Vieillissement des barrières biologiques. : caractérisation

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Vieillissement des barrières biologiques. : caractérisation
Université de Franche-Comté
UFR des Sciences Médicales et Pharmaceutiques de Besançon
École Doctorale Environnement Santé
Vieillissement des Barrières Biologiques
Caractérisation morphologique et fonctionnelle
d’un modèle de stress environnemental induit
chez la lignée kératinocytaire humaine HaCaT
Thèse soutenue publiquement le 7 Juin 2012
en vue de l’obtention du grade de
Docteur de l’Université de Franche Comté
en Sciences de la Vie et de la Santé
Céline HEU
Jury
Pr. Dominique FELLMANN, Président
Université de Franche-Comté
Pr. Odile SERGENT, Rapporteur
Université de Rennes 1
Dr. Pierre-Emmanuel MILHIET, Rapporteur
Université de Montpellier 1
Pr. Eric LESNIEWSKA, Examinateur
Université de Bourgogne
Pr. Laurence NICOD, Directrice de thèse
Université de Franche-Comté
Dr. Céline ELIE-CAILLE, Co-directrice
Université de Franche-Comté
II
IV
Remerciements
Au terme de ces travaux de recherche, je suis heureuse de pouvoir remercier tous ceux et
celles qui m'ont accompagnée et soutenue tout au long de cette aventure ou qui ont croisé ma
route et grâce à qui j'ai pu avancer.
Je voudrais tout d’abord remercier mes co-directrices, le Professeur Laurence Nicod et le
Docteur Céline Elie-Caille de m’avoir donné la possibilité de réaliser ce travail au sein de leur
laboratoire respectif : le laboratoire de Biologie Cellulaire au sein de l’équipe I4S et la
Plateforme CLIPP au sein de l’UMR6174-CNRS de l’institut Femto-ST pour la confiance et
le soutien dont elles me gratifient depuis le début de cette thèse. A toutes les deux, je veux
exprimer toute ma reconnaissance. Je voudrais également souligner leur disponibilité et leur
patience dans les situations de « dernières minutes » auxquelles je les ai parfois confrontées.
Je voudrais également remercier le professeur Dominique Fellmann (EA 3922 - SFR FED
4234 de l’université de Franche-Comté) qui a accepté de présider ce jury, les Professeurs
Odile Sergent (UMR U1085 INSERM de l’université de Rennes 1) et Pierre-Emmanuel
Milhiet (UMR 5048CNRS, U1054 INSERM de l’université de Montpellier 1) pour leur
contribution en tant que rapporteurs et membres du jury de thèse, et le professeur Eric
Lesniewska (UMR INSERM U 1085 de l’université de Bourgogne) qui a accepté d’examiner
ce travail.
Je tiens à remercier le Docteur Alexandre Berquand pour son accueil au sein de Bruker Nanodivision à Mannheim, sans qui toute une partie de ce travail n’aurait pas été possible. Merci
pour ton soutien sans faille et tes précieux conseils.
Je tiens également à remercier le Docteur Stéphane Bourque (INRA, Dijon) pour m’avoir
initiée à l’électrophorèse bidimensionnelle et prêté ensuite le matériel, pour son accueil et sa
disponibilité.
V
Je souhaite adresser aussi mes remerciements au Dr. Sophie Launay et à Virginie Mougey
pour leur accueil au sein de la plateforme DImaCell, la formation qu’elles m’ont délivrée
respectivement en microscopie confocale et en cytométrie en flux, et leur constante
disponibilité et leurs conseils pour la mise au point des protocoles et la réalisation des
manipulations.
J’exprime ma vive reconnaissance à Alain Rouleau pour ma formation au PF2D, pour sa
disponibilité et sa gentillesse. Merci pour ces moments partagés au bureau comme à la
paillasse.
Merci également à Géraldine Lucchi pour son accueil au sein de la plateforme CLIPP de
Dijon et sa disponibilité pour la mise en œuvre de la spectrométrie de masse.
Je remercie également Barbara Dehecq et Alexandre Bonet pour sa contribution à la poursuite
de mes travaux de thèse, ses compétences et son expérience.
Merci à mes parents pour m’avoir toujours soutenue et portée dans ma voie, et m’avoir appris
le goût du travail et de la connaissance. Merci à mes frères : Sébastien, ta sœur a enfin terminé
ses études !! ; Jeremy, de l’œuf ou de la poule, je n’ai pas découvert qui fut le premier, mais
j’espère que tu apprécieras tout de même la lecture de ce manuscrit.
Mes remerciements les plus forts vont à Julien, à mes côtés chaque jour, qui a su me donner le
soutien nécessaire pour terminer ce travail, tout en faisant preuve d’une patience sans limite.
Merci à mes amis, Céline & Cyrille, Sandrina, votre soutien sans égal dans les bons comme
dans les mauvais moments, merci pour ces instants partagés et ceux à venir.
Merci enfin à tous ceux qui ont croisé ma route et ont contribué de près ou de loin à mon
travail ou au moins à ma bonne humeur, et en particulier : Stéphane Fimbel, Ambre Geneste,
Jessica Gromand, Marc Pudlo, Yann Pellequer, Isabelle Tomassoli, Dounia Karmous,
Amandine Clauzon, Mohammed Benchekroun
VI
Résumé
Il existe de nombreuses études mettant en relation le vieillissement et le stress oxydant, mais peu
d'entre elles ont caractérisé l'évolution des marqueurs des défenses antioxydantes, notamment au
niveau cutané, au cours du vieillissement dit extrinsèque ou environnemental.
Nous avons cherché à mimer in vitro le vieillissement extrinsèque cutané, à partir d’un modèle de
cellules épidermiques en culture, la lignée de kératinocytes humains HaCaT, soumises à un stress
chimique, l’exposition au glyphosate, un principe actif entrant dans la composition de nombreuses
formulations pesticides. Ainsi, nous avons exploré notre modèle par une approche multi-échelle
originale et innovante: tout d’abord, à l’échelle moléculaire, par une étude protéomique quantitative
différentielle des taux d’expression protéique intracytosolique suite à l’induction du stress ; puis, à
l’échelle cellulaire en cytomètrie en flux, par la caractérisation fonctionnelle du stress oxydant et de la
mort cellulaire qui en découle ; enfin, à l’échelle micro- et nanométrique, en microscopie confocale et
à force atomique, par le suivi de l’évolution des propriétés morphologiques et viscoélastiques des
kératinocytes stressés.
Ce travail de thèse a démontré que le glyphosate altérait significativement l’état et la fonction barrière
de l’épiderme humain, ciblant notamment les kératinocytes, dont l’équipement moléculaire et les
fonctions vitales d’adhérence et de dynamique membranaire se retrouvent fondamentalement
dégradées. L’ensemble de ces résultats constitue un « tableau » qui évoque parfaitement les
événements, les signaux et les comportements cellulaires s’installant au cours du vieillissement cutané.
Mot clés : Vieillissement cutané, Stress oxydant, Kératinocytes, Glyphosate, Microscopie à Force
Atomique, Protéomique, Mort cellulaire, Potentiel de membrane mitochondriale.
VII
Summary
Numerous studies relate ageing to oxidative stress. Few of them described the evolution of markers of
antioxidant defenses, in particular at the cutaneous level, during extrinsic or environmental ageing.
We tried to mimic in vitro cutaneous extrinsic ageing, with a model of epidermic cells in culture, the
human keratinocytes cell line HaCaT, subjected to a chemical stress, Glyphosate, an active ingredient
present in the composition of numerous pesticide formulations. Indeed, we examined the effects of
induced ageing in the loss of keratinocytes integrity in culture, by an original and innovative multiscale approach: Firstly, at the molecular scale, we assessed the stress induced modifications of
intracytosolic protein expression by a differential quantitative proteomic study; then, at the cellular
scale, with flow cytometry, by the functional characterization of the oxidative stress and resulting cell
death; finally, at the micro- and nanoscale, with confocal and atomic force microscopy by the
following the evolution of morphological and viscoelastic properties of stressed keratinocytes.
This PhD work demonstrated that glyphosate impaired the state and the barrier function of the human
skin, in particular by fundamentally impairing keratinocytes through the molecular equipment, the
vital adhesion functions and membrane dynamics. All these results give us a global image of events,
signals and cell behavior occurring in skin aging.
Key words: Skin ageing, Oxidative stress, Keratinocytes, Glyphosate, Atomic Force Microscopy,
Proteomic, Cell death, Mitochondrial membrane potential
VIII
Table des matières
Abréviations ............................................................................................................................................ 1
Liste des Figures et Tableaux .................................................................................................................. 3
Avant-Propos ........................................................................................................................................... 7
INTRODUCTION ........................................................................................................................ 9
ETAT DE L’ART ....................................................................................................................... 15
I.
Le vieillissement et ses enjeux ..................................................................................................... 17
II.
Les barrières biologiques .............................................................................................................. 21
1.
Définition et rôles ...................................................................................................................... 21
2.
La barrière cutanée humaine : structure et spécificité ............................................................... 21
i.
Structure de l’épiderme ............................................................................................. 23
ii.
L’épiderme acteur de la peau comme barrière biologique ............................................ 24
3.
Le kératinocyte .......................................................................................................................... 25
i.
Fonctions ................................................................................................................. 25
ii.
Cytosquelette du kératinocyte .................................................................................... 26
III. Le vieillissement cutané ............................................................................................................... 29
1.
Caractéristiques d’une peau vieillissante................................................................................... 29
2.
Voie intrinsèque ........................................................................................................................ 31
i.
Les télomères ........................................................................................................... 31
ii.
La production des ERO au sein de la cellule et la balance redox.................................. 32
iii.
Les autres origines intrinsèques du vieillissement ....................................................... 39
3.
Voie extrinsèque ........................................................................................................................ 41
i.
Les ultra-violets (UV) ............................................................................................... 41
ii.
La pollution.............................................................................................................. 42
iii.
Agression chimique environnementale et vieillissement cutané .................................... 43
IV. La mort cellulaire.......................................................................................................................... 45
1.
Les multiples voies d’induction de mort cellulaire ................................................................... 45
2.
La cornification ......................................................................................................................... 45
3.
L’autophagie.............................................................................................................................. 46
IX
4.
La nécrose.................................................................................................................................. 46
5.
Apoptose.................................................................................................................................... 47
i.
Chronologie de la survenue de l’apoptose................................................................... 47
ii.
Distinguer l’apoptose de la nécrose ............................................................................ 48
iii.
La mitochondrie, un organite essentiel ....................................................................... 48
iv.
Les voies de signalisation de l’apoptose ..................................................................... 49
6.
Une mort cellulaire caspase-indépendante ? ............................................................................. 51
i.
La mort par nécrose régulée ...................................................................................... 52
ii.
La mort par parthanatos ............................................................................................ 52
iii.
La mort par activation de la LEI/LDNase II ................................................................ 54
V.
Choix du modèle cellulaire et des technologies d’investigation du vieillissement cutané ........... 55
1.
Les modèles de vieillissement cutané in vitro ........................................................................... 55
2.
Le modèle « glyphosate / HaCaT » comme sujet d’étude in vitro ............................................ 56
i.
Les cellules HaCaT ................................................................................................... 57
ii.
Avantages et limites de l’utilisation d’une lignée cellulaire .......................................... 58
iii.
Le glyphosate ........................................................................................................... 59
3.
Combinaison de technologies pour une investigation multi-échelle du vieillissement cutané.. 62
i.
Protéomique quantitative différentielle ....................................................................... 62
ii.
L’étude de la mortalité cellulaire et la caractérisation de ses mécanismes ..................... 66
iii.
Evaluer la morphologie et les propriétés mécaniques cellulaires par AFM .................... 67
MATERIEL ET METHODES ..................................................................................................... 71
I.
Matériel général ............................................................................................................................ 73
1.
Kits de dosage ........................................................................................................................... 73
2.
Produits pour la culture cellulaire.............................................................................................. 73
3.
Réactifs et solvants .................................................................................................................... 73
II.
Culture cellulaire .......................................................................................................................... 74
1.
Lignée cellulaire humaine HaCaT ............................................................................................. 74
2.
Entretien de la lignée cellulaire ................................................................................................. 74
3.
Traitement des cultures de kératinocytes et préparation des échantillons ................................. 75
i.
Préparation pour l’évaluation du potentiel cytotoxique d’une substance ....................... 75
ii.
Préparation pour l’étude différentielle en protéomique ................................................ 75
X
iii.
Préparation pour l’étude en microscopie confocale à fluorescence :.............................. 77
iv.
Préparation pour la cytométrie en flux ........................................................................ 78
v.
Préparation pour le dosage des caspases 3 et 9 par mesure spectrophotométrique .......... 79
vi.
Préparation pour l’observation en AFM...................................................................... 79
III. Les méthodes d’évaluation ........................................................................................................... 80
1.
Évaluation de la cytotoxicité par mesure de la viabilité cellulaire : test du MTT ..................... 80
2.
Dosage des protéines avec le kit de Pierce ................................................................................ 81
3.
Marquage en fluorescence pour l’observation en microscopie confocale ................................. 82
i.
Marquage de la production des ERO au DCFH-DA .................................................... 82
ii.
Marquage des rafts lipidiques au FITC-CTx ............................................................... 83
iii.
Marquage de l’actine F à la phalloïdine TRITC .......................................................... 83
iv.
Marquage des kératines basales en immunofluorescence ............................................. 84
v.
Marquage de l’ADN nucléaire au DAPI ..................................................................... 85
4.
Marquage en fluorescence pour la mesure en cytométrie en flux ............................................. 86
i.
Evaluation de la production des ERO intracellulaires .................................................. 86
ii.
L’évaluation de l’apoptose par le marquage simultané à l’anV et à l’IP ........................ 89
iii.
Caractérisation du potentiel de membrane au JC-1 ...................................................... 91
5.
Dosage de l’activité des caspases 3 et 9 par mesure spectrophotomètrique .............................. 93
IV. Outils de mesure ........................................................................................................................... 95
1.
La spectrométrie de masse......................................................................................................... 95
i.
Séparation des protéines en chromatographie bidimensionnelle ................................... 95
ii.
Séparation des protéines en électrophorèse bidimensionnelle ....................................... 97
iii.
Identification des protéines en MALDI-TOF-TOF ...................................................... 99
2.
La microscopie confocale à fluorescence ................................................................................ 102
i.
Principe de la fluorescence ...................................................................................... 102
ii.
Principe de la microscopie confocale ....................................................................... 102
iii.
Appareillage ........................................................................................................... 103
3.
La cytométrie en flux .............................................................................................................. 104
i.
Principe ................................................................................................................. 104
ii.
Appareillage ........................................................................................................... 104
4.
i.
La Microscopie à Force Atomique .......................................................................................... 105
Principe ................................................................................................................. 105
XI
Appareillage ........................................................................................................... 106
ii.
RESULTATS ET DISCUSSION ............................................................................................... 111
Identification des paramètres d’étude du modèle glyphosate / HaCaT ...................................... 113
I.
1.
Cytotoxicité du glyphosate ...................................................................................................... 113
2.
Réversion de l’effet du glyphosate par les antioxydants ......................................................... 115
3.
Paramètres d’étude choisis ...................................................................................................... 117
4.
Discussion ............................................................................................................................... 118
II.
Caractérisation de biomarqueurs protéiques cytosoliques .......................................................... 121
1.
Profils protéomiques obtenus en chromatographie bidimensionnelle ..................................... 121
i.
Chromatographie de 1ère dimension ........................................................................ 121
ii.
Chromatographie de 2nde dimension ....................................................................... 123
iii.
Biomarqueurs protéiques du stress induit par le glyphosate : étude en chromatographie 2D
.............................................................................................................................. 124
2.
Profils protéomiques obtenus en électrophorèse bidimensionnelle ......................................... 125
i.
Rendement d’identification par spectrométrie de masse ............................................. 126
ii.
Reproductibilité des migrations électrophorétiques 2D .............................................. 126
iii.
Biomarqueurs protéiques du stress induit par le glyphosate : étude en électrophorèse 2D ...
.............................................................................................................................. 127
3.
Résumé : biomarqueurs caractéristiques des effets du glyphosate sur les cellules HaCaT ..... 129
4.
Discussion ............................................................................................................................... 131
III. La mortalité induite par le glyphosate ........................................................................................ 135
1.
Le glyphosate : un pro oxydant avéré...................................................................................... 135
i.
Evaluation de la production des ERO par microscopie confocale ............................... 135
ii.
Quantification de la production d’ERO .................................................................... 136
2.
Le glyphosate : inducteur de quelle(s) mort(s) cellulaire(s)? .................................................. 138
i.
Le glyphosate : un composé pro apoptotique ? .......................................................... 138
ii.
Le glyphosate : la voie mitochondriale de l’apoptose................................................. 142
iii.
Résultats préliminaires : dosage des activités caspase 3 et 9 ....................................... 144
3.
En résumé ................................................................................................................................ 146
4.
Discussion ............................................................................................................................... 147
IV. Etude morphologique et structurale ............................................................................................ 153
XII
1.
Observations cytologiques des HaCaT .................................................................................... 153
2.
Le glyphosate à l’origine de perturbations morphologiques cellulaires et membranaires ...... 154
i.
Mise au point des paramètres d’imagerie par AFM ................................................... 155
ii.
Influence du protocole de fixation sur la topographie cellulaire .................................. 156
iii.
Perte d’adhérence des cellules HaCaT suite au traitement par le glyphosate ................ 157
iv.
Effet du glyphosate sur la taille et la morphologie des cellules ................................... 159
v.
Perte d’homogénéité de la membrane cellulaire ........................................................ 160
vi.
Mise en évidence des rafts lipidiques ....................................................................... 161
3.
Effet de la hyaluronidase et de la neuraminidase sur les cellules HaCaT : imagerie des cellules
vivantes ........................................................................................................................................... 164
i.
Evaluation de la cytotoxicité de la hyaluronidase et de la neuraminidase .................... 164
ii.
Effets délétères localisés ......................................................................................... 165
4.
Paramètres physiques et cytosquelette .................................................................................... 166
i.
Perturbation des propriétés physiques de la membrane cellulaire ................................ 167
ii.
Effet du glyphosate sur la région sous-membranaire.................................................. 169
iii.
Réversion des effets du glyphosate par la quercétine ................................................. 170
iv.
Etude du cytosquelette d’actine ............................................................................... 172
v.
Etude du cytosquelette de filament intermédiaire : kératine........................................ 174
5.
Synthèse des conséquences morphologiques et structurales de l’action cytotoxique du
glyphosate ....................................................................................................................................... 176
6.
Discussion ............................................................................................................................... 177
i.
Analyses morphologiques et surfaciques des cellules HaCaT ..................................... 177
ii.
Viscoélasticité et cytosquelette ................................................................................ 178
DISCUSSION GENERALE ...................................................................................................... 185
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ...................................................................................... 191
ANNEXES .............................................................................................................................. 197
Annexe 1
.............................................................................................................................. 199
Annexe 2
.............................................................................................................................. 211
Annexe 3
.............................................................................................................................. 221
Annexe 4
.............................................................................................................................. 233
Annexe 5 : Communications orales et posters ............................................................................. 237
BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................................... 239
XIII
XIV
Abréviations
AFM
Atomic Force Microscopy
AGE
Advanced Glycation Endproducts
AIF
Apoptosis Inducing Factor
AND
Acide DésoxyriboNucléique
AnV
Annexine V
Apaf-1
Apoptotic protease activating factor
APS
Ammonium PerSulfate
ATP
Adénosine TriPhosphate
BCA
Acide BiCinchoninique
BSA
Sérum Albumine Bovine
CAT
CATalase
CI
Concentration Inhibitrice
CTx
Cholera Toxin x
DAPI
4’6-DiAmidino-2-PhenylIndole
DCFH-DA
2’,7’-DiChlorFluorescein-DiAcétate
DHEA
dehydroépiandrostérone
DIABLO
Direct IAP-Binding protein with LOw pI
DISC
Death-Inducing Signaling Complex
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO
DiMethylSulfOxyde
E2D
électrophorèse bidimensionnelle
EDTA
Acide Ethylène Diamine Tétraacétique
EGF
Epidermal Growth Factor
EPSPS
5-enolpyruvoyl-shikimate-3-phosphate synthase
ERO
Espèce Réactive de l’Oxygène
FITC
Fluorescein IsoThioCyanate
GPx
Glutathion-Peroxydase
GRase
Glutathion-Réductase
Grx
GlutaRedoxine
GSH
γglutamyl-cysteinyl-glycine ou glutathion
Hsp
Heat shock protein
IP
Iodure de Propidium
-1-
JC-1
5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolocarbocyanine iodide
LC
Liquid Chromatography
MALDI
Matrix Assisted Laser Desoption Ionisation
MBP1
c-Myc promoter-Binding Protein 1
MEC
Matrice ExtraCellulaire
MS
Mass Spectrometry
MS/MS
Spectrométrie de Masse en tandem
MTT
bromure de 3-[4,5 dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tétrazolium
NO
Oxyde Nitrique
OGM
Organisme Génétiquement modifié
PARP
Poly (ADP-ribose) polymerase
PBS
Phosphate Buffer Saline
PCNA
Proliferating Cell Nuclear Antigen
PFA
ParaFormAldehyde
pI
Point Isoélectrique
POEA
Polyethoxylated tallowamine
PS
PhosphatidylSérine
PTP
Pore de Transition de Perméabilité
SAM
Senescence Accelerated Mouse
SDS
Sodium Dodécyl Sulfate
SDS-PAGE
Sodium Dodécyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
SMAC
Second Mitochondria-derived Activator of Caspases
SOD
superoxydes dismutases
STS
Staurosporine
TA
Température Ambiante
TBP
TriButylPhosphine
TCEP
Tris(2-CarboxyEthyl)Phosphine
TFA
Acide TrifluoroAcétique
TGF β
Transforming Growth Factor β
TNF
Tumor Necrosis Factor
TOF
Time Of Flight
TRITC
Tetramethyl-Rhodamine B IsoThioCyanate
Trx
ThioRedoxine
ULFs
Unit length Filaments
UV
Ultra-Violets
α-HCCA
Acide α-Cyano-4HydroxyCinnaminique
-2-
Liste des Figures et Tableaux
Figures
Figure 1 : Pyramide des âges ................................................................................................................. 17
Figure 2 : Représentation schématique d’une coupe de peau humaine. ................................................ 22
Figure 3 : Structure de l’épiderme humain ............................................................................................ 23
Figure 4 : Représentation schématique de la structure secondaire commune à toute kératine .............. 27
Figure 5 : image au microscope électronique à transmission de filaments de kératines 5 et 14 ........... 28
Figure 6 : Évolution des sillons primaires de la peau avec l’âge évaluée par la technique de la
tribologie. .............................................................................................................................................. 30
Figure 7 : Interactions entre les différentes espèces réactives de l’oxygène impliquées en biologie .... 32
Figure 8 : Lieux de production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) .......................................... 35
Figure 9 : Exemple de réactions enzymatiques conduisant à l’élimination des ERO dans la cellule ... 36
Figure 10 : Modèle hypothétique des mécanismes physiopathologiques du photovieillissement ........ 42
Figure 11 : Les événements de la cascade de signalisation apoptotique ............................................... 50
Figure 12 : Réaction de poly (ADP ribosylation) .................................................................................. 52
Figure 13 : Structure chimique du glyphosate ....................................................................................... 59
Figure 14 : Rapport taille (FS) / structure (SS) des cellules détectées par le cytomètre à flux. ............ 87
Figure 15 : Intensité de fluorescence par cytométrie en flux et délimitation d’une population cellulaire
............................................................................................................................................................... 88
Figure 16 : Répartition des populations cellulaires par cytomètrie en flux après un marquage AnV/IP
............................................................................................................................................................... 90
Figure 17 : Marquage JC-1 du potentiel de membrane mitochondrial. ................................................. 92
Figure 18 : représentation schématique de la composition d’un spectromètre de masse .................... 100
Figure 19 : Principe de la microscopie confocale de fluorescence ...................................................... 103
Figure 20 : Principe général du microscope à force atomique (www.cea.fr) ...................................... 105
Figure 21 : Courbes de forces obtenues en PeakForce Tapping.......................................................... 108
Figure 22 : Représentation schématique des déformations, induites sur l’échantillon par la pointe,
prises en compte dans les modèles mathématique de DMT et de Sneddon. ....................................... 109
Figure 23 : Profils de cytotoxicité du glyphosate obtenus sur culture de HaCaT ............................... 114
Figure 24 : Résultats de réversion de la cytotoxicité du glyphosate (Gly) par traitement simultané à la
quercétine (Q) des HaCaT ................................................................................................................... 116
-3-
Figure 25 : Profils d’élution en gradient décroissant de pH, en chromatographie bidimensionnelle- 122
Figure 26 : Migration sur gel d’électrophorèse 2D des protéines cytotosoliques exprimées
différentiellement ............................................................................................................................ - 127 Figure 27 : Images du marquage des ERO des cellules HaCaT obtenues en microscopie confocale. ..... 136 Figure 28 : Production des ERO évaluée en cytométrie en flux ..................................................... - 137 Figure 29 : Répartitions des populations cellulaires obtenues par cytométrie en flux .................... - 139 Figure 30 : Comparaison de l’induction des différents stades de la mort cellulaire des HaCaT par le
glyphosate mesurée par cytométrie en flux. .................................................................................... - 140 Figure 31 : Etude par cytométrie en flux de la mort cellulaire chez les cellules HaCaT traitées par le
glyphosate........................................................................................................................................ - 141 Figure 32 : Marquage JC-1 du potentiel de membrane mitochondrial mesuré par cytométrie en flux
après 0,5 h de traitement par le glyphosate. .................................................................................... - 142 Figure 33 : Potentiel de membrane mitochondrial après un traitement des cellules HaCaT par le
glyphosate........................................................................................................................................ - 143 Figure 34 : Dosage de l’activité des caspases 3 et 9 après un traitement de 6 h des cellules HaCaT par
le glyphosate. ................................................................................................................................... - 144 Figure 35 : Cultures de cellules HaCaT en phase de croissance exponentielle (a) ou à confluence (b)
observées au microscope optique en phase inverse ......................................................................... - 153 Figure 36 : Images AFM des cellules HaCaT montrant la limitation de notre AFM vis-à-vis de
structures hautes de plus de 5 µm. ................................................................................................... - 155 Figure 37 : Cellules HaCaT imagées par AFM après traitement au PFA 4%. ................................ - 156 Figure 38 : Altération des cellules HaCaT induite par le glyphosate en conditions CI50 et CI65. . - 158 Figure 39 : Taille et morphologie des cellules témoins et des cellules traitées au glyphosate ........ - 159 Figure 40 : Comparaison morphologique et topologique des cellules HaCaT témoins ou traitées au
glyphosate en conditions CI50 (50 mM, pendant 0,5 h). ................................................................ - 160 Figure 41 : Mise au point de la technique de marquage au FITC-CTx sur les cellules HaCaT. ..... - 162 Figure 42 : Marquage des rafts lipidiques de la membrane plasmique et du noyau des cellules HaCaT
après traitement au glyphosate en condition CI50 (53 mM, 0,5 h). ................................................ - 163 Figure 43 : Profils cytotoxiques de la neuraminidase et la hyaluronidase. ..................................... - 164 Figure 44 : Effet délétère de l’action simultanée de la neuraminidase et de la hyaluronidase ........ - 165 Figure 45 : Module de Young (a) et déformation (b) des cellules HaCaT, mesurés par Peak force AFM
dans différentes conditions de traitement au glyphosate. ................................................................ - 167 Figure 46 : Effets du glyphosate sur la topographie de surface de cellules HaCaT vivantes imagées
avec le bioscope catalyst ................................................................................................................. - 169 -
-4-
Figure 47 : Action de la quercétine (100 µM) sur les cellules HaCaT. ........................................... - 170 Figure 48 Effet du glyphosate sur le cytosquelette d’actine après 6 ou 18 h de traitement. ........... - 172 Figure 49 : Effet du glyphosate sur le cytosquelette d’actine après 0,5 h de traitement. ................ - 173 Figure 50 : Marquage des filaments intermédiaires en immunofluorescence. ................................ - 175 Figure 51 : Etude en SPRi des types de contacts cellulaires avec le substrat.................................. - 195 -
Tableaux
Tableau 1 : CI50 obtenues pour chacun des 3 temps d’incubation (0,5, 6 et 18 h) ............................. 117
Tableau 2 : Bilan de la séparation en PF2D. ................................................................................... - 124 Tableau 3 : Bilan des résultats de la séparation en électrophorèse 2D ............................................ - 128 Tableau 4 : Fonctions des protéines sur- ou sous-exprimées en conditions CI50 versus témoin dans le
cytoplasme des cellules HaCaT en réponse au glyphosate.............................................................. - 129 -
-5-
-6-
Avant-Propos
L'investigation originale envisagée a été initiée grâce au rapprochement de
compétences complémentaires des deux protagonistes de ce projet, les co-directrices de ma
thèse respectivement Laurence Nicod et Céline Elie-Caille, d’une part en biologie cellulaire
(EA 4268, SFR FED 4234) et d’autre part, en micro/nanotechnologie et protéomique (Institut
Femto-ST Plateforme CLIPP) respectivement. Leur vision du projet s’inscrit dans l’apport
grandissant des nanotechnologies pour des applications en biologie.
Ces recherches ont été rendues possibles par le soutien de l’université de FrancheComté dans l’attribution d’une allocation du ministère de la recherche (2008-2011), de deux
Bonus Qualité Recherche, en 2008 (BQR GLYKER) et 2010 (BQR CELLADHOR). En
outre, Une bourse de mobilité (en 2011) m’a été accordée par l’école doctorale HommeEnvironnement-Santé (désormais Environnement-Santé).
Une partie de mes travaux ont été réalisé grâce au concours du Dr. Alexandre
Berquand dans le cadre d’un partenariat avec Bruker - Nano Surfaces Division® à Mannheim
(Allemagne).
Ces travaux ont abouti à la publication de 4 articles dans des revues internationales à
comité de lecture, et une note d’application Bruker1; et à 4 communications orales et 6 posters
dans des séminaires locaux, des congrès nationaux et internationaux (cf. Annexe 4). Un de ces
posters a notamment reçu le premier prix lors du congrès CARD 2011.
1 Elie-Caille C., Heu C., Guyon C., Nicod L (2010). Morphological damages of a glyphosate-treated human keratinocyte cell line
revealed by a micro- to nanoscale microscopic investigation. Cell Biol Toxicol, 2010, 26: 331-339.
Heu C, Berquand A, Elie-Caille C, Nicod L. Glyphosate-induced stiffening of HaCaT keratinocytes, a PeakForce Tapping study
on living cells. J Struct Biol, 2012, 178: 1-7.
Heu C, Elie-Caille C., Mouget V. Launay S., Nicod L. A step further towards glyphosate induced epidermal cell death:
Involvement of mitochondrial and oxidative mechanisms. Env Toxicol and Pharmacol, 2012, 34: 144-153.
Heu C, Berquand A, Elie-Caille C, Nicod L. Using PeakForce QNM for Drug Testing: Applications on Live Human Cells.
Microscopy And Analysis Spm 18 Issue April 2012
Quantitative Imaging of Living Biological Samples by PeakForce QNM Atomic Force Microscopy. Bruker-axs Application Note
#135
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-8-
INTRODUCTION
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Le processus de vieillissement est perceptible sur tous les organes du corps et se manifeste
visiblement au niveau de la peau où il résulte d’altérations cumulatives de sa structure, de sa
fonction et de son apparence. La peau est l’organe le plus vaste et constitue la première
barrière biologique de l’organisme contre l’environnement extérieur. Le vieillissement
extrinsèque, dit environnemental car dû à des facteurs externes à l’organisme, s’ajoute au
vieillissement intrinsèque, et est un phénomène auquel l’homme est de plus en plus exposé en
raison de la détérioration des conditions environnementales générales, et notamment la
pollution.
Il existe de nombreuses études mettant en relation le vieillissement et le stress oxydant, mais
peu d'entre elles ont caractérisé l'évolution des marqueurs des défenses antioxydantes,
notamment au niveau cutané, au cours du vieillissement environnemental résultant
d’agressions chimiques ou physiques telles que les expositions solaires, et dont la principale
cause est la production de radicaux libres. En outre, aucune caractérisation morphologique et
viscoélastique de l’effet d’un pesticide sur les cellules cutanées, n'a été rapportée dans la
littérature.
Des équipes de recherche locales et internationales s’attachent à comprendre le vieillissement
cutané en explorant les propriétés mécaniques de la peau et, par voie de conséquence, la
formation des rides dérivant de l’altération du derme, et plus précisément des fibroblastes et
de la matrice extracellulaire. Ces travaux sont, le plus souvent, à visée cosmétique afin
d’améliorer l’élasticité et la physiologie de la peau. En revanche, peu d’intérêt est porté à la
fragilité de la fonction barrière de l’épiderme indispensable à la protection de l’organisme.
Pourtant, même si le derme est très étudié dans le cadre du vieillissement cutané, il faut garder
à l’esprit que c’est l’épiderme, la couche la plus superficielle de la peau, qui sera en première
ligne pour empêcher, partiellement ou totalement, l’impact délétère d’agressions
environnementales ou d’une pollution chimique sur l’organisme. En outre, la majorité des
études portant sur le vieillissement extrinsèque traitent principalement des U.V, plus rarement
du nombre sans cesse croissant de polluants auxquels est soumis notre organisme, et
notamment notre peau chaque jour. Parmi eux, les pesticides représentent une proportion
grandissante.
Il s’agit donc, en filigrane, d’évaluer l’impact chez l’homme d’une pollution chimique mettant
en péril l’équilibre et l’homéostasie cellulaire de la barrière cutanée contribuant ainsi à un
vieillissement anticipé de la peau. L’agent chimique étudié ici, comme facteur d’atteinte
environnementale de la peau, est le glyphosate, un principe actif entrant dans la composition
- 11 -
de nombreuses formulations pesticides dont l’utilisation est répandue dans le monde entier.
Ainsi, notre objectif est de caractériser les effets du glyphosate sur un modèle cellulaire
épidermique en culture, de manière à obtenir la représentation la plus fidèle des conséquences
d’un stress environnemental sur la barrière cutanée. Une caractérisation complète sous-entend
de disposer d’un modèle cellulaire épidermique fiable et reproductible qui permette d’étudier
le vieillissement cutané sous les différents angles envisagés. Le matériel cellulaire que nous
avons utilisé est la lignée de kératinocytes humains HaCaT, dont les interactions avec la
molécule de glyphosate ont été finement explorées par la combinaison originale et innovante
d'outils d'investigation moléculaire et cellulaire, dans des conditions se rapprochant le plus
possible d’un environnement physiologique (pression, température, milieu, …).
D’un point de vue moléculaire, la protéomique, par une étude quantitative différentielle,
permet de mettre en évidence des biomarqueurs spécifiques de notre modèle cellulaire. Nous
avons, dans ce but, mis en œuvre des techniques de préfractionnement cellulaire, de
séparation/quantification des protéines et d’identification en spectrométrie de masse
permettant de comparer les profils protéiques des cellules HaCaT, avant et après contact avec
le glyphosate.
D’un point de vue morphologique, les techniques de caractérisation microscopique permettent
de cerner les conséquences des effets du glyphosate sur l’intégrité et la réponse cellulaires.
Outre la microscopie inverse, qui permet d’observer les cellules directement dans leur milieu
de culture, la microscopie confocale permet une grande résolution et un large champ
d’investigation grâce à ses nombreuses applications que ce soit sur cellules fixées ou cellules
vivantes. La microscopie confocale de fluorescence permet, en outre, d’étudier à la fois les
paramètres morphologiques et la localisation de paramètres fonctionnels. L’émergence
récente des techniques de microscopie à sondes locales, orientées vers des applications
biologiques, permet la caractérisation morphologique de modèles biologiques, à l’échelle
cellulaire, moléculaire, et ce, à une résolution nanométrique. La microscopie à force atomique
offre la possibilité de caractériser une cellule, à très haute résolution, dans des conditions
quasi physiologiques. Ensuite, certains développements de la microscopie à force atomique
permettent la mesure de propriétés mécaniques telle que l’élasticité de la membrane cellulaire.
Ces 2 volets, moléculaire et morphologique, forment l’essentiel du projet de base. Or,
l’évolution de nos recherches au cours de ces 3 ans, ainsi que les moyens mis à notre
disposition au sein des équipes de recherche, nous ont amenées à envisager l’étude du modèle
- 12 -
à une autre échelle. En effet, les techniques biochimiques de dosage enzymatique et de
cytomètrie en flux ont permis la mise en évidence de certains mécanismes cellulaires mis en
jeu par les cellules HaCaT en réponse au traitement par le glyphosate.
Ce manuscrit est divisé en 3 chapitres principaux. Afin de placer nos travaux dans un contexte
général, nous décrirons dans le premier chapitre, le vieillissement chez l’homme, ses enjeux
sociaux et conjoncturels, ainsi que le rôle vital des barrières biologiques de l’organisme
humain, et en particulier l’importance de la barrière cutanée et de son inévitable
vieillissement. C’est également dans ce chapitre que seront évoquées les données actuelles
concernant la mort cellulaire, puis nous exposerons la stratégie expérimentale mise en œuvre
qui s’appuie sur le modèle cellulaire glyphosate / HaCaT et sur des technologies
d’investigation multi-échelle. Dans le second chapitre, intitulé « Matériels et Méthodes »,
nous déclinerons l’ensemble des techniques expérimentales que nous avons utilisées : des plus
classiques aux plus pointues et originales. Le troisième chapitre rapporte, en 4 parties, les
résultats que nous avons obtenus et qui ont permis (i) de définir le cadre expérimental du
modèle de vieillissement glyphosate / HaCaT, (ii) de préciser les principales protéines
affectées par ce traitement au glyphosate, protéines qui étaient suggérées antérieurement lors
de mesures d’activités biochimiques au sein du laboratoire, (iii) de cerner les mécanismes de
mort cellulaire induits par le glyphosate, et enfin (iv) de caractériser les atteintes
morphologiques du modèle, et de visualiser à la fois aux niveaux moléculaire, topographique
et mécanique, les conséquences des effets du glyphosate sur l’intégrité cellulaire. Chacune de
ces parties sera discutée individuellement avant la partie « discussion générale », et les
conclusions et perspectives cloront le manuscrit.
- 13 -
- 14 -
ETAT DE L’ART
- 15 -
- 16 -
I.
Le vieillissement et ses enjeux
Les progrès de la médecine et l’amélioration des conditions de vie durant ces 100 dernières
années ont permis l’évolution de l’espérance de vie. Ainsi, depuis 1840, l’espérance de vie a
augmenté d’environ 3 mois par an (Oeppen et Vaupel, 2002). C’est le changement le plus
rapide et le plus généralisé qui n’ait jamais eu lieu dans toute l’histoire de notre civilisation.
Cet allongement de l’espérance de vie, corrélé à une baisse de la natalité, induit, en France et
dans le reste des pays développés, le vieillissement global de la population. Si cette évolution
se poursuit, en 2050, un habitant sur 3 aura plus de 60 ans (Robert-bobée, 2007) c’est-à-dire 2
fois plus que dans la population actuelle.
Figure 1 : Pyramide des âges
Evolution de la répartition de la population en France entre les années 2000 et 2050 (rapport fait
au nom de la Commission des Affaires Sociales sur le projet de loi de financement de la Sécurité
Sociale pour 2004, Mr Dominique Leclerc, Sénateur).
En effet, la figure 1, présentant l’évolution de la pyramide des âges en France entre la
situation constatée en l’an 2000 et la prévision de la situation en 2050, montre qu’elle n’est
plus une pyramide en 2050 mais devient plus étroite à la base, ceci étant dû à une
augmentation de la population vers les âges les plus avancés.
- 17 -
Le vieillissement lui-même n’est pas nouveau : la nouveauté réside dans le fait qu’un grand
nombre de personnes atteint un âge avancé (80 ans et plus). Or, le vieillissement
démographique (augmentation de la proportion des individus atteignant 65 ans et plus par
rapport à l’ensemble de la population) est synonyme de vieillissement individuel c’est-à-dire
physiologique (ou sénescence). Le vieillissement individuel se traduit par les effets du temps
(vieillissement chronologique) et s’exprime également au travers d’autres dimensions
psychologiques, sociales et existentielles (Henrard, 2008). Les différents processus de
vieillissement sont nombreux et interagissent entre eux de manière complexe, impliquant des
enjeux politiques, socio-culturels, économiques et de santé variés.
Le vieillissement physiologique s’accompagne d’une augmentation de l’incidence de
nombreuses maladies chroniques ainsi que des modifications biologiques qui peuvent être
sources de complication (apparition d’ostéoporose après la ménopause, cataracte provoquée
par la diminution de l’élasticité du cristallin….). Ensuite, la diminution de la capacité
d’adaptation au stress et l’altération de la fonction de certains organes avec le vieillissement
augmente la vulnérabilité aux maladies. De plus, le vieillissement de la population a entraîné
l’apparition de nouvelles maladies dites dégénératives : d’Alzheimer (Kern et Behl, 2009), de
Parkinson (Levy, 2007), sclérose en plaque, de Huntington-Gilford ou progeria (Ding et Shen,
2008)…, et a permis de mieux comprendre le vieillissement et ses conséquences aux niveaux
moléculaire, cellulaire et tissulaire dans le cas de ces maladies associées à ces processus. En
effet, il est établi que la prévalence de ces maladies neurodégénératives augmente avec l’âge
(Makrantonaki et Zouboulis, 2007b). La médecine doit ainsi composer avec des maladies
encore inconnues il y a une centaine d’années.
Des modèles de vieillissement sont proposés pour l’étude de ces maladies dégénératives.
Dans leur revue générale, Chiba et son équipe (2009) détaillent un modèle murin, le SAM
(Senescence Accelerated Mouse), qui se caractérise par un processus de sénescence accéléré,
d’où une durée de vie plus courte et une progression plus rapide des phénotypes
pathologiques liés à l’âge. Ces désordres seraient causés en partie par une atteinte
mitochondriale. De ce fait, ces auteurs discutent du possible rôle d’un stress oxydant aggravé
qui aurait un rôle neurodégénératif chez ce modèle, et ont montré à la fois une augmentation
- 18 -
de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) et une augmentation de l’activité des
enzymes antioxydantes dans les fibroblastes de ces souris.
