Prélèvements pour les tests de parasitologie, de

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PROCEDURE
Prélèvements pour les tests de parasitologie, de sérologie et de biologie
moléculaire
BIO-PREL
Version : 3.1
Date : 12/11/2013
REDACTEURS
VERIFICATEURS
APPROBATEUR
DESTINATAIRES
Thomas Kesteman
Franck Remoué
André Offianan Touré
Carole Eboumbou
Nicaise Ndam
Inès Vigan-Womas
Milijaona
Randrianarivelojosia
Participants au projet
PALEVALUT
Infirmiers et
superviseurs (enquête
transversale)
Date : 19/09/2013
Date : 19/09/2013
Date :
Objet : La procédure définit la méthode de prélèvement pour la réalisation des tests biologiques
rapides, ainsi que pour la collection des échantillons et leur transport au laboratoire, où ils sont
destinés à la réalisation de tests parasitologiques, sérologiques et de biologie moléculaire.
Application :
Le document est élaboré pour le personnel chargé de la réalisation des prélèvements sur le
terrain durant l’enquête transversale et l’acheminement jusqu’au(x) laboratoire(s).
Documents associés : Feuille prélèvements PALEVALUT.xlsx (Feuille de travail associée à chaque
lot d'échantillons collectés)
Annexes : 2
Historique des modifications :
Date
19/09/2013
25/09/2013
27/09/2013
05/11/2013
12/11/2013
Version
1
2.0
2.1-2.2
3.0
3.1
Nature de la modification
Création de la POS
Corrections FR
Corrections NN & CE
Fusion avec chapitres prélèvement des autres POS BIO
Ajustement du chapitre papier buvards (CE)
Cette oeuvre, création, site ou texte est sous licence Creative Commons Attribution - Partage dans les Mêmes Conditions 4.0
International. Pour accéder à une copie de cette licence, merci de vous rendre à l'adresse suivante
http://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/ ou envoyez un courrier à Creative Commons, 444 Castro Street, Suite 900,
Mountain View, California, 94041, USA.
1
PROCEDURE
moléculaire
BIO-PREL
Version : 3.1
Date : 12/11/2013
Contenu
1
2
3
4
Introduction........................................................................................................................................... 2
Objectifs ................................................................................................................................................ 3
Responsabilités ...................................................................................................................................... 3
Matériels ............................................................................................................................................... 3
4.1
Matériel non-spécifique ................................................................................................................ 3
4.2
Pour la réalisation du TDR ............................................................................................................. 4
4.3
Pour la réalisation d’étalements de sang sur lame (i.e. frottis mince et goute épaisse) .............. 4
4.4
Pour la collecte des échantillons de sang sur papier-buvard ........................................................ 4
4.5
Pour le prélèvement du sérum...................................................................................................... 5
4.5.1
Consommables de laboratoire : ............................................................................................ 5
4.5.2
Equipements.......................................................................................................................... 5
5 Méthodes .............................................................................................................................................. 5
5.1
Précautions .................................................................................................................................... 5
5.2
Etapes du prélèvement ................................................................................................................. 6
5.3
Piqûre ............................................................................................................................................ 6
5.4
Prélèvement pour le TDR .............................................................................................................. 8
5.6 Prélèvement pour la réalisation de lames GE/FS ................................................................................ 9
5.7 Prélèvement du sérum ........................................................................................................................ 9
5.8 Prélèvement sur buvard .................................................................................................................... 10
5.9 Conservation des échantillons .......................................................................................................... 11
5.4.1
Conservation des TDR.......................................................................................................... 11
5.4.2
Conservation des lames....................................................................................................... 11
5.4.3
Conservation des papier-buvards........................................................................................ 11
5.4.4
Conservation des microtubes .............................................................................................. 12
6 Annexes ............................................................................................................................................... 13
Annexe 1 : Contrôle qualité prélèvements sur papiers buvards ......................................................... 13
Annexe 2 : Feuille de travail associée à chaque lot d'échantillons collectés ...................................... 14
1
Introduction
Dans le cadre de l’évaluation des méthodes de lutte, en termes d’indicateurs d’exposition aux
vecteurs, de transmission et d’infection, il est convenu que la réalisation de différents tests,
estimant l’infection par Plasmodium et l’exposition aux Anopheles vecteurs, est utile car ces
différentes approches sont complémentaires. Ces différents tests sont réalisés sur des supports
différents et transportés dans des conditions différentes. La réalisation de ces différents tests
est décrite in extenso dans leurs POS respectives, à savoir :
2
PROCEDURE
moléculaire
2

