Sulfonate-sulfur assimilation in Escherichia coli - ETH E
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Sulfonate-sulfur assimilation in Escherichia coli - ETH E
Diss. ETH Nr. 13651 Sulfonate-sulfur assimilation in Escherichia coli A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH for the degree of DOCTOR OF NATURAL SCIENCES presented by ERIC EMMANUEL EICHHORN Dip!. Biotech. Ecole Superieure de Biotechnologie de Strasbourg born on August 21, 1971 from France accepted on the recommendationof Prof. Dr. Thomas Leisinger, examiner Prof. Dr. Linda Thöny-Meycr, co-examiner Zürich 2000 I Summary Summary In bacteria sulfur is mainly assimilated from inorganic sulfate Via the cysteine biosynthetic pathway. In nature, however, the levels of inorganic sulfate may be low, and bacteria have to re1y on organosulfur compounds such as sulfate esters, sulfamates and sulfonates as sulfur sources. Two sets of genes have previously been identified in Escherichia coli that are only expressed when sulfate or cysteine are not available as sulfur source. The tauABCD gene cluster enables E. coli to assimilate taurine-sulfur, and the ssuEADCB gene cluster encodes proteins involved in sulfonate-sulfur utilization. In the present study the biochemistry of desulfonation of taurine and other alkanesulfonates is e1ucidated, and evidence is presented that the TauABC and SsuABC proteins form two distinct transport systems for the uptake of these compounds. The sequence relatedness of the TauD protein to the u-ketoglutarate-dependent 2,4-dichlorophenoxyacetate dioxygenase TfdA from Ralstonia eutropha suggested that TauD is an u-ketoglutarate-dependent dioxygenase catalyzing the oxygenolytic release of sulfite from taurine. The TauD protein was purified after overexpression of the corresponding gene in E. coli and characterized. TauD converted taurine to sulfite and aminoacetaldehyde, which was identified by HPLC after enzymatic conversion to ethanolamine. Taurine desulfonation by TauD consumed equimolar amounts of taurine, oxygen and c-ketcglutarate, and absolutely required ferrous iron. The properties and the amino acid sequence of this enzyme define it as a new member of the u-ketoglutaratedependent dioxygenase family. Taurine was the preferred substrate of TauD, but pentanesulfonic acid, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) and 1,3-dioxo2-isoindolineethanesulfonic acid were also desulfonated at significant rates. The only «-keto acid used as a cosubstrate was u-ketoglutarate. The SsuD and SsuE proteins were purified after overexpression of the corresponding genes in E. coli and characterized. It was demonstrated that the SsuE enzyme catalyzes an NAD(P)H-dependent reduction of FMN, and that it is also able to reduce FAD and riboflavin. The pure SsuD enzyme catalyzed the conversion of pentanesulfonic acid to sulfite and pentaldehyde and was able to desulfonate a wide range of sulfonated substrates, including C2 to C IO unsubstituted linear alkanesulfonates, substituted ethanesulfonic acids and sulfonated buffers. Taurine was not desulfonated by SsuD. 2 Summary SsuD catalysis was absolutely dependent on FMNH 2 and oxygen. These results demonstrate that SsuD and SsuE form a two-component monooxygenase system involved in the desulfonation of a variety of alkanesulfonates other than taurine. The tauABC and ssuABC genes encode proteins with sequence similarity to proteins of ABC-type transport systems. TauA and SsuA are putative periplasmic substratebinding proteins, TauB and SsuB resemble ATP-hydrolyzing enzymes, and the TauC and SsuC proteins are thought to be integral membrane components. To investigate the requirement for the TauABC and SsuABC proteins for growth of E. coli with taurine and alkanesulfonates as sulfur sourees, chromosomally located in-frame deletions of single tauA, tauB, tauC and ssuA, ssuB, ssuC genes were constructed. The growth properties of the deletion strains were studied and it was found that the substrate specificities of the TauD and SsuD desulfonation systems were largely reflected in the substrate range of the corresponding transport system. However, some substrates for TauD were transported exclusively by the SsuABC system. Mutants in which only formation of hybrid transporters was possible, were unable to grow with sulfonates, indicating that the individual components of the two transport systems were not functionally exchangeable. Thus, TauABC and SsuABC form two distinct transport systems for uptake of taurine and alkanesulfonates, respectively. In conclusion, the TauABCD and SsuEADCB systems are two distinct but complementary systems that enable sulfur assimilation from taurine and other linear alkanesulfonates when cysteine or sulfate are not available. 