Malgré de nombreuses théories, le vieillissement reste un phénomène irrésolu qui est
complexe car multifactoriel : sont en cause des facteurs génétiques, environnementaux,
hormonaux et métaboliques, (Fischer, 2005). En 2008, Scaffidi et Mistelli ont démontré
l’importance de la mutation de la lamine A, une protéine structurale du noyau cellulaire, dans
le vieillissement physiologique. Schmuth et ses collaborateurs démontrèrent en 2007,
l’importance des hormones dans la survenue du vieillissement cutané, et notamment les
œstrogènes (Verdier-Sévrain et al., 2006 ; Hall et Phillips, 2005).
Le processus de vieillissement est perceptible sur tous les organes du corps et se manifeste
visiblement au niveau de la peau où il résulte d’altérations cumulatives de sa structure, de sa
fonction et de son apparence. En effet, la peau âgée est fine, relâchée, sèche, et subit une perte
d’élasticité et de régularité architecturale (Callaghan et Wilhelm, 2008).
Même si le vieillissement de la peau est un mécanisme naturel, et fait partie intégrante de la
vie, il est le reflet de la santé de notre corps. La société actuelle tend de plus en plus à faire les
louanges d’une apparence jeune, qui passe principalement par la peau et l’apparence du
visage, et qui devient donc un des enjeux culturels de notre époque. Ainsi, les progrès de la
recherche en cosmétologie, pour repousser les signes visibles de l’âge, ont un poids
économique important et représentent une part grandissante de la recherche pharmaceutique.
De plus, le vieillissement cutané dit extrinsèque ou environnemental, c’est-à-dire dû à des
facteurs externes de l’organisme, est un phénomène auquel la peau de l’homme est de plus en
plus exposée en raison de l’aggravation des conditions environnementales générales :
l’agressivité accrue du soleil liée à la réduction de l’épaisseur de la couche d’ozone
provoquant un photo-vieillissement important (appelé aussi vieillissement actinique ou
héliodermie), le vieillissement d’origine chimique, que ce soit par le contact avec l’air de plus
en plus pollué, le tabac, les cosmétiques riches en agents chimiques comme les parabènes,
mais aussi les nombreux produits chimiques présents dans notre quotidien. En outre,
l’aggravation de facteurs sociétaux actuels, tels que la privation de sommeil et le stress,
contribue largement au processus accéléré du vieillissement.
- 19 -
Dans cette première partie, nous définirons et décrirons tout d’abord la barrière cutanée, et en
particulier l’épiderme, ainsi que les caractéristiques d’une peau vieillissante, puis nous
évoquerons les différents facteurs responsables du vieillissement cutané, notamment la mort
cellulaire dont nous listerons les techniques d’études et les modèles in vitro actuellement
proposés. Enfin, nous présenterons la stratégie originale choisie pour l’étude de notre modèle
de vieillissement cellulaire épidermique in vitro.
- 20 -
II.
Les barrières biologiques
1. Définition et rôles
Les barrières biologiques ou anatomo-physiologiques sont nombreuses dans l’organisme
humain. On peut citer la barrière intestinale, hépatique, glomérulaire, placentaire, thymique,
testiculaire, alvéolaire (ou barrière air-sang), hémato-encéphalique.
On distingue 2 types de barrières biologiques : des barrières organisme-environnement, telle
que la peau, et des barrières au sein même de l’organisme telles que la barrière alvéolocapillaire, où la paroi des alvéoles pulmonaires et des capillaires sanguins séparent l’air
contenu dans les poumons des globules rouges. De même, la barrière hémato-encéphalique,
composée de cellules nerveuses et de capillaires sanguins, ralentit le débit sanguin vers le
cerveau, et joue un rôle sélectif dans le passage de certaines substances du sang vers le liquide
cérébrospinal et l’encéphale. La peau est l’exemple majeur d’une barrière entre
l’environnement et l’organisme en étant le premier organe rencontré par le milieu extérieur.
2. La barrière cutanée humaine : structure et spécificité
La peau est l’organe le plus lourd (7% de la masse corporelle) et le plus étendu de
l’organisme (1,8 m²) de l’organisme humain. La peau est structurée en 3 plans (fig. 2). La
couche la plus profonde est l’hypoderme : c’est un tissu graisseux fortement vascularisé,
constitué d’adipocytes, qui remplit les fonctions d’isolant thermique du corps humain, de
barrière mécanique et de réserve énergétique de l’organisme. La couche supérieure à
l’hypoderme est le derme, un tissu conjonctif dense constitué de fibroblastes et d’un réseau de
fibres de collagène qui constitue le tissu cicatriciel, responsable de l’élasticité de la peau. Le
derme assure les fonctions de cohésion et de nutrition de la peau, il contient de nombreux
vaisseaux sanguins et lymphatiques, des terminaisons nerveuses, les glandes sudoripares et la
base du système pilo-sébacé. Le derme adhère fortement à l’épiderme par l’intermédiaire de
la membrane basale.
- 21 -
Figure 2 : Représentation schématique d’une coupe de peau humaine.
Bien que le derme soit la couche de la peau la plus étudiée dans le cadre du vieillissement
cutané, dans le cas d’un vieillissement induit par des facteurs environnementaux, c’est
l’épiderme qui sera en première ligne pour empêcher un impact trop important d’une
pollution sur l’organisme (Madison, 2003). L’épiderme, couche la plus superficielle et la plus
mince de la peau, est donc directement en contact avec l’environnement extérieur et, à ce titre
l'épiderme assure des propriétés de protection, de perception, de régulation, et de régénération
de notre organisme. Composé à 90% de kératinocytes, l’épiderme contient également des
mélanocytes qui participent à la photo-protection, des cellules de Langerhans qui sont les
cellules immunitaires, les cellules de Merkel qui sont les cellules réceptrices du sens du
toucher et des fibres nerveuses. Enfin toutes les cellules de l’organisme « baignent » dans la
matrice extracellulaire (MEC) : celle de la peau a un rôle essentiellement structural et de
soutien ; elle est composée d’un réseau de protéines fibreuses telles que les collagènes et les
élastines, des glycoprotéines, des glycosaminoglycanes et des protéoglycanes.
- 22 -
i.
Structure de l’épiderme
L'épiderme est un épithélium pluristratifié qui se renouvelle tous les 28 jours en moyenne, et
selon un programme très précis de différenciation. Il est composé de 4 couches de
kératinocytes plus ou moins différenciés (fig. 3a) selon leur niveau de kératinisation,
processus qui aboutit à l’énucléation par voie d’apoptose des cellules remplies de kératines,
assemblées en réseaux filamenteux. Ces cellules forment la couche cornée, strate la plus
superficielle de l’épiderme.
Figure 3 : Structure de l’épiderme humain
Organisation en épithélium pluristratifié (a) (Green et Gaudry, 2000) ;aperçu de la jonction dermoépidermique (b) (http://archimede.bibl.ulaval.ca/archimede/) K : kératine
La couche cornée (stratum corneum) est composée de cellules complètement kératinisées,
anucléées, en forme de lamelles allongées. Les cornéocytes, très hydrophobes, et les lipides
de l’espace intercellulaire jouent le rôle de barrière indispensable à l’épiderme. La couche
cornée a une épaisseur variable selon sa localisation sur le corps (plus épaisse sur la paume
des mains et la plante des pieds par exemple).
Sous la couche cornée se trouve la couche granuleuse (stratum granulosum) qui est composée
de cellules aplaties fusiformes, leur cytoplasme contient des granules de kératohyaline.
- 23 -
La couche de Malpighi (stratum spinosum) est faite de plusieurs couches de kératinocytes de
formes polyédriques, qui viennent de la couche basale et possèdent dans leur cytoplasme des
précurseurs de la kératine.
La membrane basale (stratum germinatum) est une couche monocellulaire implantée sur les
papilles du derme grâce aux digitations cytoplasmiques de ces kératinocytes. Ce système
d’amarrage constitue une importante zone d’échange métabolique par transsudation entre les
capillaires du derme et l’épiderme. En effet, l’épiderme ne contient aucun système vasculaire.
L’épaisseur du derme et de l’épiderme varie sensiblement en fonction de la région du corps.
En effet, la peau sera plus fine au niveau des paupières qu’au niveau des régions palmoplantaires, en raison de l’épaississement de la couche cornée. Ainsi, l’épaisseur de l’épiderme
peut varier de 50µm à 1mm, et celle du derme de 100 µm à 1 mm selon les régions du corps.
La jonction dermo épidermique (fig. 3b) se compose de 2 lames : directement en contact avec
l’épiderme, la lame basale constituée de la lamina lucida (protéoglycanes et glycoprotéines)
qui ancrent la lamina densa, (collagènes) ; et, en continuité avec le derme, la lame réticulaire
formée principalement de collagène. Les hémidesmosmes permettent l’ancrage des
kératinocytes de la lame basale en reliant leur cytosquelette de filaments intermédiaires de
cytokératine (tonofilaments) avec à l’extérieur des cellules, la plaque dense, la plaque sous
basale, les filaments d’ancrage et les fibrilles d’ancrage. La jonction entre les kératinocytes
des couches supérieures se fait par l’intermédiaire des desmosomes.
ii.
L’épiderme acteur de la peau comme barrière biologique
La composition en céramides (précurseurs des sphingolipides) de la couche cornée joue un
rôle très important dans le maintien de la fonction de barrière biologique de la peau (Madison,
2003 ; Mizutani et al., 2009).
La fonction de barrière de la peau n’est pas absolue car celle-ci est une barrière hydrophobe,
perméable à quasiment toutes les molécules lipophiles. Seul le degré de perméabilité de ces
substances varie selon leur nature et l’état physiologique de la peau. L’absorption percutanée
est étudiée en pharmacocinétique, notamment, pour connaître le degré de pénétration d’un
agent pharmacologique. Dans le cadre d’une agression environnementale, l’absorption par la
peau d’un agent chimique aura une grande importance sur la gravité de l’atteinte de la barrière
- 24 -
cutanée. En effet, la voie principale est le passage du stratum corneum à travers 2 voies :
intercellulaire (entre les cellules) ou transépidermique (à travers les cellules). Des voies
annexes sont les glandes sudoripares et la voie pilosébacée.
L’étude de l’épiderme en tant que barrière biologique réside en premier lieu en l’étude de ses
principales cellules constitutives : les kératinocytes.
3. Le kératinocyte
Les kératinocytes sont des cellules de grande taille (10 à 15 µm) ; leur forme dépend de la
zone de l’épiderme où ils se trouvent. Leur noyau est arrondi et possède des nucléoles bien
marqués. Ils possèdent, outre les organites classiques des cellules eucaryotes (mitochondries,
réticulum endoplasmique, appareil de Golgi et ribosomes), des mélanosomes, organelles
spécifiques provenant des mélanocytes. Les kératinocytes de la couche basale sont
pavimenteux, contiennent un grand noyau ovalaire et un cytoplasme basophile riche en
organites telles que les ribosomes libres. La membrane plasmique des kératinocytes basaux
est le siège de nombreuses vésicules de pinocytose, un moyen de transport actif d’eau et de
molécules depuis le derme ; elle contient des hémidesmosomes reliés dans le cytoplasme à
des tonofilaments ou filaments intermédiaires qui constituent le cytosquelette de kératine de la
cellule.
i.
Fonctions
Dans un épiderme sain, les kératinocytes sont à l’état quiescent. Sous l’action d’un stimulus,
la cellule se met à sécréter des cytokines, des enzymes et des molécules d’adhésion induisant
des réponses cellulaires variées : prolifération, différenciation épidermique, des collagénases
de même que des composants membranaires (Boyce, 1994). Ainsi, ce sont les kératinocytes
de la membrane basale qui interviennent dans le processus de cicatrisation d’une plaie
cutanée.La communication intercellulaire est assurée par les jonctions intercellulaires qui
entourent le kératinocyte.
La croissance, la différenciation et les fonctions des kératinocytes sont régulées par des
facteurs de croissance : principalement EGF (Epidermal Growth Factor) et TGF β
(Transforming Growth Factor β) via une auto- ou une cross-induction. (Hashimoto, 2000)
- 25 -
La peau humaine est en renouvellement constant avec un « turn-over » d’environ 28 jours
(Igarachi et al., 2007) qui résulte de la compensation de la desquamation des cellules
anucléées de surface, les cornéocytes, par la migration progressive des kératinocytes,
accompagnée de leur différenciation. En effet, une des spécificités des kératinocytes est que,
lors de la division cellulaire dans la couche basale, une cellule reste en place (pool
prolifératif) et l’autre progresse à travers les couches supérieures de l’épiderme vers
l’extérieur,
subissant
des
modifications
ultra-structurales
importantes
à
la
fois
morphologiques et biochimiques. Ce renouvellement du contingent de cellules cutanées par
les kératinocytes basaux est essentiel au maintien de la fonction de barrière biologique
qu’occupent la peau et, en premier lieu l’épiderme, la couche la plus exposée au milieu
extérieur. Une des conséquences du vieillissement cutanée est la diminution du « turn-over »,
des synthèses cellulaires et donc du renouvellement épidermique.
Le maintien de l’intégrité des kératinocytes est important notamment pour l’équilibre
homéostasique et la fonction de barrière biologique. Le cytosquelette joue également un rôle
fondamental dans le maintien de l’intégrité cellulaire, mécanique et structurale, du tissu
épidermique.
ii.
Cytosquelette du kératinocyte
Il existe 3 types de filaments qui composent le cytosquelette de toute cellule : les
microfilaments d’actine, les microtubules d’alpha- et beta-tubuline et les filaments
intermédiaires. Ces derniers peuvent être composés de différents types de protéines selon les
cellules. Chez les cellules épithéliales ce sont les kératines.
Les filaments intermédiaires de kératines se forment par agrégation en tout endroit de la
cellule et ne sont pas polarisés, contrairement aux autres composants du cytosquelette. Ce
réseau sert principalement d’échafaudage au reste du cytosquelette. L’assemblage et le
désassemblage des filaments intermédiaires de kératine nécessitent l’intervention d’enzymes
comme des kinases, des phosphatases mais aussi des protéines chaperonnes comme les Hsp
(Heat Shock protein) (Herrmann et al., 2007).
- 26 -
Ce cytosquelette est à la fois attaché à la membrane nucléaire et à la membrane plasmique, au
niveau des desmosomes et des hémidesmosomes (Steinert 2001). En effet, les cadhérines des
desmosomes sont liées aux filaments intermédiaires grâce à d’autres protéines telles que les
plakines (Waschke, 2008).
Figure 4 : Représentation schématique de la structure secondaire commune à toute kératine
Une hélice α centrale (composée de 4 sous-domaines) entourée de 2 domaines non hélicoïdaux de
tête en N-terminal et de queue en C-terminal. (Gu et Coulombe, 2007)
Il existe 2 types de kératine : type I et type II ; le filament intermédiaire de kératine se forme
toujours par hétérodimérisation (structure tertiaire) d’une kératine de type I et d’une kératine
de type II. Les kératines possèdent toutes une structure commune (fig. 4). Le classement des
kératines est basé sur leur point isoélectrique (pI) (Moll et al., 1982). Les kératines de type I
ont un pI acide, alors que les kératines de type II ont un pI basique. L’hétérodimère se forme
par assemblage des hélices α des 2 kératines de manière parallèle (Er Rafik et al., 2004). Cette
structure est stabilisée par des interactions hydrophobes (Coulombe et Fuchs, 1990).
L’hétérodimère est le premier bloc de la formation des filaments intermédiaires.
La structure quaternaire des kératines se forme par assemblage en protofilaments (tétramères)
de protofibrilles (octamères formés de 2 protofilaments) et d’ULFs (Unit length Filaments)
formés par 4 protofibrilles pour un diamètre final de 20 nm) (Herrmann et al., 2002).
Les filaments intermédiaires de kératines sont formés par assemblage latéral et longitudinal de
ces sous unités. L’assemblage spontané des kératines dépend des conditions de pH et
d’osmolarité dans le cytoplasme (Magin et al., 2007). Les kératinocytes basaux contiennent la
K14 comme kératine de type I et la K5 comme kératine de type II (Indian Academy of
Sciences, 2007) (fig. 5).
- 27 -
Figure 5 : image au microscope électronique à transmission de filaments de kératines 5 et 14
reconstitués in vitro (Gu et Coulombe, 2007)
Les fonctions mécaniques du cytosquelette de kératine sont multiples : les filaments
intermédiaires servent d’échafaudage pour la polymérisation des 2 autres types de
cytosquelette de la cellule pour supporter les stress mécaniques, maintenir l’intégrité
structurale des cellules, prévenir les variations de pressions hydrostatiques et établir la
polarité de la cellule.
Les kératines présentent d’autres fonctions cellulaires non mécaniques (Gu et Coulombe,
2007). Ces fonctions se manifestent spécifiquement selon le type de kératine mis en jeu et le
contexte cellulaire épithélial. Plusieurs fonctions ont été identifiées : régulation de la
pigmentation de la peau, de la production de protéines, de la taille des cellules et enfin
régulation des signaux pro-apoptotiques. Il a été prouvé chez la souris (Ku et Omary, 2006)
que la kératine 8 joue un rôle de substrat pour les kinases pro-apoptotiques empêchant ainsi la
phosphorylation de leur véritable substrat, ralentissant ainsi le processus apoptotique
déclenché par un stress. De plus, la kératine 8, en association avec la kératine 18, joue un rôle
dans la protection de la barrière épithéliale, notamment dans l’intestin, après stimulation par
l’interleukine 6 (Wang et al., 2007).
La peau est le siège de nombreux processus métaboliques qui sont modulés par les conditions
physiologiques de l’organisme et les conditions environnementales. Une diminution des
capacités des cellules à maintenir leur homéostasie, et à conserver leur intégrité structurale et
mécanique, peut conduire à l’altération de la barrière cutanée et à un vieillissement prématuré
de la peau.
- 28 -
III.
Le vieillissement cutané
Le vieillissement est un processus multifactoriel caractérisé par une défaillance progressive de
la capacité à préserver l’homéostasie sous des conditions de stress physiologiques, ce qui
accroît la vulnérabilité de l’individu et limite sa viabilité. Le vieillissement conduit à la
détérioration progressive de la quasi-totalité des fonctions de l’organisme au cours du temps.
Le vieillissement cutané est le miroir du vieillissement de l’organisme entier.
1. Caractéristiques d’une peau vieillissante
En premier lieu, à l’échelle macroscopique, une peau vieillissante est une peau ridée. Des
rides d’une profondeur inférieure à 1mm sont considérées comme superficielles alors que des
rides d’une profondeur supérieure à cette valeur sont considérées comme profondes
(Manriquez et al., 2008). De nombreux travaux sont réalisés pour essayer d’évaluer les rides
que ce soit à partir de photographies 2D (Sainthillier et al., 2009) ou par des techniques
élaborées comme la profilométrie. Ces rides sont d’abord la conséquence de la perte
d’élasticité de la peau. Cette perte d’élasticité se traduit par la raideur et la dureté de la
barrière cutanée, et sa capacité moindre à revenir à son état initial quand on l’étire. Elle est
principalement due à la diminution de l’épaisseur de la matrice extracellulaire (MEC), réseau
de fibres particulièrement abondant dans le tissu cutané, (surtout dans le derme) assurant ainsi
le maintien des cellules entre elles et l’élasticité de la peau (Naylor et al., 2011).
D’un point de vue cellulaire, la perméabilité de la membrane cellulaire implique une certaine
déshydratation aggravée par la diminution de la synthèse d’acides gras essentiels et du sel de
sodium de l’acide pyrrolidone carboxylique qui capte les molécules d’eau de l’air ambiant
(Pontius, 2011). La diminution du nombre de mélanocytes, et de leur capacité de synthèse de
la mélanine, provoque une diminution globale de la pigmentation de la peau. Parallèlement, la
multiplication des kératinocytes et l’augmentation inhabituelle de la production de mélanine
dans certains mélanocytes entraîne l’apparition de taches brunes visibles à la surface de la
peau. Les taches brunes sont dues également au vieillissement des lysosomes dans toutes les
cellules de l’organisme, et forment des corps résiduels impossibles à dégrader à l’origine des
agrégats de lipofuscine.
- 29 -
La tribologie est la science qui étudie les frottements, l’usure, et ses effets. Appliquée à
l’étude de la peau, elle permet l’exploration de son relief et indique ainsi par exemple son état
mécanique. La figure 6 compare des sillons primaires de la peau dont l’organisation varie en
fonction de l’âge (www.inserm.fr).
Figure 6 : Évolution des sillons primaires de la peau avec l’âge évaluée par la technique de la
tribologie.
La désorganisation du relief cutané peut être due au vieillissement normal, mais aussi à des
pathologies ou à des expositions trop fréquentes à des agents toxiques. On observe que l’anisotropie
(orientation des plis dans toutes les directions) décline avec l’âge. On note la disparition des sillons
secondaires de la peau et une augmentation de la profondeur des sillons primaires. (source CNRS)
Un certain nombre d’équipes locales, nationales et internationales s’emploient à la mise au
point et à l’utilisation de modèles d’études in vivo et in vitro de vieillissement cutané (cf.
§V.1.) ; mais la tâche s’annonce difficile tant le vieillissement cutané met en jeu de nombreux
facteurs (Nouveau-Richard et al., 2005). En effet, comme nous l’avons évoqué
précédemment, le vieillissement cutané est un phénomène complexe qui est le résultat de
l’interaction entre 2 phénomènes (Puizina Ivic et al., 2008) : le vieillissement cutané
intrinsèque, qui est un phénomène naturel déterminé par des facteurs chronologiques et
génétiques auxquels sont soumis tous les organes, et le vieillissement cutané extrinsèque ou
environnemental, conséquence de l’influence de facteurs externes. La peau est d’autant plus
soumise à ce dernier qu’elle est l’organe le plus vaste de l’organisme constituant le premier
rempart vis-à-vis du milieu extérieur.
- 30 -
2. Voie intrinsèque
Le vieillissement cutané intrinsèque s’explique par deux évènements cellulaires principaux :
le raccourcissement des télomères d’une part, et le stress oxydant d’autre part.
i.
Les télomères
Chaque cellule possède un potentiel limité de divisions, ce qui réduit sa capacité de
prolifération dans le temps (Hayflick, 1980). En effet, depuis son état souche au sein de
l’embryon, chaque cellule entame un processus de sénescence réplicative. Les télomères
tiennent un rôle majeur dans ce processus. Il s’agit de structures nucléoprotéiques qui
protègent l’extrémité de chaque chromosome et sont garantes de leur intégrité et du maintien
de cette intégrité au sein du noyau de la cellule. Au niveau structural, le télomère est formé de
répétitions de la séquence nucléotidique TTAGGG et de protéines spécifiques qui assurent la
stabilité des extrémités chromosomiques. Le télomère possède une extrémité 3’OH simple
brin qui ne peut pas être répliquée par l’ADN polymérase au cours du cycle cellulaire : ainsi,
à chaque division cellulaire, le télomère se raccourcit. Cette perte est compensée, dans les
cellules germinales, par l’action d’une enzyme, appelée télomérase, qui joue le rôle de
transcriptase inverse assurant la synthèse de novo des répétitions télomériques, ce qui
maintient la longueur des télomères. Cependant, les cellules somatiques ne possèdent pas
assez d’activité télomérasique pour compenser la perte ; on assiste alors à la sénescence
réplicative.
Vient s’ajouter à la sénescence réplicative, le vieillissement résultant du stress oxydant. La
théorie radicalaire du vieillissement a été avancée pour la première fois par Harman, en 1956.
Ce phénomène est dû au métabolisme cellulaire qui accumule des déchets que sont les
espèces réactives de l’oxygène (ERO); ce terme englobe une grande variété de molécules à
propriétés oxydantes et de radicaux libres.
- 31 -
ii.
La production des ERO au sein de la cellule et la balance redox
La balance redox est l’équilibre entre la production d’ERO et leur maintien à un taux
raisonnable par le système complexe de défenses antioxydantes.
Le paradoxe de l’oxygène
L’oxygène est indispensable à la vie des organismes aérobies qui ont besoin de l’oxygène
pour oxyder des substrats riches en carbone et en hydrogène. Cependant lors de ces
oxydations, l’oxygène est réduit partiellement et forme les ERO (fig. 7).
Figure 7 : Interactions entre les différentes espèces réactives de l’oxygène impliquées en biologie
(Géhin, 2006b)
- 32 -
Il existe ainsi plusieurs molécules de ce type comme l’anion superoxyde (O2°-) et le radical
hydroxyle (HO°) très instables et très réactifs, ainsi que des espèces non radicalaires comme
l’oxygène singulet (1O2) ou le peroxyde d’hydrogène (H2O2) (Simonian et Coyle, 1996 ;
Garrel et al., 2007). Le peroxyde d’hydrogène est l’espèce la plus stable, diffuse librement et
a une durée de vie plus longue ; de plus, il a une faible réactivité ce qui lui permet de jouer un
rôle indispensable dans la signalisation cellulaire et le maintien de l’homéostasie cellulaire
(Martindale, 2002).
Cependant, en matière de stress oxydant, le peroxyde d’hydrogène constitue surtout un
précurseur générant d’autres ERO. En effet, en présence de métaux de transition tels que les
ions ferreux (Fe2+), et les ions cuivreux (Cu2+), il peut se décomposer en HO- et HO° par la
réaction de Fenton (fig. 7). Avec les peroxyles (ROO°), le radical hydroxyle (HO°) est
extrêmement réactif et ce, avec la plupart des molécules biologiques.
Le monoxyde d’azote (NO), nécessaire à la production de l’anion peroxynitrite, est produit
par la NO Synthase par oxydation de l’arginine. Contrairement aux autres cellules de la peau
qui expriment la NO Synthase 3, les kératinocytes expriment la NO Synthase 1. Le NO joue
un rôle important chez les kératinocytes. En effet, au cours d’un déséquilibre de la balance
redox, le NO, produit en grande quantité, va contribuer à inhiber la synthèse des protéines
nécessaires à la cornification (involucrine et loricrine), et donc perturber la fonction de
barrière de l’épiderme (Cals-Gierson et Ormerod, 2004).
Le lieu de production des ERO a d’autant plus d’importance pour leur effet biologique que
leur réactivité est importante.
- 33 -
La mitochondrie, le lieu majeur de production des ERO
Les ERO sont produits en grande partie par la respiration aérobie et d’autres procédés
métaboliques (Halliwell et Whiteman, 2004). Les mitochondries sont les seuls organites de la
cellule à posséder leur propre ADN. Elles ont un rôle de production de l’énergie sous forme
d’ATP. Dans ce but, elles consomment une grande partie de l’oxygène. La chaîne respiratoire
située dans la membrane interne de la mitochondrie est le lieu de métabolisation de l’oxygène
et de production de l’énergie nécessaire à la cellule (fig. 8). Le complexe IV de cette chaîne
contient la cytochrome oxydase qui réduit l’oxygène pour produire des molécules d’eau.
Cependant, cette réaction peut provoquer des fuites d’électrons, qui ne vont réduire que
partiellement l’oxygène et provoquer la production du radical superoxyde au niveau du
coenzyme Q.
D’autres organites tels que le peroxysome et le réticulum endoplasmique jouent un rôle dans
la production des ERO.
La diffusion de certains ERO fait que l’état redox d’une cellule doit être autant considéré que
celui de toute la communauté cellulaire. En effet, le relargage par les cellules de certains
ERO, notamment le peroxyde d’hydrogène qui est capable de diffuser à travers les
aquaporines (Bienert et al., 2006), provoque un effet paracrine sur leurs voisines (Pletjushkina
et al., 2005). Waghray et ses collaborateurs ont démontré, en 2005, que la production de
peroxyde d’hydrogène par des myofibroblastes de poumons atteints de fibrose générait un
signal de mort sur les cellules épithéliales pulmonaires environnantes. De plus, Ardannaz et
Pagano recensent dans une revue de 2006, les nombreux effets paracrines que peut avoir le
peroxyde d’hydrogène chez les cellules endothéliales. En outre, il existe également un effet
autocrine grâce à la NADPH oxydase.
- 34 -
Aquaporine
Espace extracellulaire
Aquaporine
NADPH
oxydase
Chaine respiratoire
Xanthine
oxydase
Acyl-CoA
oxydase
Péroxysome
Xanthine
oxidase
Mitochondrie
Réticulum
endoplasmique
Noyau
Figure 8 : Lieux de production des espèces réactives de l’oxygène (ERO)
Organelles jouant un rôle dans leur production : la chaîne respiratoire dans la membrane interne
de la mitochondrie est le lieu principal de production des ERO. La β -oxydation des lipides dans le
peroxysome peut également en être une source (dépend du niveau métabolique de la cellule). Le
cytochrome P450 et la NADPH oxydase sont sources d’ERO mais la production est restreinte en ces
endroits de la cellule. Les ERO, notamment le peroxyde d’hydrogène, peuvent induire des effets
paracrine (Covarubias et al., 2008)
- 35 -
Les systèmes de défenses antioxydantes
Le taux d’ERO cellulaire dépend également de leur dégradation ou inactivation par des
molécules antioxydantes. C’est la balance entre production et élimination des ERO qui
maintient l’homéostasie. Les antioxydants représentent l’ensemble des molécules susceptibles
d’inhiber directement la production, de limiter la propagation ou de détruire les ERO (Sies,
1997)
Il existe 3 types de défenses :
• Les enzymes qui existent à l’état endogène, défendent les cellules contre les radicaux libres.
Les principaux systèmes enzymatiques comprennent les superoxydes dismutases (SOD) dans
les mitochondries et le cytosol, la catalase dans le peroxysome, les enzymes dépendantes du
glutathion, glutathion-peroxydase et glutathion-réductase (Gpx et GRase) dans le cytosol et la
matrice mitochondriale, et le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase. Les SOD sont des
enzymes dépendantes de métaux comme le cuivre, le zinc (Cu/ Zn SOD dans le cytosol) et le
manganèse (MnSOD dans les mitochondries) qui capturent le radical superoxyde et le
dégradent en peroxyde d’hydrogène et en oxygène. La catalase quant à elle, dégrade le
peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène.
Figure 9 : Exemple de réactions enzymatiques conduisant à l’élimination des ERO dans la cellule
Les 3 enzymes majeures du système antioxydant sont la superoxyde dismutase (MnSOD), la
catalase et la glutathion peroxydase (Gpx))
ವ Les protéines chélatrices du fer, comme la transferrine, la ferritine et l’hémosidérine, ou du
cuivre comme la céruloplasmine et l’albumine : ce système bloque les ions métalliques
impliqués dans la réaction de Fenton.
- 36 -
• Les molécules antioxydantes ou piégeurs de radicaux libres comme la vitamine E connue
pour son activité anti-radicalaire très puissante : elle intervient au niveau des membranes
lipidiques. Comme autres composés piégeurs majeurs, on peut citer la vitamine C, les
caroténoïdes, l’acide urique, le glutathion et les thiols, les métallothionéines. Le glutathion et
la thiorédoxine (Wu et al., 2004) sont de petites molécules antioxydantes. Le glutathion
(γglutamyl-cysteinyl-glycine ou GSH), la thioredoxine (Trx) comme la glutaredoxine (Grx)
sont de petites protéines présentes dans le cytosol possédant un site actif (Holmgren et al.,
2005) qui permet de réduire les thiols.
Conséquences du dérèglement de la balance antioxydante.
Les ERO peuvent provoquer de nombreux dommages à l’ADN et aux protéines nécessaires
au maintien des fonctions cellulaires, et dégrader les lipides au cours de la peroxydation
lipidique. La cellule est capable de se défendre contre ces attaques grâce à un système
enzymatique élaboré (SOD, catalase, Gpx…) mais aussi grâce à de nombreuses molécules
antioxydantes (glutathion, acide-L-ascorbique, vitamine E…). Cependant, ce système de
défense a ses limites. Lorsque la cellule vient à accumuler une trop grande quantité d’ERO,
les défenses ne sont plus suffisantes et les dommages moléculaires, notamment à l’ADN, sont
trop importants pour être réparés, ce qui induit à terme la mort cellulaire. Selon Harman
(1956), le vieillissement serait dû à l’accumulation d’ERO au cours de la vie de l’organisme ;
un individu aura donc un risque de mortalité d’autant plus élevé que son âge augmente.
La théorie radicalaire du vieillissement est étayée par de nombreuses études qui prouvent que
les animaux qui possèdent un niveau métabolique élevé ont une durée de vie plus courte
(Radak et al., 2004 ; Frisard et Ravussin, 2006). Cependant, en 2005, Olshansky et Rattan
émettent des doutes sur la validité de cette théorie. Ils réfutent cette dernière grâce à plusieurs
arguments dont : le taux de mortalité qui plafonne chez certaines espèces (l’humain compris)
à partir d’un certain âge, des exceptions dans le rapport taille/espérance de vie, établi par
Harman, avec l’exemple de certains oiseaux (Austad et Fisher, 1991 ; Austad, 1997). De plus,
certains animaux ne semblent pas subir les effets physiologiques du vieillissement (Finch,
2009) : certaines tortues vivent à des âges très avancés, ne montrant aucun signe de
sénescence et sont parfois capables de pondre plus d’œufs que la moyenne des jeunes adultes.
Enfin, l’ajout au régime alimentaire d‘antioxydants ne semble pas forcément être synonyme
de longévité (Rattan, 2004). En effet, la plupart des antioxydants ont une action pro oxydante
- 37 -
à forte dose et antioxydante à des doses maîtrisées. Olshanski reprend alors la théorie du
mathématicien/biologiste Demetrius, qui en 2004 a émis l’hypothèse de la stabilité
métabolique, partant du postulat que ce qui s’applique aux autres espèces animales ne
s’applique pas forcément à l’être humain qui a une maturité sexuelle tardive, une longue
période de reproduction, une taille réduite de litière et une entropie élevée. Cette hypothèse
rend la progression du vieillissement dépendante de la capacité des cellules à résister à des
niveaux variables de métabolites. La stabilité métabolique peut se mesurer par le taux de
retour à un état d’équilibre après sa perturbation. De ce fait, des espèces peuvent avoir des
durées de vie très différentes mais des caractéristiques cellulaires, tissulaires et biochimiques
identiques : ce qui les distingue, c’est la capacité des cellules à maintenir un état d’équilibre.
Il est largement admis que le stress oxydant joue un rôle important dans le vieillissement de
l’organisme (Kohen et al., 2002 ; Muller et al., 2007). Il n’y a, à l’heure actuelle, plus aucun
doute sur le rôle du stress oxydant particulièrement dans le vieillissement de la peau
(Hosokawa, 2002) ; de même, Komura et ses collaborateurs (1988) ont démontré
l’augmentation du taux de peroxydation lipidique dans les cellules du tissu cutané.
La théorie radicalaire du vieillissement et l’hypothèse de la stabilité métabolique impliquent
des plans d’action très différents pour lutter contre le vieillissement: soit par l’augmentation
des capacités antioxydantes de l’organisme, soit par l’augmentation des capacités de la cellule
pour le maintien d’un état d’équilibre.
Cette première théorie radicalaire a mené ensuite à la théorie mitochondriale du vieillissement
ou MTA (Mitochondrial Theory of Aging) (Jang et Remmen, 2009). La mitochondrie est le
siège du métabolisme de l’oxygène. La chaîne respiratoire est localisée dans la membrane
interne de la mitochondrie, et l’ADN mitochondrial (ADNmt) moins pourvu en histones est
aussi beaucoup plus vulnérable aux lésions radicalaires que l’ADN nucléaire. Avec le temps,
les mitochondries accumulent des dommages sur leur matériel génétique. Le résultat est une
perte progressive de la quantité de mitochondries opérationnelles pour une production
optimale d’énergie à la cellule. Le vieillissement s’accompagne donc de la perte progressive
des fonctions mitochondriales des cellules (Alexeyev, 2009). Une preuve supplémentaire du
rôle des ERO dans le vieillissement est leur implication dans de nombreuses maladies liées à
l’âge.
- 38 -
Implication du stress oxydant dans les pathologies liées au vieillissement
Des études ont révélé l’intervention du stress oxydant dans des pathologies ayant un lien avec
le vieillissement. Subbarao et al. (1990) ont suggéré un rôle du stress oxydant dans la maladie
d’Alzheimer suite à l’observation de l’augmentation de la peroxydation lipidique, de
l’oxydation des protéines (Smith et al., 1985), de l’altération de l’ADN mitochondrial
(Mecocci et al., 1994) et de l’augmentation de 50% de l’activité de la Cu/Zn SOD) (Marklund
et al., 1985) dans le cerveau de patients atteints par la maladie. Ensuite, Di Monte et ses
collaborateurs ont révélés une diminution de la quantité de glutathion réduit et de l’activité du
complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale (1992) dans la maladie de parkinson.
Enfin, La maladie de Huntington Gilford, aussi appelée la chorée de Huntington a été décrite
par George Huntington en 1972. De nombreuses études ont prouvé l’implication du stress
oxydant dans la survenue de cette maladie (Kumar et al., 2010).
Cependant, la théorie radicalaire du vieillissement peut être mise en doute. Les ERO ne
seraient pas la cause du vieillissement mais accompagneraient le processus à travers la
réponse de l’organisme en servant notamment de signaux intrinsèques (Hekimi, 2011). Ce qui
demeure certain, c’est que le raccourcissement des télomères et l’accumulation d’ERO sont
des processus qui interviennent dans le vieillissement de toutes les cellules de l’organisme. En
outre, le vieillissement cutané dépend également de nombreux phénomènes de moindre
importance émanant du dysfonctionnement simultané d’autres organes.
iii.
Les autres origines intrinsèques du vieillissement
Une des causes directes du vieillissement des cellules de la peau est la baisse de production,
par celle-ci, de la matrice extracellulaire (MEC), et donc une perturbation des fibres élastiques
de la peau comme le collagène. La perturbation de la MEC aboutit au relâchement progressif
de la peau au cours du vieillissement. Nous pouvons citer également des dérèglements
endocriniens, le vieillissement du système immunitaire ainsi que l’accumulation par les
cellules de mutations spontanées de l’ADN.
- 39 -
Parmi les dérèglements hormonaux, les plus connus sont le déclin de l’activité des stéroïdes
sexuels (estrogènes, testostérone) et la déhydroépiandrostérone (DHEA). En effet, la quantité
d’hormones circulantes diminue avec le temps (Makrantonaki et Zouboulis, 2007a) :
hormones de croissance, IGF-1, œstrogènes et androgènes. Raine-Fenning et ses
collaborateurs (2003) ont démontré la présence de récepteurs aux estrogènes dans la peau. Un
taux trop bas d’estrogènes, associé au vieillissement intrinsèque, aggrave ce vieillissement.
Au moment de la ménopause chez les femmes, la baisse du taux d’hormones dans le sang a
pour conséquence la diminution du contenu en collagène et de l’épaisseur de la MEC. La
diminution des estrogènes dans la peau affecte à la fois le derme et l’épiderme. Il y a
diminution du nombre de fibroblastes, et ceux qui subsistent produisent 30% de collagène en
moins (Giardina, 2010), ce qui induit à terme une diminution de la résistance et de l’élasticité
de la peau.
Tous ces processus aboutissent à la perturbation de l’homéostasie cellulaire et par conséquent
au vieillissement cutané.
Le vieillissement cutané intrinsèque, donc physiologique, peut être aggravé par des facteurs
externes présents dans l’environnement direct en contact avec l’organisme.
- 40 -
3. Voie extrinsèque
Soleil, tabac, stress, alimentation, maladie endocrinienne, pollution… tous ces éléments, seuls
ou cumulés, induisent des altérations de la structure de la peau, de sa fonction et de son
apparence.
i.
Les ultra-violets (UV)
La principale source de vieillissement cutané extrinsèque correspond aux rayonnements UV.
D’ailleurs, de nombreux travaux utilisent les rayonnements UV pour mimer et étudier les
mécanismes de vieillissement cutané (Bernerd et Asselineau, 2008). En effet, les UV
induisent le photo-vieillissement (Wenk et al., 2001 ; Wlaschek et al., 2001 ; Laga et Murphy,
2009) et au sein du laboratoire nous avons montré que les UVB modifiaient sensiblement les
défenses antioxydantes des fibroblastes en culture primaire (Saguet et al., 2006) avec des
effets différents selon la nature, photoexposée ou non, de la zone de prélèvement des
fibroblastes. Ainsi, il a été largement montré que le photo-vieillissement dépend du degré
d’exposition, du type de peau, et induit des mécanismes moléculaires qui affectent les cellules
de la peau (Situm et al., 2010). Les UV aggravent notamment le phénomène de glycation de
la peau (Pageon et al., 2010). C’est une modification post-traductionnelle des protéines qui
résulte de la réaction non enzymatique entre un sucre et une fonction amine libre d’un acide
aminé d’une protéine. Elle produit des intermédiaires instables qui aboutissent à
l’accumulation des produits de glycation avancée ou AGE (Advanced Glycation
Endproducts). C’est le phénomène de stress oxydant induit par les UV au niveau cutané qui
aggrave le phénomène de glycation. D’ailleurs, glycation et stress oxydant sont très liés, et
souvent regroupés sous le terme de «glycoxydation». Au sein de l’épiderme, les UVB
induisent un phénomène de photoprotection endogène, caractérisé notamment par la
prolifération des kératinocytes qui se traduit par l’épaississement de la peau. Les
kératinocytes subissent alors un retard de différenciation et une induction de l’apoptose.
- 41 -
La plus grande partie des UVB est absorbée par l’épiderme et provoque des dommages à
l’ADN (fig. 10) chez les kératinocytes et les mélanocytes notamment par l’apparition de
dimères de thymidine (Puizina-Ivic, 2008). Les UVA pénètrent plus profondément dans le
derme et affectent à la fois le derme et l’épiderme. Dans le derme, les UVA affectent la MEC
et donc les propriétés mécaniques de la peau, notamment en activant les métalloprotéases
matricielles.
Sites d’action de
l’acide rétinoïque
Figure 10 : Modèle hypothétique des mécanismes physiopathologiques du photovieillissement
(Passeron and Ortonne, 2003).
ii.
