L`accréditation en mycologie médicale

Transcription

ACCRÉDITATION Mycologie médicale
L’accréditation en mycologie médicale
J.-P. KLEIN1, T. GORSY2, B. GUILLARD2
résumé
Les difficultés et contraintes de l’examen mycologique sont liées à la multiplicité des étapes au sein des processus de
réalisation (préanalytique, analytique, postanalytique) : diversité des prélèvements et des matrices biologiques, examen
direct, durée d’incubation des cultures, observation macroscopique et observation microscopique, utilisation de clés
d’identification basées sur la morphologie, vocabulaire spécialisé, interprétation des résultats, etc. L’analyse des risques
concernant l’accréditation en mycologie a permis d’identifier six étapes essentielles pour structurer la démarche qualité,
du prélèvement au diagnostic et jusqu’à la transmission des résultats. La présente synthèse est consacrée aux thématiques
clés pour rationnaliser une démarche d’accréditation (état de l’art, gestion documentaire, sécurisation des processus
de réalisation et des processus supports). Notre propos sera illustré par des expériences vécues à travers la présentation
de cas concrets (dossier de vérification des performances, habilitation des opérateurs, évaluation des connaissances,
audits de paillasse, etc.). L’objectif de ce travail est de proposer un cadre méthodologique, afin de fournir aux biologistes
des lignes directrices pour répondre aux exigences réglementaires et normatives, au bénéfice du patient et du corps
médical.
I. - INTRODUCTION
Les infections fongiques à champignons filamenteux
ou à levures, du fait de leur prévalence et de leur gravité,
constituent un problème de santé publique dans le monde
entier. Les candidoses et les aspergilloses sont responsables
d’infections profondes (1). Très communes, les onychomycoses soulèvent des problèmes de diagnostic et de
thérapeutique. Les mycoses transmises par les animaux de
compagnie sont des infections cosmopolites en expansion
(2). Les teignes du cuir chevelu, qui atteignent les enfants
d’âge scolaire, doivent pouvoir être diagnostiquées pour
prévenir et contrôler leur dissémination dans les collectivités d’enfants (3). Par ailleurs, les flux migratoires participent à la diffusion des mycoses exotiques. Depuis
plusieurs années, on assiste à l’émergence de mycoses
touchant le plus souvent des patients fragilisés du fait d’un
contexte sous-jacent (transplantation d’organe, greffe de
moelle osseuse, infection par le VIH, diabète, toxicomanie,
port de cathéter veineux central, etc.) et/ou du fait des
traitements reçus (chimiothérapie, corticothérapie, immunosuppresseur) (4-8). Ajoutons encore le risque d’infection nosocomiale fongique liée à l’air et à l’eau dans les
établissements de soins (9-10).
La spectrométrie de masse a révolutionné le domaine
de l’identification fongique et promet de nouvelles avancées pour l’identification des levures et des champignons
filamenteux (11-12). Avec le développement de nouveaux
outils en mycologie moléculaire, en cas de difficulté
d’identification par des techniques phénotypiques conventionnelles, il est indiqué de recourir à un séquençage
nucléotidique. La biologie moléculaire appliquée au
diagnostic biologique permet une identification rapide
lorsque les cultures fongiques ne poussent pas ou sont sans
fructification (13). L’imagerie médicale ainsi que les techniques d’anatomopathologie trouvent aussi toute leur
place pour le diagnostic de certaines mycoses profondes.
Comment faire pour accréditer la paillasse de mycologie ? Quelles sont les différentes étapes à suivre ? Comment
sécuriser les processus de réalisation et les processus
supports ? Comment s’y prendre pour réaliser un audit de
Laboratoire Syndibio, 98 rue des Capucins, 55200
Commercy.
2 Laboratoire Syndibio, 24 route de Behonne, 55000
Bar-Le-Duc.
1
- 47 -
feuillets de Biologie /N° 324 - MAI 2015
mots-clés : accréditation, mycologie médicale, infection fongique, sécurisation des processus, NF EN ISO 15189.
paillasse ? Pour alimenter la réflexion sur l’accréditation,
nous vous proposons d’essayer de répondre à ces
questions, afin de franchir plus facilement les prochaines
échéances de l’accréditation.
L’objectif de cet article est de mettre à disposition des
biologistes et des personnes impliquées (qualiticien, auditeur, technicien(ne), interne, étudiant) un accompagnement de l’accréditation en mycologie médicale. Aussi,
nous indiquerons une conduite à suivre en plusieurs
étapes, basée sur une évaluation des risques et mettant en
exergue les points critiques pour améliorer et sécuriser les
pratiques professionnelles.
II. - POURQUOI LA MYCOLOGIE MÉDICALE
EST-ELLE LE PARENT PAUVRE
DE L’ACCRÉDITATION ?
La mycologie médicale est une discipline bioclinique. Elle
est encore souvent délaissée de la démarche d’accréditation,
sans doute en raison de son apparente complexité. La littérature professionnelle est pourtant très riche mais, à ce jour,
rares sont les publications traitant de l’accréditation dans
cette discipline (14). Sur 363 laboratoires accrédités en
France (chiffres d’octobre 2014), seuls 19 le sont en mycologie (Figure 1).
Encore peu automatisée, la mycologie nécessite des
opérateurs expérimentés qui maîtrisent un savoir-faire
technique dans la pratique journalière. L’identification des
champignons filamenteux repose sur l’examen macroscopique des cultures (couleur,
texture) et sur l’examen microscopique de la morphologie des
filaments et de la conidiogénèse.
Pour les levures, l’identification se
fait classiquement par des tests
physiologiques d’orientation (milieu chromogène, milieu sélectif,
étude de la sensibilité au cycloheximide (Actidione®)) et par
des tests d’étude de l’assimilation
des sucres (auxanogramme) et de
la fermentation des sucres (zymogramme).
croissance lente (plus de 7 jours) (15). Les cultures mycologiques doivent donc faire l’objet d’un examen régulier et
minutieux deux fois par semaine, idéalement tous les jours
pendant 5 jours. Les observations microscopiques répétées
des structures fongiques imposent donc des contraintes
pour arriver à l’identification de l’agent pathogène. De
surcroît, la plasticité phénotypique des champignons est à
l’origine de caractères macroscopiques et microscopiques
atypiques pouvant conduire à des difficultés d’identification
(16).
L’interprétation des examens (contamination, colonisation, maladie avérée) dépend aussi de la localisation du site
de prélèvement et de la sémiologie : mycose superficielle,
mycose profonde, mycose cosmopolite (candidémie,
cryptococcose, aspergillose, zygomycose), mycose profonde
tropicale (histoplasmose, coccidioïdomycose, paracoccidioïdomycose, blastomycose, pénicilliose à Penicillium marmeffei,
sporotrichose). En effet, les échantillons peuvent être issus :
– d’un site anatomique stérile (sang, liquide céphalorachidien (LCR), ponction pleurale, articulaire, etc.),
– ou d’un site anatomique avec une flore commensale polymorphe associée (cutanée, broncho-pulmonaire, digestive,
vaginale, etc.).
Toutes ces raisons et difficultés cumulées, associées à des
volumes d’activités restreints et une nécessaire spécialisation
des opérateurs, sont à l’origine du peu d’engouement des
Laboratoires de Biologie Médicale (LBM) pour l’approche
qualité en mycologie, du moins pour l’instant.
Actuellement, de nouvelles
techniques sont utilisées comme la
spectrométrie de masse ou des
outils de biologie moléculaire : séquençage des régions ITS (Internal
Transcribed Spacer), PNA-FISH (Peptide Nucleic Acid Fluorescence In Situ
Hybridization), etc.
La Nomenclature des Actes
de Biologie Médicale (NABM)
distingue les champignons à
croissance rapide (délai inférieur
à 5 jours), des champignons à Fig 1 - Répartition des laboratoires accrédités par sous-domaine (Cofrac, octobre 2014).
- 48 -
Mycologie médicale
III. - MATÉRIEL
ET MÉTHODES
Matériel
Matière
Qualité et quantité de l’échantillon
Conditions d’acheminement
au laboratoire
Suivi et conservation
des cultures fongiques
Non entretenus,
déréglés,
non adaptés
Microscope et loupe binoculaire
PSM
Gestion des contrôles qualité
Maîtrise métrologiques des
enceintes thermiques
Non conforme
POINTS
CRITIQUES
Non compétente
non sensibilisée
Non adapté
Milieu
Détermination des spores
Risque des agents pathogènes
et allergisants
(histoplasmose, Aspergillus)
Ensemencement des prélèvements
sous PSM
Main d’œuvre
Non adaptée,
non définie,
non appliquée
Respect des règles de l’art
Compétences des opérateurs
Formations internes
Prise de renseignements cliniques
Méthode
Utilisation de milieux de culture
appropriés
Durée d’incubation
Protocole d’identification
(examen direct, milieu chromogénique,
tests de filamentation, tests biochimiques)
Veille documentaire
Les actes de mycologie de la
NABM figurent au sous-chapitre
6-04, alors que pour les examens
mycologiques associés à un examen bactériologique, il convient Fig 2 - Analyse des risques pour consolider les processus.
de se reporter au sous-chapitre Les facteurs d’incertitude sont précisés en rouge. Schématiquement et par ordre d’importance,
le poids de chacun des 5 M est : i) la main d’œuvre (expérience professionnelle) ; ii) la méthode
6-01 (examen microbiologique et la matière ; iii) le matériel ; iv) le milieu.
d’un ou plusieurs prélèvements
de même nature). La cotation
forfaitaire d’un examen micro– Identifier les agents pathogènes au niveau de l’espèce ;
biologique standard prend en compte l’identification de
le contrôle des performances est vérifié par les évalual’espèce Candida albicans ; en revanche l’isolement et/ou
tions externes de la qualité (EEQ) des organismes de
l’identification d’une levure autre que C. albicans ou d’une
contrôles interlaboratoires (OCIL) et par l’utilisation de
espèce filamenteuse est un acte distinct de la NABM (code
contrôles internes de qualité (CIQ), réalisés avec des
acte : 0252, B 50).
souches ATCC (American Type Culture Collection) ou CIP
(Collection
de l’Institut Pasteur), ou bien encore avec des
Tout comme en bactériologie, la démarche méthodoespèces
parfaitement
identifiées par un centre de réfélogique proposée est basée sur l’analyse et la gestion des
rences
;
risques pour sécuriser les processus de réalisation et les
processus supports. L’analyse des risques permet de mettre – Prendre en compte les recommandations de bonnes
pratiques pour harmoniser les gestes techniques des
en évidence les points critiques qui fragilisent les processus
opérateurs, ainsi que l’interprétation des résultats et les
(Figure 2), ainsi que les conduites à tenir pour leur maîprestations de conseils.
trise. Il est important de bien cerner les points critiques,
notamment ceux liés au manque de sensibilité de certains
Enfin, pour évaluer la pertinence des dispositions prises
outils conventionnels utilisés pour poser le diagnostic de et appliquées, les audits permettent de donner un avis sur
l’agent causal. Il appartient aux biologistes de les connaître les pratiques du LBM au regard des référentiels choisis. Ils
pour consolider l’ensemble des étapes du parcours, du donnent l’occasion au LBM de démontrer la fiabilité de
prélèvement à la transmission des résultats aux personnes ses examens en plus d’être un excellent outil de manageconcernées. Avec les systèmes d’assurance qualité des ment de la qualité.