BIO EVAL-TDR

BIO-MICROSCOPIE

BM-INFECT

BIO-EXPO

BIO-INFECT

BIO-SeroMultiplex
BIO-PREL
Version : 3.1
Date : 12/11/2013
Objectifs
Standardiser la procédure de prélèvement pour les tests biologiques rapides et de laboratoire.
3
Responsabilités
Paramédical (infirmier, sage-femme,…) : identification et réalisation des prélèvements
Superviseur d’équipe : stockage des prélèvements sur le terrain, envoi des prélèvements du
terrain vers le laboratoire central.
4
Matériels
4.1 Matériel non-spécifique







Coton hydrophile et alcool 70% (ou autre équivalent pour la désinfection du site de
prélèvement)
Sparadraps et ciseaux
Gants à usage unique
Crayon et stylo ou étiquettes individuelles
Marqueur indélébile
Container destiné à recevoir le matériel de ponction (piquant ou tranchant)
potentiellement infectieux, à usage unique, combustibles
Lancettes pour prélèvement capillaire. Les lancettes à pointe triangulaire sont
préférables à celles à pointe cylindrique car elles induisent un flux de sang plus
important (Figure 1). Le recours à des lancettes ad hoc peut être considéré, p.ex : BD
microtainer® contact-activated lancets (high flow, 1.5*2.0 mm, ref. 366594) ; Accu-chek
(Safe-t-pro Plus - Roche)
3
PROCEDURE
moléculaire
BIO-PREL
Version : 3.1
Date : 12/11/2013
Figure 1 : Lancettes à pointe triangulaire (gauche, préférables) et cylindrique (droite)


Sacs en plastiques de grande taille avec fermeture éclair
Indicateurs d'humidité
4.2 Pour la réalisation du TDR
Objet : POS BIO-EVAL-TDR




Cassettes emballées individuellement (dispositifs de test)
Tampon (réactif)
Poire jetable
Notice
4.3 Pour la réalisation d’étalements de sang sur lame (i.e. frottis mince et
goute épaisse)
Objet : POS MICROSCOPIE





Lames givrées propres
Lancettes stériles
Plateau pour le séchage des lames
Boîte de rangement pour lames
Ruban adhésif ou élastique
4.4 Pour la collecte des échantillons de sang sur papier-buvard
Objet : POS BM-INFECT






