Hybridation in situ chromosomique interphasique

Hybridation in situ
Technique d’hybridation in
chromosomique interphasique
situ sur chromosome
interphasique et exemples
Hybridation
in situ
d’applications
chromosomique interphasique
Dr Copie-Bergman et Nadine Martin
Département de Pathologie
Hôpital Henri Mondor
Créteil
DES 2007
DEFINITION
La
cytogénétique
interphasique
est
une
analyse
cytogénétique par hybridation in situ fluorescente
(FISH) sur noyaux non mitotiques avec des sondes ADN
spécifiques de chromosomes (Cremer et al; 1986).
CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE
– BASES -
• propriétés d’hybridation de l’ADN (séquences nucléotidiques
complémentaires)
• révélation du complexe sonde-cible, en règle à l’aide de sondes
fluorescentes (FISH), ou chromogéniques ou « métallographiques »
Technique FISH
• Principe
• Sondes
• Échantillons
• Méthode
PRINCIPE
SONDE
ADN marqué
CIBLE
ADN
Dénaturation Thermique
Noyaux
TAAGG
ATTCC
ADN simple brin
ADN simple brin
Hybridation spécifique
Observation au microscope
SONDES UTILISEES POUR TECHNIQUE
FISH
Sondes commercialisées
Directement couplées à un fluorochrome (CY3,TR,FITC) ou
marquées à la biotine ou digoxygénine (+2èm couche)
1- Sondes satellites :
Sondes DNA de séquences hautement répétées.
La cible sur les chromosomes comportent plusieurs centaines
ou milliers de répétitions en tandem d'un motif de bases.
•Classical satellite : répétitions AATGG dans
l'hétérochromatine des chr. 1, 9, 15, 16 et Yq distal.
•Alpha satellite :(sondes centromériques)
Répétitions en tandem de 171 pb localisées au niveau des
centromères.
•Beta satellite :
Répétitions en tandem 68 pb , sur le bras court (p) du
chromosomes 9 et des acrocentriques 13, 14, 15, 21 .
CENTROMERIQUE Y SUR SUSPENSION DE NOYAUX
2- Sondes « PAINTING »:
Mélange de multiples sondes de séquences uniques
complémentaires d’ un chromosome cible.
S'utilisent sur métaphases en cytogénétique
Marqueur chromosomique
Translocation
3- Sondes spécifiques d'une séquence unique ( un locus)
•Détection précise de translocation et d'amplification de gènes.
•Mise en évidence de délétions chromosomiques.
Exemple : locus 17q12 Amplification du gène HER2 .
4-Sondes dites "MAISON" :
-Sondes cosmidiques ou BAC:
Une séquence précise complémentaire d'un gène d’intérêt, est
insérée dans un fragment d'ADN circulaire ou cosmide.
Réplication en grand nombre dans des bactéries.
- YAC : chromosome artificiel de levure :
Séquence très longues (300 Kb)
Nécessitent une préhybridation avec de l'ADN humain total
pour neutraliser les séquences non spécifiques.
Sonde marquée
Sondes de fusion
Mise en évidence d’une translocation
Lymphome du Manteau
Interprétation de la t (11;14)
14q32 FITC, locus du gène de la chaîne lourde d'immunoglobuline
11q13 Cy3 locus gène Cycline D1
Recouvre tous les points de cassure
Noyau de cellule normale
Pas de colocalisation
Noyau de cellule tumorale
Colocalisation vert /rouge
Lymphome du Manteau
Colocalisation t(11;14)
Sonde c-MYC « split-signal »
Profil
FF
FRV
Sonde c-MYC
split
Objectif x40 zoom
Lymphome de Burkitt:t (8;14) ou ses variantes t(8;22), t(2;8)
TECHNIQUE FISH
Echantillons
•Empreintes :
-Tissus frais ou décongelés
-Frottis léger sur lames silanées super adhésives
-Séchées et fixées au Carnoy (méthanol 3V/Acide acétique1V, +4°C,5 minutes)
Rôle du Carnoy : Eliminer les cytoplasmes pour laisser les noyaux
nus.