La pollution
La pollution de l’air, par la fumée de cigarette (Biver-Dalle et Humbert, 2010) ou les gaz
d’échappement, peut provoquer un vieillissement prématuré de la peau. De plus, l’activité
photochimique due à la réduction des composés polluants en présence de soleil affecte
l’épiderme (Puizina-Ivic, 2008). En outre, les cosmétiques eux-mêmes, par leur composition,
peuvent potentialiser les conséquences des UV sur les kératinocytes (Handa et al., 2006).
- 42 -
Le contact de la peau avec des polluants chimiques peut également provoquer un
vieillissement cutané prématuré. En effet, Valacchi et ses collaborateurs (2004) ont démontré
chez les souris l’induction de l’hème oxygénase 1, de la cyclooxygénase 2, et de la protéine
PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), l’activation du facteur nucléaire κB dans la peau
après une exposition à l’ozone. De plus, il est prouvé que des métaux lourds, tel que le
cadmium, sont capables d’induire l’apoptose chez les cellules épithéliales cutanées (Son et
al., 2010) : le cadmium est toxique à de faibles doses et induit le stress oxydant. Il se retrouve
comme contaminant dans les sédiments, l’air, l’eau (Waisberg et al., 2003) dans l’agriculture
et les rejets industriels, dans la fumée de cigarette (Fassett, 1975 ; He et al., 2005 ; Jarup,
2003 ; Trinchella et al., 2006)
L’utilisation accru de pesticides à travers le monde est une source de toxicité non négligeable
pour l’homme (Bateman, 2003) et constitue notamment un facteur environnemental de
survenue de cancers (Irigaray et al., 2007). L’utilisation de ces pesticides provoque une
pollution environnementale qui, comme ces autres composés, peuvent constituer un facteur
non négligeable de vieillissement prématuré de la peau, dû à l’usage quotidien de ces
produits. Aucune étude directe n’existe sur cette forme cytotoxique de vieillissement en
particulier car peu de travaux sont rapportés sur l’effet des pesticides sur la peau et en
particulier sur son vieillissement. On peut cependant citer une étude récente en
chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse sur l’effet d’organosphosphates
sur des prélévements de callosités plantaires (Verstappen et al., 2012). Ce pesticide
provoquerait la modification des kératines 1/6 et 10 au niveau d’une tyrosine
iii.
Agression chimique environnementale et vieillissement cutané
Les pesticides chimiques sont généralement divisés en quatre grands groupes : les
insecticides, les herbicides, les fongicides et les rodenticides (Abdollahi et al., 2004). On peut
citer parmi les familles d’herbicides les phénols nitrés, les benzonitriles, les carbamates, les
urées substituées ou encore les amides, les triazines.
Le glyphosate est un herbicide mais ne peut être classé dans aucune des familles citées cidessus. Il est le principe actif du Roundup commercialisé par Monsanto. Depuis 2000, le
brevet fait partie du domaine public et d’autres sociétés le commercialisent sous d’autres
appellations. Ses caractéristiques structurales et actives seront évoquées plus loin (§ V.1.iii.).
- 43 -
Le glyphosate présente également un danger pour l’environnement. En effet, après
pulvérisation, il reste présent dans les sols et les cours d’eau provoquant ainsi des dégâts sur
la faune et la flore (Slaninova et al., 2009).
Le glyphosate est toxique pour l’homme, mais la voie de synthèse visée chez les plantes étant
absente chez les animaux, le glyphosate fut supposé de faible toxicité chez ces derniers. Or,
dès 1963, Martin émet des réserves sur l’utilisation de cet herbicide. L’inhibition de la
croissance de la plante due à l’herbicide est diminuée par l’application d’un mélange de
phénylalanine, tyrosine et de tryptophane, ce qui montre une interférence du glyphosate dans
le métabolisme des acides aminés aromatiques. Désormais, il existe de nombreuses preuves
qui attestent de la dangerosité de cette molécule sur les animaux, dont récemment celle
apportée par Modesto et al. (2010) et notamment sur l’homme.
Malgré les protections recommandées par les fabricants, l’utilisation itérative d’un herbicide
en milieu professionnel comme en milieu privé, comporte des risques. Parmi les symptômes,
on peut citer les plus courants (Goldstein et al., 2002) : oculaires (48%), cutanés (30%),
digestifs (17%), céphalées (10%), neurologiques (9%), généraux (8%), respiratoires (8%)....
d’où la légitimité de s’interroger sur les conséquences d’une exposition de la barrière cutanée
au glyphosate. Les travaux sur la mortalité cellulaire induite par les herbicides ou les
pesticides sont nombreux (Kitazawa et al., 2001 ; Saleh et al., 2003 ; Tuschl et Schwab 2003 ;
Gonzales-Polo et al., 2004 ; Mc Carthy et al., 2004 ; Marc et al., 2004 ; Olgun et al., 2004 ;
Peng et al., 2004 ; Perez-Maldonado et al., 2004 ; Sun et al., 2005, Miller et al., 2007 ;
Gasnier et al., 2009) mais peu traitent de la toxicité cutanée de telles molécules.
- 44 -
IV.
La mort cellulaire
Ce paragraphe n’est pas destiné à détailler tous les aspects de la mort cellulaire programmée,
mais vise principalement à préciser le contexte de notre étude dans notre approche de la mort
cellulaire, de façon la plus exhaustive possible dans l’état actuel des connaissances.
1. Les multiples voies d’induction de mort cellulaire
Le processus de mort cellulaire a longtemps été considéré comme réversible tant que la
cellule n’avait pas atteint un point de non-retour dépendant le plus souvent de mécanismes
biochimiques.
LE NCCD ((Nomenclature Committee on Cell Death) (Kroemer et al., 2005, 2009 ; Galluzzi
et al., 2012)a donc défini une cellule mourante selon des critères morphologiques : la perte
d’intégrité membranaire (permettant l’incorporation de colorants vitaux), la fragmentation de
la cellule et de son noyau, et/ou l’internalisation de ces fragments par les cellules adjacentes.
Il existe différents types de mort cellulaire : l’apoptose, l’autophagie, la nécrose et la
catastrophe mitotique sont les plus citées. Les cellules qui montrent un arrêt du cycle
cellulaire ne sont plus considérées comme des cellules mourantes mais sénescentes. La mort
cellulaire programmée est considérée comme un processus dynamique mettant en jeu
différents mécanismes conduisant à la mort des cellules. Les mécanismes de cornification,
d’autophagie, de nécrose, d’apoptose et de mort cellulaire caspase-indépendante sont décrits
et comparés ci-après.
2. La cornification
La cornification est un mécanisme de mort cellulaire spécifique aux kératinocytes au cours de
leur différenciation finale pour la composition du stratum corneum (cf §II.2.i. et fig. 3). Les
cellules ayant accompli la cornification sont les cornéocytes, des cellules anucléées, contenant
une grande quantité de protéines comme des kératines, la loricrine, l’involucrine, ainsi que
des lipides qui composeront le milieu extracellulaire. Elles assurent ainsi la fonction de
barrière biologique de l’épiderme. Le mécanisme de cornification nécessite l’intervention
d’enzymes : la caspase 14, et les transglutaminases 1, 3 et 5.
- 45 -
3. L’autophagie
Elle se caractérise morphologiquement par la formation massive de vacuoles dans le
cytoplasme et l’absence de condensation de la chromatine. Le matériel cellulaire est séquestré
par des autophagosomes qui, en fusionnant avec les lysosomes, deviendront des
autolysosomes.
4. La nécrose
La nécrose intervient dans de nombreux phénomènes physiologiques :
-
Le développement des mammifères, notamment dans l’élimination des chondrocytes
(Roach et Clarke, 2000)
-
L’homéostasie tissulaire chez l’adulte (Barkla et Gibson, 1999)
La mort cellulaire par nécrose, diversement nommée (mort cellulaire de type 3, necrosis cell
death ou NCD) entre désormais dans la classe des morts cellulaires programmées alors qu’elle
a souvent été considérée comme une voie de mort par défaut (Goldstein et al., 2003). En effet,
Denecker et son équipe (2001) ont une définition « négative » de la nécrose, selon laquelle
une cellule nécrotique est une cellule qui ne présente ni les caractéristiques de l’autophagie ni
les caractéristiques de l’apoptose. Okada et Mak, ont proposé en 2004, une définition
« positive » de la nécrose à travers quelques caractéristiques telles que :
-
Rupture rapide de la membrane plasmique
-
Entrée d’eau et d’électrolytes
-
Dilatation du cytoplasme et des organites
-
La fragmentation irrégulière de l’ADN
Cependant, aucun consensus n’a encore été trouvé quant aux marqueurs biochimiques de la
survenue de la nécrose. En effet, il existe plusieurs mécanismes de la nécrose. La nécroptose,
par exemple, est un type de nécrose dépendant des récepteurs de mort, qui fait intervenir les
kinases RIPK 1 et RIPK 3 (Vanlangenakker et al., 2012). Elle survient lors de l’activation des
récepteurs de mort chez des cellules incapables d’enclencher l’activation des caspases.
- 46 -
5. Apoptose
Le terme apoptose a d’abord été employé par Kerr, Wyllie et Currie en 1972. Il fait référence
à la chute programmée des feuilles d’arbres (apo : éloignement et ptose : chute). L’apoptose
fait partie de la physiologie normale de l’organisme et est hautement conservée, des
eucaryotes unicellulaires aux mammifères (Arnoult et al., 2002 ; Fadeel et Orrenius, 2005) ;
elle joue un rôle majeur dans le développement (Clarke, 1990) et le maintien de l’homéostasie
cellulaire (Lippens et al., 2009), mais elle intervient également dans le phénomène naturel du
vieillissement. Elle apparait aussi comme une défense dans le système immunitaire en
réponse à une agression par un agent toxique (Norbury et Hickson, 2001). Toute anomalie de
l’apoptose peut être responsable de pathologies comme, par exemple, le cancer dans le cas de
l’absence d’apoptose, ou des maladies neurodégénératives dans le cas d’un excès d’apoptose.
i.
Chronologie de la survenue de l’apoptose
La première étape est le phénomène appelé pyknosis, c’est-à-dire la perte de contact entre les
cellules avec condensation du cytoplasme et diminution importante du volume cellulaire
visible en microscopie optique par l’arrondissement des cellules et le retrait des pseudopodes
(Kerr et al., 1972). L’atteinte des mitochondries se manifeste par la diminution du potentiel de
membrane mitochondrial (Marchetti et al., 1996 ; Zanzami et al., 1996) et le relargage, dans
le cytoplasme, de molécules proapoptotiques comme le cytochrome c (Kluck et al., 1997).
Cependant, il est important de signaler que, selon la voie d’induction de l’apoptose (voir
§IV.3.iii.), l’atteinte de la mitochondrie se produit plus ou moins précocement. La chromatine
se condense et le noyau se fragmente (karyorrhexis). L’ADN est fragmenté en morceaux de
180 paires de bases (Wyllie, 1980). Enfin, la membrane plasmique bourgeonne, et
apparaissent des corps apoptotiques. La translocation de la phosphatidylsérine à l’extérieur de
la membrane plasmique est un phénomène caractéristique de l’apoptose, et permet aux
cellules environnantes de reconnaître et de phagocyter les corps apoptotiques (Malissein,
2005).
- 47 -
ii.
Distinguer l’apoptose de la nécrose
Une des grandes différences qui existent entre la nécrose et l’apoptose réside dans la
conservation, au moins dans ses phases les plus précoces, de l’intégrité de la membrane
plasmique, évitant ainsi, dans le cas de l’apoptose, le déversement du contenu cellulaire et
l’atteinte des cellules voisines. L’externalisation de la phosphatidylsérine est, elle aussi,
propre à l’apoptose. Si la fragmentation de l’ADN est une étape
commune aux 2
mécanismes, les fragments produits lors de l’apoptose ont tous la même taille et donnent un
profil électrophorétique dit « en barreaux d’échelle ».
Pendant la survenue d’une des morts, la cellule peut basculer vers l’autre, en raison de
changements du contexte biochimique et fonctionnel de la cellule. Les conditions de survenue
de l’une ou l’autre des morts ne sont pas communes à tous les types cellulaires, et dépendent
de l’intensité, la durée, la nature du signal de mort, l’état de développement du tissu et le
milieu physiologique (Fiers et al., 1999 ; Zeiss, 2003 ; Elmore et al., 2007).
iii.
La mitochondrie, un organite essentiel
Nous l’avons rappelé plus haut, les mitochondries sont les organites producteurs d’énergie de
la cellule grâce à la métabolisation de l’oxygène. Selon le type cellulaire et son besoin en
énergie, le nombre de mitochondries par cellule peut varier de 1000 à 1600.
Elles sont composées de 2 membranes, une externe au contact du cytoplasme, et une interne
séparant la matrice mitochondriale de l’espace inter-membranaire. La membrane externe est
composée de nombreuses protéines transmembranaires comme les porines qui permettent la
circulation passive de tous les petits métabolites hydrophiles. La membrane interne contient
principalement les protéines impliquées dans la chaine respiratoire, et des lipides particuliers,
les cardiolipines, qui la rendent imperméable aux ions, ce qui permet la formation du gradient
de protons nécessaire au fonctionnement de la chaîne respiratoire.
- 48 -
Ce gradient est la base du potentiel de membrane mitochondrial qui est utilisé par le complexe
V de la chaîne respiratoire pour la synthèse de l’ATP. Le maintien de ce gradient est donc
vital pour la cellule. Lors de l’apoptose, l’intégrité des mitochondries est atteinte, le potentiel
de membrane chute, le transport des électrons à travers la chaîne respiratoire est stoppé, et des
protéines de l’espace inter-membranaire sont libérées dans le cytosol à travers le pore de
transition de perméabilité (PTP). Cependant, ni les mécanismes de survenue de ces
événements, ni la composition exact du PTP, ni les acteurs moléculaires exacts, n’ont été
complètement identifiés avec certitudes. En outre, Bossy-Wetzel et ses collaborateurs (1998)
ont décrit la libération du cytochrome c et l’activation des caspases, indépendamment de toute
perturbation du potentiel de membrane mitochondrial et sans la l’activation du PTP.
iv.
Les voies de signalisation de l’apoptose
L’apoptose est un phénomène résultant d’une cascade de signalisation énergie-dépendante
impliquant les caspases. Ce terme regroupe les protéases apoptogènes avec le « C » pour la
cystéine de leur site actif, et « aspase » pour la spécificité du clivage du substrat toujours
après un acide aspartique.
Ce sont des enzymes protéolytiques réparties en différents groupes : les initiatrices (2, 8, 9 et
10), les effectrices (3, 6 et 7) et les inflammatoires (1, 4 et 5). Les caspases initiatrices
possèdent un pro-domaine long et ont la capacité de s’auto-activer par dimérisation ou
trimérisation. Leurs substrats sont les caspases effectrices qui possèdent un pro-domaine
court. L’intervention des caspases, dans ces cascades de signalisation, permet l’amplification
du signal pro-apoptotique de départ.
- 49 -
Figure 11 : Les événements de la cascade de signalisation apoptotique
Les 2 voies (intrinsèque et extrinsèque) d’induction de l’apoptose dans la cellule (d’après Elmore et
al., 2007)
L’apoptose peut survenir par l’activation de 2 voies : la voie intrinsèque ou mitochondriale,
et la voie extrinsèque ou voie des récepteurs de mort (fig. 11). La voie mitochondriale est
induite par un phénomène qui aura des conséquences internes sur la cellule comme l’hypoxie,
la présence de toxines, une infection virale, les ERO… ; l’atteinte mitochondriale est alors
précoce, et provoque l’ouverture du PTP mitochondrial qui induit la perte du potentiel de
membrane mitochondrial et la libération, dans le cytoplasme, de molécules pro-apoptotiques
de l’espace inter membranaire : le cytochrome c , une flavoprotéine de 50 kDa appelée AIF,
pour «Apoptosis Inducing Factor», et la protéine SMAC/DIABLO (Second Mitochondriaderived Activator of Caspases)/Direct IAP-Binding protein with LOw pI). Le cytochrome c
interagit avec la protéine cytosolique Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor) et avec la
- 50 -
procaspase 9, en présence de dATP pour former «l’apoptosome», complexe multi-protéique à
l’origine de l’activation de la caspase 9 (clivage auto-catalytique de la procaspase 9), puis de
la caspase 3. L’activation de la caspase 3 marque la première étape commune aux 2 voies
d’induction de l’apoptose.
La voie des récepteurs de mort a pour origine un facteur externe qui va activer des récepteurs
de la famille des récepteurs au TNF (Tumor Necrosis Factor) (Locksley et al., 2001). La
liaison des signaux de mort (TNF, Fas, Apo…) induit la formation d’un complexe multi
protéique cytoplasmique appelé DISC (Death-Inducing Signaling Complex) qui initie
l’enclenchement de la cascade apoptotique par activation de la procaspase 8 et de la caspase3.
L'utilisation d'inhibiteurs spécifiques des caspases a montré que les cellules peuvent mourir
aussi bien par des mécanismes impliquant les caspases que par des mécanismes indépendants
des caspases.
6. Une mort cellulaire caspase -indépendante ?
La protéine AIF, citée ci-dessus, est capable d’induire la mort cellulaire sans activation des
caspases (Larochette et al., 1999 ; Susin et al., 1999). Elle est considérée comme le principal
effecteur de la mort cellulaire caspase-indépendante. Elle est présente en majorité dans
membrane interne de la mitochondrie et l’espace intermembranaire. Cependant, un petit pool
de protéine AIF est localisé dans la membrane externe de la mitochondrie, exposée dans le
cytosol. Dans une cellule saine, elle a un rôle protecteur contre la production d’ERO grâce à
sa fonction oxydoréductase. Lors de la mort cellulaire, elle a essentiellement une activité proapoptotique nucléaire en provoquant la condensation de la chromatine ou la fragmentation de
l’ADN, en coopération avec les endonucléases nucléaires.
Mais l’AIF est aussi un effecteur de la mort dans la cellule en apoptose, puisqu’elle est
libérée, comme d’autres protéines, de l’espace inter-membranaire au moment de la chute du
potentiel de membrane mitochondrial.
Deux mécanismes de mort peuvent aboutir à l’action d’AIF de manière caspaseindépendante : la mort par nécroptose ou par parthanatos.
- 51 -
i.
La mort par nécrose régulée
Un type de mort par nécrose autre que la nécroptose a été décrit par Delavallée et ses
collaborateurs (2002). Dans ce cas, l’AIF est relargué de la mitochondrie après son clivage
par une protéase. Plusieurs protéases peuvent alors intervenir : sont évoquées les calpaïnes ou
les cathepsines. Le relargage dans le cytosol pourrait dépendre également de protéines proapoptotiques de la famille Bcl-2.
ii.
La mort par parthanatos
La poly-ADP-ribosylation est un mécanisme essentiel à la cellule pour la réparation de
l’ADN. Ce processus est régulé par les Poly-ADP-Ribose Polymérase (PARP) et les PolyADP-Ribose Glycohydrolases (PARG). La figure 12 présente leurs mécanismes d’action. En
cas de cassure de l’ADN, PARP utilise le βNAD+ pour transférer des ADP-riboses à des
protéines nucléaires acceptrices La réaction de poly-ADP-ribosylation se poursuit pour former
des poly-ADP-ribose (PAR) de longueur variable. PARG catalyse l’hydrolyse des PAR en
résidus ADP-ribose libres (Soldani et Scovassi, 2002).
Figure 12 : Réaction de poly-ADP ribosylation
(Soldani et Scovassi, 2002)
- 52 -
La PARP-1 est une protéine PARP qui contient deux sites à doigt de zinc ; elle est activée
suite à la dégradation de l’ADN. Elle procède à la poly-ADP-ribosylation, et même à l’autopoly-ADP-ribosylation. Pendant l’apoptose, PARP-1 joue 2 rôles opposés. Dans les cellules
en apoptose précoce présentant des cassures de l’ADN, PARP-1 participe à la réparation de
cet ADN. Après induction des caspases, la caspase 3 ou la caspase 7 inactive PARP-1 en la
clivant, mettant fin au processus de poly-ADP-ribosylation. Le clivage de PARP-1 est donc
utilisé comme marqueur de l’apoptose. PARP-1 est également clivé au cours de la nécrose
mais les fragments générés ne sont pas de la même taille.
La mort cellulaire après parthanatos fait intervenir le pool de protéine AIF exposé dans le
cytosol (Wang et al., 2011). L’accumulation de fragments d’ADN induit une grande quantité
de PAR dans le noyau. PAR va alors migrer dans le cytosol où il va interagir avec la partie
exposée de AIF à l’extérieur de la mitochondrie, et va induire un changement de conformation
chez AIF qui va provoquer sa libération dans le cytosol et son action pro-apototique dans le
noyau.
PARP-1 enclenche un mécanisme de mort cellulaire qui diffère, par certains points, avec les
autres types de mort. En effet, même si PARP-1 enclenche l’externalisation de la
phosphatidylsérine, la dissipation du potentiel de membrane mitochondrial, la condensation
de la chromatine, et la fragmentation de l’ADN (Delettre et al., 2006 ; Susin et al., 1999 ;
Wang et al., 2009 ; Yu et al., 2002), elle n’enclenche pas la formation de corps apoptotiques
ou la fragmentation régulière de l’ADN (donnant un profil électrophorétique en barreaux
d’échelle). Cependant, PARP induit l’atteinte de l’intégrité membranaire comme lors de la
nécrose (Wang et al., 2009 ; Yu et al., 2002). Ce type de mort a donc été appelé parthanatos
(pour PAR et thanatos : mort en grec) (Harraz et al., 2008 ; Wang et al., 2009). Il vient
compliquer l’étude de la mort cellulaire en constituant un mécanisme présentant à la fois
certaines caractéristiques de l’apoptose et de la nécrose.
- 53 -
iii.
La mort par activation de la LEI/LDNase II
La LEI (Leukocyte Elastase Inhibitor) est une molécule inhibitrice des sérine- protéases. Sous
l’action de signaux apoptotiques et lorsque la cellule est incapable de déclencher l’activation
des caspases, la LEI va subir des modifications post-traductionnelles qui vont la transformer
en endonucléase, la LDNase II qui, une fois transloquée au noyau, va induire l’apoptose. Ce
type de mort a été mis en évidence dans les cellules du cristallin et dans des cellules
cancéreuses (Torriglia et al., 2008). Cette voie d’induction de la mort peut interagir avec
d’autres voies d’induction de la mort caspase indépendante, et ainsi déclencher, par exemple,
l’accumulation de PAR dans le noyau et la mort par parthanatos qui en découle.
L’étude fondamentale du vieillissement cutané repose donc sur le choix d’un modèle d’étude
in vitro. Le modèle cellulaire d’investigation du vieillissement cutané, et la présentation des
différentes techniques employées pour son étude, font l’objet du paragraphe suivant.
- 54 -
V.
Choix du modèle cellulaire et des
technologies d’investigation du
vieillissement cutané
Divers modèles de vieillissement cutané sont proposés, dans le cadre de la recherche
fondamentale, clinique ou cosmétique, et dont l’enjeu réside souvent dans le choix du facteur
inducteur de ce vieillissement cutané, que ce soit le stress oxydant lui-même, les UV ou une
carence en vitamine par exemple (Keisala et al., 2009).
1. Les modèles de vieillissement cutané in vitro
Il existe 3 types de modèles d’étude du vieillissement cutané : sur cellules et sur peaux
reconstruites in vitro, et sur modèle animal in vivo, le plus souvent sur les souris.
Outre, les quelques modèles cités précédemment, nous nous intéressons ici, plus
particulièrement aux modèles in vitro. Les modèles cellulaires recensés dans la littérature
concernent le plus souvent les fibroblastes, pour leur rôle dans l’élasticité de la peau et leur
capacité de production de la MEC. Chang et al. (2008, 2010) étudient le rôle du récepteur
hépatique x chez les fibroblastes, mais aussi chez les kératinocytes, et s’intéresse, de la même
manière au récepteur d’estrogènes de type β. Makrantonaki et son équipe (2006, 2008)
étudient l’effet des hormones et de leur niveau de production à un âge avancé sur le
vieillissement d’origine hormonal, chez les sébocytes et les fibroblastes.
L’équipe bisontine du Pr. P. Humbert s’emploie à mettre au point des modèles d’étude du
vieillissement de la peau, in vivo ou in vitro présentant les rides comme caractéristiques
(Humbert et al., 2012a et b) en s’attachant, entre autres, à en reproduire les propriétés
mécaniques (Rolin et al. 2011).
Enfin, L’Oréal a, depuis une dizaine d’années, contribué très largement, tant sur le plan
scientifique que commercial, au développement de modèles de peau reconstruite in vitro
puisque la législation imposait le remplacement des tests sur l’animal par des tests alternatifs
in vitro. Les modèles de peaux reconstruites sont soit des modèles de derme reconstruit, soit
des modèles d’épiderme reconstruit, ou encore des modèles de peau entière (substitut
d’épiderme reconstruit sur substitut de derme) reconstruite in vitro. Pageon (2010) et ses
- 55 -
collaborateurs (2007) ont notamment prouvé l’intérêt de l’étude des effets de la glycation du
collagène sur ces modèles de peaux reconstruites, comme modèle de vieillissement cutané.
Dans leur revue, Poumay et Coquette (2007) présentent les progrès et les enjeux de la
reconstruction d’épiderme in vitro, et Lebonvallet et ses collaborateurs (2010) ont fait
l’historique de ces techniques de la mono- et la co-culture cellulaire aux modèles
organotypiques, ainsi que les limites et les avantages de ces différentes approches in vitro.
Qu’elles soient sur cellules ou sur peaux reconstruites, la majorité des études cible le rôle du
derme dans le vieillissement cutané ; mais nous l’avons démontré, l’épiderme, à travers sa
fonction vitale de barrière biologique de l’organisme, présente un intérêt certain dans
l’exploration du vieillissement cutané. Nous avons donc choisi d’étudier l’impact d’une
pollution environnementale agraire sur une lignée de kératinocytaire humaine, ceci constituant
ainsi notre modèle « glyphosate / cellules HaCaT » de vieillissement cutané. Au-delà de la
nature épidermique de ces cellules, c’est la source « infinie » de cellules identiques
disponibles pour la mise au point de notre étude multi-échelle qui présente un intérêt certain
comparé à la culture primaire de cellules issues de donneurs, dont la nature aléatoire et fragile
aurait compliqué dans un premier temps la réalisation des travaux de thèse.
2. Le
modèle
« glyphosate
/
HaCaT »
comme
sujet
d’étude in vitro
Cette thèse représente une étape en amont, relative à l’étude de l’impact d’un traitement
chimique (pesticide) réalisé par l’homme, sur lui-même et sur la pollution environnementale.
Le modèle cellulaire in vitro choisi "pesticide-cellule cutanée" est utilisé pour révéler et
comprendre les dysfonctionnements des mécanismes liés aux capacités défectueuses de
défenses contre le phénomène de stress oxydant apparaissant lors du processus de
vieillissement.
- 56 -
i.
Les cellules HaCaT
La lignée utilisée comme support à notre étude est la lignée cellulaire HaCaT. Elle tire son
nom du fait que ce sont des cellules Humaines adultes, et cultivées en présence de faibles
concentrations de Calcium à une Température élevée (38,5°C). Ce modèle résulte de
l’immortalisation spontanée de kératinocytes humains qui a été réalisée de trois manières
différentes (Gehin, 2006b):
-
L’équipe de Boukamp a réalisé en 1988, l’immortalisation spontanée des cellules
HaCaT après 140 divisions cellulaires dans un milieu avec une faible concentration en
calcium et une température élevée (38,5°C) engendrant ainsi la perte de gènes de
sénescence. L’émergence spontanée de la lignée cellulaire HaCaT, dans une culture à
long terme, de kératinocytes adultes, se produit graduellement à travers différents
stades accompagnés par des changements génétiques visibles comme des altérations
chromosomiques (Boukamp et al., 1988, 1997). C’est le cas de la lignée utilisée pour
notre étude.
-
L’immortalisation peut être également obtenue sur ces cellules après seulement deux
générations, suivies d’une irradiation aux rayonnements ultra-violets (UV). Les
mécanismes régulant normalement les réparations de l’ADN endommagé sont
perturbés ou perdus lors de l’immortalisation. En fait après irradiation, les cellules
HaCaT, cultivées dans un milieu appauvri en calcium et avec une température de
38,5°c, présentent un nombre croissant de cassures et de translocations
chromosomiques. Ainsi ces conditions pourraient contribuer à l’augmentation du taux
d’altérations génétiques durant le processus d’immortalisation des cellules HaCaT.
-
Enfin, les cellules peuvent subir, au fil de leurs divisions, une perte de l’ADN des
télomères, à moins que n’intervienne une enzyme très particulière, la télomérase (cf.
§III.4.i.). Dans les cellules HaCaT, l’activité de la télomérase est significativement
augmentée dès la première division cellulaire réalisée, ce qui suggère une contribution
de la télomérase dans le processus d’immortalisation des cellules HaCaT.
- 57 -
Cependant, les cellules HaCaT utilisées sont mutées au niveau du gène de p53 (Boukamp et
al., 1988 ; Fusenig et Boukamp, 1998), qui code pour une protéine P53 sentinelle du génome
(Nzengue, 2008). Cela compromet sa stabilité et sa capacité à activer ses gènes cibles
(inhibition de la transactivation, de l’arrêt du cycle cellulaire en phase G1, incapacité à induire
l’apoptose en réponse aux dommages de l’ADN) (Johnson et al., 2005; Lehman et al., 1993).
Bien qu’immortelles et ayant des altérations génétiques, les cellules de la lignée HaCaT ont
largement conservé leur capacité à reconstituer un épiderme bien structuré après
transplantation in vivo. De ce fait, les cellules HaCaT peuvent être considérées comme un
modèle de kératinocytes.
ii.
Avantages et limites de l’utilisation d’une lignée cellulaire
La culture cellulaire doit faire l’objet d’une grande maîtrise pour éviter toute contamination
qui viendrait perturber ou retarder l’avancer des recherches. De plus, l’utilisation d’un modèle
cellulaire ne permet pas d’étudier les interactions avec d’autres types cellulaires qui
composent l’épiderme et la peau. Cependant, la prise en compte de ce type d’interactions
vient considérablement compliquer l’étude, de même que l’utilisation de culture primaire fait
intervenir des paramètres d’âge de sexe et d’exposition à l’environnement du donneur.
L’intérêt de l’utilisation des cellules HaCaT est de disposer d’une quantité illimitée de
cellules identiques, ce qui permet de garantir une reproductibilité élevée, rapidement, à faible
coût. Ce type de modèle permet d’évaluer de façon indépendante l’effet de l’environnement
ou d’un traitement sur le phénotype des cellules. En outre, Cette lignée est, par ailleurs, bien
connue au sein du laboratoire : une première étude de l’effet du glyphosate sur les cellules
HaCaT a donné lieu à une thèse d’université (Gehin et al., 2004, 2006 a et b) et a permis
d’établir le profil biochimique du stress oxydant intracellulaire induit chimiquement par le
glyphosate. Ce stress oxydant se caractérise notamment par une atteinte significative des
défenses intracellulaires, doublée d’une altération membranaire se traduisant par une
peroxydation lipidique. Son étude atteste avec certitude de l’intérêt du modèle
« glyphosate/HaCaT » dans l’étude du stress oxydant.
- 58 -
iii.
Le glyphosate
L’agent chimique utilisé comme inducteur du stress oxydant dans notre modèle de
vieillissement cutané in vitro est le glyphosate.
Un herbicide
Les herbicides sont des substances chimiques qui font partie du groupe des produits
phytosanitaires plus communément désignés sous l’appellation anglaise de pesticides (du latin
pestis, peste et cidere tuer). Ceux-ci sont généralement composés de deux types de
substances :
-
Le principe actif qui confère au produit l’effet poison désiré.
-
Des adjuvants qui stabilisent la formulation et renforcent l’efficacité du produit.
Structure et principe d’action
Le glyphosate ou N-(phosphométhyl-)glycine est un analogue de la glycine doté d’un
groupement phosphonate (fig. 13). C’est une molécule de faible poids moléculaire (169.07
g.mol-1), polaire, modérément soluble dans l’eau (12 g.L-1), et insoluble dans les solvants
organiques.
Figure 13 : Structure chimique du glyphosate
C’est un herbicide non sélectif de la famille des aminophosphates, synthétisé pour la première
fois en 1950 par Henri Martin à Schaffhouse (Suisse). Pendant 20 ans, il restera un produit
d’intérêt secondaire, lorsqu’en 1970 J.E. Frantz, un chimiste de la compagnie Monsanto,
découvre ses propriétés herbicides. Un brevet est déposé en 1974, il est désormais du domaine
public et entre dans la composition de nombreuses formulations commerciales.
- 59 -
La molécule seule ne peut pénétrer dans les cellules, les formules désherbantes dans
lesquelles elle est utilisée contiennent des adjuvants qui la rendent active sur la vie cellulaire
(Williams et al., 2000 ; Marc et al., 2002). Celui qui prédomine est l'huile de suif
polyéthoxylatée (Polyethoxylated tallowamine = POEA) qui permet la pénétration dans la
plante par la destruction de la cuticule.
L’action phytotoxique du glyphosate est due à l’inhibition de l’enzyme 5-enolpyruvoylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) impliquée dans la voie métabolique de l’acide
shikimique laquelle est nécessaire pour la synthèse des acides aminés aromatiques mobiles
dans le phloème (Schönbrunn et al., 2001). L’effet sur l’homme (cf. §III.3.iv.) est à l’heure
actuelle encore controversée. La revue récente de Williams et ses co-auteurs (2012) mettent
encore en doute une possible toxicité du glyphosate chez l’animal en s’appuyant sur les études
utilisant l’herbicide dans sa formulation complète et insistant les effets des surfactants seul
responsables de sa toxicité. Cependant, cette molécule demeure au centre d’une controverse
au niveau mondial notamment grâce aux travaux du Français G.E.Seralini et de l’Argentin A
Carrasco. Les travaux de l’équipe de ce dernier sur les embryons de Xénope (Paganelli et al.,
2010) ont fait l’objet d’échanges entre A. Carrasco et la firme Monsanto, qui réfute ses
travaux, dans le journal Chemical Research in Toxicology (Carrasco, 2011).
Toxicité du glyphosate chez l’homme et toxicité cutanée
Ainsi, le glyphosate serait responsable de l’augmentation de la génotoxicité (Bolognesi et al.,
2009) et de la fréquence des cancers (De Roos et al., 2005) chez les agriculteurs exposés à cet
herbicide. Le cas de Gilbert Vendée risque de faire jurisprudence (octobre 2005) : la maladie
de Parkinson de cet agriculteur français a été reconnue comme maladie professionnelle due à
l’exposition aux pesticides. De plus, la société Monsanto a été condamnée le 13 février 2012 à
indemniser Mr Paul François, agriculteur en Charente pour sa maladie professionnelle due à
l’inhalation d’un autre pesticide, le lasso®.
La thèse d’Audrey Gehin réalisée au sein de notre équipe et soutenue en 2006 (Gehin, 2006b),
a déjà prouvé l’induction du stress oxydant par le glyphosate sur un modèle de lignée
cellulaire cutanée. L’équipe de Gilles-Eric Seralini, éminent spécialiste français de la question
du glyphosate et de l’utilisation des OGM, a déjà démontré la toxicité des formulations à base
de glyphosate notamment sur des cellules embryonnaires, placentaires et ombilicales
(Benachour et al., 2007) ainsi que sur des cellules hépatiques (Gasnier et al., 2009).
- 60 -
Cette dernière étude a montré l’atteinte endocrine de ces cellules au niveau du métabolisme
des estrogènes et des endogènes. Outre le stress oxydant, le glyphosate induirait donc d’autres
facteurs d’aggravation du vieillissement naturel de l’organisme.
De nombreuses études de cas font état des risques cutanés de l’utilisation d’herbicides à base
de glyphosate autant chez les particuliers (Hindson et Diffey, 1984 ; Wester et al., 1996 ;
Amerio et al., 2004 ; Nagami et al., 2005) que chez les professionnels (Penagos et al., 2004 ;
Pease et al., 1993). Ces études montrent que les effets du glyphosate sur la peau peuvent
dépendre de beaucoup de facteurs comme la concentration en principe actif, la présence ou
non de surfactants dans la formulation commerciale, la durée de l’exposition, les conditions
environnementales (l’humidité, la sueur) ou l’absorption par des matières textiles.
Dans le cas d’une exposition de la peau à l’environnement extérieur et à sa pollution, c’est
l’épiderme, la couche la plus superficielle de la peau qui sera en première ligne pour protéger
l’organisme. De plus, il est maintenant prouvé que le glyphosate est capable de traverser la
barrière cutanée humaine, la majorité de la substance restant au niveau de l’épiderme, et la
pénétration dans une peau abîmée (même superficiellement) étant 5 fois plus élevée que dans
une peau parfaitement saine (Nielsen et al., 2007).
Il est donc pertinent d’utiliser une lignée kératinocytaire comme modèle cellulaire de notre
étude de l’impact chez l’homme d’une pollution environnementale induite par l’utilisation du
glyphosate.
L’étude de la toxicité cutanée du glyphosate in vitro implique l’étude de sa cytotoxicité à
l’échelle cellulaire. L’atteinte des fonctions vitales de la cellule, ainsi que le déclenchement de
processus impliqués dans le vieillissement cutané, peuvent provoquer la mort cellulaire dont il
semble nécessaire de connaître de façon précise les mécanismes impliqués.
- 61 -
3. Combinaison de technologies pour une investigation
multi-échelle du vieillissement cutané
Notre approche originale réside, entre autres, dans la combinaison stratégique de i) techniques
standards, performantes et bien acquises par la communauté scientifique et ii) de technologies
de pointe, dans l’optique d’une exploration cellulaire multi-échelle. Dans ce paragraphe, nous
décrirons les principes généraux de chaque technique, leurs caractéristiques, leurs avantages
et inconvénients.
Les objectifs sont d’évaluer
-
les fluctuations d’expression des protéines cellulaires induites par le traitement
glyphosate, par analyse protéomique
-
la mortalité cellulaire induite par le glyphosate et ses mécanismes,
·
par mesure d’activité enzymatique mitochondriale, MTT
·
par certains marquages en microscopie confocale de fluorescence et en
cytométrie en flux
-
l’atteinte de la morphologie et des propriétés mécaniques cellulaires, par microscopie
à force atomique
i.
Protéomique quantitative différentielle
La protéomique s’intéresse à l’étude du protéome, c'est-à-dire à l’ensemble des protéines
constituant un compartiment cellulaire, une cellule, un tissu, ou un organisme, à un instant et
sous des conditions donnés. Un des principaux objectifs de la protéomique est ainsi
d’identifier et de quantifier, de façon systématique, les protéines composant un système
biologique. L’intérêt de la protéomique, dans le cadre de notre étude, est de caractériser les
différentes conditions (temps de contact, concentrations) de stress par le glyphosate de notre
modèle cellulaire afin de révéler des biomarqueurs du vieillissement cutané. L’utilité de la
protéomique dans le cadre de notre étude est de réussir à faire le lien entre mécanismes
fonctionnelles, phénotypes mécaniques, et expression protéique. En effet, notre étude reposant
sur une approche multi-échelle, les caractéristiques de notre modèle étudiées par d’autres
méthodes, à d’autres échelles, pourront trouver une explication moléculaire dans les résultats
obtenus en protéomique.
- 62 -
Dans cette approche, toutes les protéines d’un échantillon contribuent au signal, que ce soit
l’intensité des spots sur un gel ou la densité optique détectée en sortie de chromatographie.
Or, l’abondance relative des différentes protéines d’un échantillon peut couvrir une gamme de
concentrations très large, allant du mg/mL pour les protéines les plus abondantes au ng/mL
pour les protéines d’intérêt recherchées.
Dans les échantillons protéiques cellulaires que nous avons préparés, certaines protéines
abondantes comme les kératines vont inévitablement gêner la détection de protéines d’intérêt
moins concentrées. Nous avons choisi de fractionner notre échantillon cellulaire, et de
travailler sur des fractions cellulaires cytosoliques, mitochondriales, nucléaires et
endomembranaires. Les approches standardisées consistent ensuite à séparer les protéines des
différentes fractions par électrophorèse bidimensionnelle (E2D) ou par chromatographie en
phase liquide bidimensionnelle, et à analyser ces fractions (de gel E2D, ou de
chromatographie 2D) en spectrométrie de masse (Wu et al., 2006). D’autres techniques
comme les puces à protéines ou la chromatographie liquide multidimensionnelle ont été
développées et sont utilisées dans des cas plus spécifiques d’étude, en haut débit ou
d’immunodéplétion d’une protéine majeure, avant toute autre séparation classique.
La plateforme protéomique CLIPP possède le système proteomeLab™ PF2D, une
chromatographie liquide 2D commercialisée par Beckman Coulter. Il combine une
chromatofocalisation permettant la séparation des protéines en fonction de leur pI en phase
liquide avec application d’un gradient de pH, et une étape de chromatographie en phase
inverse qui sépare les protéines en fonction de leur hydrophobicité. Un système de détection
UV permet la quantification des protéines.
L’E2D est néanmoins la technique la plus répandue pour l’analyse différentielle des
protéomes. Elle permet de séparer plusieurs milliers de polypeptides simultanément en
fonction de 2 critères, la charge électrique et le poids moléculaire. Après migration, les gels
sont colorés pour détecter la présence des protéines et permettre l’analyse de l’intensité
relative de coloration des spots protéiques. Cette technique permet la quantification relative
des protéines, par rapport au reste de la carte et à une carte de référence. (Rabilloud et
Charmond, 2000 ; Xuereb, 2008)
- 63 -
Plusieurs procédés de coloration, de sensibilité différente, existent et sont choisis en fonction
de l'utilisation ultérieure des gels 2D : le bleu de coomassie permet la détection de quantités
de protéines supérieure à 100 ng par spots. Le nitrate d’argent présente l’intérêt d’avoir une
sensibilité 1000 fois plus élevée (0.1 ng par spot), mais moins reproductible que le bleu de
coomassie en raison de la linéarité de réponse plus réduite. De plus, le nitrate d’argent, dans
sa composition initiale, n’est pas compatible avec les analyses par spectrométrie de masse. Il
existe désormais des colorations au nitrate d’argent compatibles. En outre, de nouvelles
techniques de détection par fluorescence ont vu le jour avec à la fois une sensibilité
équivalente au nitrate d’argent, mais une reproductibilité plus grande, du fait d’une linéarité
de réponse sur une plus grande gamme dynamique.