Micropipette 50 µl (volume variable ou fixe)
Tips (cônes, embouts) à filtre stériles 20-200µl
Feuille de papier-buvard Whatman FTA Elute Micro Cards with 4 sample areas per card
(40 µL/spot) (Ref. Whatman: WB120410)
Sachet de conservation des FTA (Petits sacs en plastique propres)- Multi-Barrier Pouch
(Ref. Whatman: WB100036 or WB100037)
Sachets desiccants - Desiccant bags (Ref. Whatman: 100003)
Pochettes cartonnées de couleur
4
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Date : 12/11/2013
4.5 Pour le prélèvement du sérum
Objet : POS BIO-INFECT, BIO-EXPO et BIO-SeroMultiplex
4.5.1 Consommables de laboratoire :
 Microtubes pour le recueil du sérum, avec gel séparateur. Par exemple :
o Greiner bio-one MiniCollect® Capillary Blood Collection System, ref. 450473
(Z Serum, Sep, red cap, 0.5ml) + collerette (Funnel, ref. 450421)
o Sarstedt Microvette® 500 – Blood collection with collection rim, ref. 20.1344
(500 μl sample volume, round bottom inner tube, Serum gel / Clotting activator)
o Sarstedt Microvette® 200 – Capillary blood collection, ref. 20.1291 (200 μl sample
volume, round bottom inner tube, Serum gel / Clotting activator)
o BD Microtainer® tube with serum separator with Conventional gold closure (ref.
365956 ou 365951)
o BD Microtainer® tube with serum separator with Microgard™ closure, clot
activator, 400-600 µl (ref. 365967)
 Boîtes de rangement pour tubes 1.5 ml
4.5.2 Equipements
 Centrifugeuse pour tubes 1.5-2.0 ml
 Glacière et accumulateurs de froid
5
Méthodes
5.1 Précautions








Veiller à la vaccination des opérateurs contre l’hépatite B
Trouver un lieu et une surface adéquats pour effectuer les prélèvements. Après avoir
établi le nombre de sujets à tester, sortir l’équipement approprié.
Organiser son plan de travail avant d’enfiler les gants
Identifier les prélèvements (lames, TDR, papier-buvard, microtube) AVANT de réaliser la
piqûre au bout du doigt avec la lancette
Décrire soigneusement à la personne ou au parent/adulte responsable la procédure de
prélèvement exacte et ce qu’ils peuvent faire pour aider durant le prélèvement, afin
d’obtenir leur collaboration et de les rassurer.
Se laver soigneusement les mains avec de l’eau et du savon puis les sécher.
Mettre des gants avant de commencer le prélèvement.
o Porter des gants durant toutes les étapes du prélèvement.
o Utilisez une nouvelle paire de gants pour chaque patient. Ne pas réutiliser la
même paire de gants.
Manipuler tous les prélèvements avec précaution, comme s'ils étaient potentiellement
infectieux.
5
PROCEDURE
moléculaire



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Suivre les directives standard de biosécurité relatives à la manipulation et à l'élimination
des matières potentiellement infectieuses.
Toujours nettoyer le doigt du patient avant de désinfecter, et donc de piquer
Sélectionnez le lieu de ponction :
o Piquer de préférence le troisième doigt de la main gauche (pour les droitiers et
inversement pour les gauchers), au bout du doigt sur le côté (mais pas trop près
de l’ongle). En second choix, l’annulaire peut être choisi. Les autres doigts sont à
éviter: le pouce a un pouls, l’index peut être plus sensible et plus corné, et les
tissus de l’auriculaire ne sont pas assez profonds pour éviter une lésion à l’os.






o Pour les bébés avant l’âge d’un an, piquer sur le bord externe du talon
Ne jamais prélever un échantillon de sang d'un doigt froid
Eviter de toucher le papier-buvard avec les doigts (interdiction de toucher le papierbuvard au niveau des cercles)
Jeter la lancette utilisée en toute sécurité dans la boîte à aiguilles. Ne pas la poser avant
élimination.
Ne pas réutiliser la lancette.
Se laver les mains après prélèvement
Ne pas manger, boire ou fumer dans la zone de manipulation des prélèvements.
5.2 Etapes du prélèvement
L’infirmier (ou paramédical) réalisera les prélèvements dans l’ordre suivant :
1) TDR
2) Etalements de sang sur lame (GE/FS)
3) Microtube
4) 40 µl sur papier-buvard
Il convient de prévoir qu’un autre paramédical « technicien GE/FS » soit présent à côté de
l’infirmier afin de réaliser les étalements de sang (GE et FS) pendant que l'infirmier continue à
faire le prélèvement (microtube et papier-buvard) avant que le sang ait le temps de sécher sur
la lame.
5.3 Piqûre

Se positionner adéquatement par rapport au sujet.

