Biotechnologie et santé animale
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Biotechnologie et santé animale
Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1993,12 (2), 355-368 Biotechnologie et santé animale Ph. D E S M E T T R E * e Résumé : Si le développement par Louis Pasteur, à la fin du XIX siècle, des premiers vaccins destinés à l'animal, représente le premier apport de la biotechnologie à la santé animale, ce n'est que beaucoup plus récemment que des progrès décisifs ont été accomplis tant pour le dépistage des maladies infectieuses ou parasitaires que pour leur prévention. En effet, les récents progrès des connaissances permettent d'envisager le développement d'un ensemble de moyens dont la mise en œuvre conditionnera la santé de l'animal domestique ou sauvage, assurera le bien-être de l'animal de compagnie, développera la performance de l'animal de sport et améliorera la production de l'animal de rente tout en participant à la protection de la santé de l'Homme. De tels progrès résultent de l'application, toujours plus rapide, des connaissances acquises dans les sciences de la matière en même temps que dans les sciences de la vie, qui, toutes, participent au caractère multidisciplinaire de la biotechnologie. Il en est ainsi du renouvellement rapide des réactifs et des techniques de diagnostic qui allient spécificité, sensibilité, reproductibilité, rapidité de mise en œuvre et robustesse, et qui bénéficient des plus récentes découvertes de l'immunologie, de la biochimie ou de la biologie moléculaire : anticorps monoclonaux, sondes nucléiques ou amplification de l'acide désoxyribonucléique, pour ne citer que les principales. De même, la mise au point de nouveaux vaccins alliant efficacité, durée de protection, innocuité, stabilité, polyvalence et simplicité d'administration (vaccins de sous-unités, vaccins de recombinaison génétique, vaccins synthétiques, vaccins anti-idiotypes) résultent des plus récents progrès de l'immunologie, de l'immunochimie, de la biologie moléculaire et de la biochimie. Enfin, la mise à disposition de nouvelles molécules à activités thérapeutiques anti-infectieuses, anti-parasitaires ou immunomodulatrices capables de stimuler les défenses spécifiques et non spécifiques de l'organisme, sont une autre illustration des applications actuelles et futures de la biotechnologie à la santé animale. Les nouvelles techniques de diagnostic, les nouveaux vaccins ou les nouvelles molécules thérapeutiques ne représentent cependant que les applications les plus immédiates de connaissances dont la portée laisse entrevoir, à terme, l'obtention d'animaux transgéniques dont le potentiel génétique se trouvera dûment recensé en même temps que ces animaux seront rendus spontanément résistants aux maladies et que leurs performances zootechniques seront développées. Directeur recherche et développement, Rhône-Mérieux, 254, rue Marcel-Mérieux, 69007 Lyon, 356 Protéger la santé de l'Homme et préserver son environnement en assurant la santé et le bien-être de l'animal représentent l'ultime enjeu de la biotechnologie appliquée à la santé et aux productions animales. MOTS-CLÉS : Animaux transgéniques - Biotechnologie - Réactifs de diagnostic - Santé animale - Thérapeutiques - Vaccins. INTRODUCTION E n s e m b l e des techniques qui visent à l'exploitation des micro-organismes, des cellules animales et végétales, et de leurs constituants, la biotechnologie, d o n t les origines se confondent avec l'origine de l'humanité, a trouvé ses premières applications en santé animale avec les travaux de Louis Pasteur à la fin du siècle dernier. C'est, en effet, avec le d é v e l o p p e m e n t des premiers vaccins préparés à partir de micro-organismes dont le pouvoir pathogène était artificiellement atténué par culture (fièvre charbonneuse, choléra aviaire, rouget du porc, rage) que la biotechnologie trouvait ses premières applications en santé animale en m ê m e temps que naissait le concept de vaccinologie. Accompagnant les progrès de la microbiologie et de l'immunologie, d'autres vaccins de maladies virales ou bactériennes ont été développés au cours de la première moitié du siècle : vaccins préparés à partir de micro-organismes ou de leurs toxines inactivés et formulés en présence de substances adjuvantes de l'immunité, et vaccins préparés à partir de micro-organismes de pouvoir p a t h o g è n e a t t é n u é ; ce d é v e l o p p e m e n t des vaccins n'a été possible que grâce au développement concomitant des techniques de culture des tissus ou des cellules d'origine animale. A u milieu du siècle, la découverte des antibiotiques, produits du métabolisme de différents micro-organismes, devait modifier très sensiblement les conditions de lutte contre les maladies animales d'origine bactérienne ou fongique. Ce n'est toutefois que b e a u c o u p plus r é c e m m e n t q u ' u n certain n o m b r e de découvertes de caractère multidisciplinaire mais résultant principalement des progrès de la biochimie, de la biologie moléculaire et de l'immunologie, allaient jouer un rôle décisif dans le diagnostic, la p r é v e n t i o n et la lutte contre les principales maladies animales infectieuses ou parasitaires. Parmi ces découvertes, il convient de mentionner la structure de l'acide désoxyribonucléique (ADN) support de l'hérédité, la structure et la synthèse des protéines, la recombinaison génétique de l'ADN et la fusion cellulaire à l'origine de l'obtention des anticorps monoclonaux. Les différents apports de ces importantes