezione monouso, camici da laboratorio e occhiali protettivi durante la manipolazione di campioni e reagenti.
• Evitare la contaminazione dei reagenti con microbi e nucleasi durante l'estrazione di aliquote dai flaconi di reagenti. Usare puntali di pipettamento sterili
monouso.
• Lavarsi accuratamente le mani dopo avere toccato i campioni dei pazienti e i
reagenti del kit.
5.4
Manipolazione dei materiali di scarto
• Le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) sono disponibili online all'indirizzo www.e-labdoc.roche.com o su richiesta presso l'ufficio Roche locale.
• Smaltire i reagenti inutilizzati e i materiali di scarto nel rispetto delle normative nazionali, regionali e locali.
• Usare guanti di protezione monouso, camici da laboratorio e occhiali protettivi durante lo smaltimento di campioni e reagenti dei kit.
• Per smaltire i reagenti presenti nei contenitori, attenersi alla seguente procedura:
1. Perforare un angolo del foglio sigillante di un contenitore nel vassoio per
reagenti usando un oggetto monouso di plastica rigida, ad esempio una
pipetta per coltura cellulare.
2. Rimuovere il foglio sigillante tirandolo indietro e svuotare il liquido in un
contenitore idoneo.
3. Ripetere i passaggi 1 e 2 finché tutti i contenitori sono vuoti.
8
y Versione 04, IT
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
6.
6.1
Kit e reagenti
• Il kit viene spedito e consegnato a temperatura ambiente.
• I componenti del kit sono stabili tra +15 e +25°C e fino alla data di scadenza
stampata sull'etichetta.
 Conservare il kit al riparo della luce e lontano da magneti.
• I reagenti possono essere conservati per 32 ore tra +15 e +25°C sulla piattaforma dello strumento MagNA Pure 96.
• È possibile usare un set di vassoi per reagenti (Vassoio 1 e Vassoio 2) per un
massimo di quattro sedute distinte. Dopo l'apertura, i vassoi per reagenti
possono essere usati per ulteriori sedute sullo stesso strumento MagNA
Pure 96 entro 28 giorni, se opportunamente sigillati con un foglio sigillante
MagNA Pure 96* e se conservati tra +2 e +8°C. Prima dell'uso, lasciare equilibrare i componenti del kit tra +15 e +25°C per un'ora.
 I vassoi per reagenti parzialmente usati possono essere riutilizzati soltanto
sullo stesso strumento MagNA Pure 96. Grazie ai codici a barre dei reagenti, il software MagNA Pure 96 tiene traccia del materiale caricato su
ogni strumento, riconosce i vassoi per reagenti e puntali usati solo parzialmente e li riutilizza in modo appropriato nella successiva seduta.
 Se i vassoi per reagenti non vengono sigillati correttamente, può verificarsi
l'evaporazione. Condizioni di conservazione inadeguate possono avere un
impatto negativo sulle prestazioni del processo di isolamento.
6.2
Raccolta dei campioni e conservazione del materiale campione
Per una rilevazione accurata degli acidi nucleici, è importante garantire una
conservazione adeguata dei campioni (tra ⫺15 e ⫺25°C per il DNA o tra ⫺60
e ⫺80°C per l'RNA). DNA e RNA possono degradarsi se i campioni non vengono conservati in modo adeguato.
 Non usare plasma o sangue contenente eparina.
 Non usare il materiale campione dopo averlo conservato per periodi prolungati a temperature più elevate.
 Se i campioni vengono conservati congelati, scongelarli sottoponendoli ad
una moderata agitazione, ad esempio su un agitatore a rulli.
9
y Versione 04, IT
6.3
Conservazione di acidi nucleici purificati ed eluati
Per garantire la massima stabilità degli acidi nucleici eluiti, procedere immediatamente all'allestimento della PCR/RT-PCR. Non conservare l'acido
nucleico eluito sulla piattaforma dello strumento MagNA Pure 96.
Ai fini della conservazione, coprire la piastra di uscita con un foglio sigillante
MagNA Pure 96* e conservarla tra ⫺15 e ⫺25°C per il DNA o tra ⫺60 e
⫺80°C per l'RNA. Conservare l'acido nucleico purificato in aliquote per evitare
ripetuti congelamenti e scongelamenti.
Per poter essere conservate all'esterno dello strumento MagNA Pure 96, le
piastre di uscita contenenti gli eluati dovranno essere coperte da un foglio
sigillante MagNA Pure 96*.
 Per eseguire i successivi processamenti, sarà necessario rimuovere il
foglio sigillante. Non rimuovere il foglio sigillante troppo bruscamente per
evitare di creare aerosol e carryover da un pozzetto all'altro, fenomeni che
possono indurre una cross-contaminazione.
 Se gli eluati sono stati congelati, mescolarli delicatamente dopo averli
scongelati pipettando su e giù per dieci volte prima di eseguire le eventuali
operazioni successive, come analisi PCR/RT-PCR o misurazioni OD. Il
volume di miscelazione dovrebbe essere almeno la metà del volume
dell'eluato. Quando gli acidi nucleici non vengono premiscelati e distribuiti
in modo omogeneo in soluzione, i risultati potrebbero non essere riproducibili nei test successivi.
 Per la conservazione a lungo termine, si consiglia di trasferire gli eluati in
una piastra di archiviazione.
10
y Versione 04, IT
MATERIALI
7.
MATERIALI
7.1
Materiali forniti
Vedere la sezione 4, Reagenti e soluzioni di lavoro
7.2
Materiali e dispositivi necessari ma non forniti
• MagNA Pure 96 Instrument (Strumento MagNA Pure 96) (num. cat. 06 541
089 001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (Internal) (Liquido di sistema interno MagNA
Pure 96) (num. cat. 06 430 112 001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (External) (Liquido di sistema esterno MagNA
Pure 96) (num. cat. 06 640 729 001)
• MagNA Pure 96 Filter Tips (Puntali con filtro MagNA Pure 96) (1000 μl)
(num. cat. 06 241 620 001)
• MagNA Pure 96 Processing Cartridge (Cartuccia di processamento MagNA
Pure 96) (num. cat. 06 241 603 001)
• MagNA Pure 96 Output Plate (Piastra di uscita MagNA Pure 96) (num. cat.
06 241 611 001)
• MagNA Pure 96 Internal Control Tube (Provetta del controllo interno MagNA
Pure 96) (num. cat. 06 374 905 001)
• MagNA Pure 96 Sealing Foil (Foglio sigillante MagNA Pure 96) (num. cat. 06
241 638 001)
• Reagenti opzionali:
• Reagente MagNA Pure 96 External Lysis Buffer (num. cat. 06 374 913 001)
• Reagente MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer (per l'isolamento
dell'acido nucleico di batteri, funghi e virus con il protocollo Pathogen
Universal Protocol, se è richiesta la lisi esterna) (num. cat. 06 374 921 001)
• Reagente MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer (num. cat. 06 640 702
001)
• Proteinasi K, grado PCR, Attività (+37°C) b 0,6 U/␮l 
(ad esempio, num. cat. 03 115 828 001)
• (Opzionale) Strumento MagNA Lyser (num. cat. 003 358 968 001 dal 
numero di serie 40467540, num. cat. 03 358 976 001 dal numero di serie
40405218)
• (Opzionale) MagNA Lyser Green Beads (num. cat. 03 358 941 001)
• Attrezzature standard di laboratorio
• Pipette e puntali anti-aerosol privi di nucleasi, come i puntali da 10 cm di
lunghezza, per la dispensazione preventiva dei campioni nella cartuccia di
processamento MagNA Pure 96.
• (Opzionale) Centrifuga per provette
11
y Versione 04, IT
PROCEDURE DI ANALISI
8.
8.1
Protocolli di purificazione
Per l'isolamento degli acidi nucleici con il prodotto MagNA Pure 96 DNA and
Viral NA Large Volume Kit sono disponibili vari protocolli di purificazione dello
strumento MagNA Pure 96. Ogni protocollo è ottimizzato per tipi di campione
specifici.
 Eseguire i protocolli solo con il tipo di campione specificato; in caso contrario le prestazioni del processo di isolamento potrebbero essere influenzate negativamente. Un uso improprio potrebbe provocare l'agglutinazione
e la perdita delle biglie magnetiche, la cross-contaminazione dei campioni
o persino danni allo strumento. In una stessa seduta è possibile combinare
solo i tipi di materiale campione specificati.
Per le finalità della diagnostica in vitro, con il prodotto MagNA Pure 96 DNA
and Viral NA Large Volume Kit è possibile usare i seguenti protocolli. Per ogni
protocollo, dal menu del software è possibile scegliere il volume del campione
e il volume di eluizione.
Nome del protocollo
Materiale campione
Volume di
eluizione1
DNA Blood LV
500 ␮l di sangue intero
100 o 200 ␮l
 Non usare più di 1 × 107 cellule
ematiche/ml.
DNA Blood LV 1000* 1000 ␮l di sangue intero
100 o 200 ␮l
ematiche/ml.
DNA Blood ext lys LV 1000 ␮l di lisato (da 500 ␮l di san- 100 o 200 ␮l
gue intero)
ematiche/ml.
12
Viral NA Plasma LV
500 ␮l di plasma in EDTA
50 o 100 ␮l
Viral NA Plasma LV
1000*
1000 ␮l di plasma in EDTA
50 o 100 ␮l
Viral NA Plasma 
ext lys LV
1000 ␮l di lisato (da 500 ␮l 
di plasma o siero)
50 o 100 ␮l
LV
500 ␮l di campione (consigliato 
per siero o plasma citrato)
50 o 100 ␮l
LV 1000*
1000 ␮l di campione (consigliato  50 o 100 ␮l
per siero o plasma citrato)
y Versione 04, IT
Pathogen Universal2 500 ␮l di campione o 500 ␮l di
500
lisato
50 o 100 ␮l
Pathogen Universal2 1000 ␮l di campione o 1000 ␮l di
1000*
lisato
50 o 100 ␮l
100 o 200 ␮l
DNA Cells LV
Fino a 1 × 106 cellule in coltura
risospese in 200 ␮l di PBS
DNA Tissue LV
Fino a 25 mg di tessuto 
100 o 200 ␮l
omogeneizzato in un volume di 200  Quando si
usano più di 5
μl
 Il volume di 100
μl è sconsigliato per le
cellule in coltura con un
contenuto di
DNA elevato
mg di tessuto si
consiglia di
eluire in 200 ␮l
1 La
concentrazione di acido nucleico nell'eluato e la sensibilità delle applicazioni downstream possono essere aumentata scegliendo un volume di eluizione basso. Tuttavia,
l'efficienza dell'eluizione e la resa complessiva degli acidi nucleici potrebbero risultare
inferiori rispetto a quelle fornite da un volume di eluizione più elevato.
2
I protocolli universali per i patogeni sono progettati per l'isolamento dell'acido nucleico
di batteri, funghi e virus da vari tipi di campioni di origine umana. I protocolli possono
essere usati direttamente per 500 ␮l o 1000 ␮l di campione oppure per 500 ␮l o
1000 ␮l di lisato. Usare un volume di eluizione di 50 μl per i campioni liquidi con basso
contenuto cellulare, come l'urina.
 Per i protocolli contrassegnati con un asterisco (*), il volume del campione
viene diviso per produrre due campioni e processato in due pozzetti separati della cartuccia di processamento MagNA Pure 96. Quando viene
usato, il controllo interno viene aggiunto ad ogni singolo pozzetto. Ciò
significa che la quantità totale di controllo interno aggiunta per campione
è 40 ␮l invece di 20 ␮l. Occorre quindi raddoppiare il volume del controllo
interno caricato sullo strumento. Inoltre, è necessario raddoppiare il
numero di „Tests“ nella finestra di dialogo „Edit Internal Control Barcode“.
Per alcune applicazioni potrebbe essere necessaria la diluizione del controllo interno.
8.2
Materiali campione e fasi di pre-isolamento
Per ottenere risultati ottimali nelle procedure downstream, specialmente nei
test RT-PCR effettuati ad esempio con gli strumenti LightCycler®, non processare i campioni con un volume più elevato rispetto a quello per cui è progettato il protocollo di purificazione selezionato. In caso contrario, le prestazioni
del processo di isolamento potrebbero peggiorare e potrebbero avere luogo
agglutinazioni e perdite delle biglie magnetiche, cross-contaminazione dei
campioni o persino danni allo strumento.
 Trattare tutti i campioni come potenzialmente infettivi.
13
y Versione 04, IT
I. Sangue intero
Il sangue intero fresco o congelato può essere usato senza alcun pretrattamento.
 Se il conteggio delle cellule ematiche supera 1 × 107 cellule/ml, diluire il
sangue intero con PBS prima dell'uso per evitare l'agglutinazione.
 Verificare che non vi siano coaguli nei campioni di sangue intero anticoagulato.
II. Plasma/siero
Il plasma o siero fresco o congelato può essere usato senza alcun pretrattamento.
 Se si formano dei precipitati, eseguire una fase di centrifugazione di 10
minuti a 1900 × g in provette da 10 ml. Usare solo il sopranatante come
campione.
III. Lisati (per protocolli di lisi esterna)
Sangue intero, plasma o siero miscelato con reagente di lisi esterno MagNA
Pure 96 External Lysis Buffer*.
 Verificare che il reagente MagNA Pure 96 External Lysis Buffer* venga
equilibrato tra +15 e +25°C prima dell'uso.
Aggiungere 500 ␮l di sangue intero, plasma o siero a 500 ␮l di reagente
MagNA Pure 96 External Lysis Buffer* e miscelare tramite pipettamento.
 Usare 1000 ␮l di lisato direttamente, in combinazione con il relativo protocollo di lisi esterna, o conservare tra ⫺15 e ⫺25°C per il DNA o tra ⫺60 e
⫺80°C per l'RNA fino al successivo processamento.
 Se i lisati sono stati congelati, scongelarli su ghiaccio. Prima del trasferimento in una cartuccia di processamento MagNA Pure 96, miscelare
accuratamente su vortex tre volte per 10 secondi, quindi eseguire un breve
spin-down.
IV. Vari tipi di campioni e lisati per i protocolli Pathogen Universal 500
e 1000.
È possibile eseguire la lisi dei batteri in molti tipi diversi di campioni di origine
umana. I seguenti tipi di campioni possono essere idonei per il protocollo
Pathogen Universal 500 e 1000: urina, lavaggio broncoalveolare (BAL), espettorato, fluido cerebrospinale (CSF), tamponi, feci, sangue intero, plasma, siero
e colture batteriche.
 A causa della grande varietà di campioni, non è possibile indicare un'unica
procedura universalmente valida. Le fasi di preparazione di un campione
semi-liquido (BAL, espettorato, feci, eccetera) per l'isolamento degli acidi
nucleici dipendono dal tipo di campione, dalla sua viscosità e dal tipo e
contenuto delle particelle.
14
y Versione 04, IT
 Il materiale campione che utilizza la procedura di preparazione dei cam-
pioni in combinazione con qualsiasi test IVD degli acidi nucleici downstream deve essere valutato tenendo in considerazione i singoli parametri
IVD.
 A seconda della viscosità del campione, oltre che del tipo e contenuto
delle particelle, i campioni potrebbero non richiedere alcun pretrattamento.
Protocollo di lisi basato sul reagente MagNA Pure 96 Bacterial Lysis
Buffer* (BLB)
햲
 Non usare un volume iniziale di campione di 1000 μl per campioni
molto viscosi e ricchi di cellule, come espettorato o feci.
Liquefazione (fase facoltativa per i campioni ad elevata viscosità,
come BAL o espettorato)
• Preparare una soluzione stock fresca di ditiotreitolo (DTT) (ad esempio, 5× conc. = 0,75%).
• Regolare la concentrazione finale del DTT nel campione a 0,15%
aggiungendo la soluzione stock di DTT.
• Incubare il campione sottoponendolo ad agitazione a 850 rpm per
30 minuti a +37°C finché non diventa facilmente pipettabile.
햳
Aggiunta di BLB
• Aggiungere 250 ␮l (o 500 ␮l) di BLB a 250 ␮l (o 500 ␮l) di campione, quindi miscelare accuratamente.
 Se il volume del campione è inferiore a 250 ␮l (o 500 ␮l), aggiungere BLB fino a raggiungere un volume finale di 500 ␮l (o 1000 ␮l).
햴
Digestione della proteinasi K
• Aggiungere 50 ␮l (o 100 ␮l) di proteinasi K a 500 ␮l (o 1000 ␮l) di
campione/miscela BLB e mescolare accuratamente.
• Incubare per 10 minuti a +65°C.
햵
Ebollizione (per tipi di campione difficili, come l'espettorato o le
feci)
 Eseguire la fase di ebollizione per inattivare gli organismi patogeni
nel campione. Questa operazione potrebbe anche potenziare la lisi
delle pareti cellulari di alcune specie batteriche. Per evitare perdite,
eseguire questa operazione in provette di reazione con tappo a vite.
 Nel caso di isolamento dell'RNA omettere la fase di ebollizione,
perché potrebbe avere un impatto negativo sull'integrità dell'RNA.
• Incubare i campioni a +95°C per 10 minuti.
• Raffreddare i campioni su ghiaccio. A questo punto centrifugare
brevemente per raccogliere l'intero volume del campione sul fondo
della provetta.
• Trasferire 500 ␮l (o 1000 ␮l) in una cartuccia di processamento
MagNA Pure 96.
15
y Versione 04, IT
Pretrattamento dei campioni di feci
햲
Usare una piccola quantità del campione di feci e sospenderlo in 550
␮l di PBS.
 Per evitare l'ostruzione dei puntali di reazione dovuta alla presenza
di particelle solide, centrifugare per 5 secondi a 500 × g.
 Per l'isolamento dell'RNA virale, è possibile usare una miscela tampone PBS/STAR (miscela 1:1) come alternativa per la sospensione
dei campioni di feci, allo scopo di ridurre le possibili inibizioni.
햳
Trasferire 250 ␮l di sopranatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml; aggiungere 250 ␮l di BLB e 50 ␮l di proteinasi K.
햴
Incubare la provetta per 10 minuti a +65°C sottoponendola ad agitazione a 850 rpm in un thermomixer, quindi incubare per altri 10 minuti
a +95°C.
 Nel caso dell'isolamento dell'RNA omettere l'incubazione a +95°C.
햵
Trasferire 500 ␮l di lisato in una cartuccia di processamento MagNA
Pure 96.
Pretrattamento dei tamponi
햲
Sospendere un tampone secco in 500 ␮l (o 1000 ␮l) di BLB; aggiungere 50 μl (o 100 ␮l) di proteinasi K. 
Per i campioni in terreno di trasporto usare 250 ␮l (o 500 ␮l) di terreno
di trasporto, aggiungere 250 ␮l (o 500 ␮l) di BLB e 50 ␮l (o 100 ␮l) di
proteinasi K.
햳
Spremere e rimuovere il tampone.
햴
Incubare il campione liquido a +65°C per 10 minuti e quindi per 10
minuti a +95°C.
 Nel caso dell'isolamento dell'RNA omettere l'incubazione a +95°C.
햵
Trasferire 500 ␮l (o 1000 ␮l) in una cartuccia di processamento
MagNA Pure 96.
V. Cellule in coltura
È possibile usare cellule in coltura risospese in 200 ␮l di PBS.
Per l'isolamento del DNA da cellule in coltura cresciute in sospensione, eseguire un leggero spin-down delle cellule in coltura per 5 minuti a 300 × g. Se
necessario, lavare il pellet cellulare usando la soluzione PBS.
 Il pellet può essere conservato tra ⫺15 e ⫺25°C. 
Rimuovere il terreno di coltura (o PBS) e risospendere le cellule in solu16
y Versione 04, IT
zione PBS fredda pipettando o sottoponendo ad agitazione la provetta finché il pellet non viene risospeso. 
Le cellule in coltura monostrato devono essere raccolte mediante tripsinizzazione standard usando la procedura descritta in precedenza. Il volume
di campione richiesto è pari a 200 ␮l.
 Non usare più di 1 × 106 cellule/200 ␮l; in caso contrario le prestazioni del
processo di isolamento ne potrebbero risentire.
VI. Tessuto congelato fresco
È possibile usare 25 mg di tessuto congelato fresco dopo omogeneizzazione.
Omogeneizzazione del tessuto mediante digestione della proteinasi K
햲
Aggiungere un massimo di 25 mg di campione tissutale in una provetta di reazione, ad esempio una provetta per centrifuga da 1,5 ml.
햳
Aggiungere 180 ␮l del reagente MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis
Buffer* e 20 ␮l di proteinasi K al campione tissutale, quindi miscelare.
햴
Incubare a +55°C fino a completo discioglimento del tessuto (in
genere sono necessarie da tre ore a una notte intera).
 Questo metodo di omogeneizzazione produce una resa e un'integrità elevate del DNA.
Omogeneizzazione del tessuto mediante lo strumento MagNA Lyser
햲
Trasferire un massimo di 25 mg di campione tissutale in una provetta
di MagNA Lyser Green Beads.
햳
Aggiungere 200 ␮l del reagente MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis
Buffer.
햴
Omogeneizzare il tessuto sullo strumento MagNA Lyser per 30 o 40
secondi. Se l'omogeneizzazione non è ancora completa, ripetere questo passaggio.
 Questo metodo è rapido anche se, a causa della segmentazione
meccanica, il DNA potrebbe risultare parzialmente frammentato.
17
y Versione 04, IT
8.3
Controllo della qualità
 Utilizzare sempre i controlli del caso.
Per controllare l'intero processo, dalla preparazione dei campioni all'analisi,
utilizzare i seguenti controlli:
• Controllo positivo usando un materiale campione positivo al target.
• Controllo negativo usando la soluzione PBS al posto del campione.
• Controllo di estrazione usando un materiale campione negativo al target.
• Controllo interno (IC) aggiungendo una quantità prefissata di templato di
controllo a tutti i campioni da purificare.
 Per le applicazioni che potrebbero produrre risultati falsi negativi, come la
rilevazione di patogeni, è obbligatorio l'uso di un controllo interno adeguato. Il controllo interno viene aggiunto durante l'isolamento degli acidi
nucleici, preferibilmente usando la funzione automatizzata del sistema
MagNA Pure 96. Il controllo interno può anche essere aggiunto manualmente al campione. In questo caso il controllo interno deve essere stabile
nel materiale campione e non deve essere usato un controllo interno sensibile alla nucleasi, come l'RNA non protetto.
Controllo interno
Numero di
campioni
8
Il sistema MagNA Pure 96 è in grado di aggiungere automaticamente a ogni
campione un controllo interno prelevandolo dalla provetta del controllo
interno MagNA Pure 96. Il volume prefissato del controllo interno è pari a 20
␮l per isolamento. Per usare questa funzione, selezionare un controllo interno
dall'elenco Internal Control quando viene creato l'ordine. Aggiungere il volume
indicato alla provetta del controllo interno e posizionare la provetta sulla piattaforma.
 A causa di limitazioni meccaniche, il volume di controllo interno richiesto è
maggiore del valore ottenuto moltiplicando il numero di campioni per 20
␮l:
16
24
32
Quantità IC 650 800 1000 1350
(␮l)
40
48
56
64
1500 1650 2300 2450
72
80
88
96
2600 2800 2950 3100
 Per alcuni protocolli da 1000 ␮l il volume del campione viene diviso per
produrre due campioni e processato in due pozzetti separati della cartuccia di processamento MagNA Pure 96. Quando viene usato, il controllo
interno viene aggiunto ad ogni singolo pozzetto. Ciò significa che la quantità di controllo interno aggiunta per ogni campione è 40 ␮l invece di 20
␮l. Occorre quindi raddoppiare il volume del controllo interno caricato
sullo strumento e il numero di „Tests“ nella finestra di dialogo „Edit Internal
Control Barcode“.
18
y Versione 04, IT
8.4
Procedura di isolamento
 È responsabilità dell'utente la validazione delle prestazioni del sistema per
tutte le procedure del laboratorio.
Lo strumento MagNA Pure 96 è progettato per processare simultaneamente
96 campioni. Quando si usa un numero di campioni non multiplo di 8, lo strumento riempie le posizioni vuote fino a raggiungere il successivo multiplo di 8.
Per una descrizione dettagliata di come eseguire la configurazione dello strumento e una seduta di purificazione, fare riferimento al Manuale per la formazione dell'utilizzatore MagNA Pure 96 (Versione software 2.0).
