Vectorisation d`inhibiteurs d`histones déacétylases et évaluation du

Transcription

UNIVERSITÉ DE NANTES
FACULTÉ DE MÉDECINE ET TECHNIQUES MÉDICALES
_____
ÉCOLE DOCTORALE BIOLOGIE-SANTÉ
Année 2014
N° attribué par la bibliothèque
N° 17
Vectorisation d’inhibiteurs d’histones déacétylases et
évaluation du phénéthyl isothiocyanate pour l’amélioration
des traitements du mésothéliome pleural malin.
___________
THÈSE DE DOCTORAT
Discipline : Biologie, Médecine et Santé
Spécialité : Cancérologie - Biothérapie
Présentée
et soutenue publiquement par
Iza DENIS
Le 31 octobre 2014, devant le jury ci-dessous
Rapporteurs :
Dr Lucas WILLEMS
Dr Muriel CUENDET
Examinateurs :
Dr Elena ISHOW
Directeur de thèse : Dr Christophe BLANQUART
Je dédie ce manuscrit à
Mon grand-père Per Denez
Mes parents Gwendal et Danièle, et mon frèreYowan.
Hepdoc’h ne vefen ket deut a-benn, trugarez.
REMERCIEMENTS
Je tiens, tout d’abord, à remercier les membres du jury d’avoir accepté d’évaluer mon
travail de thèse, et particulièrement les membres rapporteurs : les Docteurs Muriel Cuendet
et Lucas Willems.
Je remercie Marc de m’avoir accueillie dans son laboratoire pour réaliser ma thèse,
et de m’avoir permis de travailler sur un sujet passionnant au sein d’une équipe soudée et
dans laquelle j’ai pris énormément de plaisir à travailler. Merci pour ta bonne humeur, tes
conseils, sans oublier tes chouquettes hebdomadaires, tu as toujours pris soin de nous !
Toute ma gratitude et ma reconnaissance vont à mon directeur de thèse Christophe,
sans qui je n’aurais pas pu accomplir ce travail. Christophe, merci pour ta formation, tant
technique que théorique, ton dynamisme, et surtout ta motivation. Tu es toujours resté positif
et tu m’as toujours soutenue et encouragée, même dans les moments difficiles. Merci pour ton
temps, tu as toujours été disponible pour la moindre question. Un grand merci pour ta
présence, je ne pense pas m’avancer en disant que peu d’étudiants en thèse ont la chance
d’avoir un encadrement de cette qualité et je t’en suis profondément reconnaissante. Tout
ceci bien sur sans oublier le petit poisson qui se cache en toi, cela va s’en dire, et qui met de
la bonne humeur dans cette équipe !
Le dur chemin qu’est celui de la thèse est tel que la liste des personnes que je dois
remercier est longue..Je commencerai par remercier les personnes qui ont eu à me supporter
au quotidien au labo..
Jean-Baptiste, copain de box, merci pour ton accueil, je n’oublierai pas ton cadeau de
bienvenue: la sublime et très pratique tasse zèbre, qui a tenu le choc ! Merci pour nos
discussions, nos fous-rire dans le box des bests, mais il faudra quand même que tu arrêtes un
jour de te frapper avec une règle…ça fait bizarre…Merci pour cette présidence exemplaire de
l’asso ADN-Bio, ça a été un réel plaisir de monter ça ensemble...et puis finalement, personne
ne s’est noyé lors de nos premières sessions BBQ ! Ah oui et pour info, depuis que tu es parti,
les pop-up étranges qui s’affichaient de façon intempestive n’ont plus jamais fait apparition...
bizarre… ?
Mes cocottes ptite Carole et ma Doubi, un grand merci à vous pour votre soutien
pendant ma thèse, votre bonne humeur, votre présence, qui ont fait de ces trois années un réel
3
plaisir de venir travailler au labo avec vous. Ma Carole merci pour ta bonne humeur, ta
douceur, et ton écoute. Tu as toujours été présente, et ta générosité et ta gentillesse
m’impressionneront toujours…Je te soupçonne de posséder un pouvoir magique, le pouvoir
des petits pois ;) Ma Doubi…le duo de choc Doubi et Doubi bien sur! Merci pour nos éclats
de rire, on se souviendra bien sur de la grande soirée des Troubadours, à laquelle nous
n’avions malheureusement pas pu assister.. Merci pour tes conseils beauté et flashion
toujours à la pointe de l’actualité… En même temps, qui d’auuuuutre ? Clarisse, ce n’est pas
facile de trouver les mots, mais je te remercie pour les bons moments que nous avons passés
ensemble. Nos vacances en Croatie resteront un de mes plus beaux voyages.
Camille, Linus, ptite Linotte, Synbad le marin, Robin des Boys, que de mignons
sobriquets ! Tu es arrivé dans mon année fatidique, pas forcément la plus facile, et tu as
souvent fait les frais de mes p’tits pétages de câble..et pas que du vendredi, alors merci à toi
pour avoir supporté ça. Là où c’est rassurant c’est que tu me rattrapes vite dans le genre ;) !
JF et Daniel merci pour vos conseils et apprentissages. JF merci pour tes conseils et
ton expertise en matière de rédaction ;). Merci pour les vidéos d’après-manger, toujours plus
inattendues les unes que les autres, mais surtout merci pour tes blagues, qui sont désormais
encrées dans l’histoire des Grégoire ! Daniel, je te remercie pour m’avoir initiée et formée au
maniement des souris, l’appréhension s’est vite dissipée !
Sophie, merci pour ta bonne humeur, ta disponibilité et ta motivation. Sans oublier tes
talents culinaires, tu nous régales !
Anne-Claire et Delphine, merci pour votre bonne humeur et vos conseils. Une pensée
toute particulière pour toi Delphine, à qui je souhaite le meilleur dans un avenir pas si
lointain, you know what I mean.
Je n’oublie bien sur pas ma ptite Roulette, mon compatriote breton ! Même si le coup
de la panne était un peu cliché, nos allers-retours à Rennes à bord du bolide Berlingo étaient
bien sympas..Sans oublier la Logi-team bien sur !!
Nicolas, ou « Super Blond »…Je ne te connais pas depuis assez longtemps mais
occupant ton ancien bureau de thésard je me permets une suggestion : je sais bien que
Conforama est ton magasin préféré, mais essaye d’éviter le rayon set de table quand même. ;)
Merci à nos ptits médecins Anne-Laure et Charly, votre bonne humeur et votre joie de
vivre a rajouté du peps à l’équipe, merci ! Anne-Laure, à bientôt, comme promis ;) Et merci à
Florent pour les bons moments qu’on a passé quand tu étais avec nous du temps de Roulette !
4
Je remercie également Lidia ma colloc, merci pour ton soutien, on aura vécu cette
thèse toutes les deux et ce n’était pas « tranquillos » tous les jours, mais le 17 Allée Baco
restera mémorable et finalement, si on a bien vu une chose c’est qu’on est toujours laaarge !
J’espère qu’on se retrouvera vite !
Aude, ma patate d’or, une rencontre qui a rendu la formation d’expérimentation
animale meilleure que jamais ! Et surtout la naissance d’une belle amitié, merci du fond du
cœur pour ton soutien et ta présence pendant ces trois années. Je te souhaite le meilleur pour
la suite, en espérant pouvoir réussir à réunir les deux patates ensemble une fois de temps en
temps même si la distance nous sépare !
Je tiens aussi à remercier les membres fondateurs de l’asso ADN Bio-Santé : Etienne :
merci pour nos discussions et nos soirées, et surtout merci pour ton optimisme et ta bonne
humeur inébranlables..Merci aussi pour ton soutien et ton écoute..JB G: merci pour tes
nombreuses soirées à thème, toujours originales et très réussies, et merci pour ta présence et
ton soutien, surtout a la fin de ces trois années.., Jérémie : merci pour le covoit’ juste
exceptionnel dans la Saxo édition K-Way, unforgettable, Mathilde : merci pour ta bonne
humeur, et ton franc-parlé, une vraie qualité ! Quentin, bien qu’ayant falsifié la date de
création de l’asso…merci pour ton humour lors de nos réunions !
Maud, ma ptite Alcoolyte, on s’est rencontrées trop tard !! Les quelques soirées qu’on
a pu faire ensemble étaient prometteuses d’un grand duo ! Mais je ne suis pas encore
partie.. ;) Merci pour ces moments, en espérant qu’il y en aura d’autres !
Romain, merci pour ces ptits cafés bien sympas en ta compagnie, j’attends toujours
pour le Floride cela dit ! Je te souhaite le meilleur pour la suite, sur tous les plans ;)
Merci aux autres membres de l’équipe 3, Sylvain, il serait ptet temps que tu bosses un
peu quand même, ta thèse va pas se faire en te balladant dans les couloirs ;) Typhaine, bon
courage pour la suite.
Un merci au « Magasinier de l’IRT » ;), le prince de Meknès, pour ta bonne humeur.
On a passé des bonnes soirées, et surtout, n’oublie pas de rappeler Patson !
Je tiens maintenant à remercier mes amis de longues dates, ma Dream Team ! Claire,
je te remercie du fond du cœur pour ta présence, ton écoute et surtout ton soutien immuable
5
lors de ces trois années…Dans tous les cas, je pense que le pouvoir de Super U sera toujours
avec nous ! Bibi, merci pour nos fous rires toulousains, rennais, bretons, internationaux
finalement ! Manu, merci pour ta présence et ton soutien, pendant ces trois années, mais
aussi depuis bien plus longtemps. Aurélie, merci d’avoir toujours été là malgré les distances
géographiques qui ont pu nous séparer plusieurs fois, et ce depuis de nombreuses années
aussi. Alors à vous ma Dream Team je vous dis un grand merci, du fond du cœur, pour
m’avoir accompagnée dans cette épreuve, dans les précédentes, et dans les prochaines
j’espère !
Je remercie mes amis qui m'ont accompagnés depuis les bancs de la fac, Carole mon
ptit Carreau, Hervé, Camille mon ptit, Elsa ma zazou: merci pour nos soirées Rennaises dont
certaines resteront dans les mémoires. Carole et Hervé j'en passe et des meilleurs mais un
merci spécial pr nos impro karaoké avec de grandes performances vocales, sans oublier le
corridor et le canal bien entendu..;) Bertin "oui Tin Tin oui", nombreux sont les moments que
je n'oublierai pas, depuis les TPs de la fac jusqu'aux chansons paillardes de Carole ;) Ma
zazou tu es partie vers d'autres horizons mais ça ne t’a pas empêché de me soutenir toutes ces
années alors un grand merci à vous d'avoir toujours été là :).
Enfin je voudrais remercier ma famille. Mes couz, je commencerai par un
incontournable.. "Yiiiiihhhhaaaaa" !! Maud, Damien, Antoine, Adèle, Oliv, merci pour ces
cousinades endiablées à Loriangeles. Antonio de la Véga merci à toi d'avoir été présent sur
Nantes au début de ma thèse et toujours à l'écoute. Maud ma cousinette tu as toujours été là
pour moi et je t'en remercie du fond du cœur. Dam, toi et moi, le duo inséparable depuis tous
petits, un peu pour tout mais surtout les bonnes vieilles con****** ;) Adèle, on ne sait
toujours pas où sont passées tes lunettes..? Oliv tes blagues restent un incontournable..
Un grand merci a tous pour l'enfance qu'on a passée, et d'avoir poncuté ces trois dernières
années de ces cousinades juste innoubliables.
Un merci tout particulier à ma famille Canny-Denez: ma tante Morwena et mon oncle
Nicholas, qui m'ont beaucoup soutenue pour parvenir à faire de mes projets professionnels
des réalités, et mes cousins Julian et Solenn. Thank you for the lovely walks on the Galway
promenade and all your help over these years. Morwena trugarez vras evit pebtra, ha dreistholl pred ar zul e Barna, ne oa "ket kalz tra" egist e lavarer, met Etoile Michelin oa evidon!
6
Enfin je remercie du fond du cœur mes parents Gwendal et Danièle et mon frère
Yowan, sans qui je ne serais jamais arrivée jusqu’ici. Vous m’avez toujours soutenu et aidé
dans les différentes épreuves qui ont marquées ma vie. Trugarez deoc'h holl. Trugarez evit
pebtra, kuzulied ac'hanon evit ma studioù, atav aze ganin, sikoured ac'hanon, “no matter
what” egist vez lavaret. Ne vefen ket erued betig aman a-hend-all. Trugarez vras. Enfin je
remercie tout particulièrement mon grand-père Per Denez, à qui je dédie ce manuscrit, qui
m'a beaucoup appris et qui m’a toujours encouragé depuis toute petite. Breizh ma bro,
brezhoneg ma yezh. Trugarez Tad Kozh karet.
« Grégoire un jour, Grégoire toujours ! »
7
SOMMAIRE
LISTE DES FIGURES ........................................................................................................................ .15
LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................................... .16
LISTE DES ABRÉVIATIONS ........................................................................................................... .17
CHAPITRE I : LE MÉSOTHÉLIOME PLEURAL MALIN ........................................................ 20
I. Description de la pathologie ......................................................................................... 20
A. Historique ............................................................................................................ 20
B. Localisation et caractéristiques physiopathologiques du MPM .......................... 20
1. Localisation .................................................................................................. 20
2. Description physiopathologique .................................................................. 21
C. Epidémiologie ..................................................................................................... 22
II. Etiologie ....................................................................................................................... 24
A. L’amiante ............................................................................................................ 24
1. Histoire ......................................................................................................... 24
2. Forme et taille .............................................................................................. 24
3. Mécanismes d’action de l’amiante............................................................... 25
B. Le simian virus 40 ............................................................................................... 26
III. Principaux mécanismes moléculaires de la tumorigenèse pleurale ............................ 26
A. Les anomalies génétiques et épigénétiques ......................................................... 28
1. Le gène NF2 ................................................................................................. 28
2. Les gènes suppresseurs de tumeurs.............................................................. 28
3. Les oncogènes .............................................................................................. 29
B. Le processus inflammatoire ................................................................................ 30
C. Les facteurs de croissance ................................................................................... 31
D. La résistance à l’apoptose ................................................................................... 31
IV. Les méthodes de diagnostic ........................................................................................ 32
A. Le diagnostic du MPM : un véritable challenge ................................................. 32
B. Les méthodes de diagnostic ................................................................................ 32
1. L’imagerie .................................................................................................... 33
2. La cytologie ................................................................................................. 33
3. Histologie/immunohistochimie .................................................................... 34
8
4. Les biomarqueurs solubles ........................................................................... 36
E. D’autres méthodes de diagnostic ........................................................................ 38
V. Les traitements conventionnels du MPM ..................................................................... 39
A. La chirurgie ......................................................................................................... 39
B. La chimiothérapie ............................................................................................... 40
1. Le traitement de première ligne : cisplatine-pémétrexed ............................. 40
2. Les traitements alternatifs ............................................................................ 40
3. La chimiothérapie en deuxième ligne de traitement ? ................................. 41
C. La radiothérapie .................................................................................................. 42
D. Un traitement multimodal ................................................................................... 42
VI. Alternatives thérapeutiques pour le traitement du MPM ............................................ 42
A. L’immunothérapie ............................................................................................... 43
1. MPM et système immunitaire ...................................................................... 43
2. MPM et immunothérapie ............................................................................. 44
B. La virothérapie .................................................................................................... 44
C. Les « nouvelles cibles » ...................................................................................... 45
1. Le récepteur à l’Eph2A (erythropoietin-producing hepatocellular 2A) ...... 45
2. Le récepteur à l’EGFR ................................................................................. 45
3. Des composés anti-angiogéniques ............................................................... 46
4. La thérapie génique ...................................................................................... 46
5. Des combinaisons non conventionnelles ..................................................... 47
Conclusion......................................................................................................................... 47
CHAPITRE II : LES MÉCANISMES ÉPIGÉNÉTIQUES ........................................................ …...48
I. Généralités sur l’épigénétique ...................................................................................... 48
A. Méthylation de l’ADN ........................................................................................ 48
1. Les îlots CpG ............................................................................................... 48
2. Méthylation et intégrité du génome ............................................................. 49
3. Les enzymes de la méthylation .................................................................... 50
B. Hydroxyméthylation de l’ADN .......................................................................... 50
C. Modifications des histones .................................................................................. 51
1. Structure de la chromatine ........................................................................... 51
2. Les enzymes impliquées dans la modification des histones ............................... 54
3. La méthylation des histones ......................................................................... 54
9
4. Acétylation et déacétylation des histones .................................................... 55
II. Epigénétique et cancer .................................................................................................. 57
A. Les modifications épigénétiques dans le cancer ................................................. 57
1. Hypo-hyperméthylation dans le cancer ....................................................... 58
2. Les modifications d’histones dans le cancer ................................................ 58
B. L’influence de l’épigénétique sur la génétique du cancer ................................... 60
C. Des biomarqueurs épigénétiques ? ...................................................................... 61
III. Les composés épigénétiques de première génération ................................................. 62
A. Les inhibiteurs de la méthylation d’ADN ........................................................... 62
1. Les analogues de nucléosides ...................................................................... 64
2. Les iDNMT non analogues de nucléosides ................................................. 65
3. Limites et alternatives des iDNMT .............................................................. 65
B. Les inhibiteurs de la déacétylation des histones ................................................. 66
1. HDAC et iHDAC…. .................................................................................... 66
2. Limites et alternatives des iHDAC .............................................................. 69
IV. Les composés épigénétiques de deuxième génération ................................................ 70
A. Les inhibiteurs de l’acétylation des histones....................................................... 70
B. Les inhibiteurs de la méthylation des histones.................................................... 71
1. Mécanisme d’action général ........................................................................ 71
2. Les inhibiteurs d’EZH2................................................................................ 71
C. Les histones déméthylases .................................................................................. 72
D. Des thérapies multimodales ................................................................................ 72
V. Epigénétique et MPM ................................................................................................... 73
A. iHDAC et MPM .................................................................................................. 74
1. Les hydroxamates ........................................................................................ 74
2. Les acides gras à chaîne courte .................................................................... 74
B. iDNMT et MPM.................................................................................................. 75
C. Une combinaison iHDAC-iDNMT ..................................................................... 75
D. Les essais cliniques ............................................................................................. 75
Conclusion......................................................................................................................... 76
CHAPITRE III : LES MOLÉCULES NATURELLES ET LA CANCÉROLOGIE ......................... 77
I. Historique ..................................................................................................................... 77
A. A l’origine du cancer........................................................................................... 77
10
B. Les plantes comme traitement thérapeutique ...................................................... 78
1. Les premiers composés naturels à potentiel thérapeutique .......................... 78
2. L’histoire du paclitaxel ou Taxol® ............................................................... 78
3. Les composés naturels aujourd’hui .............................................................. 79
II. Les plantes : une source de molécules naturelles à potentiel thérapeutique ................. 79
A. Les molécules issues de plantes ciblant la tubuline ............................................ 80
1. Les Vinca alcaloïdes .................................................................................... 81
2. Les Taxanes ................................................................................................. 82
B. Les inhibiteurs des ADN topoisomérases ........................................................... 83
1. Les Epipodophyllotoxines ........................................................................... 84
2. Les Camptothécines ..................................................................................... 85
C. Les antioxydants ................................................................................................. 85
1. Oxydation et carcinogenèse ......................................................................... 85
2. Le stress oxydatif ......................................................................................... 86
D. Autres molécules ................................................................................................. 88
1. Les Flavonoïdes ........................................................................................... 88
2. Les Combrestatines ...................................................................................... 90
3. La roscovitine............................................................................................... 90
4. Le cas particulier du resvératrol ................................................................... 91
E. Le cas des isothiocyanates .................................................................................. 92
1. Le métabolisme des isothiocyanates ............................................................ 92
2. Isothiocyanates et activité anti-tumorale ..................................................... 93
3. Les mécanismes impliqués dans l’activité anti-tumorale des isothiocyanates
…………………………………………………………………………………….95
III. Composés d’autres sources naturelles ......................................................................... 97
A. D’origine microbienne ........................................................................................ 97
1. Les anthracyclines ........................................................................................ 97
2. Autres molécules .......................................................................................... 98
B. Les composés d’origine marine .......................................................................... 98
1. Un peu d’histoire.......................................................................................... 98
2. Les dolastatines ............................................................................................ 99
3. Les bryostatines ........................................................................................... 99
4. Les depsipeptides ......................................................................................... 99
IV. Molécules naturelles et Mésothéliome Pleural Malin ............................................... 100
11
A. Le ciblage du facteur de transcription SP1 (Specificity Protein 1) ................... 100
1. Les diterpènes du café ................................................................................ 100
2. La quercétine .............................................................................................. 101
B. Autres ................................................................................................................ 101
Conclusion....................................................................................................................... 102
CHAPITRE IV : LES NANOMÉDECINES ET LA CANCÉROLOGIE.………………………...103
I. Les nanoparticules conventionnelles .................................................................. ……104
A. Les liposomes .................................................................................................... 105
1. Histoire ....................................................................................................... 105
2. Composition ............................................................................................... 105
3. Les liposomes aujourd’hui ......................................................................... 106
4. Les limites associées aux liposomes .......................................................... 107
B. Les dendrimères ................................................................................................ 107
1. Composition ............................................................................................... 107
2. Les différents dendrimères ................................................................................ 108
C. Les nanoparticules polymériques ...................................................................... 108
1. Composition et synthèse ............................................................................ 108
2. Activité biologique des PNP ...................................................................... 109
D. Les nanotubes de carbone ................................................................................. 109
1. Composition des nanotubes de carbone ..................................................... 109
2. Les CNT en tant que DDS ......................................................................... 111
E. Les nanoparticules virales ................................................................................. 112
1. Virus et structure virale .............................................................................. 112
2. Les bactériophages ..................................................................................... 112
3. Les limites des nanoparticules virales........................................................ 113
F. Les nanoparticules inorganiques ....................................................................... 114
1. Composition et applications cliniques ....................................................... 114
2. Les nanoparticules d’or .............................................................................. 114
3. Les limites des nanoparticules métalliques ................................................ 115
II. Le ciblage passif : « passive targetting » .................................................................... 115
A. Les fondements de l’effet EPR ......................................................................... 116
1. Historique ................................................................................................... 116
2. La perméabilité accrue ............................................................................... 116
3. La rétention accrue ..................................................................................... 118
12
B. La taille et la charge des nanoparticules : des facteurs clés de l’effet EPR ...... 119
1. L’extravasation .......................................................................................... 119
2. L’environnement tumoral extravasculaire ................................................. 120
III. Le ciblage actif : « active targeting » ........................................................................ 121
A. Les fondements du ciblage actif........................................................................ 121
1. Le principe ................................................................................................. 121
2. Le ciblage actif : un challenge thérapeutique ? .......................................... 122
B. Les stratégies de conjugaison/accrochage des ligands ...................................... 122
1. La pré et post-conjugaison ......................................................................... 123
2. Les stratégies synthétiques de conjugaison ................................................ 124
3. Les approches non covalentes .................................................................... 125
C. L’influence de l’architecture d’une nanoparticule à ciblage actif ..................... 125
1. La densité des ligands ................................................................................ 125
2. Taille et forme des nanoparticules ............................................................. 126
3. Charge électronique etl’ hydrophobie ........................................................ 126
D. Les ligands de ciblage ....................................................................................... 127
1. Les anticorps et leurs fragments ................................................................ 127
2. Les protéines .............................................................................................. 128
3. Les peptides ............................................................................................... 129
4. Les acides nucléiques ................................................................................. 131
5. Les petites molécules ................................................................................. 132
IV. Nanomédecines et cancer .......................................................................................... 133
A. Avantages des nanotechnologies pour une application clinique ....................... 133
B. Applications cliniques de certains DDS............................................................ 134
1. Liposomes et clinique ................................................................................ 134
2. Nanoparticules de polymères et clinique ................................................... 135
3. Nanoparticules virales et clinique .............................................................. 135
C. Stratégie de ciblage actif et clinique ................................................................. 136
1. Les anticorps comme ligands ..................................................................... 136
2. Les peptides comme ligands ...................................................................... 137
3. Les aptamères d’acides nucléiques comme ligands ................................... 137
4. Les petites molécules comme ligands de ciblage actif .............................. 137
D. Des nano-systèmes acido-sensibles pour le traitement du cancer..................... 138
13
1. Objectifs des nano-systèmes à relargage acido-sensible………………..….138
2. Des DDS pH-dépendants « ionisables » .................................................... 138
3. Des peptides de fusion ............................................................................... 139
4. Des chaînes acido-sensibles ....................................................................... 139
5. L’intégration de précurseurs de dioxyde de carbone ................................. 140
E. Nanomédecine et MPM .................................................................................... 141
1. Les liposomes............................................................................................. 141
2. SWCNT...................................................................................................... 142
3. Nanoparticule de Paclitaxel ....................................................................... 142
4. Films polymériques de cisplatine ...................................................................... 142
Conclusion....................................................................................................................... 143
OBJECTIFS DE LA THÈSE .............................................................................................................. 144
RÉSULTATS ARTICLE I: Design of pH Responsive Clickable Prodrugs Applied to Histone
Deacetylase Inhibitors: A New Strategy for Anticancer Therapy……………………………..146
RÉSULTATS ARTICLE II: Nanoparticles Produced by Ring-Opening Metathesis
Polymerization Using Norbornenyl-poly(ethylene oxide) as a Ligand-Free Generic Platform
for Highly Selective In Vivo Tumor Targeting ……..…………………………………………..160
RÉSULTATS ARTICLE III: Histone Deacetylase Inhibitor-Polymer Conjugate Nanoparticles
for Acid-Responsive Drug Delivery.………………………………… …………….……………174
RÉSULTATS ARTICLE IV: Vorinostat-Polymer Conjugate Nanoparticles for AcidResponsive Delivery and Passive Tumor Targeting…………………………………………….198
RÉSULTATS ARTICLE V: Acidic pH responsive Polymer conjugate of trichostatin A
anlogue in combination with Decitabine to cure asbestos cancer ………………………….….223
RÉSULTATS ARTICLE VI: Cisplatin in combination with phenethyl isothiocyanate
(PEITC), a new therapeutic strategy for malignant pleural mesothelioma.……………….….240
DISCUSSION.......................................................................................................................... 268
RÉFÉRENCES……………………………………………………………………….……………...287
14
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Représentation du mésothéliome pleural malin………………………………..…….17
Figure 2 : Facteurs impliqués dans la tumorigenèse pleurale…………………………………...23
Figure 3 : Un processus inflammatoire comme facteur déclencheur de MM..………………..26
Figure 4 : Formules chimiques du pémétrexed et du cisplatine…………………….…….…….38
Figure 5 : La chromatine sous deux formes structurales : une transcription plus ou moins
active………………………...………………………………...…………………………….………...48
Figure 6 : Structure d’un nucléosome…………………………………………...…….…….…….49
Figure 7 : Acétylation et déacétylation des histones par les HDAC et les HAT…….….…….51
Figure 8 : Modification du groupement amine des résidus de lysines…..……………….…….62
Figure
9:
Hydrolyse
des
glucosinolates
par
la
myrosinase
et
formation
des
isothiocyanates…………………………………………………………………..............….…….90
Figure 10 : Structure chimique de trois principaux isothiocyanates…………………..….…….91
Figure 11 : Schémas des principaux DDS utilisés dans le domaine des nanomédecines..….102
Figure 12 : Schéma des trois approches de conception des liposomes……………………….103
Figure 13 : Structure schématique d’un nanotube de carbone………………………….….….107
Figure 14 : Méthodes de fonctionnalisation des CNT..………………………………………...108
Figure 15 : Ciblage de nanoparticules dans le tissu tumoral par l’effet EPR..……………….115
15
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Prévisions des pics d’incidence de MPM dans différentes nations………..….….19
Tableau 2 : Principaux marqueurs utilisés en immunohistochimie pour le diagnostic de
MPM……………...…………………………………………………………………….……....….….31
Tableau 3 : Fréquences d’altération des trois principaux TSG touchés dans le MPM en
fonction du sous-type morphologique……………………………………………………….….….34
Tableau 4 : Les modifications post-traductionnelles des histones et leur fonction
associée…………………...……………………………………………………………….……….….49
Tableau 5 : Formules, spécificité et statuts cliniques des principaux iDNMT…….......….….59
Tableau 6 : Formules, spécificité et statuts cliniques des principaux iHDAC……….....….….65
Tableau 7 : Exemples des chaînes acido-sensibles les plus communes et leurs produits de
dégradation………….………...…………………………………………….……………....……….137
16
LISTE DES ABREVIATIONS
µM: micromolaire
5hmC: 5-hydroxymethylcytosine
5mC: 5-méthyl-cytosine
AA: acides aminés
ACUPA:S,S-2-3[3-[5-amino-1carboxypentyl]-ureido]-pentanedioic acid
ADCA: adénocarcinome pulmonaire
ADP: adénosine di-phosphate
AITC: isothiocyanate d’allyle
AND: active nutrients/drug
AOL: amine oxidase like
BAP1: BRAC1-associated protein-1
Bcl-2: B-cell lymphoma 2
BCRP: breast cancer resistance protein
BER: base excision repair
BITC: benzyl isothiocyanate
BRCA1: breast cancer 1
BSP-1: bone sialoprotein-1
CA125: cancer antigen 125
CD44: cluster of differentiation 44
CDK: cyclin dependant kinase
CDKN2A: cyclin-dependent kinase
inhibitor 2A
CI-994: N-acetyl-dinaline
CK: cytokeratin
CNT: carbon nanotube
CpG: cytosine-phosphate-guanine
CPMV: Cowpea mosaic virus
CT: computed tomography
CTA: Cancer testis antigens
DDS: drug delivery system
DMBA: 7, 12-dimethylbenz[a]-anthracene
DNMT: DNA methyltransferase
ECM: extracellular matrix
EGCG: épigallocatéchine-3-gallate
EGFR: epidermal growth factor receptor
ELISA: enzyme-linked immunosorbent
assay
EMA: epithelial membrane antigen
EORTC: european organisation for
Research and Treatment of Cancer
Eph: erythropoietin-producing
hepatocellular
EPP: pneumonectomie extrapleurale
EPR: enhanced permeability and retention
ERK5: extracellular signal-regulated
kinase 5
EZH2: enhancer of zeste homolog 2
FAK: focal adhesion kinases
FDA: food and drug administration
FdCyf: 5-fluoro-2-deoxycytidine
FLIP: FLICE-like inhibitor protein
FR: folate receptor
Fz: frizzled
GAG: glycosaminoglycanes
GLUT-1: glucose transporter 1
GSH: γ-glutamylcysteinylglycine
GST: glutathione S-transferase
H&E: haematoxyline-eosine
HAT: histones acétyl transférases
hCNT1: human concentrated nucleoside
transpoter-1
HDAC: histone deacetylase
HDAC: histones déacétylases
HDM: histones déméthylases
hENT1: human equilibrative nucleoside
transporter-1
HER2: human epidermal growth factor
receptor-2
HGF/SF: hepatocyte growth factor/scatter
factor
HGF: hepatocyte growth factor
HGFR: hepatocyte growth factor-receptor
HMGB1 high-mobility group protein B1
HMT: histones méthyltransférases
HPMA: N-(2 hydroxypropyl)
methacrylamide
HUVEC: human umbilical vein
endothelial cells
IGF1: insulin-like growth factor 1
iHDAC: inhibiteur d’histone deacetylase
IMIG: international mesothelioma interest
group
IMP: international mesothelioma panel
IRM: imagerie à résonnance magnétique
17
JmjC: Jumonji C
JNK: c-Jun N-terminal kinase
KDM: déméthylases lysine-spécifique
LDL: low-density lipoprotein
LINE: long interspersed transposable
elements
LLC: leucémie lymphoïde chronique
LMA: leucémie myéloïde aigue
LqP: liquide pleural
LSD1: lysine-specific demethylase 1)
MAO: monoamine oxidase
MAP: microtubules associated proteins
MAPK: mitogen-activated protein kinases
MBD: methyl-CpG-binding domain
MCR: macroscopic complete resection
mGPS: modified Glasgow Prognostic
Score
miARN: micro ARN
MLL: mixed lineage leukemia
MM: mésothéliome malin
MMP: matrix metalloproteinase
MPF: megakaryocyte potentiating factor
MPM: malignant pleural mesothelioma
MPS: mononuclear phagocytic system
MRP: protéines de résistance aux
multidrogues
MSLN: mésothéline
m-TOR: :mammalian target of rapamycin
MWCNT: multi-walled carbon nanotube
nab-PTX : albumin-stabilised aclitaxel
NAD: nicotinamide adenine dinucleotide
NB: norbornène
NCI: national cancer institute
NDV: Newcastle disease virus
NER: nucleotide excision repair
NF2: neurofibromatosis type 2
NF-kB: nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells
NK: natural killer
NLR: neutrophil-to-lymphocyte ratio
nm: nanomètre
nM: nanomolaire
NSCLC: non small cell lung cancer
NYESO-1: New-York-esophageal cancer1
OPN: ostéopontine
P/D: pleurectomie/décortication
PAMAM: polyamidoamines
Pco: proton-coupled oligopeptide
PCR2: polycomb repressive complex 2
PDGFR: platelet derived growth factorreceptor
PEG: poly ethylene glycol
PEITC: phenethyl isothiocyanate
PEO: polethylen oxide
PET: positron emission tomography
PGA: polyglutamic acid
PHD: plant homeo domain
PITC: phenyl isothiocyanate
PKC: protéine kinase C
PLGA: acide poly(lactic-co-glycolic)
PLL: poly-lysine
PNP: Polymeric Nanoparticle
PPI: polypropylimines
PSMA: prostate specific membrane
antigen
RASSAF-1: RAS-association domain
family 1, isoform A
RB: retinoblastoma
RDM: déméthylases arginine-spécifique
RES: reticuloendoplasmic system
RGD: Arginine-Glycine-Aspartate
ROMP: ring opening metethesis
polymerisation
ROS: reactive oxygen species
RTK: récepteur à tyrosine kinase
SAH: S-adenosyl-homocysteine
SAHA: suberoylanilide hydroxamic acid =
vorinostat
SAM: S’-adénosylméthionine
SCID:
severe
combined
immunodeficiency
SET: su(var)3-9 and « enhancer of zeste »
SFN: sulforaphane
SINE: short interspersed transposable
elements
SIRT: sirtuines
18
SMANCS : styrene and maleic acid
conjugated to the antitumor protein
neocarzinostatin (NCS).