LBM, le fait nouveau est d’être en mesure de prouver les
Cette approche méthodologique a permis de distinguer
performances des méthodes employées par une démonssix
étapes pour développer l’accréditation en mycologie
tration cohérente et scientifique. Les exigences normatives
médicale.
La stratégie proposée est de décomposer le proont pour vocation de mener les LBM vers de meilleures
cessus
d’accréditation
en une séquence d’étapes qui sont
performances. Pour garantir la qualité des examens de lavalidées
séparément.
Il
s’agit de conseils, avec des repères
boratoire, le biologiste doit déterminer au préalable les
pour
respecter
les
exigences
normatives et éviter ainsi les
critères ou objectifs de performance analytique (spécifica(Encadré
1).
principaux
écueils
tion, valeur seuil, limite d’acceptabilité, justesse, fidélité,
etc.) (25). Ces critères ou objectifs sont établis en fonction
Ce travail a pour vocation de contribuer à une améliode besoins des patients et doivent conduire à :
ration de pratiques de qualité en mycologie. L’accréditation
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La conformité des dispositions
organisationnelles et techniques
du LBM doit être confrontée au
référentiel d’accréditation SH
REF 02 (17) fondé sur la norme
ISO 15189 (18). Afin de respecter
les exigences de l’accréditation,
nous avons utilisé les documents
du Cofrac suivants : SH GTA 01,
SH GTA 04, SH GTA 06, LAB
GTA 12, et SH INF 50 (19-23).
Lors de la vérification des performances analytiques, la méthode
suivie a été celle de la méthode
qualitative décrite dans les documents du Cofrac SH GTA 04 et
SH FORM 44 (24).
nécessite que les LBM puissent prouver que les activités
techniques et organisationnelles sont performantes.
Encadré 1 - L’accréditation de la paillasse de mycologie en six
étapes.
1ère étape : la revue de l’état de l’art
IV. - RÉSULTATS
2ème étape : la gestion documentaire
A) La revue de l’état de l’art
L’analyse préliminaire de la littérature est indispensable
pour bien cerner la problématique et ce qui fait l’unicité
de la mycologie. La période couverte par la recherche de
littérature en langue française est de 15 ans, de 2000 à
2014, avec l’aide des bases de données PubMed et EM
consulte. Elle doit porter, d’une part, sur les référentiels
et, d’autre part, sur une revue des travaux scientifiques. La
lecture critique de la littérature scientifique a été faite en
3ème étape : la sécurisation du processus préanalytique
4ème étape : la sécurisation du processus analytique
5ème étape : la sécurisation du processus postanalytique
6ème étape : la sécurisation des processus supports
s’aidant de la grille AGREE (grille d’évaluation de la qualité des recommandations pour la pratique clinique), qui
est un outil d’appréciation de la qualité méthodologique
(26-28).
Tableau I - Les principaux référentiels français applicables en mycologie médicale.
Organismes/Auteurs
Titre du document
ANOFEL
Parasitoses et mycoses des régions tempérées et tropicales, 3ème édition,
Elsevier Masson, 2013 (45)
Badillet G.
Les dermatophytes, Atlas clinique et biologique. 3ème édition, 1991, Varia Paris (46)
Bioforma
Les moisissures, Cahier de formation n°25 (47)
Bioforma
Les dermatophytes, Cahier de formation n°31 (48)
Bioforma
Les levures et les levuroses, Cahier de formation n°44 (49)
CA-SFM /EUCAST 2014
Comité de l’antibiogramme. Recommandations 2014 (50)
SFAR/SPILF/SRLF
Prise en charge des candidoses et aspergilloses invasives de l’adulte. Conférence
de consensus 2004 (51)
SF2H
Risque infectieux fongique et travaux en établissement de soins. Hygiènes 2011 ;
19/1 : 1-52 (52)
SFM
Référentiel en microbiologie médicale (bactériologie et mycologie) Rémic 2010 (53)
SFM/ESCMID
European manual of clinical microbiology, 2012 ; 1st edition (54)
SFM
Quamic (55)
Union National
des Caisses d’Assurance Maladie
NABM (15)
Antibiolor
Antibioguide, Référentiel lorrain d’antibiologie en établissements de soins, 2014 (56)
Antibiolor
Antibioville, Référentiel lorrain d’antibiologie en pratique ambulatoire, 2014 (57)
CHU de Clermont-Ferrand
Antibioguide du CHU de Clermont-Ferrand et des établissements de santé de la
région Auvergne, 2014 (58)
CMIT
Le POPI. Maladies Infectieuses et Tropicales 2012. 11ème édition. Vivactis Plus
éditeur. 460 p. (59)
AFU
Recommandations du comité d’infectiologie de l’AFU. Diagnostic, traitement
et suivi des candiduries, 2011 (60)
ANOFEL : Association française des enseignants de Parasitologie et Mycologie ; CA-SFM /EUCAST 2014 : Comité de l’Antibiogramme de la Société Française
de Microbiologie /European Committee of Antimicrobial Susceptibility Testing ; SFAR /SPILF /SRLF : Société Française d’Anesthésiologie et de Réanimation
/Société Française de Pathologie Infectieuse de Langue Française /Société de Réanimation de Langue Française ; SF2H : Société Française d’Hygiène
Hospitalière ; SFM : Société Française de Microbiologie ; SFM /ESCMID : Société Française de Microbiologie / European Society of Clinical Microbiology and infectious Diseases ; NABM : Nomenclature des Actes de Biologie Médicale ; CMIT : Collège français des universitaires de Maladies Infectieuses et Tropicales ;
AFU : Association Française d’Urologie.
- 50 -
Mycologie médicale
Tableau II - Analyse et gestion des risques : processus gestion documentaire.
Facteurs à maîtriser
Facteurs de maîtrise
Qualité des prestations
du laboratoire non assurée
Non prise en compte d’une
évolution de la documentation
réglementaire, normative,
scientifique ou des fournisseurs
Mise en place d’une veille documentaire
Utilisation de document
non approuvé
Modification manuscrite
des documents qualité
non maîtrisée
Règle définie : modification datée et signée
Respect de la procédure interne H1-PR01
« Structure et gestion du système documentaire »
Audits de poste
Utilisation de document
obsolète
Mise à jour
des documents édités
Traçabilité de l’édition papier dans le logiciel
informatique
Audit et surveillance
Procédures, modes opératoires,
protocoles d’exécution
non appliqués
Prise de connaissance
des documents
Surveillance des attestations de lecture
Audits de poste
Indicateur trimestriel des demandes de lecture
en retard
Cette première étape a pour vocation de vérifier
la conformité des pratiques professionnelles au regard
des référentiels, de la NABM, des recommandations
(conduites à tenir) de la Haute Autorité de Santé (HAS),
des sociétés savantes, des conférences de consensus ou
encore des publications scientifiques. Rappelons qu’un
référentiel est un ensemble de dispositions de référence,
servant de guide pour la construction et la vérification
d’un système. Le tableau I reprend les principaux référentiels qu’il convient de consulter. Ces référentiels peuvent
être complétés par des ouvrages de références (29-32). La
recherche bibliographique a montré que de nombreux
articles ont été consacrés au diagnostic mycologique
(33-44).
Les sources documentaires
La liste ci-dessous n’est bien entendu pas exhaustive.
Sociétés savantes et institutions :
• Société Française de Mycologie Médicale, Société Française de Microbiologie, Société Française d’Anesthésie
et de Réanimation, Société de Pathologie Infectieuse de
Langue Française, Société Française d’Hygiène Hospitalière, Société de Réanimation de Langue Française.
• Centre national de référence (CNR) des mycoses invasives et antifongiques.
• Observatoire des levures de l’Ile-de-France.
Revues :
• Journal de Mycologie Médicale, Feuillets de Biologie, La
lettre de l’infectiologue, Option Bio, Revue Francophone des Laboratoires, Spectra Biologie, Annales de
Biologie Clinique, Biologiste Infos, etc.
Sites internet :
• Anofel
• e-Pilly TROP
• MycoBank
• Doctor Fungus
• Index Fungorum
• Mycology online
• The Aspergillus Website
B) La gestion documentaire : rédaction des procédures
La deuxième étape pourra être consacrée à la rédaction
d’une procédure générale de mycologie. Elle est utile, car
elle permet d’apporter une vue d’ensemble et une cohérence au système de management de la qualité (SMQ),
afin de favoriser sa compréhension par tous les membres
de l’équipe et par les auditeurs dans la logique de la
maîtrise des facteurs d’influence (analyse des risques). Les
documents qualité doivent également traiter les aspects
techniques (mode opératoire, instruction, enregistrement,
etc.). La gestion documentaire concerne aussi bien les
documents internes qu’externes. Un soin particulier devra
être porté à la conservation des notices fournisseurs pour
les consommables.
Le tableau II propose une synthèse de l’analyse et de la
gestion des risques appliquée à la gestion documentaire.
C) La sécurisation du processus préanalytique
Les infections fongiques sont susceptibles de toucher
tous les organes. Les prélèvements sont ciblés en fonction
des points d’appel cliniques et concernent de nombreux
sites anatomiques, entraînant une diversité des matrices
biologiques (urine, peau et phanères, sang, sécrétion des
muqueuses digestives, vaginales et oro-pharyngées, LCR,
liquide de ponction, biopsies, etc.). La qualité du prélèvement va de pair avec le recueil systématique d’un certain
nombre de renseignements à l’interrogatoire, qui permettent d’orienter l’examen mycologique : immunodépression, voyages, traitements antifongiques, contact avec des
animaux, etc.