Préparer le point de ponction
o Réchauffer le point de ponction grâce au réchauffement. Si l’on permet à la
surface de la peau d’atteindre 42°C, le débit sanguin peut être septuplé. Le plus
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moléculaire
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Version : 3.1
Date : 12/11/2013
simple est de se frotter les mains l'une contre l’autre comme si les mains étaient
froides. Si cela n'aide pas, rincer les mains à l'eau tiède. Alternativement, l’on
peut couvrir de 3 à 5 minutes avec une serviette chaude et humide ou un
système chauffant commercial (p. ex., sac de gel chauffant) dont la température
ne dépasse pas 42°C (Clinical and laboratory standards institute, 2010).
o Masser le point de ponction par un massage léger : favorise la circulation
sanguine et l’écoulement du sang (Garza Diana et al, 2009).

Nettoyer et désinfecter soigneusement avec du coton imbibé de solution aqueuse
alcoolique à 70° le lieu de ponction. S’assurer que le lieu de ponction se trouve en
dessous du cœur du sujet.

Laisser le doigt sécher à l'air. Si le doigt est encore humide lorsque la piqûre du doigt, le
sang va flotter et peut être dilué avec de l'alcool et interférer avec les tests (tout résidu
d’alcool pourrait causer l’hémolyse de l’échantillon).

Retirer la protection de la lancette selon les recommandations du fabricant. Si la lancette
est contenue dans un protection en papier, déchirer la protection à mi-hauteur et la tirer
ensuite latéralement. Ne pas toucher la pointe de la lancette, au risque d’y déposer des
bactéries qui pourraient être présentes sur les gants.

En décrivant un mouvement circulaire avec le pouce, appuyer doucement sur le doigt à
partir de la jointure supérieure vers le bout. Cela stimule la circulation sanguine vers le
lieu de ponction. Quand le pouce atteint le bout du doigt, maintenir une pression légère.

Effectuer la ponction : une incision de moins de 2,00mm de profondeur atteindra la zone
vascularisée de la peau sans causer de dommage.
o Tenir le dispositif de ponction selon les directives du fabricant
o Tenir fermement le talon ou le doigt pour empêcher tout mouvement brusque
du patient.
o Avertir le patient de la ponction imminente.
o Enfoncer la lancette d’un coup rapide et fort dans la pulpe du doigt
perpendiculairement à l’empreinte digitale, légèrement sur le côté. Éviter
l’extrémité du doigt ou les côtés extérieurs à l’empreinte digitale parce qu’il y a
un risque d’atteindre l’os sous-jacent (Figure 2).
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Version : 3.1
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Figure 2 : Ponction sur le talon (A) ou le majeur (B)

La lancette doit être placée immédiatement dans la boîte OPCT à déchets dangereux
avec le reste du matériel utilisé pour le prélèvement de sang.

Orienter le doigt de façon à présenter le point de ponction vers le bas, évitant ainsi que
les gouttes de sang ne coulent le long du doigt, ce qui complique la collection du sang,
réduit la quantité de sang que l’on peut prélever et contamine le prélèvement lorsque le
sang coule sur une partie du doigt qui n’a pas été correctement nettoyée.

Lorsque le sang apparaît, essuyer la première goutte de sang avec du coton sec ou avec
une gaze stérile (Figure 3). Cette goutte a en effet tendance à contenir du liquide de
tissus en excès qui peuvent nuire à la qualité de l'échantillon.
Figure 3 : Essuyer la première goutte de sang avec une gaze stérile.

Appliquer une pression légère à côté du point de ponction.
5.4 Prélèvement pour le TDR
Cf. POS EVAL-TDR et recommandations du fabricant
8
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
Recueillir la quantité requise de sang (généralement 5 µl) à l'aide d’une pipette
capillaire. Déposer le sang dans le puits approprié.

Jeter la pipette dans le container pour matériel contaminé.