Le contenu protéique des échantillons issus d’un préfractionnement 2D est identifié par
spectrométrie de masse (MS). Pour cela, 2 informations peuvent être obtenues à l’aide du
spectromètre de masse MALDI-TOF UltrafleXtrem (Brucker Daltonics) : l’empreinte
peptidique massique et l’information de séquence d’acides aminés.
Empreinte peptidique massique (mass fingerprint)
Elle est réalisée par MS, et fut, à l’origine, utilisée pour identifier des protéines purifiées
(Henzel et al., 1993 ; James et al., 1993 ; Mann et al., 1993). Elle donne l’ensemble des
masses des fragments peptidiques spécifiques d’une protéine, fragments obtenus par digestion
de cette protéine par la trypsine.
Les masses mesurées en MS sont ensuite confrontées au masses calculées in silico à partir de
banques de données, ce qui permet l’identification de la protéine. Cette approche nécessite
que les bases de données génomiques et/ou protéiques soient suffisamment « riches » en ce
qui concerne l’organisme étudié. Cependant, elle s’est heurtée à l’existence de peptides de
même masse mais issus de protéines différentes (He et al., 2010). Elle est désormais couplée à
la MS en tandem.
- 64 -
Information de séquence : approche MS-MS
L’utilisation de la MS en tandem ou MS-MS, permet, après la sélection d’un peptide assez
abondant en MS, de le fragmenter grâce à une impulsion laser plus élevée. Les peptides sont
alors cassés en certains endroits spécifiques. Le type d’ion issu de la fragmentation d’un ion
parent, est caractérisé par une nomenclature internationale (ions a1, b1, c1, x1, y1, z1, etc…)
(Roepstorff et Fohlman, 1984 ; Bieman, 1988).
La MS-MS peut permettre également le séquençage de novo si la protéine recherchée n’est
pas référencée (Tang et al., 1993 ; Jones et al., 1994 ; Xuereb, 2008).
Protéome différentiel et stress oxydant
La caractérisation du protéome est utilisée dans de nombreuses études ayant pour cible le
stress oxydant pour caractériser de possibles cibles moléculaires, dans le but de limiter les
effets de ce stress, et ainsi combattre les pathologies qui peuvent en être la conséquence.
Paron et ses collaborateurs (2004) ont procédé à l’étude du protéome, par une combinaison
E2D/MALDI-TOF des cellules du cristallin en réponse au stress oxydant mimé par un
traitement au peroxyde d’hydrogène, dans le but de caractériser les mécanismes précoces de
la formation de la cataracte. Ils ont mis en évidence, d’une part des variations dans
l’expression de protéines du cytosquelette comme la tubuline 1α et d’enzymes comme la αénolase, et d’autre part, l’hyperoxydation de la peroxyredoxine et de la glycéraldéhyde 3phosphate déshydrogènase. Ces protéines sont donc des marqueurs potentiels pouvant
indiquer précocement la formation de la cataracte.
Certaines études visent également le suivi d’un stress oxydant induit chimiquement par un
médicament utilisé en chimiothérapie qui, lorsque ce traitement est systémique, peut léser
d’autres organes que l’organe touché par le cancer. Ainsi, Joshi et son équipe (2010) ont mis
en évidence les variations du profil protéomique de cellules du cerveau de souris après
traitement par l’adriamycine.
Enfin, certaines études visent à étudier l’effet d’antioxydants sur le protéome, dans le cas de
certaines pathologies. De cette façon, Dekkers et al. (2008) ont étudié l’effet d’un polyphénol
, le resveratrol, sur le protéome induit par le diabète sur les cellules cardiaques de rats, et ont
mis notamment en évidence la sous-expression de la péroxyredoxine 1, enzyme impliquée
dans la défense antioxydante.
- 65 -
ii.
L’étude de la mortalité cellulaire et la caractérisation de ses mécanismes
La cytométrie en flux :
La cytométrie en flux est définie comme une mesure (-métrie) des propriétés optiques de
cellules (cyto-) transportées dans un liquide vecteur (flux) jusqu’à une source d’excitation
(laser le plus souvent).
Les premières utilisations de la cytométrie en flux ont concerné la fluorimétrie de l’ADN et
l’étude du cycle cellulaire comme le reporte Clausen dans sa revue (1983) concernant plus
particulièrement le cas des kératinocytes. Nombreux sont les fluorochromes qui ont été
développés depuis pour l’étude qualitative ou quantitative de marqueurs biologiques
cellulaires et la difficulté réside le plus souvent dans le choix de ces marqueurs et à leur
conjugaison dans une même analyse (Maecker et al., 2004).
Nous l’avons vu plus haut, l’une des causes du vieillissement est le stress oxydant, et son
étude, notamment à travers la production d’ERO intracellulaires, n’a pas échappé à cette
technique de choix. Ainsi le le 2’,7’-dichlorfluoresceine-diacétate (DCFH-DA) est utilisé pour
quantifier la production des ERO (Eruslanov et Kusmartsev, 2010). Carini et ses
collaborateurs (2000) l’utilisent, eux, pour mesurer les conséquences oxydantes des UVB sur
les kératinocytes.
L’étude de l’effet d’un composé chimique cytotoxique nécessite la caractérisation de la mort
cellulaire. Or, la distinction entre apoptose et nécrose est faite grâce notamment à
l’externalisation de la phosphatidylsérine pendant l’apoptose et l’atteinte membranaire lors de
la nécrose (cf. §IV.). Ainsi, le double marquage annexin V / iodure de propidium permet à
l’annexine V de se fixer à la phosphatidylsérine uniquement lorsqu’elle est en position
externe, alors que l’iodure de propidium ne marque l’ADN que si la membrane de la cellule
est perméabilisée. Cependant, nous l’avons vu plus haut, la mort cellulaire caspaseindépendante peut présenter les 2 types de caractéristiques (cf. §IV.3.v.).
- 66 -
La chute du potentiel de membrane mitochondrial peut être également détectée par
fluorescence. En effet, en conditions physiologiques, la concentration en cations de la matrice
mitochondriale est beaucoup plus importante que celle mesurée dans le cytosol. Ainsi
différents fluorochromes cationiques peuvent être utilisés tels que le DiOC6, le Mitotracker
Red, TMRM et le JC-1. Le stockage de ces fluorochromes dans la matrice mitochondriale
témoigne du bon fonctionnement du potentiel, qui maintient une forte concentration en
cations dans la matrice.
Il est important de coupler un marqueur de la dissipation du potentiel de membrane
mitochondrial à d’autres marqueurs de la mort cellulaire (Zuliani et al., 2003).
Enfin, il est possible d’étudier plus précisément les acteurs moléculaires des différents types
de mort à travers, par exemple, le clivage des procaspases ou de PARP. Ces dernières mesures
permettent de distinguer les différentes voies d’apoptose, voire un mécanisme de mort
cellulaire caspase-indépendant. En effet, une technique de caractérisation de l’apoptose ne se
suffit pas à elle-même (Li et al., 2009), tant les mécanismes de mort cellulaire sont nombreux.
iii.
Evaluer la morphologie et les propriétés mécaniques cellulaires par AFM
Nos recherches se portent sur la peau humaine et nous avons donc fait le choix d’orienter
cette introduction bibliographique sur l’état de l’art qui concerne principalement la recherche
sur les cellules eucaryotes. La microscopie à force atomique (AFM) (cf. Matériel et
Méthodes : principe de l’AFM) s’est énormément développée ces dix dernières années, et
notamment dans le champ de la biologie des cellules eucaryotes (Muller et Dufrêne, 2008,
2011 ; Radmacher , 2007 ; Giocondi et al., 2010). L’AFM fournit des images topographiques
de surface à l’échelle nanométrique, d’échantillons biologiques variés allant de l’ADN
(Hamon et al., 2007) à la cellule adhérente sur un biomatériau (Berquand et al., 2010). Utilisé
en mesure de forces, l’AFM permet également de mesurer des interactions inter- et intramoléculaires (Clausen-Schaumann et al., 2000) mais aussi de caractériser les propriétés
mécaniques d’une cellule (Butt et al., 2005) .
Parmi les nombreuses études réalisées sur des modèles cellulaires, très peu utilisent des
cellules de mammifères (Fung et al., 2010). De plus, peu de travaux portent sur des cellules
vivantes, placées dans un environnement proche des conditions physiologiques. Grâce à ses
nombreuses applications, l’AFM est devenu un outil important en biologie cellulaire (Dague
et al., 2007 ; Parot et al., 2007).
- 67 -
Topographie de surface en mode contact
Différents modes ont été utilisés tout au long de nos travaux selon les capacités de chaque
outil mis à notre disposition. Dans le cadre d’une étude cellulaire, l’imagerie est le plus
souvent réalisée sur cellules fixées, le glycocalix à la surface des cellules augmentant à la fois
la hauteur des cellules et, sa nature fibrillaire provoquant des artefacts de pointe (Lydataki et
al., 2004) ; de plus, dans notre cas, l’analyse AFM est complétée par une étude en
microscopie confocale à fluorescence. Pour l’observation en AFM, la fixation à l’aide
d’aldéhydes a pour objectif de figer les cellules tout en conservant leurs structures. L’appareil
mis à notre disposition au sein de FEMTO-ST est le Microscope Multimode que nous avons
utilisé en mode contact, équipé d’un contrôleur nanoscope IIIa. Dans ce mode, la pointe est en
contact permanent avec la surface de l’échantillon. Des forces attractives (van des walls) et
répulsives (électrostatiques) s’exercent entre la pointe et l’échantillon. La force appliquée au
levier doit être la force minimum nécessaire pour que l’équilibre entre ces forces bascule en
faveur de l’attraction et permette le contact permanent entre pointe et échantillon.
Un système de rétroaction permet de maintenir une force constante entre le levier et
l’échantillon, malgré les variations de relief de l’échantillon (« bosses » ou « creux »). Le
système de rétroaction permet donc de compenser ces variations en modifiant la hauteur du
tube piézoélectrique, afin que la pointe reste en permanence en contact avec l’échantillon.
Cependant, la rétroaction a ses limites, selon le type de scanner employé et sa capacité en
hauteur (Sokolov et al., 2007). Cette compensation au niveau du tube piézoélectrique permet
l’enregistrement d’une image en hauteur qui représente la topographie de l’échantillon imagé.
De nombreuses études ont été réalisées sur cellules fixées (étude en topographie, couplée ou
non à la microscopie optique) (Reich et al., 2009). De plus, le mode contact présente de
nombreux avantages comme sa simplicité de mise en œuvre, sa rapidité de scan, et son bon
rapport signal sur bruit. Néanmoins, il présente quelques inconvénients : des variations trop
fortes en z peuvent aboutir à des artefacts d’image, voire à la dégradation de l’échantillon.
- 68 -
Le mode tapping ou contact intermittent (Zhong et al., 1993) est un mode de choix pour
l’imagerie d’échantillons biologiques déformables, ou faiblement adsorbés sur la surface, car
la pointe ne vient toucher la surface de l’échantillon que par intermittence à une fréquence
maintenue constante, ce qui présente l’intérêt majeur de ne pas dégrader la surface de
l’échantillon. Le mode tapping permet également d’effectuer des mesures de forces en chaque
point de contact avec l’échantillon, ce qui permet de mesurer notamment la déformation et
l’élasticité des cellules.
Une corrélation a été démontrée entre le vieillissement et l’augmentation de la raideur
cellulaire qui passe, entre autres, par la réorganisation du cytosquelette (Starodubtseva et al.,
2011 ; Lieber et al., 2004). Des études in vivo par indentation dynamique par exemple (Boyer
et al., 2009), ont permis de caractériser les propriétés mécaniques de la peau sur toute son
épaisseur. In vitro, plus les conditions expérimentales se rapprocheront des conditions
physiologiques, plus les paramètres mécaniques mesurés au niveau d’une cellule seront
pertinents et reflèteront la réalité (comportement de ces cellules dans l’organisme).
Contrairement à la microscopie electronique, l’AFM est une technique non destructive. De
plus en plus, l’évolution des techniques permet l’imagerie par AFM sur cellules eucaryotes
vivantes (Fung et al., 2010). En effet, ce type de cellule présente une structure complexe, des
dimensions importantes (plusieurs micromètres de hauteur et jusqu’à des dizaines de
micromètres de diamètre), et des caractéristiques viscoélastiques particulières nécessitant
l’emploi de pointes appropriées (constante de raideur faible). Des études ont été réalisées in
vitro, par application d’une force à l’aide de nanosphères fixées à l’extrémité d’une pointe
AFM pour caractériser l’effet des LDL oxydés sur des cellules endothéliales (Chouinard et
al., 2008) et pour caractériser les différences d’élasticité chez des cellules de sein bénignes ou
cancéreuses (Li et al., 2008). En effet, les cellules cancéreuses sont devenues un important
sujet d’intérêt dans le cadre d’études des paramètres mécaniques de la surface cellulaire. Par
exemple, l’équipe de Manfred Radmacher a récemment décrit des variations, au sein de la
glande thyroïde, de propriétés mécaniques entre cellules saines et cancéreuses (Prabhune et
al., 2012). Furent pratiquées également des mesures mécaniques de couches de peau
fraîchement excisée, provenant de souris par indentation mécanique par AFM (Crichton et al.,
2011). Les auteurs de cette étude ont également utilisé des pointes, avec une particule
sphérique à leurs extrémités, pour pratiquer des mesures en différents endroits des
échantillons excisés.
- 69 -
En outre, des travaux sur fibroblastes (Rotsch et Radmacher, 2000) ont permis de démontrer
l’impact de modification du cytosquelette sur l’élasticité de la surface cellulaire. Mais peu
d’études portent sur le screening à haute résolution, point par point, en mesure de forces, de la
totalité de la surface d’une cellule vivante.
Combinaison imagerie et mesures de force en PeakForce Tapping
Au cours de ces 3 ans, il nous a été offert l’opportunité de mettre en place un partenariat avec
Bruker Nanodivision (anciennement Veeco), et d’aller effectuer des manipulations sur un
Bioscope Catalyst équipé de la technologie PeakForce QNM au sein des locaux Bruker à
Mannheim (Allemagne). Ce partenariat fut possible grâce au Dr. Céline Elie-Caille et au Dr.
Alexandre Berquand, Ingénieur d’Application dans le domaine des sciences de la vie. La
technologie PeakForce™ QNM™ (Pittenger et al., 2010) permet la cartographie quantitative
nanomécanique d’un échantillon, concomitante à l’obtention d’images topographiques en
haute résolution. La gamme de fonctionnement s’étend de 1 MPa pour les échantillons les
plus souples à 20 GPa pour les échantillons les plus rigides. Les données sont enregistrées en
mode Tapping ce qui permet d’obtenir des courbes de forces pour chaque pixel de l’image.
A ce jour, cette technique n’a été pratiquée que pour tester les propriétés mécaniques de
fibrilles α-amyloïdes (Adamcik et al., 2011), des cellules fixées (Berquand et al., 2011) ou
des diatomées vivantes (Pletikapic et al., 2011), mais n’avait pas encore été éprouvée sur des
cellules eucaryotes vivantes. Nous avons entrepris de le faire avec succès sur notre modèle
cellulaire « glyphosate / HaCaT ».
- 70 -
MATERIEL ET METHODES
- 71 -
- 72 -
I.
Matériel général
1. Kits de dosage
Deux kits ont été utilisés en cytométrie en flux : il s’agit de l’Apoptosis Detection Kit II (BD
Pharmingen, Franklin Lakes, USA) et le Mitochondria Staining Kit (Sigma Aldrich, Saint
Quentin Fallavier, France). Les Caspase-3 et caspase-9 colorimetric assay kits (Promokine,
Heidelberg, Allemagne) ont été utilisés pour le dosage biochimique des caspases 3 et 9. Le
FOCUS™ Subcell Kit (G-Biosciences, St Louis, USA) nous a permis le préfractionnement
des cellules avant l’étude en protéomique.
2. Produits pour la culture cellulaire
Les cellules HaCaT proviennent de Cell Line Service (Eppelheim, Allemagne).
Le Phosphate Buffer Saline (PBS), le Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), la
trypsine/EDTA, le sérum de veau fœtal et les lamelles de verre ont été fournis par Dutscher
(Brumath, France).
Les microplaques stériles 6, 24 et 96 puits, et les flacons de culture de 25 cm², 75 cm² et 225
cm² sont fournis par Nunc (Roskilde, Danemark). Les boîtes de pétri à fond de verre de 50
mm de diamètre sont produites par Willco, (Amsterdam, Pays Bas).
3. Réactifs et solvants
Le
glyphosate,
la
phalloïdine
dichlorfluorescein-diacétate,
le
tetramethyl-rhodamine
B
isothiocyanate,
4’6-diamidino-2-phenylindole,
le
2’,7’-
paraformaldéhyde,
staurosporine, la camptothecine, la quercetine, l’acide Bicinchoninique, le bromure de 3-[4,5
dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tétrazolium sont fournis par Sigma Aldrich (Saint Quentin
Fallavier, France).
Le milieu de montage est produit par Dako (Carpinteria, USA).
- 73 -
II.
Culture cellulaire
Le matériel et les méthodes utilisés dans le cadre des ces travaux de thèse reposent sur 3
volets importants : la préparation des échantillons cellulaires, les méthodes d’évaluation des
paramètres étudiés, et les outils de mesure pour les caractériser.
1. Lignée cellulaire humaine HaCaT
Les cellules de la lignée HaCaT sont des kératinocytes humains, transformés spontanément à
partir de cellules de peau d’un homme adulte, recueillies à la périphérie éloignée d’un
mélanome. Cette transformation leur confère l’immortalité (capacité de reproduction
supérieure à 140 passages), mais elles maintiennent la totalité de leur capacité de
différenciation épidermique.
2. Entretien de la lignée cellulaire
Le surnageant de culture des cellules HaCaT est éliminé, et la monocouche est rincée avec du
PBS (Phosphate Buffer Saline). Les cellules sont décollées en présence de trypsine/EDTA à
0,25% pendant 15 minutes. L’action de la trypsine est stoppée par l’ajout de Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et
80 mg/L de gentamycine (milieu complet). Après centrifugation, le culot cellulaire est remis
en suspension dans ce milieu complet.
Les kératinocytes sont ensemencés, à raison de 1.106 cellules / flacon de 75 cm², contenant du
milieu complet, et placés à 37°C en atmosphère saturée en eau, avec 5% de CO2.
Le milieu complet est renouvelé toutes les 48 heures et les cellules sont trypsinées à
confluence tous les 5 jours.
- 74 -
3. Traitement
des
cultures
de
kératinocytes
et
préparation des échantillons
Dans ce paragraphe, seront présentés les protocoles d’ensemencement cellulaire et la
préparation des différents échantillons destinés à chaque technique de caractérisation de notre
modèle.
i.
Préparation pour l’évaluation du potentiel cytotoxique d’une substance
Les kératinocytes sont ensemencés à raison de 1.104 cellules/100 µL de milieu complet dans
des microplaques 96 puits. Après 24 heures d’adhérence, les cellules sont traitées pendant 0,5,
1, 2, 4, 6, 9, 12, 15 ou 18 heures avec des concentrations croissantes de substance à tester,
diluées dans du milieu incomplet (sans SVF).
Substances testées:
Glyphosate : de 5 à 70 mM
Camptothecine : de 10 à 90 µM (utilisé comme témoin positif de la mort cellulaire)
Staurosporine : de 100 nM à 2 mM (utilisé comme témoin positif de l’activation des caspases
3 et 9)
Quercétine : de 50 à 300 µM (antioxydant)
Enfin, un test au MTT (cf. Matériel et Méthodes §II.1.) permet de déterminer la viabilité
résiduelle des kératinocytes, et d’établir le profil cytotoxique de chaque substance.
ii.
Préparation pour l’étude différentielle en protéomique
Culture cellulaire
Les cellules sont ensemencées à raison de 2.5.106 cellules / 30 mL de milieu complet dans des
flacons de culture de 225 cm². A 80% de confluence, les cellules sont traitées par le
glyphosate, en milieu incomplet à la concentration de 30 mM pendant 6 et 18 h pour la
séparation en électrophorèse bidimensionnelle, et à la concentration de 53 mM pendant 0,5 h
pour la séparation en chromatographie bidimensionnelle.
- 75 -
Préfractionnement des échantillons cellulaires
Principe
Le FOCUS™ Subcell Kit est employé pour l’enrichissement des fractions nucléaires,
mitochondriales, membranaires et cytosoliques des cellules HaCaT.
Ce protocole fonctionne pour 20.106 cellules ce qui équivaut au contenu d’une flasque de 225
cm² de cellules HaCaT à 80% de confluence.
Mode opératoire
Le tapis cellulaire est rincé 2 fois à l’aide de 12 mL de PBS. Les cellules sont grattées dans
1,5 mL de « subcell buffer 1 », récupérées dans un tube à hémolyse de 5mL et incubées dans
la glace pendant 10 minutes. La lyse est réalisée dans la glace à l’aide d’une seringue et d’une
aiguille 20G (30 aller-retour). 750 µL de subcell buffer 2 3X sont ajoutés et la suspension est
mélangée par inversion. On obtient au final le subcell buffer 2 en concentration 1X. Le
contenu du tube à hémolyse est transféré dans 2 microtubes qui sont ensuite centrifugés à 700
g pendant 10 minutes pour récupérer le culot de la fraction nucléique. Le surnageant est
transféré dans 2 nouveaux tubes qui sont centrifugés à 12 000 g pendant 15 minutes pour
former un culot de mitochondries. Le surnageant « post mitochondries » est transféré dans un
tube à ultra-centrifugeuse et stocké à +4°C. Ce surnageant peut être à nouveau fractionné par
centrifugation à 100 000 g pendant 60 minutes. Le surnageant est le cytosol et le culot est la
fraction membranaire.
Extraction protéique
Chromatographie bidimensionnelle
Les échantillons cytosoliques contiennent le tampon final de fractionnement cellulaire. Or,
pour l’injection en chromatographie bidimensionnelle, les protéines doivent se trouver dans le
tampon « Start » (Beckman Coulter) composé en majorité d’urée et de thio-urée à pH 8,5.
Pour changer de tampon, nous avons utilisé des colonnes PD-10 (Amersham) composées de
sephadex G25 medium selon le protocole suivant :
-
Ajustage du pH du tampon « Start » à 8,5
-
Rinçage de la colonne avec 25 mL de tampon Start
-
Chargement de 2,5 mL de fraction cytosolique (ajusté au volume avec du tampon Start
si besoin)
- 76 -
-
Elution de l’échantillon avec 3,5 mL de tampon Start, récupération des 3,5 mL en
sortie de colonne
Electrophorèse bidimensionnelle
Les échantillons cytosoliques sont transvasés dans 2 microtubes 1.5 mL pour être centrifugés
à 10 000 g à 4°C. Le surnageant est éliminé, les culots sont rincés 2 fois à l’acétone 1 mL
(centrifugation 10 000 rcf à 4°C). Les culots sont séchés sous une cloche à vide pendant 10
min, puis sont repris dans 400 µL total de tampon de réhydratation (200 µL dans chaque
microtube, puis réunis dans un seul).
Tampon de réhydratation :
7 M urée (Biorad)
2 M thio-urée (sigma)
4% CHAPS (Biorad)
10 mM de tributylphosphine (TBP) (Biorad)
Les échantillons sont agités au vortex pendant 15 min et centrifugés au maximum de la
capacité de la centrifugeuse (environ 20 000 g), pendant 10 min, pour éliminer tout ce qui
n’est pas solubilisé qui formera un culot. Seul le surnageant est récupéré dans un tube propre.
iii.
Préparation pour l’étude en microscopie confocale à fluorescence :
Les cellules sont ensemencées sur des lamelles en verre rondes de 13 mm de diamètre à raison
de 1.5.105 cellules / 1 mL de milieu complet dans des plaques 24 puits. Après 24 h
d’adhérence, sont mis en œuvre :
Le marquage de la production de ERO par le DCFH-DA (2’,7’-dichlorfluorescein-di
acétate)
(cf. Matériel et Méthodes §III.3.i.)
Les cellules sont traitées pendant 0,5, 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15 ou 18 h avec des concentrations de
glyphosate comprises entre 15 et 53 mM.
- 77 -
Le marquage des rafts lipidiques
Les cellules sont traitées pendant 0,5 h avec une concentration de glyphosate de 53 mM. Elles
sont ensuite marquées au FITC-Ctx (Fluorescein IsoThioCyanate-Cholera Toxin x) (cf.
Matériel et Méthodes §II.3.ii).
Le marquage de l’actine F par la phalloïdine-TRITC
Les cellules sont traitées pendant 0,5, 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15 ou 18 h avec des concentrations de
glyphosate de 15 à 53 mM. Elles sont ensuite marquées à la phalloidine TRITC (cf. Matériel
et Méthodes §II.3.iii).
Le marquage des kératines basales
Les cellules sont traitées pendant 18 h avec des concentrations de glyphosate de 15 et 30 mM.
Elles sont ensuite marquées par immunofluorescence (cf. Matériel et Méthodes §II.3.iv.).
iv.
Préparation pour la cytométrie en flux
Pour l’évaluation de l’apoptose à l’aide du dosage annexine V / iodure de propidium
Les cellules sont ensemencées à raison de 5.105 cellules / 4 mL de milieu complet dans des
flacons de culture de 25 cm². Après 24 h d’adhérence, les cellules sont traitées pendant 0,5, 1,
2, 4, 6, 9, 12, 15 ou 18 h avec des concentrations de glyphosate de 15 à 70 mM, puis les
cellules sont marquées à l’annexine V (AnV) et à l’iodure de propidium (IP) (cf. Matériel et
Méthodes §II.3.ii.). En parallèle au traitement par le glyphosate, les cellules sont traitées avec
12 µM de camptothécine en milieu incomplet.
Pour le dosage des ERO par le DCFH-DA
Les cellules sont ensemencées à raison de 5.105 cellules / 4 mL de milieu complet dans des
flacons de culture de 25 cm². Après 24 h d’adhérence, les cellules sont traitées au DCFH-DA
(cf. Matériel et Méthodes §II.3.ii.) puis pendant 0,5, 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15 ou 18 h avec des
concentrations de glyphosate de 15 à 70 mM. En parallèle au traitement par le glyphosate, les
cellules sont traitées avec du tert-butyl hydroperoxyde en milieu incomplet.
- 78 -
v.
Préparation pour le dosage des caspases 3 et 9 par mesure
spectrophotométrique
Les cellules sont ensemencées à raison de 1.106 cellules / 10 mL de milieu complet dans des
flacons de culture de 75 cm². A 80% de confluence, les cellules sont traitées avec des
concentrations de 15, 30 et 53 mM de glyphosate dans du milieu incomplet pendant 0,5, 6 et
18 h pour la séparation en électrophorèse bidimensionnelle et avec une concentration de 53
mM. Simultanément, les cellules sont traitées à la staurosporine, qui constituera le témoin
positif de d’induction de l’activité des caspases. L’activité des caspases 3 et 9 est ensuite
dosée pour les cellules ainsi traitées (cf. Matériel et Méthodes §II.4.).
vi.
Préparation pour l’observation en AFM
Mode contact
Les cellules ont été ensemencées à 2.105 cellules dans 1 mL de milieu complet sur des
lamelles de verre préalablement nettoyées avec de l’éthanol 70%, et séchées sous la hotte à
flux laminaire, puis disposées au fond des puits d’une microplaque 24 puits. Après 24 h de
culture, les cellules qui ont adhéré sont traitées avec le glyphosate, aux concentrations
adéquates, dilué dans du milieu incomplet. Avant les mesures en AFM, les cellules sont fixées
au glutaraldéhyde 0.2% pendant 10min.
PeakForce Tapping
Les manipulations ont été réalisées à Mannheim (Bruker) après le transport (de 6 heures
environ), de cellules vivantes à 37°C dans un flacon de culture de 75 cm² à 80% de
confluence. Les cellules HaCaT sont réensemencées dès l’arrivée dans des boîtes de pétri à
fond de verre de 50 mm de diamètre, à 5.105 cellules, dans 3 mL de milieu complet, la veille
du traitement.
Ainsi, le lendemain, les cellules sont traitées avec 1,5 mL de glyphosate :
-
à 40 mM et 53 mM pendant 0,5 h ;
-
à 15 et 30 mM pendant de 6 et 18 h.
Le tapis cellulaire est rincé et recouvert par 1,5 mL de milieu incomplet juste avant
l’observation en AFM. Le temps de passage en AFM n’excède pas 1h30 pour chaque boîte de
pétri.
- 79 -
III.
Les méthodes d’évaluation
1. Évaluation
de
la
cytotoxicité
par
mesure
de
la
viabilité cellulaire : test du MTT
Principe
Ce test de cytotoxicité repose sur la mesure de la réduction par la succinate déshydrogénase
mitochondriale des cellules vivantes d’un sel de tétrazolium, le MTT (bromure de 3-[4,5
dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tétrazolium), en un produit coloré insoluble : le bleu de
formazan (Mosmann, 1983).
Mode opératoire
Après contact des cellules HaCaT avec le produit à tester, le surnageant de culture est éliminé.
Le tapis cellulaire est rincé avec du PBS, puis 100 µL de MTT concentré à 0,5 mg/mL sont
ajoutés dans chaque puit. La plaque de 96 puits est incubée à 37°C pendant 2 heures. Le MTT
est éliminé, puis 100 µL de diméthylsulfoxide (DMSO) sont distribués dans chaque puit.
L’absorbance des puits est mesurée au spectromètre Multiskan RC (Lab Systems,
Courtaboeuf, France) à 570 nm.
Expression des résultats :
Les valeurs d’absorbance sont converties en pourcentages de viabilité résiduelle par rapport
aux cellules témoins non traitées (100%). Le profil cytotoxique de la substance est obtenu en
traçant la courbe de pourcentages de viabilité cellulaire en fonction des concentrations testées
et permet de déterminer la concentration inhibitrice 50% (CI50) qui correspond à la
concentration de toxique induisant 50% de mortalité cellulaire.
- 80 -
2. Dosage des protéines avec le kit de Pierce
Principe
Le kit « Pierce acide bicinchoninique (BCA) protein assay » est utilisé pour la détermination
par spectrophotométrie du contenu en protéines des échantillons (Smith et al., 1985). Les
protéines réduisent les ions cuivriques Cu²+ en ions cuivreux Cu+, lesquels réagissent de façon
stable et hautement spécifique avec l’acide bicinchoninique sous forme de sel de sodium
soluble en milieu aqueux. Deux molécules de BCA réagissent avec un ion Cu + en solution
alcaline pour former un complexe de coloration pourpre stable, présentant un pic d’absorption
à 562 nm.
Mode opératoire
Les concentrations protéiques des échantillons sont déterminées comparativement à une
gamme d’étalonnage d’albumine sérique de bovin (BSA) (de 0,1 à 1 mg/mL). Les
échantillons sont incubés en présence de réactifs de Pierce pendant 30 minutes à 37 °C.
L’absorbance est mesurée au spectrophotomètre à 562 nm.
Expression des résultats
A partir de la gamme d’étalonnage, les concentrations protéiques des échantillons sont
calculées et exprimées en mg/mL
- 81 -
3. Marquage
en
fluorescence
pour
l’observation
en
microscopie confocale
i.
Marquage de la production des ERO au DCFH-DA
Principe
Ce test est basé sur la capacité du DCFH-DA non polaire et non fluorescent à diffuser à
travers la membrane cellulaire et être désacétylé par des estérases cytosoliques pour former du
DCFH (2’,7’-dichlorfluoresceine) polaire mais toujours non fluorescent qui sera alors
emprisonné dans la cellule. Quand il y a formation d’ERO, celles-ci l’oxydent en une
molécule fluorescente, le DCF (2’,7’-dichlorfluoresceine oxydée). Le peroxyde d’hydrogène
est la molécule qui est la plus susceptible de modifier le DCFH mais le NO et l’anion
superoxyde sont des espèces également capables d’interagir avec le DCFH et de produire du
DCF.
Mode opératoire
Les cellules sont marquées avec 20µM de DCFH-DA en PBS pendant 30 min à 37°C 5% de
CO2. Le DCFH-DA est ensuite éliminé et les cellules sont rincées 3 fois avec du milieu
incomplet avant le traitement avec le glyphosate. Les cellules sont ensuite fixées au PFA 4%
avant le montage des lamelles sur lame.
Expression des résultats
Le marquage de la cellule, ou plutôt le stockage du DCFH par la cellule, est effectué avant le
traitement avec le glyphosate. Le DCFH est donc accumulé au maximum de la capacité
cellulaire et va donc être modifié au fur et à mesure de la production des ERO. Le DCFH-DA
est une technique qui va permettre de quantifier la totalité des ERO produits par la cellule
pendant un certain temps d’incubation post marquage. Il ne s’agit en aucun cas de marquer les
ERO présents dans le cytosol à un instant précis. Les résultats sont exprimés en nombre de
cellules « positives à la production d’ERO » c’est-à-dire les cellules dont la quantité d’ERO
intracellulaires dépasse la quantité mesurée en condition témoin.
- 82 -
ii.
Marquage des rafts lipidiques au FITC-CTx
Principe
Les rafts lipidiques sont des microdomaines membranaires enrichis en cholestérol et
sphingolipides, importants dans la signalisation cellulaire et l’adressage des protéines. La
sous-unité B de la toxine du choléra se lie spécifiquement avec le ganglioside GM1 qui est
localisé uniquement dans les rafts lipidiques de la membrane cellulaire. Elle n’est pas
cytotoxique et est conjugué au FITC (Fluorescein IsoThioCyanate : excitation 520 nm,
émission 490 nm).
Mode opératoire
Après traitement avec la molécule à tester, les cellules sont rincées 3 fois avec du PBS à 37
°C, incubées à TA 15 min avec du tampon bloquant (1% BSA dans PBS) puis marquées avec
du FITC-CTx 30 µg/mL. Elles sont ensuite rincées à nouveau avec du PBS à 37°C puis elles
sont fixées avec du PFA (Paraformaldéhyde) (Sigma Aldrich) 4% pendant 10 min suivi d’une
incubation à température ambiante (TA), pendant 5 min avec du NH4Cl 50 mM. Après 2
rinçages au PBS froid, les lamelles sont montées sur lames à l’aide du milieu de montage.
Expression des résultats
La fluorescence révélée par le marquage des rafts est localisée dans la membrane plasmique.
iii.
Marquage de l’actine F à la phalloïdine TRITC
Principe
La phalloïdine est une toxine fongique capable de se fixer à l’actine F dans la cellule. Elle ne
se fixe qu’aux formes polymériques et oligomériques d’actine mais pas aux formes
monomériques. La phalloïdine est conjuguée au TRITC (tetramethyl-rhodamine B
isothiocyanate : excitation 540-545 nm, émission 570-573 nm).
- 83 -
Mode opératoire
Après traitement avec la molécule à tester les cellules sont rincées 3 fois avec du PBS à 37
°C. Elles sont ensuite fixées avec du PFA (Paraformaldéhyde) (Sigma Aldrich) 4% pendant
10 min suivi d’une incubation à température ambiante (TA), pendant 5 min avec du NH4Cl 50
mM. Après 2 rinçages avec du PBS froid, elles sont perméabilisées pendant 3 min avec du
triton X100 0.1%. Après 2 rinçages au PBS froid, les cellules sont incubées à TA 15 min avec
du tampon bloquant (1% BSA dans PBS) puis marquées avec de la phalloïdine TRITC
concentrée à 10µg/mL pendant 30 min. Les lamelles sont ensuite montées sur lames à l’aide
du milieu de montage.
Expression des résultats
La fluorescence, révélée par le marquage du réseau d'actine, est localisée d'une part juste sous
la membrane plasmique, où l’actine constitue un maillage bidimensionnel associé à la
membrane, et d’autre part au sein de la cellule, où elle constitue un réseau tridimensionnel.
iv.
Marquage des kératines basales en immunofluorescence
Principe
Les kératines forment le cytosquelette de filaments intermédiaires dans les épithéliums. On
dénombre 20 kératines différentes chez l’être humain, selon l’épithélium mais aussi le degré
de maturation des cellules. Les kératines que contiennent les kératinocytes basaux sont la
kératine 5 et la kératine 14 qui sont marquées par un anticorps monoclonal primaire de
chèvre. L’anticorps secondaire anti IgG de chèvre reconnaît la chaîne lourde de l’anticorps
primaire. Il est conjugué au FITC (Fluoresceine IsoThioCyanate : excitation 520 nm, émission
490 nm). Un témoin anticorps secondaire seul est réalisé pour garantir la spécificité du
marquage fluorescent.
- 84 -
Mode opératoire
Après traitement avec la molécule à tester, les cellules sont rincées 3 fois avec du PBS à 37
°C. Elles sont ensuite fixées avec du PFA (Paraformaldéhyde) (Sigma Aldrich) 4% pendant
10 min suivi d’une incubation à température ambiante (TA), pendant 5 min avec du NH4Cl 50
mM. Après 2 rinçages avec du PBS froid, elles sont perméabilisées pendant 3 min avec du
triton X100 0.1%. Après 2 rinçages au PBS froid, les cellules sont incubées à TA 15 min avec
du tampon bloquant (1% BSA dans PBS) puis incubées avec l’anticorps primaire en tampon
bloquant pendant 1 heure. Après rinçage avec du tampon bloquant, elles sont incubées avec
l’anticorps secondaire en tampon bloquant pendant 1 heure. Les lamelles sont ensuite montées
sur lames à l’aide du milieu de montage.
Expression des résultats
La fluorescence révélée par le marquage du réseau de kératine est localisée à travers la
cellule, où elle constitue un réseau tridimensionnel relié à la membrane au niveau des
desmosomes et des hémidesmosomes.
v.
Marquage de l’ADN nucléaire au DAPI
Principe
Le 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) est une molécule capable de se fixer à l’ADN
double brin. Elle pénètre les cellules vivantes mais le marquage est plus efficace sur cellules
fixées et perméabilisées.
Mode opératoire
Après traitement avec la molécule à tester, les cellules sont rincées 3 fois avec du PBS à 37
°C. Elles sont ensuite fixées avec du PFA 4% pendant 10 min suivi d’une incubation à
température ambiante, pendant 5 min avec du NH4Cl 50 mM. Après 2 rinçages avec du PBS
froid, elles sont perméabilisées pendant 3 min avec du triton X100 0.1%. Après 2 rinçages
avec du PBS froid, les cellules sont incubées à température ambiante 15 min avec du tampon
- 85 -
bloquant (PBS 1% BSA) puis marquées avec du DAPI pendant 30 min. Les lamelles sont
ensuite montées sur les lames à l’aide du milieu de montage.
Expression des résultats
Une fois fixée à l’ADN, le DAPI absorbe dans l’UV (à une longueur d’onde maximum de 358
nm) et émet dans le bleu (à une longueur d’onde maximum de 461 nm). Il permet d’observer
une éventuelle atteinte de l’ADN nucléaire (condensation, fragmentation…).
4. Marquage
en
fluorescence
pour
la
mesure
en
cytométrie en flux
i.
Evaluation de la production des ERO intracellulaires
Principe
Ce test est basé sur la capacité du DCFH-DA non polaire et non fluorescent à diffuser à
travers la membrane cellulaire et à être emprisonné dans le cytoplasme. Les ERO vont oxyder
cette molécule en DCF (2’,7’-dichlorfluorescein oxydé) qui devient alors fluorescent.
(Cf. Matériel et Méthodes §II.2.ii.)
Mode opératoire
Le milieu de culture est éliminé et le tapis cellulaire est rincé 2 fois au PBS. 2 mL de solution
de marquage sont ajoutés aux flacons de culture, incubé 30 min à 37°C et 5% de CO 2. La
solution de marquage est éliminée et le tapis cellulaire est rincé au milieu incomplet avant
l’ajout de la molécule à tester dans le flacon. Après incubation pendant un temps déterminé, le
surnageant est collecté dans un tube à hémolyse de 5mL centrifugé à 600 g pendant 5 min ;
on récupère le culot (n°1). Le tapis cellulaire est rincé avec 2 mL de PBS, puis le tapis de
cellules est décollé par 2 mL de trypsine/EDTA 0,25% pendant environ 15 minutes
d’incubation à 37°C et 5% de CO2. Pour arrêter l’action de la trypsine, 2 mL de milieu
complet sont ajoutés, et l’intégralité de la suspension est ajoutée au culot n°1.
- 86 -
Ce pool est centrifugé à 600 g pendant 5 min, et le culot récupéré est finalement repris dans
500 µL de PBS avant la lecture.
Expression des résultats
Les exemples de représentation graphique rapportés dans les figures 14 et 15 permettent
d’expliquer le traitement des données cytométriques obtenues pour notre modèle
glyphosate/HaCaT avec le logiciel de cytométrie.
Figure 14 : Rapport taille (FS) / structure (SS) des cellules détectées par le cytomètre à flux.
Caractérisation des différents groupes de cellules ou fragments détectés par le laser, et leur
traitement pour le reste de l’analyse.
Le cytomètre en flux, permet avant tout d’analyser les cellules en fonction de paramètres
morphologiques. Dans la figure 14, le graphique représente la répartition des cellules selon
leur rapport taille/structure. Cette représentation permet à l’opérateur de faire un choix quant
aux cellules propres à être analysées. En effet, peuvent passer devant le laser du cytomètre des
débris cellulaires (contour bleu) et les doublets (contour rouge), c’est à dire 2 cellules encore
adhérentes entre elles, que la trypsine n’aurait pas séparé. La prise en compte de ces
populations dans l’analyse de la fluorescence enregistrée pourrait fausser les résultats. En
revanche, sont conservées les cellules vivantes (contour orange) et les cellules mortes
(contour vert) regroupées dans la zone B (contour noir). Ici, 85,1% des cellules sont donc
conservées pour la suite de l’analyse. Ce premier principe est appliqué à toutes les analyses en
cytométrie en flux.