 Pipettare i campioni sul fondo dei pozzetti della cartuccia di processamento. Evitare di lasciare gocce del materiale campione sulle pareti dei
pozzetti. Usare la funzione di trasferimento dei campioni per pipettare
automaticamente i campioni nei pozzetti di un'altra cartuccia di processamento. Ciò permette di trasferire i campioni senza contaminare le pareti
dei pozzetti con il materiale campione. Per maggiori informazioni, fare riferimento al Manuale operativo MagNA Pure 96 (Versione software 2.0).
 Accertarsi che le istruzioni vengano seguite nel rispetto del tipo e della
quantità di materiale campione (vedere la sezione 8.2 Materiali campione
di partenza e fasi di pre-isolamento). Usando campioni di tipo e quantità
non corretti si potrebbero verificare l'agglutinazione, con conseguente
bassa resa e purezza dell'acido nucleico, la cross-contaminazione e l'inibizione delle analisi downstream, quali PCR e RT-PCR. I campioni di partenza acquosi, come gli acidi nucleici disciolti in acqua o in liquidi privi di
tamponi biologici, possono comportare prestazioni di purificazione scadenti. In questo caso si consiglia di aggiungere una soluzione 10× PBS
con concentrazione finale di 1× PBS, o un acido nucleico carrier, quale il
Poly A RNA.
 Quando i reagenti sono stati conservati a temperature inferiori all'intervallo
tra +15 e +25°C, equilibrare i componenti del kit tra +15 e +25°C per
almeno un'ora prima dell'uso.
 Verificare che tutti i contenitori siano inseriti correttamente nei vassoi per
reagenti prima di collocarli sulla piattaforma.
 È possibile usare due set di reagenti dello stesso lotto in una singola
seduta di purificazione. In questo caso, si consiglia di usare due set di controlli esterni, uno per ogni set di reagenti.
19
y Versione 04, IT
8.5
Fine di una seduta
Al termine di una seduta, ispezionare attentamente lo strumento per individuare eventuali segni di fuoriuscite. Se si è verificata una fuoriuscita, pulire e
decontaminare lo strumento come descritto nel Manuale operativo MagNA
Pure 96.
 Pulire e decontaminare il coperchio dei liquidi di scarto dopo ogni seduta,
come descritto nel Manuale per la formazione dell'utilizzatore MagNA
Pure 96. Nel primo passaggio della procedura di pulizia non usare ipoclorito di sodio (candeggina) o acidi, che potrebbero produrre un gas fortemente tossico in combinazione con i reagenti contenenti guanidina
tiocianato.
 I residui delle biglie magnetiche nella piastra di uscita non influenzano le
analisi PCR e RT-PCR sugli strumenti LightCycler® o sui termociclatori
convenzionali.
20
y Versione 04, IT
LIMITAZIONI E INTERFERENZE
9.
LIMITAZIONI E INTERFERENZE
1. L'affidabilità dei risultati dipende da procedure adeguate di raccolta, trasporto, conservazione e processamento dei campioni.
2. L'uso di questo prodotto è riservato esclusivamente a personale addestrato
nelle procedure di purificazione e isolamento degli acidi nucleici e nelle tecniche PCR.
3. Se un campione viene raccolto, trasportato, conservato o manipolato in
modo improprio è possibile che vengano generati risultati falsi negativi. Possono essere generati falsi negativi anche quando nel campione di un
paziente è presente un numero inadeguato di organismi.
4. Le applicazioni IVD che utilizzano la procedura di preparazione dei campioni in combinazione con qualsiasi test IVD degli acidi nucleici downstream vanno valutate tenendo in considerazione i singoli parametri IVD.
5. Per ridurre al minimo il rischio di impatto negativo sui risultati, è necessario
adottare controlli adeguati per le applicazioni downstream.
6. Le condizioni di conservazione (temperatura, tempo) per i lisati, i pellet di
cellule in coltura e gli eluati devono essere validate tenendo conto dei singoli parametri IVD.
7. Il prodotto MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit e i relativi
reagenti sono destinati all'uso con il sistema MagNA Pure 96 per l'isolamento e la purificazione degli acidi nucleici totali (DNA/RNA) prelevati da
campioni biologici, per finalità di diagnostica in vitro. Spetta all'utente stabilire caratteristiche prestazionali adeguate rispetto, in particolare, alle applicazioni downstream. I risultati devono essere interpretati nel contesto di tutti
gli altri riscontri clinici e di laboratorio. Poiché la concentrazione degli analiti
può variare sensibilmente da un tipo di campione all'altro, si consiglia di stabilire le prestazioni di cross-contaminazione ad esempio tramite i cosiddetti
esperimenti a scacchiera (campione alto positivo accanto a un campione
negativo) prima di procedere con i test di routine.
21
y Versione 04, IT
DATI SULLE PRESTAZIONI
10. DATI SULLE PRESTAZIONI
 I kit MagNA Pure 96 e i relativi reagenti vengono usati con il sistema
MagNA Pure 96 per l'isolamento e la purificazione degli acidi nucleici
totali (DNA/RNA) prelevati da campioni biologici per finalità di diagnostica
in vitro. 
I dati rappresentativi delle prestazioni sono mostrati nelle tabelle seguenti.
I dati riportano, a titolo esemplificativo, le prestazioni dei tipi di campioni
più comuni allo scopo di dimostrare le prestazioni di punta del sistema.
Poiché i risultati ottenuti possono variare in funzione dei campioni o dei
parametri in uso, l'utente deve prima stabilire le caratteristiche prestazionali appropriate. Per le finalità di diagnostica, i risultati devono sempre
essere valutati sulla base della relativa applicazione e di altri riscontri. 
Per la preparazione dei campioni con lo strumento MagNA Pure 96, sono
stati usati il prodotto MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small
Volume Kit e il prodotto MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large
Volume Kit per generare i dati sulle prestazioni mostrati di seguito.
10.1
Precisione dell'efficienza della purificazione
Per determinare la precisione dell'efficienza della purificazione, il DNA genomico è stato purificato dal sangue intero. La resa e la purezza dell'acido
nucleico isolato sono state determinate tramite misurazioni OD. Qui di seguito
sono descritti l'allestimento dell'esperimento e i relativi risultati.
Tipo di kit
Protocollo di purificazione DNA Blood SV
Tipo di campione
Sangue intero (7,6 × 106 globuli bianchi/ml)
Volume iniziale di campione
200 ␮l
Volume di eluizione
100 ␮l
Ripetizioni per seduta
24
Tabella 2 - Allestimento dell'esperimento per eseguire l'analisi di resa e purezza
Resa (␮g)
CV (%)
OD 260/280
CV (%)
Seduta 1
5,6
3,9
1,9
2,5
Seduta 2
5,6
5,5
1,9
4,4
Seduta 3
5,5
6,5
1,9
1,8
Tabella 3 - Risultati (valori medi) per la resa e la purezza del DNA, per DNA genomico
purificato da sangue intero
22
y Versione 04, IT
 La resa dipende fortemente dal conteggio delle cellule ematiche e può
quindi variare da un donatore all'altro.
10.2
Prestazioni analitiche
È stata eseguita l'analisi Real time qPCR/RT-PCR sullo strumento LightCycler®
480 usando 5 ␮l di eluato in un volume totale della PCR di 20 ␮l. Gli standard
di quantificazione e i campioni di controllo sono stati aggiunti direttamente
prima di iniziare la PCR.
Parametro
Parvovirus B19
Virus dell'epatite A (HAV) Ciclofilina A (CycA)
Tipo di cam- Plasma in EDTA arric- Plasma in EDTA arricchito
pione
chito con Parvovirus B19 con Virus dell'epatite A
Sangue intero in pool da
diversi donatori
(7,6 × 106 globuli bianchi/
ml)
Target
Materiale stock interno
del Parvovirus B19
Materiale stock interno del
Virus dell'epatite A
DNA genomico umano
Kit usato 
per analisi 
PCR
(disponibile solo come 
prodotto interno)
(disponibile solo come prodotto interno)
Test di laboratorio
LightCycler® CycA:
DNA MasterPLUS
HybProbe e primer e
sonde specifiche della
Ciclofilina A
Volume di
eluato per
PCR
5 ␮l
5 ␮l
5 ␮l
Volume della 20 ␮l
PCR
20 ␮l
20 ␮l
Strumento 
per PCR
Strumento 
LightCycler® 480
Strumento 
LightCycler® 480
Strumento 
LightCycler® 480
Tabella 4 - Riepilogo dei test usati per produrre i dati sulle prestazioni mostrati di seguito.
Intervallo lineare L'intervallo lineare e il limite di rilevazione (LoD), che possono essere ottenuti
usando i prodotti MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid Kit per la purifie Limite di
rilevazione (LoD) cazione automatizzata degli acidi nucleici con lo strumento MagNA Pure 96,
sono stati valutati usando il materiale stock del Parvovirus B19 e del Virus
dell'epatite A (entrambi disponibili solo come prodotti interni).
Qui di seguito sono descritti l'allestimento dell'esperimento per determinare
l'intervallo lineare e il limite di rilevazione dei parametri scelti e i relativi risultati.
23
y Versione 04, IT
Parametro
Parvovirus B19
Tipo di kit
LV Kit
NA LV Kit
Protocollo di purificazione
Tipo di campione
Plasma in EDTA
Plasma in EDTA
Volume iniziale di campione
500 ␮l
500 ␮l
Volume di eluizione
50 ␮l
50 ␮l
Serie di diluizioni
8 diversi titoli virali 
da 2×101 a 5×107 copie/ml
8 diversi titoli virali 
da 3×101 a 1×109 copie/ml
Punti dati complessivi
disponibili
172
176
Tabella 5 - Allestimento dell'esperimento per determinare l'intervallo lineare e il limite di rilevazione.
Parametro
Parvovirus B19
2×102
a
5×106
copie/ml
Intervallo lineare
Da
Limite di rilevazione*
(LoD_95)
68 copie/ml
intervallo di confidenza: 
da 48 a 156 copie/ml
Da 3×103 a 1×109 copie/ml
119 copie/ml
intervallo di confidenza: 
da 75 a 279 copie/ml
Tabella 6 - Risultati determinati per l'intervallo lineare e il limite di rilevazione.
* Tutti i dati sono stati valutati statisticamente tramite analisi di Probit; il limite di rilevazione è stato calcolato per
l'intervallo di confidenza al 95% (LoD_95).
 La sensibilità e il limite di rilevazione sono fortemente dipendenti dall'ana-
lisi PCR
24
y Versione 04, IT
Intervallo lineare
- Parvovirus B19
Figura 1 - Intervallo lineare ottenuto con il protocollo Viral NA Universal LV per
la purificazione del Parvovirus B19 da plasma in EDTA. L'intervallo lineare per questa applicazione è compreso tra 2×102 e 5×106 copie/ml. SVT/ml: Titolo virale arricchito/ml, MVT/ml: Titolo virale misurato/ml.
Intervallo lineare
- Virus
dell'epatite A
(HAV)
Figura 2 - Intervallo lineare ottenuto con il protocollo Viral NA Universal LV per
la purificazione del Virus dell'epatite A da plasma in EDTA. L'intervallo lineare per
questa applicazione è compreso tra 3×103 e 1×109 copie/ml. SVT/ml: Titolo virale arricchito/ml, MVT/ml: Titolo virale misurato/ml.
25
y Versione 04, IT
Limite di
rilevazione del
Parvovirus B19
Figura 3 - Limite di rilevazione del Parvovirus B19 determinato usando il protocollo Viral NA Universal LV per la purificazione di una serie di diluizioni virali da
plasma in EDTA. Il valore LoD_95 è pari a 68 copie/ml. Il relativo intervallo di confidenza è compreso tra 48 e 156 copie/ml.
_____
Regressione Probit, - - - - Limite inferiore 95%, . . . . . . Limite superiore 95%, o LoD_95.
Limite di
rilevazione del
Virus dell'epatite
A (HAV)
Figura 4 - Limite di rilevazione del Virus dell'epatite A determinato usando il
protocollo Viral NA Universal LV per la purificazione di una serie di diluizioni
virali da plasma in EDTA. 
Il valore LoD_95 è pari a 119 copie/ml. Il relativo limite di confidenza è compreso tra 75
e 279 copie/ml. _____ Regressione Probit, - - - - Limite inferiore 95 %, . . . . . . Limite superiore 95%, o LoD_95.
26
y Versione 04, IT
10.3
Analisi della precisione
Le deviazioni standard (SD) e i coefficienti di variazione (CVs) sono stati determinati per serie di diluizioni entro l'intervallo lineare usando i seguenti parametri: Parvovirus B19, Virus dell'epatite A e Ciclofilina A.
Per determinare la precisione intra-saggio, tutti i dati sono stati generati in una
stessa seduta. Per determinare la precisione inter-saggio, sono state eseguite
tre sedute da diversi operatori, su diversi strumenti e in diversi laboratori. La
precisione tra lotti è stata determinata usando sei diversi lotti.
Qui di seguito sono descritti l'allestimento dell'esperimento per eseguire l'analisi della precisione e i relativi risultati.
Parametro
Parvovirus B19
Virus dell'epatite A (HAV) Ciclofilina A (CycA)
Tipo di kit
Viral NA SV Kit
and Viral NA SV Kit
MagNA Pure 96 DNA
and Viral NA SV Kit
Protocolli di
purificazione
DNA Blood SV
Tipo di campione
Plasma in EDTA
Plasma in EDTA
Sangue intero (7,6 × 106
globuli bianchi/ml)
Volume iniziale 200 ␮l
di campione
200 ␮l
200 ␮l
Volume di elui- 50 ␮l
zione
50 ␮l
100 ␮l
Serie di diluizioni
Da 1×103 a 1×106
copie/ml
Da 1×103 a 1×106 copie/ml Non applicabile
Ripetizioni
8
8
24
Punti dati
Strumento
LightCycler® 480
Strumento 
LightCycler® 480
Strumento 
LightCycler® 480
Precisione
intra-saggio
32
32
24
Precisione
inter-saggio
96
96
72
Precisione
tra lotti
160
160
144
Tabella 7 - Allestimento dell'esperimento per eseguire l'analisi della precisione.
27
y Versione 04, IT
Parvovirus B19
Precisione intra-saggio
Concentrazione (copie/ml) Media (Cp)
1×
106
1×
105
1×
104
1 × 103
SD (Cp)
CV (%)
18,0
0,14
0,78
21,5
0,21
1,00
24,9
0,31
1,23
28,5
0,39
1,37
Parvovirus B19
Precisione inter-saggio
1×
106
18,2
0,34
1,89
1×
105
21,6
0,32
1,49
1 × 104
25,2
0,44
1,73
103
28,7
0,38
1,34
1×
Parvovirus B19
Precisione tra lotti*
106
18,2
0,16
0,90
1 × 105
21,7
0,21
0,97
1×
104
25,1
0,39
1,55
1×
103
28,6
0,38
1,32
1×
Tabella 8 - Risultati dell'analisi della precisione intra-saggio, inter-saggio e tra lotti
determinati usando materiale virale del Parvovirus B19 aggiunto a plasma in EDTA.
* Media tra 6 diversi lotti
Concentrazione (copie/ml) Media (Cp)
SD (Cp)
CV (%)
19,4
0,18
0,94
23,0
0,28
1,23
4
26,2
0,12
0,45
3
29,7
0,12
0,41
6
1 × 10
1 × 105
1 × 10
1 × 10
19,4
0,26
1,33
5
22,9
0,21
0,92
4
26,2
0,12
0,45
1 × 10
1 × 10
28
1 × 106
y Versione 04, IT
1 × 103
29,6
0,32
1,07
1×
106
19,7
0,22
1,10
1×
105
23,1
0,15
0,67
1 × 104
26,6
0,39
1,46
103
30,0
0,26
0,87
1×
Tabella 9 - Risultati dell'analisi della precisione intra-saggio, inter-saggio e tra lotti
determinati usando materiale virale del Virus dell'epatite A aggiunto a plasma in EDTA.
Test CycA
Campione di riferimento
Media (Cp)
SD (Cp)
CV (%)
18,1
0,20
1,12
Test CycA
18,0
Test CycA
0,21
1,15
17,9
0,16
0,87
Tabella 10 - Risultati della precisione intra-saggio, inter-saggio e tra lotti per il test
CycA eseguito con DNA isolato da sangue intero.
10.4
L'influenza delle sostanze interferenti è stata valutata usando materiale campione arricchito con Parvovirus B19 e con una serie a concentrazioni crescenti
delle seguenti sostanze prevalenti: Emoglobina (Hemoglobin human, SigmaAldrich Co. LLC), bilirubina (Sigma-Aldrich Co. LLC) e lipidi (Intralipid 20 %
emulsion, Sigma-Aldrich Co. LLC).
Qui di seguito è descritto l'allestimento dell'esperimento per valutare
l'influenza delle sostanze interferenti e i relativi risultati:
29
y Versione 04, IT
Parametro
Parvovirus B19
Tipo di kit
Tipo di campione
Sangue intero
Volume iniziale di cam- 200 ␮l
pione
Volume di eluizione
50 ␮l
Concentrazione virale
1 × 105 copie/ml
Emoglobina, bilirubina e lipidi usati a 
diverse concentrazioni
Ripetizioni per concen- 3
trazione dell'inibitore
Tabella 11 - Allestimento dell'esperimento per valutare l'influenza delle sostanze interferenti emoglobina, bilirubina e lipidi.
Risultati
Emoglobina (mg/
dl)
Cp
Bilirubina (mg/
dl)
Cp
Lipidi (mg/dl) Cp
0
21,0
0
20,8
0
21,6
100
21,3
6,6
21,0
200
21,6
200
21,2
13,2
21,2
400
21,5
300
21,2
19,8
20,9
600
21,9
400
21,1
26,4
21,0
800
21,9
500
21,1
33,0
21,3
1000
21,8
600
21,0
39,5
21,4
1200
21,5
700
21,1
46,1
21,3
1400
21,6
800
21,3
52,8
21,0
1600
21,3
900
21,5
59,4
21,0
1800
21,2
1000
n.d.*
66,0
21,5
2000
21,1
Media
21,1
Media
20,8
Media
21,6
Tabella 12 - Risultati al crossing point (Cp) per i campioni arricchiti con le sostanze
interferenti.
* non determinato a causa di un errore di pipettamento.
Nessuna delle sostanze interferenti ha mostrato influenza sui crossing point.
L'intervallo dei crossing point ottenuto è a 0,8.
30
y Versione 04, IT
10.5
Test della cross-contaminazione
Il rischio di cross-contaminazione è stato valutato usando il test Parvo B 19.
Nelle prime due sedute, sono stati processati solo campioni negativi per verificare la presenza di possibili contaminazioni nel sistema MagNA Pure 96. Nelle
tre sedute successive, è stata processata una configurazione a scacchiera di
campioni positivi e negativi alternati. In un'ultima seduta, sono stati processati
solo campioni negativi. Un campione è stato identificato come negativo
quando non è stato ottenuto il segnale di rilevazione dopo 45 cicli PCR.
Qui di seguito sono descritti l'allestimento dell'esperimento per verificare la
possibile contaminazione del sistema MagNA Pure 96 e i relativi risultati.
Parametro
Parvovirus B19
Tipo di kit
Volume iniziale di
campione
500 ␮l
Volume di eluizione
50 ␮l
Campioni positivi
5 × 107 copie/ml in plasma in EDTA
Campioni negativi
Plasma in EDTA negativo
Numero di sedute
A) 2 sedute solo con campioni negativi
B) 3 sedute con configurazione a scacchiera
C) 1 seduta solo con campioni negativi
Analisi PCR
Kit di quantificazione LightCycler® Parvo B19 con
una piastra a 384 pozzetti su uno strumento
LightCycler® 480
Tabella 13 - Allestimento dell'esperimento per valutare il rischio di cross-contaminazione.
31
y Versione 04, IT
Seduta Media Cp di 
campioni positivi
Deviazione standard
Tasso positivi
Tasso
negativi
1
n/a
n/a
0/96
96/96
2
n/a
n/a
0/96
96/96
3
17,8
0,20
48/96
48/96
4
20,0
0,22
48/96
48/96
5
18,6
0,12
48/96
48/96
6
n/a
n/a
0/96
96/96
Tabella 14 - Risultati degli esperimenti di cross-contaminazione basati su media dei
crossing point (Cp) e tasso di risultati positivi.
Come mostrato nella Tabella 14, nelle condizioni descritte in precedenza non è
stata rilevata alcuna cross-contaminazione.
10.6
Confronto tra i metodi
Rilevazione delle
mutazioni JAK2
Il confronto tra i metodi è stato ottenuto usando il sistema MagNA Pure 96 per
verificare la presenza dell'allele JAK2-V617F nei campioni di sangue intero.
Questo metodo confronta il tasso di mutazioni rispetto al wild type. Il DNA è
stato isolato usando il sistema MagNA Pure 96 e il diffuso metodo manuale
QIAamp DNA Blood Mini Kit. L'analisi PCR è stata eseguita usando il prodotto
JAK2 MutaQuant®Kit, rispettando le istruzioni del produttore.
Parametro
Jak2 V617F
Tipo di kit
DNA Blood SV
Tipo di campione
Sangue intero
Volume iniziale di cam- 200 ␮l
pione
Volume di eluizione
50 ␮l
Campioni analizzati*
50
Analisi PCR
strumento Marseille on the Rotor-Gene 3000
Metodo di compara(volume di eluizione 85 μl)
zione
per la preparazione dei
campioni
32
y Versione 04, IT
Tabella 15 - Allestimento dell'esperimento per verificare la presenza dell'allele
JAK2-V617F in campioni di sangue intero.
* Cinquanta campioni clinici scelti alla cieca (campioni in più) sono stati ottenuti usando
procedure diagnostiche di routine e quindi misurati in parallelo.
Comparatore
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 50 campioni
Negativi
Positivi a
JAK2_V617F
Totali
Negativi
33
0
33
Positivi a
JAK2_V617F
0
17
17
Totali
33
17
50
Tabella 16 - In questa analisi sono stati inclusi 50 campioni in tutto. È stata ottenuta
una concordanza del 100% nell'identificazione dei campioni positivi e negativi tra il
metodo automatizzato MagNA Pure 96 e il metodo manuale QIAamp DNA Blood Mini
Kit.
Figura 5 - Il confronto tra i metodi si è basato sul tasso di mutazioni finale rispetto al
wild type ottenuto con la purificazione eseguita con il prodotto MagNA Pure 96 DNA
and Viral NA SV Kit rispetto a quello ottenuto con la purificazione con il QIAamp DNA
Blood Mini Kit.
……….. Linea di identità, - - - - - Regressione Bablok (1,02x); Coefficiente di correlazione
di Pearson (r) = 0,989
33
y Versione 04, IT
DNA di
Pneumocisti
jiroveci
I dati del confronto tra i metodi ottenuti usando il sistema MagNA Pure 96
sono stati valutati verificando la presenza del DNA di Pneumocisti jiroveci in
campioni di lavaggio broncoalveolare (BAL).
È stato eseguito il seguente allestimento dell'esperimento:
Parametro
DNA di Pneumocisti jiroveci
Tipo di kit
Tipo di campione
Lavaggio broncoalveolare (BAL)
Volume iniziale di
campione
500 ␮l
Volume di eluizione
100 ␮l
Campioni analizzati*
96
Analisi PCR**
Analisi Real time qPCR sviluppata in laboratorio in
combinazione con LightCycler® FastStart DNA
Master HybProbe
LoD: <50 copie/reazione
Intervallo lineare: da 103 a 108 copie/ml
I campioni > 104 copie/ml sono valutati come
positivi
Metodo di compara- QIAamp DNA Mini Kit:
zione
Volume dei campioni: 500 ␮l
per la preparazione Volume di eluizione: 200 ␮l
dei campioni
Tabella 17 - Allestimento dell'esperimento per verificare la presenza del DNA di Pneumocisti jiroveci in campioni di lavaggio broncoalveolare.
* Novantasei campioni clinici scelti alla cieca (campioni in più) sono stati ottenuti
usando procedure diagnostiche di routine e quindi misurati in parallelo.
**L'analisi PCR è stata sviluppata e validata dall'Istituto di microbiologia medica e igiene
dell'Ospedale universitario di Regensburg.
34
y Versione 04, IT
Comparatore
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 96 campioni
Negativi
Positivi a
DNA di P.jiroveci
Totali
Negativi
70
1
71
Positivi a
DNA di P.jiroveci
0
25
25
Totali
70
26
96
Tabella 18 - 26 campioni su 96 in tutto sono stati valutati come positivi. La concordanza positiva per i campioni positivi è stata di 25 su 26 (96%). La concordanza positiva
per i campioni negativi è stata di 70 su 70 (100%).
Figura 6 - Il confronto tra i metodi per i campioni positivi si è basato sui crossing point
misurati in 2 sedute consecutive eseguendo un'analisi Real time qPCR sviluppata in
laboratorio del Pneumocisti jiroveci.
…….. Linea di identità, - - - - - Regressione Bablok (1,01x+0,91); Coefficiente di correlazione di Pearson (r) = 0,9312
(Seduta 1: ×) _______ Regressione Bablok (1,01x +1,07); Coefficiente di correlazione di
Pearson (r) = 0,9304 (Seduta 2: o)
35
y Versione 04, IT
INFORMAZIONI SUPPLEMENTARI
11. INFORMAZIONI SUPPLEMENTARI
11.1
Simboli
In questo documento, vengono utilizzati i seguenti simboli per evidenziare le
informazioni importanti:
11.2
Simbolo
Descrizione