Mettre trois à cinq gouttes (selon le fabricant) du tampon de la cassette dans le
puits approprié.

Attendre le temps indiqué (généralement 15 min) avant de lire les résultats des tests
5.6 Prélèvement pour la réalisation de lames GE/FS
Cf. POS MICROSCOPIE

Avec la main droite, prendre une lame de verre propre par le bord

Avec la main gauche, presser le doigt piqué pour faire sortir une goutte de sang

Toucher la goutte de sang avec le milieu de la lame

Toujours avec la main gauche, presser le doigt piqué pour faire sortir une nouvelle
goutte de sang sur la moitié libre de la lame portant le frottis
5.7 Prélèvement du sérum
Cf. POS BIO-INFECT, BIO-EXPO et BIO-SeroMultiplex
 Avant de piquer, enfoncer la collerette dans le bouchon du microtube, si nécessaire
(modèle Sarstedt).
 Toucher la goutte de sang suivante avec le bord de la collerette ou du microtube luimême. Laisser couler le sang dans le microtube jusqu’à obtention du volume désiré.
 Mélanger doucement le microtube en le retournant et/ou en tapotant le bas du
microtube. Ne pas secouer le microtube, ce qui pourrait entraîner de la mousse ou de
l’hémolyse. Ne pas collecter plus de sang dans le microtube qu’il n’est recommandé par le
fabricant.

Déposer le microtube dans la boîte de rangement.
9
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moléculaire
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Version : 3.1
Date : 12/11/2013
5.8 Prélèvement sur buvard

Avant de piquer, fixer un cône sur la micropipette et vérifier que le volume de
prélèvement de cette dernière est de 40 µl (si micropipette à volume variable)

Identifier soigneusement le papier buvard FTA: étiquette individuelle ou numéro
d'identification, date et lieu de prélèvement au stylo à bille. Utiliser un papier buvard par
patient.

Après avoir prélevé le sang en microtube et avant que le flux de sang ne se tarisse,
prélever 40 µl de la goutte de sang restante avec la micropipette

Note : la micropipette ne peut jamais être orientée cône vers le haut pendant le
prélèvement ; au pire, elle peut être orientée à l’horizontale

Déposer rapidement les 40 µl de sang par un mouvement circulaire concentrique au
centre du cercle sur le papier buvard correspondant à l’identifiant de l’individu, faire 2
dépôts par individu

Important:
o Ne pas toucher le cercle
o Il est nécessaire que toute la zone à l'intérieur du cercle soit recouverte avec du
sang
o Etaler la goutte sur l’ensemble de la zone considérée et ne pas déposer une
goutte de sang sur une autre
o Le sang doit apparaître comme une couche uniforme

Laisser sécher le sang à l’air libre au moins 4 heures à température ambiante sur une
surface non absorbante (rack de séchage empilables est idéal) : sang sec = sang de
couleur noire

Important:
o Ne pas exposer les échantillons à la lumière solaire ou à des températures
extrêmes température ou à l’humidité,
o Ne pas chauffer pour sécher les échantillons.