SMD: syndrome myélodysplasique
SMRP: soluble mesothelin-related peptide
SP: specificity proteins
SPIO : super paramagnetic iron oxide
SV40: simian virus 40
SWCNT : single-walled carbon nanotube
TCF/LCF: T-cell factor/lymphoidenhancer factor
TET: ten-eleven translocation
Tf: transferrine
Tf-R: récepteur à la transferrine
TGF-β: transforming growth factor β
TK: tyrosine kinase
TKI: tyrosine kinase inhibitors
TNF-α: tumor necrosis factor-α
TSG: tumor suppressor gene
US: ultrasonographie
VEGF: vascular endothelial growth factor
VHL: Von Hippel-Lindau
VPA: acide valproïque = valproate
VPF: vascular permeability factor
WD40: tryptophane-aspartate 40
WIF1: Wnt inhibitory factor-1
Wnt: Wingless integrase
WT1: Wilm’s tumor gene product
19
INTRODUCTION - Chapitre I : Le mésothéliome pleural malin
CHAPITRE I : LE MÉSOTHÉLIOME PLEURAL MALIN
I. Description de la pathologie
Le mésothéliome malin (MM) est une tumeur très agressive qui touche les membranes
séreuses enveloppant les cavités abdominales et thoraciques. La majorité des mésothéliomes
déclarés affectent la plèvre (90%), on parle de mésothéliome pleural malin (MPM), qui sera
plus largement décrit ici puisqu’étant le modèle d’étude de mon travail de thèse. Néanmoins,
4 à 7% affectent le péritoine, nommé mésothéliome péritonéal, et moins de 1% des cas
touchent le péricarde, la muqueuse vaginale ou encore la muqueuse du testicule. Autrefois
considéré comme un cancer rare, le MM est désormais envisagé comme un problème de santé
publique majeur, bien que le nombre de patients diagnostiqués chaque année pour un MM soit
assez faible (10 à 40 cas pour un million de personnes dans les nations industrialisées de
l’Ouest [1]). En effet, l’agressivité de ce cancer, le pronostic rapidement fatal, le manque de
thérapies curatives et son incidence croissante en font un cancer grave à ne pas négliger.
A. Historique
Le MPM reste un cancer dont on connaît peu sur son histoire originelle. La toute
première allusion à une tumeur affectant la paroi thoracique et plus particulièrement la plèvre
remonte à 1767 avec les travaux de Joseph Lieutaud, le père fondateur de l’anatomie
pathologique en France, où l’étude de 3000 autopsies l’amena à identifier 2 cas de « tumeurs
pleurales ». En 1819, René-Théophile-Hyacinthe Laennec, un médecin français, suggère la
plèvre comme tissu envahi par la tumeur, en se basant sur sa compréhension et son savoir sur
la nature des cellules de la plèvre. En 1908, le mésothéliome péritonéal est décrit pour la
première fois [2] et la première description histologique de mésothéliome pleural malin
remonte à 1931 avec l’étude de Klemperer et Rabin [3]. La relation entre amiante et
mésothéliome pleural malin s’établit dans les années 1950.
B. Localisation et caractéristiques physiopathologiques du MPM
1.
Localisation
Le MPM est une tumeur très agressive de la plèvre. La plèvre est une membrane
séreuse entourant les poumons. Cette membrane est constituée de deux feuillets : l’un situé
contre la paroi thoracique, c’est la plèvre pariétale, l’autre accolé aux poumons : la plèvre
20
viscérale. Ce double feuillet délimite une cavité : la cavité pleurale. Lors des mouvements
respiratoires, le liquide sécrété par la plèvre, appellé liquide pleural (LqP), permet le
glissement des deux feuillets l’un sur l’autre (Figure 1).
Figure 1 : Représentation du mésothéliome pleural malin.
Source : http://www.mesothelioma.com/mesothelioma/types/pleural.htm#!prettyPhoto.
Lors du développement d’un MPM, il se produit un épanchement pleural, c’est-à-dire
une accumulation de liquide dans cette cavité pleurale, accompagnée d’un envahissement par
des cellules mésothéliales tumorales. Cette augmentation du volume de LqP (15 mL chez un
individu sain, 1 à 2L chez un patient atteint de MPM) est responsable d’une difficulté
respiratoire dite dyspnée, qui correspond au symptôme majeur du MPM.
2.
Description physiopathologique
La plupart des MM peuvent être suspectés par une analyse histologique via un
marquage haematoxyline-eosine (H&E), mais le diagnostic est difficile, comme il en sera
discuté ultérieurement. Le MPM peut être classé en trois sous-types histologiques, et la
détermination du sous-type est un facteur qui influence fortement le pronostic de la maladie.
Ainsi le mésothéliome peut être épithélioïde, sarcomatoïde ou biphasique (contenant les deux
sous-types). Cette classification facilite le diagnostic différentiel du mésothéliome malin ou
bénin.
21
a) Le mésothéliome épithélioïde
Le mésothéliome épithélioïde est le plus commun, et représente environ 60% des
mésothéliomes déclarés. Ces tumeurs sont caractérisées par des cellules polygonales, ovales
ou cuboïdes, qui miment souvent les cellules mésothéliales réactionnelles qui prolifèrent en
réponse à divers types de blessures. Lors du diagnostic différentiel, le MPM est souvent
confondu avec l’adénocarcinome pulmonaire métastatique, d’autres types de tumeurs
épithélioïdes ou encore des proliférations mésothéliales réactionnelles [4].
b) Le mésothéliome sarcomatoïde
Le mésothéliome sarcomatoïde représente 10 à 20% des mésothéliomes et est
caractérisé par de longues cellules fusiformes à l’aspect fibroblastique, qui peuvent imiter des
tumeurs mésenchymateuses malignes telles que l’histiocytome fibreux malin, le
leiomyosarcome ou encore le sarcome synovial [5]. Un élément qui peut aider à son
diagnostic réside dans la rareté de différentiation hétérologue de type ostéoïde, os ou cartilage
dans ce tissu [6]. C’est la forme la plus agressive de mésothéliome, avec un profil de
résistance aux thérapies conventionnels encore plus important, et un pronostic vital et une
médiane de survie pour les patients qui en souffrent bien inférieurs comparé au mésothéliome
épithélioïde.
c)
Le mésothéliome biphasique
Le mésothéliome biphasique contient un mélange de zones épithélioïdes et
sarcomatoïdes au sein de la même tumeur et représente environ 30% des mésothéliomes. Est
considéré comme biphasique tout mésothéliome contenant au moins 10% de chaque type
cellulaire. Si ce n’est pas le cas, le mésothéliome est qualifié de pré-sarcomatoïde ou préépithélioïde. Dans le cas du mésothéliome biphasique, le diagnostic différentiel intègre le
sarcome synovial et d’autres types de tumeurs biphasiques ou mixtes.
C. Epidémiologie
Le MPM affecte principalement les hommes (ratio 5 :1) [7] et est souvent
diagnostiqué à un âge avancé en raison de la période de latence particulièrement longue de
cette maladie. Ce cancer est d’autant plus agressif que la médiane de survie après diagnostic
dépasse rarement 12 mois [8]. Bien que considéré comme un cancer rare en raison du faible
taux de MPM déclarés chaque année (1 à 2 par million dans la population globale [9]),
22
l’incidence parmi les personnes exposées dans leur profession est au moins 40 fois supérieure
[10]. De plus, en dépit de l’interdiction d’utiliser l’amiante dans de nombreux pays
industrialisés, (1997 en France, 2005 à l’échelle Européenne), l’incidence de la maladie est
croissante et un pic est attendu entre les années 2015 et 2025 [2]. Comme mentionné
précédemment, l’âge est un facteur important et le risque de développer un MPM est 10 fois
supérieur chez des personnes de plus de 60 ans que chez des personnes de moins de 40 ans, et
ce risque continue de croître après exposition [9]. Ainsi l’incidence est actuellement
croissante en Europe, au Japon, en Australie (Tableau 1) [10-11].
Tableau 1 : Prévisions des pics d’incidence de MPM dans différentes nations.
Source : Neumann et al, Malignant Pleural Mesothelioma : Incidence, Etiology, Diagnosis,
Treatment and Occupational Health, 2013, [11].
Les raisons de cette incidence retardée sont encore obscures, mais il est fortement
présumé qu’elle soit due à la latence moyenne de développement du mésothéliome après les
premières expositions à l’amiante, autrefois 30 ans, et révisée à la hausse, allant jusqu’à 50
ans de latence parfois avant l’apparition des premiers symptômes de la maladie [12].
De façon générale, à travers le monde, l’incidence du mésothéliome péritonéal est bien
inférieure à celle du MPM [13]. En plus de varier selon la nature du mésothéliome,
l’incidence de la maladie varie également avec la géographie, avec moins d’un cas pour un
million en Tunisie et au Maroc pour 30-40 cas pour un million aux Royaumes Unis, Australie
ou encore Belgique [1].
23
II. Etiologie
C’est l’exposition prolongée aux fibres d’amiante, dans le milieu professionnel
principalement, qui est responsable de la plus grande partie des MPM déclarés (90% des cas
[9]). Cependant, ce lien établi depuis plus de 50 ans n’explique pas tous les cas de MPM
recensés.
A. L’amiante
1.
Histoire
Le lien entre MPM et exposition à l’amiante ne se fait que dans les années 1960 avec
les travaux de Wagner et ses collègues, qui rapportent une série de cas de MPM chez des
personnes travaillant dans les mines d’amiante en Afrique du Sud [14]. Le terme d’amiante
est utilisé pour parler de façon générale de fibres minérales, qui correspondent plus
particulièrement à une famille de silicates cristallins hydratés naturels qui sont très résistants
aux hautes températures et à l’humidité. Ce sont les principales raisons qui ont amené
l’utilisation massive de l’amiante en tant qu’isolant dans le secteur industriel, en particulier
durant l’après-guerre lors de la reconstruction immobilière. La plupart des cas de MPM sont
dus à une exposition professionnelle à l’amiante, où de nombreux corps de métiers sont
touchés, de part les diverses propriétés de l’amiante (incombustibilité, imputrescibilité,
résistance thermique et chimique, résistance mécanique à l’usure, isolation acoustique,
compatibilité avec le ciment), applicables dans différents secteurs industriels. Il existe deux
sous types de fibres d’amiante, les serpentines (chrysotile) et les amphiboles (tremolite,
amosite, crocidolite, actinolite, and anthophyllite) [15]. Ce sont les crocidolites qui sont
considérées comme principales responsables des MM. L’amiante a été reconnue comme l’un
des carcinogènes les plus importants par la World Health Organization (WHO), qui a estimé
en 2010 les décès liés à l’amiante à 107.000 décès par an.
2.
Forme et taille
Les propriétés physiques des fibres d’amiante peuvent expliquer une partie de leur rôle
carcinogène, et principalement celles de plus de 5mm de long et moins de 0,25mm de
diamètre. Les fibres serpentines, assez courtes, pliables et souples, et dont le rôle dans la
carcinogenèse pleurale demeure hautement probable [16] se distinguent de la famille des
amphiboles, composée de la crocidolite, amosite, trémolite, anthophyllite et actinolite, qui
sont de longues fibres ressemblant à des aiguilles et pour qui le rôle carcinogène est
24
clairement admis [17]. Ces fibres peuvent en effet migrer vers la plèvre et les ganglions
médiastaux directement par les espaces alvéolaires sous-pleuraux, ou indirectement par le
système lymphatique, et engendrer un processus inflammatoire important. L’hypothèse
majeure de l’origine du développement du MPM repose sur l’induction par les fibres
d’amiante d’une inflammation chronique au niveau de la plèvre pariétale, conduisant à la
genèse de radicaux libres mutagènes : les ROS (Reactive Oxygen Species).
3.
Mécanismes d’action de l’amiante
Les mécanismes par lesquels les fibres d’amiante entraînent le développement de la
maladie semblent directs et indirects. Dans le cas du mésothéliome péritonéal, une fois les
fibres ingérées, elles transitent depuis les organes digestifs jusqu’à la membrane péritonéale.
Si elles sont inhalées, les fibres arrivent à la membrane péritonéale par le système
lymphatique. Une fois arrivées dans les couches cellulaires péritonéales, elles sont piégées et
provoquent une modification des cellules mésothéliales, conduisant notamment à une
irritation, une inflammation, et par des mécanismes encore peu clairs, à l’initiation du
développement tumoral. De même, en ce qui concerne le MPM, les fibres sont inhalées,
pénètrent les voies pulmonaires et sont transportées jusqu’à la plèvre [18]. Elles induisent
alors la libération indirecte de facteurs inflammatoires et de facteurs de croissance dans la
cavité pleurale [19], et le processus de tumorigenèse s’engage.
a) Le stress oxydatif
La phagocytose des fibres d’amiante à l’intérieur des cellules mésothéliales provoque
la dégranulation des lysosomes et de ce fait l’augmentation de l’oxydation intracellulaire [20].
Ceci entraîne des perturbations au niveau nucléaire et notamment des cassures de l’ADN [21],
provoquant un stress génotoxique. Certaines étapes de la mitose sont perturbées avec une
ségrégation anormale des chromosomes provoquant un stress cytotoxique [22]. De plus, les
fibres d’amiante peuvent aussi être phagocytées par les macrophages et entrainer une
augmentation conséquente de la production de ROS [23]. La morphologie des fibres
d’amiante empêche leur phagocytose, et demeurent piégées dans les macrophages, ce qui
provoque leur activation continue. C’est la phagocytose contrariée, responsable d’une
augmentation du stress oxydatif et par extension de l’inflammation, favorisant ainsi la
transformation des cellules mésothéliales vers un phénotype malin.
25
b) Influence sur le cycle cellulaire
L’incubation in vitro de cellules mésothéliales saines avec de l’amiante conduit à un
arrêt du cycle cellulaire via l’activation de p53, un facteur de transcription essentiel dans le
contrôle du cycle cellulaire [24]. De plus, certains proto-oncogènes se retrouvent surexprimés
tels que C-fos, C-jun et ces fibres d’amiante provoquent également l’activation d’une cascade
de phosphorylation activant alors la voie des mitogen-activated protein kinases (MAPK) [25]
et in fine à la production de facteurs inflammatoires. Ces mécanismes déclenchent l’activation
de la prolifération des cellules mésothéliales et leur régénération, favorisant le processus de
transformation tumorale.
B. Le simian virus 40
L’espèce de Macaques rhésus est l’hôte principal du simian virus 40 (SV40) [26], un
virus à ADN souvent retrouvé à l’état latent, mais induisant potentiellement des tumeurs chez
l’homme et considéré comme potentiel facteur étiologique du MPM [27]. Cependant, la
capacité de ce virus à induire des tumeurs chez l’homme est débattue. L’origine de cette
controverse tient au fait qu’entre 1954 et 1978, des millions de personnes se sont retrouvées
exposées à ce virus via la contamination du vaccin contre la polio par le SV40 [28].
Cependant, une revue par l’Institue of Medicine stipule qu’il n’y avait pas assez de preuves
épidémiologiques en faveur ou en défaveur de l’induction de malignité chez l’homme par la
contamination des vaccins par le SV40. Néanmoins, une analyse de biopsie de MM humains
révèle la présence de séquences du SV40 dans 50% de ces prélèvements [29]. De plus, des
études montrent que le SV40 se fixe et active un certain nombre d’oncogènes (c-Met, IGF-1
et d’autres) [30]. En revanche, d’autres études ne rapportent qu’une faible proportion de MM
avec des séquences de SV40 (5-6%), suggérant qu’à la fois la faible incidence, et la faible
quantité de SV40 présents dans les biopsies étaient en défaveur d’un rôle pathogénique
associé [31].
III. Principaux mécanismes moléculaires de la tumorigenèse
pleurale
Les mécanismes modulant la tumorigenèse pleurale ne sont pas établis de façon
formelle, et plusieurs voies de signalisation et facteurs ont été suggérés. Qu’il s’agisse de
l’amiante, du SV40, de radiations ou de facteurs non déterminés, tous peuvent concourir au
26
processus de transformation tumorale des cellules mésothéliales. Les mécanismes mis en jeu
reposent sur :
- des modifications génétiques : caryotype anormal, aneuploïdie, réarrangements
chromosomiques [32-33]. Certains auteurs suggèrent une action directe des fibres d’amiante
sur l’ADN et sur la transcription par le biais de cassures et de lésions des brins d’ADN, qui
entraineraient un arrêt précoce de la mitose par mauvaise ségrégation des chromosomes lors
de la métaphase, mais cette hypothèse demeure très débattue [34].
- des altérations de divers mécanismes moléculaires telles que la division cellulaire
accélérée, la résistance à la mort cellulaire et la migration. [35-36].
Le frein à la compréhension et à l’identification des mécanismes exacts impliqués dans
la carcinogenèse pleurale repose sur l’absence de lésions précancéreuses spécifiques, et le
temps de latence très long entre l’exposition carcinogène à l’amiante, et l’apparition des
premiers symptômes. Ces modifications vont induire l’inhibition de l’expression de certains
gènes suppresseurs de tumeurs (Tumor Suppressor Gene TSG), l’activation d’oncogènes, le
développement de processus inflammatoires, l’expression de facteurs de croissance et une
résistance à l’apoptose des cellules mésothéliales tumorales (Figure 2).
Figure 2 : Facteurs impliqués dans la tumorigenèse pleurale.
Le processus de tumorigenèse pleurale est influencé par un certain nombre de caractéristiques moléculaires.
L’environnement tumoral cytokinique favorise l’inflammation et diminue la réponse cellulaire spécifique dirigée
27
contre le MPM. De plus, la croissance des cellules tumorales nécessite son propre approvisionnement
nutritionnel, réalisé grâce à la mise en place d’une néo-angiogenèse, et est supportée par des interactions avec la
matrice extracellulaire. La perte de l’expression de gènes suppresseurs de tumeurs et la surexpression de
protéines anti-apoptotiques sont responsables de la résistance des cellules de MPM à l’apoptose. L’ensemble de
ces mécanismes concourent à l’établissement et à la croissance de la tumeur.
Source : Robinson and Lake, Advances in Malignant Mesothelioma, 2005, [36].
A. Les anomalies génétiques et épigénétiques
La plupart des mésothéliomes ont des caryotypes complexes avec une forte
aneuploïdie et un réarrangement chromosomique fréquent. La modification caryotypique la
plus commune est la perte d’une copie du chromosome 22. Plus généralement, d’autres
modifications chromosomiques comprennent des délétions dans les bras des chromosomes 1p,
3p, 9p et 6q. Enfin, certains profiles d’expression géniques sont modifiés par la présence de
mutations, de délétions ou d’anomalies de méthylation de l’ADN. Ainsi, il a été observé une
modification de certains TSG : CDKN2A (p16), RASSF1A et BAP1, et une perte de fonction
de la protéine NF2 (neurofibromatosis type 2) [37].
1.
Le gène NF2
Les mutations du gène NF2 situées sur le bras court du chromosome 22 constituent
l’anomalie génétique la plus fréquente dans le MPM [38-39]. NF2 code pour une protéine de
la famille ERM (ezrine/radixine/moésine), impliquée dans les jonctions adhérentes qui
régulent l’adhésion intercellulaire [40]. Ces jonctions sont responsables de la polarité apicobasale des cellules épithéliales mais aussi mésothéliales. Cette polarité définit la cellule dans
son état physiologique normal, mais est précocement perdue lors du processus de
transformation tumorale. NF2 interagit avec certaines protéines d’adhésion telles que CD44
(cluster of differentiation 44) ou encore FAK (focal adhesion kinase), une kinase des plaques
d’adhésion focale, mais aussi avec le récepteur c-met de l’HGF (hepatocyte growth factor)
impliqué dans les processus de migration cellulaire. De par ces interactions, la perte de
fonction de NF2 pourrait être impliquée dans l’invasion locorégionale des proliférations
mésothéliales et dans ce développement atypique endothoracique.
2.
Les gènes suppresseurs de tumeurs
a) CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)
L’une des altérations génétiques les plus communes dans le MM est la délétion
homozygote du locus 9p21, locus de plusieurs gènes clés dont CDKN2A qui code pour la
28
protéine p16 [41-42]. En effet, certaines études cytogéniques et moléculaires rapportent des
délétions de CDKN2A dans plus de 72% de MM [43-44].
Des mutations ponctuelles du TSG CDKN2A ou des méthylations de son promoteur
sont fréquemment décrites dans les mésothéliomes [45-46]. Le gène CDKN2A est impliqué
dans la régulation du cycle cellulaire, et plus précisément contrôle la transition G1/S du cycle
en inhibant les kinases cyclines-dépendantes (CDKs) D1 et E. CDKN2A est un TSG
fréquemment muté dans les cancers bronchiques mais aussi dans d’autres tumeurs solides.
b) RASSF1A (RAS-association domain family 1, isoform A)
RASSF1A est un TSG qui code pour une protéine d’une famille multigénique (RASSF1
à RASSF10) [47], et qui interagit avec Ras lorsqu’elle est activée à la membrane plasmique,
généralement après stimulation d’un récepteur tyrosine kinase (RTK) tel que l’EGFR
(epidermal growth factor receptor), le PDGFR (Platelet derived growth factor-receptor),
l’HGFR (Hepatocyte Growth Factor-receptor) ou encore c-met, tous fortement exprimés dans
les cellules de MPM. L’inactivation de RASSF1A par méthylation de son promoteur est
décrite dans 35% des cas de MPM [48]. RASSF1A a une activité pro-apoptotique mais semble
aussi réguler la transition G1/S du cycle cellulaire, ainsi que le remodelage du cytosquelette
impliqué dans l’invasion tumorale.
c)
BAP1 (BRAC1-associated protein-1)
Des altérations somatiques du gène BAP1 ont été récemment décrites dans 23% des
MPM, suggérant l’importance de ce TSG dans la tumorigenèse pleurale [49]. BAP1 est une
dé-ubiquitinase nucléaire, qui agit sur les histones, comme cofacteur de certains facteurs de
transcription, et interagit avec BRCA1 (breast cancer 1) dans les processus de réparation de
l’ADN. Il a été constaté que ce gène représentait un gène de susceptibilité au MPM,
fréquemment perdu soit par délétion chromosomique en 3p21.1 (sur lequel il est normalement
présent), soit par mutation germinale de l’allèle.
3.
Les oncogènes
Une surexpression des protéines Wnt1 et Wnt2 (Wingless Integrase) est souvent
constatée dans les cellules de MPM [50]. Ces protéines sont des facteurs qui régulent les
processus de différentiation et de prolifération cellulaire. Ils se fixent sur des récepteurs
membranaires spécifiques Fz (Frizzled), ce qui active diverses cascades de signalisation
29
intracellulaire, dont la principale a pour conséquence l’accumulation de β-caténine qui va
alors rentrer dans le noyau et se lier à des facteurs de transcription tels que TCF/LCF (T-cell
factor/lymphoid-enhancer factor) pour réguler la différentiation et la prolifération cellulaire
[51]. De plus, WIF1 (Wnt inhibitory factor-1), l’inhibiteur des protéines Wnt, est
fréquemment inactivé par méthylation de son promoteur dans les mésothéliomes, favorisant
l’activation de la voie Wnt et in fine la prolifération des cellules mésothéliales malignes [52].
B. Le processus inflammatoire
L’un des mécanismes clés impliqué dans la carcinogenèse pleurale a été démontré par
une étude se basant sur des cellules mésothéliales humaines primaires. Les auteurs montrent
l’induction par l’amiante d’une mort cellulaire par nécrose, entraînant le relargage de la
protéine HMGB1 (High-mobility group protein B1). C’est une protéine fondamentale pour la
régulation de la transcription [53], mais c’est aussi une cytokine majeure impliquée dans les
processus inflammatoires. Le relargage d’HMGB1 est responsable d’une réponse
inflammatoire chronique, de l’accumulation de macrophages et de la sécrétion de TNF-α
(tumor necrosis factor-α) qui va à son tour activer NF-kB ((nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells), conduisant à la survie des cellules mésothéliales ayant
accumulé des dommages génétiques en raison de leur exposition à l’amiante [54-55] (Figure
3).
Figure 3 : Un processus inflammatoire comme facteur déclencheur de MM.