Nota importante

Nota informativa
C
Per uso diagnostico in vitro.
I
Numero di catalogo
B
Codice del lotto
s
Utilizzare entro
r
Limiti di temperatura (Conservare a)
n
Distributore
t
Fabbricante
)
Conservare al riparo dalla luce del sole (sulle
confezioni esterne dei materiali monouso)
2
Prodotto monouso (sulle confezioni esterne
dei materiali monouso)
v
Il kit è conforme ai requisiti della Direttiva IVD
98/79/CE.
*
disponibile presso Roche Applied Science
Modifiche rispetto alla versione precedente
Modifiche editoriali.
12. MARCHI
LIGHTCYCLER e MAGNAPURE sono marchi di Roche.
Tutti gli altri nomi di prodotti e marchi appartengono ai rispettivi proprietari.
13. LIMITAZIONE DELLA LICENZA
Questo prodotto è concesso in licenza per lo sfruttamento di brevetti di proprietà della Qiagen.
36
y Versione 04, IT
LIMITAZIONE NORMATIVA
14. LIMITAZIONE NORMATIVA
Per uso diagnostico in vitro.
37
y Versione 04, IT
v
Germany, +49 621 7590
Prodotto in Germania
_________________________________________________________________
0512.06671934001➃
t
n Distribuito negli USA da Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA
68298 Mannheim
Germany
C
y Versjon 04
Innhold versjon: Mai 2012
Forhåndfylte reagenser for MagNA Pure 96-instrumentet. Dette kitet brukes til
isolering av genomisk DNA og virale nukleinsyrer (NA) fra opptil 1000 ␮l fullblod,
plasma eller serum, eller fra opptil 25 mg ferskfrosset vev, og fra opptil 1 × 106
dyrkede celler, samt for isolering av nukleinsyrer fra bakterier, sopp og virus fra
opptil 1000 ␮l humant prøvemateriale.
I 06 374 891 001
r Oppbevares ved ⫹15 til ⫹25 °C
 Kitet skal beskyttet mot lys.
 Kitet skal beskyttet mot magneter.
Kit for 3 ⫻ 96 reaksjoner
Table of Contents
1.
2.
3.
4.
TILTENKT BRUK ............................................................................................................... 3
FORKLARING AV KITET ................................................................................................. 3
TESTPRINSIPP/SAMMENDRAG .................................................................................. 3
REAGENSER - ARBEIDSLØSNINGER .......................................................................... 4
4.1
4.2
Antall tester
Kit/innhold
5.
ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER ......................................................................... 6
5.1
5.2
5.3
5.4
Forholdsregler
Krav til håndtering
Laboratorierutiner
Håndtering av avfall
4
4
6
7
8
8
6.
OPPBEVARING OG HOLDBARHET .............................................................................. 9
6.1
6.2
6.3
Kit og reagenser
Prøvetaking og oppbevaring av prøvemateriale
Oppbevaring av isolerte nukleinsyrer og eluater
7.
MATERIALER .................................................................................................................. 11
7.1
7.2
Materialer som medfølger
Nødvendige materialer og utstyr som ikke medfølger
8.
ANALYSEPROSEDYRER ............................................................................................... 12
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
Isoleringsprotokoller
Prøvematerialer og trinn som skal utføres før isolering
Kvalitetskontroll
Prosedyre for isolering
Avslutte en kjøring
9.
10.
BEGRENSNINGER OG INTERFERENS ........................................................................ 20
YTELSESDATA ............................................................................................................... 21
10.1
10.2
10.3
10.4
10.5
10.6
Isoleringens presisjon
Analytisk ytelse
Presisjonsanalyse
Interfererende substanser
Testing for krysskontaminering
Metodesammenligning
9
9
10
11
11
12
13
17
18
19
21
22
25
28
29
30
11.
TILLEGGSINFORMASJON ............................................................................................ 34
11.1
11.2
Symboler
Endringer i tidligere versjon
12.
13.
14.
VAREMERKER ................................................................................................................ 34
LISENSTILKNYTTET ANSVARSBEGRENSNING ....................................................... 34
JURIDISK ANSVARSBEGRENSNING ......................................................................... 35
2
34
34
y Versjon 04, NO
TILTENKT BRUK
1.
TILTENKT BRUK
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit er et reagenskit som
brukes i kombinasjon med MagNA Pure 96-systemet for isolering av totale
nukleinsyrer (DNA/RNA) fra biologiske prøver for in vitro-diagnostiske formål.
Eventuelle IVD-applikasjoner som bruker prosedyren for prøvepreparering
sammen med eventuell nedstrøms IVD-nukleinsyretesting, skal evalueres med
hensyn til de individuelle IVD-parameterne.
2.
FORKLARING AV KITET
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit er utviklet spesifikt for å
isolere:
• Nukleinsyre fra opptil 1000 ␮l fullblod, plasma eller serum.
• Nukleinsyrer fra bakterier, sopp og virus fra opptil 1000 ␮l prøvemateriale
eller lysat av human opprinnelse.
• Nukleinsyre fra opptil 1 × 106 dyrkede celler.
• Nukleinsyre fra opptil 25 mg ferskfrosset vev.
De isolerte nykleinsyrene oppfyller kvalitetsstandardene som er satt for høysensitiv kvantitativ PCR/RT-PCR-analyse.
3.
TESTPRINSIPP/SAMMENDRAG
Prosedyren for isolering av nukleinsyrer er basert på MagNA Pure MGP-teknologi (teknologi med anvendelse av magnetiske glasspartikler). 
Hovedtrinnene i en prosedyre for nukleinsyreisolering med MagNA Pure 96 er:
1. Prøvematerialet lyseres, nukleinsyrene frigjøres, og nukleasene denatureres.
2. Nukleinsyrene bindes til silikaoverflaten til de magnetiske glasspartiklene
grunnet nærvær av kaotropiske salter og den høye ionestyrken til lyserings-/bindingsbufferen.
3. Magnetiske glasspartikler med bundne nukleinsyrer blir magnetisk separert
fra resten av den lyserte prøven.
4. Ubundne substanser, slik som proteiner, cellerester og PCR-hemmere blir
fjernet i flere vasketrinn.
5. Isolerte nukleinsyrer blir eluert fra de magnetiske glasspartiklene.
3
y Versjon 04, NO
REAGENSER - ARBEIDSLØSNINGER
4.
4.1
Antall tester
Kitet er utformet for å utføre
• 3 × 96 isoleringer av genomisk DNA og viral nukleinsyre fra opptil 
500 ␮l fullblod, plasma, serum eller fra opptil 1 × 106 dyrkede celler eller
• 3 × 96 isoleringer av nukleinsyrer fra bakterier, sopp og virus fra 500 ␮l 
prøvemateriale av human opprinnelse eller
• 3 × 96 isoleringer fra opptil 25 mg ferskfrosset vev eller
• 3 × 48 isoleringer fra 1000 ␮l fullblod, plasma, serum eller
• 3 × 48 isoleringer av nukleinsyrer fra bakterier, sopp og virus fra 1000 ␮l 
prøvemateriale av human opprinnelse.
4.2
Kit/innhold
Komponent Tekst
Innhold/funksjon
Brett 1
Reagensbrett 1
3 brett per kit
Beholder 1
Wash Buffer I
• 160 ml
• < 6 M guanidinhydroklorid, 
• for fjerning av urenheter
Beholder 2
Wash Buffer I
• 80 ml
Beholder 3
Lysis/Binding
Buffer
• 80 ml
• < 6 M guanidintiocyanat, 
• for celle-/viruslysering og binding av
nukleinsyrer
Brett 2
Reagensbrett 2
3 brett per kit
Beholder 1
4
tom
Beholder 2
Proteinase K
• 15 ml
• 2% proteinase K, 50 % glyserol
• for fordøyelse av proteiner
Beholder 3
Elution Buffer
• 80 ml
• < 60 mM Tris-HCl-buffer
• for eluering av nukleinsyre
y Versjon 04, NO
Beholder 4
Wash Buffer III
• 160 ml
• < 20 mM Na-acetatbuffer
Flaske 1
Magnetic Glass 
Particles
• 6 flasker, 18 ml i hver
• MGP-suspensjon som inneholder isopropanol
• for binding av nukleinsyrer
 MagNA Pure 96 System Fluid (intern/ekstern)* fungerer som vaskebuffer II
for dette kitet.
 Alle kitkomponenter er klare til bruk.
5
y Versjon 04, NO
ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER
5.
5.1
Forholdsregler
 Flere av bufferne i MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit
inneholder farlige stoffer eller stoffer som medfører helserisiko. For detaljert informasjon, se figur 1 (Reagensbrett 1), figur 2 (Reagensbrett 2) og
tabell 1. La ikke disse reagensene komme i kontakt med hud, øyne eller
slimhinner. Skyll umiddelbart det berørte området med store mengder
vann hvis slik kontakt oppstår. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene.
 La ikke reagenser som inneholder guanidintiocyanat, komme i kontakt
med natriumhypoklorittløsning (klorløsning) eller syrer. Slike blandinger
kan produsere en svært giftig gass. Denne forholdsregelen er det spesielt
viktig å være oppmerksom på når MagNA Pure 96-avfallsdekselet rengjøres.
Fig. 1: Reagensbrett 1
Komponent Tekst
6
Fig. 2: Reagensbrett 2
Farlige stoffer og stoffer som
medfører 
helserisiko
Brett 1
Reagensbrett 1
Beholder 1
Wash Buffer I
• guanidinhydroklorid
• etanol
Beholder 2
Wash Buffer I
• etanol
y Versjon 04, NO
Beholder 3
Brett 2
Reagensbrett 2
Beholder 1
Empty
Beholder 2
Proteinase K
Beholder 3
Elution Buffer
Beholder 4
Wash Buffer III
Flaske 1
Magnetic Glass 
Particles
• guanidintiocyanat
• proteinase K
• isopropanol
Tabell 1: Liste over reagenser med farlige stoffer eller stoffer som medfører 
helserisiko
5.2
Krav til håndtering
• Bruk engangshansker og bytt dem ofte.
• Bruk ikke kit som er gått ut på dato.
For å minimere risikoen for kontaminering, som kan føre til falske positive
resultater, følg i tillegg retningslinjene som er oppført nedenfor:
• Utfør prøvepreparering, PCR/RT-PCR-oppsett og PCR/RT-PCR på atskilte
steder.
• Kast pipettespisser i forseglede beholdere for å hindre luftbåren kontaminering.
Reagenser og reaksjonsrør som er kontaminert med nukleaser, vil degradere
templat-nukleinsyre. Følg disse retningslinjene for å minimere risikoen for
kontaminering:
• Unngå å berøre overflater eller materialer som kan medføre krysskontaminering av nukleaser.
• Bruk kun reagenser som følger med i dette kitet. Erstatninger kan introdusere nukleaser.
• Rengjør og dekontaminer arbeidsområder og instrumenter, deriblant pipetter, med kommersielt tilgjengelige dekontamineringsreagenser.
• Bruk kun nye nukleasefrie aerosolbarrierespisser og mikrosentrifugerør.
• Benytt et arbeidsområdet som er spesialutformet for arbeid med RNA. Bruk
om mulig spesifikke reaksjonsrør og pipetter til arbeid med templat-RNA.
7
y Versjon 04, NO
5.3
Laboratorierutiner
• Alt materiale av human opprinnelse og alt resulterende avfall må betraktes
som potensielt infeksiøst. Alle arbeidsoverflater må rengjøres og desinfiseres
med et desinfiserende middel som er anbefalt av lokale myndigheter.
• Siden sensitiviteten og titeret til potensielle patogener i prøvematerialet kan
variere, må brukeren optimalisere patogeninaktivering og iverksette relevante tiltak i henhold til lokale sikkerhetsforskrifter.
• Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder.
• Ikke pipetter med munnen.
• Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du
håndterer prøver og reagenser.
• Unngå mikrobiell kontaminering og nukleasekontaminering av reagensene
når du pipetterer ut porsjoner fra reagensflasker. Bruk sterile, engangs 
pipettespisser.
• Vask hendene grundig etter håndtering av prøver og reagenser.
5.4
Håndtering av avfall
• Dataark om materialsikkerhet (MSDS) er tilgjengelig online på 
www.e-labdoc.roche.com, eller kan sendes på forespørsel fra ditt lokale
Roche-kontor.
• Kast ubrukte reagenser og avfall i henhold til nasjonale, regionale og lokale
forskrifter.
• Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du
kaster prøver og reagenser.
• Følg prosedyren nedenfor når du kaster reagenser fra beholderne:
1. Stikk hull på folien i hjørnet av en av beholderne i reagensbrettet med
en forbruksartikkel av hard plast, som for eksempel en cellekulturpipette.
2. Brett tilbake folien og hell væsken i en egen avfallsbeholder.
3. Gjenta trinn 1 og 2 til alle beholderne er tomme.
8
y Versjon 04, NO
OPPBEVARING OG HOLDBARHET
6.
6.1
Kit og reagenser
• Kitet er sendt ved romtemperatur.
• Kitkomponentene er holdbare ved +15 til +25 °C inntil utløpsdatoen som er
angitt på etiketten.
 Oppbevar kitet beskyttet mot lys og ikke i nærheten av magneter.
• Reagenser kan oppbevares i 32 timer ved +15 til +25 °C på plattformen til
MagNA Pure 96-instrumentet.
• Ett sett med reagensbrett (Brett 1 og Brett 2) kan brukes i opptil fire kjøringer. Når reagensbrettene er åpnet, kan de brukes til flere kjøringer på
samme MagNA Pure 96-instrument innen 28 dager, forutsatt at de er riktig
forseglet med en MagNA Pure 96-forseglingsfolie* og oppbevart ved +2 til
+8 °C. Temperer kitkomponentene ved +15 til +25 °C i én time før bruk.
 Delvis brukte reagensbrett kan bare brukes om igjen på samme MagNA
Pure 96-instrument. MagNA Pure 96-programvaren for hvert instrument
sporer beholdningen ved hjelp av reagensstrekkoder, og kjenner igjen delvis brukte brett for reagenser og spisser og håndterer dem riktig i neste
kjøring.
 Hvis reagensbrett ikke er riktig forseglet, kan det oppstå fordampning. Feil
oppbevaring kan få negativ innvirkning på isoleringsprosessen.
6.2
Prøvetaking og oppbevaring av prøvemateriale
For sensitiv nukleinsyredeteksjon er det viktig å sikre at prøvene oppbevares
riktig (⫺15 til ⫺25 °C for DNA eller ⫺60 til ⫺80 °C for RNA). DNA eller RNA
kan bli degradert hvis prøvene ikke er oppbevart riktig.
 Ikke bruk plasma eller blod med heparin.
 Ikke bruk prøvemateriale som har vært oppbevart lenge ved høye temperaturer.
 Prøver som har vært frosset, skal tines under forsiktig oppblanding, f.eks.
ved bruk av en laboratorierulle.
9
y Versjon 04, NO
6.3
Oppbevaring av isolerte nukleinsyrer og eluater
For å sikre optimal stabilitet for de eluerte nukleinsyrene, skal PCR/
RT-PCR-oppsett startes straks. Ikke oppbevar eluerte nukleinsyrer på MagNA
Pure 96-plattformen.
Ved oppbevaring, lukk utmatingsplaten med en MagNA Pure 96-forseglingsfolie* og oppbevar den ved ⫺15 til ⫺25 °C for DNA eller ⫺60 til ⫺80 °C for
RNA. Oppbevar rensede nukleinsyrer porsjonsvis for å unngå gjentatt frysing
og tining.
Hvis utmatingsplater som inneholder eluater, oppbevares utenfor MagNA
Pure 96-instrumentet, skal platene forsegles med en MagNA Pure 96-forseglingsfolie*.
 Forseglingsfolien må fjernes før ytterligere prosessering. Ikke ta av forseglingsfolien for brått. Det kan føre til at det dannes aerosoler, som kan føre
til krysskontaminering fra brønn til brønn.
 Eluater som har vært frosset, blandes forsiktig etter tining ved å pipettere
opp og ned ti ganger før det utføres eventuelle nedstrømstrinn, f.eks. PCR/
RT-PCR eller OD-målinger. Blandevolumet skal være minst halvparten av
eluatvolumet. Hvis nukleinsyrer ikke forhåndsblandes og fordeles jevnt/
homogent i løsningen, kan det føre til at resultatene ikke blir reproduserbare i senere analyseringer.
 For langsiktig oppbevaring anbefales det å overføre eluatene til en arkivplate.
10
y Versjon 04, NO
MATERIALER
7.
MATERIALER
7.1
Materialer som medfølger
Se avsnitt 4: Reagenser og arbeidsløsninger
7.2
Nødvendige materialer og utstyr som ikke medfølger
•
•
•
•
•
•
•
•
•
MagNA Pure 96 Instrument (-instrumentet) (kat.nr. 06 541 089 001)
MagNA Pure 96 System Fluid (intern) (kat.nr. 06 430 112 001)
MagNA Pure 96 System Fluid (ekstern) (kat.nr. 06 640 729 001)
MagNA Pure 96 Filter Tips (1000 μl) (kat.nr. 06 241 620 001)
MagNA Pure 96 Processing Cartridge (kat.nr. 06 241 603 001)
MagNA Pure 96 Output Plate (kat.nr. 06 241 611 001)
MagNA Pure 96 Internal Control Tube (kat.nr. 06 374 905 001)
MagNA Pure 96 Sealing Foil (kat.nr. 06 241 638 001)
Tilleggsreagenser:
• MagNA Pure 96 External Lysis Buffer (kat.nr. 06 374 913 001)
• MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer (for isolering av nukleinsyrer fra
bakterier, sopp og virus ved bruk av Pathogen Universal-protokollen, hvis
ekstern lysering er påkrevd) (kat.nr. 06 374 921 001)
• MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer (kat.nr. 06 640 702 001)
• Proteinase K, PCR-kvalitet, aktivitet (+37 °C) b 0,6 U/␮l 
(f.eks. kat.nr. 03 115 828 001)
• Valgfritt, MagNA Lyser-instrumentet (kat.nr. 003 358 968 001 for 
SN 40467540, kat.nr. 03 358 976 001 for SN 40405218)
• Valgfritt, MagNA Lyser Green Beads (kat.nr. 03 358 941 001)
• Standard laboratorieutstyr
• Pipetter og nukleasefrie aerosolbarrierespisser, som for eksempel ekstra
lange spisser på 10 cm, for å forhåndsdispensere prøver i MagNA Pure
96-prosesseringsbrett.
• Valgfritt, sentrifuge for rør.
11
y Versjon 04, NO
ANALYSEPROSEDYRER
8.
ANALYSEPROSEDYRER
8.1
Isoleringsprotokoller
Ulike isoleringsprotokoller er tilgjengelige for MagNA Pure 96-instrumentet,
for isolering av nukleinsyrer med MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large
