Maladies Rares: Outils diagnostics (autres que génétiques)

Les outils non génétiques de
diagnostic pour les Maladies Rares
Roseline Froissart
Laboratoire des Maladies Héréditaires du Métabolisme
et Dépistage Néonatal
Centre de Biologie Est
Hospices Civils de Lyon
Bron
24 Octobre 2012
Maladies rares
• Difficultés du diagnostic
– Extrême diversité des maladies
– Hétérogénéité pour une même maladie
• Expression à tout âge (anténatal / adulte)
– Complexité
• Approche multidisciplinaire (expertise)
–
–
–
–
Clinique
Anatomopathologique
Biochimique
Génétique
Demande
d’analyse
Réponse du
biologiste
avec données
cliniques
Prélèvement
(respect des
conditions)
Envoi au
laboratoire (délai
de transport)
Compte-rendu écrit
Interprétation
Les différentes étapes d’une
analyse
Réception et
identification
Préanalytique
(centrifugation, isolement
des leucocytes, stockage)
Recueil des
résultats
Contrôle de qualité
(interne, +/- externe)
Analyse
Diversité des prélèvements
•
•
•
•
•
Sang (sérum, leucocytes, lymphocytes…)
Urines
LCR
Biopsie organe (muscle, foie..)
Biopsie de peau (culture de cellules, microscopie
électronique…)
• Villosités choriales, cellules amniotiques (diagnostic prénatal)
– Sang foetal
• Sang séché sur papier buvard (Guthrie)
Le prélèvement de Guthrie
Prélèvement de sang déposé sur buvard:
Au talon pour dépistage néonatal systématique à J3
Au bout du doigt
Sang veineux (prise de sang) déposé sur papier
Après séchage, transport à température ambiante
Excellente conservation (métabolites, enzymes, protéines…)
Utilisation d’un spot de 3mm de diamètre (environ 2,5µl sang total)
Méthodes de diagnostic
 Analyses « de routine »: orientation
• Glycémie, corps cétoniques, ammoniémie, acide
lactique, cholestérol, triglycérides, acide urique,
enzymes hépatiques, CPK, LDH…..
Bien réalisé peut orienter vers un type de pathologie
• Numération/Formule sanguine, frottis sanguin (cellules
de surcharge …)
 Examen anatomopathologique
• Etude morphologique
• Batterie standard de colorations
• Techniques spéciales: enzymo-histochimiques (enzymes)
et immuno-histochimique (antigènes), en fonction
renseignements cliniques et hypothèses diagnostiques
• Orientation ou diagnostic
Podocytes, HE, x600
Dr R. Bouvier, Lyon
Déficit enzymatique dans une voie métabolique
GENES
G1
G2
G3
ENZYMES
E1
E2
E3
METABOLITES
A
B
C
D
7
Déficit enzymatique dans une voie métabolique
GENES
G1
G2
G3
ENZYMES
E1
E2
E3
METABOLITES
A
B
Accumulation
C
D
Déficit
8
Méthodes de diagnostic
 Métabolites:
Anomalie: reflet déficit enzymatique ou transporteur
• Urines, plasma, LCR…
• Qualitatif: examen d’orientation
chromatographie couche mince
électrophorèse……
OLIGOSACCHARIDES (urines)
Chromatographie couche mince
Mucopolysaccharidose type I



Exploration biochimique par
méthode globale : profil des
mucopolysaccharides
urinaires (électrophorèse,
colorimétrie)
Mucopolysaccharidose de type I :
maladie de surcharge lysosomale
liée à un déficit en -Liduronidase, transmission
autosomique récessive
Traitement : perfusion d’enzyme
produite par génie génétique
CS HS
DS
Malade
Malade traité
MPS I
Profil normal
MPS III
MPS IV
MPS III
Profil normal
KS
11
Méthodes de diagnostic
 Métabolites: reflet déficit enzymatique ou transporteur
• Urines, plasma, LCR
• Qualitatif: examen d’orientation
chromatographie couche mince, électrophorèse…
• Quantitatif: méthodes complexes
– Spectrométrie de masse en tandem MS/MS (acides
aminés, acylcarnitines, hormones…..)