- 87 -
Les 2 graphiques suivants (fig. 15) ne prennent en compte que ces cellules (zone B) dans
l’analyse de la fluorescence détectée. Dans la figure 15a, chaque barre représente un nombre
de cellules (en ordonnée) qui ont la même intensité de fluorescence (en abscisse). Chaque
condition de traitement par le glyphosate est comparée à une condition témoin. La zone A
représente toutes les cellules qui ont une intensité de fluorescence supérieure à l’intensité des
cellules en conditions témoins. La zone A comprend donc les cellules positives à la
production anormale d’ERO. C’est cette représentation qui sera exploitée lors de la
présentation des résultats.
Figure 15 : Intensité de fluorescence par cytométrie en flux et délimitation d’une population
cellulaire
Intensité de fluorescence en fonction du nombre de cellules (a) ou de la taille des cellules (SS) (b).
La zone de travail est définie au regard des conditions témoins qui présenteront une majorité de
cellules avec une production basale de ERO. La zone A est la zone des graphiques regroupant les
cellules ayant une production de ERO supérieure à la majorité des cellules témoins.
En résumé, chaque point sur la figure 15b représente une cellule. Le graphique ne prend pas
en compte les doublets (ensemble de 2 cellules qui passent en même temps devant le laser), ni
les débris, qui peuvent induire des erreurs dans l’analyse des résultats. Les cellules de la zone
A (en bleu, fig. 15b) se démarquent, car elles ont une intensité de fluorescence reflétant une
quantité d’ERO supérieure à celles des cellules en condition témoin.
- 88 -
ii.
L’évaluation de l’apoptose par le marquage simultané à l’anV et à l’IP
Principe
L’apoptose est caractérisée par des événements morphologiques tels que la perte de
l’asymétrie de la membrane plasmique, la condensation du cytoplasme et du noyau, et de la
fragmentation de l’ADN. La perte des caractéristiques de la membrane plasmique est un des
événements précoces du mécanisme d’apoptose. La phosphatidylsérine (PS) membranaire
notamment est transloquée, depuis la face interne de la membrane vers la face externe.
L’exposition à l’extérieur de la cellule de la PS permet la fixation Ca2+ dépendante de l’AnV,
une protéine de fixation aux phospholipides qui a une grande affinité pour la PS. L’AnV est
conjuguée au FITC pour l’analyse en cytométrie en flux. La fixation de l’AnV à la cellule
permet d’identifier les cellules apoptotiques à un niveau très précoce de ce mécanisme.
Un des processus qui caractérise la nécrose est la perte de l’intégrité membranaire qui permet
alors la pénétration au sein de la cellule d’un marqueur tel que l’iodure de propidium (IP) qui
se fixe à l’ADN.
Mode opératoire
Après traitement par la molécule à tester, le surnageant est collecté dans un tube à hémolyse
de 5mL centrifugé à 600 g pendant 5 min (culot n°1). Le tapis cellulaire est rincé avec 2 mL
de PBS et 2 mL de trypsine/EDTA 0,25% sont ajoutés et incubés pendant 15 minutes à 37°C
5% de CO2, 2 mL de milieu complet sont ajoutés pour bloquer l’action de la trypsine, et
l’intégralité est ajoutée culot n°1 et centrifugé à 600 g pendant 5 min.
Le culot est rincé 1 fois au PBS puis avec 400 µL de « binding buffer » 1X froid avant l’ajout
de 110 µL de solution de marquage (100 µL de binding buffer 1X + 5 µL d’An V + 5 µL de
IP) incubé, après vortex, à TA à l’obscurité pendant 15 min. 400 µL de binding buffer 1X sont
ajoutés juste avant la lecture.
Expression des résultats
L’exemple de représentation graphique rapportée dans les figures 16 permet d’expliquer le
traitement des données cytométriques obtenues pour notre modèle Glyphosate/HaCaT avec le
logiciel de cytométrie.
- 89 -
Apoptose
Nécrose
IP
tardive
Apoptose
Saines
précoce
AnV
Figure 16 : Répartition des populations cellulaires par cytomètrie en flux après un marquage
AnV/IP
Avec l’intensité de fluorescence verte en abscisse (AnV) et l’intensité de fluorescence bleue en
ordonnée (IP)
Les populations, sous forme de nuages de points, sont séparées pour distinguer les cellules
vivantes, en apoptose précoce, tardive et en nécrose. Ces cellules sont réparties dans le
graphique de la manière suivante :
§
AnV - / IP- = cellules saines
§
AnV + / IP - = cellules apoptotiques précoces
§
AnV + / IP + = cellules apoptotiques tardives
§
AnV - / IP + = cellules nécrotiques ou mortes
Le kit FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit II ne permet pas dans l’absolu de distinguer
nettement un processus nécrotique d’un processus apoptotique lorsque les cellules sont AnV +
/ IP +. Cependant, une méthode qui mesure l’impact croissant de l’effet d’un toxique sur des
cellules, est susceptible de montrer une évolution progressive des profils cellulaires depuis
AnV - / IP- vers AnV + / IP + avec une étape intermédiaire AnV + / IP –. Cette situation
suggère fortement un processus apoptotique, et donc, permet de distinguer avec certitude un
profil d’apoptose tardive d’un profil de nécrose.
- 90 -
iii.
Caractérisation du potentiel de membrane au JC-1
Principe
La dissipation du potentiel électrochimique de la mitochondrie est un événement précoce de
l’apoptose. Le « Mitochondria staining kit » utilise le marqueur JC-1 (5,5’,6,6’-tetrachloro1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolocarbocyanine iodide) pour détecter les variations du
potentiel électrochimique de la membrane interne mitochondriale, et donc distinguer les
cellules apoptotiques des cellules vivantes.
Dans les cellules vivantes, le marqueur se concentre dans la matrice mitochondriale grâce au
potentiel électrochimique : il y forme des agrégats qui fluorescent en rouge. Tout événement
qui provoque la dissipation du potentiel, empêche l’accumulation dans la mitochondrie et
donc la formation d’agrégats, le marqueur est alors dispersé dans toute la cellule à l’état de
monomères qui fluorescent en vert.
Le kit contient de la valinomycine qui est employée au moment du marquage pour
perméabiliser la membrane mitochondriale pour les ions K+, ce qui a pour effet de dissiper le
potentiel électrochimique. Ce traitement est utilisé comme témoin positif de la dissipation du
potentiel.
Les monomères sont détectés à une longueur d’onde d’émission de 530 nm. Les agrégats sont
détectés à une longueur d’onde d’excitation d’émission de 590 nm.
Mode opératoire
Préparation de la solution de marquage :
100 µL de JC-1 stock (-20°C) sont mélangés avec 16 mL d’eau ultrapure. Cette solution est
agitée à l’agitateur Vortex brièvement puis incubée 1 à 2 minutes à TA. Sont ajoutés 4 mL de
JC-1 staining buffer 5X avant de mélanger par inversion.
Après traitement par la molécule à tester, le surnageant est collecté dans un tube à hémolyse
de 5mL, et centrifugé à 600 g pendant 5 min (culot n°1). Le tapis cellulaire est rincé avec 2
mL de PBS, et 2 mL de trypsine/EDTA 0,25% sont ajoutés et incubés pendant 15 minutes à
37°C et 5% de CO2. 2 mL de milieu complet sont ajoutés pour bloquer l’action de la trypsine,
et l’intégralité est ajoutée culot n°1 et centrifugé à 600 g pendant 5 min. Le culot est rincé 1
- 91 -
fois avec du milieu complet et repris dans 2 mL de milieu complet et 1 mL de solution de
marquage. Le culot est ainsi incubé à 37°C 5% de CO2 pendant 20 min. Les cellules sont
centrifugées à 600 g pendant 5 min, rincées avec du tampon de fixation 1 X, puis reprises
dans 500 µL de ce même tampon juste avant la lecture.
Expression des résultats
La figure 17 donne un exemple de représentation graphique, obtenue avec le logiciel de
cytométrie pour notre modèle, pour expliquer le traitement des données mis en place et suivre
ainsi l’évolution du potentiel de membrane mitochondrial en fonction d’un traitement au
glyphosate. La fluorescence rouge reflète les cellules abritant des mitochondries à potentiel de
membrane efficace ; la fluorescence verte mesure la quantité de marqueur libre dans le
cytoplasme, marqueur qui n’a pu pénétrer dans la mitochondrie en raison d’un potentiel de
membrane défectueux. Le déplacement du nuage de points du coin en haut à gauche vers le
coin en bas à droite du graphique montre donc une diminution du potentiel de membrane
Fluorescence rouge
mitochondrial.
Diminution du
potentiel
Fluorescence verte
Figure 17 : Marquage JC-1 du potentiel de membrane mitochondrial.
En abscisse : l’intensité de fluorescence verte (monomères de JC-1) ; en ordonnée : l’intensité de
fluorescence rouge (agrégats mitochondriaux de JC-1). La double barre est placée en fonction de la
population cellulaire en condition témoin et permet de distinguer le déplacement de cette population
en fonction des traitements.
- 92 -
Pour simplifier la lecture des résultats, les mesures de cytométrie en flux seront représentées
sous forme de ratio entre la fluorescence rouge et la fluorescence verte. Ainsi, la valeur du
ratio diminue proportionnellement avec le potentiel de membrane mitochondrial.
5. Dosage de l’activité des caspa ses 3 et 9 par mesure
spectrophotomètrique
Principe
Les caspases sont des protéases qui sont activées au cours de l’apoptose caspase-dépendante
(cf. Etat de l’art). La caspase 9 est activée au cours de la voie mitochondriale uniquement
alors que l’activation de la caspase 3 est commune aux 2 voies : voie mitochondriale et voie
des récepteurs de mort. Les caspases clivent des séquences protéiques spécifiques : les
séquences DEVD et LEVD sont reconnues par les caspases 3 et 9 respectivement. Dans
chacun des kits, ces séquences sont marquées avec le chromophore p-nitroanilide (pNA) qui
est libéré et donc détecté en cas de clivage de la séquence par les caspases.
Mode opératoire
Chaque flacon de culture de 75 cm² est trypsiné (cf. Matériel et Méthodes §I.2.). Les culots
cellulaires sont rincés au avec 5 mL de PBS. Les cellules sont comptées pour obtenir un culot
de 2 à 5.106 cellules ; les cellules sont remises en suspension dans 50 µL de tampon de lyse
puis transvasées dans des microtubes. Les cellules sont incubées 10 min dans la glace puis
centrifugées à 10 000 g. Les surnageants sont récupérés pour le dosage des protéines (kit de
Pierce : cf. Matériel et Méthodes § II.1.). Les concentrations protéiques des échantillons sont
ajustées entre 100 et 200 µg dans 50 µL. 50 µL de "reaction buffer 2X/DTT" sont ajoutés
ainsi que 5 µ L du substrat DEVD-pNA (caspase 3) ou LEVD-pNA (caspase 9) concentré à
4mM. Les échantillons sont incubés 2 h à 37°C puis transférés dans une plaque 96 puits avant
la lecture au spectrophotomètre à 405 nm. Les témoins négatifs (sans substrat) et positifs
(traitement préalable à la staurosporine) sont analysés simultanément aux échantillons traités
au glyphosate.
- 93 -
Expression des résultats
La valeur d’absorbance du blanc est soustraite des valeurs d’absorbance des échantillons. Les
valeurs d’absorbance sont ensuite converties en pourcentages d’activité majorés par rapport
aux cellules témoins non traitées (0%).
- 94 -
IV.
Outils de mesure
1. La spectrométrie de masse
i.
Séparation des protéines en chromatographie bidimensionnelle
Principe
Le but de la chromatographie bidimensionnelle est de séparer les protéines selon 2 critères
pour obtenir une semi quantification des protéines en fonction de leur abondance relative dans
chaque échantillon. Le système proteomeLab™ PF2D est un système à 2 dimensions
commercialisé par Beckman Coulter géré de façon automatisée par le logiciel 32 Karat
Deltavue. Il combine une chromatofocalisation, la séparation des protéines en fonction de leur
pI (Point isoélectrique) en phase liquide sur gradient de pH ; et une étape de chromatographie
en phase inverse, la séparation des protéines en fonction de leur hydrophobicité. Ainsi les
échantillons collectés en fin de 1ère dimension sont ensuite séparés indépendamment en 2nde
dimension. Cette technique permet la séparation de mélanges protéiques complexes et la
collection de fractions liquides dans le but de les identifier ensuite par spectrométrie de masse.
La comparaison des spectres de masse des fractions collectées à pH identique, mais pour des
échantillons différents, permet une étude différentielle d’un protéome global.
Mode opératoire
Les échantillons en tampon Start sont dosés à l’aide d’un kit de Pierce (cf. Matériel et
Méthodes §II.2.) avec la BSA comme référence. Chaque échantillon cytosolique est ajusté à 1
mg de protéines dans 5mL avec du tampon Start.
1ère dimension :
La colonne de 1ère dimension est montée sur le module HPCF (High Performance
ChromatoFocusing) et équilibrée en tampon « Start » pH 8,5 pendant 2h.
- 95 -
La boucle d’injection de 5 mL est rincée avec 10 mL de tampon « Start » puis l’échantillon y
est injecté. La bascule de la boucle en ligne donne le signal de départ du programme de 1 ère
dimension suivant :
-
Tampon « Start » à un débit de 0,2 mL/min pendant 35 min
-
Injection du Tampon « Eluent » (pH 4,0, Beckman Coulter, France) au même débit
-
A la fin du gradient, injection de la solution de NaCl 1 M pour le lavage de la colonne.
Les protéines sont détectées à 280 nm et les fractions sont collectées, par défaut, toutes les 5
min ou, en cas de variation du pH, tous les 0,3 intervalles de pH, dans une plaque de 96 puits
dans le module FC/I qui permet leur maintien à 10°C, puis congelée à -20°C. En effet pour
une meilleure reproductibilité du gradient de pH, il est préférable de réaliser toutes les
fractions de 1ère dimension à la suite les unes des autres, et de les congeler avant le passage en
2nde dimension.
2nde dimension :
Les fractions de 1ère dimension sont mises à décongeler la veille à 4°C. La colonne de 2nde
dimension est montée sur le module HPRP (High Performance Reversed-Phase) et équilibrée
pendant 1h en eau TFA 0,1% dans un four à 50°C. La plaque de 1 ère dimension est replacée
dans le module FC/I à 10°C. Le programme de 2nde dimension est lancé selon un gradient
linéaire de 0,1% (v/v) TFA dans de l’eau ultra pure et de 0,08% TFA dans l’acétonitrile
(ACN) à un débit de 0,75 mL/min.
Les protéines sont détectées à 214 nm et les fractions issues de la 2nde dimension sont
collectées dans des plaques de 96 puits (REMP, Oberdiessbach, Suisse) puis congelées à 80°C en attendant l’analyse des spectres de 2nde dimension et le choix des fractions à identifier
par spectrométrie de masse.
Cette technique permet la détection des protéines de faible abondance, une bonne
reproductibilité, mais est peu utilisée en raison des problèmes techniques rencontrés
fréquemment par les utilisateurs de ce système (bouchage du système, non reproductibilité du
gradient de pH, fuites…). Nous avons disposé de cet appareillage dans un premier temps,
mais nous avons, nous aussi, rencontré des problèmes techniques récurrents qui nous ont
orientés vers l’électrophorèse bidimensionnelle.
- 96 -
ii.
Séparation des protéines en électrophorèse bidimensionnelle
Principe
La première dimension appelée isoélectrofocalisation consiste à séparer les protéines dans un
gel constitué d’un gradient de pH. Ces bandes de gels très fines sont réhydratées / chargées
avec l’échantillon et soumises ensuite à un champ électrique. Les protéines vont alors migrer
et s’immobiliser dans la zone du gel où la valeur du pH est égale à leur point isoélectrique.
Les protéines de pH acide vont migrer vers le pôle positif tandis que les protéines basiques
vont migrer vers le pôle négatif.
La seconde dimension est réalisée en SDS-PAGE (sodium-dodécylsulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis). Le strip de 1ère dimension est déposé au sommet d’un gel de polyacrylamide
(acrylamide/bis acrylamide) et la séparation s’effectue en présence d’un agent dénaturant, le
SDS. La réticulation du gel de polyacrylamide permet la séparation des protéines par tamisage
moléculaire, en fonction de leur taille et donc de leur poids moléculaire. La vitesse de
migration des protéines dans le gel est inversement corrélée à leur taille.
Pour la première comme pour la seconde dimension, plus la taille du gel est grande plus la
séparation des protéines sera résolutive et donc plus on a de chance d’obtenir une seule
protéine par spot séparé.
Mode opératoire
Nous avons utilisé un système de chez Amersham Biosciences (Freiburg, Allemagne) et la
totalité des consommables sont fournis par Bio-rad (Hercules, USA).
Les échantillons en tampon de réhydratation sont dosés à l’aide du dosage de Bradford
(Annexe) et ajustés avec du tampon de réhydratation pour obtenir 500 µg de protéines dans
450 µL. Dans les échantillons à déposer, 4,5 µL de biolites 3-10 100X (Biorad) et 1,5 µL de
bleu de bromophénol 2% sont ajoutés (0.005% final). Les strips 3-10 non linéaires (Biorad)
sont réhydratés pendant une nuit à l’obscurité.
- 97 -
L’isoélectrofocalisation (IEF) est lancée selon le programme suivant :
1min de 0 à 50 V
5 heures à 50 V
30 min de 50 à 350 V
2 heures de 350 à 3500 V
29 heures à 3500 V
Les strips sont ensuite rincés à l’eau ultrapure avant l’équilibration dans un tampon (Tris HCl
50 mM pH 8.8, Urée 6M, Glycérol 30%, SDS 2%) additionné successivement de 2% de DTT
pour 15 min d’incubation à TA et de 2,5% d’iodoacétamide pour 15 minutes d’incubation à
TA.
Les strips sont ensuite déposés sur un gel SDS-PAGE préparé selon le protocole suivant
(quantité pour 6 gels) :
-
160 mL d’eau ultra pure
-
100 mL de Tris 1,5 M pH8,8
-
4 mL de SDS 10%
-
133,2 mL d’acrylamide/bisacrylamide
-
3 mL d’Ammonium PerSulfate (APS) 10%
-
500 µL de Temed
Les strips sont montés sur les gels SDS-PAGE et fixés avec de l’agarose et ceux-ci sont
disposés dans la cuve avec le tampon de course (SDS 1%, Tris 25mM, 190 mM glycine)
La 2nde dimension est lancée selon le programme suivant :
5h à 35V
20h à 120 V
Coloration :
Les gels sont démontés et rincés 3 fois à l’eau ultrapure, puis colorés pendant 24 h avec du
bleu de coomassie (d’après Candiano et al., 2004). Les étapes de coloration puis de
décoloration sont réalisées sous agitation horizontale.
- 98 -
Décoloration :
Les gels subissent une succession de bains : un bain de 3 min dans un tampon Tris/ acide
phosphorique ph 6,5, un bain de 30 secondes dans 25% de méthanol et 2 bains consécutifs de
24 h dans 20% de sulfate d’ammonium l’un à température ambiante et l’autre à 4°C. Les gels
sont ensuite lavés à l’eau ultra pure avant d’être scannés. L’intensité des spots est analysée à
l’aide du logiciel Progenesis Samespot (NonLinear dynamics). Les spots d’intérêt sont
découpés et placés dans une plaque 96 puits. Ils sont ensuite lavés successivement avec 80 µL
de tampon bicarbonate (NH4HCO3) 0,1 M sous agitation douce pendant 10 minutes puis 80
µL d’ACN sous agitation douce pendant 10 min. Le surnageant est éliminé entre ces 2 étapes
qui sont répétées 2 fois.
iii.
Identification des protéines en MALDI-TOF-TOF
Principe
John B Fenn (Etats-Unis), Koichi Tanaka (Japon) ont obtenus en 2002 le prix Nobel de
chimie pour leur contribution à l’adaptation à la biologie des méthodologies spectroscopiques
majeures initialement conduites en chimie analytique.
Le principe de la spectrométrie de masse réside dans la séparation en phase gazeuse de
molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). On obtient alors un
spectre de masse exprimé en m/z en fonction de l’abondance relative de chaque ion.
Un spectromètre de masse se compose de 3 parties principales (fig. 18) :
-
La source qui induit la formation d’ions en phase gazeuse à partir d’un échantillon
biologique solide ou liquide.
-
L’analyseur qui va séparer les ions en fonction du rapport de leur masse sur leur
charge électrique.
-
Le détecteur qui convertit des ions détectés en signaux électriques et amplifie ces
signaux pour permettre le traitement des données informatiquement.
- 99 -
Figure 18 : représentation schématique de la composition d’un spectromètre de masse
La source MALDI (Matrix Assister Laser Desorption/Ionisation) :
Elle fut mise au point en 1988 : (Karas et Hillenkamp, 1988 ; Hillenkamp et al., 1991). La
spectrométrie de masse MALDI nécessite une phase de préparation de l’échantillon préalable,
le mélange de l’échantillon à une solution de petite molécule organiques appelées matrice
possédant une bande d’absorption à la longueur d’onde du laser (le plus souvent dans l’UV).
Le mélange est déposé sur une cible métallique et le solvant s’évapore avant l’analyse. Le
résultat est un dépôt d’un mélange échantillon/matrice co-cristallisé. La cible est ensuite
introduite dans la source du spectromètre de masse maintenue sous vide (10 -7 torr).
L’échantillon est frappé par de brèves impulsions laser. C’est la matrice hautement
concentrées qui absorbe la majorité des photons lasers. Les molécules de matrice sont alors
amenées à un état excité ce qui induit l’accumulation d’une grande quantité d’énergie qui se
convertie en mouvement thermique de ces molécules. A terme, l’excitation des molécules
provoque la sublimation des cristaux de matrice et leur expansion en phase gazeuse entraînant
l’échantillon peptidique. L’échantillon est alors ionisé dans le nuage moléculaire ainsi formé,
par un transfert de proton depuis la matrice ou par collision des molécules entre elles.
Dépôt de l’analyte et de la matrice :
La méthode choisie est dite « de la goutte séchée ». La matrice d’acide α-cyano4hydroxycinnaminique (α-HCCA) est mélangée directement avec l’analyte ce qui génère une
homogénéité de cristaux qui se retrouve dans la qualité des spectres. Ces cristaux étant très
résistants aux impulsions laser, il se prête bien aux analyses de type MALDI MS/MS et leur
procure une meilleure résolution, sensibilité et reproductibilité.
L’analyseur en temps de vol :
Dans son principe, l’analyseur en temps de vol, est le plus simple de tous. Une différence de
potentiel est appliquée aux ions une certaine énergie cinétique (Dempster 1918). La valeur de
- 100 -
m/z est directement déductible de la vitesse des ions donc du temps que met un ion pour
franchir une certaine distance fixe. Les ions volent d’autant plus vite qu’ils sont plus légers.
Le temps final correspond à l’arrivée sur le détecteur, le temps initial quant à lui dépens de la
source et de son mode d’ionisation. Dans le cas d’une source MALDI, le temps initial peut
être mesuré au moment du tir laser ou après rétention des ions dans la source par application
d’un potentiel pulsé. L’intérêt majeur de l’analyseur en temps de temps de vol est qu’il n’est
donc pas limité en masse peptidique et que tous les ions produits sont détectés.
Appareillage
L’appareil utilisé est un UltrafleXtrem (Bruker Daltonics)
Mode opératoire
Les fractions sélectionnées sont évaporées et remises en suspension dans une solution de
tampon carbonate (NH4HCO3, 0,1M).
Les étapes suivantes sont réalisées automatiquement à l’aide du robot Tecan Evo200 (Tecan,
Allemagne).
Les
étapes
de
réduction/alkylation
sont
réalisées
avec
du
Tris(2-
CarboxyEthyl)Phosphine (TCEP) (10mM), 30 min à 37°C et de l’iodoacétamide (55mM)
pendant 20 min à TA. La digestion des protéines en fragments peptidiques est obtenue par
digestion trypsique (1,6 ng/µL, Promega) pendant 2 h à 37°C.
Expression des résultats
L’identification la plus fiable se base sur la spectrométrie de masse en tandem, réalisée de
manière systématique sur nos échantillons au cours de l’étude. En effet, de manière
automatique, le logiciel Flex Control (Bruker Daltonics) réalise une interrogation des banques
de données protéiques simultanément à l’analyse dans le spectromètre. Après une première
analyse en empreinte peptidique, et selon des paramètres bien définis d’interrogation des
banques et d’abondance des peptides, le spectromètre procède à la fragmentation des peptides
d’intérêt et à l’analyse de la séquence d’acides aminés.
Une fois les informations de masses peptidiques et de séquences obtenues, on procède à
l’interrogation de banques de données protéiques dans un moteur de recherche, Mascot.
- 101 -
2. La microscopie confocale à fluorescence
i.
Principe de la fluorescence
La fluorescence est caractérisée par des transitions électroniques d’un état excité à un état
fondamental. Lorsqu’une quantité d’énergie lumineuse suffisante est apporté à une molécule,
cette molécule peut passer d’un état stable à un niveau excité supérieur. Après un certain
temps ses électrons quittent leur état excité pour retrouver leur état stable inférieur en
produisant de la lumière. Les fluorochromes font partie de ces molécules capables d’émettre
de la lumière après excitation par une source lumineuse à une longueur d’onde définie. Le
marquage des cellules par un fluorochrome permet d’accéder à 2 types d’information : des
paramètres fonctionnels (modification rapide de l’état d’une cellule vivante) ou structuraux
(macromolécules ou ensemble de molécules de plus faible taille).
ii.
Principe de la microscopie confocale
La microscopie confocale a permis de pallier un inconvénient majeur de la microscopie
conventionnelle : la superposition de différents plans focaux. Dans le cas de l’étude d’une
sonde fluorescente, il est essentiel de pouvoir distinguer des structures fines dans un plan
focal précis. Dans un microscope confocal, c’est un diaphragme variable en trou d’aiguille
(aussi appelé pinhole) qui permet d’éliminer les signaux fluorescents émis par d’autres plans,
et ainsi de réaliser des coupes optiques virtuelles (fig. 19).
- 102 -
Figure 19 : Principe de la microscopie confocale de fluorescence
Au-delà de cet avantage majeur, l’intérêt du microscope confocal réside dans d’autres points
grâce aux avancées en termes de multiplication des sources d’excitation laser de l’évolution
des logiciels de traitement des données :
iii.
-
Augmentation de la résolution
-
Acquisition de série de sections optiques permettant la reconstruction de l’objet en 3D
-
Elimination du bruit de fond
Appareillage
Les mesures sont réalisées sur un microscope confocal FV1000 Olympus comprenant 4 lasers
(405, 458-488-514, 543 et 633 nm), 3 objectifs (x10, x40 et x60 - les deux derniers en
immersion) et un système pour le contraste de phase interférentiel (DIC). La technologie de
l'appareil permet de détecter des longueurs d'ondes d'émission espacées de 2 nm seulement
(ex : FITC et GFP) et de faire des acquisitions d'au moins 5 marqueurs fluorescents.
- 103 -
3. La cytométrie en flux
i.
Principe
Le but de la cytométrie en flux est d’analyser dans un temps très court, et sur un très grand
nombre de cellules, un ou plusieurs paramètres mesurés de manière quantitative sur chaque
cellule. Pour cela, les cellules défilent une à une à grande vitesse dans une veine liquide, et
sont analysées par un laser. Plusieurs paramètres sont mesurés simultanément lors du passage
devant le laser :
-
Des paramètres de taille, de forme et de granulosité
-
Des paramètres biologiques liés à l’émission de lumière par un ou plusieurs
fluorochromes fixés à l’intérieur de la cellule
La photomultiplication de cette lumière permet la transformation des photons électriques en
signaux analogiques et l’analyse des données.
ii.
Appareillage
Les échantillons sont analysés sur le cytomètre FC500 (Beckman Coulter). Le FC500 est un
cytomètre en flux équipé de deux lasers (bleu 488nm et rouge 633nm) et de cinq
photomultiplicateurs avec des filtres optiques permettant d’analyser les longueurs d’onde de
fluorescence à 525, 575, 620, 675 et 760nm.
- 104 -
4. La Microscopie à Force Atomiqu e
i.
Principe
L’AFM a été introduite en 1986 comme une application du microscope à effet tunnel
permettant l’étude de surfaces de matériaux isolants. L’AFM est basée sur la mesure de forces
entre une pointe idéalement atomique et les atomes d’une surface à étudier (fig. 20). La pointe
est portée par un levier. Les forces d’interactions modifient la déflection de ce levier ; la
mesure de cette déformation est réalisée grâce à la déviation du faisceau lumineux d’une
diode laser réfléchie par l’extrémité de la pointe. Cette outil a une précision de mesure
subnanométrique et permet d’obtenir des images en temps réel de l’échantillon.
Les études peuvent être réalisées sur tout type d’échantillon, que ce soit dans l’air, en
atmosphère contrôlée, sous vide, à basse température, en champ magnétique et en liquide.
Figure 20 : Principe général du microscope à force atomique (www.cea.fr)
- 105 -
ii.
Appareillage
En mode contact
L’analyse AFM est réalisée sur un Nanoscope IIIa (Veeco, Santa Barbara, USA). Toutes les
images ont été acquises en mode contact en tampon PBS à l’aide d’un scanner de 100µm et
avec des pointes en Nitrure de Silicium ayant une constante de raideur entre 0,12 et 0,58 N/m.
Dans le cas de l’observation de cellules, sont en général enregistrées les images en hauteur et
en déflection. En effet, ces deux types d’images sont souvent utiles car fournissant des
informations complémentaires. Les images en hauteur fournissent des mesures quantitatives
de hauteur, permettant une mesure exacte des dimensions cellulaires et de la rugosité de
surface. Les images en déflection ne reflètent pas les variations réelles de hauteur, mais
comme ce signal de déflection est plus sensible aux détails fins de surface, elles sont utiles
pour révéler l’ultrastructure d’échantillons bombés et rugueux que sont les cellules.
Une fois le levier amené au contact de l’échantillon, et le scan de l’échantillon en x/y est
lancé. Une boucle de rétrocontrôle maintient la force (de consigne = setpoint value) constante
entre le levier et l’échantillon en bougeant le scanner piézoélectrique en z, pour chaque
coordonnées x/y. Ce changement en z correspond à la hauteur topographique de l’échantillon
en chaque point. L’image en 3 dimensions de l’échantillon est reconstruite en combinant
l’information dans les 3 directions pour donner l’image de l’échantillon « en hauteur ». Cette
image préserve les informations réelles de hauteur de l’échantillon.
Aussi, l’image « en déflection » peut être enregistrée, en suivant le signal de déflection du
levier. Cette image n’est pas enregistrée à force constante, les reliefs importants de
l’échantillon représentant les régions induisant une force élevée sur le levier, autrement dit
induisant un haut degré de déflection du levier. Ce signal, soustrait à la valeur de consigne du
système de rétrocontrôle (setpoint value), donne le signal d’erreur, qui est enregistré pour
constituer l’image en déflection de l’échantillon. Ce type d’image perd la réelle information
de hauteur, mais présente des détails plus précis de l’échantillon que l’image en hauteur, car la
réponse de la boucle de rétrocontrôle est plus rapide pour corriger la position d’un levier, que
pour corriger la position d’un bloc scanner piézoélectrique.
Les traitements d’image et les mesures de taille cellulaire ont été réalisés avec le logiciel
Image J.
- 106 -
En mode PeakForce Tapping
Le Microscope à Force Atomique utilisé ici est le Bioscope™ Catalyst™ avec ScanAsyst
(Bruker). Le piezo en z est actionné à l’aide d’une onde sinusoïdale et non triangulaire
(typiquement utilisée dans les mesure de force-distance) à une fréquence proche de la
fréquence de résonnance du levier (1 à 2 Hz) et à une amplitude de 150 nm habituellement
(300 nm pic à pic).
Le mode tapping (Zhong et al., 1993) est un mode de choix pour l’imagerie d’échantillons
biologiques car la pointe ne vient toucher la surface de l’échantillon que par intermittence à
une fréquence maintenue constante. Pour maintenir cette fréquence, il faut que le système
compense l’influence du relief topographique de l’échantillon sur la pointe par une rétroaction
positive. Un signal d’erreur est généré et les déplacements verticaux du scanner nécessaire au
maintien de l’amplitude enregistrée et servent à la reconstitution du relief de l’échantillon. Le
mode tapping permet également d’effectuer des mesures de forces en chaque point de
l’échantillon « tapé ». Ce mode présente quelques inconvénients car il nécessite des étapes de
préparation plus importantes et les scans sont plus lents que pour le mode contact. Cependant,
la dégradation de la surface est réduite, ce qui est un avantage non négligeable pour les
échantillons mous. En outre, l’avantage de la technologie PeakForce™ QNM™ est d’obtenir
la même résolution en mesure de force qu’en topographie. En effet à chaque pixel de l’image
en topographie, sont collectées plusieurs courbe de force. La moyenne de ses courbes de force
en chaque point permet l’obtention une cartographie des paramètres mécaniques (adhérence,
déformation, élasticité, dissipation).
Extraction des mesures de forces :
Contrairement au mode tapping classique, ici le signal de rétroaction positive est défini par la
PeakForce de la courbe de force-distance.
- 107 -
Figure 21 : Courbes de forces obtenues en PeakForce Tapping.
(i) Force et position en z du piezo en fonction du temps avec (B) l’entrée en contact avec
l’échantillon, (C) le PeakForce, (D) l’adhésion. (iii) représentation traditionnelle de la courbe de
force en fonction de la position en z du piezo, en s’affranchissant du temps. (iv) pour une meilleure
compréhension, la force en fonction de la séparation entre la pointe et l’échantillon, la séparation
est calculée en fonction de la position en z du piezo et la déflection du levier.
La figure 21(i) montre les forces d’attraction et de répulsion auxquelles est soumise la pointe.
La courbe en pointillé représente la position du piezo en z. La courbe du bas représente la
force lorsque la pointe s’approche de l’échantillon (bleu) et lorsqu’elle s’en éloigne (rouge).
En (B) la pointe, à l’approche de la surface de l’échantillon, est entraînée par des forces
d’attractions (type Van Der Walls, Electrostatiques…) qui surmontent la rigidité du levier et
amènent la pointe à la surface de l’échantillon. La force augmente positivement jusqu’à ce
que le piezo atteigne sa position maximale (C). C’est à ce moment-là que la force entre la
pointe et l’échantillon atteint sa valeur maximale (PeakForce). La pointe commence alors à se
retirer et la force diminue jusqu’à atteindre sa valeur minimale en (D), le point auquel la
pointe quitte l’échantillon. La figure 21 (iii) montre la superposition des forces en approche et
en retrait de la pointe. La figure 21 (iv) montre la manière dont les différentes données
physiques peuvent être extraites de la courbe de force-distance. Les valeurs d’erreur de
PeakForce (topographie), de Module de Young (raideur), de dissipation, de déformation et
d’adhésion peuvent être directement extraites depuis la courbe de force sans retraitement des
données préalables. Sont ainsi enregistrées des images en hauteur (topographie) et en
déflection, ainsi que des images issues des mesures du module de Young, des forces de
déformation, d’adhésion et de dissipation.
- 108 -
Cependant, l’extraction du module de Young est alors effectuée en suivant un modèle
mathématique particulier le DMT (du nom de ses trois concepteurs : Derjaguin, Muller et
Toporov). Or, c’est le modèle de Sneddon (Sneddon, 1965) que nous avons choisi d’utiliser
pour extraire le module de Young (cf Annexe 2, appendix). La figure 22 présente de manière
schématique les déformations de l’échantillon prise en compte, dans le calcul du module de
Young, selon chacun des modèles. Contrairement au modèle DMT qui considère la pointe
comme un objet sphérique, le modèle Sneddon tiens compte de la forme conique de la pointe
et sa manière d’indenter des échantillons mous comme les cellules vivantes. Il est
préférentiellement utilisé pour les échantillons biologiques (Domke et Radmacher, 1998 ;
Rotsch et Radmacher, 2000 ; Berdyyeva et al., 2005).
Figure 22 : Représentation schématique des déformations, induites sur l’échantillon par la pointe,
prises en compte dans les modèles mathématique de DMT et de Sneddon.
Une capture de données en haute vitesse du signal de courbe de force est effectuée pour
chaque image. Les données ainsi obtenues sont retraitées avec le logiciel Rainbow (Belikov,
2009).
- 109 -
- 110 -
RESULTATS
ET
DISCUSSION
- 111 -
- 112 -
I.
Identification des paramètres d’étude du
modèle glyphosate / HaCaT
Il était important de définir le cadre de l’étude en identifiant les paramètres nous permettant
d’explorer, de façon pertinente, les effets du traitement par le glyphosate des cellules HaCaT ;
ainsi, le temps de contact avec les cellules en culture et la gamme de concentrations de
glyphosate à tester, d’une part, puis le choix et les conditions d’exposition des antioxydants
d’autre part, seront étudiés et déterminés . Les travaux précédents menés au sein de l’équipe,
s’appuyant notamment sur des plans d’expérience, avaient déjà permis de produire de solides
données pour 18 et 24 h d’incubation des HaCaT en présence de glyphosate (Gehin et al.,
2005). La nécessité d’étendre le champ d’investigation à des temps de traitement plus courts
s’est imposée pour mieux appréhender les mécanismes impliqués dans la cytotoxicité du
glyphosate.
1. Cytotoxicité du glyphosate
Le potentiel cytotoxique du glyphosate sur la lignée kératinocytaire HaCaT a été mesuré et
comparé à différents temps de traitement (de 0,5 à 18 h) et pour des concentrations de
glyphosate de 0 à 70 mM.
Les valeurs calculées des concentrations inhibant 50% des cellules, ou CI50, mettent en
évidence la variabilité des effets du glyphosate sur les cellules HaCaT en fonction des temps
de contact.
- 113 -
temps d'exposition au G (h)
0.5
120
1
2
4
6
9
12
15
18
110
100
90
viabilité (%)
80
70
60
CI50
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
glyphosate (mM)
Figure 23 : Profils de cytotoxicité du glyphosate obtenus sur culture de HaCaT
Les cellules sont à confluence, après 0,5, 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15 et 18 h de traitement par le glyphosate
à différentes concentrations (de 0 à 70 mM). Les pourcentages de viabilité résiduelle sont calculés
par rapport à la condition témoin (100%). Ces valeurs sont le résultat de la moyenne de 3
expériences indépendantes. La flèche noire matérialise la valeur de CI50 (53 mM pour 0,5 et 1 h ;
48 mM pour 2 h, 43 mM pour 4 h ; 30 mM de 6 à 18 h)
Dans la figure 23, nous pouvons déterminer 2 grands groupes de profils cytotoxiques : le
groupe présentant une CI50 de 30 mM (de 6 h à 18 h d’incubation), et le groupe présentant
une CI50 de 53 mM (de 0,5 à 1 h). Les temps 2 h et 4 h ont des CI50 intermédiaires (48 et 43
mM respectivement). L’allure générale des profils cytotoxiques est caractéristique de ces
différents groupes. Pour des temps courts (0,5 à 4h), la viabilité cellulaire reste voisine de
100% pour les faibles concentrations en glyphosate (inférieures à 40 mM), alors que pour des
temps plus longs (6 à 18 h), elle chute dès les faibles concentrations : à 20 mM par exemple,
la viabilité résiduelle est de 80 %, voir d’avantage, alors qu’elle reste comprise entre 90% et
100% pour des temps courts. Pour des concentrations de glyphosate élevées, c’est-à-dire très
toxiques, la viabilité atteint un plateau proche de 15% pour des temps longs, et de 30% pour
des temps courts. Pour cette dernière observation, il faut noter que 6 h est une condition qui
fait exception puisqu’elle permet d’atteindre un plateau intermédiaire (23%).
- 114 -
2. Réversion
de
l’effet
du
glypho sate
par
les
antioxydants
Nous avons tenté d’inverser l’effet du glyphosate par l’ajout d’antioxydants classiques, bien
connus dans la littérature. Ces antioxydants permettront par la suite (cf. § II4iii) de
caractériser la réversion des perturbations fonctionnelles ou morphologiques induites par le
glyphosate.
La quercétine présente l’avantage d’être un composé soluble en milieu aqueux, et de ne pas
s’altérer rapidement à l’air, c’est pourquoi nous l’avons retenue comme antioxydant de choix
à tester. Des essais de cytotoxicité ont été effectués après 18 h de traitement simultané avec le
glyphosate et l’antioxydant. Des témoins « antioxydant seul » et « glyphosate seul » ont
permis de mesurer l’impact de l’antioxydant sur la viabilité cellulaire par rapport à des
conditions témoins. La figure 24 rapporte les valeurs de cytotoxicité relatives obtenues en
présence (Q+, à 50, 100, 150 et 200 µM) ou non (Q-) de quercétine, et les résultats sont
exprimés en déficit (valeurs négatives) ou bénéfice (valeurs positives) de pourcentage de
viabilité par rapport à la condition témoin (sans glyphosate, sans quercétine) évalué à 0% de
bénéfice ou déficit..
- 115 -
100
80
Différence de Viabilité (%)
Echantillon-Témoin
60
40
Q-
20
Q50
0
Q100
Q150
-20
Q200
-40
-60
-80
-100
Témoin
[Gly]15mM
[Gly]30mM
[Gly]45mM
Figure 24 : Résultats de réversion de la cytotoxicité du glyphosate (Gly) par traitement simultané à
la quercétine (Q) des HaCaT
Exprimés en différence de pourcentage de viabilité positive, ou négative par rapport à une condition
témoin. Une différence de viabilité positive ou la baisse de la valeur de la différence de viabilité
négative, traduit une réversion par la quercétine de la mort cellulaire induite par le glyphosate.
(Concentrations en quercétine de 50 à 200 µM, concentrations en glyphosate de 15 à 45 mM). Ces
valeurs sont le résultat de la moyenne de 3 expériences indépendantes.