Les fibres d’amiante sont responsables de la mort de cellules mésothéliales primaires humaines, ce qui conduit à
la libération d’HMGB1 dans l’espace extra-pleurale. Ce relargage d’HMGB1 provoque l’accumulation de
macrophages, le déclenchement d’une réponse inflammatoire avec la sécrétion de TGF-α. Le TGF-α active la
voie NF-kB, qui permet d’augmenter la survie des cellules mésothéliales après l’exposition à l’amiante. Ceci
permet aux cellules mésothéliales tumorales ayant des dommages à l’ADN suite à l’exposition à l’amiante de se
multipilier, et de potentiellement conduire au développement d’un MM.
Source : Carbone et al., Malignant Mesothelioma : facts, myths and hypothesis, 2012, [31].
30
Ces études confirment une observation faite par Liu et collègues en 1998 [56], selon
laquelle l’amiante n’est pas pathogène pour des souris transgéniques n’exprimant pas de
récepteurs au TNF-α. Cependant, il semblerait que le TNF-α agisse par deux mécanismes
antagonistes, l’un en protégeant les cellules mésothéliales d’une apoptose générée par
l’exposition à l’amiante, et l’autre en favorisant la croissance des cellules mésothéliales ayant
accumulé des altérations génétiques suite à l’exposition à l’amiante. Le rôle du TNF-α dans la
tumorigenèse pleurale reste donc encore à éclaircir.
C. Les facteurs de croissance
Le développement tumoral nécessite fréquemment l’expression de facteurs de
croissance. Ainsi, le MPM est lui aussi caractérisé par la surexpression d’un certain nombre
de facteurs de croissance impliqués dans la prolifération, l’invasion tumorale mais aussi le
processus métastatique [57]. Ainsi les facteurs suivants se retrouvent très fréquemment
surexprimés dans le MPM : le PDGF, l’IGF1 (Insulin-like Growth Factor 1), l’HGF/SF
(Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor), l’EGF et le TGF-β (transforming growth factor β)
[35]. Le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), qui stimule l’angiogenèse, est aussi
fortement surexprimé dans le MPM [58].
D. La résistance à l’apoptose
Les cellules stimulées par des signaux cellulaires spécifiques peuvent rentrer dans le
processus de mort cellulaire programmée. Dans le MPM, en plus de l’altération de certaines
protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire (p16 par exemple, mentionnée
précédemment), certaines protéines anti-apoptotiques se retrouvent surexprimées, telles que
Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), ce qui peut expliquer la résistance des cellules à l’apoptose [59].
De plus, la télomérase, une enzyme essentielle pour échapper à la mort cellulaire induite par
des perturbations des divisions cellulaires, est surexprimée dans 90% des cas de MPM [60].
En dépit des efforts portés sur la compréhension des mécanismes sous-jacents
responsables de la tumorigenèse pleurale et malgré l’identification de plusieurs voies et
facteurs impliqués, les incertitudes concernant la découverte de nouvelles stratégies
thérapeutiques et l’établissement d’un diagnostic précis demeurent un problème majeur.
31
IV. Les méthodes de diagnostic
A. Le diagnostic du MPM : un véritable challenge
Le MPM est l’une des maladies les plus difficiles à diagnostiquer pour diverses
raisons. Premièrement, les symptômes sont très peu spécifiques et communs à un grand
nombre d’autres maladies. De plus, il n’existe pas aujourd’hui de biomarqueurs qui
établissent de façon certaine le diagnostic du MPM. La dyspnée, ou difficulté respiratoire, est
le symptôme majeur du MPM, partagé par 90% des patients souffrant de MPM [61]. Ensuite,
le MPM peut provoquer des douleurs thoraciques par irritation des nerfs intercostaux ou
infiltration du LqP dans la paroi thoracique. Des symptômes plus rares tels que la paralysie du
nerf phrénique, la toux irritante, les phénomènes paranéoplasiques ou encore les
pneumothorax spontanés peuvent avoir lieu. Dans tous les cas, pour toute suspicion de MPM,
un historique complet du patient doit être effectué, avec un accent tout particulier sur leurs
activités et secteurs professionnelles. De façon générale, le diagnostic de MPM devrait être
envisagé pour tout patient avec une effusion pleurale unilatérale ou un épaississement pleural,
d’autant plus si cela est accompagné d’une douleur thoracique [62].
Le diagnostic différentiel doit intégrer l’effusion pleurale, soit d’origine infectieuse ou
inflammatoire (due à la tuberculose, une pneumonie ou un traumatisme thoracique par
exemple), soit consécutive au développement de métastases de cancers d’origines diverses ou
encore une effusion pleurale due à un encombrement veineux. La plupart des patients sont
déclarés à un stade déjà bien avancé de la maladie, en raison de l’apparition tardive des
premiers signes cliniques et de la nature atypique et élusive des symptômes développés. De
plus, le délai peut être considérable avant de donner un diagnostic définitif de MPM. Le temps
moyen pour établir un diagnostic est en effet d’environ 4 mois, mais il est fréquent que le
délai de diagnostic puisse atteindre 9 mois après la déclaration des symptômes par les patients
[63].
B. Les méthodes de diagnostic
Les méthodes de diagnostic peuvent être non invasives, c’est le cas de la radiographie
thoracique (chest X-rays), de la tomodensitométrie (CT computed tomography), de
l’ultrasonographie (US), de l’imagerie à résonnance magnétique (IRM) ou encore de la
tomographie à émission de positrons (PET positron emission tomography). Cependant, les
32
méthodes de diagnostic sont le plus souvent invasives, telles que la biopsie pleurale guidée
par imagerie (par CT par exemple), la chirurgie ou encore la laparoscopie [64].
De façon plus générale, la thoracoscopie est la meilleure technique de biopsie avec une
précision de 98%, qui peut apporter une confirmation du diagnostic grâce à une observation
du tissu plus poussée, et grâce à la cytologie, un outil de diagnostic fiable pour des
cytopathologistes expérimentés. Ainsi, un certain nombre de panels immuno-histologiques
sont envisagés dans le diagnostic différentiel du MPM de façon à le distinguer de carcinome
secondaire, ou encore d’autres types de tumeurs métastatiques qui pourraient toucher des
membranes séreuses [65].
Le diagnostic définitif s’obtient donc le plus souvent avec une combinaison de
méthodes : une analyse immunohistochimique des tissus et une corrélation avec les
caractéristiques cliniques et radiologiques [66]. Bien que certaines méthodes telles que la
cytologie ou l’histologie augmentent le niveau de suspicion de MPM, le diagnostic
clinicopathologique définitif du MPM nécessite d’observer une invasion néoplasique telle
qu’une infiltration de la graisse sous-pleurale, du muscle squelettique de la paroi thoracique,
des côtes ou encore des poumons, et ceci par un examen histologique ou avec des méthodes
d’imagerie, avec bien entendu l’exclusion clinique de causes alternatives qui seraient
responsables de la prolifération atypique des cellules mésothéliales [4].
1.
L’imagerie
Les méthodes d’imagerie sont utilisées en premier dans le diagnostic du MPM, du fait
de leur caractère non-invasif, mais ne sont pas fiables à 100%. Elles apportent un soutien
supplémentaire à une suspicion de MPM mais ne suffisent pas à établir le diagnostic final.
L’US permet une évaluation de la plèvre en présence d’une effusion pleurale et c’est le
meilleur moyen pour guider visuellement une ponction pleurale [67]. La CT est la meilleure
méthode pour évaluer à quel point la tumeur s’est étendue et pour détecter d’éventuels
métastases au niveau des ganglions lymphatiques [62]. L’IRM est plus efficace pour
déterminer si la tumeur a envahi le diaphragme ou la paroi thoracique et la PET est de plus en
plus utilisée pour sa plus grande sensibilité de détection de métastases distales [62].
2.
La cytologie
La majorité des anatomo-pathologistes considèrent comme obligatoire d’avoir une
démonstration d’invasion néoplasique pour un diagnostic définitif de MPM. La cytologie
33
consiste à observer et analyser la morphologie des cellules présentes dans divers liquides
biologiques. Bien qu’à elle seule la cytologie de LqP ne permette pas un diagnostic définitif
de MPM, ni d’invasion néoplasique, il a été décrit depuis 2007 que l’examen cytologique de
LqP de patients pouvait être suffisant dans certains cas, quand il était corrélé à l’imagerie
effectuée au préalable. L’imagerie sert donc de substitut à une démonstration histologique
d’invasion [66]. En effet, la cytologie comme unique méthode de diagnostic de MPM amène à
controverse. Bien que diverses observations cytologiques augmentent le niveau de suspicion
de MPM [68], comme par exemples une prolifération mésothéliale plus étendue, la présence
de structures papillaires dans la plèvre, des vacuoles cytoplasmiques et nécroses focales
fréquentes, les diagnostics d’hyperplasie mésothéliale réactionnelle et de MM se chevauchent.
De façon plus générale, les caractéristiques cytologiques principales de MM correspondent à
la présence de nombreux agrégats circulaires à apparence de mûre, contenant des cellules
beaucoup plus grosses que les cellules saines, à la présence de macronucleoli et à une atypie
nucléaire claire.
L’analyse
cytologique
immunocytochimiques
en
peut-être
ciblant
des
aidée
par
marqueurs
la
réalisation
de
conventionnellement
marquages
utilisés
en
immunohistochimie, mais aussi d’autres qui affineraient le diagnostic différentiel avec
l’hyperplasie mésothéliale réactionnelle. C’est le cas de l’EMA (Epithelial Membrane
Antigen) [69-71] et de GLUT-1 (Glucose transporter 1) [72], qui seraient en faveur d’un
MPM, alors que la desmine [69,71] et p16 [73] seraient en faveur d’une prolifération
mésothéliale réactionnelle bénigne.
Cependant, et la question sera plus amplement abordée dans la partie concernant les
biomarqueurs, ces marqueurs, isolés ou combinés, n’ont démontré qu’une trop faible
spécificité, cohérence et reproductibilité pour remplacer la biopsie ou l’imagerie.
3.
Histologie/immunohistochimie
L’immunohistochimie est partie intégrante du diagnostic de MM et représente à
l’heure actuelle la procédure la plus fiable et utile pour distinguer cette malignité d’autres
types de cancers. L’immunohistochimie a remplacé la microscopie électronique en tant que
méthode auxiliaire et nécessite la réalisation d’une biopsie, obtenue sous thoracoscopie, qui
reste la méthode de prédilection [74], permettant d’avoir accès au tissu lésé et sain, et ainsi de
pouvoir mener l’analyse d’un certain nombre d’antigènes et de marqueurs. Deux types de
34
marqueurs sont utilisés : des marqueurs spécifiques du carcinome pulmonaire et d’autres
spécifiques du mésothéliome malin (Tableau 2).
Tableau 2 : Principaux marqueurs utilisés en immunohistochimie pour le diagnostic de
MPM.
Source: adapté depuis Scherpereel et al, Guidelines of the European Respiratory Society and
the European Society of Thoracic Surgeons for the management of malignant pleural
mesothelioma, 2010, [74].
La combinaison exacte et le nombre d’antigènes à évaluer est variable et dépend du
diagnostic différentiel. A l’heure actuelle, la calrétinine est considérée comme ayant la plus
grande spécificité pour le diagnostic du MM, suivi de WT1 et de la podoplanine [75-76].
L’IMP (International Mesothelioma Panel) recommande d’avoir au moins un marqueur de CK
(cytokeratin) et deux autres marqueurs spécifiques du mésothéliome positifs (calrétinine et
WT1 par exemple) accompagnés de deux marqueurs de l’adénocarcinome pulmonaire
négatifs pour le diagnostic définitif de MPM. L’IMIG (International Mesothelioma Interest
Group) recommande pour les pathologistes d’avoir des marqueurs avec une sensibilité et
spécificité supérieure à 80% pour la lésion en question. De plus, l’interprétation du caractère
positif d’un marqueur doit prendre en considération la localisation du marquage (nucléaire vs
cytoplasmique) ainsi que le pourcentage de cellules marquées. Il apparaît clair que les
anticorps n’ont pas 100% de spécificité ou sensibilité, d’où la nécessité d’utiliser des panels
avant d’affirmer un diagnostic.
35
La place de l’immunohistochimie dans le diagnostic de MM est en constante évolution
et un accent est mis sur la recherche de nouveaux marqueurs ou anticorps plus sensibles ou
spécifiques. Ceci étant dit, des études suggèrent que des approches moléculaires pourraient
aider au diagnostic, telles que le profilage de l’expression de microARN (miARN) dans les
tissus tumoraux ou les échantillons extrapleuraux [77]. Ces approches sont encore néanmoins
à un stade précoce et ne peuvent pas encore être recommandées pour leur utilisation en
routine pour le diagnostic de MPM.
4.
Les biomarqueurs solubles
Les difficultés de diagnostic du MPM tiennent notamment au fait qu’il n’existe pas de
biomarqueurs spécifiques du MPM. Cependant, certains marqueurs solubles ont été identifiés
et s’avèrent utiles pour le diagnostic du MPM.
a) La mésothéline
Le principal marqueur décrit dans la littérature est la mésothéline (MSLN) et plus
particulièrement la forme soluble de cette protéine : SMRP (soluble mesothelin-related
peptide). La mésothéline du sérum fut suggérée comme potentiel biomarqueur du
mésothéliome pour la première fois en 2003 [78] en utilisant un protocole ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) et approuvée en 2007 par la FDA (Food and Drug
Administration) [79]. Par la suite, des travaux réalisés au sein de mon équipe ont permis de
mettre en évidence deux mécanismes impliquées dans la production de SMRP : des
phénomènes d’épissage aberrants ou un clivage enzymatique de la mésothéline accrochée à la
membrane [80]. Cette protéine semble prometteuse, elle permet en effet d’identifier jusqu’à
84% des MPM et n’est exprimée que dans moins de 2% d’autres malignités chez l’homme,
facilitant le diagnostic différentiel [78]. De plus, le niveau d’expression de la SMRP est
proportionnel au stade de la maladie, puisqu’il augmente avec la progression de la maladie et
à l’inverse diminue avec sa régression. Enfin, un autre atout de ce marqueur réside dans le fait
qu’il peut être dosé à la fois dans les épanchements pleuraux des patients, mais aussi à partir
de prélèvements sanguins [81]. Le problème majeur posé par la mésothéline réside dans sa
sensibilité limitée, ce qui entache sa valeur en tant que biomarqueur du MPM [82]. De plus, le
sous-type de mésothéliome représente un frein à l’utilisation de la mésothéline comme
biomarqueur du MPM. En effet, la mésothéline est absente dans les MPM sarcomatoïdes et
mixtes, le gène de la mésothéline n’étant exprimé que dans les MPM de type épithélioïde
[83], et elle n’est fortement exprimée que dans 50 à 75% des MPM épithélioïdes [84].
36
b) La fibuline-3
Une récente étude a démontré l’intérêt de la fibuline-3 comme biomarqueur du MPM.
Les auteurs se sont intéressés au niveau de fibuline-3 dans des échantillons de plasma et/ou
d’effusions pleurales de patients atteints de mésothéliome, de patients exposés à de l’amiante
sans avoir développé de mésothéliome, de patients avec des effusions bénignes ou encore de
patients sains. Une analyse immunohistologique des tissus ainsi qu’un dosage par ELISA du
niveau de fibuline-3 a permis de démontrer que selon le niveau de cette protéine, il était
possible de distinguer des personnes saines ayant été exposées à de l’amiante de patients
ayant effectivement développé un MPM. De plus, la fibuline-3 apparaît également comme
prometteuse pour différencier les effusions pleurales mésothéliales d’autres types d’effusions
bénignes ou malignes [85]. Cependant, il est nécessaire de mieux comprendre les facteurs
modulant les niveaux plasmatiques de la fibuline-3, et de réaliser des études comparatives
entre ce nouveau biomarqueur et ceux déjà en place, de façon à obtenir des combinaisons de
marqueurs pour un diagnostic de MPM fiable [86].
c)
L’ostéopontine
D’autres biomarqueurs ont été étudiés tels que l’ostéopontine (OPN), une
glycoprotéine aussi connue sous le nom de BSP-1 (bone sialoprotein-1), identifiée pour la
première fois en 1986 dans les ostéoblastes. Le niveau d’expression basal de l’OPN était
montré comme un élément prédictif indépendant négatif de la survie de patients souffrant de
MPM, mais cette glycoprotéine ne semble pas aussi spécifique de la maladie que la
mésothéline [87].
d) Autres biomarqueurs
Le CA125 (cancer antigen 125) et le MPF (megakaryocyte potentiating factor) ont
aussi été étudiés comme de potentiels outils de diagnostic de MPM, ou tout du moins pour le
screening de patients à risque. L’immunoréactivité de CD24 a récemment été identifiée
comme un nouveau marqueur potentiel du mésothéliome, permettant notamment de le
distinguer de l’adénocarcinome pulmonaire [88]. Une autre étude portant sur l’évaluation du
niveau de HMGB1 dans le sérum de patients souffrant de MPM en comparaison à des patients
précédemment exposés à l’amiante, mais n’ayant développé aucun mésothéliome, montre son
intérêt comme marqueur pronostique du MPM [89].
37
Les miARN sont désormais également connus pour leur implication dans le cancer
[90] dont le MM [91], et une étude a proposé l’association de miR-126 avec les SMRP
comme marqueur précoce de MPM [92], ou encore miR-625-3p comme nouveau marqueur
diagnostique du MPM [93]. Au vue de l’hétérogénéité biologique du MPM, il est nécessaire
d’approfondir les recherches pour trouver des biomarqueurs spécifiques de pronostic et
diagnostic du MPM.
L’utilisation des biomarqueurs comme outil de diagnostic du MPM porte à
controverse. En effet, la modeste sensibilité de la mésothéline limite sa valeur de biomarqueur
de prédilection (35-50%). De plus, elle n’est pas recommandée comme marqueur pour du
screening de personnes à risque puisqu’elle n’est surexprimée que dans moins de 15% des
personnes qui déclareront un MPM [79]. A ce jour, aucun biomarqueur dosé dans le serum
n’a montré de valeur prédictive positive suffisante pour être considéré comme unique
méthode pour le diagnostic du MPM.
E. D’autres méthodes de diagnostic
Au vu des difficultés à obtenir un diagnostic de MPM fiable, des analyses génétiques
moléculaires ont révélé trois altérations majeures qui peuvent amener à un nouvel outil
diagnostic de MPM voire de nouvelles cibles thérapeutiques. Ainsi, les gènes CDKN2A, NF2
et BAP1 sont les TSG les plus fréquemment mutés dans les cellules mésothéliales malignes
[94] (Tableau 3).
Tableau 3 : Fréquences d’altération des trois principaux TSG touchés dans le MPM en
fonction du sous-type morphologique.
Source : adapté depuis Sekido et al., Molecular pathogenesis of malignant mesothelioma,
2013, [94].
38
V. Les traitements conventionnels du MPM
La gravité du MPM réside non seulement dans ses difficultés de diagnostic, son
pronostic vital grave et sa médiane de survie faible, mais aussi dans une efficacité limitée des
traitements conventionnels appliqués à cette maladie. En effet, selon le type de MM déclaré,
le stade, et l’état général du patient, les méthodes de traitement seront plus ou moins efficaces.
On peut recenser trois approches thérapeutiques majeurs pour traiter le MPM : la chirurgie, la
chimiothérapie ou encore la radiothérapie. Ainsi on distinguera les procédures dites radicales,
c’est le cas de la chirurgie, des mesures palliatives pour soulager le patient des symptômes,
telles que le retrait de l’effusion pleurale et la prévention de leur récurrence.
Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement curatif du MPM, mais des
traitements palliatifs, visant à augmenter la durée de vie du patient et à limiter ses symptômes
pour améliorer sa qualité de vie.
A. La chirurgie
Une fois le diagnostic de MPM posé, il n’existe pas de mot d’ordre concernant le type
de chirurgie à appliquer. La chirurgie n’est en effet pas une option pour tous les patients, la
plupart du temps en raison de leur état général (personnes âgées et maladie à un stade
avancée) et de la nature diffuse de ce néoplasme [95]. Le but de la chirurgie pour le traitement
du MPM consiste à la résection totale de la tumeur, on parle de MCR (macroscopic complete
resection).
Pour
l’instant,
il
existe
deux
procédures
majeures
de
MCR :
la
pleurectomie/décortication (P/D), dont le but est de rendre sa fonction ventilatoire au poumon
en le libérant de l’effusion pleurale qui l’enserre, ou la pneumonectomie extrapleurale (EPP),
qui consiste à retirer le poumon touché, la plèvre, le péricarde et le diaphragme. C’est une
procédure hautement invasive, dont le taux de mortalité peut atteindre 50% [96]. La chirurgie
de cytoréduction est une alternative possible, visant à supprimer le plus de tissu tumoral
possible, et s’accompagne de chimiothérapie et de radiothérapie [97].
Les avantages et inconvénients de chaque méthode sont en constante discussion, mais
aucune ne semble satisfaisante pour le traitement du MPM. En effet, le principal problème de
la chirurgie appliquée au MPM vient de la nature de cette tumeur, qui tend à se propager et se
disséminer de manière diffuse, rendant pratiquement impossible la résection totale de la
tumeur et laissant du tissu tumoral résiduel en place. Des thérapies adjuvantes telles que la
chimiothérapie sont donc nécessaires pour essayer de supprimer ces tissus résiduels [96].
39
B. La chimiothérapie
1.
Le traitement de première ligne : cisplatine-pémétrexed
Il est apparu très tôt dans la littérature que l’utilisation d’une combinaison d’agents
chimiothérapeutiques était plus efficace que l’utilisation d’un agent unique. Un seul essai
clinique s’est intéressé à la comparaison entre une chimiothérapie simple à un seul agent et un
placebo. Ainsi sur les 409 patients participant à l’essai, ceux ayant reçu le traitement unique
ne bénéficiaient pas d’une augmentation de la survie significative comparé aux patients
placebo [98]. Les auteurs de plusieurs études montrent qu’une combinaison de cisplatine, un
agent alkylant, avec l’anti-métabolite pémétrexed (Alimta®) peut être efficace [99-100]. Dans
l’étude clinique de phase III de Vogelzang et al., menée sur 456 patients de MPM, le
traitement de la combinaison cisplatine-pémétrexed comparé au cisplatine administré seul a
pour conséquence une amélioration du temps de survie globale de 2,8 mois. C’est suite à ces
résultats que le cisplatine en combinaison avec le pémétrexed devint le traitement standard de
première ligne pour les patients souffrant de MPM à un stade déjà avancé [101] (Figure 4).
L’une des raisons pour lesquelles le pémétrexed est particulièrement actif dans les cellules de
MPM vient de leur forte capacité d’internalisation du pémétrexed par un transport
membranaire spécifique [102]. Cependant, le gain de survie apporté par cette combinaison et
le manque d’alternatives pour les patients qui ne répondent pas au traitement nécessite la
recherche d’autres possibilités thérapeutiques [74].
Figure 4 : Formules chimiques du pémétrexed et du cisplatine.
2.
Les traitements alternatifs
Des études visant à outrepasser les limites de la combinaison cisplatin-/pémétrexed se
sont intéressées à la combinaison de carboplatine-pémétrexed [103-105], ou encore à
40
l’utilisation de la gemcitabine, un analogue de nucléoside fluoré, mais sans résultat
prometteur [106].
Quelques études portant sur le raltitrexed (Tomudex®), un inhibiteur de la thymidine
synthase, ont montré l’intérêt de cette molécule. Un essai de phase II a montré qu’utilisé seul,
il avait un effet chez des patients souffrant de MPM [107]. Un essai plus récent de phase III
étudiant sa combinaison avec du Cisplatine a montré une augmentation de la survie globale
[101].
Un autre composé ayant suscité l’intérêt pour le traitement du MPM est la vinorelbine,
sur lequel nous revenons plus en détail ultérieurement dans cette introduction. Ce composé a
déjà fait ses preuves pour le cancer du sein [108] et le cancer du poumon non à petites cellules
(NSCLC Non Small Cell Lung Cancer) [109], et un essai clinique de phase II a suggéré que la
combinaison de la vinorelbine avec d’autres composés pourrait être bénéfique, notamment en
raison de sa faible toxicité [110]. Ainsi, une étude rapporte l’efficacité notoire du cisplatine en
combinaison avec de la vinorelbine administrée en intraveineuse, montrant un taux de réponse
et une survie comparable aux régimes de chimiothérapies les plus efficaces décrits jusqu’alors
[111].
Bien qu’ayant engendré des résultats positifs dans des essais de phase II, la
doxorubicine, l’un des agents anti-cancéreux les plus communément utilisés, fut rapidement
écartée, en raison de l’importante toxicité engendrée lors de traitements à longs termes [112114].
3.
La chimiothérapie en deuxième ligne de traitement ?
Bien qu’il soit désormais admis que la chimiothérapie comme traitement de deuxième
ligne puisse être efficace en termes de prolongation de survie et pas seulement de prise en
charge des symptômes, aucun essai clinique randomisé n’a été mené pour le MPM [115] et il
n’existe à l’heure actuelle pas de traitement de deuxième ligne standardisé pour le MPM. Une
étude stipule que si des patients avaient répondu positivement au traitement de première ligne
cisplatine-pémétrexed une première fois, le même traitement devrait être appliqué à nouveau
[116].
41
C. La radiothérapie
La radiothérapie ne tient pas une grande place dans le traitement du MPM. En effet, la
radiothérapie radicale de la tumeur entière n’est pas faisable, en raison de la complexité
géométrique de croissance de ces tumeurs. Une forte radiation de zones aspécifiques pourrait
avoir pour conséquences des dommages collatéraux sévères sur le cœur et les poumons
notamment [117]. La radiothérapie est utilisée à des fins prophylactiques, au niveau des sites
de ponction après intervention chirurgicale, mais aussi après EPP [74], pour empêcher la
récurrence locale ou pour soulager la douleur dans une stratégie de soins palliatifs. De plus, la
radiothérapie est peu adaptée au MPM en raison de sa résistance à ce régime thérapeutique
[118].
D. Un traitement multimodal
A l’heure actuelle, le traitement le plus efficace est un traitement multimodal de
chimiothérapie, chirurgie et radiothérapie post-chirurgicale. Ainsi, des études démontrent
l’efficacité de ce traitement trimodal, les patients le recevant ayant une médiane de survie de
29 mois [119-120]. Un essai de phase II conduit par la European Organisation for Research
and Treatment of Cancer (EORTC) a évalué la faisabilité de telle thérapie trimodale soit : 1chimiothérapie cisplatine-pémétrexed, 2- EPP, 3-radiothérapie post-chirurgicale [121]. Bien
qu’ayant démontré des résultats positifs, ces résultats demeurent mitigés en termes de
bénéfice thérapeutique [122] et d’importantes limites à son utilisation sont à prendre en
considération, comme par exemple l’éligibilité des patients, puisque seuls les patients dans un
stade précoce de la maladie et montrant un très bon état clinique sont susceptibles de
bénéficier d’une telle stratégie.
VI. Alternatives thérapeutiques pour le traitement du MPM
Les trois approches thérapeutiques précédemment exposées présentent des effets
bénéfiques insuffisants pour les patients, avec effets secondaires sévères fréquents. Les
patients ne répondent qu’au cas par cas aux thérapies, selon leur état clinique ou encore selon
le stade d’avancement de la maladie. De plus, les patients développent rapidement des
mécanismes de résistance, surtout pour la chimiothérapie, hors la chimiothérapie est le
traitement standardisé de première ligne pour le MPM. Il apparaît donc nécessaire de
développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement du MPM. Les efforts mis
en place pour comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie ont conduit
42
à l’identification de nouvelles cibles, et à de nouveaux biomarqueurs impliqués dans le cycle
cellulaire, l’apoptose, la prolifération ou encore l’angiogenèse [123].
A. L’immunothérapie
Il est reconnu que l’inflammation chronique joue un rôle important dans la
pathogenèse du MPM, et des indices de pronostic de MPM basés sur le degré d’inflammation
ont récemment été validés: le mGPS (modified Glasgow Prognostic Score) et le NLR
(neutrophil-to-lymphocyte ratio) [124]. A noter que le NLR était aussi suggéré comme un
facteur prédictif indépendant de survie prolongée pour des patients souffrant de MM traités
par thérapie systémique [125] ou comme un facteur de pronostic pour des patients traités par
EPP [88].
1.
MPM et système immunitaire
Il est d’ors et déjà connu que le système immunitaire joue un rôle crucial dans le
développement tumoral. En ce qui concerne la réponse immunitaire et le MPM, il a été
démontré il y a maintenant plus de 30 ans qu’il existe une corrélation entre la présence d’une
infiltration lymphocytaire et un meilleur pronostic pour les patients [126]. Le développement
tumoral est aussi tributaire du microenvironnement tumoral. Ainsi les interactions entre
cellules malignes, cellules stromales, composés de la matrice extracellulaire, cellules
inflammatoires et facteurs solubles contribuent grandement au développement et à la
progression tumorale. Il est désormais reconnu que certaines tumeurs et leur stroma
environnant génèrent un microenvironnement immunosuppresseur qui empêche l’instauration
d’une réponse immunitaire anti-tumorale potentielle [127]. Une étude immunohistologique a
démontré une infiltration massive de tumeurs de MM par des cellules immunitaires
effectrices, majoritairement des macrophages, des cellules NK (natural killer) et des
lymphocytes T (auxiliaires CD4 et cytotoxiques CD8). De façon non surprenante, cette
infiltration était accompagnée de la production de nombreuses cytokines, à la fois par les
cellules de MM et dans le LqP, pouvant potentiellement attirer ces cellules immunitaires. Bien
qu’il soit désormais admis que le MM est caractérisé par un microenvironnement tumoral
immunosuppresseur, le rôle exact des macrophages, cellules T et des autres cellules
immunitaires demeure inconnu [127]. Cependant, il a été démontré au laboratoire que les
cellules de MPM expriment des antigènes de tumeurs, MUC-1 notamment, qui peuvent être
reconnus par des lymphocytes T CD8 cytotoxiques, entraînant la lyse de la cellule tumorale
[128-129]
43
2.