Suspension de noyaux :
•A partir de prélèvement frais ou décongelé
-Désagréger dans PBS
-Fixer à éthanol 70 %
-Décanter
-Filtrer surnageant sur membrane.
-Fixer au Carnoy
-Dépôt de 10 µl de suspension
• A partir de coupes épaisses de paraffine 3X20 microns
-Déparaffiner
-Désagréger mécaniquement dans éthanol 50%
-Digestion Protéinase K (30’ à 37°C)
-Rincer PBS ,centrifuger,suspendre dans 100 µl PBS
-Centrifuger et Fixer au Carnoy ,déposer
TETRASOMIE 7 DANS TUMEUR UROTHELIALE SUSPENSION DE
TETRASOMIE
NOYAUX
(Tissu congelé) 7 DANS TUMEUR UROTHELIALE
Coupes congélation
- 6 µm sur lames silanées
- Fixer 5 mn au Carnoy froid (méthanol 3V +acide acétique 1V)
- Stockées à -20 °C
- Post-fixées au paraformaldéhyde 4 % dans PBS avant usage
Coupes paraffine
-fixateur : formol
- 3 à 6 µm sur lames silanées
- Prétraitement micro-ondes
- Digestion protéolytique ++
PRECAUTION:
SUR COUPES, LES NOYAUX SONT TRONQUES , avec PERTE DE SIGNAUX
Il faut établir des seuils sur tissus normaux
CENTROMERIQUE X SUR COUPE PARAFFINE DE PEAU
Principales Etapes de la technique
Prétraitement pour Coupes paraffines:
-Déparaffiner au Xylène
-Réhydrater dans série décroissante d’Ethanol
-Traitement au micro-onde dans un tampon (citrate)
Pour rompre les liaisons covalentes de fixation.
-Thiocyanate de Sodium 1M 80°C
Ou produit de prétraitement commercial.
•Digestion protéolytique :
-Hydrolyser les protéines nucléaires
-Favoriser l'accès de la sonde
-Pepsine dans HCL ou protéinase K
-+/-10mn à 37°C
-Conditions à adapter au type d'échantillon
-Compromis entre préservation du tissus et pénétration de la
sonde
Préparation des sondes :
-Décongeler quelques minutes
-Diluer selon recommandations du fournisseur.(1/10)
-Préparer 10 µl par lame
dans un milieu d'hybridation (MIX)
contenant du 2SSC (Salt Sodium Citrate buffer)
et formamide à 50%.
Dénaturation : Séparation des deux brins d’ADN
-Co-dénaturation : Noyaux cibles et sondes dénaturés ensemble
-Déshydrater à l’éthanol et sécher les lames
-Appliquer 10 µl de sonde sur la zone d’intérêt
-Recouvrir d’une lamelle 24X24
-Sceller à la colle
-Placer la lame à 82°C pendant 5 minutes .(conditions selon sonde)
Plaque chauffante ou Etuve ou Hybridizer.
-Dénaturations Séparées :
-Technique classique au Bain-Marie
-But : préservation des noyaux (tissus fragiles)
-Lames mises 2’ à 72 ° C dans formamide à 70%/ 2SSC
Puis rincer 2SSC et déshydrater à 4°C .
-La sonde dénaturée 5’ à 85°C puis placer dans la glace.
-Appliquer10 µl de sonde sur la zone d’intérêt
-Recouvrir d’une lamelle 24X24
Préhybridation pour les sondes cosmidiques, BAC, YAC
-ADN de placenta humain ajouté au milieu d'hybridation
-Dénaturation 85°C
-Préhybridation 37°C 1H pour neutraliser les séquences non
spécifiques de la sonde avant de l ‘appliquer .
•Hybridation : appariement sonde/cible
-Une nuit (16H minimum) en chambre humide ou hybridizer.