De 50 à 200 µM, la quercétine n’est pas cytotoxique vis-à-vis des cellules témoins (en
absence de glyphosate). Nous avons également mis en évidence que la quercétine pouvait, de
façon significative, réverser l’action cytotoxique du glyphosate à la condition de CI50 (30
mM de glyphosate), car elle induit un bénéfice de viabilité dès 50 µM de quercétine.
- 116 -
3. Paramètres d’étude choisis
La stratégie originale d’exploration cellulaire que nous avons décidé d’entreprendre sur les
cellules HaCaT faisant appel à des techniques de caractérisation très diverses, et nécessitant
des mises au point délicates, il était important de définir avec précision les conditions de
traitements à partir des résultats de viabilité résiduelle exposés dans le paragraphe précédent.
Suite aux tests de cytotoxicité in vitro évalués par la technique du MTT, nous avons choisi de
poursuivre notre étude en sélectionnant 3 temps d’incubation : 0,5, 6 et 18 h. 0,5 et 18 h nous
amèneront à comparer temps de traitement court et long ; 6 h de contact est un temps
intermédiaire qui génère un profil cytotoxique du glyphosate similaire aux profils obtenus
avec des temps longs alors qu’il peut être considéré comme un temps court.
Le tableau 1 recense les CI50 de glyphosate utilisées pour l’étude des 3 temps d’incubation.
Le profil cytotoxique étant différent selon le temps étudié, il sera plus juste de comparer les
comportements cellulaires en fonction du pourcentage de cytotoxicité du glyphosate plutôt
qu’en fonction de sa concentration dans le milieu.
Tableau 1 : CI50 obtenues pour chacun des 3 temps d’incubation (0,5, 6 et 18 h)
Temps d’incubation (h)
CI50 (mM)
0,5
6
18
53
30
30
La quercétine, quant à elle, a été utilisée pour l’étude morphologique en AFM (§ IV.4.iii) à la
concentration de 100 µM, en vue de réverser les effets du glyphosate à 15 et 30 mM pendant
18 h de traitement.
- 117 -
4. Discussion
La toute première étape était de définir les paramètres expérimentaux d’exposition des
cellules au glyphosate (temps de contact, concentrations).
Le profil cytotoxique du glyphosate a été établi grâce au suivi de l’activité enzymatique
mitochondriale reflétant la viabilité des cellules après traitement. Le double intérêt de cette
technique colorimétrique en microméthode est sa rapidité et sa facilité de mise en œuvre pour
définir précisément les effets du glyphosate sur les cellules HaCaT en termes de mort
cellulaire. La gamme de concentrations de glyphosate utilisée ici (15 à 70 mM) a déjà été
validée au sein de notre laboratoire (Géhin et al., 2005, 2006) et confirmée par Malatesta et
ses collaborateurs (2008 ; environ 2mg/mL soit concentration de l’ordre de 10 mM) qui ont
utilisé le glyphosate sans aucun adjuvant.
Les profils cytotoxiques ont été réalisés pour différents temps de contact allant de 0,5 à 18 h.
Lors d’une étude antérieure menée par A. Géhin dans le cadre de sa thèse (2006b), il avait été
montré que des périodes d’incubation allant de 18 h à 24 h n’entraînaient pas de changement
des profils cytotoxiques du glyphosate. Ainsi, il nous a paru pertinent de tester des temps de
contact plus courts (de l’ordre de l’heure voire moins) afin d’étendre notre champ
d’investigation et d’optimiser les conditions expérimentales d’étude de notre modèle. Le test
explorant l’influence de différents temps de contact glyphosate-HaCaT, s’échelonnant de 0,5
h à 18 h, a montré que la CI50 est identique entre 6 h à 18 h de traitement, mais également
pour des temps très courts de 0,5 et 1 h, alors que cette valeur de CI50 varie sensiblement
entre 2 h et 4 h. Si l’écart très restreint entre 0,5 et 1 h peut expliquer une CI50 stable, ce n’est
plus le cas pour les 2 temps de 6 h et 18 h, où l’intervalle de temps est bien supérieur.
Finalement, nous avons fait le choix de présenter les résultats de notre étude en fonction du
pourcentage de toxicité qu’induit le glyphosate sur les cellules HaCaT, et non en fonction de
de la concentration de glyphosate testée. La valeur de référence utilisée en cytotoxicité est la
CI50 qui est la concentration de glyphosate induisant la mortalité de 50 % des cellules en
culture, mais nous utiliserons parfois également d’autres CI moins toxiques.
- 118 -
Nous pouvons également constater que les conséquences cytotoxiques du stress oxydant
induit par le glyphosate sur les cellules HaCaT ne seraient pas seulement dose-dépendantes,
mais aussi temps-dépendantes. Le choix d’étudier 3 temps de contact, dans notre stratégie de
caractérisation du modèle glyphosate / HaCaT, va nous aider, d’une part, à comparer les
résultats obtenus suite aux différentes techniques d’exploration cellulaire mises en œuvre,
après un traitement très court (0,5 h) et long (18 h), et d’autre part, à discriminer 6 h et 18 h
d’incubation, car des profils cytotoxiques similaires n’induisent pas systématiquement des
conséquences cellulaires identiques, étant données les 12 h d’intervalle entre ces 2 conditions
de traitement.
L’équipe de Seralini (Richard et al., 2005 ; Benachour et al., 2007, 2009) a démontré que la
mort cellulaire induite par les formulations commerciales de glyphosate était plus la
conséquence des effets de la formulation complète que du glyphosate seul. Ces auteurs
suggèrent que les adjuvants contenus dans les formulations, comme le POEA, jouent un rôle
dans la mort cellulaire par nécrose, caractérisée par l’altération d’organites cellulaires (le
gonflement et la rupture des mitochondries) et de la membrane cellulaire. De plus, les
adjuvants peuvent provoquer une bioaccumulation et/ou modifier le délai d’action du
glyphosate. Ici, nous utilisons la molécule de glyphosate pure, s’affranchissant d’une
variabilité dans le délai d’action ou dans un processus de bioaccumulation.
Les paramètres d’étude du modèle étant définis, le premier volet de la caractérisation peut être
présenté. Il découle directement des travaux de thèse d’Audrey Géhin (2006b) qui reposaient,
entre autres, sur une étude biochimique révélant les conséquences pro-oxydantes du
traitement des cellules HaCaT par le glyphosate, et, rapportant le dysfonctionnement de
certaines capacités antioxydantes des cellules traitées. L’un des objectifs fixés dans mon
projet de thèse a été d’approfondir ces données en caractérisant de la façon la plus précise
possible, grâce à une étude protéomique, l’impact de ce stress oxydant sur certaines protéines
cellulaires dont les variations reflètent l’état, plus ou moins altéré, des cellules épidermiques.
- 119 -
- 120 -
II.
Caractérisation de biomarqueurs
protéiques cytosoliques
L’étude protéomique fait suite aux travaux de caractérisation biochimique d’Audrey Gehin au
cours de sa thèse (2006b). Cette étude protéomique de notre modèle original glyphosate /
cellules HaCaT est particulière dans sa mise en œuvre puisqu’elle est réalisée sur des fractions
cellulaires. En effet, cette étude se place dans le contexte plus global de la cartographie
protéomique de ce modèle pour chacun des compartiments cellulaires. L’objectif est de
révéler les expressions différentielles de protéines impliquées dans le déséquilibre de la
balance pro/antioxydante, et dans les mécanismes moléculaires que ce déséquilibre perturbe.
Ce chapitre présente les résultats obtenus à partir des extraits protéiques cytosoliques en
chromatographie et en électrophorèse bidimensionnelles.
1. Profils
protéomiques
obtenus
en
chromatographie
bidimensionnelle
L’analyse en spectrométrie de masse de fractions protéiques issues de la séparation en
chromatographie 2D s’est limitée à un seul essai suite à des problèmes récurrents d’ordre
technique. Par voie de conséquence, nous avons dû nous orienter vers la méthode de
séparation par électrophorèse 2D. Cependant, nous présentons tout de même les résultats de
chromatographie car ils ont permis d’identifier certaines protéines retrouvées également lors
des expériences d’électrophorèse bidimensionnelle.
i.
Chromatographie de 1ère dimension
La chromatographie en première dimension consiste à séparer les protéines en fonction de
leur charge. Elle s’effectue selon un gradient de pH (de 8,5 à 4). Il est important pour une
bonne reproductibilité du fractionnement que la pente du gradient de pH soit identique entre
les différents échantillons. La figure 25 présente les gradients de pH ainsi que la répartition
des fractions de première dimension pour l’échantillon témoin et l’échantillon traité par le
glyphosate (CI50 : 53mM, 0,5 h).
- 121 -
a
b
Figure 25 : Profils d’élution en gradient décroissant de pH, en chromatographie bidimensionnelle
Réalisée pour le fractionnement de 1ère dimension (de pH 8,5 à 4) des fractions cytosoliques des
échantillons HaCaT témoin (a) ou traité avec 53 mM de glyphosate pendant 0,5 h (b).
- 122 -
Les pentes des 2 gradients de pH (témoin et échantillon traité) sont parfaitement
superposables, mais les problèmes de stabilité de pH qui apparaissent dans le plateau, avant le
début du gradient, provoquent un décalage dans la collecte (fraction 17 témoin = fraction 15
traitée). Il s’agit ici d’un problème technique récurrent de l’appareillage de PF2D, qui, malgré
2 h de stabilisation du pH en tampon Start, a présenté des signes d’instabilité du pH en début
de « run » de 1ère dimension. Une autre conséquence de cette instabilité est un décalage dans
le temps (début de la fraction 17 à 72 min et début de la fraction 15 à 70 min). En effet le
logiciel de fonctionnement de la chromatographie bidimensionnelle est préréglé pour collecter
des échantillons au rythme des variations de 0,3 pH et par défaut toutes les 4 minutes. Le
plateau normalement stable donne lieu à la collecte d’échantillons par défaut, mais ici des
changements de pH supérieur à 0,3 ont provoqué une collecte différente entre les 2
échantillons au sein même du plateau.
Il est important d’en tenir compte dans l’interprétation des résultats : les fractions ne sont pas
parfaitement comparables. Ceci sera préjudiciable pour l’établissement de cartes protéiques
différentielles entre contrôle et essai.
ii.
Chromatographie de 2nde dimension
La chromatographie en seconde dimension consiste à séparer chaque fraction de première
dimension en fonction de l’hydrophobicité des protéines. Les spectres de 2nde dimension sont
ensuite analysés pour déterminer les échantillons à identifier en MS. La comparaison des
spectres entre les 2 échantillons (traité et non traité par le glyphosate) permettent
l’établissement d’une carte différentielle des protéines exprimées. Ainsi, ne sont testées, en
MS, que les fractions présentant un différentiel dans leur contenu en protéines. Chaque
échantillon issu de la 2nde dimension est ensuite, après digestion par la trypsine, soumis à
l’identification en spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).
90 fractions, sur les 840 issues de la séparation en chromatographie bidimensionnelle, ont
présenté une analyse différentielle en protéines, entre échantillon traité et non traité par le
glyphosate.
- 123 -
Sur ces 90 fractions testées, 18 ont donné une identification en MS, 27 en MS/MS. La
concentration par évaporation des échantillons, non identifiés en premier lieu, ont permis
d’ajouter 2 identifications MS et 4 identifications MS/MS. Seules les échantillons identifiés
en MS/MS, avec ou sans identification MS préalable, soit 31 fractions, c’est-à-dire 34,4% des
fractions testées, sont prises en compte dans l’interprétation des résultats. Face à ce rendement
d’identification, des recherches de modifications des protéines par ajout d’une molécule de
glutathion ont été réalisées. Aucune des fractions récoltées ne contient de protéines modifiées.
iii.
Biomarqueurs protéiques du stress induit par le glyphosate : étude en
chromatographie 2D
Résulte de ce premier essai concluant en chromatographie 2 dimensions, l’identification de 6
protéines cytosoliques différentiellement produites par les cellules traitées par le glyphosate
(53 mM) pendant 0,5 h versus la condition témoin. Ces protéines sont recensées dans le
tableau 2.
Tableau 2 : Bilan de la séparation en PF2D.
Protéines sur- ou sous-exprimées en conditions CI50 versus témoin, dans le cytoplasme des cellules
HaCaT en réponse au glyphosate. HSP27 : Heat Shock Protein 27, KPYM : Pyruvate Kinase
isozyme M1/M2, GSTP1 : Glutathione S Transferase P1.
Swissprot
ID
Protéine
Score
Masse
Couverture de
Mascot
(Da)
Séquence (%)
106,6
22,8
8,3
P14618
KPYM
119,0
57,9
8,5
P06733
α énolase
237,1
47,1
10,1
P68104
Facteur
d’élongation 1 α1
185,4
50,1
11,3
P09211
GSTP1
249,5
23,4
31
P10768
Sformylglutathione
hydrolase
145,0
31,5
7,8
- 124 -
Sur
exprimées
HSP27
Sous exprimées
P04792
Expression
Les fonctions des différentes protéines identifiées dans le tableau 2 seront commentées plus
loin, dans le paragraphe II.3. « Résumé : biomarqueurs caractéristiques des effets du
glyphosate sur les cellules HaCaT ». On peut cependant souligner, dès maintenant, la surexpression d’une enzyme du cycle redox du glutathion (Glutathione S Transferase P1)
largement impliquée dans la détoxification antioxydante intracellulaire.
La sous-expression de 5 autres protéines semble traduire une réduction de l’activité
enzymatique jouant un rôle dans le maintien de l’homéostasie cellulaire
L’appareillage du PF2D ayant montré ses limites, autant au niveau technique qu’en matière de
rendement d’identification, nous avons décidé de nous orienter vers l’E2D qui bénéficie d’un
regain d’intérêt, depuis ces dernières années, en raison de l’évolution de la technique, la
modernisation des équipements, des logiciels d’analyse d’images plus performants et de la
l’amélioration de la sensibilité de détection des techniques de coloration.
2. Profils
protéomiques
obtenus
en
électrophorèse
bidimensionnelle
L’électrophorèse 2D présente l’avantage d’être meilleur marché que la chromatographie 2D,
et d’être plus simple à mettre en œuvre d’un point de vue technique et temps de manipulation.
Le matériel d’électrophorèse 2D nous a été prêté par le Dr. Stéphane Bourque, de l’INRA de
Dijon, qui m’a gentiment formée à sa pratique. J’ai pu également utiliser le scanner et le
logiciel d’analyse des gels de l’INRA, avec le concours du Dr. Christelle Guillier, de
Delphine Aimé et d’Aloui Achref.
L’électrophorèse 2D a été réalisée en triplicata sur 2 échantillons : un échantillon témoin et un
échantillon traité par 45 mM de glyphosate (CI50) pendant 6 h et 18 h. Les résultats qui sont
présentés ci-dessous concernent le temps de traitement de 6 h qui générait une meilleure
reproductibilité.
- 125 -
i.
Rendement d’identification par spectrométrie de masse
96 spots issus des gels E2D ont été soumis à l’identification par MS. Chaque spot a été
découpé sur le gel où son intensité était la plus élevée. Après digestion par la trypsine et
extraction en gel, les protéines sont identifiées par spectrométrie de masse en tandem. Les
échantillons ont été soumis à l’identification une première fois, puis après concentration pour
les échantillons n’ayant pas donné de résultats ou des résultats non concluants en termes de
score Mascot. On obtient un rendement final de 80% d’identification en MS/MS soit 77 spots
identifiés sur les 96 initiaux. De manière générale, pour la même méthode de travail sur le
spectromètre de masse et d’interrogation des banques de données sous Mascot, le rendement
d’identification est
meilleur pour l’électrophorèse bidimensionnelle que pour la
chromatographie bidimensionnelle. En effet, le travail sur un spot en gel solide électrophorèse
nous affranchit des problèmes de décalage dans la collecte des fractions en chromatographie
et des éventuelles pertes de protéines au cours des transferts entre tubes.
ii.
Reproductibilité des migrations électrophorétiques 2D
La reproductibilité des migrations électrophorétiques sur gels sous-entend la reproductibilité
de l’intensité d’un même spot pour un même échantillon. Elle dépend de la répétition des
différents paramètres entrant en compte dans la réalisation des 2 dimensions. Les 6 strips de
1ère dimension sont isoélectrofocalisés au cours de la même manipulation, et sont ensuite
congelés à -80°C. Nous disposons d’une cuve de 6 gels où les triplicatas de chaque condition
subissent une migration simultanée pour garantir une bonne reproductibilité. Malgré toutes les
précautions prises, deux paramètres limitant subsistent :
-
Un certain nombre de solutions tampon sont à préparer extemporanément. Malgré une
préparation rigoureuse, des étapes comme l’ajustement du pH peuvent induire une
faible variabilité.
-
La réhydratation peut ne pas être homogène pour les 3 strips d’un même échantillon
- 126 -
iii.
Biomarqueurs protéiques du stress induit par le glyphosate : étude en
électrophorèse 2D
Figure 26 : Migration sur gel d’électrophorèse 2D des protéines cytotosoliques exprimées
différentiellement après traitement au glyphosate
(entourées et chiffrées de 1 à 8) à partir des extraits cytoplasmiques de cellules HaCaT. la migration
de première dimension (horizontalement) sépare les protéines selon un gradient de pH (de 3 à 10) et
la seconde dimension (verticalement) sépare les protéines selon leur poids moléculaire.
8 protéines, numérotées de 1 à 8 dans la figure 26, sont désignées par notre analyse comme
biomarqueurs cytoplasmiques potentiels du stress induit chimiquement par le glyphosate sur
les cellules HaCaT. Les caractéristiques d’identification en masse de ces protéines, ainsi que
leur expression, sont résumées dans le tableau 3.
Il est à signaler que le spot 5 se trouve à côté d’autres spots alignés sur le gradient de pH ; il
s’agirait d’une isoforme possédant une modification post-traductionnelle, en plus ou en
moins.
- 127 -
Tableau 3 : Bilan des résultats de la séparation en électrophorèse 2D
Protéines sur- ou sous- exprimées en conditions CI50 versus témoin dans le cytoplasme des cellules
HaCaT en réponse au glyphosate.
Swissprot
ID
Protéine
Score
Masse
Couverture de
Mascot
(Da)
Séquence (%)
P14618
KPYM
139,0
57,9
5,5
2
P06733
α énolase
237,1
47,1
6,9
152,8
32,8
55,6
Protéine
3
P08865
ribosomale
40s
P29401
Transketolase
177,0
67,8
31,5
5
P60709
β actine
164,9
41,7
7,2
6
P04406
202,0
36
11,0
7
P23528
106,4
18,5
11,4
85,4
56,7
5,3
G3P
déhydrogenase
Cofiline 1
Protéine
8
P30101
disulfide
Sur exprimées
4
Sous exprimées
1
Expression
isomérase
La petite proportion de protéines exprimées différentiellement (repérées en électrophorèse)
comparée au rendement d’identification en MS, s’explique par un défaut de reproductibilité
des résultats. En effet, la variabilité des mesures d’intensité de spots entre les différents gels
induit des écarts types élevés. Les protéines présentées dans le tableau sont celles dont la
différence d’expression est significative entre condition témoin et condition traitée.
- 128 -
3. Résumé : biomarqueurs caractéristiques des effets
du glyphosate sur les cellules HaCaT
Tableau 4 : Fonctions des protéines sur- ou sous-exprimées en conditions CI50 versus témoin dans
le cytoplasme des cellules HaCaT en réponse au glyphosate.
Swissprot ID
Protéines
fonctions
P14618
KPYM
Glycolyse et apoptose caspase-indépendante des cellules
tumorales
P06733
α énolase
P04792
HSP27
Résistance au stress et organisation de l’actine
P68104
Facteur
d’élongation 1 α1
Liaison de l’ARNt au ribosome durant la synthèse
protéique, facteur de transcription
P09211
GSTP1
Transfert du glutathion sur des molécules hydrophobes et
électrophiles
Expressions
CI50
Multifonctionnelle : glycolyse, control de la croissance,
ribosomale 40s
Assemblage et stabilité de la sous unité ribosomale 40S,
récepteur de surface pour la laminine, adhésion de la
membrane basale cellulaire
P29401
Transketolase
Voie des pentoses phosphate
P60709
β actine
Composant du cytosquelette
P10768
Sformylglutathione
hydrolase
Sérine hydrolase impliquée dans la détoxification du
formaldéhyde
P23528
P30101
déshydrogénase
Cofilin 1
Protéine disulfide
isomérase
Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, activité
nitrosylase dans le noyau (transcription, réplication,
transport d’ARN, apoptose)
Rôle pH-dépendant de dépolymérisation de l’actine
Réorganisation des ponts disulfures des protéines
- 129 -
Surexprimées
P04406
G3P
Sous-exprimées
P08865
Protéine
tolérance à l’hypoxie, réactions allergiques
Suite aux résultats très intéressants que nous avons obtenus par les 2 méthodologies décrites
ci-dessus, nous avons récapitulé, dans le tableau 4, les différents biomarqueurs qui ont
présenté des variations significatives sous l’effet du stress induit par le glyphosate dans les
cellules HaCaT. Afin de mieux comprendre les acteurs de ce stress, nous avons résumé
brièvement les principales fonctions de chaque protéine impliquée.
Parmi les protéines sur-exprimées, la plupart ont des fonctions dans le renforcement des
défenses cellulaires contre un stress : détoxification, apoptose, réorganisation du cytosquelette
et de la configuration des protéines.
Ainsi, la S-formyl glutathion hydrolase est une enzyme impliquée, entre autres, dans la
détoxification intracytoplasmique, grâce au pouvoir antioxydant du glutathion qui, à l’état
réduit, est le thiol majoritaire responsable de l’équilibre redox de la cellule. Par ailleurs, la
cofiline 1 est connue pour être impliquée dans la dépolymérisation et la fragmentation des
filaments d’actine, importante dans le maintien de la structure de la cellule, et donc de son
intégrité ; de même, la disulfide isomérase, grâce à son action sur la conformation 3D des
protéines, est essentielle à la mobilisation des défenses cellulaires en réponse à un stress.
Les protéines sous-exprimées sont également impliquées dans des processus dynamiques
intracytoplasmiques comme l’organisation du cytosquelette, la régulation des voies
métaboliques et des réponses au stress nécessaires au maintien de l’homéostasie cellulaire. Il
faut signaler que la pyruvate kinase isozyme M1/M2 et de l’α énolase sont identifiées par
spectrométrie de masse après séparation, à la fois par électrophorèse et par chromatographie
bidimensionnelle.
Il est intéressant de souligner que la pyruvate kinase isozyme M1/M2, sous-exprimée dans le
modèle glyphosate / HaCaT, joue un rôle dans la mort cellulaire caspase-indépendante. Il est
alors justifié de s’interroger sur la nature de la mort cellulaire induite par le glyphosate,
question à laquelle nous tenterons de répondre dans le paragraphe suivant (cf. §III.).
- 130 -
4. Discussion
Cette étude a été réalisée en comparant quantitativement le contenu protéique du cytosol des
cellules témoin non traitées avec celui de cellules traitées par le glyphosate à la CI50. Nous
avons fait le choix de cette condition pour garantir la mesure d’effets visibles de l’effet du
glyphosate sur l’expression protéique. La thèse d’Audrey Gehin (2006b) avait permis
d’obtenir un état des lieux complet au niveau biochimique de la balance antioxydante
cellulaire par, notamment, des études d’activité d’enzymes antioxydantes comme la SOD, la
catalase, mais aussi le dosage du glutathion réduit et oxydé. Cette dernière molécule, de par sa
fonction thiol, est un acteur essentiel des défenses antioxydantes intracellulaires capables
d’inactiver des Espèces Réactives de l’Oxygène (ERO).
L’importance du glutathion dans la réponse cellulaire au glyphosate, est confirmée par notre
étude protéomique, qui a mis en évidence la sous-expression, dans le cytosol, de la Glutathion
S Transferase P1 (GSTP1), après un traitement en condition CI50. La GSTP1 est connue pour
être activée lors d’un processus de défense antioxydante, ou même lors de la stimulation du
système cellulaire par un antioxydant tel que la curcumine (Nishinaka et al., 2007). Black et
ses collaborateurs (2008a et b) ne signalent pas d’effet des UVB sur l’expression de la
GSTP1, que les kératinocytes soient différenciés ou non. Par contre, la sur-expression de la
protéine a été révélée dans des lysats totaux cellulaires de kératinocytes murins en culture
primaire, en réponse au paraquat, autre pesticide de la famille des Bipyridylium, mais surtout
chez les cellules différenciées. Le paraquat crée, en contact avec les électrons libres libérés
par la chaîne respiratoire, un radical qui va avoir un rôle direct dans l’induction du stress
oxydant, en réagissant avec l’oxygène, pour engendrer de nouveaux ERO ; cela ne semble
donc pas être le même mécanisme d’action que le glyphosate. On remarque cependant que la
GSTP1 joue un rôle important dans le stress oxydant induit par un xénobiotique du type
pesticide, ce qui est cohérent avec notre modèle. En outre, notre étude protéomique a été
réalisée à la condition de la CI50, et nous permet ainsi d’observer des événements aboutis,
mais, en contrepartie, le stress que subit la cellule à cette condition est important, et de ce fait
son métabolisme est déjà très perturbé. Plutôt qu’une sur-expression de la protéine comme
signe de défense accrue de la cellule, nous assistons peut-être dans ces conditions, à une sousexpression due à la dérégulation des mécanismes de défenses antioxydantes. Dans le cytosol
des cellules HaCaT, la sous-expression de la protéine GSTP1 a été détectée uniquement par
chromatographie bidimensionnelle. En effet, bien que ces 2 techniques, chromatographie et
- 131 -
électrophorèse bidimensionnelles, présentent une séparation en première dimension identique
en fonction du pHi, la séparation en 2nde dimension se fait en fonction de l’hydrophobicité des
protéines en chromatographie, et en fonction du poids moléculaire en électrophorèse ; cette
différence peut expliquer le non recoupement de toutes les protéines identifiées.
En outre, il faut souligner que la sous-expression de 2 autres protéines a été confirmée par les
2 techniques de séparation/quantification des échantillons, la chromatographie et
l’électrophrèse bidimensionnelles malgré des critères de séparation des protéines différents. Il
s’agit de l’α énolase et de la pyruvate kinase isoenzyme M1/M2.
Les énolases constituent une superfamille d’enzymes connues pour être des lyases, entraînant
la rupture des liaisons entre carbone et oxygène, avec un rôle dans la glycolyse. Mais elles
disposent également d’une activité régulatrice, notamment dans leur capacité à devenir
récepteur au plasminogène après intégration à la membrane, sans même posséder de séquence
signal (Pancholi, 2001). Elles interviennent aussi dans la réponse à un stress hypoxique ou
ischémique (Mizukami et al., 2004; Sousa et al., 2005) et dans la maladie d’Alzeihmer (Dotti
et al., 2004 ; Butterfield et Lange, 2009). De plus, l’α énolase est codée par le même gène
(ENO1) que MBP1 (c-myc promoter-binding protein 1) ; selon les besoins de la cellule, il y a
transcription en ARNm de la MBP1 ou en ARNm de l’α énolase.
Comme cela a été démontré lors de la réponse à l’hypoxie de cellules cancéreuses qui, pour
s’adapter, produisent moins de MBP1 et plus d’α énolase (Sedoris et al., 2010), il se peut que,
dans le cas de notre modèle, il y ait sous-expression de l’α énolase au profit de MBP1 qui
empêche la transcription du gène c-myc dans le noyau, pour favoriser la réparation de l’ADN.
MBP-1 étant une protéine nucléaire, il n’est pas possible, à ce stade de l’étude réalisée
uniquement sur la fraction cytosolique, de constater la diminution de l’expression de cette
protéine dans le noyau.
Une autre hypothèse serait la migration de l’α énolase vers la membrane pour participer à
l’activation du plasminogène. Son recrutement par la membrane plasmique entrainerait de ce
fait, après le traitement par le glyphosate, une diminution de sa concentration dans le cytosol.
- 132 -
La pyruvate kinase isoenzyme M1/M2 joue un rôle dans la glycolyse et l’apoptose caspaseindépendante des cellules tumorales. De nombreuses études, portant sur des tumeurs ou des
cellules tumorales, démontrent des changements dans l’expression de cette protéine. Il faut
souligner que, lors des processus de tumorigenèse, cette protéine est associée à d’autres
protéines que nous avons également mises en évidence : l’α énolase, la cofiline (Kumar et al.,
2009), la GSTP1 et la transketolase (Trojanowicz et al., 2010).
Cette étude protéomique a été effectuée sur les cellules HaCaT, traitées par la CI50 du
glyphosate, afin de visualiser au mieux ses effets sur l’expression protéique. Nous verrons,
par la suite, l’intérêt d’étudier des concentrations en glyphosate moins délétères sur ces
cellules. En effet, le deuxième axe de recherche de notre projet est la caractérisation de la
mort cellulaire induite par le glyphosate dans le modèle HaCaT. L’utilisation d’un panel plus
large de concentrations de glyphosate, plus et moins cytotoxiques, nous a permis de qualifier
et de quantifier plus précisément la réponse des cellules HaCaT au glyphosate.
- 133 -
- 134 -
III.
La mortalité induite par le glyphosate
Après avoir défini les conditions expérimentales (temps de contact, concentrations) et réalisé
l’étude protéomique de l’altération des cellules épidermiques sous l’effet du glyphosate,
l’exploration des conséquences fonctionnelles au niveau cellulaire a pu être envisagée. Les
répercussions biochimiques du déséquilibre des capacités antioxydantes provoqué par le
glyphosate ayant déjà été identifiées antérieurement (Gehin et al. 2006), nous avons voulu
évaluer, de façon directe et quantitative, la libération des ERO intracellulaires au sein de la
cellule, étape préalable indispensable à l’exploration des mécanismes de mort cellulaire
induite par le glyphosate sur les cellules HaCaT.
Ces travaux viennent de faire l’objet d’une publication dans le journal « Environmental
Toxicology and Pharmacology » (Heu et al., 2012b) (cf. Annexe 3).
1. Le glyphosate : un pro oxydant avéré
Deux techniques ont été mises en œuvre : la microscopie confocale, qui permet de révéler la
production des ERO intracellulaires, et la cytométrie en flux, qui propose une étude
quantitative de cette production.
i.
Evaluation de la production des ERO par microscopie confocale
Le DCFH-DA marque la quantité totale d’ERO produite sur un temps donné : ce
fluorochrome réagit avec le peroxyde d’hydrogène, majoritairement présent dans la cellule,
au fur et à mesure de sa formation, et génère une fluorescence qui est détectée
microscopiquement (cf. Matériel et Méthodes §III.3.ii). Les images présentées dans la figure
27 sont obtenues en microscopie confocale, en marquant les kératinocytes au DCFH-DA,
après traitement des HaCaT pendant 0,5 h avec 53 mM de glyphosate, et comparativement
aux cellules témoins sans glyphosate. On constate que la formation d’ERO est beaucoup plus
intense et étendue autour du noyau après le traitement par le glyphosate, ce qui signifie qu’il y
- 135 -
a eu plus d’ERO produites pendant le traitement chimique, et leur localisation s’étend de la
région péri-nucléaire vers le compartiment cytoplasmique.
Figure 27 : Images du marquage des ERO des cellules HaCaT obtenues en microscopie confocale.
En condition témoin (a) et traitées au glyphosate (b) à 53 mM pendant 0,5 h. Les images ont été
capturées avec une même intensité de laser et des paramètres de retraitement du signal
informatique identiques.
Ce marquage qualitatif peut néanmoins être classé comme semi-quantitatif car les images ont
été réalisées avec des intensités de laser et des paramètres d’amplification du signal identiques
entre les échantillons traités et l’échantillon témoin. Ces premiers tests nous permettent
d’appréhender les résultats quantitatifs attendus en cytométrie en flux.
ii.
Quantification de la production d’ERO
La surproduction d’ERO intracellulaires
Les résultats des différentes mesures en cytométrie en flux, après 0,5 h, 6 h et 18 h
d’incubation avec le glyphosate, ont été reproduits au moins 3 fois et collectés. Ils sont
présentés sous forme de moyennes, dans la figure 28.
- 136 -
Figure 28 : Production des ERO évaluée en cytométrie en flux
Cellules positives aux ERO en fonction d’un traitement au glyphosate de cytotoxicité croissante à
0,5, 6 et 18 h d’incubation.
Les histogrammes attestent de la surproduction d’ERO en réponse au glyphosate de manière
concomittante à sa cytotoxicité avérée (cf. § II.1.). Globalement, le nombre de cellules
positives aux ERO augmente après un traitement au glyphosate, comparativement à la
condition témoin. Cette production d’ERO est donc « glyphosate-dose dépendante ».
Le nombre de cellules positives aux ERO est également dépendant du temps. En effet, alors
que nous détectons des cellules positives aux ERO dans une population de cellules ayant subi
une cytotoxicité de 20% après 0,5 h de traitement (environ 18% de cellules positives aux
ERO), les cellules montrent une production d’ERO basale (moins de 10% de cellules
positives aux ERO) à des niveaux de cytotoxicité supérieurs (30 et 27%) respectivement après
6 et 18 h de traitement. Cette observation traduit la nature plus drastique du traitement d’une
durée de 0,5 h par le déclenchement d’une réaction cellulaire comparable à un temps plus
long, mais pour une cytotoxicité moindre.
En outre, à la condition CI50, les proportions de cellules positives produisant des ERO sont
comparables entre 0,5 et 18 h de traitement (respectivement 60 et 70%), alors qu’elles sont
beaucoup moins importantes pour un traitement de 6 h (environ 35%). Ce résultat confirme le
caractère drastique, précédemment souligné, d’une condition de traitement de courte durée
puisque qu’il y a, après 0,5 h, pour une cytotoxicité équivalente, la même proportion de
cellules accumulant une grande quantité d’ERO qu’à 18 h. Cela signe une première différence
entre 6 h et 18 h d’incubation. Le nombre de cellules concernées par une surproduction
d’ERO est plus élevé à 18 h qu’à 6 h. L’intervalle de temps se déroulant entre 6 et 18 h est
donc en faveur d’une atteinte plus large de la population cellulaire.
- 137 -
L’étude en microscopie confocale et par cytomètrie en flux révélant la présence d’ERO
intracellulaires, suite au traitement par le glyphosate, confirme le caractère pro oxydant de ce
dernier, déjà démontré indirectement par Audrey Gehin. Cette approche de la cytométrie en
flux m’a permis de me familiariser à cette technique pour envisager ensuite l’étude de la mort
cellulaire induite par le glyphosate mettant en œuvre, cette fois-ci, des doubles marquages.
2. Le
glyphosate :
inducteur
de
quelle(s)
mort(s)
cellulaire(s)?
Pour étudier la mort cellulaire, nous avons utilisé deux protocoles complémentaires :
-
L’évaluation de l’apoptose par le marquage simultané à l’annexine V et à l’iodure de
propidium réalisée par cytométrie en flux, qui permet la discrimination des cellules en
apoptose précoce ou tardive et en nécrose.
-
La caractérisation du potentiel de membrane mitochondrial par cytométrie en flux par
le marquage au JC-1.
i.
Le glyphosate : un composé pro apoptotique ?
Méthode choisie pour exprimer les résultats de cytométrie en flux
Ce paragraphe vise à expliquer la méthode utilisée pour le traitement des données
cytométriques. La figure 29 donne un exemple de résultats obtenus dans le cadre de notre
étude, avec le logiciel de cytométrie et son traitement, pour discriminer les différents types de
mort possibles.
- 138 -
Figure 29 : Répartitions des populations cellulaires obtenues par cytométrie en flux
En fonction du pourcentage de cytotoxicité après 0,5 h d’incubation avec le glyphosate, grâce au
double marquage AnV/IP
Les populations sont séparées pour distinguer les cellules vivantes, en apoptose précoce,
tardive et en nécrose (cf. Matériel et Méthodes §III.4.ii) lorsque les conditions de cytotoxicité
sont de 0 %, 15 % et 45 %. Une légère autofluorescence des cellules de la lignée HaCaT est
constatée, caractéristique de la forme de « pointe de flèche » prise par la population cellulaire
saine sur les graphiques (fig. 29). La découpe des nuages de points a été réalisée en
conséquence, non pas par des carrés parfaits, mais par des quadrilatères. Chaque point
représente une cellule.
En fonction du pourcentage de cytotoxicité, on observe une répartition différente des cellules
dans ces différents groupes : à 15%, seules les cellules en apoptose précoce apparaissent, alors
qu’à la CI50, chaque type de mort est représenté.
Le glyphosate : la priorité à l’apoptose
Les résultats obtenus peuvent être retranscrits de 2 manières : en représentant, sous forme
d’histogrammes, les cellules vivantes (fig. 30) ou non (fig. 31). La figure 30 permet de
souligner le contraste entre les mesures du double marquage AnV/IP et celles du test de
cytotoxicité au MTT (cf. §I.1.). En effet, pour 45% de cytotoxicité (c’est-à-dire 45% des
cellules mortes) évalués par le test au MTT, la part de cellules mortes détectée par le double
marquage AnV/IP n’est que de 20%.
- 139 -
Cependant, dans la figure 30, nous pouvons tout-de-même comparer le nombre de cellules
dans chacune des populations cellulaires ayant déclenché un phénomène de mort. Les données
statistiques ont été traitées différemment dans la figure 31, pour ne considérer que les cellules
« non saines », et ainsi comparer les différents types de mort les uns par rapport aux autres.
Indépendamment des temps d’incubation, le phénomène d’apoptose précoce et tardive est
prédominant au cours du traitement par le glyphosate. La nécrose n’apparaît qu’à partir de
conditions de cytotoxicité plus importantes (environ 70 %).
0,5 h
100
6h
18 h
90
80
Cellules (%)
70
60
nécrose
50
apoptose tardive
40
apoptose précoce
30
cellules saines
20
10
0
0
15 20 45 67
0 28 30 45 69
Cytotoxicité (%)
0
18 27 42 70
Figure 30 : Comparaison de l’induction des différents stades de la mort cellulaire des HaCaT par le
glyphosate mesurée par cytométrie en flux.
Les histogrammes représentent la distribution, en pourcentage, de chaque population cellulaire
(saine, apoptose précoce, apoptose tardive et nécrose) après traitements cytotoxiques pendant 0,5, 6
et 18 h. Les résultats rapportés correspondent à la moyenne de trois expériences indépendantes.
- 140 -
La figure 31 ne tient pas compte des cellules vivantes et montre la répartition de l’apoptose
précoce, l’apoptose tardive et la nécrose parmi les cellules non saines du profil cytométrique.
0,5 h
6h
18 h
100%
90%
80%
necrose
cellules (%)
70%
apoptose tardive
60%
apoptose précose
50%
40%
30%
20%
10%
0%
0
15 20 45 67
0 28 30 45 69
Cytotoxicité (%)
0
18 27 42 70
Figure 31 : Etude par cytométrie en flux de la mort cellulaire chez les cellules HaCaT traitées par le
glyphosate.
Les pourcentages de cellules en apoptose (précoce ou tardive) et en nécrose sont la moyenne de 3
expériences indépendantes, en fonction de la cytotoxicité du glyphosate et pour 0,5, 6 et 18 h de
traitement.
Jusqu’à 20, 30 et 27 % de cytotoxicité respectivement pour 0,5, 6 et 18 h de traitement,
l’équilibre entre apoptose précoce et tardive reste comparable à celui des témoins. L’apoptose
précoce diminue au profit de l’apoptose tardive à partir de la CI50. Dans le cas d’un
traitement de 0,5 h, cette baisse du nombre de cellules en apoptose précoce, à la CI50, a lieu
également au profit de la nécrose. Ce profil se généralise pour une cytotoxicité beaucoup plus
importante, où la part de nécrose reste tout-de-même beaucoup moins élevée pour 18 h de
traitement avec le glyphosate. Ainsi, la majorité des cellules engage un processus apoptotique
au contact du glyphosate. Au vu de ces résultats, il est logique de voir apparaître des
processus nécrotiques uniquement lors de conditions drastiques d’environ 70% de
cytotoxicité.
- 141 -
ii.
Le glyphosate : la voie mitochondriale de l’apoptose
Méthode choisie pour exprimer les résultats de cytométrie en flux
La figure 32 donne un exemple de représentation graphique obtenue avec le logiciel de
cytométrie, pour expliquer le traitement des données mis en place, et suivre l’évolution du
potentiel de membrane mitochondrial en fonction du type de traitement par le glyphosate. Le
potentiel de membrane mitochondrial est mesuré par marquage au JC-1 (cf. Matériel et
Méthodes §III.4.iii.). Par rapport à la condition témoin cellules non traitées, les cellules dont
les mitochondries sont lésées (perte de leur capacité à maintenir un potentiel mitochondrial
efficace) sont responsables d’une intensité de fluorescence verte plus élevée et d’une intensité
de fluorescence rouge plus faible.
Figure 32 : Marquage JC-1 du potentiel de membrane mitochondrial mesuré par cytométrie en flux
après 0,5 h de traitement par le glyphosate.
En abscisse : FL3 (monomères de JC-1) ; en ordonnée : FL1 (agrégats mitochondriaux). La double
barre, délimitant la zone graphique en 4 zones, est placée en fonction de la population cellulaire en
condition témoin et permet de distinguer le déplacement de cette population en fonction des
traitements par le glyphosate. Les mesures représentent une seule expérience réalisée à 0,5 h
d’incubation pour 0, 15 et 45% de cytotoxicité.
- 142 -
Ainsi, la figure 32 montre les profils obtenus après un traitement de 0,5 h par des
concentrations de glyphosate responsables de 0, 15 et 45 % de cytotoxicité. Le profil se
déplace, de la condition témoin vers la CI50, de la partie supérieure gauche du graphique vers
la partie inférieure droite. Pour simplifier la lecture des résultats, le reste du document
présentera les mesures de cytométrie en flux sous forme de ratio entre la fluorescence rouge et
la fluorescence verte. Ainsi, un ratio Fluo rouge/Fluo verte qui diminue reflète des cellules
dont les mitochondries ne sont plus capables de maintenir un potentiel de membrane.