MPM et immunothérapie
L’immunothérapie est un concept particulièrement attirant, hautement spécifique, et
pouvant toucher des maladies à fort potentiel de dissémination sans affecter les tissus sains
environnants. L’objectif thérapeutique vise à favoriser la reconnaissance des cellules
tumorales par les cellules du système immunitaire, de façon à activer la cytotoxicité en ciblant
des antigènes spécifiques des cellules tumorales et générer une mémoire immunitaire pour
assurer une rémission à long terme [130]. Il existe deux types d’immunothérapie antitumorale : l’immunothérapie passive, aussi appelée immunothérapie adoptive, qui vise à isoler
et activer des effecteurs avant leur injection in situ. Ce n’est pas une méthode visant à activer
le système immunitaire de manière systémique in situ. L’autre méthode est l’immunothérapie
active, appelée adaptative ou encore « vaccination », qui vise à engager une réponse
immunitaire en venant présenter des antigènes dans un contexte idéal de stimulation
immunitaire [130]. Il existe cinq principales méthodes d’immunothérapie :
-
la déplétion des lymphocytes T régulateurs et des macrophages associés aux
tumeurs [130-131]
-
la vaccination par les cellules dendritiques [132]
-
l’injection de cytokines (IFN-β, IL-2, IL-12) ou leur inhibiteurs (anti-CCL2, antiTGF-β, anti-CTLA4) [130-131] [133]
-
les thérapies immuno-adjuvantes (agonistes des TLR, injection de BCG) [134]
-
les anticorps monoclonaux anti-mésothéline (MORAb-009), qui suscitent une
cytotoxicité anticorps-dépendante [135]. Cet anticorps a été utilisé seul dans une
phase clinique I, sans démontrer d’amélioration de la maladie chez des patients
atteints de MPM [136]. Cependant le MORAb-009 démontrait un profil de toxicité
prometteur et il est actuellement en phase clinique II en combinaison avec de la
chimiothérapie (http://clinicaltrials.gov NCT00738582).
Bien que générant une réponse biologique positive telle que l’augmentation de la
population d’effecteurs cytotoxiques T CD8, ces approches d’immunothérapie semblent
n’avoir qu’un effet limité sur la survie des patients, nécessitant leur amélioration.
B. La virothérapie
La virothérapie anti-tumorale, basée sur les virus oncolytiques, est une stratégie de
traitement des cancers relativement récente en plein développement depuis le début des
44
années 2000 [137]. Cette approche est actuellement étudiée pour le traitement du MPM.
Brièvement, la virothérapie anti-tumorale vise à utiliser une souche atténuée de virus qui ne
va infecter que les cellules tumorales et entrainer une apoptose immunogène favorable à
l’induction d’une réponse immunitaire anti-tumorale. Il existe un certain nombre de virus
oncolytiques utilisés en virothérapie [137]. Mon équipe a démontré qu’une souche atténuée du
virus de la rougeole présentait des propriétés oncolytiques particulièrement intéressantes
contre le MPM [138-140], et un essai de phase I est actuellement en cours de recrutement
(http://clinicaltrials.gov/). De plus, une étude portant sur le virus génétiquement modifié NDV
(Newcastle disease virus) a montré son pouvoir oncolytique et sa capacité à induire une
rémission tumorale dans un modèle de MPM [141].
Bien que l’immunothérapie et la virothérapie soient des approches particulièrement
attrayantes dans le domaine de l’oncologie, aucune technique dans ce domaine n’a à l’heure
actuelle été validée pour le traitement du MPM, mais des essais cliniques sont en cours.
C. Les « nouvelles cibles »
1.
Le récepteur à l’Eph2A (erythropoietin-producing hepatocellular 2A)
Une étude assez récente démontre l’intérêt de cibler le récepteur à l’Eph2A pour traiter
le MPM [7]. Les récepteurs à l’Eph font partie de la grande famille des RTK qui jouent un
rôle crucial dans de nombreux processus physiologiques, le développement embryonnaire et
la progression de diverses pathologies humaines [142]. De façon générale, les Eph permettent
un système de communication cellule-cellule grâce à leur interaction avec leurs ligands : les
ephrines. Il existe deux sous-classes de récepteurs aux Eph : les Eph-A (au nombre de 9) et les
Eph-B (au nombre de 5). Le récepteur à l’Eph2A est surexprimé dans un grand nombre de
cancers, dont le MPM [143] et il a été montré in vitro que la diminution de son expression par
des siRNA induisait la mort des cellules de MPM [143-144]. Les mécanismes d’inhibition de
la croissance tumorale ne sont pas encore bien compris, mais le récepteur à l’Eph2A apparaît
comme une cible intéressante pour aborder le traitement du MPM.
2.
Le récepteur à l’EGFR
Lors du développement d’un MPM, il est fréquent que le récepteur à l’EGFR soit
surexprimé, stimulant les recherches vers l’utilisation d’inhibiteurs de l’EGFR. Ainsi, deux
molécules ont été identifiées comme de potentielles options thérapeutiques dénommées
EGFR-tyrosine kinase inhibitors (TKIs) : le gefitinibe et l’erlotinibe. Des études in vitro ont
45
montré que le gefitinibe inhibe la croissance de cellules de MPM et empêche leur survie en
bloquant la phosphorylation de l’EGFR par les TK (tyrosine kinase) et en stabilisant les
dimères inactifs d’EGFR [145-146]. De plus, tout comme dans le NSCLC dans lequel une
mutation de l’EGFR présente dans le domaine TK était prédictive d’une réponse positive aux
thérapies [147], des mutations de l’EGFR dans le MPM ont récemment été identifiées comme
indicatrices d’une issu favorable pour les patients [148].
3.
Des composés anti-angiogéniques
Si le VEGF n’apparaît pas comme la cible idéale pour le traitement du MPM, il reste
utile en tant que facteur pronostique. En effet, la concentration du VEGF dans le sérum est
beaucoup plus élevée chez les patients souffrant de MPM, comme l’a montrée une étude
comparant 51 patients de MPM avec 42 individus atteints de maladies bénignes liées à une
exposition à l’amiante ou bien sains malgré une exposition à l’amiante [149]. La voie de
signalisation du VEGF tient un rôle important dans le MPM et de nombreux composés dits
anti-angiogéniques ont été étudiés dans des essais cliniques tels que le bevacizumab
(Avastin®), le SU5416, le vatalanibe, le thalidomide ou encore le sorafenibe, mais n’ont
montré qu’une activité limitée lorsqu’utilisés seuls. De plus amples études sont donc
nécessaires pour améliorer l’approche anti-angiogénique appliquée au MPM [150]. Ainsi un
essai clinique de phase II mené en combinant le bevacizumab au cisplatine ou à la
gemcitabine ne montre pas d’effets significativement positifs en termes de survie globale
[151]. Le valatinibe, un inhibiteur de l’activité TK du VEGFR, a montré un taux de réponse
de 11%, un taux de stabilisation de la maladie de 66% et une médiane de survie pouvant
atteindre 10 mois d’après un essai clinique de phase II. D’autres essais suggèrent un potentiel
thérapeutique pour les stratégies ciblant l’angiogenèse, cependant les résultats demeurent
insuffisants et des études plus poussées sont nécessaires.
4.
La thérapie génique
La thérapie génique consiste à modifier le matériel génétique au niveau cellulaire pour
modifier le comportement de certaines cellules. Des souches de virus atténuées sont souvent
utilisées comme transporteurs du matériel génétique à délivrer dans la cellule. Certaines
thérapies géniques visent à affecter les capacités de réplication des cellules tumorales,
empêchant ainsi la dissémination de la tumeur. D’autres ciblent certains gènes de façon
spécifique pour rendre les cellules plus sensibles à certains composés thérapeutiques. Une
étude prometteuse montre des effets bénéfiques de vecteurs d’adénovirus (Ad5/MKp-E1 et
46
Ad5F35/MKp-E1) sur des cellules de MM [152], présentant une activité oncolytique
nécessaire et suffisante sur quatre lignées de MM humaines.
5.
Certaines
Des combinaisons non conventionnelles
études
se
sont
intéressées
à
une
combinaison
de
traitement
d’ascorbate/épigallocatéchine-3-gallate/gemcitabine, aussi connue sous le nom d’AND pour
Active Nutrients/Drug. Les auteurs montrent une synergie de ces molécules in vitro dans un
modèle de MPM avec un blocage de la progression tumorale et du processus métastatique in
vivo dans un modèle de xénogreffe [153].
De plus, la combinaison d’un inhibiteur de ERK5 (extracellular signal-regulated
kinase 5) avec des agents chimiothérapeutiques s’avère être une thérapie multimodale
bénéfique chez des patients souffrant de MM [154].
Conclusion
Le MPM est une maladie qui pose donc divers challenges, tant au niveau de sa prise
en charge thérapeutique que de son diagnostic. C’est une maladie particulièrement difficile à
identifier, et il est souvent trop tard pour intervenir lorsqu’elle est enfin diagnostiquée. De
plus, les stratégies thérapeutiques appliquées à l’heure actuelle ne génèrent que de modestes
bénéfices aux patients. Il apparaît donc nécessaire d’étendre les recherches pour trouver de
nouvelles stratégies thérapeutiques, ainsi que de nouvelles pistes pour diagnostiquer au mieux
cette maladie.
47
INTRODUCTION - Chapitre II : Les modifications épigénétiques
CHAPITRE II : LES MODIFICATIONS ÉPIGÉNÉTIQUES
Malgré un patrimoine génétique unique, le devenir des cellules au cours du
développement de l’organisme varie. Les morphologies, fonctions cellulaires, phénotypes
sont différents, et ces variations peuvent être conservées après plusieurs cycles cellulaires.
Ceci suggère l’existence d’une mémoire de l’identité cellulaire, une signature permettant à la
cellule de « se rappeler » quelle fonction, morphologie et fonction biologique elle est amenée
à adopter au sein de l’organisme. En effet, il est maintenant admis que l’ADN à lui seul ne
peut pas expliquer toute la diversité biologique. C’est en 1942 que Waddington propose le
concept d’« épigénétique », suggérant un support de l’information génétique autre que la
séquence d’ADN [155]. On entend par altération épigénétique une modification héréditaire de
l’expression génétique sans affecter la séquence d’ADN, et suffisamment importante pour
réguler la dynamique d’expression génétique [156].
I. Généralités sur l’épigénétique
Le cancer, à l’origine considéré comme une maladie résultant d’aberrations
génétiques, est à l’heure actuelle reconnu pour posséder des altérations épigénétiques en plus
des mutations génétiques qui le caractérisent. Il est en effet clair que les perturbations
épigénétiques générées par le microenvironnement jouent un rôle crucial dans le
développement néoplasique [157]. Les mécanismes clés responsables de la régulation
épigénétique et sur lesquels nous revenons plus en détail dans ce chapitre sont la méthylation
de l’ADN, les modifications du statut d’acétylation ou de méthylation des histones, ou encore
la régulation génique post-transcriptionnelle par des ARN non codants communément appelés
miARN [158]. Ces mécanismes sont des processus importants dans le développement et la
croissance physiologique cellulaire, mais leur modification contribue grandement au
phénotype tumoral [159].
A. Méthylation de l’ADN
1.
Les îlots CpG
Dans le règne eucaryote, la méthylation de l’ADN est impliquée dans des
modifications épigénétiques jouant un rôle important dans divers processus physiologiques
cellulaires : le maintien de l’intégrité du génome, l’empreinte génomique, la régulation
transcriptionnelle et le processus de développement [160]. La méthylation de l’ADN
48
correspond à l’ajout d’un groupement méthyle –CH3 à la place d’un atome d’hydrogène le
plus souvent en position 5’ des résidus de cytosines des dinucléotides CpG (Cytosinephosphate-Guanine), résultant en une 5-méthyl-cytosine (5mC). Ces dinucléotides sont
regroupés dans les régions proximales des promoteurs de 60% des gènes. Il en résulte la
répression de l’expression de certains gènes. Les dinucléotides CpG ne sont pas répartis de
façon uniforme dans le génome et sont concentrés dans des régions appelées îlots CpG. Les
cytosines méthylées ne représentent qu’1% des nucléotides totaux et près de 75% des
dinuclétotides CpG présents dans le génome humain, estimé à 29000 séquences. L’importance
des îlots CpG dans le génome tient au fait qu’ils sont principalement localisés au niveau des
promoteurs de gènes [161]. La plupart des dinucléotides CpG du génome sont à l’état
méthylé, mais les îlots CpG des promoteurs sont le plus souvent à l’état non méthylé dans les
tissus normaux [161]. La méthylation de l’ADN va plus généralement favoriser la forme
hétérochromatine de la chromatine, synonyme d’une répression de la transcription, alors que
la déméthylation est un processus qui favorise l’activation de la transcription. La méthylation
de l’ADN peut entraîner l’inhibition de l’expression de certains gènes directement en
empêchant l’accrochage de certains facteurs de transcription ou indirectement en recrutant des
protéines possédant un domaine MBD (methyl-CpG-binding domain). Ces protéines à
domaine MBD vont alors recruter des complexes qui vont modifier les histones et la
chromatine, et engendrer la méthylation de certains sites [162]. Le processus de méthylation
des résidus de cytosine de l’ADN est donc un composant critique de la régulation génétique.
2.
Méthylation et intégrité du génome
De plus, dans les cellules normales, la méthylation de l’ADN se produit
principalement dans des régions génomiques répétitives, telles que les ADN satellites et les
éléments parasites tels que les LINEs (long interspersed transposable elements) ou encore les
SINEs (Short Interspersed transposable elements) [163]. Autrefois considérées comme l’ADN
« poubelle », les séquences répétées dispersées dans le génome ont suscité un grand intérêt
ces dernières années. Un tiers du génome de mammifères serait composé de ces éléments
appelés de façon générale des éléments transposables [164]. Ces éléments transposables
existent sous deux formes : les transposons et les rétrotransposons. Les transposons sont des
séquences d’ADN capables de se déplacer d’un site à un autre par un mécanisme « coupercoller », appelé transposition. Les rétrotransposons sont des séquences d’ADN capables de se
déplacer, mais contrairement aux transposons, ils sont aussi capables de se multiplier par un
mécanisme de « copier-coller ». Ainsi, la copie d’une séquence originelle peut se retrouver
49
intégrée dans une nouvelle région du génome. Ces séquences sont donc fortement impliquées
dans la stabilité du génome, et il apparaît primordial de conserver ces éléments mobiles et
amplifiables transcriptionnellement réprimés, de façon à maintenir l’intégrité du génome
[165]. La méthylation de l’ADN joue un rôle clé dans la régulation de l’expression génique, et
plus particulièrement dans la répression des éléments transposables, de façon à maintenir cette
intégrité génomique [166].
3.
Les enzymes de la méthylation
La modification des cytosines en 5mC est catalysée par des enzymes appelées ADN
methyltransférase (DNMT, DNA methyltransferase), dont le substrat donneur du groupement
méthyle est le S’-adénosylméthionine (SAM). Il en existe trois principales : la DNMT1,
DNMT3A et DNMT3B. La DNMT1 permet de maintenir les profils de méthylation déjà en
place après la réplication de l’ADN en reconnaissant et méthylant l’ADN hémi-méthylé
durant la réplication de l’ADN [167]. Les DNMT3A et 3B sont des enzymes qui induisent
une méthylation dite de novo, spécifiquement exprimées lors de l’embryogenèse alors qu’elles
le sont beaucoup moins au moment de la vie adulte. Il existe un dernier type de DNMT, la
DNMT-3L, qui ne possède pas de propriétés de méthylation intrinsèques mais interagit avec
les DNMT-3A et 3B pour faciliter la méthylation des rétrotransposons [168] et ciblent les
îlots CpG non méthylés pour initier le processus de méthylation [169]. En se liant à l’ADN,
elle est capable de recruter la DNMT-3A qui peut alors exercer son activité de méthylation.
L’initiation ainsi que le maintien de la méthylation de l’ADN sont tous deux des processus
critiques pour la survie de l’organisme, comme l’ont démontré des études sur un modèle
murin, dans lequel une déplétion en enzymes DNMT-3B ou DNMT1 conduisait à leur mort
prématurée à l’état embryonnaire, et où une déplétion en DNMT-3A conduisait à la mort des
souris au plus tard 4 semaines après la naissance [170].
B. Hydroxyméthylation de l’ADN
L’hydroxyméthylation de l’ADN a été identifiée en 2009 comme nouveau déterminant
épigénétique [171]. Ce sont les enzymes de la famille des dioxygénases ten-eleven
translocation (TET) au nombre de trois : TET1, TET2 et TET3 qui sont responsables de
l’oxydation des 5mC en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC). Sous une activité locale modérée
des TET, la 5hmC peut persister telle une signature épigénétique stable. Contrairement à la
5mC, la 5hmC est le plus souvent associée à une activation de la transcription, probablement
en raison des différences de propriétés d’accrochage des facteurs de transcription à cette base
50
modifiée [172]. Dans des conditions physiologiques normales, la 5hmC sert d’intermédiaire
actif à la déméthylation de l’ADN durant la reprogrammation des cellules germinales en
cellules totipotentes, ainsi que durant le développement embryonnaire [173]. De plus, la
5hmC semble impliquée dans le développement neuronal. Une étude menée sur modèle murin
montre en effet qu’une inactivation par siRNA des gènes de TET2 et TET3 causait
l’accumulation de neurones indifférenciés dans les zones ventriculaires et intermédiaires du
cortex [174]. De plus, la 5hmC joue un rôle dans la progression tumorale et le processus
métastatique, le niveau de 5hmC étant en effet significativement réduit dans un grand nombre
de cancers [175].
C. Modifications des histones
1. Structure de la chromatine
a) La chromatine
Les modifications d’histones influencent la structure de la chromatine, qui joue un rôle
crucial dans la régulation des gènes et par extension dans la carcinogenèse [176]. La
chromatine est le support de l’information génétique dans la cellule. C’est la forme sous
laquelle s’organise l’ADN dans le noyau des cellules. Elle est composée d’ADN, de
protéines : les histones, et d’autres protéines condensées formant un complexe
nucléoprotéique [177]. La chromatine existe sous deux formes : l’hétérochromatine,
condensée, caractérisée par une transcription inerte, et l’euchromatine, décondensée et
permettant une transcription active. L’euchromatine présente un fort taux d’acétylation et de
triméthylation des résidus de lysine 4 de l’histone H3 (H3K4), lysine 36 de l’histone H3
(H3K36) et lysine 79 de l’histone H3 (H3K79). A l’inverse, l’hétérochromatine est
caractérisée par un faible taux d’acétylation au niveau des résidus lysine 9 et 27 de l’histone
H3 (respectivement nommées H3K9,
H3K27), et du résidu lysine 20 de l’histone H4
(H4K20). Parallèlement, ces mêmes résidus ont un fort taux de méthylation, notamment la
triméthylation de H3K27. Une étude a notamment montré l’intérêt de connaître l’état de
modification des histones en termes de prédiction d’expression génique [178]. D’autres
travaux ont montré que certaines combinaisons de modifications des histones dans des régions
génomiques bien spécifiques conduisaient à un état « ouvert » ou « fermé » de la chromatine,
entrainant une activation ou une répression de l’expression de certains gènes (Figure 5) [179].
51
Figure
5:
La
chromatine sous deux
formes structurales :
une
transcription
plus ou moins active.
L’euchromatine
est
la
forme relâchée de la
chromatine et est associée à
une transcription active.
L’hétérochromatine quant à
elle est compacte et
associée à une transcription
inactive.
Source : Sha, K. and
Boyer, L. A., stemBook
2009.
b) Les nucléosomes et les protéines histone
La chromatine est une structure très organisée, composée d’une répétition de motifs
appelés nucléosomes, décrits pour la première fois dans les années 1970, suite à la digestion
de l’ADN par des nucléases en fragments de 200 Pb [180]. Par la suite, une observation plus
poussée grâce aux progrès de la microscopie a permis de décrire une structure en collier de
perles. Chaque nucléosome est constitué de 146 pb d’ADN enroulées autour d’un octamère
d’histones. Il existe cinq familles d’histones : H1, H2A, H2B, H3 et H4. Chaque octamère est
composé de deux sous unités des quatre histones : H2A, H2B, H3 et H4 [181]. HA2, H2B, H3
et H4 forment le cœur octamérique du nucléosome. Les histones H1 sont dites de liaison.
Elles ne participent pas à la formation des « perles » de nucléosomes, mais permettent de
maintenir en place le brin d’ADN qui s’enroule autour du nucléosome et de stabiliser la
chromatine entre deux nucléosomes (Figure 6).
52
Figure
6:
nucléosome.
Structure
d’un
Les histones H2A, H2B, H3 et H4 toutes deux
en duplica constituent le cœur octamérique du
nucélosome. L’histone H1 a un rôle de
maintien de l’ADN s’enroulant autour des
nucléosomes.
Les histones sont de petites protéines basiques qui contiennent un domaine globulaire
et une portion distale -NH2 flexible, chargée : c’est la queue de l’histone qui dépasse du
nucléosome. La régulation de l’expression des gènes passe par des modifications posttraductionnelles covalentes de la queue des histones, principalement l’acétylation, la
méthylation, mais aussi la phosphorylation, l’ubiquitination, la sumoylation, l’isomérisation
des prolines ou encore la ribosylation de l’ADP (adénosine di-phosphate) [179]. L’ensemble
de ces modifications peut être résumé dans un tableau (Tableau 4).
Tableau 4 : Les modifications post-traductionnelles des histones et leur fonction
associée.
Source : Adapté depuis Kouzarides, Chromatine modifications and their function, 2007 ,
[182].
53
2. Les enzymes impliquées dans la modification des histones
L’acétylation et la méthylation suscitent un intérêt tout particulier en raison de leur
forte implication dans le processus de carcinogenèse. Ce sont ces modifications posttraductionnelles de la queue des histones qui gouvernent le statut structural de la chromatine
et in fine le statut de transcription et d’expression de certains gènes. Ces modifications sont
réversibles et contrôlées par des enzymes, principalement :
-
les HAT : histones acétyl transférases
-
les HDAC : histones déacétylases
-
les HMT : histones méthyltransférases
-
les HDM : histones déméthylases
D’autres familles d’enzymes sont plus rarement impliquées : les phosphatases,
kinases, ligases ou encore protéases.
3. La méthylation des histones
La méthylation des histones est une modification post-traductionnelle clé pour la
régulation du cycle cellulaire, le développement embryonnaire, ou encore les dommages à
l’ADN. De nombreuses études ont montré un lien entre anormalités de méthylation des
histones et cancer [183]. Deux familles d’enzymes sont impliquées: les HMT et les HDMs.
Les HMT catalysent la réaction de méthylation des histones, soit l’ajout d’un groupement
méthyle –CH3 sur les trois résidus basiques : lysine, arginine et histidine, bien que la
méthylation de l’histidine soit un phénomène rare et peu étudié. Quelque soit le résidu
accepteur, le SAM est toujours le donneur du groupement méthyle. C’est la paire d’électrons
libres présente sur l’atome d’azote de la lysine ou de l’arginine qui agit comme une attaque
nucléophile sur le cation électrophile méthyl-sulfonium, donnant lieu, suite à une série de
réactions, à une lysine ou arginine méthylée et au relargage de S-adenosyl-homocysteine
(SAH) [184]. Les HMT chez l’homme contiennent un domaine SET (su(var)3-9 and
« enhancer of zeste ») fondamental correspondant au domaine catalytique, composé d’environ
130 AA, organisé en une série de feuillets-β repliés.
L’impact de la méthylation des histones est moins clair que les modifications
d’acétylation des histones sur lesquelles nous revenons dans le point suivant, et varient en
fonction des résidus méthylés. En effet, les mécanismes de méthylation ne sont pas clairement
associés à une activation ou répression transcriptionnelle. La méthylation des résidus lysine 4,
54
36 et 79 de l’histone H3 est associée à une activation de l’expression génique alors que la
méthylation au niveau de H3K9, H3K27 et H4K20 est le plus souvent associée à une
répression de la transcription. De plus, les résidus peuvent être mono-, di- ou tri-méthylés et la
méthylation peut être asymétrique, rajoutant encore un niveau de complexité à ce mécanisme
et à ses conséquences. Quatre domaines protéiques spécifiques permettent la reconnaissance
des marques d’histones méthylées : le chromodomaine, le domaine WD40 (tryptophaneaspartate 40), le domaine PHD (Plant Homeo Domain), tous trois impliqués dans la
reconnaissance des lysines méthylées. Le quatrième domaine, Tudor, reconnaît quant à lui
aussi bien les lysines que les arginines méthylées.
4. Acétylation et déacétylation des histones
a) Acétylation des histones
L’acétylation des histones concerne principalement les résidus lysines (K). Il existe un
équilibre physiologique entre acétylation et déacétylation des histones, régit par deux familles
d’enzymes précédemment mentionnées : les HAT et les HDAC. Cet équilibre se retrouve
perturbé dans divers types de cellules tumorales, et tend vers une augmentation de la
déacétylation des histones. L’état déacétylé des histones est associé avec une chromatine
condensée, et donc une moindre disponibilité des gènes à leur transcription. A l’inverse, l’état
acétylé des histones tend vers une chromatine décondensée et donc des gènes beaucoup plus
disponibles à la transcription (Figure 7).
Figure 7 : Acétylation
et déacétylation des
histones
par
les
HDAC et les HAT.
L’acétylation des histones
est un équilibre régit par
deux familles d’enzymes :
les HDAC qui catalysent les
réactions de déactylation et
les HAT qui catalysent les
réactions d’acétylation. Cet
équilibre a un impact direct
sur le degré de compaction
de la chromatine, et par
extension sur le degré de
transcription du matériel
génétique.
Source :
http://cellways.blogspot.fr/
55
L’acétylation des histones a deux conséquences principales:
-
Une première physico-chimique qui instaure un changement de charge des
histones. Dans des conditions physiologiques, les histones sont chargées plutôt positivement,
ce qui favorise leur interaction avec l’ADN, chargé plutôt négativement. L’acétylation des
histones modifie leur charge positive, ce qui va diminuer leur affinité pour l’ADN, changeant
alors la structure conformationnelle de la chromatine pour passer à une forme décompactée
associée à une transcription active [185-187].
-
La deuxième étant la mise en place d’un « code histone ». Il a en effet été
suggéré que certaines acétylations de lysines spécifiques entraînaient la liaison de protéines
régulatrices et ainsi l’activation ou inhibition de la transcription de gènes cibles [188].
Il existe 4 familles d’HAT :
-
la superfamille des GNAT (GCN5 related N acetyltransferase),
-
la superfamille des MYST (MOZ, Ybf2, Sas3, Sas2 et Tip60)
-
la famille CBP/p300
-
la famille SRC
b) Déacétylation des histones
La suppression du groupement N-acétyl des résidus lysines des histones est catalysée
par les HDAC. Il en existe 18 répertoriées à ce jour, classées en 4 familles selon leur
homologie de site catalytique [189] :
-
les HDAC de classe I, associées au gène des levures Rpd3, comprenant les
HDAC1-2-3 et 8, principalement localisées dans le noyau, bien que les HDACs 3
et 8 puissent parfois être localisées dans le cytoplasme [184]
-
les HDAC de classe II, associés au gène des levures Hda1, subdivisées en deux
classes : La classe IIa constituées des HDAC 4-5-7 et 9 et la classe IIb constituées
des HDAC 6 et 10, localisées à la fois dans le cytoplasme et dans le noyau.
-
la classe III regroupe les HDAC homologues à la levure Sir2, qu’on appelle les
sirtuines (SIRT), numérotées de 1 à 7 chez l’homme, situées dans le cytoplasme, le
noyau ou les mitochondries.
-
l’HDAC11 constitue la classe IV à part entière, mais possède des caractéristiques
communes aux classes I et II et notamment un domaine conservé similaire au
domaine catalytique de ces deux classes d’enzymes.
56
Cette classification a son importance du fait de la spécificité plus ou moins aigue de
certains inhibiteurs d’HDACs sur lesquels nous reviendrons ultérieurement qui vont cibler
une classe plus qu’une autre par exemple.
II. Epigénétique et cancer
A. Les modifications épigénétiques dans le cancer
Dans les cancers humains, les aberrations épigénétiques sont maintenant connues pour
leur contribution à différentes phases du développement néoplasique, dont l’initiation, la
promotion, l’invasion, le processus métastatique ainsi que les mécanismes de résistance,
notamment résistance à la chimiothérapie. Il a récemment été suggéré que plus de 300 gènes
ou produits de gènes étaient altérés de manière épigénétique dans de nombreux types de
cancers [159]. Le lien entre modifications épigénétiques et cancer a été suggéré pour la
première fois en 1983, lorsqu’il a été démontré que le génome de cellules cancéreuses de
colon était hypométhylé comparé au génome de cellules saines [190]. Ces résultats ont par la
suite été confirmés par une autre étude qui a analysé la teneur en 5mC d’un plus grand panel
de cellules tumorales en tirant la même conclusion : une réduction de la méthylation globale
dans les cellules malignes comparé aux cellules saines [191].
