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BK KINYOUN KIT Para diagnóstico “in vitro” PRINCIPIO La tinción de Kinyoun es una variante de la tinción clásica de Ziehl-Neelsen que utiliza como colorante primario Fucsina básica con fenol a concentraciones altas, lo que permite la coloración en frío, mientras que la tinción clásica de Ziehl-Neelsen precisa la utilización de calor en la etapa de la coloración primaria. El resto de las etapas del procedimiento son las mismas que en la metódica original de Ziehl. Como colorante de contraste se utiliza Verde brillante, aunque también puede utilizarse Azul de Metileno. La tinción de Ziehl–Neelsen se utiliza para la diferenciación de los microorganismos ácido-alcohol resistentes. Estos microorganismos poseen una pared celular lipídica especial, que contiene entre otros ácido micólico, que les permite resistir la decoloración con ácido-alcohol después de la tinción con colorantes básicos como la fucsina y aparecen de color rosarojizo, mientras que el resto de los microorganismos se tiñe con el colorante de contraste. Se supone que la permeabilidad a través de las membranas intactas puede ser un componente importante del mecanismo involucrado en el fenómeno de resistencia a la decoloración por alcohol ácido indicado. Aunque el mecanismo de la diferenciación no está plenamente establecido, la metódica está totalmente aceptada como procedimiento diagnóstico de sospecha precoz así como para proporcionar información sobre el número de bacilos presentes en la muestra. Los microorganismos ácido-alcohol resistentes son básicamente las Mycobacterias, aunque existen otros microorganismos que también presentan esta característica como son el género Nocardia y algunos parásitos como Cryptosporidium. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Los colorantes para tinción de Kinyoun se utilizan para realizar tinciones de cultivos o muestras que se sospecha que contienen micobacterias, para el diagnóstico precoz de infección micobacteriana y su caracterización. MUESTRA Extensiones procedentes de cultivos bacterianos. Muestras procedentes de diversos fluidos corporales: esputos, fluidos pulmonares, sedimentos de orina, líquido cefalorraquídeo, tejido, etc. REACTIVOS Kit 3 x 250 mL. Contiene: A. 1 x 250 mL. Reactivo Nº 1 B. 1 x 250 mL. Reactivo Nº 2 C. 1 x 250 mL. Reactivo Nº 3 Ref. 99 25 05 Extender la muestra con un asa en un portaobjetos para conseguir un frotis uniforme y delgado. Secar al aire y fijar con calor pasando el portaobjetos por una pequeña llama entre 2 y 3 veces. Dejar enfriar antes de realizar la tinción. Ref. 99 25 55 Ref. 99 20 84 Ref. 99 56 68 Manipular las muestras con precaución por su capacidad potencialmente infecciosa. Fucsina Fenicada Kinyoun Decolorante BK Verde Brillante PROCEDIMIENTO Fucsina Fenicada Kinyoun Composición Fucsina básica Fenol Isopropanol 1,5% 5% 20% Verde Brillante Composición Verde Brillante 0,2% 1. Cubrir con Fucsina Fenicada Kinyoun. Dejar unos 5 minutos. NO CALENTAR 2. Lavar suavemente con agua corriente. Eliminar el exceso de agua. 3. Cubrir con el Decolorante BK, balancear suavemente y a continuación lavar con agua. Si sigue apareciendo coloración rojiza en la muestra repetir la decoloración. 4. Lavar suavemente con agua corriente. Eliminar el exceso de agua. 5. Cubrir la preparación con Verde Brillante o Azul de Metileno durante 1 minutos. 