-Température selon type de sonde
-37°C sondes centromériques
-45°C sondes pour translocation
•Rinçages stringents:
Rôle : Eliminer les hybridations non spécifiques
température
% de formamide
stringence
.
concentration en sels (Na)
Exemple pour sondes centromériques:
0,4SSC 72°C 2’
ou
2 SSC/50% formamide 37°C 2X5’
Détection:
-Par Immunofluorescence directe ou indirecte
Sonde couplée à un fluorochrome
Objectif X40
Sonde-DIG+anti-DIG/FITC
Objectif X100
FISH Multi-couleurs
Halling et al, Human Path 2007
C.I.S.H.
Chromogenic in situ Hybridisation
Technique indirecte
• Sonde marquée à la Biotine
• Liaison avec Streptavidine couplée Péroxydase
• Chromogène : Diaminobenzidine (DAB)
DAB
Streptavidine-PER
Sonde marquée à la biotine
C.I.S.H
Chromogenic in situ Hybridisation
Sonde HER2 biotinylée
+Streptavidine/Per
+DAB
Pas d'amplification du gène
amplification HER2 >10 spots
amplification HER2 avec des clusters
S.I.S.H
Tissu sain : 2 signaux par noyaux
Tumeur : amplification du gène
Powell et al, Human Pathol, 2007
Double marquage du gène HER2 par S.I.S.H
et de la protéine HER2 par I.H.C
Amplified for HER2 by FISH
Amplified for HER2 by FISH
3+ immunostaining by IHC.
1+ immunostaining by IHC.
Powell et al, Human Pathol, 2007
LECTURE :
-Microscope à Fluorescence (100W mini)+3 filtres
-Equipé d’une caméra et logiciel d’acquisition,
superposition et traitement d’images.
-Aspect des noyaux (iodure de propidium ou
dapi)
-Intensité du signal
-Bruit de fond
-Comptage des signaux ( 100 à 200 noyaux)
-Se fait sur photos de plusieurs champs.
-Etablir un seuil de positivité sur tissu normal.
APPLICATIONS
Maladies génétiques acquises (+++)
Cancérologie
I. Anomalies chromosomiques de « nombre »
Tumeurs de vessie
monosomie du 9p21
polysomies 3, 7
Cancer de la prostate
perte du Y, monosomies 10
Lymphome de la zone marginale de type MALT
Trisomie 3, 18
Tumeurs mammaires
amplification de HER 2
Exemple: amplification de l’oncogène HER2 et
cancer du sein
• HER2/neu (Human epidermal growth factor
receptor 2) = membre d’une famille de gènes
codant pour des récepteurs transmembranaires de
facteurs de croissance (EGFR, HER2, HER3,
HER4)
• Partie intracytoplasmique de HER2 a une activité
tyrosine kinase Æ rôle dans la croissance et
différenciation cellulaire
• Amplification de l’oncogène HER2 (Chr 17) induit
une augmentation de l’expression de HER2 à la
surface des cellules tumorales de cancer du sein
Amplification de l’oncogène HER2 et cancer
du sein
• les cancers HER2+ ont un pronostic plus péjoratif
que les cancers du sein HER2-: tumeurs de haut
grade, métastases ganglionnaires, résistance à
certains types de chimiothérapie, récidive….