L’inactivation de l’expression de TSG est le mécanisme clé par lequel les
modifications épigénétiques contribuent à la tumorigenèse, bien qu’il existe de rares cas où
les modifications épigénétiques vont activer l’expression de certains gènes. La modification
de l’acétylation ou de la méthylation des histones est maintenant corrélée à de nombreux
cancers. Ainsi, la perte d’acétylation de H4K16 ou de la triméthylation de H4K20 est
communément retrouvée dans de nombreux cancers chez l’homme [192]. De plus, une
diminution globale de la méthylation de H3K4, de l’acétylation de H3K18, de la méthylation
de H3K9 ou de la tri-méthylation de H3K27 a été associée à un mauvais pronostic pour les
cancers de la prostate, du rein, du sein, de l’ovaire et du poumon [193-194]. Cependant, ces
changements épigénétiques de méthylation ou d’acétylation sont le plus souvent la
conséquence d’altérations spécifiques des enzymes associées. Ces altérations peuvent être des
mutations, des délétions, des expressions altérées ou encore des translocations, et ont été
observées dans un large spectre des familles d’enzymes impliquées : DNMT, HDAC, HAT,
HMT ou encore HDM.
57
1.
Hypo-hyperméthylation dans le cancer
Dans les cellules tumorales, le génome est globalement hypométhylé et ce sont des
sites spécifiques des îlots CpG de certains promoteurs qui sont hyperméthylés [195-196].
Cette hypométhylation globale du génome a diverses conséquences. D’une part, elle induit
une activation de gènes spécifiques : des oncogènes, mais aussi des gènes de la famille des
cancer testis (CT) dans laquelle on retrouve les CTA (Cancer testis antigens) [197]. D’autre
part, cette hypométhylation engendre une instabilité chromosomique, la déméthylation des
séquences satellites favorisant en effet les cassures d’ADN et les recombinaisons anormales.
Le processus de tumorigenèse est aussi associé à l’hyperméthylation de certains gènes,
et en particulier de certains promoteurs de TSG. C’est l’étude de l’hyperméthylation du
promoteur du gène RB (retinoblastoma) entrainant sa perte d’expression qui a permis de
mettre en évidence l’implication de l’hyperméthylation spécifique d’un de ses allèles dans le
processus oncogénique [198]. Suite à cela, un nombre important de TSG ont été décrits
comme gènes réprimés dans divers types de cancers suite à une hyperméthylation de leur
promoteur, tels que VHL (Von Hippel-Lindau), CDKN2A, BRCA1, RASSF1A. Ces gènes sont
impliqués dans divers processus cellulaires tels que le cycle cellulaire, la réparation de l’ADN
ou encore certaines voies de transduction.
De plus, il existe une hyperméthylation qui va affecter l’expression d’enzymes
impliquées dans la régulation de ces mécanismes épigénétiques, telles que les DNMT, les
HAT ou encore les HMT. Les conséquences d’une hypo-hyperméthylation dans le processus
de tumorigenèse sont donc non négligeables et méritent de faire de la méthylation un sujet
suscitant un plus grand intérêt quant à son potentiel thérapeutique anti-tumoral.
2.
Les modifications d’histones dans le cancer
L’hypoacétylation et l’hyperméthylation des histones sont caractéristiques de
séquences d’ADN qui sont réprimées dans les cellules normales, comme par exemple le
chromosome X inactif chez les femelles. Cependant, la tendance actuelle vise à penser qu’une
combinaison spécifique de modifications d’histones confère l’état général d’expression de
certaines régions de la chromatine, une théorie que l’on nomme le « code histone », encore à
ce jour loin d’être entièrement comprise [199]. En plus de leur influence sur l’expression
génique, des preuves émergeantes indiquent que des modifications spécifiques d’histones
interviennent dans d’autres processus nucléaires tels que la voie de réparation de l’ADN
58
[200]. De plus, la modification des histones avec la méthylation de l’ADN ont un rôle vital
dans l’organisation de l’architecture nucléaire, ce qui en retour suggère une implication dans
d’autres processus nucléaires tels que la transcription. En somme, l’altération globale des
motifs de modification d’histones a le potentiel d’affecter la structure et l’intégrité du
génome, donc de modifier les profils d’expression génique physiologiques normaux,
augmentant les facteurs de risque de cancer [201].
Les modifications des histones sont liées aux modifications de méthylation de l’ADN
abordées précédemment, notamment par l’interaction conjointe de HMT avec certaines
DNMT [176,202]. Ainsi la méthylation de certains promoteurs de TSG est souvent associée à
une déacétylation des histones H3 et H4 et à une méthylation des lysines 9 et 27 de l’histone
H3, suggérant une corrélation entre méthylation de l’ADN et modifications épigénétiques des
histones dans l’activation de certains oncogènes et parallèlement la répression des TSG
[176,203]. L’hyperméthylation aberrante de H3K9 et H3K27 est en effet impliquée dans
l’inactivation de certains TSG dans différents types de cancer (colorectal, prostate, sein) [204205]. Un cas particulier d’activation de gène est observé dans la leucémie myéloïde aigue
(LMA) avec l’hyperméthylation inappropriée de H3K79 à des loci spécifiques du gène MLL
(mixed lineage leukemia), favorisant la progression et le développement de la leucémie [206].
Ainsi une étude a rapporté la relation entre l’apparition de la marque H3K9me et la répression
du TSG CDKN2A dans certaines cellules tumorales [207].
Ces marques sont maintenant admises comme des événements fréquents dans le
cancer, et particulièrement la méthylation et l’acétylation des lysines et leur impact sur le
processus de tumorigenèse [208]. Ainsi l’hypométhylation de l’H4K16 et l’augmentation de
la marque H3K20me3 sont fréquentes lors de l’initiation du processus tumoral, et
s’accumulent lors de la progression de la tumorigenèse [192].
Il est important de mentionner que la modification de ces histones et notamment des
marques d’acétylation ou de méthylation sont le plus souvent associées à une modification de
l’expression des enzymes qui participent à la régulation de ces marques. Ainsi HAT et HDAC
sont spécifiquement mutées dans certains cancers. HDAC2, par exemple, est mutée dans le
cancer colorectal et associée à une instabilité des microsatellites, conférant une résistance
particulière aux inhibiteurs d’HDAC, molécules utilisées en clinique pour le traitement de
certains cancers, sur lesquelles nous revenons ultérieurement. Les HDAC ont aussi un rôle
dans le maintien de l’expression des TSG. En effet, la présence d’ilôts CpG méthylés au
59
niveau des régions promotrices de TSG est reconnue par des protéines à domaine MBD, qui
vont à leur tour recruter des HDACs et ainsi contribuer au verrouillage de l’expression de ces
gènes [209].
Les enzymes responsables de l’équilibre de la méthylation des histones : les HMT et
HDM, peuvent également être affectées et mutées. A titre d’exemple, l’enzyme EZH2
(enhancer of zeste homolog 2) est une méthyltransférase spécifique de l’histone H3K27
appartenant aux complexes polycomb PCR2 (Polycomb Repressive Complex 2) et PCR3.
L’apparition de la marque H3K27me3 va entraîner le recrutement du répresseur PCR1 et
conduire à l’inactivation de certains gènes clés comme le suppresseur de tumeur p16/INK4.
B. L’influence de l’épigénétique sur la génétique du cancer
Il paraît évident que des altérations génétiques discrètes dans les cellules néoplasiques
ne peuvent pas expliquer à elles seules les divers processus engagés dans la carcinogenèse, où
les cellules tumorales sont capables d’exprimer différents phénotypes dans des phases
complexes du développement et de la progression tumorale. En effet, les cellules tumorales
ont un épigénome modifié comparé à leur tissu sain équivalent, et comme précédemment
abordé, les mécanismes épigénétiques peuvent être à l’origine d’une instabilité génétique,
ayant pour conséquence l’acquisition de mutations génétiques réprimant l’expression des
TSG, ou à l’inverse activant l’expression de certains oncogènes. De plus, les altérations
épigénétiques dans les tumeurs sont souvent de nature clonale, suggérant un phénomène
précoce dans la genèse des cellules [210].
Il est désormais reconnu que les résidus 5mC sont des « hot spots » pour les mutations,
ce qui peut déstabiliser la structure et la fonction des gènes. Ainsi, un tiers des mutations
ponctuelles des lignées germinales responsables de maladies chez l’homme se produisent au
niveau des îlots CpG, et la plupart sont des transitions C→T [211], en raison de la facilité de
muter les 5mC par déamination, résultant par extension à des mutations de type transition. Au
vu de la symétrie de ces îlots CpG, la méthylcytosine du brin opposé est susceptible d’être
affectée également, conduisant à une transition de type G→A, mutations observées dans
presque 45% des leucémies et myélodysplasies, et 60% des cancers du colon. Les transitions
C→T ou les tandems CC-TT se retrouvent dans les carcinomes de cellules basales ou
squameuses [212].
60
De plus, l’hydroxyméthylation 5hmC contribuerait aux hautes fréquences de
transitions C→T dans les îlots CpG. En effet, le stress oxydatif peut contribuer au
développement tumoral, pas seulement au travers d’altérations génétiques mais aussi
épigénétiques. Ainsi la présence de radicaux libres peut entrainer un certain nombre de lésions
de l’ADN dont des modifications de bases, des délétions, des cassures des brins d’ADN ou
encore des réarrangements chromosomiques. Ces lésions confèrent à l’ADN une moindre
affinité avec les DNMT, conduisant à une hypométhylation globale [213]. Ces observations
suggèrent que les dommages de l’ADN liés à un stress oxydatif peuvent affecter les motifs de
méthylation de l’ADN, conduisant à une altération de l’expression de certains gènes et
participant potentiellement au développement de la malignité [159].
C. Des biomarqueurs épigénétiques ?
Les séquences d’ADN méthylées représentent des biomarqueurs potentiels pour le
diagnostic, pronostic, ou prévisions de réponses aux thérapies contre le cancer. Ainsi, les
marqueurs épigénétiques peuvent être observés dans des prélèvements de tumeurs, ou dans
certains fluides de l’organisme. Par exemple, la fréquence d’hyperméthylation de CDH13,
MYOD1, MGMT, p16INK4a ou encore RASSF1A varie significativement parmi les différents
types de cancers. L’hyperméthylation d’un petit nombre de gènes incluant RASSF1A, RARβ2,
APC et GSTP1 est observée pour discriminer des modifications malignes de bénignes dans la
prostate. De plus, bien que leur utilité clinique demeure incertaine, la présence d’éléments
répétitifs souvent hypométhylés de type SINEs ou LINEs dans la séquence d’ADN est utilisée
pour caractériser certains cancers chez l’homme [214].
Comme précédemment mentionné, les marques de modifications d’histones sont aussi
capables d’informer quant au diagnostic et pronostic de certains cancers et de façon globale,
des modifications dans la structure de la chromatine et des modifications d’histones sont le
plus souvent associées à un pronostic vital engagé [215].
Plus récemment, les miRNA ont été suggérés comme des biomarqueurs épigénétiques
potentiels pour le diagnostic du cancer. Ainsi, des miRNA sont surexprimés dans certains
cancers chez l’homme (miR-199a, miR-200a, miR-146, miR-214, miR-221, miR-222), alors
que d’autres sont réprimés (miR-100) [216].
En conclusion, cancer et épigénétique sont des concepts intimement liés. Les cellules
tumorales peuvent être caractérisées par une hypométhylation globale de l’ADN, et une
61
hyperméthylation de régions bien spécifiques au niveau de certains promoteurs de TSG. De
plus, les modifications d’histones, qu’elles soient de type méthylation ou acétylation, font
aussi partie du paysage épigénétique tumoral, et in fine, l’ensemble de cet « épigénome »
conduit à l’augmentation de l’expression d’oncogènes accompagné de la répression
d’expression de TSG. Ces modifications épigénétiques ne sont pas seulement une
conséquence du processus tumoral mais sont bien souvent impliquées dans les stades précoces
de la tumorigenèse. L’importance des mécanismes épigénétiques a donc suscité un grand
intérêt notamment dans la recherche de molécules thérapeutiques capables de contrecarrer ces
modifications épigénétiques pour le traitement de certaines pathologies dont un certain
nombre de cancers.
III. Les composés épigénétiques de première génération
Les recherches sur les modifications épigénétiques et leur plus ample compréhension
notamment sur leur implication dans la cancérogenèse a conduit à un intérêt grandissant pour
le développement de molécules capables de « restaurer » un état épigénétique normal des
cellules tumorales. Ainsi, une intense recherche a été menée ces dernières années dans le but
de développer des thérapies ciblant spécifiquement les enzymes impliquées dans la régulation
de ces mécanismes épigénétiques. Dans ce chapitre, nous exposons certaines molécules et
leurs mécanismes d’action pour renverser les modifications épigénétiques aberrantes des
cellules tumorales.
A. Les inhibiteurs de la méthylation d’ADN
La méthylation de l’ADN implique le transfert enzymatique d’un groupement méthyle
(-CH3) à partir du donneur SAM sur le carbone 5 des résidus de cytosine, réaction catalysée
par les DNMT. Etant donné l’implication de ces enzymes dans les cancers, d’importantes
études ont été menées dans le but d’inhiber ces enzymes par l’identification ou le
développement d’inhibiteurs de DNMT (iDNMT). L’objectif est de favoriser la transcription
de gènes réprimés par hyperméthylation de leur promoteur, et particulièrement restaurer
l’expression des TSG dans les cancers.
L’inhibition de la méthylation de l’ADN entraine la réactivation de certains gènes
réprimés, l’inhibition de la prolifération cellulaire maligne, l’apoptose ou encore la
sensibilisation des cellules à d’autres composés thérapeutiques [184]. Selon leur structure et
62
mode d’action, les iDNMT peuvent être regroupés dans deux catégories distinctes : les
iDNMT analogues de nucléosides et les iDNMT non analogues de nucléosides (Tableau 5).
Strucutre des iDNMTs
Strucutre des iDNMTs
Nom
Nom
Spécificité
Spécificité
Statut
Statut
Azacitine (5-Aza-CR)
Azacitine (5-Aza-CR)
Adduits DNMT
Adduits
ADNDNMT
ADN
Approuvé
Approuvé
Decitabine (5-AzaDecitabine
CdR)(5-AzaCdR)
Adduits DNMT
Adduits
DNMT
ADN/ARN
ADN/ARN
Approuvé
Approuvé
Zebularine
Zebularine
Adduits DNMT
Adduits
DNMT
ADN/ARN
ADN/ARN
Préclinique
Préclinique
5-Fluoro-deoxycytidine
5-Fluoro-deoxycytidine
(FdCyd/FDAC)
(FdCyd/FDAC)
Adduits DNMT
Adduits
DNMT
ADN/ARN
ADN/ARN
Phase I/II
Phase I/II
de nucléosides
A : iDNMT analoguesNon
de analogues
nucléosides
Non analogues de nucléosides
Procaine
Procaine
DNMT1
DNMT1
Phase I
Phase I
Procanamide
Procanamide
DNMT1
DNMT1
Phase I
Phase I
Hydralazine
Hydralazine
DNMT1,
DNMT1,
DNMT3A
and
DNMT3A
3B and
3B
Phase
Phase
II/III
II/III
RG108
RG108
DNMT1
DNMT1
IC50 =
IC50 lM
=
1000
1000 lM
B : iDNMT non analogues de nucléosides.
Tableau 5 : Formules, spécificité et statuts cliniques des principaux iDNMT.
Seules l’Azacytidine et la Décitabine sont approuvées pour leur utilisation en clinique, mais d’autres iDNMT
sont en évaluation à différentes phases cliniques. A) iDNMT analogues de nucléosides, B) iDNMT non
analogues de nucléosides.
Source : Adapté depuis Bojang et Ramos, The promise and failures of epigenetic therapies
for cancer treatment, 2014, [184].
63
1.
Les analogues de nucléosides
Les iDNMTS nucléosidiques sont des analogues de la cytidine et comprennent la 5Azacytidine (5-Aza-CR = Azacytidine), 5-Aza-2-deoxycytidine (5-Aza-CdR=décitabine), la
zébularine, la cytarabine et le 5-fluoro-2-deoxycytidine (FdCyd). L’activité anti-tumorale de
ces composés passe par deux mécanismes : une cytotoxicité provenant de leur incorporation
dans l’ADN et/ou l’ARN et une réactivation des TSG par déméthylation passive de leur
région promotrice. L’azacytidine et la décitabine sont prises en charge par les transporteurs
hCNT1 (human concentrated nucleoside transpoter-1), hENT1 (human equilibrative
nucleoside transporter-1) ou encore le Pco (proton-coupled oligopeptide) pour rentrer dans la
cellule [217-218]. Une fois à l’intérieur, une cascade de phosphorylations permet d’obtenir les
produits qui s’incorporent dans l’ADN et/ou l’ARN pour former des adduits covalents entre
DNMT et ADN, ce qui piège les DNMT et empêche leur activité de méthylation. Ces
composés ne déméthylent donc pas l’ADN à proprement parler, mais lors de la réplication, les
résidus cytosines sont remplacés par ses analogues, conduisant à une dilution en série des
bases nucléiques disponibles à la méthylation. De plus, les DNMT se retrouvent piégées par
liaisons covalentes à l’ADN via l’incorporation des analogues de cytidine et leur interaction
avec ces derniers.
L’azacytidine et la décitabine sont approuvées pour le traitement du syndrome
myélodysplasique (SMD) en clinique. L’azacytidine fut synthétisée pour la première fois en
1964 et initialement étudiée tel un composé cytotoxique à large spectre, pour le traitement de
la LMA. La cytotoxicité engagée était trop importante et le composé échoua dans la
progression de son évaluation clinique. Après l’identification de la méthylation de l’ADN
comme mécanisme d’action de cette molécule, de faibles doses d’azacytidine démontrèrent un
réel bénéfice clinique, conduisant à l’approbation de ce composé par la FDA pour le
traitement du SMD [219]. La décitabine fut par la suite approuvée en 2006 [220]. Toutes deux
sont des inhibiteurs covalents irréversibles de toutes les isoformes catalytiquement actives de
DNMT, après incorporation dans l’ADN. Bien qu’ayant une structure semblable, il semblerait
que l’azacytidine soit moins sélective, avec plus d’effets pléiotropiques, basés sur sa capacité
à affecter divers systèmes de maturation de l’ARN dont la transcription ribosomale [221].
Des essais cliniques utilisant l’azacytidine en combinaison avec du phenylbutyrate de
sodium [222], avec de l’acide valproïque [223] ou avec de la lenalidomide chez des patients
atteints de tumeurs solides ou de SMD [224] ont montré plus de 40% d’efficacité. En raison
64
de la toxicité importante de ces composés, des molécules alternatives ont été développées,
dont la zébularine ou encore le FdCyf, sur lesquels nous revenons dans le chapitre sur les
alternatives aux iDNMT actuels.
2.
Les iDNMTs non analogues de nucléosides
Il existe six principaux iDNMT décrits non analogues de nucléosides : la procaïne, les
dérivés
de
L-trytophane,
le
RG108,
l’hydralazine,
la
procainamide
ou
encore
l’épigallocatéchine-3-gallate (EGCG). La procaïne est un anesthésique local aussi utilisé
comme iDNMT, ayant montré des capacités de déméthylation et de réactivation de TSG dans
un modèle de cancer du sein chez l’homme [225]. Contrairement aux analogues de
nucléosides, la procaïne rentre en compétition avec les DNMT pour son accrochage aux
régions riches en CpG [226]. La procainamide et l’hydralazine sont originellement des
antiarrhytmiques, capables d’inhiber la méthylation de l’ADN grâce à l’interaction entre leur
atome d’azote et les résidus de lysine 162 et d’arginine 240 du site catalytique des DNMT. De
plus, la procainamide a démontré une spécificité pour inhiber la DNMT1 [227]. RG108
est
une petite molécule inhibitrice des DNMT libres, qui bloque les poches catalytiques des
DNMT sans former d’adduits covalents, souvent responsables de la cytotoxicité. De plus, des
études dans un modèle de cellules de cancer du poumon ont montré que le RG108 était
capable d’entraîner la déméthylation de l’ADN ainsi que la ré-expression de TSG réprimés,
sans affecter la méthylation de régions microsatellites, suggérant un niveau de spécificité
jusqu’alors inédit avec les autres iDNMT.
En dépit des résultats prometteurs obtenus in vitro, aucun composé de cette classe
d’iDNMT n’a été jusqu’au stade clinique et il reste à savoir si ceux identifiés jusqu’alors sont
de réels iDNMT ou si leur activité biologique est due à des effets non spécifiques.
3.
Limites et alternatives des iDNMT
Les iDNMT présentent une cytotoxicité importante, accompagnée d’une instabilité
rendant impossible l’administration prolongée de ces molécules aux patients. De façon
générale, les iDNMT analogues de nucléosides utilisés à l’heure actuelle manquent d’une
disponibilité d’administration par voie orale, d’une faible stabilité dans le plasma (courte
demi-vie) et d’une inhibition à large spectre des DNMT. Ces limites empêchent l’application
clinique de ces molécules chez l’homme en traitement standardisé, et de nouvelles molécules
ont été développées. La zébularine est adaptée à une administration par voie orale, et est
65
capable de réactiver l’expression de certains TSG, d’augmenter la sensibilité des cellules aux
traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie, et exercent des activités angiostatiques et
antimitogéniques [228-229]. Le FdCyd est un autre analogue de la cytidine capable de
déméthyler l’ADN dans les cancers du sein et du poumon. De plus, le FdCyd en combinaison
avec d’autres composés épigénétiques est en cours d’évaluation pour le traitement du MM
[230].
Enfin une prodrogue a été conçue : le SGI-110, qui correspond à l’essai clinique le
plus avancé à ce jour pour le traitement du SMD (http://www.cancer.gov/clinicaltrials/). La
combinaison de SGI-110 avec d’autres immunothérapies pourrait ouvrir de réelles
perspectives pour le ciblage de cellules cancéreuses.
B. Les inhibiteurs de la déacétylation des histones
La suppression des groupements N-acétyl des résidus lysines des histones est catalysée
par les histones déacétylases HDACs, par opposition à l’action inverse des histones acétyl
transférases (HAT) (Figure 8).
Figure 8 : Modification du groupement amine des résidus de lysines.
Les HDACs et les HAT agissent en synergie pour assurer un équilibre entre acétylation et déacétylation des
histones. Les HAT permettent l’acétylation par ajout d’un groupement N-acétyl alors que les HDACs catalysent
la suppression de ces groupements. R1 et R2 représentent d’autres résidus de la chaîne peptidique de la queue
d’histone.
Source : Dhanak et Jackson, Development and classes of epigenetic drugs for cancer, 2014,
[231].
1.
HDAC et iHDAC
Comme précédemment mentionné, les HDAC sont regroupées en quatre classes :
Classe I, IIa et IIb, III (les SIRT) et IV. Les classes I, IIa, IIb et IV sont des enzymes dites
66
zinc-dépendantes (Zn2+). Les SIRT de la classe III à l’inverse sont non zinc-dépendantes mais
NAD+-dépendantes (nicotinamide adenine dinucleotide). En termes fonctionnels, les HDAC
de classe II sont régulées par les HDAC de classe I et ensemble, sont impliquées dans la
répression transcriptionnelle et l’organisation du génome durant le développement. Les SIRT
sont en partie responsables du maintien du taux basal d’acétylation des histones, ainsi que de
la répression spécifique de certains gènes. Des études de répression des HDAC suggèrent
l’implication de ces enzymes en tant que médiateurs cruciaux dans la survie et la progression
tumorale [232-233]. De gros efforts ont été déployés pour développer des inhibiteurs
d’HDACs (iHDAC) pour le traitement du cancer.
L’inhibition des HDAC conduit à l’accumulation d’histones acétylées, ayant pour
conséquence l’activation TSG ou la répression d’oncogènes [234]. Les iHDAC peuvent
induire des effets directs ou indirects sur la transcription selon l’état d’acétylation des
histones, ou alternativement, peuvent avoir une activité d’hyperacétylation d’autres protéines
non histones [235], qui pourraient avoir un rôle important dans l’activité anti-tumorale des
iHDAC. Par exemple, des études moléculaires et cellulaires préliminaires ont montré qu’en
réponse à certains iHDAC, le gène p21 était constamment surexprimé indépendamment de
p53, menant à un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 [236]. Cette surexpression est corrélée
à une augmentation de l’acétylation des histones H3 et H4 à proximité du promoteur de p21
[237]. D’autres études montrent l’activation de certains gènes pro-apoptotiques (TRAIL, DR5,
Bim) par les iHDAC par opposition à la répression de certains gènes anti-apoptotiques (Bcl-2,
XIAP) [238]. A la différence d’autres composés thérapeutiques épigénétiques, la force des
iHDAC réside notamment dans leur activité biologique à des doses de l’ordre du
micromolaire (µM) voire du nanomolaire (nM) [239].
Les iHDAC ont été classés suivant sept catégories, sur la base de leur structure
chimique et mode d’inhibition : les acides gras à chaine courte, les benzamides, les peptides
cycliques, les cétones électrophiles, les hydroxamates, les inhibiteurs de SIRT, et des
composés divers (tels que la dépudecine ou le MGCD-0103). Comme précédemment
mentionné, les classes I, II et IV d’HDACs partagent des caractères communs, et notamment
la présence d’ions Zn2+ au niveau du site catalytique [240]. La structure des HDACs
complexée à leurs inhibiteurs a permis d’identifier un pharmacophore type pour l’inhibition
de l’activité enzymatique des HDAC. Ce pharmacophore est composé de trois parties :
67
-
un domaine d’accrochage métallique, qui induit la chélation du Zn2+ au niveau
du site actif et bloque ainsi l’activité de l’enzyme
-
un domaine de liaison qui imite le substrat et occupe la poche catalytique
-
un domaine de surface, qui forme des contacts avec les bords de la poche
catalytique [240-241].
En raison de la présence du NAD, le cofacteur spécifique aux HDACs de classe III, les
iHDAC sont inefficaces contre ces dernières, et les SIRT sont inhibées par différents
composés : les nicotinamides, les analogues de NAD+, les indoles, les dérivés
d’hydroxynaphthaldehyde, les splitomicines, les suramines et des inhibiteurs de kinass [242].
La plupart des iHDAC fonctionnent en bloquant spécifiquement l’entrée du cofacteur dans le
site actif. Le mode d’action des inhibiteurs de SIRT mentionnés précédemment est quant à lui
beaucoup moins documenté, leurs conséquences biologiques sont beaucoup moins claires
[243], et surtout sont efficaces principalement sur les organismes inférieurs et très peu sur
l’homme [244].
Les iHDAC sont des composés dont l’efficacité pour le traitement du cancer est
désormais admise, et deux inhibiteurs : le vorinostat et la romidepsine, ont été approuvés par
la FDA [245] (Tableau 6) pour le traitement du Lymphome T cutané.
Strucutre des iHDACs
Nom
Spécificité
Statut
Vorinostat=
suberanilohydroxamic
= SAHA=Zolinza®
HDAC1, HDAC2,
HDAC3, HDAC6
Approuvé
Romidepsine
HDAC1, HDAC2,
HDAC3, HDAC8
Approuvé
Panobinostat
HDAC1, HDAC2,
HDAC3, HDAC6
Phase II
Acide valproïque
(VPA)
Classes I and IIa
Phase I
Phenyl butyrate
Classes I and IIa
Phase I/II
SEN196
SIRT1
Phase II
68
Tableau 6 : Formules, spécificité et statuts cliniques des principaux iHDAC.
Seuls le Vorinostat et la Romidepsine sont approuvées pour leur utilisation en clinique, mais d’autres iHDAC
sont en évaluation à différentes phases cliniques.
Source : Adapté depuis Bojang et Ramos, The promise and failures of epigenetic therapies
for cancer treatment, 2014, [184].
Comme il en sera discuté dans le chapitre sur les alternatives possibles, les iHDAC
fonctionnent très bien en combinaison de protéines intrinsèques à l’organisme ou avec
d’autres agents chimiothérapeutiques. De cette manière, les iHDAC sensibilisent les cellules à
la molécule à laquelle ils sont combinés, et représentent des candidats prometteurs pour des
stratégies de thérapies multimodales.
2.
Limites et alternatives des iHDAC
Le vorinostat, bien qu’approuvé en clinique pour le traitement du Lymphome T
cutané, montre ses limites quant à son efficacité thérapeutique. D’une part son spectre
d’action est bien spécifique et ne peut pas être étendu à d’autres types de cancers et d’autre
part il montre un profil de toxicité non négligeable. De plus, des effets secondaires sévères
étaient observés tels que nausée, thrombopénie, asthénie, perte de poids sévère, limitant
l’analyse de l’efficacité thérapeutique du composé [246].
Bien que les composés thérapeutiques ciblant les mécanismes épigénétiques aberrants
des cellules cancéreuses présentent des propriétés thérapeutiques bénéfiques in vitro voire
dans certaines phases cliniques, les effets secondaires sévères associés demeurent trop
importants et nécessitent la recherche de nouvelles stratégies. Ainsi, des études
cristallographiques de la structure des HDAC ont révélé que les sites catalytiques de ces
enzymes étaient semblables à d’autres métalloenzymes telles que les métalloprotéases de la
matrice (MMP). Par analogie à la recherche menée dans le domaine des MMP, le groupement
hydroxamate a été remplacé par des hétérocycles engageant du Zn2+ [247]. Par exemple,
l’ajout d’un groupement trifluoromethyloxadiazole permet une inhibition des HDACs de
classe IIa [248]. Les SIRT ont attisé un intérêt particulier quant à leur implication dans des
processus de régulation métabolique, mais elles ont été beaucoup moins étudiées dans le
cancer. L’expression de SIRT1 a été suggérée comme indicatrice du stade tumoral, du statut
de différentiation et de la capacité de réponse à la chimiothérapie dans le NSCLC [249]. De
plus, l’inactivation de SIRT1 semblerait suffisante pour réprimer la croissance de cellules de
cancer pancréatique [250].