– Spectrométrie de masse couplée à la chromatographie
gazeuse : GC-MS (acides organiques…)
 Analyse protéique
 Etude génétique souvent dans un 2° temps (si test biochimique fiable)
Spectrométrie de masse en tandem
(MS/MS)
• Implantation dans les laboratoires de diagnostic depuis
environ 20 ans
• Séparation très fine d’un grand nombre de métabolites qui
peuvent être quantifiés (étalon interne du composé à doser,
marqué par isotope stable)
• Injection directe ou étape de séparation (chromatographie
liquide)
• Composition: source d’ionisation / 2 quadripôles en série /
détecteur
Principe MS/MS
Echantillon
ES
I
Q1
Q2
Q3
D
Abondance
– Principe: séparation des molécules (préalablement ionisées) en
fonction de leur rapport masse/charge (m/z)
– Source Electrospray (ESI): ionisation à pression atmosphérique
des métabolites à analyser, mode positif [M+H]+ ou négatif [M-H]– Triple quadripôle
• Q1 détermine le poids moléculaires des ions (ions parents)
• Q2 est une chambre de collision : fragmentation des ions
• Q3 analyse les fragments produits par Q2 (ions fragments)
– Détecteur : multiplicateur d’électrons
m/z
Source
d’ionisation
Analyseur
Détecteur
déficit en MCAD
C2
(beta-oxydation des acides gras à chaîne moyenne)
*
*Étalons internes
(acylcarnitines deutérées)
C8
C0
C6
*
* *
*
*
C10:1
* *
C0
*
C2
*
* * * C5
*
* *
C3 C4
Control
*
*
*
*
*
*
15
MS/MS
Avantages:
–
–
–
–
–
Spécificité
Grande sensibilité
Grande variété des applications (sur un même appareil)
Multiplex: dosage simultané de nombreux composés
Analyse de nombreuses molécules sur faible volume d’échantillon
(ex: quelques µl de sérum, tache de sang…)
– Temps d’analyse court (2’ au lieu de 2h pour Phénylalanine): de
nombreux pays l’ont adopté pour le dépistage néonatal
– Ex: acides aminés: 15’ pour identifier 76 composés (avant: 2h30
avec moins de composés)
– Ex: Profil des acylcarnitines: 30 maladies testées en 3’ (temps
machine)
MS/MS
Limites:
– Composés ionisables
– Séparation préalable indispensable si composés isomasses
– Étapes préparatives de l’échantillon (extraction,
purification…), assez longues
– Coût: investissement important >200.000 euros mais coût
des réactifs faible
– Personnel qualifié: technicien spécialisé et interprétation
des données nécessitant un niveau d’expertise élevé
– Ingénieur nécessaire (appareillage sophistiqué)
Méthodes de diagnostic
 Métabolites: reflet déficit enzymatique ou transporteur
•
Urines, plasma, LCR
• Qualitatif: examen d’orientation
chromatographie couche mince, électrophorèse…
• Quantitatif: méthodes complexes
 Analyse protéique
• Cellules sanguines, cultivées, tissus, plasma…
• Western blot: CDG, protéines musculaires…
• Etude enzymatique (activité): MS/MS (multiplex),
fluorimétrie, colorimétrie, substrat radioactif…
 Etude génétique souvent dans un 2° temps
Western blot
•
•
•
•
Principe: séparation des protéines par électrophorèse + Immunodétection =
séparation en fonction du poids moléculaire
Intérêt pour protéines non enzymatiques
Analyse qualitative et quantitative
Ex: CDG (Carbohydrate Deficient Glycoprotein):
= anomalies de glycosylation des glycoprotéines
Western Blot (transferrine)
N
CDG I
80 kDa
77 kDa
74 kDa
•
Diagnostic de certaines myopathies
Ex: dystrophine (taille, quantité)
•
Limites: peut être normal
CDG II
Etudes enzymatiques
• Utilisation substrat spécifique:
– fluorimétrie, colorimétrie, substrat radioactif
– MS/MS (multiplex)
• Recherche déficit
• Activité résiduelle: seuil?
– Il peut être difficile de différencier un malade et un
hétérozygote (non atteint): rare
• Enzyme non mesurable (activité trop faible)
• Enzyme exprimée dans un seul tissu (ex: foie, rein, cerveau…)
• Pseudodéficits (variants non pathologiques)
• Déficits multiples (sulfatases)
• Déficits protéines activatrices
• Tissu ou cellules fraîches parfois nécessaires
Contrôle de qualité/ Validation
• Interne (échantillon normal, pathologique, étalon interne)
• Externe (ERNDIM….)
• Validation de méthode
– Chaque labo valide sa méthode (protocole peut être
variable d’un labo à l’autre)
– Valeurs usuelles (parfois fonction de l’âge)
– Connaître les limites de chaque test (faux positifs et faux
négatifs)
Expertise
•
•
•
•
Un résultat normal exclut-il le diagnostic?
Un résultat anormal affirme t’il le diagnostic?
Confrontation à la clinique
Si conclusion impossible:
– Nouveau prélèvement
– Analyse complémentaire: autre méthode biochimique,
étude génétique
• Pas d’intérêt à multiplier les labos
– Surtout important pour des maladies rares!
– Plusieurs biologistes doivent être formés
Pourquoi est ce parfois si long?
• Sauf urgence+++ si urgence vitale et si maladie traitable
(étude métabolites)
•
•
•
•
•
Analyses très spécialisées
Techniques manuelles chronophages
Analyses regroupées pour raisons économiques (séries)
Analyses faites à fréquence variable
Faites par peu de laboratoires
– (ex: sulfite oxydase: 2 laboratoires dans le monde)
• Vérification parfois nécessaire
• Autre technique requise
• Temps de culture
Risques de passer à côté du diagnostic?
• Qualité du prélèvement
– Conservation (enzymes+++)
– Ex: urines: lactates d’or bactérienne ou endogène
– Labilité du composé (ex: sulfocystéine, homocystéine…)
• Moment du prélèvement
– Normalisation biochimique peut exister entre les crises (AA, AO, cycle de
l’urée…): prélever au moment accès aigu
ex: déficit beta-oxydation des acides gras, cycle de l’urée (OCT)
– Intérêt de prélèvement avant toute mesure thérapeutique (quand une
maladie métabolique est suspectée)
• Formes tardives et frustes: dialogue avec le clinicien +++
– Ex: acidémie glutarique
– Déficit enzymatique partiel
– Profils atypiques
• Nécessité d’une expertise pour chaque test et pour un diagnostic
dans son ensemble (réseaux nationaux)
Conclusions
• Les résultats doivent être interprétés par le biologiste
• Garder l’expertise biochimique même pour les maladies très
rares
• Etude génétique: permet de confirmer ou est nécessaire au
diagnostic
• Utilité des tests biochimiques +++ pour confirmer les résultats
des explorations génétiques (séquençage haut débit)
• Techniques récentes mais coûteuses et d’interprétation
difficile (non disponible en labo de diagnostic):
– Spectro RMN in vitro (nouvelles maladies identifiées)
– MALDI/TOF
• Identification de nouveaux biomarqueurs (« omique »)