découvertes et, plus généralement, des plus récents d é v e l o p p e m e n t s de la biotechnologie au diagnostic, à la prévention et au traitement des maladies animales seront successivement envisagés en même temps que seront passées en revue quelques-unes de leurs principales applications futures. BIOTECHNOLOGIE ET DIAGNOSTIC A u plan général, le diagnostic des maladies infectieuses, virales ou bactériennes et des maladies parasitaires repose sur la mise en évidence de l'agent ou de certains de ses 357 constituants (diagnostic direct) ou sur la mise en évidence des éléments de la réponse immunitaire induite par les antigènes portés par cet agent (diagnostic indirect). Diagnostic direct Pour le diagnostic direct, les techniques les plus classiquement utilisées (mise en évidence m a c r o s c o p i q u e ou m i c r o s c o p i q u e directe de l'agent ou après coloration incluant l'utilisation de marqueurs fluorescents, culture, isolement, caractérisation, etc.) cèdent p r o g r e s s i v e m e n t le pas à de nouvelles t e c h n i q u e s plus spécifiques et plus sensibles. Parmi celles-ci figurent les techniques immuno-enzymatiques, qui reposent sur la mise en évidence des déterminants antigéniques portés par l'agent recherché au moyen d'anticorps spécifiques m a r q u é s p a r des enzymes destinées à révéler la formation des complexes antigènes-anticorps. Ces complexes sont révélés par l'activité enzymatique qu'ils portent, l'action de l'enzyme sur un substrat approprié transformant ce dernier en un produit coloré, facilement visualisable. La spécificité et la sensibilité de ces techniques peuvent se trouver considérablement accrues par l'utilisation d'anticorps monoclonaux obtenus par la fusion d'une cellule productrice d ' u n anticorps monospécifique (plasmocyte B) avec u n e cellule lui a p p o r t a n t l'immortalisation et la sécrétion ( m y é l o m e ) . D e m ê m e , la sensibilité de ces t e c h n i q u e s p e u t se t r o u v e r a u g m e n t é e p a r l ' u t i l i s a t i o n d ' u n m a r q u e u r chimioluminescent en lieu et place d'un marqueur enzymatique. Plus récemment, les progrès réalisés dans la connaissance des acides nucléiques ont permis d'envisager la mise au point de techniques de diagnostic direct basées non plus sur la recherche de l'agent infectieux ou parasitaire et de ses constituants antigéniques, mais sur la mise en évidence du m a t é r i e l g é n é t i q u e , A D N ou acide r i b o n u c l é i q u e (ARN), porté par ces agents. Grâce à la propriété d'appariement des bases qui constituent le code génétique, les techniques d'hybridation de l ' A D N ou de l ' A R N utilisent des fragments d'acide nucléique obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse (oligonucléotides) et qui sont choisis pour leur spécificité, c'est-à-dire pour leur propriété de n'être présents que sur le génome de l'agent recherché. Après avoir marqué l'oligonucléotide ou sonde nucléique au moyen d'un marqueur approprié (radioélément, enzyme, fluorochrome, etc.), il est possible de mettre en évidence son hybridation spécifique avec le génome de l'agent recherché (préalablement extrait et préparé en vue de cette hybridation). D e telles techniques, dont la sensibilité dépend, pour une large part, du nombre de copies de génome présentes dans le milieu réactionnel, trouvent également leurs limites dans les variations de spécificité induites par les conditions de l'hybridation qui peuvent conduire au mésappariement des bases. Un progrès décisif pour la mise en évidence des matériels génétiques portés par les agents est représenté par la technique dite d'«amplification en chaîne par polymérase», plus connue sous la dénomination anglaise de «polymerase chain reaction» (PCR). Cette technique repose sur l'amplification de séquences nucléotidiques spécifiques portées par le génome de l'agent recherché et met en œuvre l'activité d'une enzyme, l'ADN polymérase, capable de synthétiser des brins complémentaires d ' A D N compris entre deux oligonucléotides ou amorces, choisis pour leur spécificité et introduits dans le milieu réactionnel de telle sorte qu'ils puissent s'hybrider spécifiquement au génome de l'agent préalablement extrait. L'avantage principal de cette technique réside dans le fait qu'elle met en œuvre de multiples cycles d'amplification du même fragment d'acide 358 nucléique délimité par les amorces, permettant ainsi d'obtenir des quantités suffisantes de ce fragment p o u r le m e t t r e d i r e c t e m e n t en évidence, par é l e c t r o p h o r è s e (visualisation du fragment amplifié sous forme d ' u n e b a n d e spécifique) ou p a r hybridation avec une sonde spécifique marquée. D ' u n e extrême sensibilité, cette t e c h n i q u e p e u t être également d ' u n e g r a n d e spécificité qui dépend notamment de la nature des amorces utilisées. Toutes ces techniques, dont certaines (hybridation, amplification de gène) relèvent encore du laboratoire spécialisé et du diagnostic individuel, sont désormais disponibles sous forme de trousses (kits) fournissant tous les éléments nécessaires à la réaction. Nul doute que, dans un proche avenir, leur utilisation au moyen d'automates les destinera au diagnostic de masse en même temps que leur simplification les rendra accessibles au laboratoire non spécialisé ou au praticien. Diagnostic indirect Pour le diagnostic indirect, les techniques classiquement utilisées pour la mise en évidence des anticorps (agglutination r a p i d e , agglutination