69
IV. Les composés épigénétiques de deuxième génération
A. Les inhibiteurs de l’acétylation des histones
Comme mentionné précédemment, l’acétylation des histones correspond au transfert
d’un groupement N-acétyl, à partir de la coenzyme A (acétyl-CoA) au niveau du groupement
amine des résidus lysines, réaction catalysée par les HAT. Il existe deux familles d’HAT : les
HAT de type A et les HAT de type B, classées selon leur divergence de séquence et leur
localisation intracellulaire. Il existe trois HAT de type A : GNAT, P300/CBP et MYST, qui
ont une localisation nucléaire et qui acétylent les histones et d’autres protéines associées à la
chromatine. A l’heure actuelle, HAT1 est la seule enzyme dite de type B capable d’acétyler
l’histone H3 sur les résidus de lysine 5 et 12. Ce sont des études de cristallographie qui ont
permis de comprendre les mécanismes d’action de ces enzymes et comment elles interagissent
avec leurs substrats [251]. Ainsi, au sein du type A a été identifié un domaine fondamental
formé de trois feuillets β connectés à de longues hélices α parallèles, qui supportent les
interactions de la protéine avec l’Acétyl-CoA ou des substrats associés [251]. Bien que ce
domaine soit conservé, des analyses biochimiques, enzymatiques et génétiques montrent que
les différentes familles d’HAT utilisent des mécanismes différents pour transférer le
groupement acétyle sur les histones.
Sur la base de l’activité catalytique des HAT avec l’Acétyl-CoA, les inhibiteurs
d’HATs (iHAT) sont principalement des dérivés, des conjugués ou des composés associés à
l’Acétyl-CoA, classés en 3 sous-groupes :
-
les iHAT synthétiques peptidiques basés sur la CoA dits bisubstrats, qui
fonctionnent en mimant le complexe Acétyl-CoA-Lysine dans les réactions
catalysées par les HAT
-
les iHAT naturels, comprenant la curcumine qui a montré une grande efficacité
dans la prévention et le traitement des cancers colorectal, du col de l’urérus, de la
prostate, du rein, des poumons, de l’ovaire et du foie [252],
-
les petites molécules d’iHAT, principalement conçues pour outrepasser les limites
des deux autres classes.
La pertinence d’envisager les HAT comme cible thérapeutique est compliquée par le
fait que la plupart des HAT font partie de plus gros complexes multiprotéiques. Ces
complexes empêchent parfois une activité spontanée des HAT à certains loci. De plus, le
70
problème majeur d’imperméabilité des cellules aux iHAT nécessite de développer de
nouvelles stratégies avant de les considérer comme une option pour le traitement du cancer
chez l’homme.
B. Les inhibiteurs de la méthylation des histones
1.
Mécanisme d’action général
Contrairement à la méthylation de l’ADN, synonyme de répression de la transcription,
et à l’acétylation des histones, corrélées à une activation de la transcription, l’impact
fonctionnel de la méthylation des histones est contextuel et peut conduire à la fois à
l’activation et à la répression de la transcription. Cette énigme peut s’expliquer par le timing
et la manière dont les HMT sont recrutées jusqu’à leur destination cible, la composition
protéique des complexes HMT, l’occurrence des marques épigénétiques, le degré de
méthylation des histones ou encore la contribution de petits ou longs ARNs non codants.
L’influence de la plupart de ces facteurs peut s’expliquer par le fait que la méthylation des
histones n’agit pas sur la charge de la queue histone, mais influence la basicité et l’affinité de
différentes protéines de « lecture » sur le site de méthylation.
Ainsi la méthylation des histones est désormais admise comme un évènement
important dans la tumorigenèse, ce qui a conduit au développement d’inhibiteurs d’HMT
(iHMT) permettant de contrecarrer les effets aberrants de ces enzymes. Ainsi, deux types ont
été développés : les inhibiteurs à domaine SET et les inhibiteurs non à domaine SET. La
pertinence d’envisager les HMT comme cibles pour le traitement du cancer vient notamment
de leur haut degré de spécificité pour méthyler les résidus de lysine et d’arginine. Cependant,
cette spécificité potentielle en tant que cible thérapeutique est entachée par le fait que ces
enzymes méthylent également des protéines indépendantes des histones. Ainsi la recherche de
composés ciblant la méthylation aberrante des histones sans affecter les autres protéines
nécessite une plus ample compréhension pour son application dans le traitement du cancer.
2.
Les inhibiteurs d’EZH2
EZH2 catalyse la réaction de méthylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27).
Une dérégulation d’EZH2 a été associée à la progression tumorale d’un bon nombre de
cancers : prostate, sein, reins et poumons en plus de malignités hématologiques telles que la
LMA, le SMD ou encore la myélofibrose [253]. De plus, il a été suggéré que EZH2 puisse
aussi être impliqué dans le médulloblastome et dans des tumeurs pédiatriques du système
71
nerveux central, soulevant l’intérêt de cibler EZH2 pour son inhibition afin d’aborder de
nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies [254-255]. Parmi les composés les plus
actifs on retrouve le GSK-126 et l’EPZ-5687.
C. Les histones déméthylases
Il existe deux classes d’enzymes responsables de la suppression du groupement
méthyle des histones : les déméthylases lysine-spécifique (KDM) et les déméthylases
arginine-spécifique (RDM). La famille des KDM est composée de deux types de
déméthylases : les amine oxidase like (AOL) au nombre de deux, LSD1 (lysine-specific
demethylase 1) (KDM1A) et LSD2 (KDM1B) et les déméthylases contenant des domaines
Jumonji C (JmjC) [231]. Depuis la découverte de la première HDM en 2004, ces enzymes ont
été identifiées comme impliquées dans diverses formes de cancers : myélome multiple, cancer
du sein, du colon ou encore cancer de la prostate [256]. Ainsi, la surexpression de LSD1 est
un marqueur prédictif du cancer de la prostate [257]. Jusqu’à aujourd’hui, seules deux
enzymes AOL ont été identifiées : LSD1(KDM1A) et LSD2 (KDM1B) qui catalysent la
réaction de suppression des groupes mono- et di-méthyle de la lysine 4 de l’histone H3
(H3K4) [258]. Structurellement, ces deux enzymes consistent en trois domaines :
-
Un domaine SWIRM (SWI3P, RSC8p et Moira) commun aux 2 enzymes,
permettant de stabiliser l’enzyme et favorise les interactions avec leur substrat
[259].
-
Un domaine AOL interrompu par un spacer domain (le tower domain), spécifique
à LSD1, impliqué dans la spécificité de l’enzyme [260].
-
Un domaine en doigt zinc CW, spécifique à LSD2.
Divers types d’inhibiteurs de LSD1 ont été développés tels que des analogues des
monoamine oxidases A et B (MAO A/B) ou encore des analogues de bisguanine [261]. De
plus, plus de 30 HDM chez l’homme possèdent des domaines JmjC et trois classes
d’inhibiteurs ont été conçues pour le ciblage des HDM à domaine JmjC : les analogues Noxalylglycine, les iHDAC et les dérivés de pyridine carboxylate.
D. Des thérapies multimodales
La reconnaissance du besoin de combiner diverses molécules dans un but
d’amélioration de l’efficacité mais surtout de la durabilité des thérapies anti-tumorales ont
stimulé le développement de régimes thérapeutiques multimodaux combinant des agents à
72
ciblage épigénétique avec d’autres composés thérapeutiques. Actuellement, de nombreuses
études ont démontré cette conception et un bénéfice clinique bien plus intéressant a été relevé
dans divers cas de cancer. Comme précédemment mentionné, les iHDAC sont
particulièrement efficaces dans des thérapies multimodales. En effet, dans le cancer du sein,
l’action des inhibiteurs de topoisomerase II est renforcée par un prétraitement au vorinostat
[262]. Certains iHDAC ont été utilisés en combinaison avec des agents déméthylants de
l’ADN pour réactiver l’expression réprimée de certains TSG [263-264]. Un autre type de
combinaison émergeant consiste à combiner des iHDAC avec des inhibiteurs de TK dans des
cancers où une surexpression de gènes pro-apoptotiques est décelée. Ainsi la combinaison du
vorinostat, du LBH-589, du LAQ-824 ou encore de la romidepsine avec l’imatinibe ou
d’autres inhibiteurs de TK a montré un effet synergique pro-apoptotique important dans le
traitement de cellules de leucémie résistantes ou non à l’imatinibe [265-266]. De plus, une
combinaison de décitabine avec la suramine permet la diminution du potentiel invasif de
diverses souches de cellules de cancer du sein en évitant une cytotoxicité importante [267]. Il
était suggéré que le mécanisme d’action sous-jacent était une réexpression de certains TSG.
De même, la décitabine en combinaison avec le SAM permet de bloquer les propriétés
invasives et métastatiques des cellules de cancer du sein et de la prostate [268]. Des études
menées à l’Université de John Hopkins basées sur une combinaison d’azacytidine avec de
l’entinostat chez des patients atteints de NSCLC réfractaires aux thérapies conventionnelles
montrent une réponse positive des patients à ce type de thérapie. L’étude a permis d’identifier
quatre gènes intimement associés à la récurrence de la maladie, et la combinaison était
capable d’améliorer la progression de survie. L’ensemble de ces études démontre une capacité
originellement non anticipée des agents épigénétiques à améliorer de façon significative les
effets thérapeutiques des stratégies déjà en place.
V. Epigénétique et MPM
Le MPM est caractérisé par un nombre important de modifications épigénétiques
contribuant à la tumorigenèse, tant par des aberrations de la méthylation de l’ADN [269-271]
que par des altérations de l’acétylation des histones [272]. Ainsi, plusieurs inhibiteurs des
enzymes impliquées dans la régulation des mécanismes épigénétiques ont été étudiés, in vitro
et in vivo, et certains ont même atteint la clinique.
73
A. iHDAC et MPM
Bien que les mécanismes d’action exacts des iHDAC demeurent mal compris, il est
désormais décrit que les iHDAC induisent une mort cellulaire programmée des cellules de
MPM, via les deux voies de l’apoptose : extrinsèque avec l’activation de récepteurs de mort et
de la caspase 8, et intrinsèque via l’activation de plusieurs protéines de la famille de Bcl-2,
entrainant une rupture de la membrane mitochondriale, le relargage du cytochrome c et
l’activation de la caspase 9 [273]. Les iHDAC de la classe des hydroxamates et des acides
gras à courte chaîne sont parmi les plus évalués en préclinique.
1.
Les hydroxamates
Une étude s’intéressant aux propriétés pro-apoptotiques du vorinostat (suberoylanilide
hydroxamic acid ou SAHA) dans un modèle murin montre que les protéines Bid et Bim sont
des régulateurs clés de la signalisation apoptotique intrinsèque [274]. Le panobinostat
(LBH589), un autre hydroxamate, a montré des propriétés pro-apoptotiques dans plusieurs
lignées cellulaires de MPM, et une réduction de la croissance tumorale dans un modèle de
xénogrèffe murin [275]. De plus, une étude réalisée sur un modèle 3D de sphéroïdes de
cellules de MPM montre l’intérêt de combiner le vorinostat avec du bortezomib, un composé
classiquement utilisé pour le traitement du myélome multiple [276]. Le même groupe a
également démontré l’importance de la caspase 8 et de FLIP (FLICE-like inhibitor protein)
dans l’induction de l’apoptose de cellules de MPM par le vorinostat [277].
2.
Les acides gras à chaîne courte
Parmi les acides gras à chaîne courte, le valproate (acide valproïque ou VPA) et le
butyrate de sodium possèdent tous deux des propriétés pro-apoptotiques sur des cellules de
MPM. Bien que le butyrate ait montré des capacités d’inhibition des protéines antiapoptotiques Bcl-XL [278], son utilisation clinique fut rapidement abandonnée en raison de
propriétés pharmacologiques inadaptées. Le VPA a montré une capacité à améliorer les effets
du traitement cisplatine-pémétrexed à la fois dans un modèle cellulaire et murin [279]. Son
activité cytotoxique était décrite comme caspase-dépendante et associée à l’activation des
deux voies d’apoptose : intrinsèque et extrinsèque, à la genèse de ROS, au clivage de Bid et
au relargage de cytochrome c depuis la mitochondrie. De plus, cette combinaison inhibe la
croissance tumorale dans un modèle murin de MPM épithélioïde.
74
B. iDNMT et MPM
La décitabine (5-aza-2’-deoxycytidine) diminue la survie de cellules de MPM [280] et
initie le processus de sénescence en augmentant l’expression de p21 de manière p53dépendante, et en induisant un arrêt des cellules en phase G2/M du cycle cellulaire [281].
L’EGCG, sur lequel nous revenons dans le chapitre suivant, induit l’apoptose de cellules de
MPM sans affecter les cellules mésothéliales saines [282]. Enfin, la curcumine induit
l’apoptose de cellules de MPM impliquant la kinase p38, les caspases 3 et 9 ou encore les
protéines Bax et PARP [283].
C. Une combinaison iHDAC-iDNMT
La combinaison iHDAC-agent hypométhylant a montré des résultats précliniques
prometteurs. Le VPA combiné à la décitabine a un effet pro-apoptotique synergique, et les
cellules tumorales ayant échappé à la cytotoxicité du traitement exprimaient des antigènes de
tumeurs reconnus spécifiquement par des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques [284]. De plus,
l’induction de l’antigène de tumeur New-York-esophageal cancer-1 (NYESO-1) par un
traitement séquentiel décitabine-depsipeptide conduit à une reconnaissance spécifique des
cellules traitées par des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de NYESO-1 [285]. Des
observations similaires étaient reportées lors d’une étude visant à combiner la décitabine avec
le VPA, induisant une infiltration de lymphocytes T cytotoxiques et une inhibition de la
croissance de cellules murines de mésothéliome péritonéal (AK7) dans un modèle murin
orthotopique [286].
Au vu des résultats encourageants d’une combinaison iHDAC-agents hypométhylants,
l’idéal serait de combiner une activité inhibitrice des HDAC avec une activité inhibitrice des
DNMT, dans une seule et même formulation thérapeutique. Ainsi, l’ES8, un composé de
synthèse comportant des propriétés intrinsèques d’inhibition à la fois des HDAC et des
DNMT, a montré des propriétés pro-apoptotiques sur diverses lignées cellulaires de MPM, et
une inhibition de la croissance tumorale dans un modèle murin, associées à une
hyperacétylation des histones et une hypométhylation de l’ADN dans les tumeurs [272].
D. Les essais cliniques
Etant donné la capacité des iHDAC et iDNMT à induire l’apoptose des cellules de
MPM in vitro et in vivo, plusieurs essais cliniques ont été initiés dans un premier temps pour
75
s’assurer du profil de toxicité de ces molécules chez l’homme (phase I). En 2006,
l’hydroxamate belinostat (PXD101) était évalué chez 73 patients atteints de formes avancées
de cancers dont 13 avaient un mésothéliome et avaient déjà reçu un traitement de cisplatinePémétrexed [287]. Le résultat de cette étude révéla que le belinostat n’était pas efficace en
tant que monothérapie pour les MM récurrents. Le benzamide MS-275 a montré des effets
secondaires sévères et n’était pas bien toléré [288]. L’étude la plus importante utilisant un
iHDAC pour le traitement du MPM concerne le vorinostat. Une phase I de petite ampleur
regroupant 13 patients ne montra qu’une réponse partielle des patients [289]. Une étude
randomisée de phase II/III portée sur 660 patients ayant rechuté comparant le vorinostat
administré seul à un placebo ne montrait pas d’amélioration de la survie globale des patients
traités avec le vorinostat seul. Enfin, l’étude clinique la plus prometteuse de phase II regroupe
45 patients atteints de MPM traités avec une combinaison de VPA et de doxorubicine [290].
Cette étude montre une bonne tolérance des patients à cette combinaison, ainsi qu’une bonne
efficacité chez les patients réfractaires. Il pourrait donc être envisagé d’ajouter le VPA au
traitement de première ligne cisplatine-pémétrexed [272].
Conclusion
Il serait présomptueux de vouloir dresser une liste exhaustive des efforts mis en œuvre
dans la recherche d’alternatives possibles pour les molécules actuellement développées dans
le domaine de l’épigénétique appliquées en oncologie. En effet, un accent particulier est mis
sur la recherche d’alternatives possibles aux molécules ou stratégies actuelles adoptées dans le
domaine de l’épigénétique appliquée à la clinique et notamment au traitement du cancer.
Cependant, les effets secondaires, les doses limite, les profils de toxicité, la spécificité
incertaine demeurent des problèmes qui nécessitent une solution rapide. La nécessité de
trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc encore bien présente, de façon à se
rapprocher le plus possible de thérapies curatives voire préventives plutôt que palliatives.
Ainsi, des combinaisons non conventionnelles utilisant des composés naturels, ou des
composés de synthèse encore jamais étudiés ouvrent de nouvelles perspectives, tout comme le
domaine des nanomédecines, particulièrement prometteur en termes de ciblage spécifique de
la tumeur.
76
INTRODUCTION - Chapitre III : Les molécules naturelles et la cancérologie
CHAPITRE III : LES MOLÉCULES NATURELLES ET LA
CANCÉROLOGIE
Etant donné l’incidence exponentielle du cancer dans le monde, la recherche sur les
moyens pour le traiter mais aussi pour sa prévention a suscité grand intérêt. Outre les
molécules synthétiques et les médicaments découverts au fil du temps, la Nature est apparue
comme une source considérable de composés avec un fort potentiel thérapeutique.
Il existe des preuves de l’existence d’une forme de cancer dans la littérature médicale
depuis l’Antiquité, le temps des Pharaons dans l’Egypte ancienne et le monde Classique. Bien
qu’il reste difficile d’interpréter le diagnostic des médecins de cette époque, toutes leurs
observations et conclusions ne laissent pas place au doute quant à l’existence de ce qu’il est
appelé dans notre société actuelle le « cancer ». Ainsi la médecine ancienne rapporte
l’application de la chirurgie pour traiter ces cas, mais également l’utilisation de composés
naturels provenant de certaines plantes [291]. Cette notion est donc particulièrement
intéressante actuellement, à l’heure d’une évolution des pensées médicales selon lesquelles les
produits naturels jouent un rôle crucial dans de nombreuses stratégies thérapeutiques dont des
stratégies anti-tumorales. Durant ces dernières années, la recherche de nouveaux composés
thérapeutiques basée sur des sources naturelles a donc suscité grand intérêt.
I. Historique
A. A l’origine du cancer
L’utilisation de composés issus de sources naturelles pour des applications
thérapeutiques n’est pas une conception nouvelle. En effet, le bénéfice thérapeutique des
plantes notamment pour traiter le cancer est l’un des concepts les plus anciens de ce qui a été
appelé la médecine moderne. Cependant, il est à rappeler que le concept moderne de cancer
connu à l’heure d’aujourd’hui est bien différent de celui considéré dans les temps plus
anciens. Le mot « cancer » vient du Père de la Médecine : Hypocrates, qui décrit les tumeurs à
partir de l’éthymologie grecque « Karkinos », faisant référence à la mythologie grecque et au
crabe Karkinos. Il trouvait en effet qu’une tumeur ressemblait à une sorte d’araignée. Bien
qu’ayant introduit le terme de cancer, Hypocrates n’est surement pas le premier à observer
cette forme de maladie. En dépit de la difficulté à identifier précisément le cancer dans les
77
textes anciens, les progrès dans la compréhension et le traitement du cancer ont été lents et
datent du 18ème siècle, se basant au départ sur l’anatomie pathophysiologique du cancer. Ces
50 dernières années reflètent une véritable explosion dans la compréhension des mécanismes
de cette forme de maladie, et désormais, les découvertes cliniques avancent quotidiennement.
B. Les plantes comme traitement thérapeutique
La cancérologie est l’un des domaines de la médecine les plus pluridisciplinaires, de
part le nombre conséquent de facteurs et mécanismes mis en jeu lors de son développement.
Ainsi, parmi les différentes approches potentielles pour aborder le traitement des cancers, il
est apparu comme évident d’utiliser des sources naturelles pour la découverte de composés
thérapeutiques. De nombreux composés issus des plantes, ayant aujourd’hui un bénéfice
thérapeutique pour le traitement du cancer, ont en fait une longue histoire médicinale derrière
eux.
1.
Les premiers composés naturels à potentiel thérapeutique
L’antioxydant d’EGCG, présent dans le thé vert et utilisé depuis longtemps dans la
civilisation Japonaise, a récemment montré des vertus pour ralentir la progression du cancer
du sein dans un modèle murin. Ceci n’est qu’un exemple, plusieurs extraits de plantes ayant
en effet montré un fort potentiel thérapeutique anti-tumoral, tels que l’ail [292], le jus,
l’écorce ou l’huile de Punica granatum [293], ou encore la myrrhe, une résine aromatique
produite par un arbre des déserts d’Arabie. Cette dernière a été depuis longtemps utilisée pour
des douleurs intestinales, des problèmes de circulation, la cicatrisation ou encore certains
problèmes de peau. Ce qui fait de la myrrhe un composé anti-tumoral particulièrement
intéressant ne réside pas seulement dans sa capacité à tuer les cellules tumorales, mais surtout
dans sa capacité à tuer les cellules résistantes aux composés anti-tumoraux conventionnels.
Bien que la myrrhe ne soit pas aussi puissante que d’autres composés issus de plantes utilisés
en thérapie anticancéreuse (la vincristine, vinblastine ou encore le paclitaxel sur lesquels nous
reviendrons ultérieurement), elle présente un atout non négligeable puisque capable de
toucher les cellules tumorales sans affecter les cellules saines environnantes.
2.
L’histoire du paclitaxeaxol ou Taxol®
L’un des composés naturels utilisé de nos jours en première ligne de traitement de
nombreux types de cancers a été découvert il y a maintenant plus de 50 ans dans l’écorce, et à
faible dose dans les aiguilles, d’un if du Pacifique rare, le Taxus brevifolia. En effet, dans les
78
années 1970, le NCI (National Cancer Institute) des Etats Unis a mené une campagne pour
explorer le pouvoir thérapeutique d’une collection de plantes, dont un extrait de l’if du
Pacifique collecté en 1962 par le département de l’Agriculture. C’est le taxol, aujourd’hui
communément connu sous le nom de paclitaxel, qui fut découvert et qui est maintenant
approuvé à travers le monde pour le traitement d’un grand nombre de cancers chez l’homme.
C’est notamment l’un des composés thérapeutiques anti-cancéreux les plus efficaces pour les
cancers du sein et de l’ovaire. L’espèce d’ifs nécessaires pour obtenir le paclitaxel étant rare
et la récupération de son écorce lui étant fatale, des chimistes ont trouvé une alternative en
synthétisant le paclitaxel à partir de structures plus simples. Ainsi, en 1990, Holton et ses
collègues développent la chimie pour synthétiser du paclitaxel à partir de 10-deactetyl
baccatine III, extrait des aiguilles de l’if Anglais Taxus baccata [294], commun en Europe et
aux Etats Unis [295]. Enfin, la même équipe publia il y a maintenant 30 ans la synthèse
chimique totale du paclitaxel. Les résultats impressionnants chez des patients souffrant de
cancer ovarien conduisent au développement d’un programme étendu d’essais cliniques sur
des patients atteints de cancers de l’ovaire et du sein. La recherche s’attarde par la suite sur le
développement d’analogues de ce composé pour des propriétés thérapeutiques encore plus
intéressantes [296].
3.
Les composés naturels aujourd’hui
Une analyse sur le nombre d’agents chimiothérapeutiques actuellement utilisés en
clinique révèle que 60% des composés approuvés sont dérivés de composés naturels [297].
On comprend donc tout l’intérêt de s’intéresser de plus près aux molécules de sources
naturelles et les vertus qu’elles présentent pour une application thérapeutique. Le but ici n’est
pas de fournir un catalogue exhaustif de tous les agents thérapeutiques issus de composés
naturels, mais d’apporter les éléments clés quant à la compréhension moderne de l’implication
de la Nature et de la biodiversité qu’elle peut fournir en termes de recherche de composés à
bénéfice thérapeutique.
II. Les plantes : une source de molécules naturelles à potentiel
thérapeutique
Malgré l’évidence de l’intérêt des composés naturels appliqués aux thérapies antitumorales, seule une modeste proportion de plantes médicinales a attiré l’intérêt des
scientifiques pour rechercher leur potentiel thérapeutique anti-tumoral. Ce n’est que dans les
79
années 1950 avec la campagne du NCI menée sur toute une collection de plantes répertoriées
que l’idée d’utiliser les plantes comme source d’agents thérapeutiques est devenue un concept
enfin réel [298].
Les plantes ont la capacité de se défendre contre de potentiels prédateurs, et de se
pérenniser en empêchant le développement d’espèces compétitives sur leur propre territoire
[299]. Pour survivre, les plantes ont développé des mécanismes de défense sophistiqués
impliquant tout un arsenal complexe de substances chimiques toxiques, telles que les terpènes
ou les alcaloïdes, qui les rendent répulsives contre certains prédateurs. Un exemple pour
illustrer ce phénomène pourrait être la production de tannin par certaines espèces d’arbres.
Quand un prédateur commence à se nourrir d’un arbre dans une forêt, cet arbre va relâcher de
l’éthylène dans l’air, donnant ainsi le signal aux arbres environnants d’augmenter la
production de tannin au niveau de leur feuille, les rendant alors empoisonnés et répulsifs pour
le prédateur qui souhaiterait les consommer [300]. Dans cette partie les principales molécules
naturelles ayant démontré un intérêt pour une application thérapeutique anti-tumorale sont
décrites.
A. Les molécules issues de plantes ciblant la tubuline
La tubuline soluble est un hétérodimère composé d’une molécule d’α-tubuline et d’une
molécule de β-tubuline. Jusqu’à aujourd’hui, il a été recensé six isotypes d’α-tubuline et sept
de β-tubuline [301]. Lors de la polymérisation, les hétérodimères se lient les uns aux autres
pour former des protofilaments. C’est l’assemblage de treize protofilaments organisés en un
cylindre creux qui constitue le squelette d’un microtubule [302]. Le réseau de microtubules
est en équilibre dynamique dans des conditions physiologiques, sous le contrôle de différents
facteurs dont les microtubules associated proteins (MAP). Ce réseau est un constituant
essentiel du cytosquelette cellulaire et les microtubules sont impliqués dans de nombreuses
fonctions cellulaires. Ainsi, ils occupent un rôle critique dans la mobilité des organelles lors
de la mitose et de l’interphase, permettent la formation du fuseau mitotique et le transport des
chromosomes lors de la métaphase. Des composés qui affectent le réseau de microtubules
entrainent un mauvais alignement des chromosomes et des perturbations dans leur
attachement bipolaire au fuseau mitotique, conduisant à un arrêt de la mitose en
métaphase/anaphase, aboutissant à une apoptose des cellules [302]. Ce phénomène a été
caractérisé comme mécanisme primaire anti-néoplasique des agents affectant le réseau de
microtubules.
80
1.
Les Vinca alcaloïdes
a) Vinca alcaloïdes de première génération
Les premiers composés dérivés de plantes à intégrer la clinique sont les Vinca
alcaloïdes, et plus particulièrement la vinblastine et la vincristine, isolées à partir de la
pervenche Catharanthus roseus (ou Vinca rosea), que l’on trouve dans les forêts pluvieuses
de Madagascar [303]. La vincristine a des propriétés d’inhibition de l’assemblage des
microtubules, conduisant à l’auto-assemblage de la tubuline en agrégats spiralés. La
vincristine a permis d’augmenter considérablement le taux de guérison de la maladie de
Hodgkin ainsi que de certaines formes de leucémies [304]. Ces Vinca alcaloïdes ont aussi
montré des propriétés anti-carcinogènes pour certains lymphomes, cancers du testicule, du
sein et des poumons ainsi que pour le sarcome de Kaposi. Une formulation liposomale de
vincristine a été synthétisée et appliquée à certains types de cancers dont le lymphome non
Hodgkinien particulièrement agressif. Le principal avantage de cette formulation par rapport à
la vincristine seule réside dans sa capacité à augmenter son temps de demi-vie plasmatique,
permettant ainsi une circulation systémique prolongée, et favoriser une accumulation dans la
tumeur [305].
b) Vinca alcaloïdes de deuxième génération
La vinorelbine correspond au premier Vinca alcaloïde de seconde génération,
émergeant d’études de modifications de la structure supérieure de la vinblastine [306]. Un
dérivé bi-fluoré de la vinorelbine, la vinflunine [306] a été synthétisé par la suite, avec des
propriétés précliniques
anti-tumorales particulièrement intéressantes,
notamment
la
perturbation de l’équilibre des microtubules et l’inhibition de l’angiogenèse. Il est
actuellement sous étude clinique phase I-III [307].
c)
Mécanisme d’action des Vinca alcaloïdes
De façon générale, les Vinca alcaloïdes perturbent l’assemblage du réseau mitotique
via des interactions avec les tubulines. En effet, elles se lient particulièrement à la sous-unité
β-tubuline et bloquent leur liaison avec la sous-unité α-tubuline, empêchant de ce fait la
polymérisation des microtubules. La mitose est interrompue et les cellules en division
meurent. Il est à noter que les Vinca alcaloïdes de deuxième génération type vinorelbine et
vinflunine ont une moindre affinité avec les sous unités de tubuline comparé à leur molécules
81
mères (vincristine ou vinblastine), et le moyen par lequel elles perturbent le réseau des
microtubules serait différent [308].
d) Vinca alkaloïdes et application clinique
En clinique, les Vinca alcaloïdes sont classiquement utilisés dans le traitement de
néoplasmes hématologiques et lymphatiques (surtout la vincristine), et dans certains cas de
tumeurs solides (vinblastine pour les cancers du sein, du testicule, la vindestine pour le cancer
du poumon non à petites cellules). Les principaux effets secondaires sont une
myélosuppression et une certaine neurotoxicité, bien que des composés plus récents telle la
vinflunine induisent des effets secondaires moins sévères que ses molécules mères [307].