Le tableau III présente une synthèse des conditions
préanalytiques requises pour les examens de mycologie
- 51 -
Identification des risques
Tableau III - Conditions préanalytiques en mycologie.
Paramètres
Température (T) de transport
ou de conservation
Délai d’acheminement
approprié
Matériel de recueil
de prélèvement
Biopsies
T ambiante
<2h
Flacon stérile
Coprocultures
5 ± 3 °C
< 24 h
Flacon de coproculture
Expectoration et prélèvements
broncho-pulmonaires
T ambiante
<2h
Flacon stérile
Hémocultures
10 mL*
T ambiante
< 24 h
Flacons pour
hémocultures
T ambiante
<2h
Flacon stérile
T ambiante
< 24 h
Échantillon avec milieu
de transport
LCR
T ambiante
Immédiat
Flacon stérile
<2h
Flacon stérile
Prélèvement ORL
T ambiante
< 24 h
1 eSwab
2-3 jours
Flacon stérile
<2h
2 écouvillons
< 24 h
1 eSwab
Liquides de ponction
(articulaire, pleural, etc.)
Peau et phanères
(ongles, cheveux, poils)
T ambiante
Prélèvements génitaux
T ambiante
Urines
T ambiante
ou
5 ± 3 °C
<2h
< 12 h
T ambiante
< 48 h
Flacon ECBU
sans borate
Flacon ECBU
avec borate
* Volume recommandé.
(53, 54, 61). Elles sont à intégrer dans le manuel de prélèvement ou son équivalent. D’une manière générale, dans
les LBM privés polyvalents, les prélèvements mycologiques
sont traités avec les prélèvements bactériologiques.
Le tableau IV est consacré à une synthèse de l’analyse
et de la gestion des risques appliquées au processus préanalytique.
Les écouvillons avec milieu (Amiès, Stuart) de transport
(Medical Wire®, Copan®, Sarstedt®) peuvent se conserver
24 heures à température ambiante (21 ± 7 °C, SH GTA
01). Les urines recueillies dans un flacon avec du borate
se conservent 48 heures à température ambiante selon les
notices des différents fabricants. L’utilisation de milieux
de transport permet d’allonger de façon notable les délais
d’acheminement (24 heures) et par conséquent de mieux
maîtriser les conditions préanalytiques. On remarquera
que la conservation des champignons n’est pas mentionnée par les fournisseurs précités, hormis pour deux
milieux de Copan® : « catBroth » (transport des Candida
et Trichomonas vaginalis pour les prélèvements uro-génitaux)
et « UriSwab » (urines). Les fabricants de milieu de transport signalent que leur milieu respecte la norme M40-A
du CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). L’exigence
essentielle de la norme M40-A est de démontrer que la
qualité microbiologique des échantillons des patients est
maintenue stable pendant la durée de transport.
D) Le processus analytique
L’objectif est d’utiliser la meilleure technique pour
identifier l’agent pathogène et ainsi répondre aux attentes
des patients et aux besoins des cliniciens.
1) Harmonisation des pratiques professionnelles
Dans les lignes qui suivent, nous indiquerons les
mesures à prendre pour harmoniser les pratiques professionnelles des opérateurs.
a) Lectures microscopiques : numération
Les examens directs microscopiques à la recherche
d’éléments fongiques sont réalisés à l’état frais (urines) ou
après coloration de May-Grünwald Giemsa (MGG) pour
les expectorations, les épanchements et les liquides de
ponction, ou encore après ajout d’un agent éclaircissant
de type rouge Congo ou bleu de lactophénol (peau et
phanères).
- 52 -
Mycologie médicale
Tableau IV - Analyse et gestion des risques : processus préanalytique.
Milieu
Altération de l’échantillon
biologique : rendu de résultats
inexacts
Conditions de transport
(température)
Conservation avant la prise
des échantillons par les coursiers
Surveillance des conditions environnementales de
transport (température par sonde « Tomkey »)
Utilisation des boîtes de prélèvement et mallettes de
transport
Plan de tournée défini et communiqué
Audit du préanalytique : coursiers
Sensibilisation des préleveurs externes
Méthode
inexacts
Critères d’acceptation des échantillons biologiques (matériels de
recueil, délais d’acheminement, …)
Erreur dans le rendu des résultats
Protocole de prélèvement :
identification des échantillons,
recueil des renseignements cliniques
Allongement des délais
de rendu de résultats
Traitement des dossiers urgents
Respect de la documentation interne et externe
Conventions avec les préleveurs externes
Sensibilisation des préleveurs (internes et externes) :
interrogatoire du patient*
Respect de la documentation interne
Audits et évaluations des connaissances/compétences
Matériel
inexacts
Péremption du matériel de prélèvement
Intégrité des boîtes de prélèvement
et mallettes de transport
Respect et maîtrise des critères d’acceptation des
échantillons(C3-PR01 « Réception des échantillons »)
Audit du préanalytique : préparation des boîtes de
prélèvement
Vérification des dates de péremption
Sensibilisation des préleveurs (internes et externes)
Compétence du personnel :
préleveurs, coursiers,
réception des échantillons
Formation (interne et externe) / habilitation / évaluation
Respect des procédures internes
Allongement des délais de rendu
des résultats
Compétence du personnel
Fiches de préconisation remises aux patients
Audits et évaluations de connaissances/compétences
du préanalytique pour le secteur mycologie :
prélèvement, transport, réception des échantillons
Erreur dans l’enregistrement
informatique des analyses à
réaliser : allongement des délais
de rendu des résultats,
augmentation des coûts d’analyse
Enregistrement des données patients
(prescription, renseignements
cliniques, dossiers urgents)
Respect des procédures d’enregistrement
Formation (interne et externe) / habilitation / évaluation
Protocole de vérification des ordonnances
Audit du secrétariat
Rendu de résultats inexacts
Matière
inexacts
Intégrité de l’échantillon
biologique : volume d’échantillon,
présence d’agent de conservation
Respect et maîtrise des critères d’acceptation des
échantillons
Respect des procédures de prélèvements (C2-ENR01
« Manuel de prélèvement »)
Fiches de préconisation remises aux patients
Audits et évaluations des connaissances / compétences du
préanalytique pour les secteurs concernés : prélèvement,
réception des échantillons
* Durée de la lésion, saisonnalité, antécédents familiaux, exposition professionnelle, traitement médicamenteux, …
- 53 -
Main d’œuvre
Tableau V - Standardisation des examens microscopiques. Modifié de « Interprétation de l’examen microscopique », Canadian Coalition
For Quality in Laboratory Medicine (CCQLM), 2004.
Cellules épithéliales ou polynucléaires
Expression du résultat
Nombre par champ (grossissement x100)
Rares (+)
<1
Quelques (++)
1-10
Assez nombreux (+++)
11-25
Nombreux (++++)
> 25
Bactéries, levures, champignons
Nombre par champ (grossissement x1000)
Rares (+)
<1
Quelques (++)
1-10
Assez nombreux (+++)
11-25
Nombreux (++++)
> 25
Tableau VI - Quantification pour la standardisation des lectures des cultures. Modifié de (36).
UFC par tube ou boîte
1-5
Rares
+
6-20
Nombreuses
++
> 20
Très nombreuses
+++
Tableau VII - Milieux de culture à ensemencer en fonction des matrices biologiques (choix du LBM Syndibio).
Milieux de cultures
Gélose
Gélose
Sabouraud
Sabouraud
chloramphénicol
chloramphénicol 2
Actidione®
(SAB CHL 2-T)
(SAB CHL-ACTI-T)
Matrice
biologique
Gélose
ChromIDTM
Candida
(CAN 2)
Biopsies
X
X
Coprocultures
X
X
Expectorations
et prélèvements
broncho-pulmonaires
X
X
Sang (10 mL)
Flacon BacT/Alert
X
Liquides de ponction
(articulaire, pleural, etc.)
X
X
LCR
X
X
Prélèvement ORL
Peau et phanères
(ongles, cheveux, poils)
Prélèvement vaginal
X
X
Prélèvement urétral
X
Urines
X
(si levures
à l’examen direct)
X
X
Gélose
Dermato-T
(DTA)
Gélose
ChromIDTM CPS
(CPS3)
X
X
X
- 54 -
Mycologie médicale
b) Quantification des colonies sur les milieux de culture
La NABM exige que la présence de nombreuses colonies sur les milieux de cultures soit signalée. Le tableau VI
propose une expression des résultats pour standardiser le
compte rendu d’analyse en fonction de l’abondance de la
croissance sur les géloses.
c) Les milieux de culture à utiliser en mycologie en pratique
quotidienne
Il est important de signaler que lors des mycoses, la
charge fongique est souvent faible dans l’organisme et
dans les prélèvements. Il faut donc des prélèvements abondants, bien ciblés, et un ensemencement beaucoup plus
riche qu’en bactériologie.
Les techniques d’ensemencement sont les suivantes :
– Isolement des levures par méthode bactériologique
d’épuisement par stries ;
– Isolement des champignons filamenteux par dépôt
« pièce par pièce » du produit pathologique à examiner
à la surface du milieu nutritif (en boîtes de Pétri ou en
tubes) ; l’utilisation des boîtes est plus aisée, celle des
tubes limite la dessiccation du milieu et les risques de
contamination ;
– Isolement des champignons par ensemencement en milieu liquide (hémocultures).
Une enquête sur les conditions analytiques des
examens de mycologie médicale menée par la Société
Française de Mycologie Médicale a montré une grande
hétérogénéité des pratiques d’analyse (62).
À titre indicatif, le tableau VII mentionne le choix que
nous avons fait au sein de notre laboratoire concernant les
milieux de culture à ensemencer, en fonction des différents types de prélèvement.
Un certain nombre d’éléments sont à connaître :
– Pour les milieux chromogéniques, les différents fabricants rapportent des sensibilités de l’ordre de 99 % pour
la détection de C. albicans ;
– Les géloses Sabouraud - chloramphénicol et Sabouraud
- chloramphénicol - Actidione® empêchent le développement des contaminants (champignons saprophytes et
bactéries) ; pour les prélèvements profonds et en fonction du contexte clinique (mycose exotique), on veillera
à ensemencer un milieu de Sabouraud - chloramphénicol à incuber au moins deux semaines ;
– L’Actidione® inhibe la croissance de certains champignons filamenteux (Fusarium, Aspergillus spp, etc.) et
peut empêcher la pousse de certaines espèces du genre
Candida telles que C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis,
C. tropicalis et C. famata (sensibilité variable à l’Actidione®) ;
– La gélose Sabouraud - tétrazolium - gentamicine - chloramphénicol permet le diagnostic différentiel de
certaines espèces du genre Candida qui sont capables de
réduire les sels de tétrazolium ; il s’agit donc d’un milieu
d’identification.