lente, fixation du complément, inhibition de l'hémagglutination, neutralisation, etc.); bien qu'encore très largement utilisées y compris comme techniques de référence, cèdent progressivement le pas aux techniques immuno-enzymatiques souvent plus spécifiques et surtout plus sensibles. Les techniques de diagnostic indirect sont basées, c o m m e les techniques de diagnostic direct, sur la mise en évidence de complexes antigènes-anticorps. Dans le cas du diagnostic indirect, les complexes sont formés entre le ou les antigènes de spécificité connue, apportés dans la réaction (virus, bactéries, parasites, etc., ou leurs extraits) et les anticorps éventuellement présents dans l'échantillon (sérum, lait, etc.) soumis à l'analyse. D a n s ce cas, les complexes antigènes-anticorps formés peuvent être révélés par différentes techniques, qui utilisent toutes des m a r q u e u r s enzymatiques engagés secondairement dans des réactions enzymes-substrats se traduisant par l'apparition de produits colorés. Les complexes antigènes-anticorps p e u v e n t é g a l e m e n t être révélés au m o y e n d'anticorps anti-anticorps de l'espèce animale ayant fourni l'échantillon à analyser, ces anti-anticorps étant eux-mêmes m a r q u é s par une enzyme. D a n s d ' a u t r e s cas, la révélation est assurée par la mise en évidence d'une compétition survenue entre les anticorps dont on recherche la présence dans l'échantillon à traiter et des anticorps de même spécificité, de préférence monoclonaux, choisis pour leur affinité pour l'antigène et marqués par une enzyme. Dans le test indirect, la présence des anticorps spécifiques dans l'échantillon analysé se traduit par l'apparition d'un produit coloré résultant de la dégradation du substrat par l'enzyme, alors que, dans le test par compétition, c'est l'absence d'apparition du produit coloré qui traduit la positivité de la réaction. Comme dans le cas du diagnostic indirect, le marquage des anticorps révélateurs (anti-anticorps ou anticorps e n t r a n t en compétition) peut se faire au moyen de radioéléments ou de composés chimioluminescents, ce qui rend la réaction plus sensible sinon plus spécifique. 359 E n m a t i è r e de diagnostic indirect, un p r o g r è s décisif a été accompli p a r le développement de vaccins p r é p a r é s à partir de micro-organismes n ' e x p r i m a n t pas certains des d é t e r m i n a n t s antigéniques n o r m a l e m e n t p r é s e n t s sur les souches pathogènes sauvages, et de réactifs de diagnostic p e r m e t t a n t de m e t t r e en évidence l'absence de réponse immunitaire post-vaccinale vis-à-vis de ces antigènes. D e telles approches, qui p e r m e t t e n t de distinguer les animaux vaccinés des animaux infectés (diagnostic différentiel), laissent envisager l'éradication des maladies sous couverture vaccinale, éradication r e n d u e j u s q u ' a l o r s impossible en raison de l'équivalence du marquage sérologique des animaux vaccinés et infectés. L'apport de la biotechnologie au diagnostic indirect, reposant sur la mise en évidence des c o m p o s a n t e s cellulaires de la r é p o n s e i m m u n i t a i r e , doit être souligné, avec l'utilisation des tests in vivo qui r e c h e r c h e n t un état d'hypersensibilité r e t a r d é e ( i n t r a d e r m o r é a c t i o n s ) p o u r le diagnostic de n o m b r e u s e s infections virales ou bactériennes et d'infestations parasitaires. A ces tests, il convient maintenant d'ajouter les tests in vitro qui s'adressent aux différents éléments cellulaires de la r é p o n s e immunitaire en révélant leur niveau de sensibilisation à des antigènes spécifiques (test de cytotoxicité lymphocytaire par exemple). BIOTECHNOLOGIE ET VACCINS Ainsi qu'il a été précédemment indiqué, depuis les travaux de Louis Pasteur et le développement des premiers vaccins destinés à l'animal et préparés à partir de microorganismes dont le pouvoir pathogène se trouvait atténué par cultures successives en conditions dysgéniques (vaccins vivants), de n o m b r e u x autres vaccins ont été développés, soit à p a r t i r de micro-organismes a t t é n u é s , soit à partir de microorganismes inactivés par l'action d'agents physiques ou chimiques (vaccins inactivés). Dans ce dernier cas, les vaccins sont formulés en présence de substances adjuvantes de l'immunité destinées à potentialiser la réponse immunitaire induite. Les vaccins vivants, les vaccins de sous-unités et les vaccins p r é p a r é s à partir de produits du métabolisme des micro-organismes tels que les toxines, ont très largement bénéficié des progrès de la biotechnologie, notamment pour ce qui concerne les moyens de culture en masse des micro-organismes, les conditions de leur récolte et de leur purification et les conditions de leur stabilisation p a r congélation ou lyophilisation (vaccins vivants) ou encore de leur inactivation et de leur formulation en présence d'adjuvants de l'immunité (vaccins inactivés ou vaccins préparés à partir d'anatoxines). Dans ce domaine, les progrès les plus décisifs ont été réalisés avec le développement de la culture en masse des cellules animales et plus p a r t i c u l i è r e m e n t des lignées cellulaires qui ont permis la multiplication des virus ou des parasites à l'échelle industrielle. D e la m ê m e m a n i è r e , les vaccins b a c t é r i e n s ont très l a r g e m e n t bénéficié de l'amélioration des cultures en masse rendues notamment possibles par l'utilisation de fermenteurs. Plus récemment, les progrès de la biochimie