2.
Les Taxanes
Les taxanes sont principalement représentés par le paclitaxel et le docetaxel, qui ont
démontré une activité anti-tumorale impressionnante contre les cancers du sein, de l’ovaire, et
sont désormais partie intégrante des thérapies standards pour le NSCLC. De nouveaux taxanes
sont actuellement en cours de développement, pour une amélioration de l’index thérapeutique
et des voies d’administration.
a) Paclitaxel et docetaxel
Le paclitaxel et le docetaxel sont des agents hydrophobes caractérisés par un cœur
composé d’un cycle de taxane, une estérification au niveau du carbone 13 avec un
groupement ester complexe et un quatrième cycle atypique au niveau des carbones C-4,5,
essentiels pour leur activité biologique. Le principal problème de ces composés concerne leur
faible solubilité. Ils sont donc administrés dans des solutions contenant des surfactants
polyoxyéthylés différents. Ces surfactants étant biologiquement et pharmacologiquement
actifs, ils conduisent à des effets secondaires non négligeables tels que des réactions
d’hypersensibilité,
des
neuropathies
périphériques
ou
encore
des
altérations
pharmacocinétiques surtout pour le Paclitaxel [309].
b) Des alternatives au paclitaxel
Cherchant à améliorer les effets thérapeutiques des taxanes, limiter leurs mécanismes
de résistance associés ou encore améliorer leur seuil de tolérance, de nombreux efforts ont été
portés sur le développement de nouvelles formulations de taxanes (l’albumine, des formes
nanoparticulaires ou liposomales, des polyglutamates), de nouveaux analogues de taxanes ou
82
encore des prodrogues [310-311]. Ainsi l’abraxane (CT-2103) ou le paclitaxel d’acide
docosahexenoique (DHA) (DHA-paclitaxel) sont des exemples de nouveaux taxanes qui ont
montré une plus grande efficacité que le palcitaxel dans des modèles de cancer résistants aux
taxanes ou insensibles au paclitaxel. De plus, ils ont un profil de toxicité moindre et une voie
d’administration ne nécessitant pas de prémédication pour les réactions d’hypersensibilité
[312].
c)
Mécanisme d’action des taxanes
Contrairement aux Vinca alcaloïdes, les taxanes stabilisent le réseau de microtubules.
Ils favorisent en effet l’assemblage des microtubules, empêchent leur dépolymérisation et
interfèrent donc avec un certain nombre de fonctions cellulaires normales qui dépendent de
l’équilibre physiologique entre hétérodimères de tubulines et microtubules. En plus de leur
action sur le réseau de microtubules, les taxanes exercent leur activité anti-tumorale par
d’autres biais qu’il ne faut pas négliger. Ainsi, bien que différant de seulement deux
groupements, le paclitaxel et le docetaxel n’ont pas le même effet sur le cycle cellulaire. Alors
que le paclitaxel entraîne un arrêt du cycle en phase G2/M [313], le docetaxel agit au moment
de la phase S [314]. De plus, l’induction en apoptose des cellules a été corrélée avec une
phosphorylation d’une des protéines les plus importantes de la voie d’apoptose : Bcl-2 [315].
d) Taxanes et application clinique
Les applications du paclitaxel et docetaxel sont assez larges. Ils sont utilisés dans des
cas de tumeurs solides (ovaire, sein, poumon, tête et cou, gastro-intestinal, vessie, testicule,
endomètre) et aussi dans certaines affections hématologiques. Des effets secondaires associés
à ces molécules ont été observés comprenant une neutropénie, des mucosites, des réactions
d’hypersensibilité et des neuropathies, ces deux derniers étant liés aux surfactants utilisés pour
diluer les composés, et donc pouvant être évités par la recherche de nouvelles formulations
pour l’utilisation de ces taxanes en clinique.
B. Les inhibiteurs des ADN topoisomérases
Les ADN topoisomérases sont des enzymes nucléaires réduisant le stress de torsion de
l’ADN supercoloïdale, permettant ainsi à des régions spécifiques de l’ADN de devenir
suffisamment dénouées pour subir la réplication, la recombinaison, la réparation et la
transcription. Ainsi, certains agents anticancéreux inhibiteurs des topoisomérases I et II sont
actifs dans une variété de tumeurs solides ou hématologiques, et possèdent des propriétés
83
pharmacologiques spécifiques et des profiles pharmacocinétiques et toxicologiques propres
[316-317]. Ainsi, parmi les agents anti-cancéreux agissant sur les topoisomérases, les
camptothécines (irinotecan et topotecan) sont des inhibiteurs de la topoisomérase I, tandis que
les épipodophyllotoxines (etoposide et teniposide) et les anthracyclines (doxorubicine,
épirubicine) sont des inhibiteurs de la topoisomérase II.
1.
Les Epipodophyllotoxines
Les podophyllotoxines ont une longue histoire médicinale. Extraits des racines d’un
plant indien de podophyllum (Podophyllum peltatum), les podophyllotoxines étaient utilisées
par les Indiens d’Amérique comme remède grâce à leurs effets émétiques, purgatifs ou encore
vermifuge. Parmi les différents composés identifiés et synthétisés, deux molécules
appartenant à la famille isomérique des épipodophyllotoxines ont été identifiés : l’etoposide et
le teniposide. Tous deux sont des dérivés semi-synthétiques d’épipodophyllotoxines, utilisés
pour le traitement de certains lymphomes et des cancers des bronches et du testicule. Plus
particulièrement, l’ectoposide administré en combinaison avec la bléomycine et le cisplatine
provoque de forts taux de rémission du cancer du testicule [318].
a) Mécanismes d’action
L’ectoposide est dérivé du plant de Mandragore Podophyllum peltatum et du cerfeuil
sauvage Podophyllum emodi. Il agirait en tant qu’inhibiteur de la topoisomérase II, stabilisant
ainsi les complexes d’ADN d’ordinaire clivés par certaines enzymes et conduisant alors à des
cassures de l’ADN [319]. L’action de la topoisomérase II est donc irréversible, ce qui conduit
à une cassure double brin de l’ADN permanente et in fine à la mort de la cellule.
b) Applications cliniques
L’ectoposide est appliqué pour le traitement du cancer du poumon, du
choriocarcinome, des cancers de l’ovaire et du testicule, du lymphome ou encore de la LMA.
Le tenoposide quant à lui est approuvé pour le traitement de tumeurs du système nerveux
central, du lymphome malin ou encore du cancer de la vessie [316]. Parmi les effets
secondaires observés, la myélosuppression est l’un des plus communs, et la leucopénie est
l’effet dose-limitant en termes de toxicité, alors que la thrombopénie se produit moins
fréquemment et est souvent moins sévère. Cependant, ces effets secondaires ont davantage été
associés aux adjuvants utilisés dans les formulations qu’au traitement à proprement parler
[316].
84
2.
Les Camptothécines
Suite à la campagne menée par le NCI dans les années 1950 sur une collection
d’extraits de plantes, la camptothécine isolée à partir de l’arbre chinois du Camptotheca
acuminata fut identifiée comme ayant une activité cytotoxique sur un certain nombre de
tumeurs solides et leucémies. Bien que présentant des activités anti-tumorales précliniques et
cliniques très prometteuses, la première utilisation de la camptothécine révéla une toxicité
sévère imprévisible. Trente ans après sa première identification en 1966 et après d’intenses
recherches, deux analogues ont été découverts : l’irinotecane et le topotecane, qui entrèrent en
clinique pour le traitement du cancer colorectal et ovarien, respectivement [320]. Aujourd’hui,
plusieurs analogues synthétiques de la camptothécine agissant en stabilisant le complexe
topoisomérase I-ADN [321] sont à différents stades d’évaluation clinique tels que le
lurtotecane, la karenitecine ou encore le gimatecane. Ils possèdent certaines propriétés plus
avantageuses que la camptothécine utilisée seule. Le gimatecane peut par exemple échapper à
des mécanismes de résistance dans le cancer du sein, n’étant pas un substrat de la protéine de
résistance du cancer du sein BCRP (breast cancer resistance protein). La karenitecine est un
composé très lipophile qui pourrait présenter des avantages cliniques non négligeables de par
sa biodisponibilité importante pour une administration par voix orale [322].
a) Applications cliniques
Le topotecane est utilisé en traitement de deuxième ligne chez des patients atteints de
carcinome ovarien n’ayant précédemment pas répondu aux régimes de platines ou aux
chimiothérapies à base de paclitaxel [323]. L’irinotecane fait partie du traitement de première
ligne en combinaison avec du 5-fluorouracile chez les patients atteints de cancer colorectal à
un stade métastatique [324]. Bien qu’une toxicité dose-dépendante ait été observée,
conduisant par exemple à une neutropénie accompagnée ou non d’une thrombopénie, des
résultats encourageants ont été obtenus sur un certain nombre de tumeurs solides : cancer du
col de l’utérus, de l’ovaire ou encore du poumon.
C. Les antioxydants
1.
Oxydation et carcinogenèse
Les antioxydants se retrouvent dans une grande variété de fruits, légumes, extraits de
plantes, herbes et épices ou encore de composés semi-synthétiques. Il semblerait qu’ils aient
des propriétés anti-tumorales non négligeables, notamment en limitant les dommages
85
oxydatifs à l’ADN. Si des cellules en division se répliquent avant de pouvoir réparer
quelconque dommage à l’ADN, le résultat n’est autre qu’une altération génétique permanente
conduisant aux premières étapes de la carcinogenèse. Des cellules qui d’ordinaire se divisent
rapidement seront donc plus sujettes à un développement tumoral, minimisant les
opportunités de la machinerie de réparation des dommages à l’ADN d’exercer son action
correctement. Il semblerait que ce soient les stades précoces de la carcinogenèse qui soient
concernés quant aux effets protecteurs des nutriments antioxydants. Les mécanismes d’action
des antioxydants sur la carcinogenèse sont multiples. Il est maintenant admis que des
composés antioxydants ou anti-inflammatoires peuvent être utilisés pour modifier le pH du
microenvironnement tumoral et donc modifier le comportement des cellules tumorales [325].
Il a donc été suggéré que les antioxydants auraient le potentiel de réduire l’instabilité
génétique des cellules cancéreuses et donc de les rendre plus sensibles à certaines types de
traitements [326]. Une autre étude a montré la capacité des antioxydants à augmenter
l’efficacité de certains agents chimiothérapeutiques [327]. Ainsi, la vitamine C, utilisée à des
doses non toxiques, augmente les effets cytotoxiques du cisplatine et de l’ectoposide dans un
modèle humain de cellules de cancer du col de l’utérus, en stabilisant la protéine p53.
2.
Le stress oxydatif
D’autres études démontrent que d’importantes doses de flavonoïdes ou d’autres
phénols peuvent induire un stress oxydatif dans les cellules cancéreuses. Ainsi des doses de β
carotène supérieures à celles observées dans le plasma humain induisent une apoptose de
cellules d’adénocarcinomes humaines via un mécanisme modulant les radicaux libres. De
même, la vitamine C a montré des propriétés cytotoxiques in vitro sur divers modèles de
cellules tumorales en raison de la genèse de radicaux libres [328-330].
Ces études sont des exemples reflétant l’importance des réactions d’oxydoréduction et
leurs effets dans les mécanismes d’action des composés antioxydants.
a) Les dérivés réactifs de l’oxygène
L’élévation du niveau de ROS (reactive oxygen species) se produit lorsque le flux
électronique et la production énergétique ne sont plus synchrones, entraînant une production
excessive de radicaux libres [331]. Les sources de ROS sont multiples. En effet, ils sont
produits continuellement dans la cellule lors du processus de transfert électronique
mitochondrial, ou par le biais de certaines activités enzymatiques telles les xantines oxydases,
86
les lipoxygénases ou encore les cycloxygénases [332]. Les ROS peuvent donc avoir une
origine endogène par le métabolisme intracellulaire, ou exogène par une exposition à des
facteurs environnementaux telles les irradiations UV ou encore un excès de sels ferreux. Les
ROS peuvent aussi provenir de l’activité de certaines cellules : les macrophages et les
neutrophiles, qui possèdent des enzymes telles la NADPH oxidase, capable de générer des
radicaux superoxides et du peroxyde d’hydrogène. C’est lorsque le niveau des ROS dépasse
les capacités antioxydantes de la cellule que l’homéostasie d’oxydoréduction intracellulaire
est perturbée et que le stress oxydatif survient. Ce stress oxydatif est impliqué dans divers
types de maladies chez l’homme. Pour pallier à ce stress et maintenir cette homéostasie, des
mécanismes sophistiqués de protection entrent en action. Ainsi, les ROS sont soit neutralisés,
détoxifiés, leur production inhibée ou les métaux engendrant leur production séquestrés.
b) ROS et GSH
Il serait ambitieux de vouloir être exhaustif sur les antioxydants et leurs divers
mécanismes d’action dans cette introduction. L’idée est ici de donner une idée de
l’implication des antioxydants dans les applications thérapeutiques qui peuvent être adoptées
avec des molécules naturelles. Mais il reste indispensable de mentionner un acteur clé dans le
métabolisme des ROS. Le tripeptide γ-glutamylcysteinylglycine, aussi appelé GSH, est le
régulateur intracellulaire non-enzymatique principal de l’homéostasie d’oxydoréduction,
présent de façon ubiquitaire à des doses de l’ordre du mM dans toutes les cellules [333]. Il
participe aux réactions d’oxydoréduction par le biais d’une oxydation réversible de son
groupement actif thiol [334]. En plus d’avoir la capacité de recycler les radicaux libres
potentiellement toxiques, la GSH est parfois lié de façon covalente à des protéines via un
processus appelé glutathionylation, et agit ainsi telle une coenzyme dans des mécanismes de
défense cellulaire [335].
c)
ROS et GST
La glutathione S-transferase (GST) est impliquée dans la détoxification des
xénobiotiques électrophiles toxiques telles que des carcinogènes toxiques, des polluants
environnementaux ou encore des agents anti-tumoraux. Elle a aussi une activité protectrice
contre des réactifs produits in vivo lors d’un stress oxydatif via une inactivation des aldéhydes
endogènes insaturés, des quinones, des époxides ou des hydroperoxides, tous produits de
façon intracellulaire après exposition à des polluants par exemple [336].
87
Les antioxydants et leurs applications thérapeutiques représentent un domaine de
recherche à part entière que nous ne faisons ici qu’aborder. Cependant, il est à noter
l’importance des antioxydants dans les processus de défense et de protection cellulaire par
leurs mécanismes d’action divers et leur potentiel en tant qu’agents thérapeutiques antitumoraux.
D. Autres molécules
1.
Les Flavonoïdes
Les flavonoïdes font partie du plus grand groupe des phénols et sont des pigments
solubles très largement retrouvés dans le règne végétal, dans les fruits, les graines, les fleurs,
les feuilles et aussi les écorces de certaines espèces. Ils ont des propriétés antioxydantes et
peuvent piéger les superoxides, les hydroxyles ainsi que bloquer les réactions en chaîne de
peroxydes lipidiques. De plus, ils sont associés à des mécanismes de protection et de
réduction des risques de maladies chroniques chez l’homme. Ils ont en effet démontré des
propriétés protectrices contre les dommages provoqués par les rayons X, et inhibitrices du
développement métastatique de certains cancers in vivo [337]. Plus de 4000 flavonoïdes ont
été identifiés, possédant une structure générique: 2 cycles aromatiques reliés par 3 carbones
qui sont souvent dans un hétérocycle oxygéné. Ce sont les différences dans cette structure
générique qui va différencier les flavonoïdes les uns des autres, et ils peuvent être classifiés
comme suit : flavonols (quercétine, kaempferol et myricétine), flavones (lutéoline et
apigénine), flavanols (catéchines, épicatéchines, épigallocatéchines, épicatéchines gallates et
épigallocatéchines gallates), flavanones (naringénine), anthocyanidines, isoflavanoïdes
(génistéine) et les flavonoïdes synthétiques ou semi-synthétique (flavorpiridol).
a) Les phénols
Stricto senso, la définition chimique d’un phénol est un composé constitué d’un cycle
aromatique et d’un groupement hydroxyle –OH. Lorsqu’il y a plusieurs groupements
hydroxyles, ce sont des polyphénols. Bien qu’il existe diverses classifications, ils sont le plus
souvent classés en 5 familles : les acides phénoliques, les flavonoïdes, les stilbènes, les
coumarines et enfin les tannins. Les phénols sont le produit du métabolisme secondaire chez
les plantes, fournissant des fonctions essentielles dans la reproduction et la croissance des
plantes et les protègent contre des pathogènes, parasites ou prédateurs. En ce qui concerne les
88
fruits, c’est la canneberge qui contient la plus grande part de composés phénoliques tandis que
parmi les légumes, il s’agit du brocoli.
b) Un flavonoïde semi-synthétique : le flavopiridole
Le flavopiridole (ou Alvocidib) fait partie des composés naturels ayant suscité une
excitation notoire en tant qu’agent anti-cancéreux, représentant en effet le premier inhibiteur
de CDK à entrer en clinique [338]. Le flavopiridole est un flavonoïde semi-synthétique dont
la structure nouvelle se base sur un produit naturel, la rohitukine, isolée dans un premier
temps à partir des feuilles et tiges de l’Amoora rohituka puis par la suite à partir du
Dysoxylum binectariferum, de la famille des Méliacées. La rohitukine était utilisée pour ses
vertus anti-inflammatoires et immunomodulatrices. Les mécanismes d’action du flavopiridole
impliquent la perturbation de la phosphorylation des CDK, empêchant leur activation et de ce
fait provoquant un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 ou G2. Les résultats d’une étude en
phase clinique I sur les effets du flavopiridole ont montré des taux de réponses encourageants
dans une variété de tumeurs solides et hématologiques. Ces résultats conduisirent à l’entrée en
phase II de ce composé, chez des patients atteints de cancer colorectal, de la prostate, du rein
ainsi que chez des patients souffrant de NSCLC, lymphome non-Hodgkien ou de leucémie
lymphoïde chronique (LLC) [339]. De plus, son administration en combinaison avec d’autres
agents utilisés conventionnellement tels que le paclitaxel ou le cisplatine, ont permis la
rémission partielle voire complète chez un certain nombre de patients dans une étude clinique
de phase I, conduisant à poursuivre des études en phase II chez des patients possédant des
tumeurs résistantes au paclitaxel [340].
c)
Les Flavonols : Quercétine et génistéine
La quercétine, que l’on retrouve principalement dans les oignons, injectée en
intrapéritonéal permet de diminuer la croissance tumorale de deux types de cellules tumorales
humaines de la prostate injectées à des souris [341]. La génistéine a montré des capacités
d’inhibition de croissance de cellules de leucémie Jurkat-T et de cancer de la vessie [342].
Une étude in vitro a montré que la génistéine agissait en synergie avec l’acide
eicosapentanoïque pour inhiber la prolifération de cellules humaines de cancer du sein. Dans
cette même étude, la génistéine inhibait la prolifération de cellules de cancer pancréatique par
le biais d’un mécanisme nouveau : la modulation de la synthèse d’ADN via une altération de
l’oxydation du glucose. L’impact des flavonoïdes sur la tumorigenèse reste parfois obscure et
une étude a démontré une stimulation de la croissance de cellules de mélanome dans un
89
modèle murin traité par une injection péritonéale de quercétine [343]. De plus, une autre étude
portant sur la génistéine montrait que son administration orale stimulait la croissance de
cellules tumorales humaines de cancer du sein injectées à des souris [344]. Les flavonoïdes,
bien qu’ayant montré certains aspects néfastes, représentent donc des composés à potentiel
thérapeutique anti-tumoral intéressant, mais des études plus poussées sont nécessaires pour
une application chez l’homme.
2.
Les Combrestatines
Les Combrestatines sont une famille de stilbènes avec une activité anti-angiogénique,
conduisant à la destruction du réseau vasculaire tumoral et donc à la nécrose tumorale. Elles
ont été isolées à partir de l’écorce d’un arbre d’Afrique du Sud de la famille des
Combrétacées : le Combretum caffrum. Ces composés ont montré des propriétés actives
contre les cancers du colon, du poumon, certaines formes de leucémies et sont aujourd’hui
considérées parmi les phytomolécules les plus cytotoxiques isolées jusqu’alors [345]. Au sein
des Combrestatines, l’acide bétulinique est un triterpène pentacyclique et un métabolite
secondaire commun chez les espèces Betula de la famille des Bétulacées, issu des espèces de
Zizyphus telles que Zizyphus mauritania, rugosa ou encore oenoplia. Cette molécule a
démontré une cytotoxicité sélective pour des cellules humaines de mélanome. Le Silvestrol,
isolé à partir des fruits d’Aglaia sylvestris, possède quant à lui une activité cytotoxique sur des
cellules de cancer du sein et du poumon. A l’heure actuelle, il existe trois combrestatines en
évaluation clinique, onze au stade préclinique, et de nombreux analogues de cette molécule
sont actuellement en cours de développement.
3.
La roscovitine
La roscovitine est un agent encore au début du processus de développement clinique,
mais apparaît déjà comme un candidat intéressant pour une application thérapeutique. Il est
actuellement obtenu de façon synthétique, mais c’est à la base un dérivé de l’olomucine,
originellement isolée à partir des cotylédons de radis de Raphanus sativus, de la famille des
Brassicacées. L’olomucine partage des propriétés avec les flavonoïdes puisqu’il entraîne
également l’inhibition des CDK. La roscovitine est en fait un dérivé de l’olomucine, obtenue
par des modifications chimiques, permettant l’obtention d’un inhibiteur plus affin et plus
efficace. S’en est suivie la recherche de composés encore plus bénéfiques et la famille des
purvalanoles est actuellement en cours d’évaluation préclinique.
90
4.
Le cas particulier du resvératrol
a) Le resvératrol et « l’énigme du paradoxe français »
Le resvératrol est un polyphénol de la sous-classe des stilbènes, isolé pour la première
fois à partir des racines d’un hellébore (Veratrum grandiflorum), et depuis retrouvé dans une
variété de sources alimentaires dont le vin rouge, le raisin, les mûres ou encore les cacahuètes
[346]. En 1963, le resvératrol fut identifié comme le constituant actif des racines du
Polygonum cuspidatum, ou Fallopia japonica, plus connue sous le nom de renouée du Japon,
une plante utilisée pour ses vertus médicinales en Chine et au Japon depuis des décennies
[347]. Suite à l’identification de la présence de resvératrol dans des proportions notoires dans
le vin rouge, ce composé a attiré l’attention de nombreux scientifiques, surtout en France. Son
histoire est souvent connue pour ses vertus contre les maladies cardiovasculaires plutôt que
pour ses propriétés anti-tumorales. En effet, l’intérêt primaire pour ce composé est survenu
suite à deux études clés : une première en 1992 dans laquelle les auteurs montrent un bénéfice
non négligeable de la consommation modérée de vin rouge contre les maladies coronariennes
[348], et une seconde l’année suivante dans laquelle il est démontré que c’est le resvératrol
présent dans le vin qui est responsable de ses propriétés cardioprotectrices, en inhibant
l’oxydation du LDL (low-density lipoprotein, communément connu sous le terme de
« mauvais cholestérol ») [349]. Cette molécule est surtout connue en France puisqu’éclairant
quelque peu « l’énigme du paradoxe français », correspondant au faible taux de personnes
atteintes de maladies cardio-vasculaires dans le Sud-Ouest de la France comparé à
l’alimentation riche en graisses animales dans cette région.
b) Un composé aux propriétés anti-tumorales
Outre cette cardioprotection, le resvératrol a été démontré dans la fin des années 1990
comme un composé capable d’inhiber la carcinogenèse à différentes étapes : initiation,
promotion et progression [350]. Par la suite, de nombreuses études ont montré une haute
efficacité de chimioprévention du resvératrol dans plusieurs modèles animaux de cancer. A
titre d’exemple, une administration par voie orale de resvératrol pendant 32 jours permet la
réduction de la croissance de cellules de cancer du poumon et une réduction métastatique dans
un modèle murin [351]. Une administration orale à des souris atteintes de fibrosarcomes
permet une diminution de la croissance des cellules, par inhibition de l’angiogenèse [352]. En
plus de ses propriétés de chimioprévention, le resvératrol est un candidat prometteur pour la
thérapie anti-cancéreuse, interférant avec de nombreuses voies de signalisation qui régulent la
91
prolifération cellulaire, l’apoptose, l’inflammation, l’angiogenèse ou encore le processus
métastatique. Ces études soutiennent globalement le fait que le resvératrol possède des
capacités anti-tumorales et chimiopréventives importantes, bien qu’il faille poursuivre les
études in vivo de façon à avoir une compréhension plus complète de ses mécanismes d’action
à des fins thérapeutiques chez l’homme.
E. Le cas des isothiocyanates
De nombreuses études supportent le fait que certains composés phytochimiques
trouvés dans l’alimentation pourraient être de bons protecteurs anti-carcinogènes. Ainsi, les
végétaux crucifères ont été admis comme des composés alimentaires potentiellement capables
de réduire les risques de cancer [353]. L’activité chimiopréventive de ces végétaux contre le
cancer est principalement attribuée aux isothiocyanates, des constituants abondants dans les
crucifères tels que le brocoli, le cresson, les choux de Bruxelles, le chou, le radis Japonais ou
encore le chou-fleur. Les trois isothiocyanates issus de crucifères que sont le sulforaphane
(SFN), le phenethyl isothiocyanate (PEITC) et le benzyl isothiocyanate (BITC) se sont avérés
hautement efficaces pour prévenir ou réduire le risque de cancer dans des modèles animaux.
Ils ont aussi une capacité à inhiber la croissance tumorale de divers types de cancers [354].
Comme mentionné précédemment, les effets chimiopréventifs des végétaux de la
classe des crucifères sont attribués à leur contenu en isothiocyanates, qui ne sont autres que
les produits d’hydrolyse des glucosinolates (β-thioglucoside N-hydroxysulfates), présents en
grandes quantités chez ces végétaux [355]. Les crucifères représentent une grande famille,
dont le genre Brassica, comprenant diverses variétés de choux, le brocoli, le chou-fleur, les
choux de Bruxelles, la moutarde brune et noire ainsi que des racines telles que les navets ou le
rutabaga [356]. Le contenu en glucosinolates dépend de plusieurs facteurs : la variété de la
plante, le mode de culture, le climat, ainsi que des facteurs agronomiques associés à la
croissance de chaque plante [357].
1.
Le métabolisme des isothiocyanates
Il est désormais reconnu que les propriétés anti-tumorales des glucosinolates sont
majoritairement dues à leurs produits de dégradation : les isothiocyanates (Figure 9). Plus
d’une centaine de glucosinolates différents a été répertoriée, classés en 4 familles : les
glucosinolates d’indole, les aliphatiques insaturés, les aliphatiques saturés et les aromatiques.
La proportion de ces glucosinolates dépend des espèces, mais sont dans la plupart des cas
92
localisés principalement dans le cytoplasme des cellules. C’est lors de la mastication ou de la
préparation culinaire que les tissus sont rompus et les glucosinolates relargués, permettant
ainsi l’hydrolyse des glucosinolates par la myrosinase [358].
Figure 9 : Hydrolyse des glucosinolates par la myrosinase et formation des
isothiocyanates.
Source : D’après Wu et al, Are isothiocyanates potential anti-cancer drugs, 2009,
[359].
Les isothiocyanates ainsi obtenus traversent l’épithélium gastro-intestinal et
l’endothélium capillaire par diffusion passive. Ils se lient rapidement et de façon réversible
aux groupements thiols présents sur les protéines du plasma et traversent ainsi la membrane
plasmatique pour rejoindre l’espace intracellulaire tissulaire. Une fois à l’intérieur des
cellules, les isothiocyanates réagissent avec le glutathion et forment un conjugué de
glutathion : le glutathion S-(N-alkyl/arylthiocarbamoyl), grâce à l’activité de la GST. Ce
conjugué est alors expulsé des cellules par des transporteurs protéiques appelés les protéines
de résistance aux multidrogues (MRPs). S’en suit une série de réactions d’hydrolyse, de façon
à conduire les conjugués au foie et aux reins pour leur élimination in fine dans les urines.
Cette voie correspond à la voie de l’acide mercapturique, qui caractérise majoritairement le
métabolisme des isothiocyanates.
2.