Les cultures doivent être examinées régulièrement pendant une durée de 2 à 5 jours pour les levures, de 3 à 7 jours
pour les moisissures, de 2 à 4 semaines pour les dermatophytes (ou plus si la clinique le justifie), et de 3 mois pour
les mycoses exotiques dues à Histoplasma et Blastomyces.
Ajoutons encore que le milieu pour blastèse et le milieu
PCB (pomme de terre, carotte, bile) ne sont plus commercialisés, ni par bioMérieux, ni par Bio-Rad.
Enfin, notons le cas des champignons dimorphiques,
qui se présentent sous forme de levure dans les tissus et
sous forme filamenteuse en culture ; en ce qui concerne
l’agent pathogène Sporothrix schenckii, la forme filamenteuse peut être isolée à 25 °C, mais la forme levure est
mieux isolée à 37 °C.
d) Les pièges de l’identification
L’identification au niveau de l’espèce est importante,
car la sensibilité aux antifongiques peut varier en fonction
des taxons. Lorsque l’identification par les techniques
conventionnelles est mise en défaut, la spectrométrie de
masse est un recours intéressant.
– Si les systèmes Vitek® (bioMérieux) permettent facilement d’identifier de très nombreuses levures, certaines
espèces sont susceptibles de poser des problèmes d’identification comme C. dubliniensis, C. famata, C. guillermondii,
C. lusitaniae et C. rugosa ; il est alors intéressant d’utiliser
les capacités des levures à réduire les sels de tétrazolium.
– Sur Sabouraud - tétrazolium, les colonies de C. albicans
et de C. krusei sont blanches, et les colonies de C. tropicalis,
de C. pseudotropicalis et de C guilliermondii sont violacées.
– Test de blastèse : C. tropicalis et C. parapsilosis produisent
des pseudo-tubes germinatifs ; C. dubliniensis produit des
tubes germinatifs, c’est pourquoi il a longtemps été
confondu avec C. albicans. Ajoutons que l’intérêt de
distinguer C. albicans de C. dubliniensis est d’ordre épidémiologique et non thérapeutique.
2) Les contrôles de qualité
Les contrôles de qualité, qu’ils soient internes ou externes, sont indispensables pour sécuriser les processus
(63). Ils garantissent la qualité analytique par la maîtrise
des processus. L’analyse des tendances des résultats obtenus
permet d’objectiver la robustesse des techniques utilisées.
a) CIQ
Le CIQ permet de vérifier :
– Les performances des réactifs utilisés ;
– Les performances du personnel qui effectue les
analyses ;
– La fidélité de la méthode et l’exactitude des résultats.
- 55 -
Il s’agit d’une quantification approximative dite appréciation de la numération. Le tableau V présente une standardisation des lectures microscopiques pour les cellules
épithéliales et les polynucléaires (grossissement x100) ainsi
que pour les bactéries, les levures et les champignons
(grossissement x1 000).
Tableau VIII - Utilisation des souches ATCC dans le cadre du CIQ.
N° souche ATCC
Espèce
Date(s)
Identification
Antifongigramme
34449
Candida lusitaniae
Janvier 2012
Janvier 2014
12
7
6258
Candida krusei
Janvier 2012
Juillet 2014
14
14
15126
Candida glabrata
Novembre 2013
Juillet 2014
3
3
14053
Candida albicans
Août 2014
Octobre 2014
2
2
28188
Trichophyton rubrum
Novembre 2014
1
Tableau IX - Souchier de mycologie issu des EEQ.
Souche
Référence
Cas clinique
Contrôle National de Qualité
Cladosporum spp (C. cladosporioides)
11 PAR 1 (LUENGO)
Tumeur solide pulmonaire
Candida glabrata
10 PAR 1 (SASTRE)
Hémoculture, traitement par fluconazole
Microsporum audouinii
09 PAR1 (GABA)
Alopécie circulaire, Burkina Faso
Trichophyton rubrum var. africaine
08 PAR1 (BEDAYA)
Lésion squameuse à la cuisse, Sénégal
Association de Biologie Praticienne
Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale
ABP 14-bouchon bleu
Espaces inter-orteils
Paecilomyces variotii
ABP 14-1 bouchon vert
Lavage broncho-alvéolaire
Trichophyton soudanense
ABP 13-3 bouchon bleu
Enfant africain avec plaques d’alopécie
Acremonium alternatum
ABP 13-3 bouchon vert
Ongle avec anomalies
Pichia manshurica
ABP 13-3
Lavage broncho-alvéolaire
Trichophyton tonsurans
ABP 13-2 bouchon bleu
Enfant africain avec plaques d’alopécie
Candida rugosa
ABP 2013
Conduit auditif externe
Candida kefyr
ABP 14-1
Écouvillon rectal
Biologie Prospective
Candida tropicalis
2013-3A
Hémoculture
Candida guillermondii
2012-4A
Cathéter
Aspergillus versicolor
2013-4A
Suspicion d’onychomycose
Scedosporium prolificans
2013-1A
Hémoculture et lymphome
Fusarium solani
2011-2A
Ongle
Trichosporon inkin
2010-4A
Nodules pubiens
Le CIQ assure une détection immédiate et une identification des erreurs pour définir des actions correctives.
La sélection des souches de contrôle est effectuée, d’une
part, en fonction du recrutement du laboratoire (patients
et établissements de soin) et, d’autre part, en fonction des
recommandations des fournisseurs.
Au sein du laboratoire Syndibio, nous réalisons un CIQ
par semaine. Nous utilisons un souchier ATCC constitué
de 21 espèces en microbiologie : 16 souches bactériennes,
4 souches de levures et 1 souche de dermatophyte (Trichophyton rubrum).
Ces souches de « référence » correspondent :
– à des souches ATCC ou CIP,
– à des souches transmises par un organisme d’évaluation
externe de la qualité : ANSM (Agence Nationale de
Sécurité du Médicament et des produits de santé), ABP
(Association de Biologie Praticienne), BP (Biologie
Prospective).
- 56 -
Mycologie médicale
Tableau X - Enregistrement pour une souche test utilisée comme CIQ et pour la formation interne.
Date
15/05/14
Souche
Origine
Association de Biologie
Lavage
Praticienne 2014-1
broncho-alvéolaire
Cas clinique
Identification et commentaires
Visa
Syndrome
interstitiel
Paecilomyces variotii
Pousse en 48 heures,
couleur blanc crème
4 jours plus tard :
conidies ovalaires en chaînette
Colonies brun rouille en vieillissant
CG
JPK
Tableau XI - Analyse et gestion des risques.
Rendu de résultats
inexacts
Rendu de résultats
inexacts
de rendu des résultats
Gestion des contrôles (CIQ, EEQ)
non conformes
Respect des procédures internes
Analyse des tendances
Définition des objectifs analytiques et limites
d’acceptabilité
Compétence du personnel
technique :
- mise en culture
- lecture et interprétation
Formation (interne et externe) / qualification /
habilitation / évaluation
Respect des référentiels (Rémic, CA-SFM/EUCAST)
fiches d’instruction et notices fournisseurs
Résultats aux contrôles qualité (souche de référence,
CNQ, OCIL)
Harmonisation des lectures inter-opérateurs
D4-D-INS07 « Techniques d’ensemencement
en mycologie »
D4-D-ENR01 « Milieux de culture en mycologie »
Audits de la paillasse de mycologie
Saisie manuelle des résultats
Vérification des saisies manuelles
Rupture de stock des réactifs
Suivi informatisé de la gestion des stocks
Communication interne des
Protocole de communication interne
résultats critiques du plateau
Traçabilité informatique de la transmission
technique vers les sites périphériques
Le tableau VIII mentionne les souches utilisées dans le
cadre du CIQ de mycologie au sein du laboratoire Syndibio. Une planification pour le passage des CIQ a fait l’objet
d’un enregistrement. Le tableau VIII illustre le nombre de
passages effectués depuis 2012.
3) Analyse et gestion des risques
L’analyse et la gestion des risques du processus sont
détaillées dans l’encadré 2. Le tableau XI reprend les
points clés de cette activité.
4) Dossiers de vérification des performances
b) EEQ
Les contrôles externes font l’objet d’enquêtes ponctuelles. Les souches transmises lors des EEQ sont conservées en souchier et utilisées comme des contrôles internes
mais aussi à titre pédagogique pour la formation continue
(Tableau IX).
Le tableau X concerne un enregistrement d’une formation interne tracée à la suite du repiquage d’une
souche.
Pour l’examen mycologique d’un prélèvement, il est
nécessaire de compléter le tableau de portée d’accréditation pour la famiL’accréditation en mycologie médicalelle
parasitologie-mycologie, conformément aux préconisations
du document du Cofrac SH INF 50. Les dossiers de vérification des performances/validation des méthodes devront
être réalisés comme suit.
– PM 1 : Examen morphologique direct macro- et microscopique à l’état frais et/ou après préparation,
- 57 -
Encadré 2 - Fiche type qualitatif, vérification (portée A) / validation (portée B) d’une méthode de biologie médicale selon le SH FORM 44.
EXAMEN DE BIOLOGIE MÉDICALE
Mise en culture pour le diagnostic d’une infection fongique
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Analyte / Mesurande
Échantillon biologique pour mise en culture (levures, champignons filamenteux
et dermatophytes)
Principe de la mesure
Inoculation de milieu de culture pour isolement des agents pathogènes fongiques
Mise en culture des échantillons secs (peau et phanères)
Mise en culture des échantillons humides (selles, sécrétion, expectoration, etc.)
Mise en culture des échantillons liquides (urine, sang, liquide de ponction, etc.)