Volume Kit. Hver protokoll er optimalisert for spesifikke prøvematerialer.
 Kjør protokoller kun med angitt prøvemateriale. Ellers kan det få negativ
innvirkning på isoleringsprosessen. Feil bruk kan føre til dannelse av klumper og tap av magnetiske glasspartikler, krysskontaminering av prøver
eller skade på instrumentet. Kun de spesifiserte typene med prøvematerialer kan kombineres i samme kjøring.
For in vitro-diagnostiske formål kan følgende protokoller brukes med MagNA
Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit. For hver protokol kan prøvevolumet og elueringsvolumet velges fra programvaremenyen.
Protokollnavn
Prøvemateriale
Elueringsvolum
1
DNA Blood LV
500 ␮l fullblod
100 eller 200 ␮l
 Ikke bruk mer enn 1 × 107 blodceller/ml.
DNA Blood LV 1000* 1,000 ␮l fullblod
100 eller 200 ␮l
7
DNA Blood ext lys LV 1,000 ␮l lysat (fra 500 ␮l fullblod) 100 eller 200 ␮l
Viral NA Plasma LV
50 eller 100 ␮l
Viral NA Plasma LV
1000*
1,000 ␮l EDTA-plasma
50 eller 100 ␮l
Viral NA Plasma 
ext lys LV
1,000 ␮l lysat (fra 500 ␮l 
plasma eller serum)
50 eller 100 ␮l
LV
500 ␮l prøve (anbefales 
for sitratplasma og serum)
50 eller 100 ␮l
LV 1000*
1,000 ␮l prøve (anbefales 
for sitratplasma og serum)
50 eller 100 ␮l
Pathogen Universal2 500 ␮l prøve eller 500 ␮l lysat
500
12
50 eller 100 ␮l
y Versjon 04, NO
ANALYSEPROSEDYRER
Pathogen Universal2 1,000 ␮l prøve eller 1000 ␮l lysat
1000*
DNA Cells LV
50 eller 100 ␮l
Opptil 1 × 106 dyrkede celler resus- 100 eller 200 ␮l
pendert i 200 ␮l PBS
 100 μl anbefa-
les ikke for dyrkede celler
med høyt
DNA-innhold
DNA Tissue LV
Opptil 25 mg homogenisert 
vev i et volum på 200 μl
100 eller 200 ␮l
 Hvis det bruker
mer enn 5 mg
vev, anbefaler
vi at det elueres
i 200 ␮l
1 Konsentrasjonen
av nukleinsyrer i eluatet og sensitiviteten til nedstrømsapplikasjoner
kan økes ved å velge et lavt elueringsvolum. Men elueringseffektiviteten og det samlede nukleinsyreutbyttet kan bli lavere enn ved bruk av et høyere elueringsvolum.
2 Pathogen Universal-protokollene er utformet for isolering av nukleinsyrer fra bakterier,
sopp og virus fra mange ulike typer prøver av human opprinnelse. Protokollene kan
brukes direkte for 500 ␮l eller 1000 ␮l prøvemateriale eller for 500 ␮l eller
1000 ␮l lysat. Bruk et elueringsvolum på 50 μl for væskeprøver med lavt celleinnhold,
som for eksempel urin.
 For protokoller som er merket med en stjerne (*), skal prøvevolumet deles
opp i to prøver og prosesseres i to separate brønner i MagNA Pure
96-prosesseringsbrettet. Hvis det brukes en internkontroll, skal internkontrollen tilsettes i hver brønn separat. Dette betyr at den totale mengden
med internkontroll som tilsettes per prøve, er 40 ␮l i stedet for 20 ␮l. Derfor skal volumet med internkontroll som lastes inn i instrumentet, dobles. I
tillegg skal antallet "Tests" (Tester) i dialogboksen "Edit Internal Control
Barcode" dobles. For enkelte applikasjoner kan det være nødvendig å fortynne internkontrollen.
8.2
Prøvematerialer og trinn som skal utføres før isolering
For å få optimale resultater i nedstrømsprosedyrer, spesielt ved sanntids
RT-PCR-analyser, for eksempel ved bruk av LightCycler®-instrumentene, skal
ikke prøver prosesseres med høyere volum enn den valgte isoleringsprotokollen er utformet for å håndtere. Dette vil redusere ytelsen til isoleringsprosessen, og kan føre til dannelse av klumper og tap av magnetiske glasspartikler,
krysskontaminering av prøver eller skade på instrumentet.
 Alle prøver skal håndteres som potensielt infeksiøse.
13
y Versjon 04, NO
ANALYSEPROSEDYRER
I. Fullblod
Ferskt eller frosset fullblod kan brukes uten forbehandling.
 Hvis antallet blodceller er mer enn 1 × 107 blodceller/ml, skal fullblodet
fortynnes med PBS før bruk for å unngå dannelse av klumper.
 Forsikre deg om at det ikke er noen koagler i de antikoagulerte fullblodprøvene.
II. Plasma/serum
Fersk eller frosset plasma eller serum kan brukes uten forbehandling.
 Hvis det har dannet seg utfellinger, må det utføres et sentrifugeringstrinn i
10 min ved 1900 x g for 10-ml rør). Bruk kun supernatanten som prøve.
III. Lysater (for protokoller med ekstern lysering)
Fullblod, plasma eller serum blandet med MagNA Pure 96 External Lysis Buffer*.
 Sørg for at MagNA Pure 96 External Lysis Buffer* tempereres til +15 til
+25 °C før bruk.
Tilsett 500 ␮l fullblod, plasma eller serum i 500 ␮l MagNA Pure 96 External
Lysis Buffer* og bland ved pipettering.
 Bruk 1000 ␮l lysat direkte i kombinasjon med den respektive protokollen
for ekstern lysering, eller oppbevar ved ⫺15 til ⫺25 °C for DNA eller ⫺60
til ⫺80 °C for RNA inntil videre prosessering.
 Lysat som har vært frosset, skal tines på is. Før overføring til et MagNA
Pure 96-prosesseringsbrett, bland grundig ved å vortexe tre ganger i 10 s,
og sentrifuger en kort stund.
IV. Ulike prøvematerialer og lysater for Pathogen Universal 500- og
1000-protokollen.
Lysering av bakterier i mange ulike prøvetyper av human opprinnelse kan
utføres. Følgende prøvematerialer kan være egnet for Pathogen Universal 500og 1000-protokollen: urin, bronkialskyllevæske (BAL-prøve), spytt, ryggmargsvæske (CSF), penselprøver, avføring, fullblod, plasma, serum og bakteriekulturer .
 Grunnet den store variasjonen i prøvematerialer er det ingen enkeltprosedyrer som kan brukes universelt. Klargjøringstrinnene for en halvflytende
prøve (BAL, spytt, avføring osv.) for isolering av nukleinsyrer vil variere i
forhold til typen prøvemateriale, prøvens viskositet, partikkeltype og innhold.
 Eventuelle prøvematerialer som bruker denne prøveprepareringsprosedyren sammen med eventuell nedstrøms IVD-nukleinsyretesting, skal evalueres med hensyn til de individuelle IVD-parameterne.
 Prøver kan brukes uten forbehandling, avhengig av prøvens viskositet,
partikkeltype og innhold.
14
y Versjon 04, NO
ANALYSEPROSEDYRER
Lyseringsprotokoll ved bruk av MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer* (BLB)
햲
 Ikke bruk et prøveinnmatingsvolum på 1000 μl for svært viskøse og
햳
Tilsetning av BLB
• Tilsett 250 ␮l (eller 500 ␮l) BLB til 250 ␮l (eller 500 ␮l) prøve og
bland grundig.
 Hvis prøvevolumet er mindre enn 250 ␮l (eller 500 ␮l), tilsett BLB
for å få et sluttvolum på 500 ␮l (eller 1000 ␮l).
햴
Proteinase K-fordøyelse
• Tilsett 50 ␮l (eller 100 ␮l) proteinase K til 500 ␮l (eller 1000 ␮l)
prøve-/BLB-blanding, og bland grundig.
• Inkuber i 10 min. ved +65 °C.
햵
Koking (for vanskelige prøvematerialer, som spytt- eller 
avføringsprøver)
 Utfør koketrinnet for å deaktivere patogene organismer i prøven.
Dette kan også øke lysering av cellevegger for enkelte bakterie-
arter. Utfør dette trinnet i reaksjonsrør med skrukork for å hindre
lekkasje.
 Ved isolering av RNA skal koketrinnet utelates, siden det kan få
negativ innvirkning på integriteten til RNA.
• Inkuber prøvene ved +95 °C i 10 min.
• Kjøl ned prøvene på is. Sentrifuger deretter kort for å få samlet hele
prøvevolumet på bunnen av røret.
• Overfør 500 ␮l (eller 1000 ␮l) til et MagNA Pure 96-prosesseringsbrett.
cellerike prøver, som for eksempel spytt- og avføringsprøver.
Omdannelse til væske (valgfritt trinn for svært viskøse prøver, f.eks.
BAL- eller spyttprøver)
• Klargjør en fersk DTT-stamløsning (ditiotreitol) (f.eks. 5× kons. =
0,75 %).
• Juster den endelige DTT-konsentrasjonen i prøven til 0,15 % ved å
tilsette DTT-stamløsning.
• Inkuber prøven under risting ved 850 rpm. i 30 min. ved +37 °C til
den enkelt kan pipetteres.
15
y Versjon 04, NO
ANALYSEPROSEDYRER
Forbehandling av avføringsprøver
햲
Bruk en mengde på størrelse med en ert av avføringsprøven og bland
den i 550 ␮l med PBS.
 Sentrifuger i 5 s. ved 500 × g, for å unngå at reaksjonsspissene tilstoppes med faste partikler.
 For isolering av viralt RNA kan det brukes en PBS/STAR-bufferblanding (1:1-blanding) som alternativ til suspendering av avføringsprøver, for å redusere mulig inhibisjon.
햳
Overfør 250 ␮l supernatant til et nytt 1,5 ml-mikrosentrifugerør, tilsett
250 ␮l BLB og 50 ␮l proteinase K.
햴
Inkuber i 10 min. ved +65 °C under risting ved 850 rpm i en termo-
mikser, og inkuber deretter i 10 min. ved +95 °C.
 Utelat inkubering ved +95 °C for isolering av RNA.
햵
Overfør 500 ␮l av lysatet til et MagNA Pure 96-prosesseringsbrett.
Forbehandling av penselprøver
햲
Suspender en tørr penselprøve i 500 ␮l (eller 1000 ␮l) BLB. Tilsett 50 μl
(eller 100 ␮l) proteinase K. 
For penselprøver i transportmedium, bruk 250 ␮l (eller 500 ␮l) transportmedium, tilsett 250 ␮l (eller 500 ␮l) BLB og 50 ␮l (eller 100 ␮l) proteinase K.
햳
Klem og ta ut penselprøven.
햴
Inkuber væskeprøven i 10 min. ved +65 °C, og inkuber deretter i 10
min. ved +95 °C.
 Utelat inkubering ved +95 °C for isolering av RNA.
햵
Overfør 500 ␮l (eller 1000 ␮l) væskeprøve til et MagNA Pure 96-prosesseringsbrett.
V. Dyrkede celler
Dyrkede celler resuspendert i 200 ␮l fosfatbufret saltvannsløsning (PBS) kan
brukes.
For DNA-isolering fra dyrkede celler i suspensjon, sentrifuger forsiktig de dyrkede cellene i 5 min. ved 300 × g. Vask om nødvendig cellepelleten ved hjelp
av PBS.
 Cellepelleten kan oppbevares ved ⫺15 til ⫺25 °C. 
Fjern dyrkningsmediet (eller PBS), og resuspender cellene i kald PBS ved å
pipettere eller riste røret til cellepelleten er resuspendert. 
16
y Versjon 04, NO
ANALYSEPROSEDYRER
Ettlags dyrkede celler skal samles ved standard trypsinisering ved å bruke
prosedyren som er beskrevet ovenfor. Nødvendig prøvevolum er 200 ␮l.
 Ikke bruk flere enn 1 × 106 celler/200 ␮l, ellers kan det få negativ innvirkning på isoleringsprosessen.
VI. Ferskfrosset vev
Opptil 25 mg ferskfrosset vevsprøve kan brukes etter homogenisering.
Vevshomogenisering med proteinase K-fordøyelse
햲
Tilsett opptil 25 mg vevsprøve i et reaksjonsrør, som for eksempel et
1,5 ml-sentrifugerør.
햳
Tilsett 180 ␮l MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer* og 20 ␮l proteinase K til vevsprøven, og bland.
햴
Inkuber ved +55 °C til alt vevet er oppløst (det tar vanligvis fra tre
timer til over natten).
 Denne homogeniseringsmetoden gir høyere DNA-utbytte og integritet.
Vevshomogenisering ved bruk av MagNA Lyser-instrumentet
8.3
햲
Overfør opptil 25 mg vevsprøve i et MagNA Lyser Green Beads-rør.
햳
Tilsett 200 ␮l MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer.
햴
Homogeniser vevet i MagNA Lyser-instrumentet i 30 til 40 sekunder.
Gjenta dette trinnet hvis homogeniseringen ikke er ferdig.
 Denne metoden er rask, men grunnet mekanisk oppdeling kan
DNA-et være delvis fragmentert.
Kvalitetskontroll
 Kjør alltid relevante kontroller.
For å kontrollere hele prosessen, fra prøvepreparering til analysering, skal følgende kontroller utføres:
• Positiv kontroll ved bruk av et prøvemateriale som er positivt for målet.
• Negativ kontroll, ved bruk av PBS i stedet for prøven.
• Ekstraksjonskontroll ved bruk av et prøvemateriale som er negativt for målet.
• Internkontroll (IC) ved å tilsette en definert mengde kontrolltemplat til alle
prøver som skal isoleres.
 For applikasjoner som kan gi falske negative resultater, som deteksjon av
patogener, er det obligatorisk å bruke en egnet internkontroll (IC). Internkontrollen tilsettes under nukleinsyreisolering, helst ved bruk av MagNA
Pure 96-systemets automatiske internkontrollfunksjon. Internkontrollen
17
y Versjon 04, NO
ANALYSEPROSEDYRER
kan også tilsettes prøven manuelt. I så fall må internkontrollen være stabil
i prøvematerialet, og en nukleasesensitiv internkontroll, som ubeskyttet
RNA, skal ikke brukes for dette formålet.
Internkontroll
MagNA Pure 96-systemet kan tilsette en internkontroll (IC) automatisk i hver
prøve fra MagNA Pure 96-internkontrollrøret. Internkontrollvolumet er fastsatt
til 20 ␮l per isolering. For å bruke denne funksjonen, velg en internkontroll fra
Internal Control-listen når du oppretter en bestilling. Tilsett det indikerte volumet med internkontroll i internkontrollrøret, og plasser røret på plattformen.
 Grunnet mekaniske begrensninger er det påkrevde volumet med internkontroll høyere enn ved multiplikasjon av antallet prøver med 20 ␮l:
Antall 
prøver
8
Mengde
internkontroll (␮l)
650 800 1000 1350
16
24
32
40
48
56
64
1500 1650 2300 2450
72
80
88
96
2600 2800 2950 3100
 For enkelte 1000 ␮l-protokoller skal prøvevolumet deles opp i to prøver og
prosesseres i to separate brønner i MagNA Pure 96-prosesseringsbrettet.
Hvis det brukes en internkontroll, skal internkontrollen tilsettes i hver
brønn separat. Dette betyr at den totale mengden med internkontroll som
tilsettes per prøve, er 40 ␮l i stedet for 20 ␮l. Derfor skal du doble volumet
med internkontroll som lastes inn i instrumentet, og doble antallet "Tests"
(tester) i dialogboksen "Edit Internal Control Barcode".
8.4
Prosedyre for isolering
 Det er brukerens ansvar å validere systemets ytelse for alle prosedyrer
som brukes i laboratoriet.
MagNA Pure 96-instrumentet er konstruert for å prosessere 96 prøver samtidig . Hvis det brukes et antall prøver som ikke er et multiplum av 8, vil instrumentet fylle opp de tomme posisjonene inntil neste multiplum av 8 er nådd.
For en detaljert beskrivelse av hvordan man setter opp instrumentet og utfører
en kjøring henvises det til MagNA Pure 96 veiledning til brukeropplæring
(programvareversjon 2.0).
 Pipetter prøvene ned i bunnen av brønnene i prosesseringsbrettet. Sørg
for at det ikke kommer dråper av prøvemateriale på brønnveggene. Bruk
prøveoverføringsfunksjonen for å pipettere prøvene i brønnene til et annet
prosesseringsbrett automatisk. Dette vil sikre overføring uten risiko for at
brønnveggene kontamineres med prøvemateriale. For mer informasjon
henvises det til MagNA Pure 96-brukermanualen (programvareversjon
2.0).
 Sørg for at instruksjonene vedrørende type og mengde prøvemateriale følges (se avsnittet 8.2 Prøvematerialer og trinn som skal utføres før isolering). Bruk av feil typer og mengder prøvemateriale kan føre til dannelse av
18
y Versjon 04, NO
ANALYSEPROSEDYRER
klumper, som kan medføre lavt utbytte og dårlig nukleinsyrerenhet, i tillegg til krysskontaminering og inhibisjon av nedstrømsanalyser, som PCR
og RT-PCR. Vandige prøvematerialer, som nukleinsyrer oppløst i vann eller
væsker uten biologisk buffer, kan føre til dårlige isoleringsresultater. I så
fall anbefaler vi å tilsette 10× PBS til en sluttkonsentrasjon på 1× PBS,
eller en bærernukleinsyre, som Poly A RNA.
 Hvis reagenser har vært oppbevart ved temperaturer under +15 til +25 °C,
skal kitkomponentene tempereres ved +15 til +25 °C i minst én time før
bruk.
 Sørg for at alle beholdere settes inn riktig i reagensbrettene før de plasseres på plattformen.
 Det er mulig å bruke to reagenssett av samme lot i én kjøring. I så fall
anbefaler vi å bruke to sett med eksterne kontroller, ett for hvert reagenssett.
8.5
Avslutte en kjøring
Når en kjøring er ferdig, inspiser instrumentet nøye for å se etter tegn på søl.
Hvis det er søl, rengjør og dekontaminer instrumentet som beskrevet i MagNA
Pure 96-systemets brukermanual.
 Rengjør og dekontaminer avfallsdekselet etter hver kjøring, som beskrevet
i MagNA Pure 96-systemets veiledning til brukeropplæring. Ikke bruk
natriumhypoklorittløsning (klorløsning) eller syrer under det første rengjøringstrinnet, da dette kan produsere svært giftige gasser i kombinasjon
med reagenser som inneholder guanidintiocyanat.
 Rester av magnetiske glasspartikler i utmatingsplaten får ingen innvirkning på PCR- og RT-PCR-analyser på LightCycler®-instrumentene eller
konvensjonelle termoblokkcyclere.
19
y Versjon 04, NO
BEGRENSNINGER OG INTERFERENS
9.
BEGRENSNINGER OG INTERFERENS
1. Pålitelige resultater er avhengig av adekvat prøvetaking, transport, oppbevaring og håndtering.
2. Dette produktet må kun brukes av personell som er opplært i nukleinsyre-
isolering og PCR-teknikker.
3. Falske negative resultater kan forekomme hvis en prøve blir tatt, transportert, oppbevart eller håndtert på feil måte. Falske negative resultater kan
også forekomme hvis prøven inneholder et utilstrekkelig antall organismer.
4. Eventuelle IVD-applikasjoner som bruker prosedyren for prøvepreparering
sammen med eventuell nedstrøms IVD-nukleinsyretesting, skal evalueres
med hensyn til de individuelle IVD-parameterne.
5. For å minimere risikoen for negativ innvirkning på resultatene, skal det brukes adekvate kontroller for nedstrømsapplikasjoner.
6. Oppbevaringsforholdene (temperatur, tid) for lysater, pellets av dyrkede celler og eluater skal evalueres med hensyn til de individuelle IVD-parameterne .
7. MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit og de tilhørende reagensene brukes i kombinasjon med MagNA Pure 96-systemet for isolering
av totale nukleinsyrer (DNA/RNA) fra biologiske prøver for in vitro-diagnostiske formål. Brukeren skal forsikre seg om at ytelsesegenskapene er tilstrekkelige, spesielt i forbindelse med eventuelle nedstrømsapplikasjoner.
Resultater skal tolkes i sammenheng med alle relevante kliniske funn og
laboratoriefunn. Siden det kan være stor variasjon i analyttkonsentrasjonen
fra prøvetype til prøvetype, anbefaler vi at man utfører testing av krysskontamineringen, for eksempel ved bruk av såkalte "sjakkbretteksperimenter"
(høypositive prøver ved siden av negative prøver) før vanlig testing startes.
20
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
10. YTELSESDATA
 MagNA Pure 96-kit og reagenser brukes i kombinasjon med MagNA Pure
96-systemet for isolering av totale nukleinsyrer (DNA/RNA) fra biologiske
prøver for in vitro-diagnostiske formål. 
Representative ytelsesdata vises under. Dataene viser eksempler på ytelsen for de vanligste prøvematerialene for å demonstrere systemets avanserte ytelse. Siden resultatene kan avvike avhengig av prøve og parameter,
skal brukeren forsikre seg om at ytelsesegenskapene er tilstrekkelige. For
diagnostiske formål skal resultatene alltid vurderes i sammenheng med
relevant applikasjon og andre funn. 
Ved prøvepreparering med MagNA Pure 96-instrumentet ble både
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit og MagNA
Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit brukt for å finne ytelsesdataene som vises nedenfor.
10.1
Isoleringens presisjon
For å fastslå isoleringens presisjon, ble genomisk DNA isolert fra fullblod.
Utbyttet av og renheten til isolerte nukleinsyrer ble fastslått med OD-måling.
Eksperimentoppsettet og resultatene beskrives under.
Kittype
Isoleringsprotokoll
DNA Blood SV
Prøvetype
Fullblod (7,6 × 106 hvite blodceller/ml)
Prøveinnmatingsvolum
200 ␮l
Elueringsvolum
100 ␮l
Replikater per kjøring
24
Tabell 2: Eksperimentoppsett for analysering av utbytte og renhet
Utbytte (␮g)
CV (%)
OD 260/280
CV (%)
Kjøring 1
5,6
3,9
1,9
2,5
Kjøring 2
5,6
5,5
1,9
4,4
Kjøring 3
5,5
6,5
1,9
1,8
Tabell 3: Resultater (gjennomsnittsverdier) for DNA-utbytte og renhet, for genomisk
DNA isolert fra fullblod
 Utbyttet avhenger i stor grad av antallet blodceller, og kan derfor variere
fra donor til donor.
21
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
10.2
Analytisk ytelse
Sanntids qPCR/RT-PCR ble utført i LightCycler® 480-instrumentet ved bruk av
5 ␮l eluat i et totalt PCR-volum på 20 ␮l. Kvantifiseringsstandarder og kontrollprøver ble tilsatt like før oppstart av PCR.
Parameter
Parvo B19-virus
Hepatitt A-virus (HAV)
Prøvetype
EDTA-plasma tilsatt
Parvo B19-virus
EDTA-plasma tilsatt hepatitt Fullblod blandet fra ulike
A-virus
donorer
(7,6 × 106 hvite blodceller/
ml)
Mål
Internt Parvo B19-virus- Internt hepatitt A-virusstam- Humant genomisk DNA
stammemateriale
memateriale
Kit som ble
brukt 
for PCR
-analyse
(kun tilgjengelig 
(kun tilgjengelig internt)
internt)
LightCycler® CycA intern
analyse:
DNA MasterPLUS HybProbe og cyclophilin
A-spesifikke primere og
prober
Eluatvolum
per PCR
5 ␮l
5 ␮l
5 ␮l
PCR-volum
20 ␮l
20 ␮l
20 ␮l
PCR
-instrument
LightCycler®
LightCycler®
-instrumentet
480
-instrumentet
480
-instrumentet
Tabell 4: Sammendrag av analysene som produserte ytelsesdataene som vises under.
Lineært område
og
deteksjonsgrense
(LoD)
Det lineære området og deteksjonsgrensen (LoD), som kan påvises ved å
bruke MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid-kit for automatisk nukleinsyreisolering sammen med MagNA Pure 96-instrumentet, ble evaluert ved
bruk av virusstammemateriale fra Parvo B19-virus og hepatitt A-virus (begge
kun tilgjengelig internt).
Eksperimentoppsettet for å fastslå det lineære området og deteksjonsgrensen
for de valgte parameterne og resultatene beskrives under.
Parameter
Parvo B 19-virus
Kittype
NA LV Kit
LV Kit
Isoleringsprotokoll
Prøvetype
EDTA-plasma
EDTA-plasma
22
Hepatitt A-virus
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
Prøveinnmatingsvolum
500 ␮l
500 ␮l
Elueringsvolum
50 ␮l
50 ␮l
Fortynningsserie
8 ulike virustitre 
8 ulike virustitre 
Tilgjengelige datapunkter 172
til sammen
176
Tabell 5: Eksperimentoppsett for å fastslå det lineære området og deteksjonsgrensen (LoD).
Parameter
Parvo B 19-virus
Hepatitt A-virus
Lineært område
2×102
Deteksjonsgrense*
(LoD_95)
68 kopier/ml
konfidensintervall: 
til
5×106
kopier/ml
119 kopier/ml
Tabell 6: Resultater som ble funnet for lineært område og deteksjonsgrense (LoD).
* Alle data ble vurdert statistisk med Probit-analyse. Deteksjonsgrensen (LoD) ble beregnet for 
95 % konfidensintervall (LoD_95).
 Sensitiviteten og deteksjonsgrensen er svært avhengige av PCR-analysen
Lineært område Parvo B19-virus
Figur 1: Lineært område ved bruk av Viral NA Universal LV-protokollen for å
isolere Parvo B19-virus fra EDTA-plasma. Det lineære området for denne applikasjonen er 2×102 til 5×106 kopier/ml. SVT/ml spiket virustiter/ml, MVT/ml: målt virus-
titer/ml.
23
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
Lineært område hepatitt A-virus
(HAV)
Figur 2: Lineært område ved bruk av Viral NA Universal LV-protokollen for å
isolere HAV fra EDTA-plasma. Det lineære området for denne applikasjonen er
3×103 til 1×109 kopier/ml. SVT/ml spiket virustiter/ml, MVT/ml: målt virustiter/ml.
Deteksjonsgrense
for Parvo
B19-viruset
Figur 3: Deteksjonsgrense for Parvo B19-viruset ble bestemt ved bruk av Viral
NA Universal LV-protokollen for å isolere en virusfortynningsserie fra
EDTA-plasma. LoD_95 er 68 kopier/ml. Det relaterte konfidensintervallet er 48 til 156
kopier/ml.
_____ Probit-regresjon, - - - - nedre 95 %-grense, . . . . . . øvre 95 %-grense, o LoD_95.
24
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
Deteksjonsgrense
for hepatitt
A-viruset (HAV)
Figur 4: Deteksjonsgrense for HAV ble bestemt ved bruk av Viral NA Universal
LV-protokollen for å isolere en virusfortynningsserie fra EDTA-plasma. 
LoD_95 er 119 kopier/ml. Det relaterte konfidensintervallet er 75 til 279 kopier/ml. _____
Probit-regresjon, - - - - nedre 95 %-grense, . . . . . . øvre 95 %-grense, o LoD_95.
10.3
Presisjonsanalyse
Standardavvik (SD) og variasjonskoeffisienter (CV) ble fastslått for fortynningsserier innenfor det lineære området ved bruk av følgende parametere:
Parvo B19-virus, hepatitt A-virus og cyclophilin A.
For å finne presisjonen innenfor analysene, ble alle data produsert i en enkelt
kjøring. For å finne presisjonen mellom analysene, ble det utført tre ulike kjøringer av ulike brukere, på ulike instrumenter og i ulike laboratorier. Presisjonen fra lot til lot ble bestemt ved bruk av seks ulike lot.
Eksperimentoppsettet ved utførelse av presisjonsanalyse og de tilsvarende
resultatene beskrives under.
Parameter
Parvo B19-virus
Kittype
Viral NA SV Kit
and Viral NA SV Kit
Hepatitt A-virus (HAV)
MagNA Pure 96 DNA
and Viral NA SV Kit
Isolerings-
protokoll(er)
DNA Blood SV
Prøvetype
EDTA-plasma
EDTA-plasma
Fullblod (7,6 × 106 hvite
blodceller/ml)
Prøveinn-
matingsvolum
200 ␮l
200 ␮l
200 ␮l
25
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
Elueringsvolum 50 ␮l
50 ␮l
100 ␮l
Fortynningsserie 1×103 til 1×106 
kopier/ml
Ikke aktuelt
Replikater
8
8
24
Datapunkter
LightCycler®
LightCycler®
480-instrumentet
480
-instrumentet
-instrumentet
32
32
24
Presisjon 
96
mellom kjøringer
96
72
Lot til lot-
presisjon
160
144
Presisjon 
innenfor kjøring
160
Tabell 7: Eksperimentoppsett ved utførelse av presisjonsanalyse.
Parvo B19-virus
Presisjon innenfor kjøring
Konsentrasjon (kopier/ml)
Gjennomsnitt
(Cp)
SD (Cp)
CV (%)
1 × 106
18,0
0,14
0,78
5
1 × 10
21,5
0,21
1,00
1 × 104
24,9
0,31
1,23
3
28,5
0,39
1,37
1 × 10
Parvo B19-virus
Presisjon mellom kjøringer
6
1 × 10
18,2
0,34
1,89
1 × 105
21,6
0,32
1,49
4
25,2
0,44
1,73
3
28,7
0,38
1,34
1 × 10
1 × 10
Parvo B19-virus
Lot til lot-presisjon*
1 × 106
18,2
0,16
0,90
5
21,7
0,21
0,97
4
25,1
0,39
1,55
3
28,6
0,38
1,32
1 × 10
1 × 10
1 × 10
Tabell 8: Resultater for presisjon innenfor analyse, mellom analyser og fra lot til lot ble
fastslått ved bruk av Parvo B19-virusmateriale tilsatt i EDTA-plasma.
* gjennomsnitt over 6 ulike lot
26
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
Hepatitt A-virus
Konsentrasjon (kopier/ml)
Gjennomsnitt (Cp)
SD (Cp)
CV (%)
1 × 106
19,4
0,18
0,94
1 × 105
23,0
0,28
1,23
4
26,2
0,12
0,45
3
29,7
0,12
0,41
1 × 10
1 × 10
Hepatitt A-virus
1 × 106
19,4
0,26
1,33
5
22,9
0,21
0,92
4
26,2
0,12
0,45
3
29,6
0,32
1,07
1 × 10
1 × 10
1 × 10
Hepatitt A-virus
1 × 106
19,7
0,22
1,10
5
23,1
0,15
0,67
4
1 × 10
26,6
0,39
1,46
1 × 103
30,0
0,26
0,87
1 × 10
Tabell 9: Resultater for presisjon innenfor analyse, mellom analyser og fra lot til lot ble
fastslått ved bruk av HAV tilsatt i EDTA-plasma.
CycA-analyse
Referanseprøve
Gjennomsnitt
(Cp)
SD (Cp)
CV (%)
18,1
0,20
1,12
CycA-analyse
Referanseprøve
18,0
CycA-analyse
Referanseprøve
0,21
1,15
17,9
0,16
0,87
Tabell 10: Resultater for presisjon innenfor analyse, mellom analyser og fra lot til lot for
CycA-analysen som ble utført med DNA isolert fra fullblod.
27
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
10.4
Interfererende substanser
Innvirkningen av interfererende substanser ble vurdert ved bruk av prøvemateriale tilsatt Parvo B19-virus, og med en økende konsentrasjonsserie for
følgende forekommende substanser: Hemoglobin (humant hemoglobin,
Sigma- Aldrich Co. LLC), bilirubin (Sigma-Aldrich Co. LLC) og lipider (Intralipid 20 %-emulsjon, Sigma-Aldrich Co. LLC).
Eksperimentoppsettet for å evaluere innvirkningen av interfererende substanser og tilsvarende resultater beskrives under.
Parameter
Parvo B19-virus
Kittype
Isoleringsprotokoll
Prøvetype
Fullblod
Prøveinnmatingsvolum 200 ␮l
Elueringsvolum
50 ␮l
Viruskonsentrasjon
1 × 105 kopier/ml
Interfererende substan- Hemoglobin, bilirubin og lipider som ble brukt i 
ser
ulike konsentrasjoner
Replikater per inhibitor- 3
konsentrasjon
Tabell 11: Eksperimentoppsettet for å evaluere innvirkningen av de interfererende substansene hemoglobin, bilirubin og lipider.
Resultater
28
Hemoglo- Cp
bin (mg/dl)
Bilirubin (mg/dl)
Cp
Lipider (mg/
dl)
Cp
0
21,0
0
20,8
0
21,6
100
21,3
6,6
21,0
200
21,6
200
21,2
13,2
21,2
400
21,5
300
21,2
19,8
20,9
600
21,9
400
21,1
26,4
21,0
800
21,9
500
21,1
33,0
21,3
1000
21,8
600
21,0
39,5
21,4
1200
21,5
700
21,1
46,1
21,3
1400
21,6
800
21,3
52,8
21,0
1600
21,3
900
21,5
59,4
21,0
1800
21,2
1000
n.d.*
66,0
21,5
2000
21,1
Gjennomsnitt
21,1
Gjennomsnitt
20,8
Gjennomsnitt
21,6
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
Tabell 12: Resultater fra krysningspunkt (Cp-resultater) for prøver tilsatt interfererende
substanser.
* ikke fastslått grunnet pipetteringsfeil.
Ingen av de interfererende substansene viste noen innvirkning på krysningspunktene. Det oppnådde krysningspunktområdet er a 0,8.
10.5
Testing for krysskontaminering
Risikoen for krysskontaminering ble evaluert ved bruk av Parvo B 19-testen.
Under de første to kjøringene ble kun negative prøver prosessert for å teste
MagNA Pure 96-systemet for mulig kontaminering. I tre kjøringer ble et sjakkbrettmønster med vekselvis positive og negative prøver prosessert. I den siste
kjøringen ble kun negative prøver prosessert. En prøve ble identifisert som
negativ hvis det ikke ble registrert noen deteksjonssignaler etter 45
PCR-sykluser.
Eksperimentoppsettet for å teste MagNA Pure 96-systemet for mulig kontaminering og tilsvarende resultater beskrives under.
Parameter
Parvo B19-virus
Kittype
Isoleringsprotokoll
Prøveinnmatings-
volum
500 ␮l
Elueringsvolum
50 ␮l
Positive prøver
5 × 107 kopier/ml i EDTA-plasma
Negative prøver
negativt i EDTA-plasma
Antall kjøringer
A) 2 kjøringer med kun negative prøver
B) 3 kjøringer med sjakkbrettmønster
C) 1 kjøring med kun negative prøver
PCR-analyse
LightCycler® Parvo B19 Quantification Kit ved
bruk av en 384-brønns plate på LightCycler®
480-instrumentet
Tabell 13: Eksperimentoppsett for å evaluere risikoen for krysskontaminering.
Kjøring Gjennomsnitt Cp Standardavvik
for 
positive prøver
Positivitetsrate Negativitetsrate
1
n/a
n/a
0/96
96/96
2
n/a
n/a
0/96
96/96
3
17,8
0,20
48/96
48/96
29
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
4
20,0
0,22
48/96
48/96
5
18,6
0,12
48/96
48/96
6
n/a
n/a
0/96
96/96
Tabell 14: Resultater av krysskontamineringseksperimenter basert på gjennomsnittlige
krysningspunkter og treffrater.
Som vist i tabell 14 ble det ikke detektert noen krysskontaminering under de
ovennevnte forholdene.
10.6
Metodesammenligning
Deteksjon av
JAK2-mutasjon
Metodesammenligningen ble gjennomført ved å bruke MagNA Pure 96-systemet for å teste fullblodprøver for allelet JAK2-V617F. Denne metoden sammenligner mutasjonsraten med villtypen. DNA ble isolert ved å bruke MagNA
Pure 96-systemet og den etablerte manuelle QIAamp DNA Blood Mini
Kit-metoden. PCR-analysen ble utført ved hjelp av JAK2 MutaQuant®Kit, i
samsvar med produsentens instruksjoner.
Parameter
Jak2 V617F
Kittype
Isoleringsprotokoll
DNA Blood SV
Prøvetype
Fullblod
Prøveinnmatingsvolum 200 ␮l
Elueringsvolum
50 ␮l
Antall testede prøver*
50
PCR-analyse
Marseille på Rotor-Gene 3000-instrumentet
Sammenlignings-
metode
Prøvepreparering
(elueringsvolum 85 μl)
Tabell 15: Eksperimentoppsett for å teste fullblodprøver for allelet JAK2-V617F.
* Femti blindede kliniske prøver (reserveprøver) ble innhentet fra rutinemessige diagnostiske prosedyrer, og ble målt parallelt.
30
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
Sammenligning
Negative
Positive
JAK2_V617F
Totalt
Negative
33
0
33
Positive
JAK2_V617F
0
17
17
Totalt
33
17
50
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 50 prøver
Tabell 16: Til sammen 50 prøver ble inkludert i denne analysen. Samsvaret for identifisering av positive og negative prøver var 100 % mellom den automatiske MagNA Pure
96-metoden og den manuelle QIAamp DNA Blood Mini Kit-metoden.
Figur 5: Metodesammenligningen var basert på den endelige mutasjonsraten til WT
(villtype) mellom isolering ved bruk av MagNA Pure 96 DNA and Viral NA SV Kit sammenlignet med QIAamp DNA Blood Mini Kit.
……….. Identitetslinje, - - - - - Bablok-regresjon (1,02x); Pearson r= 0,989
31
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
Pneumocystis
jiroveci DNA
Metodesammenligningsdataene som ble oppnådd ved bruk av MagNA Pure
96-systemet, ble vurdert ved å teste bronkialskyllevæske-prøver (BAL-prøver)
for Pneumocystis jiroveci-DNA.
Følgende eksperimentoppset ble brukt:
Parameter
Kittype
Isoleringsprotokoll
Prøvetype
Bronkialskyllevæske (BAL)
Prøveinnmatings-
volum
500 ␮l
Elueringsvolum
100 ␮l
Antall testede 
prøver*
96
PCR-analyse**
Intern sanntids qPCR-analyse kombinert med
LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe
LoD: <50 kopier/ reaksjon
Lineært område: 103 - 108 kopier/ml
Prøver > 104 kopier/ml er vurdert som positive
Sammenlignings-
metode
Prøvepreparering
Prøvevolum: 500 ␮l
Elueringsvolum: 200 ␮l
Tabell 17: Eksperimentoppsett ved testing av bronkialskyllevæske-prøver (BAL-prøver)
for Pneumocystis jiroveci-DNA.
* Nittiseks blindede kliniske prøver (reserveprøver) ble innhentet fra rutinemessige diagnostiske prosedyrer, og ble målt parallelt.
**PCR-analysen ble utviklet og validert av Institute of Medical Microbiology and 
Sammenligning
Negative
Positive
P.jiroveci DNA
Totalt
Negative
70
1
71
Positive
P.jiroveci-DNA
0
25
25
Totalt
70
26
96
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 96 prøver
32
y Versjon 04, NO
YTELSESDATA
Tabell 18:Til sammen ble 26 av 96 prøver vurdert som positive. Det positive samsvaret
for de positive var 25 av 26 (96 %). Det positive samsvaret for de negative var 70 av 70
(100 %).
Figur 6: Metodesammenligning for de positive prøvene basert på krysningspunkt 
målt i 2 etterfølgende kjøringer ved utførelse av den interne, sanntids Pneumocystis 
jiroveci-qPCR-analysen.
…….. Identitetslinje, - - - - - Bablok-regresjon (1,01x+0,91); Pearson r= 0,9312 
(Kjøring 1: ×) _______ Bablok-regresjon (1,01x +1,07); Pearson r= 0,9304 (Kjøring 2: o)
33
y Versjon 04, NO
TILLEGGSINFORMASJON
11. TILLEGGSINFORMASJON
11.1
Symboler
Følgende symboler brukes i dette dokumentet for å fremheve viktig informasjon
Symbol
Beskrivelse

