Gélose de BAIRD-PARKER RPF pré-coulée

Gélose de BAIRD-PARKER RPF pré-coulée
DOMAINE D’UTILISATION
La gélose de Baird-Parker avec plasma de lapin et fibrinogène (RPF = Rabbit Plasma Fibrinogen)
permet la détection et la numération directe des staphylocoques pathogènes, ainsi que leur
confirmation. Cette gélose présente l’avantage de très nettement réduire le nombre de tests de
confirmation lorsque la présence de staphylocoques à coagulase positive ne se manifeste pas de
façon évidente sous l’aspect de colonies bien typiques sur d’autres milieux sélectifs. Le milieu précoulé permet d’effectuer la confirmation des staphylocoques à coagulase positives, conformément
aux méthodes décrites dans les normes NF EN ISO 6888-3, NF V 08 057-1, et ISO 5944 / FIL 60
pour les échantillons destinés à l’alimentation humaine et animale, les échantillons de
l’environnement, et plus spécifiquement pour les produits laitiers secs. Le milieux pré-coulé peut
aussi être utilisé pour le dénombrement et la confirmation des staphylocoques pathogènes lors de la
mise en œuvre de la norme XP T 90-412 dans le cadre du contrôle des eaux.
HISTORIQUE
La production de coagulase libre, considérée comme étant le caractère principal utilisé pour la
reconnaissance de la pathogénicité des staphylocoques et notamment de Staphylococcus aureus, a
été à l’origine de la mise au point du milieu de Baird-Parker au plasma de lapin et fibrinogène. Les
premiers essais d'incorporation de plasma à des milieux de culture gélosés ont révélé des
discordances entre les résultats obtenus par le test de mise en évidence de la coagulase en tube et
la formation d'un halo caractéristique de fibrine autour des colonies. Les écarts observés résultaient
du fait que certaines souches, possédant bien une coagulase, activaient également le système
plasminogène-plasmine. Ce phénomène provoquait une fibrinolyse dont la conséquence se
manifestait par la disparition du halo. Pour pallier cette difficulté, l'addition du facteur antitrypsique
de la graine de soja a été recommandée.
En 1976, afin de favoriser la mise en évidence de la coagulase produite par Staphylococcus aureus,
Devoyod et al. ont étudié l'incorporation de plasma de porc au milieu de Baird-Parker.
Ultérieurement, Hauschild a amélioré les performances du milieu de Devoyod en y incluant du
fibrinogène bovin et le facteur antitrypsique tout en diminuant corrélativement la quantité de plasma.
En 1983, Beckers et al. ont modifié le milieu de Hauschild en remplaçant le plasma de porc par le
plasma de lapin plus classiquement utilisé pour l'épreuve de la coagulase. Ces auteurs ont
également ensemencé le milieu en profondeur contrairement à la technique antérieurement
pratiquée en double couche par Devoyod. Enfin, la formulation a été améliorée par Sawhney en
1986, au terme de son étude relative à la toxicité du tellurite de potassium vis à vis de
Staphylococcus aureus dans un milieu au plasma de lapin avec fibrinogène.
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Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 – www.biokar-diagnostics.fr
PRINCIPES
- La croissance des staphylocoques est favorisée par le pyruvate de sodium et la glycine.
- La microflore secondaire est inhibée en présence de chlorure de lithium, de tellurite de potassium
(ajouté extemporanément), ainsi que par la forte concentration en glycine.
- Le plasma de lapin a été choisi pour son excellente spécificité vis à vis de la coagulase
staphylococcique et son aptitude à produire rapidement un coagulum en formant une
staphylothrombine à partir de la prothrombine. Il est renforcé en fibrinogène bovin. La
staphylothrombine agit en coupant les fibrinopeptides A et B du fibrinogène, entraînant un
processus de polymérisation qui se traduit par l'apparition de fibrine autour des colonies.
- L'inhibiteur de trypsine extrait du soja évite la fibrinolyse.
- La coloration noire des colonies de Staphylococcus aureus est due à la réduction du tellurite de
potassium en tellure. De plus, la présence de tellurite favorise l'inhibition de la microflore
contaminante à Gram positif.