Méthode de mesure
Méthode de culture en milieu solide / en milieu liquide
Isolement de levures par méthode bactériologique d’épuisement en stries
Isolement des champignons filamenteux par dépôt pièce par pièce du produit
pathologique à examiner à la surface du milieu nutritif
Marquage CE (Oui / Non)
Oui
Codage CNQ (s’il existe)
PAR
MISE EN ŒUVRE
Opérateurs (habilitation)
DM, CG, CM, EM
Procédure de validation
D5-PR01 « Vérification / Validation des méthodes »
Procédure de gestion
de la portée flexible
D5-PR02 « Gestion des portées »
Période d'évaluation
2013-2014
Date de mise en service
Autorisation par
13 juillet 2014
Jean-Paul Klein, biologiste
MAÎTRISE DES RISQUES
Données d'entrée
Points critiques à maîtriser
Identification du risque
Modalités de maîtrise
Type d'échantillon
primaire
(urine, sang, type
de récipient : tubes,
additifs, …)
Quantité de l’échantillon
Qualité de l’échantillon
Conformité de la demande
Faux négatif dû à un mauvais prélèvement
Faux positif dû à une contamination
Formations des préleveurs
Curette dermatologique de Besnier /
Brocq
Contrôle des critères d’acceptation
Vérification des renseignements cliniques
Diffusion du manuel de prélèvement
Fiche de prélèvement
Prétraitement
de l'échantillon
(homogénéisation,
centrifugation,
dilution, …)
Biopsies, prélèvements ostéo-articulaires (broyage
et homogénéisation des échantillons)
Examen direct avec préparation (éclaircissement
et coloration des structures fongiques)
L’examen d’un fragment dilacéré de culture
présente un risque de destruction de l’architecture
des appareils sporifères à l’origine de difficultés
d’identification
Charge de l’inoculum
Âge de la culture
Disperseur - homogénéiseur à billes
Ultra-Turrax®
Rouge Congo (Mycétocolor®)
- 58 -
Formation des opérateurs
Vitek Densichek (1,8-2,2 McF)
18-96 h
Mycologie médicale
Encadré 2 - (suite).
MAÎTRISE DES RISQUES (suite)
Compétence du personnel technique
Documents techniques à disposition
Main d'œuvre
(habilitation
du personnel) :
préciser les références
des procédures
et enregistrements
Formation (interne et externe) qualification /
habilitation / évaluation
Respect des fiches d’instruction et notices fournisseurs
Résultats aux contrôles qualité (souche de référence,
CNQ, OCIL)
D4-D-INS07 « Techniques d’ensemencement en
mycologie »
D4-D-ENR01 « Milieux de culture en mycologie »
Gestion documentaire e-learning (e-MYCOimage)
Protection de l’opérateur
Protection de l’échantillon
Protection de l’environnement
PSM
Compétence du personnel de secrétariat
Respect des procédures d’enregistrement C1-PR01
« Création du dossier patient sur le SIL »
Vérification de concordance entre demande du
médecin et code SIL saisi
Audit du secrétariat
Conditions environnementales préconisées par le fournisseur d’automate et de
PSM 15-30 °C
Travail sous PSM pour les échantillons le nécessitant
(groupe 2 et groupe 3)
D4-A-INS02 « Manipulations à effectuer sous PSM »
Système de surveillance des températures Evisense®
Labguard
Maintenance des appareils
Sensibilité des cultures
Choix et sélectivité/spécificité des
milieux de culture
Référence du réactif Milieu urée/indole
(référence fournisseur, Conformité des réactifs
version)
Lectures des milieux chromogéniques
Subculture des levures
Subculture des champignons filamenteux
Utilisation de géloses chromogènes
Sensibilité à l’Actidione®
Gélose ChromIDTM Candida
Gélose dermatophytes
Gélose Sabouraud - chloramphénicol
Gélose Sabouraud - chloramphénicol - Actidione®
Gélose Dermatophyte Test Medium
Gélose Sabouraud - tétrazolium - gentamicine chloramphénicol
Milieu de Borelli (subcultures pour dermatophytes)
Incuber les géloses couvercle vers le haut pour les
champignons filamenteux
Conditions de conservation conformes aux recommandations fournisseurs
Métrologie des enceintes de stockage des réactifs :
cartographie et système de surveillance des températures Evisense® Labguard
Gestion des stocks informatisée
Matériel à usage unique
Utilisation d’un PSM
Fiches fournisseurs : connaissance des performances
des réactifs et des milieux de culture utilisés
Respect des délais préconisés par les fabricants
Repiquage en stries comme les bactéries
Repiquage des colonies en prélevant un fragment de
la culture avec un peu de gélose sous-jacente
Conditions ambiantes
requises (ex : température, organisation des
locaux, éclairage, …)
- 59 -
Données d'entrée
Encadré 2 - (suite).
MAÎTRISE DES RISQUES (suite)
Données d'entrée
Candida glabrata ATCC 15126
Candida krusei ATCC 6258
Candida lusitaniae ATCC 34449
Trichophyton rubrum ATCC 28188
CIQ
Matériau de références
(témoins)
EEQ
BP, ANSM, ABP
Protection de l’opérateur
Dissémination de spores dans l’environÉquipements :
nement
Exigences métrologiques
Allergie aux spores de moisissures (alvéo(définir les paramètres critiques)
lite allergique aspergillaire)
Pour les champignons de classe 2, les
cultures sont à manipuler sous PSM
Pour les champignons de classe 3 comme
Histoplasma, les souches ne sont pathogènes que sous forme de spores (cultures), alors que la forme levure présente
Exigences informatiques
dans les prélèvements n’est pas infectante
spécifiques
à moins de se piquer au cours de la manipulation
Équipement de protection collectif : travail
sous PSM
Maintenance annuelle du PSM
Bionettoyage des paillasses et contrôle des
surfaces
Surveillance des conditions environnementales (température, hygrométrie)
Équipement de protection individuel :
audit des bonnes pratiques professionnelles
Application des précautions standard
Vérification de concordance entre demande
du médecin et code SIL saisi
BP : Biologie Prospective ; ANSM : Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé ; ABP : Association de Biologie Praticienne.
Commentaires
Ce dossier de vérification consacré à la méthode manuelle d’ensemencement s’applique à l’ensemble des prélèvements mycologiques, c’est-à-dire à toutes
les matrices biologiques. L’étape préalable à la rédaction de cette étude a été d’analyser l’état de l’art, c’est-à-dire les connaissances actuelles rapportées dans
la littérature, afin que les ensemencements soient réalisés conformément aux bonnes pratiques de laboratoire. Pour vérifier l’harmonisation des inoculations
entre des opérateurs différents, il est judicieux de réaliser des audits de paillasse pour observer les gestes techniques (règles de l’art) lors de l’inoculation des
différents types de produits pathologiques (selle, urine, prélèvement vaginal, biopsie, cathéter, etc.) et ainsi évaluer les performances analytiques des méthodes
utilisées.
Les milieux chromogènes sont surtout faits pour les levures ; ils ne sont pas favorables à la croissance des moisissures.
La sécurisation du processus analytique nécessite l’utilisation de CIQ associés à des EEQ. L’évaluation des performances est effectuée avec des souches tests
de type ATCC ou avec des isolats cliniques fournis par des OCIL.
Pour les températures d’incubation, le Rémic 2010 préconise 30 ± 1,5 °C pour la mycologie.
Pour les levures, la température optimale de croissance des espèces du genre Candida est de 37 °C avec une durée d’incubation de 24 à 72 h. Cependant,
comme les levures Candida peuvent être retrouvées en association avec d’autres micromycètes non thermophiles, il peut être utile d’incuber un jeu de deux
géloses, l’une à 25 ± 2 °C, l’autre à 35 ± 2 °C (40). Pour les LCR et les hémocultures la température optimale est de 35 ± 2 °C. Les espèces du genre Aspergillus
se développent également mieux à 35 ± 2 °C.
La société bioMérieux recommande une température d’incubation de 25 °C pour les dermatophytes et de 37 °C pour les levures.
En ce qui concerne Trichophyton verrucosum, l’isolement est favorisé par une incubation à 32 °C (e-MYCOimage).
Pour les champignons filamenteux, il faut observer la croissance dès 3 jours d’incubation et conserver les cultures 7 jours pour les moisissures (Aspergillus),
jusqu’à 30 jours pour les dermatophytes, et 2 à 3 mois pour Histoplasma et Blastomyces.
La finalisation de ce dossier de vérification des performances permet de conclure sur l’aptitude du processus analytique à isoler les souches pathogènes
pour leur identification.
13 juillet 2014, Jean-Paul Klein, biologiste.
– PM 2 : Mise en culture (voir encadré 2),
– PM 3 : Analyse chimique après culture (hémoculture),
– PM 4 : Identification phénotypique du taxon,
– PM 5 : Étude de la sensibilité aux antifongiques,
– PM 6 : Identification de champignons spécifiques par
génotypage.
L’encadré 2 rassemble les données essentielles du
dossier de vérification des performances pour la mise en
culture conformément au document Cofrac SH FORM 44
(24) ; on remarquera que les données d’entrée demandées
par le formulaire SH FORM 44 ne sont pas toujours bien
adaptées à la discipline.
N.B. La ligne de portée PM 2 a été créée pour pouvoir
gérer les mises en culture des sites périphériques
(PREANA). Cependant, du fait de l’importance de bien
maîtriser la mise en culture, nous avons choisi de maintenir sciemment cette vérification des performances dans le
cadre de ce travail.
- 60 -
Mycologie médicale
1) Prestations de conseil
La prestation de conseil est au cœur de l’activité du biologiste. Elle concerne les médecins, les patients, les préleveurs externes et les autres professionnels de santé. Elle
peut porter sur tous les processus de réalisation. Nous donnons ci-après quelques exemples.
• Préanalytique (modalités de prélèvements et de transports des échantillons)
De la qualité des prélèvements et de la connaissance du
contexte clinique, dépend l’identification de l’agent causal. Pour un prélèvement de bonne qualité, il faut :
– Une fenêtre thérapeutique de 2 à 3 mois en cas de traitement antifongique systémique ou de traitement local
par un vernis ou une solution filmogène (40) ;
– Une fenêtre thérapeutique de 15 jours en cas d’application locale par une crème antifongique.
• Analytique (sensibilité des cultures, incertitudes de mesures, seuils)
– La sensibilité des flacons d’hémocultures se situe entre
30 et 80 % selon les études ; les flacons d’hémocultures
sont rarement positifs avec les moisissures sauf Fusarium
(positif dans 50 % des cas) et Scedosporium prolificans
(positif dans 40 % des cas) ;
– Toutes les infections fongiques invasives ne sont pas
hématogènes ;
– Pour les sites superficiels, l’antifongigramme n’est pas
utile, sauf si le malade a déjà reçu un traitement antifongique ; en revanche, il peut être utile pour les isolats
provenant d’un site profond.