microbienne et de l'immunochimie ont permis l'obtention des vaccins de sous-unités préparés à partir de fractions de microorganismes, purifiées de m a n i è r e à ne r e t e n i r que les fractions i m m u n o g è n e s protectrices, à l'exclusion des fractions susceptibles d'induire des effets adverses tels 360 que des réactions locales ou générales liées au développement ou à la révélation d'un état d'hypersensibilité. Le développement de tels vaccins, qui représentent un incontestable progrès, n'a été rendu possible que par la mise en œuvre de p r o c é d é s de concentration, de fractionnement et de purification (Chromatographie) utilisables à l'échelle industrielle. Ces vaccins, qui ne comportent que certains des antigènes viraux, bactériens ou parasitaires, fournissent, en outre, les bases d'un diagnostic différentiel des animaux vaccinés ou infectés. Vaccins de recombinaison génétique Les progrès les plus récents accomplis dans le d o m a i n e des vaccins t i e n n e n t à l'utilisation des techniques de recombinaison génétique, c'est-à-dire à la possibilité de modifier le patrimoine génétique d'un organisme vivant par insertion dans son génome de l'information génétique codant pour une nouvelle fonction (gène). Rendue possible par l'universalité du code g é n é t i q u e , la recombinaison g é n é t i q u e p e r m e t ainsi l'intégration, dans le génome de micro-organismes (virus, bactéries, levures) ou de cellules de mammifères, de l'information g é n é t i q u e qui code p o u r la synthèse d'antigènes différents de ceux normalement portés par ces mêmes organismes. Ainsi, lorsque ces micro-organismes se multiplient ou, dans le cas des virus, sont multipliés par des systèmes cellulaires appropriés, ils induisent la synthèse, en même temps que celle de leurs propres constituants, des antigènes qui c o r r e s p o n d e n t à l'information génétique nouvellement intégrée dans leurs génomes. D e telles techniques de recombinaison génétique peuvent également être mises à profit p o u r la délétion d ' u n e information g é n é t i q u e n o r m a l e m e n t p o r t é e p a r un génome. Il en résulte l'obtention de micro-organismes recombinés qui n'expriment plus certains des antigènes normalement présents sur les souches parentales ou sauvages. De tels micro-organismes se p r ê t e n t alors parfaitement à la p r é p a r a t i o n de vaccins permettant la différenciation entre animaux vaccinés et infectés. En outre, la délétion par recombinaison génétique de gènes codant pour des facteurs de pathogénicité ou pour des fonctions métaboliques en relation avec le pouvoir p a t h o g è n e des microorganismes p e r m e t la construction de souches microbiennes ayant un pouvoir pathogène atténué et utilisables pour la préparation de vaccins vivants. Dans un certain nombre de cas, la délétion peut elle-même être accompagnée par l'insertion, en lieu et place du gène délété, d'un ou de plusieurs gènes codant pour de nouvelles fonctions : synthèse d'une protéine utilisable comme marqueur de souche ou comme m a r q u e u r de vaccination, ou synthèse de n o u v e a u x antigènes p r o t e c t e u r s provenant d'un micro-organisme différent. Les applications p o t e n t i e l l e m e n t les plus larges de la recombinaison g é n é t i q u e résident dans l'obtention de nouvelles souches de micro-organismes ou de cellules intégrant dans leurs génomes des gènes codant pour de nouveaux antigènes protecteurs. Ces souches peuvent alors être utilisées pour la préparation de vaccins vivants ou de vaccins de sous-unités. D a n s le cas des vaccins vivants, des souches vaccinales p r é s e n t a n t un pouvoir pathogène atténué, soit spontanément, soit par mutation induite, sont utilisées comme vecteurs. Ces vecteurs, dont le génome doit, de préférence, être constitué d ' A D N afin de faciliter la recombinaison génétique, peuvent être soit des virus, soit des bactéries. 361 Dans le cas des virus, les vecteurs les plus classiquement utilisés sont les poxvirus et plus particulièrement le virus de la Vaccine, les herpèsvirus et les adénovirus. Si chacun des vecteurs potentiels p r é s e n t e un certain n o m b r e d ' a v a n t a g e s et d'inconvénients, liés notamment au pouvoir pathogène résiduel des souches utilisées, à leur tropisme, à leur capacité d'intégrer de larges séquences génomiques étrangères ou encore au statut immunitaire des principales espèces animales cibles vis-à-vis des virus vecteurs, les principaux développements à ce jour ont été obtenus avec les poxvirus et en particulier le virus de la Vaccine. L'exemple le plus significatif est celui du développement d'un vaccin antirabique utilisable pour la vaccination orale de la faune sauvage et préparé à partir d'un virus de la Vaccine recombiné, intégrant dans son génome l ' A D N complémentaire du gène qui code pour la glycoprotéine qui est l'antigène p r o t e c t e u r du virus r a b i q u e . Ce virus recombiné, qui a fait l'objet d'études extensives portant sur son innocuité établie sur plus de 50 espèces domestiques ou sauvages de mammifères ou d'oiseaux, et sur son activité pour les espèces cibles (renard roux, raton laveur, mouffette, mais aussi chien et chat), est actuellement en essais élargis sur le terrain, tant en E u r o p e (Belgique et France) qu'aux Etats-Unis d'Amérique. A ce titre, il représente le premier exemple de dissémination volontaire élargie d'un organisme génétiquement modifié o b t e n u par insertion d'un gène étranger dans le génome d'un virus