Viktig merknad

Informasjonsmerknad
C
For bruk til in vitro-diagnostikk.
I
Katalognummer
B
Lotnummer
s
Utløpsdato
r
Temperaturbegrensning (Oppbevares ved)
n
Distributør
t
Produsent
)
Oppbevares beskyttet mot sollys. (Ytter-
emballasjen på forbruksartikler)
2
11.2
Kun til engangsbruk. (Ytteremballasjen på
forbruksartikler)
v
Kitet oppfyller kravene i IVD-direktiv 98/79/
EF.
*
tilgjengelig fra Roche Applied Science
Endringer i tidligere versjon
Redaksjonelle endringer.
12. VAREMERKER
LIGHTCYCLER og MAGNA PURE er varemerker for Roche.
Alle andre produktnavn eller varemerker er deres respektive eieres eiendom.
13. LISENSTILKNYTTET ANSVARSBEGRENSNING
Dette produktet er lisensiert under patenter som tilhører Qiagen.
34
y Versjon 04, NO
JURIDISK ANSVARSBEGRENSNING
14. JURIDISK ANSVARSBEGRENSNING
For bruk til in vitro-diagnostikk.
35
y Versjon 04, NO
v
Germany, +49 621 7590
Produsert i Tyskland
_________________________________________________________________
0512.06671934001➃
t
n Distribueres i USA av Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA
68298 Mannheim
Tyskland
C
y Version 04
Innehållet uppdaterat: maj 2012
Förfyllda reagens för instrumentet MagNA Pure 96. Det här kitet används för isolering av genomiskt DNA och virala nukleinsyror (NA) från upp till 1 000 ␮l helblod, plasma eller serum, eller från upp till 25 mg färskfrusen vävnad eller från
upp till 1 × 106 odlade celler, samt för isolering av bakteriella, fungiala och virala
nukleinsyror från upp till 1 000 ␮l provmaterial med humant ursprung.
I 06 374 891 001
r Förvara i ⫹15 till ⫹25 °C
 Skydda kitet mot ljus.
 Håll kitet borta från magneter.
Kit för 3 ⫻ 96 reaktioner
Table of Contents
1.
2.
3.
4.
AVSEDD ANVÄNDNING ................................................................................................. 3
BESKRIVNING AV KITET ................................................................................................ 3
PRINCIP/SAMMANFATTNING ..................................................................................... 3
REAGENS – ARBETSLÖSNINGAR ................................................................................ 4
4.1
4.2
Antal tester
Kit/innehåll
4
4
5.
VARNINGAR OCH SÄKERHETSÅTGÄRDER ............................................................... 6
5.1
5.2
5.3
5.4
Säkerhetsåtgärder
Krav på hantering
Avfallshantering
6
7
8
8
6.
FÖRVARING OCH HÅLLBARHET .................................................................................. 9
6.1
6.2
6.3
Kit och reagens
Provtagning och förvaring av provmaterial
Förvaring av renade nukleinsyror och eluat
7.
MATERIAL ...................................................................................................................... 11
7.1
7.2
Material som medföljer
Material och utrustning som behövs men inte medföljer
8.
ANALYSPROCEDURER ................................................................................................ 12
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
Extraktionsprotokoll
Provmaterial och förisoleringssteg
Kvalitetskontroll
Isoleringsprocedur
Avsluta en körning
9.
10.
BEGRÄNSNINGAR OCH INTERFERENSER ............................................................... 20
EGENSKAPER ................................................................................................................. 21
10.1
10.2
10.3
10.4
10.5
10.6
Precision för extraktionseffektivitet
Analytiska egenskaper
Precisionsanalys
Interfererande substanser
Testning för korskontaminering
Metodjämförelse
9
9
10
11
11
12
13
18
18
19
21
22
26
28
30
31
11.
TILLÄGGSINFORMATION ............................................................................................ 35
11.1
11.2
Symboler
Ändringar från tidigare version
12.
13.
14.
VARUMÄRKEN .............................................................................................................. 35
LICENS ............................................................................................................................ 35
BESTÄMMELSE OM ANVÄNDNING .......................................................................... 36
2
35
35
y Version 04, SV
AVSEDD ANVÄNDNING
1.
AVSEDD ANVÄNDNING
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit är ett reagenskit som
används tillsammans med systemet MagNA Pure 96 för isolering och extraktion av den totala nukleinsyrapoolen (DNA/RNA) från biologiska prover i in
vitro-diagnostiskt syfte.
Alla IVD-tillämpningar som använder provpreparationsproceduren tillsammans med nedströms-IVD-nukleinsyratestning ska utvärderas med hänsyn till
de individuella IVD-parametrarna.
2.
BESKRIVNING AV KITET
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit är specifikt utformat för
att isolera:
• Nukleinsyra från upp till 1 000 ␮l helblod, plasma eller serum.
• Bakteriell, fungial och viral nukleinsyra från upp till 1 000 ␮l provmaterial eller
lysat av humant ursprung.
• Nukleinsyra från upp till 1 × 106 odlade celler.
• Nukleinsyra från upp till 25 mg färskfrusen vävnad.
De isolerade nukleinsyrorna uppfyller de kvalitetsstandarder som krävs för
mycket känslig kvantitativ PCR/RT-PCR-analys.
3.
PRINCIP/SAMMANFATTNING
Nukleinsyraisoleringen baseras på MGP-teknologi (MagNA Pure Magnetic
Glass Particle). 
De grundläggande stegen i en MagNA Pure 96 NA-isoleringsprocedur är:
1. Provmaterial lyseras, nukleinsyror frigörs och nukleaser denatureras.
2. Nukleinsyror binder till kiselytan på de tillsatta magnetiska glaspartiklarna
tack vare de kaotropiska salterna och den höga jonstyrkan hos lyserings-/
bindningsbufferten.
3. Magnetiska glaspartiklar med bundna nukleinsyror separeras från det resterande lyserade provet med hjälp av magneter.
4. Obundna ämnen, t.ex. proteiner, cellpartiklar och PCR-hämmare tas bort i
flera tvättsteg.
5. Renade nukleinsyror elueras från de magnetiska glaspartiklarna.
3
y Version 04, SV
REAGENS – ARBETSLÖSNINGAR
4.
4.1
Antal tester
Kitet är utformat för att utföra
• 3 × 96 isoleringar av genomiskt DNA och virala NA från upp till 500 ␮l helblod, plasma, serum eller från upp till 1 × 106 odlade celler eller
• 3 × 96 isoleringar av bakteriell, fungial och viral NA från 500 ␮l provmaterial
av humant ursprung eller
• 3 × 96 isoleringar från upp till 25 mg färskfrusen vävnad eller
• 3 × 48 isoleringar från 1 000 ␮l helblod, plasma eller serum eller
• 3 × 48 isoleringar av bakteriell, fungial och viral NA från 1 000 ␮l provmaterial av humant ursprung.
4.2
Kit/innehåll
Komponent Beteckning
Innehåll/funktion
Kassett 1
Reagent Tray 1
3 kassetter per kit
Behållare 1
Wash Buffer I
• 160 ml
• för borttagning av föroreningar
Behållare 2
Wash Buffer I
• 80 ml
Behållare 3
Lysis/Binding
Buffer
• 80 ml
• < 6 M guanidintiocyanat, 
• för cell-/viruslysering och bindning av
nukleinsyror
Kassett 2
Reagent Tray 2
3 kassetter per kit
Behållare 1
4
tom
Behållare 2
Proteinase K
• 15 ml
• 2 % proteinas K, 50 % glycerol
• för nedbrytning av proteiner
Behållare 3
Elution Buffer
• 80 ml
• < 60 mM Tris-HCl-buffert
• för eluering av nukleinsyra
y Version 04, SV
Behållare 4
Wash Buffer III
• 160 ml
• < 20 mM Na-acetatbuffert
Flaska 1
Magnetic Glass 
Particles
• 6 flaskor, 18 ml vardera
• MGP-suspension innehållande isopropanol
• för bindning av nukleinsyror
 MagNA Pure 96-systemvätska (intern/extern)* fungerar som Wash Buffer
II för detta kit.
 Alla kitkomponenter är klara att använda.
5
y Version 04, SV
VARNINGAR OCH SÄKERHETSÅTGÄRDER
5.
5.1
Säkerhetsåtgärder
 Flera buffertar i MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit inne-
håller farliga eller hälsoskadliga föreningar. Mer information finns i bild 1
(reagenskassett 1), bild 2 (reagenskassett 2) och tabell 1. Låt inte dessa
reagens komma i kontakt med hud, ögon eller slemhinnor. Tvätta omedelbart med rikliga mängder vatten vid eventuell kontakt. Om det förekommer spill av reagens, späd ut med vatten innan du torkar upp.
 Se till att inte reagens som innehåller guanidintiocyanat kommer i kontakt
med natriumhypokloritlösning eller syror. Dessa blandningar bildar en
mycket giftig gas. Den här säkerhetsåtgärden är extra viktig när MagNA
Pure 96-vätskeavfallsskyddet rengörs.
Bild 1: Reagenskassett 1
Komponent Beteckning
6
Bild 2: Reagenskassett 2
Farliga och hälsoskadliga 
föreningar
Kassett 1
Reagent Tray 1
Behållare 1
Wash Buffer I
• etanol
Behållare 2
Wash Buffer I
• etanol
Behållare 3
• guanidintiocyanat
y Version 04, SV
Kassett 2
Reagent Tray 2
Behållare 1
Empty
Behållare 2
Proteinase K
Behållare 3
Elution Buffer
Behållare 4
Wash Buffer III
Flaska 1
Magnetic Glass 
Particles
• proteinas K
• isopropanol
Tabell 1: Reagenslista över farliga och hälsoskadliga föreningar
5.2
Krav på hantering
• Använd engångshandskar och byt dem ofta.
• Använd inte kitet efter passerat utgångsdatum.
För att minska risken för kontaminering, vilket kan resultera i falskt positiva
resultat, ska dessutom dessa riktlinjer följas:
• Utför provpreparation, pipettering av PCR/RT-PCR-reagens och PCR/
RT-PCR på separata platser.
• Kassera pipettspetsar i förslutna behållare för att undvika luftburen kontaminering.
Nukleaskontaminering i reagens och reaktionskärl bryter ned nukleinsyror.
Följ de här riktlinjerna för att minimera risken för kontaminering:
• Undvik att vidröra ytor eller material eftersom det kan orsaka nukleasöverföring.
• Använd endast reagens som medföljer detta kit. Andra reagens kan introducera nukleaser.
• Rengör och dekontaminera arbetsområden och instrument, inklusive pipetter, med i handeln förekommande dekontamineringsmedel.
• Använd endast nukleasfria pipettspetsar med aerosolbarriär och nukleasfria
mikrocentrifugrör.
• Använd ett arbetsområde som är särskilt avsett för arbete med RNA. Om
möjligt, använd reaktionskärl och pipetter som är avsedda endast för arbete
med RNA.
7
y Version 04, SV
5.3
• Allt material med humant ursprung och resulterande avfall ska betraktas
som potentiellt smittbärande. Rengör och desinficera noga alla arbetsytor
med desinfektionsmedel som rekommenderas av lokala instanser.
• Eftersom känsligheten och titer hos potentiella patogener i provmaterial kan
variera måste användaren optimera inaktiveringen av patogener och vidta
lämpliga åtgärder enligt lokala säkerhetsföreskrifter.
• Ät, drick eller rök inte i laboratoriet.
• Pipettera inte med munnen.
• Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd vid hantering av
prover och kitreagens.
• Undvik mikrobiell kontaminering och nukleaskontaminering av reagens när
portioner tas från reagensflaskor. Använd sterila engångspipettspetsar.
• Tvätta händerna noga efter hantering av prover och kitreagens.
5.4
Avfallshantering
• Säkerhetsdatablad (MSDS) finns tillgängliga på webben på 
www.e-labdoc.roche.com eller vid förfrågan hos närmaste Roche-kontor.
• Kassera oanvända reagens och avfall enligt gällande nationella och lokala
föreskrifter.
• Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd vid kassering av
prover och kitreagens.
• Följ proceduren nedan när reagens ska kasseras från behållarna:
1. Gör ett hål i skyddsfilmen i hörnet på en del av reagenskassetten med
hjälp av en stabil förbrukningsartikel av plast, till exempel en pipett för
cellodling.
2. Vik tillbaka skyddsfilmen och kassera vätskan i en avfallsbehållare.
3. Upprepa steg 1 och 2 tills alla behållare är tomma.
8
y Version 04, SV
FÖRVARING OCH HÅLLBARHET
6.
6.1
Kit och reagens
• Kitet fraktas i rumstemperatur.
• Kitkomponenterna är hållbara i +15 till +25 °C fram till utgångsdatumet som
står på etiketten.
 Skydda kitet mot ljus och håll det borta från magneter.
• Reagens kan förvaras i 32 timmar i +15 till +25 °C i instrumentdäcket på
instrumentet MagNA Pure 96.
• Ett set reagenskassetter (kassett 1 och kassett 2) kan användas för upp till
fyra individuella körningar. Efter att reagenskassetterna öppnats kan de
användas för ytterligare körningar på samma MagNA Pure 96-instrument
inom 28 dagar, ordentligt förslutna med en MagNA Pure 96-skyddsfilm* och
förvarade i +2 till +8 °C. Ekvilibrera kitkomponenterna i +15 till +25 °C i en
timme innan användning.
 Det är endast möjligt att återanvända delvis använda reagenskassetter på
samma MagNA Pure 96-instrument. Programmet MagNA Pure 96 kontrollerar materialstatusen för varje instrument med hjälp av reagensens
streckkoder och identifierar delvis använda reagens och spetsbrickor för
att de ska hanteras korrekt vid nästa körning.
 Om reagenskassetter inte försluts ordentligt kan vätska avdunsta. Felaktiga förvaringsförhållanden kan ha negativ inverkan på isoleringsprocessens prestanda.
6.2
Provtagning och förvaring av provmaterial
För känslig detektion av nukleinsyror är det viktigt att säkerställa korrekt förvaring av proverna (⫺15 till ⫺25 °C för DNA eller ⫺60 till ⫺80 °C för RNA). DNA
och RNA kan brytas ned om proverna inte förvaras korrekt.
 Använd inte plasma eller blod som innehåller heparin.
 Använd inte provmaterial som har förvarats länge i högre temperaturer.
 Om proverna förvarats frysta ska de tinas under lätt omrörning, t.ex. med
hjälp av en skakapparat.
9
y Version 04, SV
6.3
Förvaring av renade nukleinsyror och eluat
För att säkerställa bästa möjliga hållbarhet för de eluerade nukleinsyrorna,
fortsätt omedelbart med PCR/RT-PCR. Förvara inte eluerad nukleinsyra på
instrumentdäcket på MagNA Pure 96.
Vid förvaring ska output-plattan förslutas med en MagNA Pure 96-skyddsfilm*
och förvaras i ⫺15 till ⫺25 °C för DNA eller ⫺60 till ⫺80 °C för RNA. Förvara
renad nukleinsyra i portioner för att undvika att de fryses och tinas upprepade
gånger.
När output-plattor som innehåller eluat förvaras utanför instrumentet MagNA
Pure 96 ska plattorna förslutas med en MagNA Pure 96-skyddsfilm*.
 Vid ytterligare bearbetning måste skyddsfilmen tas bort. Ta inte bort
skyddsfilmen för hastigt, eftersom det kan orsaka korskontaminering
genom att aerosoler skapas och att smitta överförs mellan brunnar.
 Om eluaten har förvarats frysta, blanda dem försiktigt efter att de tinat
genom att pipettera upp och ned tio gånger innan du utför något nedströms-moment, t.ex. PCR/RT-PCR eller OD-mätningar. Pipetten ska vara
inställd på minst hälften av eluatvolymen vid blandning. Om nukleinsyrorna inte blandas i förväg och distribueras jämnt/homogent i lösningen
kan reproducerbarheten i efterföljande analyser påverkas negativt.
 För längre förvaring rekommenderar vi att eluaten överförs till en lagringsplatta.
10
y Version 04, SV
MATERIAL
7.
MATERIAL
7.1
Material som medföljer
Se avsnitt 4: Reagens och arbetslösningar
7.2
Material och utrustning som behövs men inte medföljer
• MagNA Pure 96 Instrument (Instrumentet MagNA Pure 96) (kat.nr 06 541
089 001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (Internal) [-systemvätska (intern)] (kat.nr 06
430 112 001)
• MagNA Pure 96 System Fluid (External) [-systemvätska (extern)] (kat.nr 06
640 729 001)
• MagNA Pure 96 Filter Tips (-filterspetsar) (1 000 μl) (kat.nr 06 241 620 001)
• MagNA Pure 96 Processing Cartridge (-processplatta) (kat.nr 06 241 603
001)
• MagNA Pure 96 Output Plate (-output-platta) (kat.nr 06 241 611 001)
• MagNA Pure 96 Internal Control Tube (-internkontrollrör) (kat.nr 06 374 905
001)
• MagNA Pure 96 Sealing Foil (-skyddsfilm) (kat.nr 06 241 638 001)
• Alternativa reagens:
• MagNA Pure 96 External Lysis Buffer (kat.nr 06 374 913 001)
• MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer (för isolering av bakteriell, fungial
och viral nukleinsyra med hjälp av Pathogen Universal-protokollet, om
extern lysering krävs) (kat.nr 06 374 921 001)
• MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer (kat.nr 06 640 702 001)
• Proteinas K, PCR-grad, aktivitet (+37 °C) b 0,6 U/␮l 
(t.ex. kat.nr 03 115 828 001)
• Valfritt: instrumentet MagNA Lyser (kat.nr 003 358 968 001 från 
SN 40467540, kat.nr 03 358 976 001 från SN 40405218)
• Valfritt: MagNA Lyser Green Beads (kat.nr 03 358 941 001)
• Standardlaboratorieutrustning
• Pipetter och nukleasfria spetsar med aerosolbarriär, t.ex. extra långa spetsar på 10 cm, för att fördispensera prover i MagNA Pure 96-processplattan.
• Valfritt: centrifug för rör.
11
y Version 04, SV
ANALYSPROCEDURER
8.
ANALYSPROCEDURER
8.1
Olika extraktionsprotokoll för instrumentet MagNA Pure 96 finns tillgängliga
för nukleinsyraisolering med MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large
Volume Kit. Varje protokoll är optimerat för specifika provmaterial.
 Kör protokollen endast med specificerade provmaterial, annars kan isoleringsprocessens prestanda påverkas negativt. Felaktig användning kan
leda till att MGP klumpar sig eller går förlorade, korskontaminering av prover eller till och med skador på instrumentet. Endast prov av samma provmaterial får kombineras i en körning.
För in vitro-diagnostisk användning kan följande protokoll användas med
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit. För varje protokoll kan
provvolym och elueringsvolym väljas från menyn i programmet.
Protokollnamn
Provmaterial
Elueringsvolym
1
500 ␮l helblod
 Använd inte mer än 1 × 107
blodceller/ml.
100 eller 200 ␮l
DNA Blood LV 1000* 1,000 ␮l helblod
blodceller/ml.
100 eller 200 ␮l
DNA Blood LV
DNA Blood ext lys LV 1,000 ␮l lysat (från 500 ␮l helblod) 100 eller 200 ␮l
blodceller/ml.
Viral NA Plasma LV
50 eller 100 ␮l
Viral NA Plasma LV
1000*
1,000 ␮l EDTA-plasma
50 eller 100 ␮l
Viral NA Plasma 
ext lys LV
1,000 ␮l lysat (från 500 ␮l 
plasma eller serum)
50 eller 100 ␮l
LV
500 ␮l prov (rekommenderas 
för citratplasma och serum)
50 eller 100 ␮l
LV 1000*
1,000 ␮l prov (rekommenderas 
för citratplasma och serum)
50 eller 100 ␮l
Pathogen Universal2 500 ␮l prov eller 500 ␮l lysat
500
12
50 eller 100 ␮l
y Version 04, SV
ANALYSPROCEDURER
Pathogen Universal2 1 000 ␮l prov eller 1 000 ␮l lysat
1000*
DNA Cells LV
50 eller 100 ␮l
Upp till 1 × 106 odlade celler resus- 100 eller 200 ␮l
penderade i 200 ␮l PBS
 100 μl rekom-
menderas inte
för odlade celler med ett
högt
DNA-innehåll
DNA Tissue LV
Upp till 25 mg homogeniserad 
vävnad i volymen 200 μl
100 eller 200 ␮l
 Vid användning av mer än
5 mg vävnad
rekommenderar vi att eluera
i 200 ␮l
1 Koncentrationen
av nukleinsyra i eluatet och känsligheten hos nedströms-tillämpningar kan ökas genom att välja en låg elueringsvolym. Dock kan effektiviteten på elueringen och det totala nukleinsyrautbytet bli lägre jämfört med vid användning av en
högre elueringsvolym.
2 Pathogen Universal-protokollen är utformade för isolering av bakteriell, fungial och
viral nukleinsyra från flera olika provtyper med humant ursprung. Protokollen kan
användas direkt för 500 ␮l eller 1 000 ␮l provmaterial eller för 500 ␮l eller
1 000 ␮l lysat. Använd en elueringsvolym på 50 μl för vätskeprover med lågt cellinnehåll, t.ex. urin.
 För protokoll markerade med en asterisk (*) är provvolymen delad för att
producera två prover, och bearbetade i två separata brunnar i MagNA
Pure 96-processplattan. När en internkontroll används tillsätts internkontroll separat i varje brunn. Det innebär att den totala mängden internkontroll som tillsätts per prov är 40 ␮l istället för 20 ␮l. Därför ska volymen
internkontroll som laddas på instrumentet fördubblas. Fördubbla också
antalet "Tests" i dialogrutan "Edit Internal Control Barcode". För vissa tilllämpningar kan spädning av internkontrollen krävas.
8.2
Provmaterial och förisoleringssteg
För att uppnå optimala resultat i nedströms-procedurer, i synnerhet i realtids-RT-PCR-analyser, exempelvis vid användning av LightCycler®-instrument,
ska inte prover som har högre volym än vad det valda extraktionsprotokollet är
utformat för bearbetas. Annars kan prestandan hos isoleringsprocessen
påverkas, vilket kan leda till att MGP klumpar sig eller går förlorade, korskontaminering av prover eller till och med skador på instrumentet.
 Behandla alla prover som potentiellt smittbärande.
13
y Version 04, SV
ANALYSPROCEDURER
I. Helblod
Färskt eller fryst blod kan användas utan någon förbehandling.
 Om antalet blodceller är över 1 × 107 blodceller/ml, späd helblodet med
PBS innan användning för att undvika klumpbildning.
 Kontrollera att det inte finns koagel i de antikoagulerade helblodsproverna.
II. Plasma/serum
Färsk eller fryst plasma eller serum kan användas utan någon förbehandling.
 Om det har bildats fällning, utför ett centrifugeringssteg i 10 minuter i
1 900 × g för 10 ml-rör. Använd endast supernatanten som prov.
III. Lysat (för externa lyseringsprotokoll)
Helblod, plasma eller serum blandat med MagNA Pure 96 External Lysis Buffer*.
 Se till att MagNA Pure 96 External Lysis Buffer* är ekvilibrerad till +15 till
+25 °C innan användning.
Tillsätt 500 ␮l helblod, plasma eller serum i 500 ␮l MagNA Pure 96 External
Lysis Buffer* och blanda genom att pipettera.
 Använd 1 000 ␮l lysat direkt i kombination med respektive externt lyseringsprotokoll eller förvara i ⫺15 till ⫺25 °C för DNA eller ⫺60 till ⫺80 °C
för RNA tills bearbetningen återupptas.
 När lysat har förvarats frysta ska de tinas på is. Innan överföring till en
MagNA Pure 96-processplatta, blanda noga genom att vortexa tre gånger
i 10 sekunder och centrifugera lätt för att samla upp innehållet på botten
av röret.
IV. Olika provmaterial och lysat för Pathogen Universal 500- och
1000-protokoll.
Lysering av bakterier i många olika provtyper av humant ursprung kan utföras.
Följande provmaterial kan vara lämpliga för Pathogen Universal 500 och
1000-protokoll: urin, bronkoalveolärt lavage (BAL), slem, cerebrospinalvätska
(CSV), pinnprov, faecesprov, helblod, plasma, serum och bakterieodlingar.
 På grund av den stora variationen av provmaterial finns ingen enskild allmänt tillämplig procedur. Preparationsstegen för ett halvflytande prov
(BAL, slem, faecesprov etc.) för nukleinsyraisolering beror på typen av
provmaterial, provets viskositet, partikeltyp och -innehåll.
 Allt provmaterial som används vid den här provpreparationsproceduren
tillsammans med nedströms-IVD-nukleinsyratestning ska utvärderas med
hänsyn till de individuella IVD-parametrarna.
 Beroende på provets viskositet och partikeltyp och -innehåll kan prover
användas utan någon förbehandling.
14
y Version 04, SV
ANALYSPROCEDURER
Lyseringsprotokoll med MagNA Pure 96 Bacterial Lysis Buffer* (BLB)
햲
 Använd inte 1 000 μl provvolym för mycket viskösa och cellrika pro-
ver, såsom slem eller faecesprov.
Kondensering (valfritt steg för mycket viskösa prover, t.ex. BAL eller
slem)
• Preparera en färsk DTT-stamlösning (ditiotreitol) (t.ex. 5× konc. =
0,75 %).
• Justera den slutliga DTT-koncentrationen i provet till 0,15 % genom
att tillsätta DTT-stamlösning.
• Inkubera provet under skakning i 850 rpm i 30 minuter i +37 °C tills
det enkelt kan pipetteras.
햳
Tillsats av BLB
• Tillsätt 250 ␮l (eller 500 ␮l) BLB i 250 ␮l (eller 500 ␮l) prov och
blanda noga.
 Om provvolymen är mindre än 250 ␮l (eller 500 ␮l), tillsätt BLB för
en slutlig volym på 500 ␮l (eller 1 000 ␮l).
햴
Nedbrytning med proteinas K
• Tillsätt 50 ␮l (eller 100 ␮l) proteinas K i 500 ␮l (eller 1 000 ␮l) prov-/
BLB-blandning och blanda noga.
• Inkubera i 10 minuter i +65 °C.
햵
Kokning (för svårhanterligt provmaterial som t.ex. slem eller
faecesprover)
 Utför kokningssteget för att inaktivera patogena organismer i provet. Det kan även förbättra lysering av cellväggar för vissa bakterietyper. För att förhindra läckage ska det här steget utföras i
reaktionsrör förslutna med skruvlock.
 Uteslut kokningssteget vid isolering av RNA, eftersom det kan ha
negativ inverkan på integriteten hos RNA.
• Inkubera prover i +95 °C i 10 minuter.
• Kyl proverna på is. Centrifugera sedan lätt för att samla upp hela
provvolymen i botten av röret.
• Överför 500 ␮l (eller 1 000 ␮l) till en MagNA Pure 96-processplatta.
15
y Version 04, SV
ANALYSPROCEDURER
Förbehandling av faecesprover
햲
Använd ett faecesprov i ungefär en ärtas storlek och suspendera i 550
␮l PBS.
 Centrifugera i 5 sekunder i 500 × g för att undvika att reaktionsspetsarna täpps igen med fasta partiklar.
 För isoleringen av viralt RNA kan en PBS/STAR-buffertblandning
(1:1) användas som ett alternativ till att suspendera faecesprover
för att minska eventuell hämning.
햳
Överför 250 ␮l supernatant till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt
250 ␮l BLB och 50 ␮l proteinas K.
햴
Inkubera i 10 minuter i +65 °C under skakning i 850 rpm i en termomixer, följt av 10 minuters inkubering i +95 °C.