• Postanalytique (interprétation des résultats en fonction
du contexte clinique, conseil médical, scientifique et thérapeutique)
– Candida glabrata a une sensibilité diminuée au fluconazole ;
– La langue noire villeuse correspond à une hyperplasie
des prolongements kératinisés des papilles filiformes ;
son origine n’est pas toujours candidosique ;
– Différents médicaments sont susceptibles d’induire des
pathologies de l’ongle (anticancéreux, cyclines, antimalariques, zidovudine) (64) ;
– Une biopsie est préconisée pour les mycoses de type
chromoblastomycoses ;
– Un antifongigramme n’est pas indiqué pour les traitements topiques (ex. : mycose vaginale) sauf dans le cas
d’un échec thérapeutique.
2) Compte rendu de résultat
Exploiter et interpréter avec rigueur les résultats nécessite de prendre en compte le contexte clinique et l’ensemble des arguments diagnostiques (mycose superficielle,
mycose profonde, etc.).
Chez les patients atteints de broncho-pneumopathie
chronique obstructive (BPCO) ou de mucoviscidose,
l’isolement d’Aspergillus spp peut correspondre à une
simple colonisation bronchique sans infection réelle, mais
il convient de le signaler. Les recommandations pour
l’interprétation des examens bactériologiques des expectorations basées sur le score de Bartlett (rapport entre le
nombre de cellules épithéliales et celui des polynucléaires
neutrophiles) n’ont pas d’intérêt pour les infections
fongiques. D’autres critères doivent être pris en compte
quand un champignon est isolé chez des patients prédisposés ou présentant des signes évocateurs d’une infection
fongique (39).
Les sportifs touchés par des dermatophytes doivent être
traités rapidement, car c’est un motif de disqualification
pour une compétition.
3) Traitements
• Onychomycoses des doigts et orteils à dermatophytes
Classiquement, le traitement des onychomycoses sans
atteinte matricielle est uniquement local. Lors d’une atteinte matricielle, un traitement oral est ajouté.
Un traitement topique en monothérapie par une solution filmogène ou un vernis, est réservé aux atteintes mineures ou modérées.
Si atteinte matricielle : terbinafine à la dose de 250 mg/j
pendant 6 semaines à 3 mois (ongles des mains) et de 3 à
6 mois pour les ongles des pieds. Une surveillance de la
fonction hépatique et de la numération formule sanguine
est indiquée.
• Onychomycoses à levures
Traitement antifongique topique (imidazolé, ciclopiroxolamine).
• Onychomycoses à moisissures (Fusarium spp, Acremonium
spp, Scopulariopsis spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Onychocola canadensis)
Il est important de confirmer que la moisissure est bien
à l’origine de l’onychomycose en effectuant un second
prélèvement. L’amphotéricine B en application locale
reste le traitement de choix après excision de la partie
parasitée.
Le traitement de référence des aspergilloses invasives
repose sur l’utilisation du voriconazole (commentaire EEQ
BP 2013-2).
Le tableau XII expose une synthèse de l’analyse et de
la gestion des risques appliquée au processus postanalytique.
F) Sécurisation des processus supports
1) Gestion des ressources humaines : habilitation
Les examens biologiques mycologiques ne peuvent être
réalisés que par du personnel qualifié et habilité. En ce qui
concerne l’habilitation, il faut distinguer l’habilitation initiale avec une phase de tutorat, de l’habilitation sur la base
de l’acquis des connaissances et des compétences.
- 61 -
E) Le processus postanalytique
Tableau XII - Analyse et gestion des risques : processus postanalytique.
Résultats demandés en urgence
Qualité des prélèvements
Respect de la documentation interne :
C1-PR01 « Création du dossier patient sur Alysé »
E2-ENR01 « Délais de rendu des résultats »
Ajout automatique du suffixe « U » pour les
dossiers présentant des résultats d’urgences vitales
Audits, enquête de satisfaction, indicateur qualité
Si l’examen direct est positif, il convient de traiter
Non-respect des délais
de rendu des résultats
Examen direct positif
Transmission des données dans le SIL
Vérification périodique des connexions du SIL
et des interfaces connectées
Baisse de la qualité des soins
Absence ou retard de communication
prodigués aux patients
des résultats
Suivi des dossiers en cours et en fin de journée
Respect de la documentation interne : E1-ENR01
« Grille des critères d’alerte »
Non-respect des obligations Devoir d’informer le patient le cas
légales en matière
échéant
de rendu de résultat*
E1-ENR02 « Avis et interprétation en biologie
médicale »
Transmission des résultats aux destinataires prévus
Gestion des éditions centralisées
Vérification de l’identification lors de la diffusion
des résultats en main propre
Audits et enquête de satisfaction
Traitement des réclamations
Absence de traçabilité des résultats
communiqués par téléphone
Traçabilité du SIL en post-it dossier : date, heure
d’appel, nom et fonction de la personne contactée,
résultats transmis et nom de l’opérateur
Système informatique
du laboratoire (SIL)
Non-respect des exigences
et besoins des utilisateurs
* Articles L.6211-2 et L.6211-8-1 du Code de la Santé Publique.
L’habilitation est basée sur l’ancienneté, le diplôme, la
maîtrise du secteur concerné (évaluée par la présence au
poste concerné, les résultats aux contrôles de qualité, les
évaluations de compétences et de connaissances, les audits
internes et externes), l’aptitude à gérer les difficultés, les
formations réalisées (internes et externes), le programme
MYCOimage de formation continue, et les entretiens individuels d’évaluation.
Il convient de signaler qu’il ne faut pas trop détailler les
tâches des opérateurs, afin de rendre la grille d’habilitation opérationnelle et de ne pas bâtir un système trop complexe et ingérable dans le temps. Il ne s’agit pas de faire
de la « surqualité » en habilitant des opérateurs qui ont
plusieurs années d’expérience professionnelle.
La personne nouvellement affectée est supervisée durant trois phases (observation, tutorat actif et habilitation)
qui sont tracées. Le biologiste responsable du laboratoire
fixe la durée de ces phases en fonction de la nature du
poste, de la qualification et de l’expérience de la personne.
Le formulaire d’enregistrement est décliné en fonction
des postes concernés. À l’issue de la période de formation,
le biologiste responsable évalue la formation du nouvel
embauché et décide de son habilitation. Un code utilisateur lui est attribué pour lui permettre l’accès individualisé
sur le système informatique du laboratoire (SIL).
Critères d’habilitation
La grille d’habilitation a été élaborée sur la base de critères objectifs, permettant de s’assurer de la maîtrise des
étapes critiques de l’analyse (mise en situation, quiz, analyses de dix échantillons en doublons, ou d’anciens EEQ).
Les autorisations sont regroupées autour de trois niveaux
d’habilitation :
3 = référent, formateur et suppléant,
2 = travail autonome,
1 = travail en routine encadré.
Technicien(ne)s
Le tableau XIII présente un exemple de grille d’habilitation des technicien(ne)s pour la mycologie.
Les habilitations sont définies pour une période de
2 ans. Elles sont examinées lors des entretiens individuels
d’évaluation et sont également revues en cas d’absence
prolongée (supérieure à 6 mois). Les fonctions de référent
nécessitent une habilitation de niveau 3.
Le laboratoire doit définir un programme de maintien
des compétences (participation des opérateurs aux EEQ,
adhésion à des e-learning, formations internes ou externes,
quiz, etc.).
Biologistes
Le tableau XIV donne un exemple de grille d’habilitation des biologistes pour la mycologie.
- 62 -
Mycologie médicale
Tableau XIII - Grille d’habilitation des techniciens pour la mycologie.
Opérateur Opérateur Opérateur Opérateur Opérateur Opérateur
1
2
3
4
5
6
Examen direct sans et avec préparation
3
3
Mise en culture des différents types de prélèvements
3
2
3
Lecture des milieux de culture
3
2
3
Examen microscopique après coloration
3
2
3
Identification automatisée / antifongigramme
3
2
3
Réalisation des contrôles qualité (CIQ, EEQ)
3
2
3
Gestion des commandes
3
2
3
Gestion des abonnements
3
2
Réception des commandes et gestion des stocks
3
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
Tableau XIV - Grille d’habilitation des biologistes pour la mycologie.
Prélèvement mycologique
3
3
2
2
2
2
Identification taxonomique
3
2
3
2
2
2
Interprétation de l’antifongigramme
3
3
Stratégie de passage des contrôles qualité
3
3
Choix des meilleures techniques
pour répondre à la demande
3
3
Formateur interne
3
3
Prestation de conseil
3
3
Parmi les compétences requises pour l’exercice de la
mycologie médicale, le biologiste responsable de la paillasse de mycologie doit particulièrement maîtriser les
spécificités propres à cette discipline, en rappelant que la
formation et l’expérience doivent garantir la compétence :
– Préanalytique : connaissance des manifestations cliniques associées aux infections fongiques afin d’orienter
l’examen mycologique ;
– Analytique : choix de la meilleure technique pour répondre à la demande ;
– Postanalytique : connaissance des agents de mycoses permettant de donner un conseil adapté.
de qualité, observation des gestes techniques à la paillasse
lors d’audits, suivi des maintenances des automates, aptitude à gérer les problèmes techniques, entretien individuel, ... À côté de ces modes d’évaluation, la littérature
professionnelle s’ouvre de plus en plus à l’utilisation de
cas cliniques ou de quiz (45, 65-70). En annexe, nous proposons un questionnaire d’évaluation des connaissances
en mycologie, qui peut être intégré au processus d’habilitation.
Évaluation des compétences
La diffusion de l’information scientifique et technique
est un facteur qui est essentiel au développement des pratiques professionnelles. Il est tout aussi important de vérifier la bonne compréhension des dispositions techniques
qui sont prises. C’est le but de l’évaluation des compétences.
2) Hygiène et sécurité
Cette évaluation peut être effectuée de différentes manières : mise en situation, résultats obtenus aux contrôles
Une synthèse de l’analyse et de la gestion des risques
pour assurer la consolidation du processus de gestion des
ressources humaines est présentée dans le tableau XV.
Les micro-organismes sont répartis en 4 groupes
d’agents pathogènes en fonction de leur niveau de risque
(pouvoir pathogène et mode de transmission facile de
l’homme à l’homme, etc.). En regard du risque biologique, 4 niveaux croissants de sécurité ont été définis pour
la manipulation de ces agents infectieux dans les industries
et les laboratoires de recherche, d’enseignement et de
biologie médicale (N.B. Il n’existe aucun champignon de
- 63 -
Biologiste Biologiste Biologiste Biologiste Biologiste Biologiste
1
2
3
4
5
6
Tableau XV - Maîtrise des points critiques liés au processus « Ressources humaines ».