MODE D’EMPLOI
Confirmation des staphylocoques à coagulase positive dans le cadre du contrôle des échantillons
destinés à l’alimentation humaine et animale, des produits laitiers secs, et des échantillons de
l’environnement :
- A partir des tubes de bouillon de Giolitti et Cantoni avec Tween 80 (BK159, BM110 ou BM111)
incubés en conditions anaérobies à 37°C, ensemencer une öse (10 µL) de la culture obtenue sur
une boîte de milieu.
Dénombrement des staphylocoques pathogènes dans le cadre du contrôle des eaux, méthode par
filtration sur membrane :
- Déposer la membrane sur la boîte de Petri en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne s’interpose
entre la membrane et la gélose.
Retourner la boîte et incuber à 36 ± 2 °C pendant 21 ± 3 h et prolonger l’incubation jusqu’à 44 ± 4 h.
Confirmation des staphylocoques pathogènes dans le cadre du contrôle des eaux :
- Repiquer le nombre de colonies caractéristiques selon les recommandation de la norme XP T 90412, ou transférer la membrane à partir milieu Chapman au mannitol (BK030 ou BM085) ou à
partir du milieu Baird-Parker jaune d’œuf tellurite [(BK055 + BS060) ; BM018 ou BM091].
- Incuber à 36 ± 2 °C pendant 21 ± 3 h.
LECTURE / INTERPRETATION
Les staphylocoques à coagulase positive sont caractérisés par la formation de colonies grises ou
noires entourées d'un halo opaque de fibrine net, stable et bien visible. Pour effectuer un
dénombrement, procéder au comptage des boîtes.
Etant donné que le milieu entraîne une réaction à la coagulase, il n'est pas nécessaire de procéder
à la confirmation des résultats par le test de la coagulase en tube.
NOTE 1 :
Dans le cadre du contrôle des eaux, lors de la lecture à 21 ± 3 h, il est recommandé de vérifier la
présence de zones opaques caractéristiques avant de poursuivre l’incubation. En effet, une
réversion des zones opaques peut très occasionnellement se produire à 48 h.
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FORMULE – TYPE
(pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales) :
Pour 1 litre de milieu :
- Tryptone .........................................................................................9,47 g
- Extrait de viande ............................................................................4,74 g
- Extrait autolytique de levure...........................................................0,95 g
- Pyruvate de sodium .......................................................................9,47 g
- Glycine .........................................................................................11,37 g
- Chlorure de lithium .........................................................................4,74 g
- Agar agar bactériologique ............................................................14,21 g
- Plasma de lapin, EDTA ...............................................................25,0 mL
- Fibrinogène bovin ............................................................................5,0 g
- Inhibiteur de trypsine...................................................................25,0 mg
- Tellurite de potassium .................................................................25,0 mg
pH du milieu complet prêt-à-l’emploi à 25°C : 7,2 ± 0,2.
CONTRÔLE QUALITE
- Milieu en boîtes : gélose ambrée.
- Réponse culturale de croissance sur milieu complet après 48 h d’incubation à 37°C (XP CEN ISO
TS 11133-2) :
Croissance
(Rapport de
productivité : PR)
Microorganismes
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Escherichia coli
-
ATCC® 6538
ATCC 25923
ATCC 12228
ATCC 25922
PR ≥ 50%
PR ≥ 50%
ralentie, score 0-1
inhibée, score 0
Caractéristiques
Couleur des
colonies
Halo
de fibrine
noire
noire
noire
présence
présence
absence
Réponse culturale de croissance après 44 h d’incubation à 36°C (XP T 90-412 ;
NF T 90-461) :
Caractéristiques
Microorganismes
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
CIP 53.154
CCM 2541
Croissance
(Rapport de productivité)
66% ≤ R3 ≤ 150%
inhibée
Couleur des
colonies
Halo
de fibrine
noire
présence
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STOCKAGE / CONSERVATION
Milieu pré-coulé en boîtes de Petri :
- Stocker entre 2 et 14°C, à l’abri de la lumière.
- La date de péremption est mentionnée sur l’étiquette.
PRESENTATION
Code
Milieu complet pré-coulé en boîtes de Petri :
- Coffret de 20 boîtes (Ø 90 mm)
BM06708
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SUPPORT PHOTO :
Référence : BM06708
Domaine d’utilisation : La détection et la numération directe des staphylocoques à coagulase
positive.
