TP n°10 Les outils de la génétique moléculaire.(travail sur

TPn°10 : Les outils de la génétique moléculaire
Mercredi 16 septembre
1. Objectif
Il s’agit de réviser les différentes techniques utilisées en biotechnologie grâce à des
animations trouvées sur internet. En observant ces animations et en répondant aux questions
posées tu pourras revoir les notions acquises aux cours (enzymes de restriction, PCR,
électrophorèse, southern blot).
2. Matériel
- PC
- feuille et crayon
3. Procédure
I. Les enzymes de restriction
-
Taper www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/diabete
-
Cliquer sur glycogène synthase et diabète
-
Cliquer sur II polymorphisme de restriction
-
Cliquer sur l’image (fig.1)
-
Répondre aux questions suivantes :
a) Donner le nom de l’enzyme de restriction utilisé pour couper le gène de la
glycogène synthase.
b) Quelle est la séquence reconnue par cette enzyme ?
c) Quelle est la grandeur du gène en Kb avant la digestion par cette enzyme ?
d) Combien de sites de restriction possède l’allèle A1 et l’allèle A2 ?
e) Combien obtient-on de fragments pour l’allèle A1 et pour l’allèle A2 après
digestion ?
f) Quelle est la longueur des deux fragments que l’on obtient toujours lorsqu’on
digère l’ADN du gène GYS par une enzyme de restriction spécifique ?
g) Quelle est la grandeur en Kb des fragments communs entre les deux allèles ?
h) Quelle est la grandeur en Kb du fragment qui a migré le plus loin ? Expliquez
pourquoi ?
i) Comment peut-on distinguer les deux allèles ?
j) Revenir à la figure 1 puis lire III : Allèles A1, A2
k) Pourquoi l’allèle A2 a-t-il un site de restriction supplémentaire ?
1
II. La PCR
-
Taper www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim
-
Cliquer sur présentation htm.
-
Lancer l’animation et la regarder jusqu’au bout en répondant aux questions suivantes :
a)
b)
c)
d)
e)
Quel est l’autre nom (en français) de la PCR ?
Par qui a été mise au point cette technique et quand ?
Qu’est-ce que l’annelage ?
Selon quels critères choisit-on la température d’hybridation ?
À partir de quelle extrémité de l’ADN les ADN polymérases synthétisent-elles le
nouveau brin ?
f) Combien de molécules d’ADN obtient-on après 6 cycles ?
g) Combien de « molécules cibles » obtient-on après 5 cycles ?
III. L’électrophorèse
- Taper www.ac-creteil.fr/biotechnologies/main-biochemistry.htm
- Cliquer sur technique biochimiques et ensuite sur animation électrophorèse.
- Répondre aux questions suivantes :
a)
b)
c)
d)
e)
Donner la définition de l’électrophorèse.
Quels types de molécules retrouve-t-on au fond du gel ?
Quel est le pH de la solution tampon ?
En quoi la bande d’électrophorèse est-elle faite ?
Donner le nom de la molécule qui possède une masse moléculaire plus élevée ?
(dans le sérum non immun)
IV. Le Southern blot
- Taper www.univ-rouen.fr/ABISS/L1/WEB/empreinte/southernblot.html
- Répondre aux questions suivantes :
a) Pourquoi le gel d’électrophorèse est-il trempé dans une solution alcaline ?
b) Expliquez comment se fait le transfert de l’ADN sur la membrane de nitrocellulose
c) Comment se fait la fixation permanente de l’ADN sur la membrane ?
- Lancer l’animation :
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
Qu’introduit-on dans les tubes contenant les échantillons d’ADN ?
Pourquoi ajouter du bleu de bromophénol ?
Quand l’électrophorèse s’arrête-t-elle ?
A quoi sert le bromure d’éthidium ? Où se place-t-il dans la molécule d’ADN ?
Que contient chaque bande d’ADN ?
Pourquoi mettre l’ADN dans une solution basique ?
A quoi sert la membrane de nitrocellulose ?
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h) Comment s’effectue le transfert des fragments sur la membrane ?
i) Pourquoi mettre la membrane de nitrocellulose dans un milieu d’hybridation ?
j) A quoi sert la technique du southern blot ?
- Noter toutes les étapes du southern blot.
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