Non-respect des exigences
et besoins des utilisateurs
Manque de personnel
Définition de l’effectif minimum
Mise en place des plannings en fonction des compétences nécessaires
Fiches de poste par site
Maintien et suivi
des compétences
Mise en place d’une grille d’habilitation par fonction
et par site
G1-ENR17 « Grille d'habilitation secrétaire-coursieragent d'entretien »
G1-ENR19 « Grille d'habilitation techniciens »
G1-ENR20 « Grille d'habilitation biologistes »
G1-ENR21 « Grille d'habilitation Cellule qualité »
Suivi du maintien des habilitations lors des entretiens
individuels
Questionnaires de compétences/connaissances pour
assurer l’évaluation continue de l’ensemble des acteurs
du laboratoire
Revue de contrat annuelle avec les établissements
de soin
Définition des suppléances aux fonctions clés
Mise en œuvre, développement
de nouvelles compétences
(intégration, changement de
poste, de fonction)
G1-INS02 « Intégration d'une nouvelle secrétaire »
G1-INS03 « Intégration d'un nouveau technicien »
G1-INS05 « Intégration d'un nouvel agent d'entretien »
G1-INS06 « Intégration d’un nouveau biologiste »
Fiches de formation/habilitation du personnel : G2ENR02 « Grille de suivi formation/habilitation »
Gestion des formations
G2-ENR03 « Évaluation des formations à chaud et à
froid »
G2-ENR01 « Politique annuelle de formation définie
en revue de direction »
Indicateur annuel d’efficacité des formations internes
et externes, évalué en revue de direction
Rendu de résultats inexacts,
allongement des délais
de rendu
Formation inefficace
et/ou insuffisante
niveau 4, qui concerne essentiellement les virus des fièvres
hémorragiques).
Des exemples de champignons appartenant aux
groupes 1, 2 et 3, sont présentés dans le tableau XVI.
Pour les champignons du groupe 2, la culture doit être
manipulée sous poste de sécurité microbiologique (PSM).
Les espèces du genre Aspergillus méritent une mention particulière car elles sont allergisantes, c’est pourquoi les opérateurs doivent être protégés de l’inhalation des spores,
qui sont très volatiles, et manipuler ces agents pathogènes
sous PSM.
Les agents des mycoses exotiques du groupe 3 comme
Histoplasma capsulatum ne sont pathogènes que sous la
forme de spores. La forme levure est présente dans les tissus. Les cultures sur milieu de Sabouraud se présentent
sous forme de colonies duveteuses blanches ; le mycélium
porte de grosses spores spiculées (macroconidies) associées à de petites spores (microconidies). La forme levure
présente dans les prélèvements n’est pas infectante à
moins de se piquer au cours de la manipulation (71-72).
3) Processus supports
Ces processus ne sont pas spécifiques à la mycologie,
mais leur maîtrise est indispensable pour être accrédité.
Une synthèse de l’analyse et de la gestion des risques
pour assurer la consolidation des processus supports est
donnée par le tableau XVII.
V. - L’AUDIT DE MYCOLOGIE
L’audit est un instrument pivot de l’amélioration continue et aussi un bon outil de management par la qualité. Il
doit apporter une réponse argumentée et informée sur la
conformité des pratiques du laboratoire, par rapport aux
exigences de la norme ISO 15189 et des référentiels de
bonnes pratiques de mycologie. L’audit de paillasse est
l’occasion de vérifier si les opérateurs techniques sont
expérimentés et travaillent dans les règles de l’art (travail
de qualité fait avec professionnalisme en suivant les recommandations de bonnes pratiques) et conformément à
l’état de l’art (connaissance théorique). Il permet aussi
- 64 -
Mycologie médicale
Tableau XVI - Classification selon le niveau de risque biologique.
Groupes
Exemples
Définition
Groupe 1
Aspergillus niger,
Penicillium camenbertii
Comprend les agents biologiques non susceptibles de provoquer
une maladie chez l’homme.
Groupe 2
Candida albicans, Candida tropicalis,
Epidermophyton floccosum,
Trichophyton spp, Microsporum spp,
Aspergillus flavus
Comprend les agents biologiques pouvant entraîner une maladie
chez l’homme et constituer un danger pour les personnes en
contact avec ces agents ; leur propagation à la collectivité est peu
probable ; il existe une prophylaxie et/ou un traitement efficace.
Groupe 3
Histoplasma capsulatum
Blastomyces dermatitidis
Cladophialophora bantiana
Paracoccidiodes brasilensis
Coccidioides immitis
Comprend les agents biologiques pouvant entraîner une maladie
grave chez l’homme et constituer un danger sérieux pour les
personnes en contact avec ces agents ; la propagation de ces
agents à la collectivité est possible, mais il existe généralement
une prophylaxie ou un traitement efficace.
Tableau XVII - Maîtrise des points critiques liés au processus support.
Processus
Identification
des risques
Identification
des points critiques
Conduite à tenir
pour la maîtrise
Non-respect des obligations légales (confidentialité, protection des
données)
Protections des locaux et des
systèmes informatisés
Perte des données
Accès limité aux locaux informatiques et
archives
Accès sécurisé aux applications et logiciels
informatiques Antivirus, Firewall
Engagement de confidentialité
Définition des durées d’archivage
Protocole de sauvegarde automatisée avec
externalisation
Tests de restauration des données
rendu de résultat inexact
Panne bloquante du système
informatique
Fonctionnement des interfaces informatiques
Intégrité des données transmises aux prescripteurs
Respect des procédures internes en cas de
panne informatique
Traçabilité des interventions sur le système
informatique
Vérification des connexions automatesMiddleware-SIL
Convention de preuve avec les prescripteurs
(comptes rendus papier, fax, Hprim…)
augmentation des coûts
Perte d’efficience
Rupture de stock
Compétences des fournisseurs
Réception des commandes
Définition des besoins
Gestion informatisée des stocks (quantité,
péremption)
Évaluation annuelle des fournisseurs
Respect des procédures internes (vérification des livraisons, traçabilité)
Critères d’achat
Panne du matériel
Étalonnage du matériel
critique
Entretien du matériel
Respect des procédures dégradées en cas de
panne
Suivi continu du programme de vérification
des instruments de mesure
Planification informatisée des maintenances
avec alertes et traçabilité
Audit de la paillasse de mycologie
Gestion des achats
et des stocks
Gestion
des équipements
et métrologie
rendu de résultat inexact
- 65 -
Gestion du système
d’information
d’explorer et de contrôler la véracité des données et d’évaluer les perspectives de progrès.
Avant de déposer le dossier d’accréditation au Cofrac,
il est très important de réaliser un audit à blanc, afin de
vérifier la conformité des pratiques par rapport aux exigences des référentiels. Les constatations sont toujours
plus objectives lorsque l’on a recours à un auditeur
externe à la structure.
L’auditeur doit toujours prendre en compte l’intérêt
du patient.
Processus préanalytique
– Quelles sont les modalités de prélèvements pour la
mycologie ?
– Comment procédez-vous au transport des échantillons
biologiques et quels sont les milieux de transport
utilisés ?
– Quelles sont les dispositions prises pour surveiller les
conditions de transport des échantillons ?
Processus analytique
– Pouvez-vous me montrer comment vous procédez pour
la lecture des examens directs sans et avec préparation ?
– Avez-vous une liste des milieux de culture à ensemencer
en fonction des différents types de prélèvements ?
– Quelle est la démarche diagnostique pour identifier une
levure ?
– Quelle est la démarche diagnostique pour identifier un
champignon filamenteux ?
– Quelle est votre stratégie de contrôle qualité (interne et
externe) en mycologie ?
– Quelles sont les souches tests ATCC ou CIP que vous utilisez ?
– Comment avez-vous défini les durées et les températures
d’incubation en fonction des isolats cliniques et des
champignons recherchés ?
– Quelles sont les modalités de gestion des EEQ (enregistrement, traitement comme un patient, validation,
compte rendu, souchothèque, analyse des tendances) ?
– Est-ce que vous connaissez les prélèvements précieux ?
– Quelles dispositions avez-vous prises pour traiter les
ponctions et les biopsies (durée d’incubation, milieux,
broyeur, PSM) ?
– Quelles sont les isolats cliniques que vous conservez en
souchothèque ?
– Quels sont les indicateurs qualité ou de performance
que vous utilisez ?
Processus postanalytique
– Disposez-vous d’une grille de critères d’alerte ?
– Comment réalisez-vous le signalement externe ? Est-il
tracé ?
– Quelles sont les modalités de conservation des échantillons primaires ?
– Quelles sont les modalités de sous-traitance de certains
examens (identification et antifongigramme des souches
difficiles, transmissions au CNR des mycoses invasives et
antifongiques) ?
Processus supports
– Quelles dispositions avez-vous prises pour assurer le raccordement métrologique : périodicité ? Avez-vous défini
des critères ou des évènements qui impliqueraient une
modification de cette périodicité ?
– Le laboratoire dispose-t-il d’un programme de formation
(interne et externe) concernant la mycologie ? Ce programme est-il suivi et évalué ?
– Comment vous assurez-vous de la maîtrise du SIL (vérifications des interfaces entre les systèmes informatiques
connectés) ?
– Quelles sont les modalités d’habilitation et de suivi des
compétences des opérateurs ?
Processus de management
– Quelles dispositions avez-vous prises pour assurer une
veille électronique ?
– Utilisez-vous des sites internet d’e-learning (e-MYCOimage, Bio Qualité) ?
– Quelles dispositions avez-vous prises pour vous assurer
de la maîtrise de votre portée flexible standard de type
A ou de votre portée flexible étendue de type B ?
VI. - DISCUSSION
Le processus d’accréditation n’est pas figé. Les dispositions de travail sont susceptibles d’être modifiées ou complétées en fonction de l’état de l’art et de l’évolution de la
NABM, mais aussi dans une logique de contrôle des coûts.
La démarche qualité est structurante, car elle met en évidence autant les lacunes que les nouvelles orientations
pour une harmonisation concertée des pratiques.
L’analyse et l’interprétation de l’information issue de
la recherche documentaire, de même que les échanges
avec les autres biologistes, permettent de dégager un
certain nombre de constats pour orienter les décisions et
organiser les activités d’analyses mycologiques.