6. Lavar con agua corriente y secar al aire. 7. Examinar al microscopio con objetivo de inmersión. Disponible asimismo: Decolorante BK Composición Etanol HCl Azul Metileno Kühne Composición Azul de metileno Fenol Etanol 1 x 1000 mL 6 x 250 mL Ref. 99 71 15 Ref. 99 20 90 RESULTADOS Bacilos ácido-alcohol resistentes: rojo oscuro a rosa Bacilos no ácido-alcohol resistentes: verde pálido o azul, según el colorante utilizado 97% 3% 1 x 500 mL 1 x 1000 mL CONTROL DE CALIDAD Se recomienda seguir las prácticas de control de calidad marcadas por el CLSI (antes NCCLS). Realizar los controles con microorganismos ATCC para este fin o cultivos de microorganismos ácido-alcohol resistentes y no resistentes conocidos. Ref. 99 37 40 Ref. 99 89 77 0,5% 1% 30% CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Los reactivos almacenados a 15-30ºC y protegidos de la luz, son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Los envases deben mantenerse siempre bien cerrados. Con el tiempo, puede aparecer un ligero precipitado en algún reactivo, que no afecta a la funcionalidad del producto. MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO Material de uso general de laboratorio. Portaobjetos y cubreobjetos, mechero Bunsen, asa de siembra, soporte de tinción, microscopio con lente de inmersión. PRECAUCIONES Los productos son para uso profesional. Todos los reactivos deben manipularse con precaución por personal técnico formado. Se aconseja consultar antes de su uso la ficha de datos de seguridad. La Fucsina Fenicada Tensoactiva así como el Azul Metileno Kühne pueden resultar nocivos por ingestión y en contacto con la piel. La Fucsina fenicada Tensoactiva es corrosiva. El Decolorante BK y el Azul de Metileno Kühne son inflamables. NOTAS El resultado de la tinción es orientativo. Una tinción positiva ofrece evidencia presuntiva de la presencia de micobacterias en la muestra y debe confirmarse con pruevas adicionales (cultivo, pruebas moleculares,etc.). Una tinción negativa no indica necesariamente que la muestra sea negativa en cultivo para micobacterias. La técnica descrita anteriormente puede modificarse de acuerdo con las preferencias del técnico para lograr variaciones en la intensidad de coloración, lo cual implica modificaciones en los tiempos de tinción, decoloración, lavado,etc. Si se usa agua corriente para el lavado, tener presente que aguas intensamente cloradas pueden debilitar la coloración de contraste. Un lavado excesivo después de la Fucsina puede producir falsos negativos. Un exceso de lavado después de utilizar el colorante de contraste puede disminuir la coloración de los microorganismos no ácido-alcohol resistentes. BIBLIOGRAFÍA Gurr,E. (1965). “The rational use of dyes in Biology”. Leonard Hill, London. Clark, G. (1981) “Staining Procedures”, pp.380-382,4th ed. Williams & Willkins CLSI Guidelines and Standards, CLSI, Wayne, P.A Young D.S., Effect of drugs on Clinical Lab. Test, 5th Ed. AACC Press (2000). Somoskövi, A., Hotaling, J.E., Fitzgerald, M., O’Donnell, D., Parsons, L.M., Salfinger, M. (2001), Chest, 120, 250-257. Good, R.C., Silcox, V, Kilborn, C., ch.40, 679-686 in Balows, A., Hausler, W., Diagnostic procedures for bacterial, mycotic and parasitic infections. (1981), 6th ed. Washington D.C. Ederer, G.M., Lund, M.E., ch.46, 806-811 in Balows, A., Hausler, W., Diagnostic procedures for bacterial, Mycotic and parasitic infections. (1981), 6th ed. Washington D.C. Lennette, Spaulding & Truant. Manual of Clinical Microbiology. 3rd ed., 1974, ASM. La eliminación de los residuos debe hacerse según la normativa local vigente. Distribuidor: http://www.cromakit.es QUIMICA CLINICA APLICADA S.A. Empresa Certificada ISO 9001 / ISO 13485 A 7 Km 1081 – P.O. Box 20 - E43870 AMPOSTA / SPAIN Tel. ++ 34 (977) 70. 62. 30 Fax ++ 34 (977) 70. 30. 40 Revisión: Octubre 2016 PRO4_REG9_BKKIN_4