 Uteslut inkubering i +95 °C för isolering av RNA.
햵
Överför 500 ␮l lysat till en MagNA Pure 96-processplatta.
Förbehandling av pinnprover
햲
Suspendera en torr pinne i 500 ␮l (eller 1 000 ␮l) BLB, tillsätt 50 μl
(eller 100 ␮l) proteinas K. 
För pinnprover i transportmedium, använd 250 ␮l (eller 500 ␮l) transportmedium, tillsätt 250 ␮l (eller 500 ␮l) BLB och 50 ␮l (eller 100 ␮l)
proteinas K.
햳
Kläm ur vätska och avlägsna pinnen.
햴
Inkubera det flytande provet i +65 °C i 10 minuter, följt av 10 minuters
inkubering i +95 °C.
 Uteslut inkubering i +95 °C för isolering av RNA.
햵
Överför 500 ␮l (eller 1 000 ␮l) flytande prov till en MagNA Pure
96-processplatta.
V. Odlade celler
Odlade celler resuspenderade i 200 ␮l fosfatbuffrad lösning (PBS) kan användas.
För DNA-isolering från odlade celler som odlats i suspension, centrifugera
varsamt de odlade cellerna i 5 minuter i 300 × g. Tvätta vid behov cellpelleten
med hjälp av PBS.
 Cellpelleten kan förvaras i ⫺15 till ⫺25 °C. 
Avlägsna odlingsmediet (eller PBS) och resuspendera cellerna i kall PBS
genom att pipettera eller skaka röret tills cellpelleten är resuspenderad. 
16
y Version 04, SV
ANALYSPROCEDURER
Monolayer-odlade celler ska samlas in genom standardtrypsinering med
hjälp av den procedur som beskrivs ovan. Nödvändig provvolym är 200 ␮l.
 Använd inte mer än 1 × 106 celler/200 ␮l, annars påverkas isoleringsprocessens prestanda negativt.
VI. Färskfrusen vävnad
Upp till 25 mg färskfruset vävnadsprov kan användas efter homogenisering.
Vävnadshomogenisering genom nedbrytning med proteinas K
햲
Tillsätt upp till 25 mg vävnadsprov i ett reaktionsrör, till exempel ett 
1,5 ml centrifugeringsrör.
햳
Tillsätt 180 ␮l MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer* och 20 ␮l
proteinas K i vävnadsprovet, och blanda sedan.
햴
Inkubera i +55 °C tills vävnaden är helt upplöst (vanligtvis från tre timmar till över natten).
 Den här homogeniseringsmetoden resulterar i en stor mängd DNA
med hög integritet.
Vävnadshomogenisering med hjälp av instrumentet MagNA Lyser
햲
Överför upp till 25 mg vävnadsprov till ett MagNA Lyser Green
Beads-rör.
햳
Tillsätt 200 ␮l MagNA Pure 96 DNA Tissue Lysis Buffer.
햴
Homogenisera vävnaden i instrumentet MagNA Lyser i 30 till 40 sekunder. Upprepa steget om homogeniseringen fortfarande inte uppnåtts.
 Metoden är snabb, men på grund av mekanisk finfördelning kan
dock DNA fragmenteras delvis.
17
y Version 04, SV
ANALYSPROCEDURER
8.3
Kvalitetskontroll
 Inkludera alltid tillämpliga kontroller.
Inkludera följande kontroller för att kontrollera hela processen, från provpreparation till analys:
• Positiv kontroll – tillsätt ett provmaterial som är positivt för target.
• Negativ kontroll – tillsätt PBS istället för prov.
• Extraktionskontroll – tillsätt ett provmaterial som är negativt för target.
• Internkontroll (IC) – tillsätt en angiven mängd kontrolltemplat i alla prover
som ska extraheras.
 För tillämpningar som kan ge falskt negativa resultat, till exempel detektion av patogener, är användning av en lämplig internkontroll (IC) obligatorisk. IC tillsätts under nukleinsyraisolering, förslagsvis med hjälp av den
automatiska IC-funktionen i systemet MagNA Pure 96. IC kan också tillsättas manuellt i provet. I det fallet måste IC vara stabil i provmaterialet,
och en nukleaskänslig IC, t.ex. naket RNA, får inte användas i det här syftet.
Internkontroll
Systemet MagNA Pure 96 kan automatiskt tillsätta en internkontroll (IC) från
MagNA Pure 96-internkontrollröret i varje prov. Internkontrollens volym är
fastställd till 20 ␮l per isolering. Använd funktionen genom att välja en internkontroll i listan Internal Control när en order skapas. Tillsätt den volym internkontroll som anges i IC-röret och placera röret i instrumentdäcket.
 På grund av mekaniska begränsningar är den volym internkontroll som
krävs större än vid multiplicering av antalet prover med 20 ␮l:
Antal 
prover
8
Mängd IC
(␮l)
650 800 1000 1350
16
24
32
40
48
56
64
1500 1650 2300 2450
72
80
88
96
2600 2800 2950 3100
 För vissa 1 000 ␮l protokoll är provvolymen delad för att producera två
prover, och bearbetade i två separata brunnar i MagNA Pure 96-processplattan. När en internkontroll används tillsätts internkontroll separat i varje
brunn. Det innebär att den totala mängden internkontroll som tillsätts per
prov är 40 ␮l istället för 20 ␮l. Därför ska volymen internkontroll som laddas på instrumentet fördubblas och antalet "Tests" i dialogrutan "Edit
Internal Control Barcode" också fördubblas.
8.4
Isoleringsprocedur
 Det är användarens skyldighet att validera systemprestandan för alla pro-
cedurer som används i laboratoriet.
Instrumentet MagNA Pure 96 är utformat för att bearbeta 96 prover samtidigt.
När provantal som inte är multiplar av 8 används kommer instrumentet att fylla
upp de tomma positionerna tills nästa multipel av 8 har uppnåtts.
18
y Version 04, SV
ANALYSPROCEDURER
En detaljerad beskrivning av hur du förbereder instrumentet och en extraktionskörning finns i utbildningshandboken till MagNA Pure 96 (programversion 2.0).
 Pipettera prover i botten av brunnarna i processplattan. Undvik att placera
droppar av provmaterial på brunnarnas väggar. Använd provöverföringsfunktionen för att pipettera proverna i brunnarna på en annan processplatta automatiskt. Det säkerställer överföring utan risk för att kontaminera
brunnarnas väggar med provmaterial. Mer information om detta finns i
användarhandboken till MagNA Pure 96 (programversion 2.0).
 Säkerställ att instruktionerna om typ av och mängd provmaterial följs (se
avsnitt 8.2 Provmaterial och förisoleringssteg). Användning av fel typer och
mängder provmaterial kan orsaka klumpbildning, vilket kan leda till lågt
utbyte och låg renhet på de isolerade nukleinsyrorna, samt till korskontaminering och hämning av nedströmsanalayser, till exempel PCR och
RT-PCR. Provmaterial som innehåller vatten, till exempel nukleinsyror som
är lösta i vatten eller i vätskor utan biologisk buffert, kan påverka resultatet
negativt vid extraktion. I det här fallet rekommenderas tillsats av 10× PBS
till en slutlig koncentration på 1× PBS, eller en carrier-nukleinsyra, till
exempel Poly A RNA.
 När reagens har förvarats i temperaturer under +15 till +25 °C ska kitkomponenterna ekvilibreras vid +15 till +25 °C i minst en timme innan de
ska användas.
 Kontrollera att alla behållare sitter på rätt sätt i reagenskassetterna innan
de placeras på instrumentdäcket.
 Det är möjligt att använda två reagensset från samma lot i en extraktionskörning. I så fall rekommenderar vi att två set med externa kontroller
används, ett för varje reagensset.
8.5
Avsluta en körning
När körningen har avslutats ska instrumentet undersökas noggrant så att
eventuellt spill upptäcks. Om det finns spill ska instrumentet rengöras och
dekontamineras enligt beskrivningen i användarhandboken till systemet
MagNA Pure 96.
 Rengör och dekontaminera vätskeavfallsskyddet efter varje körning enligt
beskrivningen i utbildningshandboken till systemet MagNA Pure 96.
Använd inte natriumhypokloritlösning eller syror vid det första rengöringssteget, eftersom de kan bilda mycket giftig gas i kombination med reagens
som innehåller guanidintiocyanat.
 Rester av magnetiska partiklar på output-plattan påverkar inte PCR- och
RT-PCR-analyserna på LightCycler®-instrument eller konventionella
PCR-instrument som använder termoblock.
19
y Version 04, SV
BEGRÄNSNINGAR OCH INTERFERENSER
9.
BEGRÄNSNINGAR OCH INTERFERENSER
1. Resultatens tillförlitlighet beror på korrekt provtagning, transport, förvaring
och behandling av prover.
2. Denna produkt ska endast användas av personal som utbildats i extraktion
av nukleinsyra, isolering och PCR-teknik.
3. Falskt negativa resultat kan uppstå om ett prov har tagits, transporterats,
förvarats eller hanterats felaktigt. Falskt negativa resultat kan också uppstå
om ett otillräckligt antal organismer finns i provet.
4. Alla IVD-tillämpningar som använder provpreparationsproceduren tillsammans med nedströms-IVD-nukleinsyratestning ska utvärderas med hänsyn
till de individuella IVD-parametrarna.
5. För att minimera risken för negativ inverkan på resultaten måste lämpliga
kontroller för nedströms-tillämpningar användas.
6. Förvaringsvillkor (temperatur, tid) för lysat, pelletar av odlade celler och
eluat måste utvärderas med hänsyn till de individuella IVD-parametrarna.
7. MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit och tillhörande reagens ska användas tillsammans med systemet MagNA Pure 96 för isolering
och extraktion av den totala nukleinsyrapoolen (DNA/RNA) från biologiska
prover i in vitro-diagnostiskt syfte. Lämpliga prestandaegenskaper måste
etableras av användaren, i synnerhet i kombination med alla nedströms-tilllämpningar. Alla resultat ska tolkas med hänsyn till alla relevanta kliniska
fynd och laboratoriefynd. Då analytkoncentrationen kan variera kraftigt mellan olika provtyper rekommenderar vi att etablera korskontamineringsresultat, till exempel med s.k. schackbrädesexperiment (högpositiva bredvid
negativa prover) innan rutintestning påbörjas.
20
y Version 04, SV
EGENSKAPER
10. EGENSKAPER
 MagNA Pure 96-kit och tillhörande reagens används tillsammans med
systemet MagNA Pure 96 för isolering och extraktion av den totala nukleinsyrapoolen (DNA/RNA) från biologiska prover i in vitro-diagnostiskt
syfte. 
Representativa egenskaper visas nedan. Uppgifterna visar exempel på
egenskaperna hos vanliga provmaterial för att påvisa systemets mycket
höga prestanda. Då resultat kan variera beroende på prov och parametrar
måste lämpliga prestandaegenskaper fastställas av användaren. För diagnostisk användning ska resultaten alltid bedömas i kombination med den
relevanta tillämpningen och andra relevanta laboratoriefynd. 
För provpreparation med instrumentet MagNA Pure 96 användes både
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit och MagNA
Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit för att ta fram de prestandadata som visas nedan.
10.1
Precision för extraktionseffektivitet
För att fastställa precisionen för extraktionseffektiviteten extraherades genomiskt DNA från helblod. Erhållen mängd isolerad nukleinsyra och dess renhet
fastställdes med OD-mätning. Experimentkonfigurationen samt resultaten
beskrivs nedan.
Kittyp
DNA Blood SV
Provtyp
Helblod (7,6 × 106 vita blodceller/ml)
Provvolym
200 ␮l
Elueringsvolym
100 ␮l
Replikat per körning
24
Tabell 2: Experimentkonfiguration för att genomföra analys av erhållen mängd och renhet
Erhållen mängd
(␮g)
CV (%)
OD 260/280
CV (%)
Körning 1
5,6
Körning 2
5,6
Körning 3
5,5
3,9
1,9
2,5
5,5
1,9
4,4
6,5
1,9
1,8
Tabell 3: Resultat (medelvärden) för erhållen mängd DNA och renhet för DNA, för
genomiskt DNA extraherat från helblod
21
y Version 04, SV
EGENSKAPER
 Den erhållna mängden beror i hög grad på antalet blodceller och kan där-
för variera från blodgivare till blodgivare.
10.2
Analytiska egenskaper
Realtids-qPCR/RT-PCR utfördes på instrumentet LightCycler® 480 med 5 ␮l
eluat i en total PCR-volym på 20 ␮l. Kvantifieringsstandarder och kontrollprover tillsattes precis innan PCR startades.
Parameter
Parvovirus B19
Hepatit A-virus (HAV)
Provtyp
EDTA-plasma spikad
med parvovirus B19
EDTA-plasma spikad med
hepatit A-virus
Helblod poolat från olika
blodgivare
(7,6 × 106 vita blodceller/
ml)
Target
Internt material: parvovi- Internt material: hepatit
rus B19
A-virus
Humant genomiskt DNA
Kit som
använts 
för PCR-
analys
(endast tillgängligt 
(endast tillgängligt internt)
internt)
LightCycler® CycA intern
analys:
DNA MasterPLUS HybProbe och Cyclophilin A
specifika primers och prober
Eluatvolym
per PCR
5 ␮l
5 ␮l
5 ␮l
PCR-volym
20 ␮l
20 ␮l
20 ␮l
PCR-
instrument
Instrumentet 
LightCycler® 480
Instrumentet 
LightCycler® 480
Instrumentet 
LightCycler® 480
Tabell 4: Sammanfattning av de analyser som använts för att ta fram de prestandadata som visas nedan.
Linjärt intervall
och
detektionsgräns
(LoD)
22
Det linjära intervall och den detektionsgräns (LoD) som kan uppnås med
MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid Kits för automatisk extraktion av
nukleinsyror i kombination med instrumentet MagNA Pure 96 utvärderades
med hjälp av virusmaterial av parvovirus B19 och av hepatit A-virus (båda
endast tillgängliga internt).
Experimentkonfigurationen för att fastställa det linjära intervallet och detektionsgränsen för de valda parametrarna samt resultaten beskrivs nedan.
y Version 04, SV
EGENSKAPER
Parameter
Parvovirus B 19
Kittyp
LV Kit
NA LV Kit
Hepatit A-virus
Provtyp
EDTA-plasma
EDTA-plasma
Provvolym
500 ␮l
500 ␮l
Elueringsvolym
50 ␮l
50 ␮l
Spädningsserier
8 olika virustitrar 
2×101 till 5×107 kopior/ml
8 olika virustitrar 
Totalt antal tillgängliga
datapunkter
172
176
Tabell 5: Experimentkonfiguration för att fastställa det linjära intervallet och LoD.
Parameter
Parvovirus B 19
Hepatit A-virus
Linjärt intervall
Detektionsgräns* 
(LoD_95)
68 kopior/ml
48 till 156 kopior/ml
119 kopior/ml
75 till 279 kopior/ml
Tabell 6: Resultat som fastställts för det linjära intervallet och LoD.
* Alla data utvärderades statistiskt med probitanalys; LoD beräknades för det 95-procentiga konfidensintervallet
(LoD_95).
 Känsligheten och detektionsgränsen beror i hög grad på PCR-analysen
23
y Version 04, SV
EGENSKAPER
Linjärt intervall –
parvovirus B19
Bild 1: Linjärt intervall med användning av protokollet Viral NA Universal LV för
extraktion av parvovirus B19 från EDTA-plasma. Det linjära intervallet för den här
tillämpningen är 2×102 till 5×106 kopior/ml. SVT/ml spikad virustiter/ml, MVT/ml: uppmätt virustiter/ml.
Linjärt intervall –
hepatit A-virus
(HAV)
Bild 2: Linjärt intervall med användning av protokollet Viral NA Universal LV för
extraktion av HAV från EDTA-plasma. Det linjära intervallet för den här tillämpningen är 3×103 till 1×109 kopior/ml. SVT/ml spikad virustiter/ml, MVT/ml: uppmätt
virustiter/ml.
24
y Version 04, SV
EGENSKAPER
Detektionsgräns
för parvovirus
B19
Bild 3: Detektionsgräns för parvovirus B19 fastställd med protokollet Viral NA
Universal LV för extraktion av en virusspädningsserie från EDTA-plasma.
LoD_95 är 68 kopior/ml. Det relaterade konfidensintervallet är 48 till 156 kopior/ml.
_____
Probitregression, - - - - nedre 95 %-gränsen, . . . . . . övre 95 %-gräns, o LoD_95.
Detektionsgräns
för hepatit
A-virus (HAV)
Bild 4: Detektionsgräns för HAV fastställd med protokollet Viral NA Universal
LV för extraktion av en virusspädningsserie från EDTA-plasma. 
LoD_95 är 119 kopior/ml. Det relaterade konfidensintervallet är 75 till 279 kopior/ml.
_____
Probitregression, - - - - nedre 95 %-gräns, . . . . . . övre 95 %-gräns, o LoD_95.
25
y Version 04, SV
EGENSKAPER
10.3
Precisionsanalys
Standardavvikelser (SD) och variationskoefficienter (CV) fastställdes för spädningsserier inom det linjära intervallet med hjälp av följande parametrar: Parvovirus B19, hepatit A virus och Cyclophilin A.
För att bestämma precision inom analyser togs alla data fram i en enskild körning. För att bestämma precision mellan analyser genomfördes tre körningar
av olika användare, på olika instrument och i olika laboratorier. Lot-till-lot-precision fastställdes med hjälp av sex olika loter.
Experimentkonfigurationen för att genomföra precisionsanalys samt de motsvarande resultaten beskrivs nedan.
Parameter
Parvovirus B19
Kittyp
Viral NA SV Kit
and Viral NA SV Kit
MagNA Pure 96 DNA
and Viral NA SV Kit
Extraktions-
protokoll
DNA Blood SV
Provtyp
EDTA-plasma
EDTA-plasma
Helblod (7,6 × 106 vita
blodceller/ml)
Provvolym
200 ␮l
200 ␮l
200 ␮l
50 ␮l
100 ␮l
Inte tillämplig
Elueringsvolym 50 ␮l
Spädnings-
serier
1×103 till 1×106 
kopior/ml
Hepatit A-virus (HAV)
Replikat
8
8
24
Datapunkter
Instrumentet 
LightCycler® 480
Instrumentet 
LightCycler® 480
Instrumentet 
LightCycler® 480
32
32
24
Precision mellan  96
körningar
96
72
Lot till lot-
precision
160
144
Precision inom 
körning
160
Tabell 7: Experimentkonfiguration för utförande av precisionsanalys.
26
y Version 04, SV
EGENSKAPER
Parvovirus B19
Precision inom körning
Koncentration (kopior/ml)
Medelvärde
(Cp)
SD (Cp)
CV (%)
1 × 106
18,0
0,14
0,78
1 × 105
21,5
0,21
1,00
4
24,9
0,31
1,23
3
28,5
0,39
1,37
1 × 10
1 × 10
Parvovirus B19
Precision mellan körningar
1 × 106
18,2
0,34
1,89
5
21,6
0,32
1,49
4
25,2
0,44
1,73
3
28,7
0,38
1,34
1 × 10
1 × 10
1 × 10
Parvovirus B19
Lot till lot-precision*
1 × 106
18,2
0,16
0,90
5
21,7
0,21
0,97
4
1 × 10
25,1
0,39
1,55
1 × 103
28,6
0,38
1,32
1 × 10
Tabell 8: Resultat för precision inom analyser, mellan analyser och lot-till-lot fastställd
med material innehållande parvovirus B19 spikat i EDTA-plasma.
* medelvärde för 6 olika loter
Hepatit A-virus
Koncentration (kopior/ml)
Medelvärde SD (Cp)
(Cp)
CV (%)
1 × 106
19,4
0,18
0,94
1×
105
23,0
0,28
1,23
1×
104
26,2
0,12
0,45
3
29,7
0,12
0,41
1 × 10
Hepatit A-virus
1 × 106
19,4
0,26
1,33
5
22,9
0,21
0,92
1 × 10
27
y Version 04, SV
EGENSKAPER
1 × 104
26,2
0,12
0,45
103
29,6
0,32
1,07
1×
Hepatit A-virus
106
19,7
0,22
1,10
1 × 105
23,1
0,15
0,67
1×
104
26,6
0,39
1,46
1×
103
30,0
0,26
0,87
1×
Tabell 9: Resultat för precision inom analyser, mellan analyser och lot-till-lot fastställd
med HAV spikat i EDTA-plasma.
CycA-analys
Referensprov
Medelvärde (Cp) SD (Cp)
CV (%)
18,1
1,12
CycA-analys
Referensprov
18,0
CycA-analys
Referensprov
0,20
0,21
1,15
17,9
0,16
0,87
Tabell 10: Resultat för precision inom analyser, mellan analyser och lot-till-lot för
CycA-analysen utförd med DNA som isolerats från helblod.
10.4
28
Interfererande substanser
Påverkan från interfererande substanser utvärderades med hjälp av provmaterial som spikats med parvovirus B19, och med serier av följande förekommande substanser i ökande koncentrationer: Hemoglobin (Hemoglobin
human, Sigma- Aldrich Co. LLC), bilirubin (Sigma-Aldrich Co. LLC) och lipider
(Intralipid 20 % emulsion, Sigma-Aldrich Co. LLC).
Experimentkonfigurationen för utvärdering av påverkan från interfererande
substanser och de motsvarande resultaten beskrivs nedan:
y Version 04, SV
EGENSKAPER
Parameter
Parvovirus B19
Kittyp
Provtyp
Helblod
Provvolym
200 ␮l
Elueringsvolym
50 ␮l
Viruskoncentration
1 × 105 kopior/ml
Interfererande substan- Hemoglobin, bilirubin och lipider som används i 
ser
olika koncentrationer
Replikat per hämmarkoncentration
3
Tabell 11: Experimentkonfiguration för att utvärdera påverkan av de interfererande
substanserna hemoglobin, bilirubin och lipider.
Resultat
Hemoglo- Cp
bin (mg/dl)
Bilirubin (mg/dl)
Cp
Lipider (mg/
dl)
Cp
0
21,0
0
20,8
0
21,6
100
21,3
6,6
21,0
200
21,6
200
21,2
13,2
21,2
400
21,5
300
21,2
19,8
20,9
600
21,9
400
21,1
26,4
21,0
800
21,9
500
21,1
33,0
21,3
1000
21,8
600
21,0
39,5
21,4
1200
21,5
700
21,1
46,1
21,3
1400
21,6
800
21,3
52,8
21,0
1600
21,3
900
21,5
59,4
21,0
1800
21,2
1000
i.f.*
66,0
21,5
2000
21,1
Medelvärde
21,1
Medelvärde
20,8
Medelvärde
21,6
Tabell 12: Cp-värden för prover som spikats med interfererande substanser.
* inte fastställt på grund av pipetteringsfel.
Inga av de interfererande substanserna visade sig påverka Cp-värdena. Det
erhållna intervallet för Cp-värdena är a 0,8.
29
y Version 04, SV
EGENSKAPER
10.5
Testning för korskontaminering
Risken för korskontaminering utvärderades med hjälp av testet Parvo B 19.
Under de två första körningarna bearbetades endast negativa prover för att
testa eventuell kontamination i systemet MagNA Pure 96. Ett schackbrädesmönster med omväxlande positiva och negativa prover bearbetades i tre körningar. I den sista körningen bearbetades endast negativa prover. Ett prov
identifierades som negativt om ingen detektionssignal erhölls efter 45
PCR-cykler.
Experimentkonfigurationen för testning av systemet MagNA Pure 96 för eventuell kontaminering samt de erhållna resultaten beskrivs nedan.
Parameter
Parvovirus B19
Kittyp
Provvolym
500 ␮l
Elueringsvolym
50 ␮l
Positiva prover
5 × 107 kopior/ml i EDTA-plasma
Negativa prover
negativ EDTA-plasma
Antal körningar
A) 2 körningar med endast negativa prover
B) 3 körningar med schackbrädesmönster
C) 1 körning med endast negativa prover
PCR-analys
LightCycler® Parvo B19 Quantification Kit med en
platta med 384 brunnar på instrumentet LightCycler® 480
Tabell 13: Experimentkonfiguration för utvärdering av risken för korskontaminering.
30
y Version 04, SV
EGENSKAPER
Körning
Cp-medelvärde
för 
positiva prover
Standard-
avvikelse
Antal positiva Antal
negativa
1
n/a
n/a
0/96
96/96
2
n/a
n/a
0/96
96/96
3
17,8
0,20
48/96
48/96
4
20,0
0,22
48/96
48/96
5
18,6
0,12
48/96
48/96
6
n/a
n/a
0/96
96/96
Tabell 14: Resultat av experiment med korskontaminering baserat på medelvärde för
Cp-värden och antal positiva och negativa värden.
Av tabell 14 framgår att under de ovan beskrivna förhållandena kunde ingen
korskontaminering detekteras.
10.6
Metodjämförelse
Detektion av
JAK2-mutation
Metodjämförelsen gjordes med systemet MagNA Pure 96 för att testa om allelen JAK2-V617F förekom i helblodsprover. Metoden jämför mutationskvoten
med vildtypen. DNA isolerades med systemet MagNA Pure 96 och den beprövade manuella QIAamp DNA Blood Mini Kit-metoden. PCR-analys utfördes
med JAK2 MutaQuant®Kit enligt tillverkarens instruktioner.
Parameter
Jak2 V617F
Kittyp
DNA Blood SV
Provtyp
Helblod
Provvolym
200 ␮l
Elueringsvolym
50 ␮l
Antal testade prover*
50
PCR-analys
Marseille på Rotor-Gene 3000 Instrument
Jämförelsemetod
Provpreparation
(elueringsvolym 85 μl)
Tabell 15: Experimentkonfigurationen för testning av helblodsprover för allelen
JAK2-V617F.
* Femtio blinda kliniska prover (överblivna prover) erhölls från rutinmässiga diagnostiska
procedurer och analyserades parallellt.
31
y Version 04, SV
EGENSKAPER
Komparator
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 50 prover
Negativt
Positivt för
JAK2_V617F
Totalt
Negativt
33
0
33
Positivt för
JAK2_V617F
0
17
17
Totalt
33
17
50
Tabell 16: Totalt ingick 50 prover i analysen. Överensstämmelsen för identifiering av
positiva och negativa prover var 100 % mellan den automatiska MagNA Pure 96-metoden och den manuella QIAamp DNA Blood Mini Kit-metoden.
Bild 5: Metodjämförelsen baserades på det slutliga förhållandet mellan mutation och
WT (vildtyp) vid extraktion med MagNA Pure 96 DNA and Viral NA SV Kit jämfört med
QIAamp DNA Blood Mini Kit.
……….. Identitetslinje, - - - - - Bablok-regression (1,02x); Pearson r= 0,989
32
y Version 04, SV
EGENSKAPER
Pneumocystis
jiroveci-DNA
Metodjämförelsedata som erhölls med systemet MagNA Pure 96 bedömdes
genom att testa BAL-prover (bronkoalveolärt lavage) för förekomst av
Pneumocystis jiroveci-DNA.
Följande experimentkonfiguration användes:
Parameter
Pneumocystis jiroveci-DNA
Kittyp
Provtyp
Bronkoalveolärt lavage (BAL)
Provvolym
500 ␮l
Elueringsvolym
100 ␮l
Antal testade prover* 96
PCR-analys**
Intern realtids-qPCR-analys i kombination med
LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe
Detektionsgräns: <50 kopior/reaktion
Linjärt intervall: 103–108 kopior/ml
Prover med > 104 kopior/ml bedöms som positiva
Jämförelsemetod
Provpreparation
Provvolym: 500 ␮l
Elueringsvolym: 200 ␮l
Tabell 17: Experimentkonfiguration för testning av BAL-prover (bronkoalveolärt lavage)
för förekomst av Pneumocystis jiroveci-DNA.
* Nittiosex blinda kliniska prover (överblivna prover) erhölls från rutinmässiga diagnostiska procedurer och analyserades parallellt.
**PCR-analysen har utvecklats och validerats av institutet för medicinsk mikrobiologi
och hygien på universitetssjukhuset i Regensburg.
Komparator
MagNA Pure 96
DNA and Viral
NA SV Kit
n= 96 prover
Negativt
Positivt för
P.jiroveci-DNA
Totalt
Negativt
70
1
71
Positivt för
P.jiroveci-DNA
0
25
25
Totalt
70
26
96
Tabell 18: Totalt bedömdes 26 prover av 96 som positiva. Den positiva överensstämmelsen för de positiva proverna var 25 av 26 (96 %). Den positiva överensstämmelsen
för de negativa proverna var 70 av 70 (100 %).
33
y Version 04, SV
EGENSKAPER
Bild 6: Metodjämförelsen för de positiva proverna baserat på de Cp-värden som uppmättes i 2 efterföljande körningar med intern realtids-qPCR-analys för Pneumocystis
jiroveci.
…….. Identitetslinje, - - - - - Bablok-regression (1,01x+0,91); Pearson r= 0,9312 
(Körning 1: ×) _______ Bablok-regression (1,01x +1,07); Pearson r= 0,9304 (Körning 2:
o)
34
y Version 04, SV
TILLÄGGSINFORMATION
11. TILLÄGGSINFORMATION
11.1
Symboler
I det här dokumentet används följande symboler för att markera viktig information:
11.2
Symbol
Beskrivning