3 Zusammenfassung Zusammenfassung Schwefelassimilation erfolgt bei Bakterien ausgehend von anorganischem Sulfat über den Cysteinbiosyntheseweg. In vielen Ökosystemen liegen allerdings nur geringe Mengen an Sulfat vor. Infolgedessen müssen sich Bakterien ihren Bedarf an Schwefel aus organischen Schwefelquellen wie z.B. Sulfatestern, Sulfamaten oder Sulfonaten erschliessen. In früheren Arbeiten wurden in Escherichia coli zwei Gencluster identifiziert, deren Expression nur stattfindet, wenn Cystein oder Sulfat nicht als Schwefelquelle vorliegen. Das tauABCD Operon ermöglicht E. coli die Verwertung von Taurin (2-Aminoethansulfonat) als Schwefelquelle. Dagegen wird das ssuEADCB Operon für die Schwefelassimilation aus anderen Sulfonaten gebraucht. In der vorliegenden Arbeit ist die Biochemie der Desulfonierung von Taurin und anderen Alkansulfonaten in E. coli aufgeklärt worden. Es wurde auch bewiesen, daß die TauABC und SsuABC Proteine zwei eigenständige Transportsysteme darstellen, die für die Aufnahme dieser Verbindungen in die Zelle zuständig sind. Die Aminosäuresequenz des TauD Proteins zeigt nahe Verwandtschaft zu derjenigen des TfdA Proteins von Ralstonia eutropha, einer a-Ketoglutarat-abhängigen Dioxygenase. Es wurde deshalb vermutet, daß TauD für die oxygenolytische Abspaltung von Sulfit aus Taurin zuständig ist. Das TauD Protein wurde nach Überexpression des tauD Gens in E. coli gereinigt und charakterisiert. TauD katalysierte die Umwandlung von Taurin zu Sulfit und Aminoacetaldehyd. Aminoacetaldehyd, das organische Produkt der Reaktion konnte wegen seiner Instabilität nur indirekt nach enzymatischer Umwandlung zu Ethanolamin nachgewiesen werden. Bei der Desulfonierung von Taurin durch TauD wurden stöchiometrische Mengen von Taurin, a- Ketoglutarat und Sauerstoff verbraucht. Katalyse erfolgte nur unter Anwesenheit von Eisen(I1) Ionen. Aufgrund der biochemischen Eigenschaften und der Aminosäuresequenz des TauD Enzyms lässt sich schließen, daß TauD der Familie der a-Ketoglutarat-abhängigen Dioxygenasen angehört. Taurin war das beste Substrat für dieses Enzym, welches auch fähig war, Pentansulfonat, 1,3-Dioxo-2-isoindolinethansulfonat und 3-(N- Morpholino )propan- sulfonat (MOPS) zu desulfonieren. Dagegen war a-Ketoglutarat die einzige «-Ketosäure, die als Cosubstrat dienen konnte. Zusammenfassung 4 Die SsuD und SsuE Proteine wurden ebenfalls nach Überexpression der entsprechenden Gene in E. coli gereinigt und charakterisiert. Es wurde gezeigt, daß das SsuE Enzym die NAD(P)H-abhängige Reduktion von FMN katalysiert und in der Lage ist, auch FAD sowie Riboflavin zu reduzieren. Das SsuD Enzym katalysierte die Umwandlung von Pentansulfonat zu Sulfit und Pentaldehyd sowie die Desulfonierung einer Reihe anderer Alkansulfonate. Dazu gehören nicht-substituierte Alkansulfonate, deren Kettenlänge 2 bis 10 Kohlenstoffatome beträgt SOWIe substituierte Ethansulfonatderivate und sulfonierte Pufferverbindungen. Taurin ist kein Substrat für SsuD. Die durch SsuD katalysierte Desulfonierungsreaktion ist FMNH 2- und sauerstoffabhängig. Daraus lässt sich schließen, daß SsuD und SsuE ein Zweikomponenten-Monooxygenasesystem bilden, das für die Desulfonierung einer Reihe von Alkansulfonaten, nicht aber von Taurin zuständig ist. tauABC und ssuABC codieren für Proteine, welche Ähnlichkeit zu Komponenten von Transportsystemen des ABC-Typs aufweisen. TauA und SsuA sind vermutlich periplasmatische Substratbindeproteine, TauB und SsuB ähneln ATP-hydrolysierenden Enzymen, und es wird vermutet, daß TauC und SsuC integrale Membranproteine sind. Um die Notwendigkeit der TauABC und SsuABC Proteine für das Wachstum von E. coli auf Taurin und anderen Alkansulfonaten zu überprüfen, wurden chromosomale Deletionen der tauA, tauB, tauC, ssuA, ssuB, ssuC Gene, einzeln oder in verschiedenen Kombinationen im gleichen Leseraster konstruiert. Die Wachstumseigenschaften der einzelnen Deletionsmutanten wurden untersucht. Dabei zeigte sich, daß das Substratspektrum des TauD bzw. des SsuD Enzyms weitgehend jenem des jeweiligen Transportsystems entspricht. Einige Substrate von TauD konnten allerdings nur über den SsuABC Transporter in die Zelle gelangen. Deletionsmutanten, in welchen nur hybride Transportsysteme gebildet werden konnten, waren unfähig Alkansulfonate als Schwefelquelle zu verwerten. Dies hat den Beweis dafür gebracht, daß die einzelnen Komponenten der TauABC und SsuABC Transportsysteme nicht austauschbar sind; TauABC und SsuABC sind zwei eigenständige Transportsysteme. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß TauABCD und SsuEADCB zwei Systeme sind, die durch ihre Komplementarität die Verwertung von Taurin und anderen Alkansulfonaten als Schwefelquellen ermöglichen, wenn Cystein oder Sulfat nicht verfügbar sind. 5 Resurne Resurne L'assimilation de soufre par les bacteries se fait principalement par biosynthese de cysteine ä partir d'ions sulfate. Cependant, dans leur environnement, les ions sulfate ne sont d'ordinaire pas la source de soufre la plus abondante, et les bacteries sont de ce fait souvent tributaires de sources de soufre organique. En l'absence de cysteine ou d'ions sulfate comme source de soufre, Escherichia coli exprime specifiquement deux operons. L'un, tauABCD, permet l'assimilation du soufre de la taurine (acide 2-aminoethanesulfonique), l'autre, ssuEADCB permet l'assimilation du soufre d'autres acides sulfoniques. Le travail presente d'une part les mecanismes biochimiques responsables de la desulfonation de la taurine et d'autres acides sulfoniques, et, d'autre part, conforte l'hypothese de la presence de deux systemes de transport de type ABC, dont le röle est l'absorption de ces composes, L'homologie de sequence entre TauD et TfdA, une dioxygenase u-cetoglutaratedependante isolee de Ralstonia eutropha suggere que TauD est responsable de la liberation du soufre de la taurine par un mecanisme oxygenolytique de rupture de la liaison C-S0 3H. TauD a ete purifiee apres surexpression du gene codant dans E. coli et caracterisee. La reaction de desulfonation de la taurine catalysee par TauD conduit a la formation de sulfite et daminoacetaldehyde qui, vu sa faible stabilite, n'a pu etre detecte qu 'indirectement apres conversion enzymatique en ethanolamine, La desulfonation de la taurine par TauD est tributaire de la presence d'ions ferreux ; la reaction consomme de la taurine, de I' acide u-cetoglutarique et de I' oxygene en quantites equimolaires, Ainsi, les proprietes enzymatiques de TauD et les caracteristiques de sa sequence d'acides amines, permettent de considerer cette proteine comme membre apart entiere de la famille des dioxygenases o-cetoglutaratedependantes. Apart la reaction de desulfonation de la taurine, TauD catalyse egalement la desulfonation de l'acide pentanesulfonique, de l'acide 3-(N-morpholino) propanesulfonique (MOPS) et de l'acide 1,3-dioxo-2-isoindoline-ethanesulfonique, avec toutefois une efficacite moindre. L' acide c-cetoglutarique est le seul «-cetoacide utilise comme cosubstrat par TauD. Les proteines SsuD et SsuE ont egalement ete purifiees apres surexpression dans E. coli du gene codant correspondant. La caracterisation de ces deux enzymes a montre que SsuE est une FMN reductase NAD(P)H-dependante qui catalyse aussi la reduction Resurne 6 du FAD et de la riboflavine. L'enzyme SsuD, quant ä lui, catalyse la reaction de desulfonation de l'acide pentanesulfonique en sulfite et pentaldehyde. Un grand nombre d'autres acides sulfoniques sont desulfones par SsuD, parmi ceux-ci des acides alkanesulfoniques lineaires non substitues de longueur de chaine carbonee allant de 2 ä 10 atomes de carbone, des acides ethanesulfoniques substitues, ainsi que des composes tampon sulfonates, ä I' exclusion de la taurine. La reaction de desulfonation catalysee par SsuD est FMNH2-dependante et consomme de I' oxygene, 11 apparait donc que SsuD et SsuE forment ensemble un systeme bi-enzymatique responsable de la desulfonation d'un large spectre d'acides sulfoniques ä l'exclusion de la taurine. Les proteines codees par les genes tauABC et ssuABC presentent une homologie de sequence avec des composantes de systemes de transport de type ABC. TauA et SsuA sont probablement deux pro teines periplasmatiques, TauB et SsuB sont supposees etre des ATPases, TauC et SsuC presentent des caracteristiques de proteines transmembranaires. Pour montrer que les proteines TauABC et SsuABC sont indispensables pour la production de biomasse par E. coli lorsque celui-ci utilise la taurine ou d'autre acides alkanesulfoniques comme source soufree, une serie de deletions geniques chromosomiques de genes codant pour ces proteines on ete construites dans le meme cadre de lecture en combinaisons diverses. L' etude de la croissance des souches mutantes obtenues a montre que la specificite de substrat des enzymes TauD et SsuD se superpose largement a celle du systeme de transport correspondant. Cependant, certains substrats de TauD ne peuvent entrer dans les cellules que par le systeme de transport SsuABC. Par ailleurs, l'absence de croissance de souches mutantes potentiellement capables de former des systemes de transport hybrides, montre que les composantes des systemes de transport TauABC et SsuABC ne sont pas interchangeables. Par consequent, TauABC et SsuABC sont deux systemes de transport distincts et independants. En conclusion, le travail montre que TauABCD et SsuEADCB permettent de par leur complementarite, l'utilisation de la taurine et d'autres acides alkanesulfoniques comme source soufree alternative lorsque la cysteine ou les ions sulfate font defaut,