Perturbation du potentiel de membrane mitochondrial des HaCaT par le glyphosate
Figure 33 : Potentiel de membrane mitochondrial après un traitement des cellules HaCaT par le
glyphosate.
Les histogrammes représentent la valeur du ratio fluorescence rouge / fluorescence verte en
fonction de la cytotoxicité avec la condition témoin pour référence (100%). Plus ce ratio diminue,
plus le potentiel de membrane mitochondrial des cellules chute.
D’une manière générale, le glyphosate provoque la chute du potentiel de membrane
mitochondrial des cellules HaCaT (fig. 33). Cependant, comme dans l’étude de l’apoptose (cf.
§ III.2.i.), le profil obtenu pour un temps d’incubation de 0,5 h se distingue des autres par un
effet du glyphosate plus drastique.
En effet, pour des cytotoxicités comparables, la diminution du potentiel est plus importante
après 0,5 h qu’après 6 et 18 h de traitement. De plus, à la CI50, le potentiel de membrane
mitochondrial des cellules après 0,5 h de traitement est pratiquement inexistant alors qu’il est
encore très élevé après 6 h et 18 h.
- 143 -
L’apoptose est un phénomène résultant d’une cascade de signalisation énergie-dépendante
impliquant les caspases. Nous avons donc réalisé des dosages d’activité de la caspase 3 et de
la caspase 9 impliqués dans l’apoptose caspase-dépendante par la voie intrinsèque (caspase 9)
ou commune aux deux voies intrinsèque et extrinsèque (caspase 3) (cf. Etat de l’art §IV.3.iv.).
Ces résultats sont préliminaires et demandent à être confirmés par de nouvelles expériences.
iii.
Résultats préliminaires : dosage des activités caspase 3 et 9
Pour garantir les résultats de ces dosages, un témoin positif est réalisé en traitant les cellules à
la staurosporine (STS) durant un même temps d’incubation que le traitement par le
glyphosate.
Pour 0,5 h, le témoin traité à la STS est négatif. Il n’est donc pas possible de conclure quant
aux résultats obtenus avec un traitement par le glyphosate pendant 0,5h.
A 6 h et 18 h, le témoin traité à la STS est positif et montre, comme attendu, des mesures
d’activité bien supérieures à la condition témoin sans glyphosate.
Cependant, lors du traitement par le glyphosate, seules les mesures réalisées après un
traitement de 6 h sont reproductibles pour les 3 expériences préliminaires pratiquées (fig. 34).
16
activation des caspases (%)
14
12
10
caspase 3
8
caspase 9
6
4
2
0
STS
Gly28%
Gly45%
Figure 34 : Dosage de l’activité des caspases 3 et 9 après un traitement de 6 h des cellules HaCaT
par le glyphosate.
Les histogrammes représentent le pourcentage d’activation des caspases 3 et 9 en fonction de la
cytotoxicité du glyphosate (CI28 et CI45), avec la condition témoin pour référence (0%
d’activation).
- 144 -
Les 2 conditions de traitement par le glyphosate (28 et 45 % de cytotoxicité) montrent une
activation des 2 caspases supérieure aux activités enzymatiques mesurées chez les témoins
cellules non traitées ; ces activités restent cependant inférieures à celles du témoin positif
traité à la STS. Elles apparaissent plus élevées à 45% de cytotoxicité, comparativement à 28%
de cytotoxicité, mais les écarts types pour cette condition sont aussi plus élevés.
28 % de cytotoxicité génère des profils, en termes d’apoptose/nécrose et de potentiel de
membrane mitochondrial, identiques à ceux de la condition témoin. A 45 % de cytotoxicité,
ces résultats montrent un processus apoptotique enclenché et une atteinte avérée du potentiel
de membrane mitochondrial.
- 145 -
3. En résumé
L’étude fonctionnelle des conséquences de l’action cytotoxique du glyphosate nous permet de
conclure à un phénomène apoptotique majoritaire caractérisé par l’externalisation de la
phosphatidylsérine (annexine V). Cette mort cellulaire programmée est provoquée par la
perturbation de l’état antioxydant de la cellule en faveur d’une surproduction d’ERO
intracellulaires (DCFH-DA). L’apoptose induit logiquement l’atteinte du potentiel de
membrane mitochondrial.
L’activation des caspases 3 et 9 semble impliquée dans le processus apoptotique déclenché
par l’action du glyphosate, pour au moins 1 des 3 temps de traitement : 6 h.
L’ensemble des résultats obtenus a permis de mettre en évidence des différences entre :
-
le temps de traitement court (0,5 h) et les temps plus longs (6 h et 18 h). En effet, un
temps de contact avec le glyphosate court pour des effets cytotoxiques (MTT)
comparables a des conséquences beaucoup plus drastiques sur les cellules. Deux
raisons majeures sont avancées : l’intervention plus importante de la nécrose parmi les
cellules en processus de mort cellulaire, et un dysfonctionnement plus globale des
cellules, à la fois en termes de capacités antioxydantes et d’atteinte du potentiel de
membrane mitochondrial.
-
6 h et 18 h, au sein de la gamme de temps dits longs. Alors qu’on ne constate pas de
différence significative dans l’atteinte de la membrane mitochondriale, pour un temps
d’incubation de 18 h, la surproduction d’ERO touche une population plus vaste de
cellules, et l’apoptose tardive tient une part plus importante parmi les cellules ayant
entamé un processus de mort.
- 146 -
4. Discussion
Dans un premier temps, nous avons voulu révéler, de façon directe et quantitative, la
libération des ERO au sein de la cellule, étape préalable et indispensable à l’étude des
mécanismes de mort cellulaire induits par le glyphosate sur la lignée HaCaT. La visualisation
de la production d’H2O2 est fiable et spécifique de dommages oxydants précoces (Carini et al.,
2000). En effet, l’H2O2 est lui-même le précurseur de nombreux ERO beaucoup plus actifs.
Néanmoins, dans ce test, les cellules accumulent la fluorescence proportionnellement à la
production d’ERO, c’est-à-dire que la sonde reflète les ERO totaux produits au bout d’un
certain temps, mais ne rend compte ni de la production en temps réel, ni de l’élimination
éventuelle des ERO par le système de défenses antioxydantes de la cellule. C’est en tenant
compte de ces limites que nous avons appliqué cette méthode à notre modèle
glyphosate/HaCaT.
Nous avons pu constater que la production d’ERO est localisée préférentiellement autour du
noyau en condition témoin, et s’étend bien au-delà de la périphérie nucléaire en condition
CI50. Les HaCaT produisent également des ERO de manière dose-dépendante vis-à-vis du
glyphosate. Cependant, il est à noter qu’un temps de traitement de 0,5 h des HaCaT par le
glyphosate a des conséquences plus drastiques sur la production d’ERO que des temps de
contact plus longs, à pourcentages de cytotoxicité comparables. Nous pouvons donc formuler
l’hypothèse qu’il existe un temps nécessaire à la mise en place des défenses antioxydantes
intracellulaires qui est supérieur à 0,5 h.
En outre, la différence de quantité de cellules produisant des ERO entre 6 h et 18 h s’explique
par une grande difficulté des cellules, après 18 h d’incubation avec l’herbicide, à se défendre
contre l’accumulation des ERO produits abondamment dans leur cytoplasme. Davantage de
cellules ont épuisé leurs défenses antioxydantes après 18 h de traitement. Enfin, il existe, de
toute évidence, un effet paracrine de la production d’ERO, entre les cellules voisines, qui
aggrave les conséquences cellulaires du stress oxydant in vitro (Trouba et al., 2002). Ainsi,
après 18 h de traitement, la communication paracrine entre les kératinocytes HaCaT en
culture provoque un stress oxydant chez un plus grand nombre de cellules.
- 147 -
Outre la confirmation de l’action pro-oxydante du glyphosate, l’étude de la production
d’ERO dans les cellules HaCaT au contact avec le glyphosate, a mis en évidence que ces ERO
constituaient un premier élément distinctif entre les différents temps de traitement choisis. La
conséquence, à terme, du stress oxydant étant la mort cellulaire, il s’agissait ensuite de
préciser le ou les mécanisme(s) de mort cellulaire résultant de l’action du glyphosate sur les
cellules HaCaT.
Le but du double marquage AnV/IP, que nous avons réalisé, est de discriminer, au sein du
processus de mort cellulaire, la part de l’apoptose et celle de la nécrose. Il existe plusieurs
interprétations au double marquage AnV/IP. De nombreux travaux (Lecoeur et Gougeon,
1996, Vermes et al., 1999) incluent la nécrose dans la population cellulaire AnV +/IP + en
qualifiant les cellules AnV -/IP + de mortes, sans préciser le mécanisme de mort. En effet,
d’une part l’apoptose tardive entraîne, après externalisation de la phosphatidylsérine, la
fragmentation de l’ADN, et d’autre part, la nécrose aboutit à la lyse de la membrane, et donc
au marquage de la phosphatidylsérine intracellulaire non externalisée. Cependant, nous avons
fait le choix de cette classification car l’étude de l’effet de concentrations croissantes de
glyphosate démontre une évolution des profils depuis AnV -/IP - vers AnV +/IP + avec une
étape intermédiaire AnV +/IP –. Cette progression suggère fortement un processus
apoptotique (Kaneko et al., 2007).
Parmi les cellules discriminées, sont également visibles les cellules saines. Or, nos résultats
mettent en évidence des taux de cellules vivantes bien supérieurs aux taux mesurés par les
tests de viabilité au MTT utilisé pour quantifier la cytotoxicité du glyphosate. A ce stade de
l’étude, nous pouvons formuler 2 hypothèses :
§
le test au MTT traduit des événements beaucoup plus précoces dans la mort cellulaire
que le test AnV/IP. Par conséquent, le nombre de cellules détectées ayant déjà
enclenché un processus de mort cellulaire est plus élevé que lors d’un marquage
AnV/IP.
§
les conditions de culture en microplaque, et les étapes de rinçage imposées par la
technique du MTT (cf. Matériel et Méthodes II.1.), sont enclines à produire plus de
cellules mortes sous l’effet d’un stress que les conditions de culture en flacon de 25
cm² pour la cytométrie en flux (cf. Matériel et Méthodes §II.3.i.). Pourtant, dans les 2
cas, les cellules sont en phase de croissance exponentielle. En outre, le test au MTT
- 148 -
reflète l’activité d’une réductase mitochondriale qui peut, sans doute, être influencée
par l’état physiologique de la cellule. Les conditions de culture doivent donc être
rigoureusement fixées et respectées au fil des essais de cytotoxicité pour éviter des
variations non contrôlées.
Si l’on se concentre uniquement sur les cellules ayant déclenché l’un ou l’autre des
mécanismes de mort, la caractérisation de l’apoptose par le double marquage AnV/IP
confirme le caractère beaucoup plus drastique d’un traitement pendant 0,5 h. De plus, Les
processus de mort cellulaire sont donc bien différents entre 6 h et 18 h pour des valeurs de
cytotoxicité identiques du glyphosate. Jusqu’à la CI50, la part de l’apoptose tardive est plus
faible à 6 h comparé à 18 h, ce qui est logique, si l’on prend en compte l’intervalle de temps
qui sépare ces 2 conditions. La mise en évidence de la production d’ERO discutée
précédemment (1er § de cette discussion) confirme cette tendance car pour 6 h de traitement,
la proportion de cellules produisant une quantité accrue d’ERO est moins élevée qu’après
18 h.
Cependant, cette logique n’est plus valable pour une cytotoxicité élevée (69%) car la nécrose
prend le pas sur l’apoptose, et son taux est plus élevé à 6 h qu’à 18 h. Cela signifie qu’au
cours d’un traitement de 18 h, les cellules, en train de mourir, choisissent préférentiellement
d’enclencher un mécanisme d’apoptose, même lorsque la cytotoxicité est forte, contrairement
à un traitement de 6 h. La nécrose constatée à 6 h, pour 69% de cytotoxicité, ne serait pas la
conséquence des ERO uniquement. Outre le stress oxydant, d’autres mécanismes entrent donc
en jeu dans la mort cellulaire induite par une exposition cutanée au glyphosate, notamment
lorsque les effets cytotoxiques sont élevés.
Nel et al. (2006), ont évoqué une hiérarchie dans le stress oxydant. Alors que de faibles doses
d’ERO activent les défenses cellulaires, des doses plus élevées induisent la mort cellulaire.
Nous estimons que le temps d’exposition à ces ERO peut également entrer en ligne de compte
dans la réaction cellulaire au stress oxydant. En effet, nous avons démontré, plus haut, qu’un
temps de traitement court par le glyphosate (0,5 h), même à faibles concentrations
cytotoxiques, provoque une augmentation importante de la production d’ERO, alors que le
système de défense des cellules n’est pas encore opérationnel.
- 149 -
Nous estimons que cette augmentation brutale du stress oxydant, alors que la cellule ne
dispose pas encore de moyens de défense efficace, peut permettre le déclenchement de la
nécrose. De la même façon, une exposition plus longue au glyphosate permet à la cellule de
mettre en place des mécanismes de défense antioxydante pour empêcher de passer ce seuil, en
tout cas pour de faibles concentrations cytotoxiques. Pour des valeurs de cytotoxicité plus
élevées, plus le temps de traitement est long, plus les défenses antioxydantes permettraient de
minimiser la part de la nécrose au profit de l’apoptose tardive, alors même qu’un plus grand
nombre de cellules produisent des ERO en grande quantité.
L’un des événements marquants de l’apoptose est l’atteinte de la mitochondrie et de ses
fonctions. Le test au MTT a montré que la mort cellulaire induite par le glyphosate provoquait
une perturbation de l’activité enzymatique de la mitochondrie ; cette atteinte se manifeste
notamment à travers la perturbation du potentiel de membrane mitochondrial, que nous avons
confirmée et varie en fonction de la durée du traitement des cellules HaCaT par le glyphosate.
En effet, de la même façon que pour la production d’ERO, la diminution du potentiel de
membrane mitochondrial a lieu, même pour de faibles cytotoxicités, après 0,5 h de
traitement. La mitochondrie est le principal lieu de production d’ERO jouant ainsi un rôle clé
dans l’induction de l’apoptose à la suite de l’exposition à des agents stressant (Kumar et al.,
2009). Dans leur revue générale, Ly et al. (2003), décrivent 2 éventualités dans la chronologie
des événements aboutissant à l’apoptose, où la perturbation du potentiel de membrane est soit
une cause soit une conséquence de ce processus.
L’étude de la mort cellulaire et la mise en évidence de la perturbation du potentiel
mitochondrial a ouvert la voie à une recherche plus approfondie des mécanismes moléculaires
mis en jeu dans l’atteinte de la viabilité cellulaire par le glyphosate. L’apoptose est le
mécanisme qui domine pour des cytotoxicités du glyphosate modérées. Cependant, les voies
de signalisation moléculaire menant à l’apoptose, bien que nombreuses, ont, pour une grande
majorité, un point commun : l’activation des protéases de la famille des caspases. (cf. Etat de
l’art §IV.3.iii.).
- 150 -
L’étude préliminaire d’évaluation de l’activité des caspases 3 et 9, réalisée au laboratoire par
Barbara Dehecq (technicienne) et Ali Shamas (stagiaire Master 2) montre l’activation des 2
enzymes après 6 h de traitement par le glyphosate à la CI50. L’activation de la caspase 9
intervient dans la voie intrinsèque de l’apoptose, mettant en jeu la mitochondrie. L’activation
de la caspase 3 intervient de manière commune aux 2 voies d’induction de l’apoptose. A
l’aide d’une étude plus approfondie, ces mesures confirmeraient l’induction d’un processus
d’apoptose caspase-dépendante après 6 h de traitement au glyphosate.
Nos essais n’ont pas permis d’obtenir une activation des 2 caspases après traitement, pendant
0,5 h, des HaCaT par la staurosporine, considérée comme témoin positif. Dans le cas des ERO
et du déséquilibre oxydant induit par le glyphosate, nous avons émis, plus haut, l’hypothèse
qu’il existe un temps nécessaire à la mise en place des défenses antioxydantes intracellulaires
qui est supérieur à 0,5 h. De la même façon, pourquoi n’existerait-il pas un temps nécessaire à
la mise en place de voie(s) d’induction de l’apoptose caspase-dépendante supérieur à 0,5h ?
Notre hypothèse finale est la suivante : plusieurs voies « caspase-dépendantes » ou « indépendantes » seraient impliquées dans l’induction de la mort cellulaire par le glyphosate.
Le déclenchement de l’une ou l’autre de ces voies dépend des conditions (temps et
concentrations) de traitement des cellules par le glyphosate. Des investigations
complémentaires sont nécessaires pour déduire les voies de signalisation impliquées dans la
survenue de la mort cellulaire au sein de notre modèle glyphosate / HaCaT. .
L’originalité de nos travaux repose sur la combinaison de cette étude fonctionnelle que nous
venons de présenter, avec une étude morphologique pointue, que nous abordons dans le
chapitre suivant qui vise à mettre en évidence les caractéristiques topographiques et
mécaniques de la surface membranaire, et les conséquences, au niveau des structures
intracellulaires, des effets du glyphosate sur les cellules HaCaT.
- 151 -
- 152 -
IV.
Etude morphologique et structurale
Les observations en microscopies optique et à force atomique permettent de déterminer les
spécificités morphologiques des cellules HaCaT. L’AFM offre l’avantage d’obtenir des
caractéristiques topographiques à l’échelle nanométrique, et la microscopie confocale de
fluorescence offre la possibilité d’identifier des évènements cellulaires, au niveau
intracellulaire et également au niveau de la membrane plasmique ; mais la microscopie
optique en phase inverse reste un outil indispensable pour contrôler globalement la
morphologie cellulaire, de manière rapide et en routine, sur une population plus vaste, et au
cours des manipulations aussi bien sur cellules adhérentes que sur cellules en suspension
après décollement.
Ces résultats ont donné lieu à la publication de 2 articles le premier dans Cell Biology and
Toxicology (Elie-Caille et al., 2010), le second dans Journal of Structural Biology (Heu et al.,
2012a)(cf. Annexe 2) ; et d’une communication d’une page dans Microscopy and Analysis
(2012)(cf. Annexe 4).
1. Observations cytologiques des HaCaT
Figure 35 : Cultures de cellules HaCaT en phase de croissance exponentielle (a) ou à confluence
(b) observées au microscope optique en phase inverse
De manière générale, les cellules HaCaT ont une réfringence moyenne et présentent un noyau
en position centrale (fig. 35). En phase exponentielle de croissance, elles peuvent atteindre
30 µm de diamètre avec leurs expansions membranaires. D’ailleurs, elles forment souvent des
amas où les cellules sont reliées entre elles par leurs prolongements membranaires.
A confluence, elles forment une monocouche pavimenteuse, et ont un diamètre d’environ 15
µm. Le fait qu’elles soient toutes en contact les unes avec les autres limite l’étalement et les
prolongements membranaires.
Ces observations cytologiques posent les bases de l’identification de perturbations
morphologiques dues au stress oxydant induit par le glyphosate, avant une étude plus fine en
AFM et en microscopie confocale de fluorescence. En outre, chaque technique entreprise au
cours de nos travaux expérimentaux a donné lieu à des contrôles réguliers et/ou systématiques
de l’aspect général des cellules au microscope optique en phase inverse.
2. Le
glyphosate
à
l’origine
de
perturbations
morphologiques cellulaires et membranaires
L’imagerie AFM est généralement compliquée à mener sur des échantillons tels que les
cellules vivantes. Les cellules sont avant tout des structures de taille et de volume conséquents
par rapport aux limites de mesure de l’AFM, de par leur circonférence et leur hauteur. Cette
dernière donnée a été déterminante dans la mise en œuvre de l’AFM pour imager les cellules
HaCaT traitées avec une dose importante de glyphosate.
Pour l’observation en AFM, la fixation à l’aide d’aldéhydes a pour objectif de figer les
cellules, tout en conservant leurs structures et en induisant un nombre minimum d’artefacts
entre la pointe et l’échantillon cellulaire. . Ce procédé de fixation crée des liaisons entre les
protéines, et permet ainsi de limiter les interactions entre la pointe de l’appareil et les
molécules de surface des cellules, interactions qui ont l’inconvénient de donner des images en
AFM de cellules relativement floues. De plus, cette fixation empêche une dégradation trop
rapide de l’échantillon cellulaire, et offre la possibilité d’imager, à température ambiante, en
milieu tamponné (PBS), permettant ainsi de s’affranchir du milieu de culture riche en
protéines, source de contamination pour la pointe d’AFM. Cependant, l’AFM sur cellule
nécessite des réglages nombreux, précis et délicats pour espérer obtenir des images nettes et
exploitables.
- 154 -
i.
Mise au point des paramètres d’imagerie par AFM
Ce paragraphe nous permet de présenter le travail de mise au point nécessaire pour l’obtention
d’images en AFM qui soient exploitables et interprétables. En effet, la difficulté d’imager des
cellules en AFM réside dans l’adaptation des contraintes de ces nanotechnologies à notre
matériel, les cellules. Par exemple, la figure 36 présente des images obtenues à partir de
cellules trop hautes pour les capacités maximum de dilatation du tube piézoélectrique et de
déflection du levier.
Figure 36 : Images AFM des cellules HaCaT montrant la limitation de notre AFM vis-à-vis de
structures hautes de plus de 5 µm.
Cellule isolée (a) ou amas cellulaire avec cellules jointives (b). Les flèches rouges indiquent les
artefacts.
On peut repérer dans la figure 36a une cellule unique isolée sur le support, dont la hauteur
provoque l’apparition d’un artefact en son sommet (indiqué par une flèche rouge) mais ses
contours sont tout de même visibles. La figure 36b présente l’image d’un groupe de cellules
où on retrouve le même type d’artefact au sommet des cellules les plus hautes, et où on
distingue également difficilement les espaces intermembranaires, en raison de lignes
(indiquées par une flèche rouge) formées par la pointe à leur contact
Ces premiers essais nous ayant permis de maîtriser nombre de réglages, nous avons ensuite
souhaité harmoniser les différentes techniques d’imagerie autour d’un même protocole de
préparation. Nous nous sommes donc interrogées sur le choix de la technique de fixation.
- 155 -
ii.
Influence du protocole de fixation sur la topographie cellulaire
Toutes les images AFM exposées ci-après sont réalisées après fixation des cellules au
glutaraldéhyde (GA). L’étude des cellules, menée en parallèle en microscopie confocale de
fluorescence, demande l’application d’un protocole de fixation au para-formaldéhyde (PFA).
Dans le but d’uniformiser au maximum les conditions d’observation des cellules pour les
différentes études mises en œuvre, l’effet d’une telle fixation a été analysé en AFM (fig. 37)
a
b
10 mm
c
d
Figure 37 : Cellules HaCaT imagées par AFM après traitement au PFA 4%.
L’image en déflection des cellules traitées au PFA (a), un zoom de 20 µm de largeur est capturé
selon le cadre rouge en a (b), l’image en hauteur des réticulations est obtenue selon un cadre de 10
µm de largeur (c). Le profil en hauteur (d) de la section est réalisé selon la ligne blanche en c. Les 2
triangles rouges (c,d) délimitent un espace de 500 nm de largeur.. L’échelle en z des images en
hauteur correspondantes est de 3.3 µm et 350 nm (a,b) et de 250 nm (c).
- 156 -
En conditions témoins (sans aucun traitement par le glyphosate), après une fixation au PFA
(fig. 37a), les cellules présentent une morphologie générale identique à celle observée après
fixation au GA : elles sont sphériques, étalées et connectées entre elles. Mais la topographie
de surface est différente. Lorsqu’on zoome sur cette surface (fig 37b), des réticulations
régulières recouvrent la surface membranaire de la cellule. Ces réticulations sont étudiées à
une échelle plus fine (fig. 37c), et un profil de section (selon la ligne blanche, fig. 37d) permet
d’évaluer la taille de chaque espace inter-réticulaire voisine de 500 nm. Nous avons choisi le
terme réticulation car il correspond à la formation d'un ou de plusieurs réseaux
tridimensionnels. Ce réseau est probablement dû à la liaison chimique des protéines de
surface par l’action du PFA. L’apparition de ces réticulations pouvant perturber l’étude de la
surface membranaire en AFM, nous avons décidé de conserver le protocole de fixation au GA
pour la suite de notre étude.
iii.
Perte d’adhérence des cellules HaCaT suite au traitement par le
glyphosate
Les performances de l’AFM vont nous permettre d’appliquer cet outil à la recherche des
désordres morphologiques susceptibles d’être induits in vitro par le glyphosate. Pour chaque
condition, témoin ou après traitements, l’étude morphologique en AFM a été réalisée à partir
d’une concentration cellulaire identique présente à la surface du substrat. La figure 38
compile les images en hauteur et en déflection obtenues en conditions témoin, CI50 et CI65.
- 157 -
Figure 38 : Altération des cellules HaCaT induite par le glyphosate en conditions CI50 et CI65.
Images AFM en hauteur (ai, bi, ci) et en déflection (aii, bii, cii). Les astérisques en ci et cii
indiquent une aire du substrat où une cellule a probablement adhéré (*) et des débris correspondant
aux restes d’une cellule (**). L’échelle en z des images en hauteur est de 3µm (di), 3,5µm (ei) et
1µm (fi)
En condition témoin, les cellules sont reliées entre elles par leurs expansions membranaires
qui peuvent être multiples ; elles sont sphériques, et homogènes en termes de rugosité de
surface (fig. 38ai, aii). A la CI50 (50 mM glyphosate, 0,5h), les cellules paraissent moins
étalées et ne développent plus de connexions entre elles ; elles ont un aspect plus ramassé,
plus allongé, en forme de cylindre aplati (fig. 38bi, bii). En condition plus drastique,
correspondant à 65% de cytotoxicité (25mM glyphosate, 18 h), la mort d’une grande majorité
des cellules à la surface du support peut être repérée par la présence de zones totalement nues,
d’environ 30 µm de diamètre, qui correspondent probablement à l’empreinte d’une cellule qui
s’est détachée du support. De plus, des zones bien délimitées, de 20 à 30 µm de diamètre,
montrent une accumulation de matériel pouvant correspondre à des résidus membranaires
(fig. 38ci, cii).
- 158 -
L’action du glyphosate conduit donc à la perte progressive d’adhérence des cellules. Le
mécanisme de perte d’adhérence reste à définir. Ces 2 types de profil (zone nue ou résidus)
sont soit 2 étapes différentes d’un même mécanisme, imagées à 2 moments différents du
détachement de la cellule, soit 2 mécanismes différents. L’hypothèse d’une différence dans la
qualité du support n’est pas plausible étant donnée la qualité plane et régulière des lamelles de
verre sur lesquelles sont ensemencées les cellules.
iv.
Effet du glyphosate sur la taille et la morphologie des cellules
Les mesures moyennes de taille réalisées sur 20 cellules, et le recensement de la morphologie
de 22 cellules, ont été comparés (fig. 39) entre échantillons de cellules témoins et de cellules
traitées par le glyphosate.
Figure 39 : Taille et morphologie des cellules témoins et des cellules traitées au glyphosate
La surface cellulaire en condition témoin et CI50(a), le pourcentage de cellules étalées/globulaires
(en noir) et de cellules allongées (en gris) en conditions témoin et CI50 (b). La mesure a été réalisée
sur 20 (a) et 22 (b) cellules et la moyenne est calculée pour chaque condition.
La taille des cellules diminue significativement après un traitement par le glyphosate à la
CI50 : elle passe de 620 à 290 µm² (fig. 39a). On note également que les cellules à confluence
changent de morphologie et passent d’un aspect sphérique et étalé à un aspect allongé (fig.
39b).
- 159 -
v.
Perte d’homogénéité de la membrane cellulaire
L’étude des cellules en AFM à plus haute résolution, permet de concentrer l’étude à l’échelle
d’une seule cellule, et de révéler, en détail, la rugosité de surface de la cellule. Nous avons
comparé dans la figure 40 la rugosité de surface avant et après traitement des cellules par le
glyphosate (CI50).
Figure 40 : Comparaison morphologique et topologique des cellules HaCaT témoins ou traitées au
glyphosate en conditions CI50 (50 mM, pendant 0,5 h).
Les images AFM en hauteur (ai, bi) et en déflection (aii, bii) des cellules témoins (a) et traitées (b)
et les profils topographiques obtenus à partir des images en hauteur correspondantes (le long de la
ligne pointillée blanche) (ci et cii respectivement). L’échelle en z des images en hauteur est de 2,5
µm (a) et 1,75 µm (b).
En condition témoin, la rugosité de surface des cellules est homogène et présente de
nombreuses protrusions membranaires (fig. 40ai et aii). Après un traitement par le glyphosate
à la CI50, la surface des cellules possède des zones totalement lisses, le nombre de protrusions
a fortement diminué, et leur répartition à la surface est désordonnée (fig. 40bi et bii). Cette
désorganisation de la topographie de surface des cellules est confirmée par 2 profils de section
établis respectivement dans chacune des conditions décrites (fig. 40ci et cii). Chaque triangle
rouge met en évidence une protrusion, ce qui permet de constater leur raréfaction, et la
perturbation de l’homogénéité de la surface cellulaire après traitement par le glyphosate.
- 160 -
Cette hétérogénéité de surface est probablement une conséquence de la réorganisation des
protéines de surface et/ou à la perte de mobilité des lipides de la membrane plasmique.
Afin de confirmer et d’expliquer les phénomènes membranaires observés sur les cellules
HaCaT en AFM, la membrane a été explorée au niveau des rafts lipidiques en microscopie
confocale de fluorescence.
vi.
Mise en évidence des rafts lipidiques
Au cours de sa thèse, Audrey Gehin a mis en évidence l’augmentation de la peroxydation
lipidique conséquence du stress oxydant induit par le glyphosate. L’altération des lipides
cellulaires peut avoir des effets sur l’intégrité de la membrane cellulaire. Les rafts lipidiques
de la membrane des cellules HaCaT ont été marqués au FITC-Ctx. La figure 41 représente les
différentes étapes de mise au point de la technique pour la rendre compatible avec la fixation,
et donc d’autres marquages tel que le DAPI.
Fixer et perméabiliser les cellules (cf. Matériel et Méthodes, §II.3.ii) avant le marquage au
FITC-CTx est impossible (fig. 41a) car la membrane doit être vivante pour obtenir un
marquage optimal (fig. 41b). Nous avons cependant pu fixer et perméabiliser les cellules
après marquage au CTx (fig. 41c), et ainsi permettre un marquage DAPI simultané pour une
observation en microscopie confocale.
- 161 -
Figure 41 : Mise au point de la technique de marquage au FITC-CTx sur les cellules HaCaT.
Les cellules ont d’abord été marquées après fixation au PFA (a), elles ont ensuite été marquées et
imagées sans fixation (b) et enfin, la fixation post-marquage au CTx permet un marquage au DAPI
(c).
- 162 -
La figure 42 compare les images obtenues avec les cellules témoins et les cellules traitées par
le glyphosate à 53 mM pendant 0,5 h (CI50)
Témoin
CI50
Figure 42 : Marquage des rafts lipidiques de la membrane plasmique et du noyau des cellules
HaCaT après traitement au glyphosate en condition CI50 (53 mM, 0,5 h).
Le marquage des rafts des cellules non traitées est localisé dans la membrane et dans certaines
structures cytoplasmiques (système endomembranaire). Après traitement par le glyphosate
(CI50), le marquage est beaucoup moins net, phénomène probablement dû à la dégradation de
la membrane, donc la pénétration facilitée du marqueur à l’intérieur de la cellule.
Nous l’avons constaté au cours de cette première étude en AFM, les cellules HaCaT sont
difficiles à imager en mode contact lorsqu’elles sont vivantes, et les différentes études décrites
ci-dessus ont nécessité une fixation avant observation en AFM. La difficulté de cette
observation peut s’expliquer par l’abondance de macromolécules à la surface des cellules,
avec lesquelles la pointe de l’AFM interagit. Les différentes protéines et les sucres présents à
la surface de la membrane, ainsi que la matrice extracellulaire (MEC), peuvent perturber
l’imagerie. D’autre part, l’idéal est de pouvoir analyser les cellules vivantes en se rapprochant
le plus possible des conditions physiologiques. Pour s’affranchir de ce tapis moléculaire, nous
avons traité les cellules, avant l’observation, avec des enzymes telles que la hyaluronidase et
la neuraminidase (Le Grimellec et al., 1994 ; Lydataki et al., 2003).
- 163 -
La hyaluronidase dégrade l’acide hyaluronique présent dans la MEC et la neuraminidase est
une glycosidase qui dégrade les chaînes O- et S-glycosyl. Les résultats obtenus après ces
traitements enzymatiques font l’objet du paragraphe suivant.
3. Effet de la hyaluronidase et de la neuraminidase sur
les cellules HaCaT : imagerie des cellules vivantes
Avant toute étude en AFM, nous avons recherché une éventuelle activité cytotoxique des 2
enzymes sur les cellules HaCaT.
i.
Evaluation de la cytotoxicité de la hyaluronidase et de la neuraminidase
La technique de mesure de viabilité au MTT a été appliquée après traitement des HaCaT par
la neuraminidase et la hyaluronidase, pour 7 concentrations de chacune des enzymes et 30
Viabilité (%)
minutes d’incubation (fig. 43).
120,0
110,0
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
Neuraminidase U/mL
Hyaluronidase mU/mL
0
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Concentration (mU/ml ou U/ml)
Figure 43 : Profils cytotoxiques de la neuraminidase et la hyaluronidase.
Obtenus après contact 30 mn aux concentrations de 0 à 50 mU/mL (Hyaluronidase) ou U/mL
(Neuraminidase) sur les cellules HaCaT.
- 164 -
Aucune toxicité significative n’est observée après un traitement avec ces enzymes : la
viabilité reste supérieure à 80% aux plus fortes concentrations de l’une ou l’autre enzyme.
L’utilisation de ces enzymes dans notre étude est donc possible sur les cellules HaCaT.
ii.
Effets délétères localisés
Le traitement par la neuraminidase ou la hyaluronidase n’a pas permis réellement d’imager
plus facilement les cellules en conditions physiologiques, c'est-à-dire sans fixation.
De plus, les images réalisées en AFM (fig. 44) après une action simultanée des 2 enzymes a
montré un effet délétère sur certaines cellules.
a
b
10µm
10µm
Figure 44 : Effet délétère de l’action simultanée de la neuraminidase et de la hyaluronidase
Réalisé sur les cellules HaCaT (15mU + 15 U /mL). (b) est un zoom de la zone encadrée en rouge
dans (a).
Certaines zones du support sont couvertes de ce qui semble être des débris cellulaires (fig.
44a). Un zoom focalisé sur un « fantôme de cellule » (fig. 44b) permet de distinguer ce qui est
probablement le résidu des expansions membranaires. La persistance de ces expansions sur le
support, alors que le corps de la cellule s’est détaché, peut s’expliquer par l’abondance de
points focaux d’adhérence dans la membrane basale cellulaire.
- 165 -
Nos images sont similaires à celles obtenues sur des cellules REF52 par Franz et Müller
(2005) avec la technique du « de-roofing » par ajout de polylysine, préalablement à une étape
de sonication, pour améliorer l’adhérence de la partie basale de la membrane plasmique.
Le mode contact a donc permis d’imager les cellules fixées. Nous avons également testé le
mode tapping avec le Nanoscope IIIa mais sans succès. En effet, même en mode tapping, les
images de cellules vivantes, manquant de netteté, n’ont pas été concluantes.
Le but était d’éviter des interactions avec des molécules de surface cellulaire (cf. Matériel et
Méthodes §IV.4.ii.). Le mode tapping permet à la pointe de toucher l’échantillon par
intermittence, ce qui réduit le risque d’altération de l’échantillon biologique et, inversement,
la contamination de la pointe par l’échantillon. C’est donc un mode de choix pour l’imagerie
d’échantillons biologiques.
Nous avons testé le mode tapping avec le Bioscope Catalyst, développé pour l’imagerie
d’échantillons biologiques, afin d’imager les cellules en conditions quasi physiologiques. Ces
résultats ont été obtenus grâce au concours du Dr. Alexandre Berquand dans le cadre d’un
partenariat avec Bruker - Nano Surfaces Division® à Mannheim (Allemagne) et avec la
collaboration de la Hochschule pour toutes les manipulations en culture cellulaire.
4. Paramètres physiques et cytosquelette
La technologie PeakForce du Bioscope Catalyst offre la capacité d’imager sans fixation les
cellules, grâce à son système d’oscillation ; il présente à la fois les avantages du mode contact
et du mode tapping. Il utilise la réponse dynamique du levier pour ajuster automatiquement
tous les paramètres d’imagerie, comme la force d’interaction avec l’échantillon, et donc
s’adapte systématiquement en fonction des caractéristiques de surface de l’échantillon. Le
bioscope catalyst permet d’effectuer des mesures de forces en haute résolution sur
l’échantillon cellulaire correspondant à la totalité de l’image AFM, et ainsi caractériser les
cellules en termes de propriétés mécaniques de surface. Les cellules sont ici ensemencées
dans des boîtes de Pétri à fond de verre (cf. Matériel et Méthodes §II.3.vi.).
- 166 -
i.
Perturbation des propriétés physiques de la membrane cellulaire
Les 2 histogrammes de la figure 45 représentent les variations de Module de Young (MY)
(fig. 45a) et de déformation (fig. 45b) dans les différentes conditions de temps de traitement
par le glyphosate. Plus la valeur du module de Young est élevée, plus la surface des cellules
est rigide. Les cellules traitées pendant 6 h et 18 h avec du glyphosate 15 mM et 30 mM, sont
comparées d’une part entre elles, et d’autre part à une condition témoin sans glyphosate. De
plus, des essais ont été effectués avec ajout de quercétine simultanément au glyphosate, afin
de tester une éventuelle inversion des effets du glyphosate par cet antioxydant.
Figure 45 : Module de Young (a) et déformation (b) des cellules HaCaT, mesurés par Peak force
AFM dans différentes conditions de traitement au glyphosate.
Ces moyennes ont été calculées à partir de 3 images AFM différentes pour les conditions témoins,
traitées au glyphosate sans ou supplémenté en quercétine.
- 167 -
Les mesures (fig. 45a) du MY ont été réalisées grâce au modèle de Sneddon que nous avons
estimé le plus proche de la réalité cellulaire (cf. Matériel et Méthodes §IV.4.ii.). Les
différentes conditions de traitement par le glyphosate donnent des résultats relativement
identiques entre 6 h et 18 h. En condition témoin, les cellules ont un MY de 77 et 109 kPa,
respectivement pour 6 h et 18 h. Après un traitement de 15mM de glyphosate, le MY
augmente significativement pour atteindre des valeurs 4 fois plus élevées pour 6 h, et 3 fois
plus pour 18 h. Cette augmentation traduit une rigidité accrue de la cellule. A l’inverse, après
un traitement à 30 mM, les valeurs de MY sont similaires à celles obtenues en conditions
témoin (104 et 125 kPa respectivement pour 6 et 18 h).
L’ajout de quercétine concomitante au traitement par le glyphosate, a un effet sensible sur la
raideur cellulaire. Pour un traitement de 15 mM, la quercétine induit une diminution de la
valeur de MY d’un facteur 1.8 (de 319 à 181 kPa). Au contraire, pour un traitement de 30
mM, elle induit une augmentation de cette valeur d’un facteur 3 (de 125 à 301 kPa). Donc,
l’ajout de quercétine pendant le traitement par le glyphosate à 15mM, permet de tendre vers la
valeur de MY des cellules témoins.
Les mesures de MY et de déformation sont complémentaires, car la déformation est
inversement proportionnelle au MY.
Le glyphosate module ainsi les propriétés mécaniques des kératinocytes HaCaT. De plus,
nous avons mis en évidence que, d’une part, le glyphosate provoque l’augmentation de la
rigidité cellulaire en réponse à une faible agression cytotoxique, et, d’autre part, qu’il
provoque la diminution de celle-ci en condition fortement cytotoxique.
Les images en basse résolution ont permis d’accumuler des données statistiques. Nous avons
réalisé également des images en haute résolution pour caractériser les cellules vivantes en
topographie de surface, après un traitement par le glyphosate (fig. 46) et l’ajout de quercétine
(fig. 47).
- 168 -
ii.
Effet du glyphosate sur la région sous-membranaire
Les cellules non traitées montrent un profil topographique similaire à celui obtenu
précédemment sur cellules fixées en mode contact. Elles sont étalées, présentant une surface
membranaire homogène couverte de protrusions (cf. § III2ii et III2iii). Cette première
observation semble donc indiquer que la fixation au GA réalisée dans la première étude (cf.
§III.2.) n’a pas affecté la morphologie et la rugosité de surface des cellules.
Figure 46 : Effets du glyphosate sur la topographie de surface de cellules HaCaT vivantes imagées
avec le bioscope catalyst. L’échelle en déflection est de 0 à 500 pN.
En présence de 15 mM de glyphosate, après 6 h ou 18 h de traitement, les cellules présentent
de nombreuses structures sous-membranaires organisées en réseau filamenteux, plus
nombreuses que dans le cas des cellules témoins ; cela rend d’ailleurs difficile la distinction
des cellules les unes des autres. Par contre, avec 30mM de glyphosate pendant 6 h, ces
structures sont moins visibles. Les images réalisées en présence de 30 mM de glyphosate
pendant 18 h, ne sont pas présentées ici en raison de la difficulté à obtenir une image en haute
résolution interprétable. En effet, comme dans le cas du mode contact, les cellules HaCaT,
- 169 -
placées en condition de cytotoxicité élevée, deviennent globulaires et atteignent une hauteur
trop importante pour la capacité de déflection du levier ; il est donc très difficile d’obtenir des
images correctes sans artefact d’imagerie. Cependant les observations faites à partir des
images basse-résolution confirment les constatations établies pour 6 h de traitement : les
cellules ne montrent pas ces structures filamenteuses, mais ont une surface membranaire lisse,
sans protrusions. De la même façon que pour les observations précédentes, les profils
topographiques des cellules sont les mêmes que ceux obtenus sur cellules stressées, fixées au
GA (cellules plus allongées et lisses).
iii.
Réversion des effets du glyphosate par la quercétine
La quercétine (100 µM) a été ajoutée aux cellules en culture traitées par le glyphosate pendant
18 h d’incubation (fig. 47)
Figure 47 : Action de la quercétine (100 µM) sur les cellules HaCaT.