Staphylococcus aureus
Colonie caractéristique
Couleur grise à noire
entourée d’un halo opaque
de fibrine
Gélose de Baird-Parker RPF
Réf : BM06708
Incubation 24 heures à 37°C (surface)
Colonies caractéristiques grises à noires entourées d’un halo opaque de fibrine
(réduction du tellurite et coagulation du plasma)
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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Loeb, L. 1903. The influence of certain bacteria on the coagulation of blood. Jour. Med. Res., 10: 407.
Duthie, E.S. 1954. Evidence of Two Forms of Staphylococcal Coagulase. J. gen. Microbiol., 10: 427-436.
Baird-Parker, A.C. 1962. An improved diagnostic and selective medium for isolating coagulase positive staphylococci.
Jour. of Appl. Bact., 25: 12-19.
Devoyod, J.J., Millet, L., et Mocquot G. 1976. Un milieu gélosé pour le dénombrement direct de Staphylococcus aureus:
milieu au plasma de porc pour Staphylococcus aureus (PPSA). Can. Jour. of Microbiol., 22 (11): 1603-1611.
Stadhouders, J., Hassing, F., and van Aalst - van Maren, N.O. 1976. A pour-plate method for the detection and
enumeration of coagulase-positive Staphylococcus aureus in the Baird-Parker medium without egg yolk. Neth. Milk Dairy
J., 30: 222-229.
Hauschild, A.H.W., Park, C.E., and Hilsheimer, R. 1979. A modified pork plasma agar for the enumeration of
Staphylococcus aureus in foods. Can. J. of Microbiol., 25: 1052-1057.
Beckers, H.J., van Leusden, F.M., Bindschedler, O., and Guerraz, D. 1984. Evaluation of a pour-plate system with a rabbit
plasma-bovine fibrinogen agar for the enumeration of Staphylococcus aureus in food. Can. Jour. of Microb., 30: 470-474.
Sawhney, D. 1986. The toxicity of potassium tellurite to Staphylococcus aureus in rabbit plasma fibrinogen agar. Journ. of
Applied Bacteriology. 61: 149-155.
de Buyser, M.L., Audinet, N., Delbart, M. O., Maire, M., and Françoise, F. 1998. Comparison of selective culture media to
enumerate coagulase-positive staphylococci in cheeses made from raw milk. Food microbiol. 15: 339-346.
NF EN ISO 6888-2 (V 08-014-2). Octobre 1999. Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour le dénombrement
des staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces). Partie 2 : Technique utilisant le
milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène.
ISO 5944 / FIL 60. Décembre 2001. Lait et produits à base de lait. Détection des staphylocoques à coagulase positive.
Technique du nombre le plus probable.
NF EN ISO 6888-2/A1 (V 08-014-2/A1). Décembre 2003. Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour le
dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces). Partie 2 : Technique
utilisant le milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène. Amendement 1 : Inclusion des données de fidélité.
NF V 08-057-1. Janvier 2004 (2e tirage de Décembre 2004). Microbiologie des aliments. Méthode de routine pour le
dénombrement des staphylocoques à coagulase positive par comptage des colonies à 37 °C. Partie 1 : Technique avec
confirmation des colonies.
XP CEN ISO/TS 11133-2 (V 08-104-2). Janvier 2004. Microbiologie des aliments. Guide pour la préparation et la
production des milieux de culture. Partie 2 : Guide général pour les essais de performance des milieux de culture.
NF EN ISO 6888-3 (V 08-014-3). Juin 2003 (3e tirage d’Avril 2005). Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour
le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces). Partie 3 :
Recherche et méthode NPP pour les faibles nombres.
XP T 90-412. Juin 2006. Qualité de l’eau. Recherche et dénombrement des staphylocoques pathogènes. Méthode par
filtration sur membrane.
NF T 90-461 (juillet 2001), NF T 90-461/A1 (juin 2005) et NF T 90-461/A2 (mai 2007). Qualité de l’eau. Contrôle qualité
des milieux de culture.
Les mentions portées sur l’étiquette sont prédominantes sur les formules ou les instructions décrites dans ce document.
Les informations et les spécifications contenues dans cette fiche technique ont été établies à la date du 2008-12-22.
Elles sont susceptibles d’être modifiées à tout moment, sans préavis.
Code document : BM067/F/2003-06 : 9.
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