Viktigt

Information
C
För in vitro-diagnostisk användning.
I
Katalognummer
B
Lotnummer
s
Använd före
r
Temperaturbegränsning (Förvaras vid)
n
Distributör
t
Tillverkare
)
Förvara skyddat mot ljus. (Yttre förpackning
för förbrukningsartiklar.)
2
Enbart för engångsbruk. (Yttre förpackning
för förbrukningsartiklar.)
v
Kitet uppfyller kraven i IVD-direktivet 98/79/
EG.
*
Finns att köpa hos Roche Applied Science
Ändringar från tidigare version
Språkliga ändringar.
12. VARUMÄRKEN
LIGHTCYCLER och MAGNA PURE är varumärken som tillhör Roche.
Alla andra produktnamn och varumärken tillhör respektive ägare.
13. LICENS
Den här produkten är licensierad med patent som ägs av Qiagen.
35
y Version 04, SV
BESTÄMMELSE OM ANVÄNDNING
14. BESTÄMMELSE OM ANVÄNDNING
För in vitro-diagnostisk användning.
36
y Version 04, SV
v
Tyskland, +49 621 7590
Tillverkad i Tyskland
_________________________________________________________________
0512.06671934001➃
t
n Distribueras i USA av Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA
68298 Mannheim
Tyskland

MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit

Transcription

Documents pareils

Y0XM25RV YAMAHA X-MAX 250_05 resp

Blazer, Jimmy, Suburban 1/2 ton

LANCIA THEMA 2.0 i.e. Turbo L

Vitara (not XL-7)

Suzuki - trail master

DAELIM ROADWIN

gratuit - FuelRod

Handling GTC Handling GTC

P t T / Pié O t / S t t Part Type / Piéçes Overcosts / Surcout port yp / ç / p

liste ricambi - Lavor Wash Service

Documento PDF - Padua@Research - Università degli Studi di