• Détermination du statut HER2: FISH et/ou
immunohistochimie
• Applications thérapeutiques: anticorps monoclonal
humanisé anti-HER2 réservé aux cancers avec
amplification de HER2
FISH double couleur
CEN 17 et HER2
C.I.S.H
Chromogenic in situ Hybridisation
Sonde HER2 biotinylée
+Streptavidine/Per
+DAB
Pas d'amplification du gène
amplification HER2 >10 spots
amplification HER2 avec des clusters
S.I.S.H
Tissu sain : 2 signaux par noyaux
Tumeur : amplification du gène
Powell et al, Human Pathol, 2007
Wolff, JCO 2007
II. Anomalies chromosomiques de structure
• Délétions (del)
17p13 (locus du gène P53) dans les tumeurs du sein
• Inversions (inv)
2 cassures suivies d’un recollement après inversion du
segment chromosomique
• Duplications (dup)
duplication d’un segment au sein d’un même chromosome
Anomalies chromosomiques de structure
• Isochromosomes
2 bras identiques aux 2 extrémités (2 courts ou 2 longs)
• Translocations (t) chromosomiques
définition=cassure et déplacement d’un fragment de
chromosome sur un autre chromosome
- « spécifiques » de certaines tumeurs
- « marqueur » diagnostique et évolutif
- exemples: lymphomes
- # méthodes de détection dont la FISH
EXEMPLES D’APPLICATIONS DU FISH
DANS LES LYMPHOMES
• exemple de translocation: t(11;18) et lymphome du
manteau
•Anomalies de structure et/ou de nombre: le lymphome
T γδ et l’isochromosome 7q
• déterminer l’origine receveur ou donneur d’un
syndrome lymphoprolifératif dans un contexte de
transplantation de moelle ou d’organe
Lymphome
Définition= prolifération tumorale maligne lymphoïde
¾ Atteinte privilégiée des
organes hématopoïétiques
¾ Hétérogénéité histologique
d’importance clinique et
thérapeutique
¾ Tumeurs chimiosensibles
(globalement 50% de guérison)
OUTILS DIAGNOSTIQUES
• ETUDE MORPHOLOGIQUE
• IMMUNOHISTOCHIMIE
Anticorps, méthodes sensibles
• MOLECULAIRES
Southern Blot
PCR
In situ hybridization
• CYTOGENETIQUE
Translocations chromosomiques et lymphomes
Lymphome
Translocation récurrente
Gènes
Burkitt
t(8;14)(q24;q32)
t(2;8)(p12;q24)
t(8;22)(q24;q11)
MYC/IGH
IGK/MYC
MYC/IGL
Folliculaire
t(14;18)(q32;q21)
t(3;14)(q27;q32)
BCL2/IGH
BCL6/IGH
Manteau
t(11;14)(q13;q32)
CCND1/IGH
Lymphome Diffus à grandes
cellules B (LDGCB)
t(3;14)(q27;q32)
t(14;18)(q32;q21)
BCL6
BCL2
Zone marginale de type MALT
t(11;18)(q21;q21)
t(14;18)(q32;q21)
t(1;14)(p22;q32)
API2/MALT1
IGH/MALT1
BCL10/IGH
Anaplasique
t(2;5)(p23;q35)
NPM/ALK
variants
Mise en évidence d’une translocation
• Cytogénétique conventionnelle
+ cytogénétique moléculaire (FISH)
• Southern blot
• PCR ADN
• FISH
• mise en évidence de la conséquence d’une translocation:
- RT-PCR (compétitive, ou quantitative)
- IHC (Ex: cycline D1, ALK …)
- utile/indispensable au Dc, suivi
- choix dépend de réactivité IHC(anticorps, fixateur), congélation
- spécificité
Exemple 1
Lymphome du manteau et t(11;14)
Classification des lymphomes B à petites cellules
Lymphome du manteau
Lymphome de la zone marginale
CD5-, CD10-, CD23-, m+, d-/+
CD5+, CD10-, CD23-, m+, d-/+
Lymphome folliculaire
CD5-, CD10+,
CFD+
Follicule lymphoïde
Le lymphome du manteau
•
Clinique
stade disséminé, atteinte amygdalienne fréquente
atteinte digestive (polypose lymphomateuse)
mauvais pronostic
•
Morphologie
architecture nodulaire ou diffuse
lymphocytes de petite taille, monomorphe