vecteur. D'autres poxvirus recombinés, utilisant soit le virus de la Vaccine ou des vecteurs dérivés, soit des poxvirus aviaires (virus de la variole aviaire chez la poule, le pigeon ou le canari), soit des poxvirus d ' a u t r e s espèces animales (virus de la variole porcine, poxvirus du raton laveur, virus de l'ecthyma du mouton ou poxvirus de la chèvre), sont actuellement en cours de développement. O u t r e les n o u v e a u x vaccins a n t i r a b i q u e s , les virus r e c o m b i n é s r e p r é s e n t e n t la possibilité de développer des vaccins aussi divers que ceux de la rhinopneumonie et de la grippe équines, de la maladie d'Aujeszky du porc, de la leucémie et du syndrome d'immunodéficience félines, ou de la maladie de Newcastle et de la maladie de Marek des volailles. La r e c h e r c h e p o r t a n t sur l'utilisation d ' a u t r e s virus vecteurs, bien q u e moins avancée, présente suffisamment d'intérêt potentiel pour justifier d'assez nombreuses études. C'est le cas de l'utilisation des herpèsvirus responsables de la rhinotrachéite infectieuse bovine ou de la maladie d'Aujeszky du porc et plus généralement de tous les herpèsvirus animaux, sans oublier l'herpèsvirus du dindon utilisé pour la vaccination contre la maladie de Marek, ou encore l'herpèsvirus responsable de la laryngotrachéite infectieuse aviaire. Les principales cibles vaccinales révélées à ce j o u r sont la peste porcine classique, la maladie de Newcastle et la bursite infectieuse. Pour les adénovirus, bien que les travaux soient d'une importance plus limitée, les principaux résultats obtenus à ce jour ont porté sur l'utilisation d'un adénovirus humain de type 5 et d'un adénovirus canin de type 1 pour l'obtention de vaccins antirabiques. Dans le domaine des vecteurs bactériens, différents projets utilisant des souches vaccinales d'Escherichia coli, de Salmonella ou encore de mycobactéries ont vu le jour sans qu'aucune étude n'ait dépassé le stade du laboratoire. Cette situation est due aux difficultés d ' o b t e n t i o n de vecteurs suffisamment a t t é n u é s mais restant capables d'exprimer, au niveau de leurs flagelles, pili ou protéines de m e m b r a n e externe, des quantités suffisantes du m a t é r i e l antigénique c o r r e s p o n d a n t à l'information nouvellement intégrée dans leur génome. Cela tient également à la difficulté d'obtenir 362 une implantation stable du vecteur dans la microflore, digestive par exemple, lors des tentatives d'utilisation de ce vecteur pour une immunisation par voie orale. Dans le cas des vaccins de sous-unités, la recombinaison génétique est utilisée pour modifier le patrimoine génétique de micro-organismes de telle sorte que ceux-ci, en se multipliant, induisent la synthèse d'antigènes protecteurs utilisables après extraction et purification pour la formulation de vaccins. D e telles approches peuvent également être utilisées pour l'obtention d'antigènes destinés à la préparation de tests de diagnostic immunologique. Les micro-organismes les plus fréquemment utilisés pour la préparation d'antigènes destinés à la réalisation de ces tests ou à la formulation de vaccins, sont des virus (poxvirus se multipliant sur des cellules de mammifères ou des cellules d'oiseaux, baculovirus se multipliant sur des cellules d'insectes), des bactéries (E. coli) et des levures (Saccharomyces, Pischia, etc.). U n e a u t r e possibilité est l ' o b t e n t i o n de lignées de cellules immortalisées ayant intégré dans leur génome les gènes codant pour les antigènes et pouvant donc produire ces derniers de manière constitutive ; ces antigènes peuvent dès lors être extraits et purifiés. Pour l'heure, peu d'applications de la recombinaison génétique à la production de vaccins de sous-unités sont disponibles. Elles n'en constituent pas moins une approche prometteuse pour l'avenir des vaccins. Vaccins synthétiques Les progrès des connaissances dans le domaine de l'immunochimie permettent des approches vaccinales radicalement différentes de celles offertes par la recombinaison génétique. Elles reposent, pour l'essentiel, sur la connaissance des séquences peptidiques qui forment les d é t e r m i n a n t s antigéniques impliqués dans l'induction des r é p o n s e s immunitaires à lymphocytes B ou à lymphocytes T (épitopes B ou T). Ces d é t e r m i n a n t s , dont la séquence p e u t être d é t e r m i n é e soit directement, soit indirectement à partir de la séquence nucléotidique des gènes codant p o u r les antigènes, sont généralement constitués d'un nombre limité d'acides aminés et sont, de ce fait, accessibles à la synthèse par voie chimique. Non directement immunogènes, ces déterminants doivent toutefois être couplés à des molécules porteuses, comme par exemple des protéines, afin de les r e n d r e i m m u n o g è n e s . D e plus, le pouvoir immunogène du conjugué doit se trouver exacerbé par l'utilisation d'un adjuvant de l'immunité approprié. Jusqu'à présent, différentes difficultés inhérentes à cette approche ont limité le développement des vaccins dits synthétiques, la principale de ces difficultés résidant dans la caractérisation des épitopes B et T. Les récents progrès de l'immunochimie laissent toutefois entrevoir la possibilité de caractériser ces épitopes postérieurement à leur association au complexe majeur d'histocompatibilité de l'hôte, ce qui permettra de ne retenir que les séquences véritablement réactives. Une autre difficulté réside dans le fait qu'actuellement, la synthèse ne permet encore que la r e p r o d u c t i o n des d é t e r m i n a n t s séquentiels à l'exclusion des d é t e r m i n a n t s conformationnels, ce qui limite le potentiel de cette approche. 