Après séchage de l'échantillon :
o Rabattre le volet de dessus du papier,
o Placez les papiers-buvards dans des sacs en plastique individuels avec un sachet
désiccant qui peut être renouvelé.
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moléculaire
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Version : 3.1
Date : 12/11/2013
5.9 Conservation des échantillons
5.4.1 Conservation des TDR
 Les TDR sont jetés conformément aux règles de biosécurité.
5.4.2 Conservation des lames
 Le frottis confectionné est rapidement séché par agitation pour éviter que les hématies
soient crénelées.
 Eviter le contact entre étalements de sang et mouches ou poussières : les déposer
rapidement dans les boîtes de rangement.
 Le frottis séché est fixé avec du méthanol.
5.4.3 Conservation des papier-buvards
 Avant d’être envoyés au laboratoire, faire le contrôle qualité des échantillons (Annexe 1)
 Sur le terrain et au cours du transport entre le terrain et le laboratoire, les feuilles
papier-buvards seront conservées à température ambiante ou à +4°C dans un endroit
frais et sombre dans des sachets fermés avec papier dissécant. Avant transfert au
laboratoire, ces feuilles seront stockées dans un classeur ou pochette plastique sur
lequel on prendra soin de noter la date de passage, le village, etc…
 Pour une conservation sur plusieurs mois, les papier-buvards, classés dans des classeurs
ou pochettes plastiques sont conservés au frigidaire à +4°C ou à -20°C, et à l’abri de
l’humidité dès que possible, après réalisation sur le terrain.
 Expédition des échantillons :
o Les échantillons doivent être envoyés au laboratoire dans les plus brefs délais en
respectant les exigences liées aux analyses et édictées par le laboratoire.
o Vérifier la présence de papier dissécant dans les sachets individuels.
o Placez plusieurs sacs individuels contenant chacun les 2 papiers buvards FTA sec
du patient dans un sac en plastique de grande taille avec fermeture éclair.
o Joindre la feuille de travail avec chaque lot d'échantillons (conserver une copie
pour la réception des résultats) : voir Annexe 2
o Faites expédier les échantillons au laboratoire par les moyens les plus rapides en
les protégeant contre l’humidité, les températures élevées et le soleil. Si
nécessaire, placer les échantillons dans une glacière avec des packs de glace.
Conditions requises pour expédition
Fréquence des envois
Type de transport
Condition d’expédition
Documentation incluse
Température ambiante non humide
En fonction de la disponibilité des échantillons
Courrier : transport normal
Température ambiante, éviter les temperatures
extrêmes
- Feuille de travail associée à chaque lot
d'échantillons collectés (Annexe 2)
- Facture d’envoi
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moléculaire
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Version : 3.1
Date : 12/11/2013
5.4.4 Conservation des microtubes
 Chaque soir, les microtubes seront centrifugés selon les recommandations du fabricant.
 Le prélèvement est stable à température ambiante (<22°C) mais peu se dessécher ou
être détérioré par la prolifération de microorganismes, surtout si la température excède les
22°C. La boîte de rangement devra donc être stockée dans une glacière avec accumulateurs de
froid.
 A l’arrivée au laboratoire central, les sérums seront aliquotés, en tubes Eppendorf de 1,5
ml de la façon suivante :

o 50 µl pour BIO-EXPO
o 50 µl pour BIO-INFECT
o 50 µl pour BIO-SeroMultiplex
o Le reste est conservé dans le tube d’origine = réserve sérothèque « Pays »
Tous les aliquots sont conservés à -20°C
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PROCEDURE
moléculaire
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BIO-PREL
Version : 3.1
Date : 12/11/2013
Annexes
Annexe 1 : Contrôle qualité prélèvements sur papiers buvards
Il est essentiel de s'assurer que le prélèvement et le séchage de l'échantillon est de très haute qualité.
Les échantillons de mauvaise qualité aboutiront à des résultats de mauvaise qualité.
Nature du contrôle : analyse visuelle des échantillons et vérification de la concordance patient ID,
échantillon ID avec celui de la feuille de travail (Annexe 2) avant l'envoi au laboratoire d’analyse
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PROCEDURE
moléculaire
BIO-PREL
Version : 3.1
Date : 12/11/2013
Annexe 2 : Feuille de travail associée à chaque lot d'échantillons collectés
Cette oeuvre, création, site ou texte est sous licence Creative Commons Attribution - Partage dans les Mêmes Conditions 4.0 International. Pour accéder à une copie de cette licence, merci
de vous rendre à l'adresse suivante http://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/ ou envoyez un courrier à Creative Commons, 444 Castro Street, Suite 900, Mountain View, California,
94041, USA.
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Prélèvements pour les tests de parasitologie, de

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