•
Phénotype B
CD20+, CD5+, CD10-, CD23-, IgD+, Bcl2+
Réseau de cellules folliculaires dendritiques
Bcl1+
•
Cytogénétique
t(11;14)(q13;q32)(CCND1/IGH)
Æ hyperexpression de la cycline D1 (Bcl1)
POLYPOSE LYMPHOMATEUSE
Lymphome du manteau
Lymphome du manteau
CD20
CD10
CD5
BCL2
Etude de l’hyperexpression de la cycline D1 par
immunohistochimie
Bcl1
Bcl1
Mise en évidence d’une translocation t(11;14)
(CCND1;IGH)
• PCR ADN
• FISH
•
mise en évidence de sa conséquence:
- RT-PCR (compétitive, ou quantitative)
- IHC (Ex: cycline D1, ALK …)
- utile/indispensable au Dc, suivi
- choix dépend de réactivité IHC(anticorps, fixateur), congélation
- spécificité
Etude du réarrangement du gène CCND1 par PCR (ADN)
BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936: PCR-based clonality studies
PCR analysis of BCL1 gene rearrangements
CCND1 gene
123 kb
BCL1/MTC
MTC region (85bp) (~41% of BCL1 breakpoints)
BCL1/MTC primer
5'
3'
GGATAAAGGCGAGGAGCATAA
IGH gene
JH segments
JH primer
3'
5'
CCAGTGGCAGAGGAGTCCATTC (+57) JH consensus
FISH avec une sonde « split » CCND1
Lymphocyte normal
Mise en évidence d’une translocation
t(11;14)
par FISH
• FISH sur chromosomes en
métaphases
Æ cytogénétique moléculaire
• FISH interphasique
- appositions de cellules
tumorales
- coupes tissulaires fixées et
inclus en paraffine
FISH
interphasique
Sondes « split »
Split CCND1
Mise en évidence d’une translocation t(11;14)
(CCND1/IGH)
• PCR ADN
• FISH
• Éventuellement, mise en évidence de sa conséquence:
- RT-PCR (compétitive, ou quantitative)
- IHC : Bcl1
Exemple 2
Lymphome T γδ hépatosplénique
Isochromosome 7q
LYMPHOMES T γδ hépatospléniques
TIA1
CD3
I Wlodarska et al Genes Chromosomes Cancer, 2002
i(7q)
i(7q)
7p22
7q35
7p15
7q22
exemple 3
Déterminer l'origine, donneur ou receveur, d'un
syndrome
lymphoprolifératif
post-transplantation
après allogreffe avec un donneur de sexe opposé.
(ex: recherche du chromosome Y dans le lymphome
d'une femme dont le donneur de greffe est un homme)
Mr R...27 ans
• Diagnostic de SCID à la naissance
• « SCID » (Severe Combined Immunodeficiency)
Groupe d’affections héréditaires caractérisées par un blocage de
la différenciation des lymphocytes T, un développement anormal
des lignées B et NK et plus rarement des lignées myéloïdes
• mutation homozygote du gène Rag 1 contrôlant la recombinaison
spécifique des gènes du TCR et des gènes d’Ig
• Allogreffe géno-identique à l’âge d’un mois (sœur aînée donneuse)
• Diagnostic de LNH gastrique à grandes cellules B découvert à
l’occasion de brûlures gastriques
Aspects morphologiques et immunohistochimiques
HES
BCL2
CD20
Mib1
ETUDE EN FISH INTERPHASIQUE
(Mr R, 27 ans, déficit immunitaire congénital, greffé
allogénique)
Tumeur
sonde X
sonde Y
Muqueuse saine
Conclusion
• Applications multiples
- identification de certaines tumeurs
translocations
spécifiques
- origine de la tumeur chez les transplantés
- suivi maladie résiduelle
associées
à
des
• Avantages
- possibilité de travailler sur des prélèvements frais ou inclus
en paraffine
• Limites
- temps de préparation des échantillons et d’hybridation (O/N)
- difficultés d’interprétation quand la préservation des
échantillons n’est pas optimum (mode de fixation, mauvaise
congélation…)
- coût des sondes +++ équipement (microscope à fluorescence)
Fishing is possible!