363 Pour l ' h e u r e , des résultats e n c o u r a g e a n t s ont été o b t e n u s dans la p r é p a r a t i o n d'immunogènes synthétiques correspondant au virus de la fièvre aphteuse et au virus de la rage, certains de ces i m m u n o g è n e s p o u v a n t p r o t é g e r l'espèce cible c o n t r e une épreuve virulente. D'application potentielle plus immédiate sont les tentatives d'immunisation contre des hormones peptidiques visant à l'immunomodulation des activités hormonales ; la plus avancée de ces approches concerne un vaccin permettant l'immunocastration des mâles ou des femelles des grandes espèces domestiques (bovins, porcins). Vaccinsanti-idiotypespes U n e a u t r e possibilité de d é v e l o p p e m e n t de vaccins est liée à la d é c o u v e r t e des idiotypes, déterminants antigéniques portés par les anticorps obtenus par immunisation d'un animal au moyen d'anticorps eux-mêmes dirigés contre un antigène. Ces antianticorps, p o r t e u r s d'un d é t e r m i n a n t antigénique, peuvent eux-mêmes être utilisés comme antigènes pour induire une réponse immunitaire vis-à-vis de l'antigène dont ils sont issus. La possibilité de préparer des anticorps monoclonaux porteurs des idiotypes permet de disposer des masses antigéniques nécessaires à l'induction d'un b o n niveau de réponse. Si le concept du vaccin anti-idiotype a pu être vérifié à différentes reprises, les applications pratiques tardent à venir, sans doute en raison de l'extrême spécificité de la réponse immunitaire induite, celle-ci n'étant dirigée que contre le seul épitope auquel correspond l'idiotype. O u t r e les approches vaccinales, il convient de signaler que les idiotypes peuvent é g a l e m e n t ê t r e u t i l i s é s c o m m e a n t i g è n e s d a n s le c a d r e d u d é v e l o p p e m e n t d'immunoessais. Vaccins génétiques Enfin, pour clore cette revue des apports de la biotechnologie à la préparation des vaccins, il convient de mentionner une toute récente approche qui consiste à introduire dans les cellules de certains tissus de l'animal l'information génétique codant pour des antigènes protecteurs. Dans ces conditions, les cellules ayant reçu l'information produisent des antigènes qui vont engendrer une réponse immunitaire à l'origine de la protection. BIOTECHNOLOGIE ET TRAITEMENT Les antibiotiques, produits du métabolisme de différentes bactéries ou champignons, représentent une des principales applications de la biotechnologie au traitement des maladies animales. O b t e n u s à l'origine par culture en masse des micro-organismes suivie d ' u n e extraction et d'une purification à partir des micro-organismes ou des milieux de culture, différents antibiotiques ont, depuis, été o b t e n u s soit par h é m i s y n t h è s e à partir de précurseurs synthétisés par les micro-organismes, soit par synthèse directe. 364 Plus récemment, de nouvelles classes de molécules extraites de micro-organismes et douées d ' u n e activité antiparasitaire ont été isolées. A p p a r t e n a n t à la famille des avermectines, elles r e p r é s e n t e n t u n e a u t r e application de la biotechnologie à la prévention et au traitement des maladies animales. D a n s le domaine du traitement également, la recombinaison génétique ouvre de nouvelles perspectives de synthèse de molécules naturelles d o u é e s d ' u n e activité thérapeutique, et qu'il était difficile, voire impossible, d'obtenir en quantités suffisantes par les techniques classiques d'extraction et de purification (Fig. 1). A ce titre, les cytokines, qui sont des médiateurs impliqués dans la communication entre les cellules et tout particulièrement e n t r e les cellules du système i m m u n i t a i r e , fournissent l ' o p p o r t u n i t é de nouvelles classes de composés t h é r a p e u t i q u e s à activité immunomodulatrice. Fusion cellulaire Génie génétique Recombinaison génétique Génie microbiologique Génie enzymatique Fermenteurs biologiques Fermenteurs enzymatiques Anticorps monoclonaux Génie biochimique Extraction, purification Produit FIG.l Principales techniques de biotechnologie utilisées pour la préparation de produits destinés à la santé animale BIOTECHNOLOGIE ET ANIMAUX TRANSGÉNIQUES La possibilité de modifier le p a t r i m o i n e g é n é t i q u e de micro-organismes ou de cellules par recombinaison génétique s'étend également aux organismes supérieurs. L'intégration d'une information génétique nouvelle dans le génome des cellules qui constituent les tissus ou les organes d'un animal est dénommée transgénèse. Cette intégration peut être réalisée à différents stades du développement de l'œuf fécondé ou de l'embryon. Si cette intégration intervient directement au niveau de l'œuf fécondé ou de l'ensemble des cellules non encore différenciées de l'embryon (cellules totipotentes ou ES), l'ADN intégré sera retrouvé dans l'ensemble des cellules de l'organisme, y compris dans les cellules germinales. Il sera donc transmis à la descendance et l'on parlera alors de transgénèse germinale. 