En ce qui concerne le processus préanalytique, la prise
de renseignements cliniques est un élément clé pour
orienter les recherches et faciliter l’interprétation des examens. Il faut s’assurer que les performances analytiques
répondent bien aux besoins des clients et aux exigences
des référentiels. Une analyse des risques potentiels permet
de cibler les points critiques et de consolider ainsi la fiabilité des analyses et la fidélité des méthodes. L’élaboration
des dossiers de vérification des performances permet de
conclure sur l’aptitude du processus analytique à isoler et
identifier les souches pathogènes. L’approche méthodologique prouve que les performances analytiques répondent donc aux besoins des clients et aux exigences des
référentiels.
- 66 -
Mycologie médicale
VII. - CONCLUSION
Accréditer la paillasse de mycologie nécessite de consolider les processus de réalisation en s’appuyant sur une
analyse des risques et sur les recommandations de bonnes
pratiques. Si on dresse le bilan de la démarche d’accréditation, on constate qu’elle permet aussi de réactualiser les
pratiques professionnelles par la prise en compte des référentiels et de leur adaptation au sein du laboratoire. Les
développements obtenus peuvent toucher tous les aspects
de la discipline, de l’achat de nouveaux matériels (curettes
de prélèvements, lampe de Wood, milieux de culture,
Références Bibliographiques
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étuves, livres de mycologie, souches ATCC, etc.), jusqu’à
l’intégration de commentaires circonstanciés dans les
comptes rendus de résultats.
L’engagement qualité assure aussi, le cas échéant, une
réorganisation de la paillasse en conformité avec l’état de
l’art conduisant à une optimisation des pratiques techniques et des gains de productivité. Cette problématique
est un thème fédérateur aussi bien pour les techniciens
que pour les biologistes. Il en résulte une meilleure prise
en charge des patients aussi bien diagnostique que thérapeutique.
Finalement, l’accréditation permet de redécouvrir les
choses, de façon plus précise, plus pratique et donc plus
pragmatique. À vous de vous engager.
Remerciements
Les auteurs remercient Kim Tang (Vitry-le-François),
Patrice Laudat (Tours), Jean-Michel Garnier (Reims),
Jean-Pierre Bouilloux (Rodez), Pierre-Olivier Bazin (Beauvoisin), Florian Scherrer (Roussillon), Catherine KauffmannLacroix (Poitiers), Nicolas Chatelain (Valenciennes),
Pascal Dumur (Bar-le-Duc), Jean-François Carod (SaintClaude) et Luc Essemilaire (Condom) pour la lecture
critique de ce travail.
Conflit d’intérêt : aucun.
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Cependant, si l’interprétation des résultats est aisée en
présence d’une croissance fongique, elle est délicate en
l’absence de culture et en fonction du contexte clinique
(immunodépression, mycose invasive). Il y a alors lieu
d’utiliser d’autres outils diagnostiques. Lorsqu’il est impossible de mettre en évidence le champignon lui-même, les
sérologies fongiques sont des méthodes complémentaires
très utiles : cryptococcose (antigène circulant), candidoses
systémiques (anticorps, antigène circulant), aspergilloses
(anticorps, antigène circulant), etc. Le diagnostic des aspergilloses invasives et des fongémies à levures a été amélioré par le développement de biomarqueurs basés sur la
détection de l’ADN ou celle d’antigènes (galactomannane
et b (1-3)-D-glucane).
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Contet-Audonneau N. Enquête sur les conditions
analytiques d’un examen de mycologie médicale
auprès des membres de la Société française de
mycologie médicale. Journal de Mycologie Médicale
2011 ; 21 : 159-68.
(63) Kauffmann-Lacroix C, Cassaing S, Bessières MH,
Mayet D, Linas MD, Roques C. Les contrôles de
qualité en mycologie médicale. Journal de Mycologie
Médicale 2011 ; 21 : 15-8.
(64) Lebrun-Vignes B, Bris C, Lelièvre B, Diquet B.
Ongles et médicaments. Revue Francophone des Laboratoires 2011 ; 432 : 77-81.
(65) Conte C. Une teigne d’origine animale. Option Bio
2010 ; 445 : 23.
(66) Gits M, Hommel B, Buot G. Quiz n°10. Feuillets de
Biologie 2013 ; 312 : 45-7.
(67) Paugam A, Eldin de Pécoulas P, Bourée P. Fillette
africaine avec des plaies du coude, des abcès froids
et des lésions cutanées de type Molluscum. La Lettre
de l’Infectiologue 2014 ; 29 (3) : 118-9.
(68) Bourée P, Paugam A. La basidiobolomycose : des
placards sous-cutanés tropicaux. Option Bio 2014 ;
501 : 16-7.
(69) Morio F, Barbarot S, Pineau S, et coll. Photo quiz :
lésion cutanée au retour d’un séjour de Thaïlande.
Journal de Mycologie Médicale 2014 ; 245 : 65.
(70) Anselmo M, Dunand J, Ait-Ammar N. Quiz n°12.
Feuillets de Biologie 2014 ; 316 : 37-9.
(71) Klein JP. Le poste de sécurité microbiologique : de
la réglementation à l’accréditation. Revue Francophone des Laboratoires 2012 ; 445 : 91-100.
(72) Kauffmann-Lacroix C, Bousseau A, Castel O. La
sécurité au laboratoire de mycologie clinique.
Décembre 2013 ESKA ; section XII, chapitre 15 : 1-7.
Mycologie médicale
ANNEXE : QUIZ
2. Pour les champignons filamenteux, il est préférable
d’ensemencer un milieu de culture avec une gélose en
pente :
q vrai / q faux
3. En mycologie médicale, les groupes de micromycètes
suivants peuvent être rencontrés (cochez la ou les
réponses exactes) :
q A. Les levures
q B. Les dermatophytes
q C. Les opportunistes filamenteux
q D. Les champignons dimorphiques
4. Un champignon dimorphique se présente sous forme
de levure dans les tissus et sous forme filamenteuse en
culture :
q vrai / q faux
5. Pour les champignons dimorphiques, la forme la plus
susceptible de produire des aérosols est (cochez la
réponse exacte) :
q A. La forme levure
q B. La forme filamenteuse
6. L’histoplasmose est une infection due à un champignon
dimorphique :
q vrai / q faux
7. La conidiogénèse correspond à la formation de spores
externes ou conidies :
q vrai / q faux
8. Une blastospore est une spore constituée lors du bourgeonnement d’une levure :
q vrai / q faux
11. Les phialospores sont des spores formées à partir d’un
sac (phialide) chez les champignons filamenteux des
genres (cochez la ou les réponses exactes) :
q A. Aspergillus
q B. Penicillium
12. Les chlamydospores sont (cochez la ou les réponses
exactes) :
q A. Des spores terminales ou latérales rondes ou
ovales
q B. Obtenues sur PCB et RAT
q C. Caractéristiques de l’espèce Candida albicans
q D. Caractéristiques du genre Candida
13. Les spores de dermatophytes sont appelées aleuries :
q vrai / q faux
14. Les conidies sont formées au sommet des phialides
pour les genres suivants (cochez la ou les réponses
exactes) :
q A. Penicillium
q B. Aspergillus
q C. Fusarium
q D. Acremonium
15. Candida tropicalis présente une sensibilité diminuée
(cochez la ou les réponses exactes) :
q A. Aux azolés
q B. À la 5-flucytosine
16. Pour Candida tropicalis (cochez la ou les réponses
exactes) :
q A. La culture est inhibée par l’actidione
q B. On note l’absence de chlamydiospore sur milieu
RAT ou PCB
q C. Le test de filamentation en sérum est négatif
q D. Le tétrazolium est réduit (coloration rouge à
violet)
17. Le milieu urée-indole permet de différentier la variété
duveteuse de Trichophyton rubrum de T. mentagrophytes
var. interdigitale :
q vrai / q faux
9. Le test de blastèse ou de filamentation dans le sérum
q A. Est spécifique de Candida albicans dans 95 % des cas
q B. Est spécifique de Candida albicans dans 100 % des cas
q C. Produit des tubes germinatifs en 3 heures à 37 °C
q D. Produit des tubes germinatifs à base non étranglée
q E. Produit du pseudomycélium à base étranglée
18. Le cycloheximide (Actidione®) inhibe la croissance
des champignons saprophytes comme Fusarium et Aspergillus et celle de certaines espèces du genre Candida :
q vrai / q faux
10. Le pseudomycélium est un ensemble de cellules allongées qui ne sont pas séparées par des cloisons :
q vrai / q faux
19. À l’examen direct, la présence de filaments mycéliens
est en faveur de la pathogénicité du champignon :
q vrai / q faux
- 69 -
1. Pour les espèces fongiques à pousse rapide, il est préférable d’ensemencer un milieu de culture en boîte de
Pétri :
q vrai / q faux
20. Quel est le milieu de culture le mieux adapté pour
l’isolement des levures (cochez la réponse exacte) :
q A. Milieu de Sabouraud additionné de chloramphénicol et/ou de gentamicine
q B. Milieu de Sabouraud
q C. Milieu de Sabouraud additionné de chloramphénicol et d’Actidione®
21. Le cycloheximide (Actidione®) peut-il inhiber la
pousse de certaines espèces de champignons telles que
q A. Candida glabrata
q B. Candida parapsilosis
q C. Candida tropicalis
q D. Candida famata
q E. Fusarium spp.
q F. Aspergillus spp.
22. La seule présence de Candida au niveau de la muqueuse buccale ou digestive autorise-t-elle à affirmer
son rôle pathogène :
q vrai / q faux
23. Pour les prélèvements des onychomycoses, quelle est
la fenêtre thérapeutique (cochez la ou les réponses
exactes) :
q A. 2 à 3 mois après un traitement systémique ou un
traitement local par un vernis ou une solution
filmogène
q B. 15 jours après un traitement local par une crème
antifongique
Réponses : 1. vrai ; 2. vrai ; 3. A, B, C, D ; 4. vrai ; 5. B ; 6. vrai ; 7. vrai ; 8. vrai ; 9. A, C ; 10. vrai ; 11. A, B ; 12. A, B, C ;
13. vrai ; 14. A, B, C, D ; 15. A, B ; 16. A, B, C, D ; 17. vrai ; 18. vrai ; 19. vrai ; 20. A ; 21. A, B, C, D, E, F ; 22. faux ; 23. A, B.
- 70 -

L`accréditation en mycologie médicale

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