Pour l’étude de la réversion des phénotypes morphologiques du glyphosate à 15 et 30 mM
pendant 18 h.
- 170 -
Les images obtenues après un traitement de 15 mM de glyphosate avec quercétine sont
comparables à celles obtenues sur les cellules témoins sans quercétine (fig. 47). En effet, les
protrusions sont absentes, et remplacées par des réticulations irrégulières réparties de manière
homogène à la surface de la cellule. De même, les images réalisées après traitement de 30
mM de glyphosate avec quercétine sont très comparables à celles obtenues après un traitement
de 15 mM de glyphosate seul sans ajout de quercétine (fig. 47), montrant des structures
filamenteuses sous membranaires.
L’apparition des structures filamenteuses coïncide avec l’augmentation de la raideur
cellulaire. La mobilisation du cytosquelette en position sous-membranaire, comme système de
défense de la cellule, est une hypothèse plausible pour expliquer les images topographiques et
les mesures de propriétés mécaniques. Le fait que cet état de mobilisation ne persiste pas en
présence de 30 mM de glyphosate s’expliquerait par un effet cytotoxique trop important pour
que la cellule puisse mettre en place des moyens de résistance au stress.
En outre, la quercétine permet à la cellule de se défendre en mobilisant son cytosquelette en
périphérie, puisqu’elle provoque l’apparition de ces mêmes structures filamenteuses et
l’augmentation de la raideur cellulaire lors d’un traitement par 30 mM de glyphosate, ce qui
n’était pas le cas avec 15 mM de glyphosate sans ajout de quercétine.
- 171 -
iv.
Etude du cytosquelette d’actine
Après 6 h et 18 h de contact avec le glyphosate
La figure 48 présente les résultats obtenus après 6 et 18 h de traitement des cellules par 15 et
30 mM de glyphosate, comparativement aux cellules témoins. Ce sont les mêmes conditions
utilisées que pour les précédentes observations en AFM (cf. § III4). Les images obtenues sont
similaires entre le traitement à 6 h et à 18 h.
Témoin
[Gly]15mM
[Gly]30mM
Figure 48 Effet du glyphosate sur le cytosquelette d’actine après 6 ou 18 h de traitement.
Marquage des cellules HaCaT après traitement au glyphosate (15 et 30 mM) avec de la phalloïdine
TRITC et du DAPI.
Le cytosquelette d’actine des cellules témoins est bien structuré, sous forme de fibres, à
travers la totalité de la cellule. Après un traitement avec 15 mM de glyphosate, les
microfilaments d’actine sont répartis de façon plus hétérogène, toujours sous un aspect
fibreux. Après un traitement de 30 mM, le cytosquelette d’actine disparaît du cytoplasme, et
se relocalise sous la membrane. Cependant, l’actine F de la membrane ne forme plus d’aussi
longues fibres comme en condition 15mM, et certains prolongements membranaires
deviennent visibles au marquage à la phalloïdine, alors qu’ils ne l’étaient pas dans les autres
conditions (témoin et 15mM).
- 172 -
Ces images viennent étayer l’hypothèse formulée lors de l’étude en AFM. En effet, la
relocalisation des filaments de F-actine en position sous-membranaire après un traitement de
15 mM de glyphosate, coïncide avec l’apparition des structures filamenteuses sur les images
topographiques d’une part, et l’augmentation de la raideur cellulaire d’autre part.
Après 0,5 h de contact avec le glyphosate
Le comportement du cytosquelette d’actine est différent après traitements par 40 et 53 mM de
glyphosate pendant 0,5 h, comme rapporté dans la figure 49.
Témoin
[Gly]40mM
[Gly]53mM
Figure 49 : Effet du glyphosate sur le cytosquelette d’actine après 0,5 h de traitement.
Marquage des cellules HaCaT après traitement au glyphosate (40 et 53 mM) avec de la phalloïdine
TRITC et du DAPI.
Dans les cellules non traitées, ou en présence de concentrations faiblement toxiques de
glyphosate (40mM), seules quelques fibres d’actine sont visibles dans le contenu
cytoplasmique. L’actine F est localisée de façon granulaire à la fois dans la membrane et le
cytoplasme de la cellule. En condition de CI50 (53mM), nous pouvons distinguer, sur les
images, des fibres d’actine présentes en périphérie de la cellule, et localisées de manière sousmembranaire comme à la CI50 pour 6 h et 18 h.
Ces images ont permis de soulever le problème de l’utilisation du milieu de culture incomplet,
c’est-à-dire sans SVF, pour ces expérimentations. Si le maintien en milieu incomplet des
cellules n’altère pas significativement la viabilité cellulaire des HaCaT, le changement
brusque des ressources nutritionnelles et des facteurs de croissance disponibles pour les
cellules peut induire des mécanismes d’adaptation compliqués à mettre en place en 0,5 h.
- 173 -
En effet, nous savons que le cytosquelette d’actine s’organise ou se dépolymérise très
rapidement au sein de la cellule (Papakonstanti et al., 2008), alors que sur des durées plus
longues, la cellule peut s’adapter aux nouvelles conditions imposées par le milieu de culture.
Ainsi, lorsque les conditions expérimentales se rapportent à un temps aussi court que 0,5 h, le
changement des conditions de culture (absence de SVF) pourrait provoquer une
désorganisation du cytosquelette d’actine.
Dans le cas d’un traitement par la CI50 de glyphosate, la cellule ne doit pas seulement se
réadapter mais développe un système de défense « mécanique » qui se traduit par l’apparition
de fibres de stress.
v.
Etude du cytosquelette de filament intermédiaire : kératine
Les filaments intermédiaires du cytosquelette des HaCaT ont été caractérisés par
immunofluorescence grâce à un anticorps anti-kératine 5, après traitement par 15 et 30 mM de
glyphosate pendant 18 h versus la condition témoin.
La figure 50 présente deux images en microscopie confocale pour chaque condition. En effet,
différents profils cellulaires ont été caractérisés lors de la mise en évidence des filaments
intermédiaires. En condition témoin, le cytosquelette de kératine est régulièrement réparti à
travers toute la cellule. En condition glyphosate 15 mM, soit le cytosquelette se renforce en
périphérie de la cellule, soit il se raréfie dans la totalité du cytoplasme. En condition
glyphosate 30 mM, la tendance générale est à la raréfaction du cytosquelette de filaments
intermédiaires, mais avec plus ou moins d’homogénéité dans les amas cellulaires. Ces
résultats rejoignent donc ceux observés pour le cytosquelette d’actine.
- 174 -
Témoin
[Gly]15mM
[Gly]30mM
Figure 50 : Marquage des filaments intermédiaires en immunofluorescence.
En condition témoin et après traitements au glyphosate (15 et 30 mM, 18 h). 2 images capturées en
microscopie confocale sont présentées pour chaque condition avec une échelle de 20µm.
- 175 -
5. Synthèse
des
conséquences
morphologiques
et
structurales de l’action cytotoxique du glyphosate
En conclusion, l’AFM a révélé 2 effets du glyphosate sur les HaCaT : de façon générale,
l’atteinte cellulaire se traduit par une perte d’adhérence, une réduction de la taille des cellules
et une modification de la morphologie, par un passage d’un état étalé à un état rétracté de la
cellule.. De manière plus spécifique, et à une échelle plus fine, on constate une réorganisation
de la topographie de la surface cellulaire (hétérogénéité des protrusions), des désordres
membranaires (répartition hétérogène des protrusions membranaires, raideur) et sousmembranaires (densification du cytosquelette et sa destruction/réorganisation en condition
CI50) perturbant significativement le phénotype mécanique cellulaire.
Nous avons ensuite confirmé et expliqué ces phénomènes spécifiques d’atteinte de la
membrane et de mobilisation du cytosquelette, par des marquages fluorescents des rafts
lipidiques d’une part, et du cytosquelette d’actine et de kératine d’autre part. Ils ont mis en
évidence la désorganisation des rafts à la surface de la membrane cellulaire en réponse au
traitement par le glyphosate, et la mobilisation du cytosquelette de kératine dans la réponse à
un traitement par le glyphosate à faible cytotoxicité.
L’utilisation de la quercétine, inverse et/ou atténue les effets du glyphosate. L’apparition du
cytosquelette de kératine en position sous-membranaire et l’augmentation de la raideur de la
cellule seraient un moyen de défense de la cellule, conséquence directe de l’action pro
oxydante de l’herbicide.
- 176 -
6. Discussion
i.
Analyses morphologiques et surfaciques des cellules HaCaT
L’étude en AFM en mode contact nous a permis d’envisager, pour la première fois, les
dommages morphologiques subis à l’échelle de la cellule entière lors du traitement par le
glyphosate. Dans le but de normaliser les conditions de traitement des cellules entre la
microscopie confocale et la microscopie à force atomique, nous avons tenté d’imager les
cellules en AFM après fixation au paraformaldehyde plutôt qu’au glutaraldéhyde utilisé
classiquement. Au-delà de l’aspect plus rigoureux des comparaisons entre images AFM et
images confocales, l’apparition de nouveaux matériels d’AFM adaptables sur un microscope
confocal, et capables d’acquérir simultanément les 2 types d’image, nous pousse à tenter
d’homogénéiser les protocoles de préparation d’échantillons. Cependant la fixation au
glutaraldehyde est moins forte que la fixation au paraformaldehyde qui induit des liaisons très
fortes entre les molécules de surface cellulaire, formant un réseau de réticulation visible en
AFM, rendant ainsi les images en topographie pauvres en informations sur l’état de la surface
cellulaire.
L’imagerie des cellules fixées à l’aide du nanoscope IIIa en mode contact nous a permis de
discriminer des morphologies et topographies significativement différentes entre cellules
témoins et traitées au glyphosate. Les cellules témoins sont très étalées, plutôt sphériques et
jointives entre elles, avec des prolongements membranaires. Les cellules traitées sont de
forme allongée, plus hautes que les cellules témoins, et ont une surface cellulaire réduite d’au
moins 2 fois, ce qui caractérise un rétrécissement et une perte d’adhérence de la cellule ;ces
comportements sont la conséquence tardive du phénomène apoptotique mis en évidence cidessus. D’autres études (Rieti et al., 2004) ont démontré des réponses similaires à l’exposition
aux ondes électromagnétiques basse fréquence. Reich et al., (2007, 2009) ont rapporté des
altérations de la morphologie des kératinocytes après une irradiation aux UVB induisant une
atteinte des contacts entre cellules adjacentes, et le détachement des cellules de la surface du
support en verre. De même, Reich décrit des protrusions nombreuses, régulières et homogènes
à la surface de la cellule, comme c’est le cas dans notre modèle cellulaire en condition témoin.
- 177 -
Au contraire, dans notre étude le traitement par le glyphosate provoque la raréfaction et
l’hétérogénéité des protrusions, laissant place à des plages beaucoup plus lisses à la surface de
la membrane cellulaire.
Les rafts (radeaux) lipidiques sont des microdomaines membranaires situés sur la surface
externe de la membrane plasmique, riches en sphingolipides et cholestérol (Simons et
Ehehalt, 2002). Ces radeaux lipidiques de nature dynamique sont compacts grâce au
cholestérol qui agit comme une glue entre les sphingolipides. L’activité de nombreuses
protéines (récepteurs de mort, de facteurs de croissance ….) dépend de leur inclusion dans les
rafts (Pike et Casey, 2002) ; la destruction des rafts atteint donc de nombreuses fonctions
cellulaires dépendantes de signaux externes à la cellule. Nous savons déjà que le glyphosate
induit une augmentation de la peroxydation lipidique chez les cellules HaCaT (Gehin et al.,
2005) et la présence des rafts lipidiques chez les cellules HaCaT, ainsi que leur rôle dans le
contrôle de la prolifération et du métabolisme, ont déjà été démontrés par Gniadecki et al.
(2002, 2003).
Notre étude a permis d’observer en microscopie confocale, la désorganisation des rafts
lipidiques au cours d’un traitement par le glyphosate à la CI50. Bang et al. (2005), ont prouvé
que la perturbation des rafts lipidiques déclenchait l’apoptose chez les kératinocytes HaCaT.
Ainsi, nous pouvons affirmer ici que la perturbation des rafts lipidiques par le glyphosate est
une des causes de la mort des kératinocytes en culture. Enfin, ces résultats confirment la
désorganisation de la surface cellulaire, constatée en AFM en mode contact, par la perte et la
réorganisation des protrusions membranaires.
ii.
Viscoélasticité et cytosquelette
Les cellules sont des structures viscoélastiques hétérogènes et complexes, leurs propriétés
mécaniques sont connues pour refléter leur état physiologique et fonctionnel dans
l’organisme. Le déclenchement et la progression de certaines maladies sont fortement
associés aux propriétés mécaniques des cellules vivantes (Chouinard et al., 2008; Hsieh et al.,
2008; Suresh et al., 2005). L’équipe bisontine du Pr. Humbert s’emploie à mettre au point des
modèles d’étude du vieillissement de la peau, in vivo ou in vitro (Humbert et al., 2012a et b)
en s’attachant, entre autres, à en reproduire les propriétés mécaniques (Rolin et al,. 2012) ;
mais la tâche s’annonce difficile tant le vieillissement cutané met en jeu de nombreux facteurs
- 178 -
(Nouveau-Richard et al., 2005). Il existe de nombreuses théories du vieillissement, mais le
facteur commun est toujours les changements structuraux, à différents niveaux, comme
l’affinement de l’épiderme, la diminution de la résistance de la peau et sa perte d’élasticité (cf.
Etat de l’art §III.1.), que ce soit par la diminution de la MEC ou par la perte d’élasticité des
cellules elles-mêmes. De plus, de nombreuses études ont démontré la corrélation entre
vieillissement cellulaire et perte d’élasticité, indépendamment de la MEC (Lieber et al., 2004;
Starodubsteva, 2011), et principalement due au remaniement du cytosquelette comme le
démontrent Lieber et al., chez les myocytes de rat (2008). La perturbation des propriétés
mécaniques des kératinocytes doit aussi jouer un rôle dans la survenue du vieillissement de la
peau.
Le PeakForce Tapping
La technologie PeakForce™ QNM™ (Pittenger et al., 2010) permet la cartographie
quantitative nanomécanique d’un échantillon en plus de sa caractérisation topographique en
haute résolution, ce qui en fait un outil innovant en biologie ultrastructurale. La technologie
PFT nous a permis d’obtenir des données statistiques des mesures d’élasticité et de
déformation sur cellules vivantes non fixées.
Le mode contact (Binnig et al., 1986) est le mode de référence pour l’imagerie d’échantillons
biologiques, pour sa mise en œuvre facile, mais le mode tapping (Zhong et al., 1993) a aussi
de nombreux avantages, comme le fait que la pointe ne rentre en contact que de manière
intermittente avec l’échantillon, ce qui rend négligeables les forces de friction et de
cisaillement que pouvait induire la pointe. Récemment, des études nano-mécaniques sur
cellules, portant sur le cancer des os, ont révélé une hétérogénéité des fibrilles de collagène, et
ont été proposées comme techniques nouvelles de détection de l’ostéoarthrite (Stolz et al.,
2009). Dans le cas de cellules métastatiques, les mesures d’élasticité révèlent une diminution
de plus de 70% de la rigidité des cellules cancéreuses comparativement aux données récoltées
pour des cellules bénignes (Cross et al., 2008). De plus, une cartographie, à l’échelle
nanométrique, de cellules de levures en solution aqueuse a révélé des aires de la surface
cellulaire qui deviennent significativement plus rigides que le reste de la membrane cellulaire
(Touhami et al., 2003).
- 179 -
Parmi les études AFM conduites ces dernières années avec des modèles cellulaires, peu sont
proposées sur un modèle de cellules de mammifères (Fung et al., 2010). De plus, les mesures
de propriétés mécaniques sont réalisées sur un nombre limité de points à la surface cellulaire
(Gunning et al., 2008). Or, réduire ces mesures à un petit nombre de points à la surface
cellulaire ne peut pas être représentatif de l’état du phénotype mécanique de l’entièreté de la
cellule, et peut conduire à des caractérisations erronées. En effet, Laurent et al. (2005) ont
caractérisé les lamellipodes des kératinocytes et ont démontré une hétérogénéité mécanique
par une diminution de l’élasticité entre la jonction avec le corps cellulaire et l’extrémité du
lamellipode.
Notre approche permet d’effectuer des mesures d’élasticité et de déformation de la membrane
cellulaire, en haute résolution, sur la totalité de la cellule, ce qui nous amène à caractériser le
comportement élastique réel de la cellule entière.
Dans le cas de cellules vivantes, l’utilisation du modèle de Sneddon pour le calcul de module
de Young donne une meilleure approximation de l’élasticité de la surface cellulaire que le
modèle DMT (cf. Matériel et Méthodes §III.4.i).
La comparaison systématique d’images topographiques en haute résolution et des données de
mesure d’élasticité et de déformation fournit de bonnes informations sur l’état morphologique
de la cellule. En effet, nous avons pu constater des modifications du comportement mécanique
et du profil topographique des cellules entre les conditions témoin et de traitement par le
glyphosate ; de même qu’il existe des différences significatives selon les concentrations de
glyphosate testées. En effet, un traitement faiblement toxique (30%) induit une augmentation
de la raideur des cellules qui coïncide avec l’apparition d’un réseau filamenteux sousmembranaire ; alors qu’un traitement de plus forte toxicité (CI50) implique un retour à un
profil mécanique comparable à une condition témoin, et l’absence d’un quelconque réseau
sous-membranaire.
Il est important de remarquer la concordance des profils topographiques, observés en
conditions témoin et CI50, avec les profils topographiques obtenus dans les mêmes
conditions, en mode contact et sur cellules fixées. De plus, les valeurs de modules de Young
mesurées sont du même ordre de grandeur que la plupart des cellules vivantes (Alonso et
Goldmann, 2003).
- 180 -
Comme il a déjà été démontré au sein du Laboratoire (Gehin et al., 2005, 2006), le glyphosate
affecte les cellules via une perte significative de leurs capacités antioxydantes intracellulaires.
La quercétine est l’un des bioflavonoides les plus retrouvés dans l’alimentation d’origine
végétale. Bien que cette molécule soit le plus souvent considérée comme un cytoprotecteur
contre les inflammations et les désordres oxydants (Kook et al., 2008) notamment chez les
kératinocytes (Kimura et al., 2009; Wang et al., 2010), des études récentes ont démontré que
ces effets cytoprotecteurs n’apparaissaient que pour de faibles échelles de concentrations
(Ossola et al., 2008; Shih et al., 2004). De plus, Alcocer et al. (2002) ont rapporté que la
quercétine inhibait la prolifération et la migration de cellules musculaires lisses aortiques. Cet
effet controversé a également été constaté dans l’application à notre modèle (cf. fig. 15)
comme l’ont démontré nos tests de cytotoxicité sur cette molécule combinée ou non au
glyphosate. En conséquence, nous avons choisi et appliqué une très faible concentration de
quercétine (100mM) sur les cellules HaCaT, soumises au glyphosate pendant une durée de 18
h.
Le traitement à la quercétine en présence de glyphosate modifie les profils mécaniques et
topographiques. En effet, en présence de quercétine, la cytotoxicité de glyphosate diminue et
induit alors, à faible dose, des profils similaires à ceux des témoins, ce qui pourrait traduire un
frein aux effets du glyphosate sur les cellules HaCaT. Phénomène d’atténuation qui se
confirme avec la condition CI50 qui révèle, en présence de quercétine, des profils mécaniques
et topographiques comparables à ceux observés sans quercétine pour une faible cytotoxicité
du glyphosate. Il a donc été prouvé, par l’ajout de cet antioxydant classique, que l’apparition
d’un réseau filamenteux sous-membranaire est bien la conséquence de l’action du glyphosate.
De plus, le phénotype mécanique induit par le glyphosate sur les cellules HaCaT est bien une
conséquence du stress oxydant.
Le réseau filamenteux sous-membranaire apparait, sous certaines conditions de traitement, et
induit une augmentation de la raideur cellulaire. Il s’agit, en tout état de cause, du
cytosquelette. La mobilisation du cytosquelette apparaitrait comme moyen de défense de la
cellule contre le traitement au glyphosate pour maintenir les fonctions cellulaires dépendantes
de l’intégrité structurelle de la cellule. Cette défense n’a lieu que pour des conditions de faible
cytotoxicité (30% ou CI50+Quercétine) alors que pour des conditions de traitement trop
drastique, le métabolisme cellulaire est probablement débordé et n’est plus capable de
mobiliser son cytosquelette.
- 181 -
Marquage du cytosquelette
Parmi les 3 types de composants dynamiques du cytosquelette présents dans la cellule, les
filaments visibles en position sous-membranaire, mis en évidence par les résultats obtenus en
AFM, pourraient être les filaments d’actine. Leur manifestation sous-membranaire
résulteraient d’une polymérisation accrue de l’actine ou de la mobilisation de fibres de stress
(Li et al., 2008; Pellegrin and Mellor, 2007) en réaction au traitement par le glyphosate. Les
fibres de stress sont des structures contractiles particulières, formées de 10 à 30 filaments
d’actine (Cramer et al., 1997) qui traversent le cytoplasme, et sont liées à la membrane basale
par les points focaux d’adhérence.
De nombreuses études soutiennent cette hypothèse : Birukova et al. (2009) ont démontré la
présence d’un réseau d’actine périphérique concordant avec des modifications de la raideur de
cellules endothéliales ; Chouinard et al. (2008) ont déduit une corrélation entre le
réarrangement du cytosquelette d’actine et la rigidité cellulaire durant l’induction d’un stress
des cellules endothéliales avec des LDL oxydés ; enfin Rotsch et Radmacher (2000) ont
montré que la désagrégation des filaments d’actine induisait la diminution du MY chez les
fibroblastes, alors qu’une réorganisation des microtubules n’affecte en rien la mesure de
l’élasticité cellulaire. Nous pourrions donc, en toute logique, suggérer qu’en réponse à de
faibles effets cytotoxiques induits par le glyphosate, les cellules HaCaT se défendent en
mobilisant davantage leur cytosquelette d’actine.
Or, il est reconnu que le réseau cytosquelettique de kératine peut également jouer un rôle dans
l’élasticité cellulaire. Dans leur revue générale, Magin et al. (2007) rassemblent des données
qui démontrent avec certitude l’implication des filaments intermédiaires de kératine dans la
résistance à de nombreux types de stress tels que l’exposition à une toxine ou un stress
oxydant ou encore la résistance à l’apoptose. En outre, Lulevich et al. (2010), démontrent, par
l’utilisation de kératinocytes codant pour une kératine mutée, que la désorganisation de
filaments intermédiaires de kératine induit des fluctuations de la raideur des kératinocytes.
Enfin, il est également possible que les 2 types de fibres cytosquelettiques, kératine et actine,
soient liées dynamiquement : le premier servant d’échafaudage à la polymérisation du second.
- 182 -
Nous avons décidé d’éclaircir ce point par la caractérisation, par fluorescence, des fibres du
cytosquelette d’actine et de kératine dans ces différentes conditions de stress par le
glyphosate.
Il a déjà été évoqué plusieurs fois au cours de cette discussion, le cas particulier d’un
traitement court de 0,5h : cette condition s’avèrerait plus drastique que les autres, ce qui rend
les observations du cytosquelette impossibles à confronter aux résultats obtenus en AFM. En
effet, la perte de volume, consécutive au traitement par le glyphosate, ne nous permet pas de
conclure quant aux propriétés mécaniques, puisque la proximité du support en verre sous la
cellule entraîne elle-même l’augmentation de la raideur et la diminution de la déformation
cellulaire.
Nous n’avons pas observé de mobilisation du cytosquelette d’actine après 6 h et 18 h de
traitement par le glyphosate, mais plutôt une régression d’autant plus importante que la
cytotoxicité du glyphosate est élevée.
Le réseau de filaments intermédiaires de kératine, quant à lui, présente des fibres plus épaisses
et réparties de manière transversale à travers la cellule après un traitement de 15mM de
glyphosate. Ce même cytosquelette de kératine mobilisé lors d’un traitement par le glyphosate
à des concentrations faiblement cytotoxiques, est très atteint dans le cas d’un traitement à la
condition CI50, et ne peut plus assurer l’intégrité morphologique des cellules. Ces
constatations sont en parfait accord avec les variations des paramètres d’élasticité et des
paramètres topographiques cellulaires, notamment l’apparition et la disparition du réseau
filamenteux sous-membranaire.
Les cellules HaCaT développent donc leur cytosquelette de kératine en réponse au glyphosate
à des concentrations peu cytotoxiques pour tenter de se défendre contre le stress induit. Cette
mobilisation du cytosquelette entraîne une augmentation de la raideur de la surface cellulaire.
- 183 -
- 184 -
DISCUSSION GENERALE
- 185 -
- 186 -
La peau est l’organe le plus vaste du corps humain, et représente la première barrière contre
les polluants environnementaux comme les pesticides. Seul, ou comme composant actif de
formulations commerciales, le glyphosate a longtemps été considéré comme inoffensif dans
son usage courant, au cours de tests d’exposition chronique (Williams et al., 2000).
Cependant, il est maintenant prouvé que le glyphosate est capable de traverser la barrière
cutanée humaine, la majorité de la substance restant au niveau de l’épiderme, et la pénétration
dans une peau abîmée (même superficiellement) étant 5 fois plus élevée que dans une peau
parfaitement saine (Nielsen et al., 2007).
L’équipe de Marc a démontré, à plusieurs reprises, l’action des formulations à base de
glyphosate sur le dérèglement du cycle cellulaire (Marc et al., 2002) et de la transcription
(Marc et al., 2005) dans des embryons d’oursins. La plus grande contribution aux recherches
sur le glyphosate est apportée par l’équipe de Seralini qui a fait des risques du glyphosate et
des OGM son sujet d’étude. Cette équipe a démontré la toxicité du glyphosate sur différents
types cellulaires embryonnaires, placentaires et ombilicaux (Benachour et al., 2009). Ils ont
également travaillé sur les effets des formulations commerciales qui s’avèrent être des
composés perturbateurs endocriniens pour les cellules en culture, et des inhibiteurs de
l’activité aromatase du cytochrome P450 type 19 (Richard et al., 2005 ; Gasnier et al., 2009).
Des études épidémiologiques ont démontré avec certitude la relation entre l’exposition
chronique au glyphosate et le risque accru de cancer (De Roos et al., 2003 ; Pieniazek et al.,
2009).
Enfin, la toxicité cutanée du glyphosate a déjà été analysée depuis la brûlure chimique jusqu’à
la dermatose allergique de contact (Amerio et al., 2004 ; Penagos et al., 2004 ; Nagami et al.,
2005), mais jamais dans une stratégie in vitro de caractérisation cellulaire, à la fois au niveau
moléculaire, fonctionnel et morphologique.
Après avoir défini le cadre de nos travaux de recherche relatifs à la cytotoxicité du glyphosate
in vitro sur culture cellulaire, nous nous sommes attaché à discuter les résultats obtenus dans
chaque grand axe exploré: la mise en évidence de protéines dont l’expression est modulée,
l’étude de la mort cellulaire, et enfin la caractérisation morphologique et mécanique de notre
modèle glyphosate/HaCaT. Nos observations ont permis de constater que les conséquences
cytotoxiques du stress oxydant induit par le glyphosate sur les cellules HaCaT ne seraient pas
seulement dose-dépendantes, mais aussi temps-dépendantes.
- 187 -
Nous avons donc choisi d’étudier 3 temps de contact dans notre stratégie de caractérisation du
modèle glyphosate/HaCaT: 0,5 h, 6 h et 18 h.
L’importance du glutathion, et plus largement de l’équipement antioxydant intracellulaire,
dans la réponse des HaCaT au contact du glyphosate, est corroborée par l’étude protéomique,
qui a mis en évidence la sous-expression, dans le cytosol, de la Glutathion S Transferase P1
(GSTP1), après un traitement en condition CI50. En outre, il faut souligner que la sousexpression de 2 autres protéines a été validée par les 2 techniques de séparation/quantification
des échantillons, la chromatographie et l’électrophorèse bidimensionnelles. Il s’agit de l’αénolase et de la pyruvate kinase isoenzyme M1/M2.
L’étude fonctionnelle des conséquences de l’action cytotoxique du glyphosate permet de
confirmer son impact temps-dépendant, et de conclure à un phénomène apoptotique
majoritaire pour des valeurs de cytotoxicité du glyphosate modérées. Cette mort cellulaire
programmée est provoquée par la perturbation de l’état antioxydant de la cellule en faveur
d’une surproduction d’ERO intracellulaires. L’apoptose induit logiquement l’atteinte du
potentiel de membrane mitochondrial ; l’étude de la mort cellulaire et la mise en évidence de
la perturbation du potentiel mitochondrial ont ouvert la voie à une recherche plus approfondie
des mécanismes moléculaires mis en jeu dans l’atteinte de la viabilité cellulaire par le
glyphosate. Cependant, l’exploration de l’activation des caspases 3 et 9 a révélé à nouveau
des écarts entre les mécanismes cellulaires engagés pour chaque temps de traitement testé.
Notre hypothèse finale est la suivante : plusieurs voies « caspase-dépendantes » ou « indépendantes » sont impliquées dans l’induction de la mort cellulaire par le glyphosate, où
l’une ou l’autre de ces voies dépend des conditions d’exposition des cellules au glyphosate, en
termes de temps et de concentrations.
L’étude morphologique en microscopie confocale et à force atomique a permis de révéler de
nombreux éléments de caractérisation des cellules HaCaT traitées par le glyphosate : une
réorganisation de la membrane plasmique, d’une part, avec l’hétérogénéité surfacique de la
cellule impliquant la réorganisation des rafts lipidiques de la membrane cellulaire ; d’autre
part, une réorganisation mécanique défensive de la cellule, avec le développement du
cytosquelette de kératine en réponse au glyphosate à des concentrations peu cytotoxiques,
mobilisation du cytosquelette entraînant une augmentation de la raideur de la surface
cellulaire. A la CI50, les cellules ne répondent plus de manière visible morphologiquement au
traitement au glyphosate. Ce constat fait écho aux résultats obtenus au cours de l’étude
- 188 -
fonctionnelle puisque la CI50 est caractérisée par la survenue systématique de la nécrose dont
l’intensité varie selon la durée du traitement.
L’étude complète du modèle qui compare temps de traitement court (0,5 h) et temps plus ou
moins longs (6 h et 18 h), nous a permis de constater qu’une demi-heure ne suffit pas à la
cellule pour mettre en place les défenses intracellulaires nécessaires à sa survie : la production
accrue d’ERO et l’intervention de la nécrose pour des cytotoxicités élevées en sont la preuve.
De même, il semblerait, d’après nos résultats préliminaires, que les cellules HaCaT soient
incapables, dans ce même laps de temps court, d’engager un processus de mort dépendant des
caspases.
Les différences entre les 2 temps de traitement, 6 h et 18 h, sont plus subtiles car ils
produisent des profils cytotoxiques similaires et une CI50 identique. De même, aucune
différence, en termes de morphologie et de phénotype mécanique, n’a été observée.
Cependant, il existe bien une variabilité dans le processus de mort cellulaire enclenché dans
les cellules stressées, puisque, après 18 h de traitement, la communication paracrine entre les
kératinocytes et l’épuisement de leurs défenses intracytosoliques (antioxydantes ou autres)
provoquent un stress oxydant chez un plus grand nombre de cellules. L’apoptose plus tardive
après 18 h de traitement confirme cette logique.
En outre, les cellules exposées au glyphosate pendant 6 h ou 18 h, feraient appel à des voies
de signalisation de la mort cellulaire différentes. Au vu des premiers dosages de l’activité des
caspases, 6 h de traitement semblent être la condition la plus reproductible en termes de
mécanismes de mort engagés.
Tout au long de notre travail, nous avons privilégié les CI50 comme valeurs de référence en
cytotoxicité, même si, dans certains cas, notamment dans les études morphologiques, des
concentrations moins cytotoxiques permettaient de meilleures observations et des
interprétations comparatives. . En effet, aucune mobilisation du cytosquelette, ni de raideur de
la surface cellulaire n’ont été constatées pour des traitements à la CI50, ce qui sous-entend
que, pour un traitement drastique, la cellule n’est plus capable de lutter contre ce stress. De
plus, la caractérisation de l’apoptose, avec une forte proportion de cellules apoptotiques
détectées à la CI50, confirme l’enclenchement d’un phénomène irréversible contre lequel la
cellule a perdu tout moyen de défenses antioxydantes ou autres.
- 189 -
L’atteinte du cytosquelette, l’altération de l’intégrité de la membrane cellulaire, associées au
phénomène apoptotique induit par le glyphosate, conduisent les cellules HaCaT à la perte de
contacts intercellulaires (Pellegrino et al., 2004), à l’affaiblissement des points d’adhérence
des cellules sur leur support de culture, et enfin au détachement irréversible de celles-ci.
Ainsi, le passage du glyphosate à travers l’épiderme in vivo doit provoquer une fragilisation
de sa fonction de barrière par l’atteinte de l’homéostasie cellulaire et du phénotype mécanique
des kératinocytes. En outre, l’exposition à cette pollution chimique pourrait potentialiser
l’effet d’autres facteurs environnementaux, physiques ou chimiques, accélérant encore
davantage le processus complexe du vieillissement cutané.
- 190 -
CONCLUSIONS
ET
PERSPECTIVES
- 191 -
- 192 -
Le modèle glyphosate / HaCaT que nous avons exploré au cours de ces travaux de thèse, et
validé comme modèle in vitro mimant le vieillissement environnemental, a permis d’aborder
les événements, les signaux et les comportements cellulaires s’installant au cours du
vieillissement cutané
Du fait de sa petite taille, la molécule de glyphosate est capable de traverser la barrière
cutanée humaine, mais la majorité de la substance est retenue dans l’épiderme. Ce travail de
thèse a démontré que le glyphosate altérait significativement l’état et la fonction barrière de
l’épiderme humain, en ayant notamment pour cible les kératinocytes, dont l’équipement
moléculaire et les fonctions vitales d’adhérence et de dynamique membranaire se retrouvent
fondamentalement dégradées.
Ainsi, nous avons montré le bien fondé de notre modèle expérimental de vieillissement
environnemental induit par le glyphosate, l’agent actif d’un pesticide sur la lignée
kératinocytaire HaCaT. Nombreux sont les modèles de vieillissement cutané qui étudient le
comportement du derme et sa capacité à entretenir sa matrice extracellulaire, et donc ses
propriétés viscoélastiques. Notre contribution à la compréhension des mécanismes du
vieillissement cutané a révélé, en lien avec l’état actuel des connaissances sur le sujet, que
l’épiderme jouait un rôle tout aussi important dans l’impact du vieillissement sur la barrière
cutanée, d’autant plus si ce vieillissement est extrinsèque, provoqué par une pollution
chimique. En nous appuyant sur notre modèle épidermique original, nous avons mis en
exergue l’impact du glyphosate sur la modulation d’expression protéique des cellules HaCaT
ainsi que sur les fonctions cellulaires impliquées dans des phénomènes de mort cellulaire,
essentielles au maintien de l’homéostasie de l’épiderme. Notre étude est la première à révéler
les effets délétères d’un pesticide, le glyphosate, sur les propriétés morphologiques,
fonctionnelles et mécaniques des cellules majoritaires qui composent l’épiderme, les
kératinocytes. Ces effets, décrits au cours de ce travail, concernent essentiellement la perte
d’élasticité cellulaire liée, à la fois, à la mobilisation accrue du cytosquelette et à des atteintes
significatives de la membrane cellulaire et de son contenu en rafts lipidiques. Nous
démontrons ainsi le rôle important de l’épiderme dans le maintien des propriétés
viscoélastiques de la peau, qui s’additionne à celui, mieux connu, du derme.
- 193 -
L’ensemble de nos travaux a visé à valider le modèle expérimental glyphosate / HaCaT que
nous proposons, et nous permet de conclure sur les conditions optimales de son utilisation
pour le criblage ultérieur d’autres substances pouvant être incriminées dans le vieillissement
environnemental, ou dans la recherche de composés capables de réverser les effets du
vieillissement.
Plusieurs perspectives sont à prévoir, à court terme, s’appuyant sur 3 pistes principales :
-
poursuivre le dosage de l’activité des caspases et d’autres molécules impliquées dans
les différents mécanismes d’induction de l’apoptose : caspase 3, 9 et 8, AIF, PARP…
-
compléter l’étude protéomique E2D/MALDI-TOF de manière systématique pour 6 h
de traitement, et sur la totalité des fractions cellulaires. Ceci permettrait d’identifier de
manière formelle les mécanismes mis en jeu par les cellules HaCaT lors du traitement
au glyphosate, en établissant notamment s’il y a adressage de ces protéines vers un
autre compartiment cellulaire.
-
envisager le couplage du Bioscope catalyst avec un microscope confocal à
fluorescence, en vue de vérifier l’implication du cytosquelette de kératine dans les
modifications surfaciques observées sur les cellules HaCaTs et sur la variation de leurs
propriétés viscoélastiques.
A plus long terme, d’autres axes de recherches peuvent être développés :
-
La transposition de notre modèle glyphosate/épiderme sur des cultures primaires de
kératinocytes humains, voire d’épidermes reconstruits, étant donnée la facilité d’accès
à des prélèvements d’abdominoplastie effectués dans le service de dermatologie (Pr P.
Humbert) du CHU de Besançon.
-
La détection de biomarqueurs membranaires à la surface des cellules vivantes par
immunoAFM et cartographie. Il est possible de fonctionnaliser une pointe AFM avec
des anticorps spécifiques de protéines d’intérêt et sonder la surface cellulaire avec
cette pointe pour mettre en évidence la présence de ces protéines à l’extérieur de la
membrane cellulaire.
- 194 -
En parallèle à notre étude, il serait intéressant d’étudier plus finement l’impact du glyphosate
sur les propriétés d’adhérence des cellules. Un moyen d’aborder cette problématique est
d’utiliser la technique de résonance de plasmons de surface, ou SPRi, qui rend possible une
investigation, en temps réel, de phénomènes apparaissant dans les 100 à 150 premiers nm
situés au-dessus de la surface sur laquelle les cellules sont cultivées. Cette approche peut,
d’ailleurs, bénéficier de l’expertise associée dans l’environnement proche du laboratoire, au
sein de l’institut FEMTO-ST (plateforme CLIPP). Il serait donc pertinent d’utiliser cette
technologie pour caractériser les interactions que développent les cellules HaCaT avec la
surface d’adhérence, et repérer particulièrement les effets du traitement au glyphosate, non
plus sur la face cellulaire exposée au milieu comme le permettait l’AFM, mais au niveau de
l’interface membrane cellulaire/substrat qui conditionne l’adhérence et donc la viabilité
cellulaire. Cette investigation permet de focaliser sur la nature et la dynamique des
interactions de contact entre les cellules et le substrat, et ceci en fonction du contexte
environnemental.
Figure 51 : Etude en SPRi des types de contacts cellulaires avec le substrat.
D’après Giebel et al. (1999).
- 195 -
- 196 -
ANNEXES
- 197 -
- 198 -
Annexe 1
Morphological damages of a glyphosate-treated human keratinocyte cell line
revealed by a micro- to nanoscale microscopic investigation.
Elie-Caille C, Heu C, Guyon C, Nicod L.
Cellular Biology and Toxicology. 2009;26(4):331-9.
- 199 -
- 200 -
- 201 -
- 202 -
- 203 -
- 204 -
- 205 -
- 206 -
- 207 -
- 208 -
- 209 -
- 210 -
Annexe 2
Glyphosate-induced stiffening of HaCaT keratinocytes,
a Peak Force Tapping study on living cells.
Heu C, Berquand A, Elie-Caille C, Nicod L.
Journal of Structural Biology. 2012;178(1):1-7.
- 211 -
- 212 -
- 213 -
- 214 -
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- 216 -
- 217 -
- 218 -
- 219 -
- 220 -
Annexe 3
A step further towards glyphosate-induced epidermal cell death:
Involvement of mitochondrial and oxidative mechanisms.
Heu C, Elie-Caille C, Mougey V, Launay S, Nicod L.
Environmental Toxicology and Pharmacology. 2012;34(2):144-53.
- 221 -
- 222 -
- 223 -
- 224 -
- 225 -
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- 228 -
- 229 -
- 230 -
- 231 -
- 232 -
Annexe 4
Using PeakForce QNM for Drug Testing: Applications on Live Human Cells.
Heu C, Berquand A, Elie-Caille C, Nicod L.
Microscopy And Analysis Spm 18 Issue April 2012
- 233 -
- 234 -
- 235 -
- 236 -
Annexe 5 : Communications orales et posters
Heu C, Berquand A, Elie-Caille C, Nicod L. Glyphosate-induced stiffening of HaCaT
keratinocytes - A combined fluorescence/AFM study Focus on Microscopy Singapore, 2012.
(poster et communication orale)
Heu C, Berquand A, Elie-Caille C, Nicod L. Characterizing the glyphosate-induced
epidermal cell mechanical properties using the QFM-based Peak Force QNM Technology.
Cell Signalling, Merida, Mexico, 2011
Heu C, Lucchi G, Berquand A, Ducoroy P, Elie-Caille C and Nicod L. Proteomic mapping of
glyphosate-treated human keratinocytes cell line using two-dimensional Electrophoresis.
Spectrométrie de Masse et Analyse Protéomique (SMAP) Avignon, September 19-22 2011
Heu C, Berquand A, Nicod L and Elie-Caille C. Characterizing the glyphosate-induced
epidermal cell mechanical properties using the QFM-based Peak Force QNM Technology.
AFM Biomed, Paris, August 23-27 2011
Heu C, Elie-Caille C, Mougey V, Launay S and Nicod L. Involvement of mitochondrial and
oxidative mechanisms in glyphosate-induced epidermal cell death. 4th International
Symposium of Nutrition, Oxygen Biology and Medicine -- "Free Radicals, Nutrition and
Aging: from fundamental aspects to clinical applications", Paris, June 15-17 2011
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dans la mort des cellules épidermiques induite par le glyphosate Congrès Annuel de
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