365 En revanche, si l'intégration intervient au niveau d e cellules déjà différenciées, l'ADN intégré ne sera retrouvé qu'au niveau de certains tissus ou organes et ne pourra être transmis à la descendance. On parlera alors de transgénèse somatique. L'intégration d'un A D N étranger dans les cellules d'un embryon peut être réalisée directement par microinjection dans l'ovule avant la fusion des pronuclei (noyaux des gamètes). Dès que l'embryon devient pluricellulaire, il devient difficile d'atteindre toutes les cellules par microinjection et il est alors nécessaire d'utiliser des vecteurs rétroviraux, c'est-à-dire des virus qui ont la p r o p r i é t é de s'intégrer au g é n o m e des cellules. Les vecteurs utilisés sont, dans ce cas, des rétrovirus défectifs produits sur des cellules dites transcomplémentantes et incapables de donner naissance à une nouvelle génération virale. La transgénèse, si elle représente un moyen théorique de modifier certains aspects de la physiologie de l'animal qui p e u v e n t c o n d u i r e à u n e a m é l i o r a t i o n de ses performances zootechniques, représente plus encore et de façon bien plus réaliste la possibilité de r e n d r e l'animal spontanément résistant aux maladies, tout comme elle peut permettre de corriger certains désordres d'origine génétique. La résistance d'un animal aux maladies et plus particulièrement aux maladies d'origine virale peut être obtenue par intégration dans le génome des cellules, de gènes codant pour des antigènes impliqués n o t a m m e n t dans les phases initiales de reconnaissance des r é c e p t e u r s et d'attachement aux cellules. L'expression constitutive de ces antigènes par les cellules les rend secondairement réfractaires à l'infection virale. D ' a u t r e s a p p r o c h e s , actuellement au stade e x p é r i m e n t a l , consistent à faire synthétiser par les cellules des A R N antisens des A R N messagers qui accompagnent la réplication virale, bloquant ainsi cette réplication. D e m ê m e , il est possible de faire synthétiser par les cellules de l'animal transgénique des A R N à activité catalytique, les ribozymes qui ont la p r o p r i é t é d'hydrolyser et donc d'inactiver les A R N messagers comportant des séquences prédéterminées. Plus couramment réalisés sur des espèces animales de laboratoire telles que la souris, les essais d'induction d'une résistance spontanée aux maladies virales par le biais de la transgénèse sont également conduits chez le poulet, et des résultats encourageants ont d'ores et déjà été o b t e n u s dans le cas de l'infection p a r le virus de la leucose ou de l'infection par le virus de la maladie de Newcastle. CONCLUSION Biotechnologie et santé animale apparaissent d'autant plus indissociables que la biotechnologie fournit les moyens du diagnostic, de la prévention et du traitement des maladies animales. D a n s le d o m a i n e du diagnostic, la biotechnologie, en plus de fournir la base des réactifs de diagnostic i m m u n o l o g i q u e conventionnels, a p p o r t e de nouvelles opportunités de développement de réactifs et de techniques de diagnostic direct ou indirect, p a r m i lesquels il faut citer la p r o d u c t i o n d'antigènes par r e c o m b i n a i s o n génétique, l'obtention d'anticorps monoclonaux par fusion cellulaire et probablement, dans un futur p r o c h e , p a r r e c o m b i n a i s o n g é n é t i q u e , l'hybridation n u c l é i q u e et 366 l'amplification de gène ; ces réactifs et t e c h n i q u e s c o n c o u r e n t à la réalisation de diagnostics plus fiables reposant sur des techniques plus spécifiques, plus sensibles et plus reproductibles. D a n s le d o m a i n e des vaccins, si la biotechnologie est é t r o i t e m e n t associée au développement de vaccins vivants préparés à partir de micro-organismes au pouvoir pathogène spontanément ou artificiellement atténué, elle l'est aussi au développement des vaccins inactivés ou de sous-unités. Elle r e p r é s e n t e , en outre, l ' o p p o r t u n i t é de d é v e l o p p e m e n t de n o u v e a u x vaccins résultant des p r o g r è s de la recombinaison génétique, vaccins vivants ou vaccins de sous-unités, à la fois plus sûrs et plus efficaces et qui présentent, de surcroît, la particularité de p e r m e t t r e de distinguer les animaux vaccinés des animaux infectés et ainsi d'envisager l'éradication des maladies sous couverture vaccinale. D'autres approches, vaccins synthétiques, vaccins anti-idiotypes, représentent de nouvelles formes de vaccins appelés à compléter, sinon à remplacer à terme les vaccins existants ; ces approches permettront aussi le développement de nouveaux vaccins. Dans le domaine des thérapeutiques, si la biotechnologie ne peut être dissociée du d é v e l o p p e m e n t des anti-infectieux, elle s'inscrit également dans le d é v e l o p p e m e n t d'autres classes thérapeutiques, dont les plus récents antiparasitaires. Dans ce contexte, la recombinaison g é n é t i q u e , en p e r m e t t a n t l ' o b t e n t i o n de molécules naturelles jusqu'alors impossibles à produire par les procédés classiques, ouvre une perspective d'obtention de nouvelles substances t h é r a p e u t i q u e s parmi lesquelles des i m m u n o modulateurs représentés notamment par les lymphokines. A plus long t e r m e , l ' o b t e n t i o n d ' a n i m a u x transgéniques, r e n d u s s p o n t a n é m e n t résistants aux infections, limitera l'intérêt des approches préventives ou thérapeutiques. D e tels animaux, dont le potentiel génétique se trouvera recensé et les anomalies génétiques é v e n t u e l l e m e n t corrigées, p o u r r o n t , de plus, voir leurs performances zootechniques développées. E n assurant la santé et le b i e n - ê t r e de l'animal, la biotechnologie c o n t r i b u e et contribuera ainsi chaque jour davantage à la protection de la santé de l'Homme et à la préservation de son environnement. * * * BIOTECHNOLOGY AND ANIMAL HEALTH. - P. Desmettre. Summary: The development of the first vaccines for use in animals, by Louis Pasteur at the end of the 19th Century, was an initial step in applying biotechnology to animal health. However, it is only much more recently that decisive progress has been made in finding applications for biotechnology, in both detecting and preventing infectious and parasitic diseases. This progress has shown the way to developing a range of procedures, the application of which will benefit the health of domestic and wild animals, enhance the well-being of companion animals, develop the performance of sporting animals and improve the productivity of farm animals, while also serving to protect human health. Such progress results from the increasingly rapid application of knowledge gained in the material and life sciences, all of which contribute to the multidisciplinary nature of biotechnology. Similarly, reagents and diagnostic techniques have been made more specific, sensitive, reproducible, rapid and robust by updating them through recent discoveries in immunology, biochemistry and molecular biology (monoclonal antibodies, nucleic probes, deoxyribonucleic acid amplification and many more). The development of new vaccines which combine efficacy, duration of protection, innocuity, stability, multivalence and ease of use (subunit vaccines, recombinant vaccines, synthetic vaccines and anti-idiotype vaccines) has resulted from recent progress in immunology, immunochemistry, molecular biology and biochemistry. Finally, the availability of new anti-infective, and-parasitic agents and immunomodulatory therapeutic agents (capable of stimulating the specific and non-specific defence mechanisms of the body) demonstrates that biotechnology is continuing to find new applications in the field of animal health. New diagnostic techniques, vaccines and therapeutic substances are the most immediate applications of knowledge which may, in the future, extend to the development of transgenic animals of revised genetic potential, which will be more resistant to diseases and more productive. The ultimate aim of biotechnology applied to animal health and animal production is to protect human health, preserve the environment and ensure the health and well-being of animals. K E Y W O R D S : Animal health - Biotechnology - Diagnostic reagents Therapy - Transgenic animals - Vaccines. * BIOTECNOLOGÍA Y SANIDAD ANIMAL. - P. Desmettre. Resumen: Si bien el desarrollo por parte de Louis Pasteur, a fines del siglo pasado, de las primeras vacunas que se aplicarían a animales representa el primer aporte de la biotecnología a la sanidad animal, sólo en fecha mucho más reciente se cumplieron progresos decisivos tanto en la detección de enfermedades infecciosas o parasitarias de los animales como en su prevención. Más aún, los progresos alcanzados por nuestros conocimientos en la actualidad permiten prever el desarrollo de un conjunto de medios cuya puesta en práctica va a condicionar la salud del animal doméstico o salvaje, asegurar el bienestar del animal de compañía, mejorar los resultados de los animales de deporte y de los animales de producción y contribuir a protejer la salud del hombre. Estos progresos son consecuencia de la aplicación, cada vez más rápida, de los conocimientos adquiridos en las ciencias de la materia al mismo tiempo que en las ciencias de la vida, participantes unas y otras del carácter pluridisciplinario de la biotecnología. Así ocurre, por ejemplo, con la rápida renovación de los reactivos y las técnicas de diagnóstico, que alian especificidad, sensibilidad, reproductividad, rapidez de puesta en práctica y robustez, a la vez que se ven beneficiadas con los descubrimientos más recientes de la inmunología, la bioquímica o la biología molecular: anticuerpos monoclonales, sondas nucleicas o amplificación del ácido desoxirribonucleico, entre las principales. Asimismo, el desarrollo de nuevas vacunas que alian eficacia, duración de la protección, inocuidad, estabilidad, polivalencia y simplicidad de administración (vacunas de subunidades, vacunas de recombinación genética, vacunas sintéticas, vacunas antiidiotipos) resulta también de los avances recientes de la inmunología, la inmuno química, la biología molecular y la bioquímica. Por último, la posibilidad de acceder a nuevas moléculas de actividades terapéuticas antiinfecciosas, antiparasitarias o inmunomoduladoras capaces de estimular las defensas específicas e inespecíficas del organismo es otra ilustración de las aplicaciones actuales y futuras de la biotecnología a la sanidad animal. Sin embargo, las nuevas técnicas de diagnóstico, las nuevas vacunas o las nuevas moléculas de actividades terapéuticas no representan sino las aplicaciones más inmediatas de conocimientos cuyo alcance permite entrever, a más largo plazo, la obtención de animales transgénicos cuyo potencial genético se encontrará debidamente inventariado y a los que se hará espontáneamente resistentes a las enfermedades, perfeccionando también sus resultados zootécnicos. El máximo objetivo de la biotecnología aplicada a la sanidad y la producción animal es, además de preservar la salud y el medio ambiente del ser humano, proteger la salud y el bienestar del animal. PALABRAS CLAVE: Animales transgénicos - Biotecnología - Reactivos de diagnóstico - Sanidad animal - Terapéuticas - Vacunas.