Isothiocyanates et activité anti-tumorale
La capacité des isothiocyanates à bloquer la carcinogenèse induite chimiquement fut
reconnue pour la première fois il y a plus de 30 ans avec l’isothiocyanate α-naphthyl [360].
Depuis, plus d’une vingtaine d’isothiocyanates naturels ou synthétiques ont été étudiés et ont
93
montré une capacité d’inhibition de la carcinogenèse induite par divers types de composants
chimiques dans des modèles de rongeurs. Une étude menée chez le rat a ainsi montré que
certains isothiocyanates inhibaient la formation de tumeurs mammaires induites par le 7, 12dimethylbenz[a]-anthracene (DMBA) quand ils étaient administrés 4h avant le traitement au
DMBA. De plus, l’addition d’isothiocyanates à l’alimentation contenant également du DMBA
inhibe la formation de néoplasmes de l’estomac ou d’adénomes pulmonaires dans un modèle
murin [361-362]. D’autres isothiocyanates naturels tels que le PEITC, BITC précédemment
mentionnés ou encore le phenyl isothiocyanate (PITC) ont montré des capacités d’inhibition
de la tumorigenèse pulmonaire dans des modèles murins [363-364]. Parmi ces trois
isothiocyanates, le PEITC est le plus efficace en termes de prévention, allant jusqu’à inhiber
le développement de tumeurs du poumon chez 97% des souris (Figure 10).
Figure 10 : Structure chimique de trois principaux isothiocyanates.
A) PITC B) BITC C) PEITC
Il existe d’autres études menées sur différents modèles de cancer chez le petit animal
qui aboutissent au même constat : les isothiocyanates possèdent des propriétés prometteuses
de protection anti-tumorale. Ceci étant dit, comme mentionné précédemment, il existe divers
types d’isothiocyanates, et leur pouvoir anti-tumoral dépend de nombreux facteurs : le modèle
d’étude, le tissue cible, le type de carcinogène utilisé, les doses, le régime de traitements et la
nature même de l’isothiocyanate. Bien que la littérature ne manque pas en termes d’études des
caractéristiques anti-tumorales des isothiocyanates chez l’animal, il n’y a qu’un nombre limité
d’études portant sur les effets de ces composés chez l’homme et une meilleure compréhension
des mécanismes sous-jacents est nécessaire.
94
3.
Les
mécanismes
impliqués
dans
l’activité
anti-tumorale
des
isothiocyanates
a) Induction d’apoptose
Les premières observations d’une induction d’apoptose par les isothiocyanates furent
apportées en 1998 dans un modèle de cellules HeLa. Les auteurs montrent que le PEITC et
d’autres isothiocyanates structurellement semblables tels que le phenylmethyl isothiocyanate
ou encore le phenylhexyl isothiocyanate induisent des cellules HeLa en apoptose de façon
temps et dose dépendante [365]. De plus, un traitement avec des doses induisant l’apoptose
conduit à l’activation de la voie des caspases, et notamment l’activation rapide et transitoire
de la caspase-3. Un prétraitement avec un inhibiteur puissant de la caspase 3 a montré une
inhibition de l’activation de cette dernière et de l’apoptose, laissant supposer que les
isothiocyanates induisent l’apoptose via un mécanisme caspase 3-dépendant. Une autre étude
menée sur des cellules de leucémie a montré que les isothiocyanates induisaient une apoptose
via la voie des caspases et impliquaient également activement la voie JNK (c-Jun N-terminal
kinase) [366]. La capacité du SFN à induire des cellules en apoptose via l’activation de
multiples mécanismes moléculaires fut également démontrée dans un modèle cellulaire de
glioblastome [367]. Toutes ces études soulèvent l’importance de l’apoptose comme l’un des
mécanismes majeurs par lesquels les isothiocyanates exercent leur cytotoxicité.
b) Le stress oxydatif
Les ROS sont très souvent en concentrations plus élevées dans les tumeurs, et sont
notamment responsables d’une stimulation de la prolifération cellulaire et d’une instabilité
génétique. Cette augmentation anormale des ROS peut être exploitée pour cibler
spécifiquement les cellules cancéreuses. Une étude menée sur des cellules cancéreuses de
l’ovaire a montré l’intérêt et l’implication du PEITC dans ce mécanisme. En effet, il y a dans
des cellules épithéliales d’ovaire transformées en cellules malignes une augmentation de la
production de ROS, sensibilisant les cellules au PEITC. Brièvement, le PEITC désactive la
machinerie antioxydante du glutathion, notamment la GSH, et conduit à une accumulation de
ROS préférentiellement dans les cellules transformées du fait de leur production active de
ROS. L’excès de production de ROS au sein d’un tissu provoque des dommages dans les
mitochondries, le relargage spontané de cytochrome c, l’inactivation de certaines molécules
sensibles aux réactions d’oxydo-réduction, ce qui conduit à une mort cellulaire massive [368].
Dans cette même étude, les auteurs soulèvent l’intérêt d’utiliser le stress oxydatif généré par
95
les isothiocyanates pour traiter des cellules cancéreuses résistantes aux traitements
conventionnels. Ainsi, les cellules de LLC sont un bon modèle d’étude d’une part puisque
particulièrement résistantes à la fludarabine, l’un des traitements conventionnels de la
leucémie chronique, et d’autre part du fait de leur fort taux de ROS intracellulaire. Ainsi, en
utilisant des cellules primaires de LLC et des lymphocytes sains, les auteurs montrent une
forte sensibilité des cellules tumorales au PEITC alors que les lymphocytes sains ne sont que
très peu affectés par le traitement. L’exposition des LLC au PEITC a diverses conséquences :
la déplétion sévère en GSH, l’accumulation des ROS, l’oxydation de la cardiolipine
mitochondriale conduisant à une mort cellulaire massive. Cette étude a donc pu apporter de
nouvelles perspectives quant à l’utilisation des isothiocyanates pour l’élimination de cellules
malignes résistantes aux traitements conventionnels, via un mécanisme d’oxydo-réduction,
avec une très modeste toxicité sur les lymphocytes sains environnants [354].
c)
Arrêt du cycle cellulaire
L’arrêt du cycle cellulaire par les isothiocyanates fut observé il y a plus de 20 ans dans
des cellules HeLa traitées avec l’isothiocyanate d’allyle (AITC), le BITC et le PEITC. Après
16h de traitement, les cellules étaient arrêtées en phase G2/M, conduisant à une inhibition de
la prolifération cellulaire [369]. De plus, le SFN inhibe lui aussi la progression du cycle
cellulaire, bloquant complètement la croissance de cellules LM8 et provoquant leur arrêt en
phase G2/M. Le mécanisme sous jacent à l’arrêt du cycle par le SFN semble être une
surexpression de la protéine p21, responsable d’un arrêt du cycle cellulaire de manière dosedépendante [370]. Les isothiocyanates ont donc une action anti-carcinogène notamment par le
biais de l’arrêt du cycle cellulaire. Cependant, les arrêts peuvent se faire dans différentes
phases du cycle, selon les lignées cellulaires, mais aussi selon la nature de l’isothiocyanate.
d) Effet anti-angiogénique:
Le PEITC pourrait aussi exercer son action préventive contre le cancer via l’inhibition
de l’angiogenèse. En effet, un traitement au PEITC sur des cellules humaines endothéliales de
veine ombilicale (HUVEC) a montré une diminution de la survie cellulaire de manière temps
et dose-dépendante [371]. L’inhibition des caractéristiques angiogéniques des HUVEC par le
PEITC in vitro étaient associées à une suppression de la sécrétion du principal facteur proangiogénique, le VEGF à une sous-régulation du récepteur au VEGF-2, et à une inactivation
de la protéine Akt.
96
e)
Inhibition des histones déacétylases:
Certains isothiocyanates ont montré une activité d’inhibition des HDAC [372], et
notamment le SFN pour la première fois sur des cellules humaines de cancer du colon [373].
Cette activité d’inhibition des HDAC a aussi été démontrée pour d’autres types cellulaires
dont quatre lignées de cancer du sein (MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF-7 et T47) [374].
Outre le SFN, le PHITC démontre aussi des activités d’inhibition des HDAC notamment dans
un modèle de cellules humaines de leucémie HL-60 [375].
Cette liste des mécanismes mis en jeu par des traitements aux isothiocyanates n’est pas
exhaustive mais reflète la diversité des voies impliquées dans leur rôle chimio-protecteur et
anti-tumoral.
III. Composés d’autres sources naturelles
A. D’origine microbienne
Un certain nombre de composés dits naturels sont issus de micro-organismes, et les
agents anti-tumoraux antibiotiques sont parmi les plus nombreux agents chimiothérapeutiques
utilisés en cancérologie. Ceci comprend des membres de différentes familles de composés :
les anthracyclines, les bléomycines, les actinomycines, les mitomycines, les cryptophycines
ou encore les acides auréoliques. Certains composés agissent en ciblant la tubuline, comme
par exemple les cryptophycines. La formation du réseau de microtubules est inhibée, ce qui
arrête prématurément la mitose et conduit à la mort cellulaire.
1.
Les anthracyclines
Les anthracyclines, isolées à partir d’Actinobactéries du genre Streptomyces, telles que
la doxorubicine ou la daunomycine, demeurent les antibiotiques anti-tumoraux les plus
utilisés en clinique, exerçant leur activité en inhibant la topoisomérase II [300]. Elles inhibent
les processus de religation suite à l’action de l’ADN topoisomérase II, ce qui conduit à une
accumulation de cassures double et simple brin de l’ADN, causant des dommages à l’ADN
aboutissant à la mort de la cellule [376]. Ainsi la doxorubicine a un spectre d’activité très
large et demeure l’agent anti-cancéreux le plus utilisé puisque le plus efficace. Il est appliqué
au traitement du cancer du sein, du poumon à petites cellules, de l’ovaire et également dans
des lymphomes. Cependant, des effets secondaires importants ont été associés aux molécules
pionnières de la famille des anthracyclines : elles affectent la moelle osseuse et entraine
97
stomatite, alopécie ou encore des toxicités gastro-intestinale ou dermatologique. De plus, ces
agents sont responsables d’une cardiotoxicité caractérisée par une dysfonction du myocarde et
une insuffisance cardiaque. C’est pourquoi des dérivés ont été développés, tels l’épirubicine et
l’idarubicine, de façon à améliorer les propriétés thérapeutiques et pharmacologiques et
minimiser les effets secondaires.
2.
D’autres
Autres molécules
molécules
telles
que
la
rapamycine
(Sirolimus),
aux
propriétés
immunosuppressives, agit comme un inhibiteur spécifique de m-TOR (mammalian target of
rapamycin), qui est un acteur de la cascade PI3K/Akt, bloquant l’activation de la transcription
[377]. La L-asparaginase, aux propriétés anti-tumorales observées il y a plus de 60 ans [378379], a depuis été utilisée pour traiter une série de maladies lymphoprolifératives et de
lymphomes.
Ainsi, des toxines originellement destinées à l’autoprotection de certains organismes
du règne animal ou végétal contre des prédateurs ou d’autres organismes, s’avèrent de bons
candidats pour une utilisation thérapeutique chez l’homme.
B. Les composés d’origine marine
1.
Un peu d’histoire
La mer représente une source étonnante, jusqu’alors très peu explorée, pour la
recherche de nouveaux composés à potentiel thérapeutique anti-tumoral. L’histoire des agents
anti-cancéreux d’origine marine remonte aux années 1960 quand la cytarabine, un analogue
de nucléoside pyrimidique, fut développée sur la base de deux nucléosides dérivés d’une
espèce d’éponge des Caraïbes Cryptotheca crypta (spongothymidine et spongouridine). La
cytarabine possède des propriétés anti-tumorales dans des modèles de leucémies [380] et de
lymphomes [381]. Plus récemment, un dérivé fluoré de la cytarabine fut isolé, la gemcitabine,
avec une activité significative chez des patients atteints de cancers du pancréas, du sein, de la
vessie et du NSCLC [382-384]. S’en suivit une série d’extractions de composés à potentiel
thérapeutique tels les bryostatines, isolées à partir de certaines espèces de Bryozoaires. Dans
les années 1980, les améliorations technologiques ainsi qu’une campagne pour collecter des
échantillons des profondeurs océaniques conduisent à étendre la collection des composés à
potentiel thérapeutique de source marine. Ainsi, plus de 3000 nouvelles substances ont été
98
identifiées ces trois dernières décennies, soulevant une fois de plus le fort potentiel de la
biodiversité des océans comme source de nouveaux composés à des fins thérapeutiques.
Les composés de source marine peuvent être regroupés suivant quatre familles : les
dolastatines, les bryostatines, les depsipeptides ou encore les composés dérivés des tuniciers,
appartenant à l’ordre des chordés et plus précisément des urochordés.
2.
Les dolastatines
Les dolastatines sont des peptides cytotoxiques issus d’un mollusque vivant dans
l’Océan Indien : Dolabella auricularia. Ils présentent des activités cytotoxiques, et parmi eux,
les dolastatines 10 et 15 ont suscité un grand intérêt quant à leur application potentielle en
clinique [385]. Ces peptides induisent un arrêt des cellules en métaphase lors de la mitose, dû
à l’inhibition de la formation du réseau mitotique empêchant l’assemblage des microtubules
[386]. Cependant, les dolastatines induisent des effets secondaires trop importants pour les
considérer comme de bons candidats pour le traitement d’un certain nombre de tumeurs
solides chez l’homme.
3.
Les bryostatines
Les bryostatines proviennent de diverses espèces de bryozoaires marins, mais sont
principalement obtenues à partir du Bugula neritina. Elles ont été décrites comme modulant
l’activité de la protéine kinase C (PKC), ne possèdent pas d’activité pro-tumorigénique, et
induisent une différentiation cellulaire dans différents modèles in vivo et in vitro. Plus
particulièrement, la bryostatine 1 a fait ses preuves en phase II chez des patients souffrant de
mélanome malin [387], lymphome [388], carcinome ovarien [389], ou encore pour le
traitement du cancer colorectal métastatique [390]. Bien que les effets des bryostatines dans
des modèles précliniques aient été concluants, la bryostatine 1 ne montra objectivement pas
d’effet anti-tumoral significatif chez des patients atteints de tumeurs solides à des stades
avancés [391], ce qui conduisit au développement d’analogues des bryostatines.
4.
Les depsipeptides
Le premier composé anti-tumoral d’origine marine à avoir intégré un essai clinique
était la didémnine B, un depsipeptide cyclique isolé à partir d’une espèce d’urochordées :
Trididennum solidum [392]. Son mécanisme implique un arrête du cycle cellulaire en phase
G1. Les résultats préliminaires montraient un effet positif sur des cellules de lymphome non-
99
Hodgkinien [393], cependant la toxicité neuromusculaire et cardiaque engendrée était telle
que l’essai fut interrompu. Divers depsipeptides ont démontré une activité cytotoxique contre
plusieurs lignées de cellules de tumeurs solides humaines, soulevant l’intérêt de ces composés
pour leur utilisation à des fins thérapeutiques.
Tous ces composés d’origine marine sont de très puissantes molécules, aux propriétés
anti-tumorales actives à des concentrations moindres (jusqu’au nM). Bien que la découverte
de nouveaux composés thérapeutiques à partir d’organismes océaniques représente un vrai
challenge de par les technologies limitées dans le domaine et les difficultés d’échantillonnage,
il est maintenant admis que l’océan représente une source considérable de composés
possédant de puissantes propriétés thérapeutiques. En somme, la biodiversité naturelle a de
très grandes capacités pour fournir des composés applicables à la médecine humaine, mais ne
reste cependant que très modestement exploitée. Il apparaît donc comme évident l’intérêt
d’exploiter la biodiversité lorsqu’il est question de la recherche de nouveaux composés
thérapeutiques.
IV. Molécules naturelles et Mésothéliome Pleural Malin
L’acceptation du bénéfice thérapeutique que peuvent apporter des composés d’origine
naturelle dans le traitement du cancer n’est que très récente. Les études s’intéressant à
l’application de molécules naturelles dans le traitement du MPM sont en effet encore à leurs
débuts. Néanmoins, quelques molécules semblent déjà susciter un intérêt pour leur utilisation
thérapeutique.
A. Le ciblage du facteur de transcription SP1 (Specificity Protein 1)
Les protéines SP (specificity proteins) sont des facteurs de transcription ubiquitaires
exprimés dans une grande variété de cellules de mammifères. SP1 est fortement exprimée
dans de nombreux types de cancers dont le MPM et de précédentes études démontrent le rôle
de SP1 dans la carcinogenèse et le processus métastatique de différents types de cancers
[394].
1.
Les diterpènes du café
Un groupe de chercheurs s’est récemment intéressé aux diterpènes présents dans le
café et à leur intérêt dans une application thérapeutique pour traiter le MPM. Le café est une
mixture complexe de différents composés, qui possède des fonctions biologiques diverses
100
largement débattues (anti-oxydant, anti-inflammatoire, anti-carcinogène, anti-mutagène…)
[395]. Parmi ses constituants, les deux diterpènes de cafestol et kahweol ont suscité l’intérêt
quant à leurs propriétés anti-tumorales appliquées au MPM chez l’homme. Les auteurs
démontrent un effet pro-apoptotique des cafestol et kahweol sur des cellules de MPM par le
biais de la répression de l’expression de SP1 [396].
2.
La quercétine
Une récente étude rapporte les effets anti-carcinogènes de la quercétine. En effet, cette
étude montre les propriétés pro-apoptotiques de la quercétine sur une lignée de MPM,
accompagnée d’une augmentation de la proportion de cellules en phase sub-G1. De plus, les
auteurs décrivent une suppression de l’expression de SP1 avec un traitement à la quercétine.
Dans cette étude, la quercétine apparaît comme une molécule à potentiel thérapeutique,
notamment par le ciblage de SP1.
B. Autres
La ranpirnase est une ribonucléase retrouvée dans les oocytes des grenouilles léopards
(Rana pipiens), et a été l’objet d’évaluation en tant qu’agent thérapeutique pour le traitement
de certains cancers, dont le MPM. La ranpirnase pénètre à l’intérieur des cellules par
endocytose, et une fois dans le cytosol, dégrade préférentiellement les ARNt. Les dommages
générés à l’ARN peuvent constituer un signal de mort cellulaire ou contribuer à l’inhibition de
la croissance et de la prolifération cellulaire. Ainsi une étude préliminaire in vitro montrait
une inhibition de la croissance de cellules de MM avec des concentrations de ranpirnase de
l’ordre du nM (Costanzi, 1996 « The use of onconase for patients with advanced malignant
mesothelioma). Quelques temps plus tard, un essai clinique de phase II a montré des
propriétés anti-tumorales intéressantes de la ranpirnase chez des patients atteints de MM
[397].
101
Conclusion
La médecine et son application au traitement du cancer a connu d’importantes
évolutions depuis les premières recherches dans le domaine de l’oncologie. Ainsi, un certain
nombre de maladies humaines peuvent être guéries, ou tout du moins les patients peuvent
bénéficier d’une survie prolongée grâce aux stratégies thérapeutiques qui ont été développées
[398]. L’identification et le développement de molécules naturelles a grandement participé à
ces progrès, et certains composés naturels sont allés jusqu’à l’approbation pour leur utilisation
clinique. La biodiversité est donc de nos jours appréhendée comme une gigantesque source de
différents types de composés à fort potentiel thérapeutique, par les patients, mais aussi de plus
en plus par le corps médical. En conclusion, l’application de composés naturels dans le
traitement du cancer, notre « peste » des temps moderne, s’est avérée très prometteuse
puisque permettant d’augmenter l’efficacité des thérapies actuelles.
102
INTRODUCTION - Chapitre IV : Les nanomédecines et la cancérologie
CHAPITRE IV : LES NANOMÉDECINES ET LA CANCÉROLOGIE
A l’heure actuelle, la recherche en cancérologie touche à un grand nombre de
domaines de la biologie, chimie et même physique et aboutit au développement de stratégies
thérapeutiques pluridisciplinaires. L’arsenal conventionnel de traitement des cancers
comprend la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie ou encore une combinaison des
trois [399].
En dépit des progrès réalisés depuis ces quelques dizaines d’années, la plupart des
composés thérapeutiques administrés en chimiothérapie provoquent d’importants effets
secondaires tels qu’une toxicité systémique ou encore une toxicité sur les cellules saines
environnantes. En plus des effets secondaires communément anticipés telle la perte de
cheveux, les nausées ou encore les infarctus du myocarde, d’importants risques de
néphrotoxicité, neurotoxicité, toxicité vasculaire, infertilité ou encore complications
thromboemboliques sont encourus. Les principaux inconvénients des composés utilisés en
chimiothérapie résident d’une part dans leur incapacité à cibler spécifiquement les cellules
tumorales, et d’autre part dans les doses et voies d’administration non satisfaisantes pour leur
application en clinique [400]. Ainsi, le domaine des nanomédecines a émergé pour permettre
d’une part la destruction ciblée des cellules tumorales tout en minimisant les effets sur les
cellules saines environnantes, et d’autre part le développement de méthodes permettant
d’augmenter les doses de composés administrés de façon à augmenter le bénéfice
thérapeutique, tout en limitant les effets secondaires.
L’ultime but des nanomédecines est donc la vectorisation du composé thérapeutique
afin d’en libérer le maximum dans les cellules tumorales cibles, tout en évitant leur
accumulation dans des tissus ou organes sains. Cependant, cet objectif constitue un réel
challenge, puisque qu’il ne pourrait être idéalement atteint que par injection du composé
thérapeutique directement dans la tumeur, ce qui n’est pratiquement et médicalement faisable
que dans de très rares cas. La discipline des nanomédecines s’est donc concentrée depuis une
dizaine d’année sur la conception de systèmes de libération ciblée de composés, appelés des
DDS (drug delivery systems), de façon à gagner en spécificité d’action des composés
thérapeutiques, et diminuer les effets secondaires en limitant la toxicité sur les cellules saines
[401].
103
I. Les nanoparticules conventionnelles
Les nanotechnologies reposent actuellement sur certaines définitions fournies par
l’initiative nationale des nanotechnologies (NNI : National Nanotechnology Initiative), les
caractérisant comme un développement de la recherche et de la technologie aux niveaux
atomique, moléculaire et macromoléculaire, avec une échelle de nano-systèmes de l’ordre de
la centaine de nm. De plus, les systèmes et dispositifs élaborés ont de nouvelles propriétés et
fonctions basées sur les nanomatériaux qui les composent, notamment du fait de leur petite
taille [402]. Les nanoparticules ont été développées dans le but d’une application préclinique
et clinique des nanomédecines, de façon à améliorer les effets thérapeutiques des composés
actuellement administrés tels que les petites molécules, gènes ou encore peptides [403-405].
Ainsi il est possible de recenser les caractéristiques idéales d’une nanomédecine appliquée à
une stratégie anti-tumorale. Sept principales caractéristiques peuvent donc être mentionnées
[405] :
-
Une augmentation de la concentration du composé thérapeutique au niveau du site
tumoral.
-
Une diminution de la concentration du composé dans les tissus sains environnants.
-
Une diffusion limitée du composé lors de son transit vers le site tumoral.
-
Une absence de dégradation et d’élimination prématurée du système.
-
Une rétention du composé au niveau du site ciblé durant la période voulue.
-
Une facilité de transit intracellulaire et de récupération par les cellules cibles.
-
Une biocompatibilité et biodégradation des nanoparticules.
Ainsi, la recherche dans le domaine des nanomédecine, biotechnologie et
nanotechnologie s’est focalisée sur le développement de différents DDS dans le but
d’atteindre ces caractéristiques idéales. Bien que la liste des différents composés soit longue,
il est utile de décrire les principaux nano-systèmes développés dans un but de stratégie antitumorale (Figure 11).
104
Figure 11 : Schémas des principaux DDS utilisés dans le domaine des nanomédecines.
Source : adapté depuis Kamaly et al., Targeted polymeric therapeutic nanoparticles : design,
development and clinical translation, 2012, [406].
A. Les liposomes
1.
Histoire
Les liposomes furent décrits pour la première fois en 1965, et furent les premiers
nano-systèmes appliqués en clinique [407]. Avant d’être considérés comme des
« transporteurs » potentiels de composés thérapeutiques, les vésicules de bicouche lipidiques
étaient utilisées comme un modèle pour mimer les membranes biologiques [408]. Par la suite,
compte tenu de leur facilité d’utilisation tant par leur taille que par leur composition lipidique,
les liposomes devinrent le modèle idéal des membranes plasmatiques, et furent utilisés pour
mimer des cellules vivantes et comprendre un panel de phénomènes physiologiques tels que la
diffusion transmembranaire ou la réponse cellulaire à différents agents biologiques ou
pharmacologiques.
2.
Composition
Les liposomes sont des vésicules composées d’une ou plusieurs bicouches lipidiques
qu’on appelle des lamellae qui encapsulent un compartiment aqueux. Les liposomes offrent
des caractéristiques intéressantes telles qu’une biocompatibilité, une biodégradation et une
toxicité réduite comparés aux autres DDS. La polyvalence des structures liposomales réside
dans leur capacité d’agir comme cargo de différents types de macromolécules, qu’elles soient
hydrophiles ou hydrophobes. En effet, les composés hydrophobes s’intègrent dans la bicouche
lipidique, alors que les composés hydrophiles pourront se loger dans le cœur aqueux du
liposome. Enfin, certains types de molécules peuvent alternativement être chimiquement ou
physico-chimiquement adsorbés à la surface externe du liposome (Figure 12) [409].
105
Figure 12 : Schéma des trois approches de conception des liposomes.
Les nanoparticules hydrophobes peuvent être encrées dans la bicouche lipidique (A), encapsulées dans le cœur
aqueux (B), chimiquement conjuguées (C) ou physiquement adsorbés/complexés à la surface du liposome (D).
Source: adapté depuis Al Jamal et al., Liposomes: From a Clinically Established Drug
Delivery System to a Nanoparticle Platform for Theranostic Nanomedicine, 2011, [409].
3.
Les liposomes aujourd’hui
Actuellement, les liposomes sont les plus utilisés en clinique dans le domaine des
systèmes d’échelle nanométrique utilisés pour libérer des composés cytotoxiques anti
fongiques, des gènes, des vaccins ou encore des agents d’imagerie [410]. En effet, après une
décennie de travaux sur les DDS et notamment sur les liposomes comme DDS potentiels, il
est maintenant admis que les liposomes sont des candidats intéressants pour la libération d’un
large panel de composés thérapeutiques. Leur application en clinique pour la libération de
composés anti-carcinogéniques dans de nombreux types de cancers est maintenant bien établi
[409]. Répondant à l’effet EPR (Enhanced Permeability and Retention), expliqué plus tard
dans cette introduction, les liposomes s’accumulent et sont retenus préférentiellement au
niveau du site tumoral. Les applications cliniques des nanomédecines sont discutées plus en
détails par la suite, mais plusieurs systèmes nanométriques de liposomes tels que le Doxil ®, le
Caelyx® et le Myocet®, tous encapsulant de la doxorubicine dans leur compartiment aqueux,
ont été utilisés dans le Sarcome de Kaposi, le cancer de l’ovaire et le myélome multiple [411412].
Les liposomes de dernière génération ont un but « théranostique », un terme récent
employé pour illustrer les efforts mis en œuvre pour trouver des thérapies plus efficaces et
spécifiques de chaque patient, en combinaison avec une capacité de diagnostic, le tout dans un
seul et même agent thérapeutique. Ainsi la théranostique vise à combiner la thérapie avec le
106
diagnostic, de façon à promouvoir le développement d’essais cliniques plus spécifiques à
chacun et de ce fait offrant un bénéfice thérapeutique plus important. Ainsi le concept de
transporter et délivrer simultanément un agent thérapeutique et diagnostique dans un seul et
même nano-système suscite grand intérêt [413-414].
4.
Les limites associées aux liposomes
Cependant, certaines limites associées aux liposomes, notamment des paramètres
pharmacocinétiques insuffisants ou encore un relargage précoce du composé de la
nanoparticule, susceptible de causer une cytotoxicité importante, ont conduit les recherches à
pousser plus loin la caractérisation de nouveaux DDSs [415]. De plus, les liposomes dits de
première génération subissent une élimination importante par le système mononucléaire de
phagocytose (MPS : Mononuclear Phagocytic system) [416], suite à l’adsorption des
opsonines [417]. Suite à ces observations, des liposomes de « seconde génération » furent
synthétisés, en ajoutant des groupements de PEG (poly ethylene glycol), de façon à augmenter
la demi-vie plasmatique des composés, et ainsi optimiser leur accumulation dans la tumeur.
L’intérêt de cette technologie réside dans l’idée selon laquelle les groupements PEG génèrent
un nuage hydrophile autour du liposome, minimisant ainsi l’opsonisation et l’élimination des
nanoparticules par le MPS [418-419]. Bien que les liposomes représentent une part importante
des recherches sur les DDS, d’autres nanoparticules en développement présentent aussi un
grand intérêt.
B. Les dendrimères
1.
Composition
Les dendrimères sont des nanomatériaux tridimensionnels de forme sphérique
constitués de branchements répétés de dendrons contenant un unique groupement chimique
appelé le point focal [420-421]. Les dendrimères se structurent comme suit : un cœur
initiateur, des branchements répétés, des groupements fonctionnels terminaux et des espaces
de vide laissant place à un cargo moléculaire [422]. Les groupements fonctionnels terminaux
situés à la surface externe sont essentiels pour la détermination des propriétés des
macromolécules dendrimériques, qui peuvent être conjuguées avec d’autres molécules pour
cibler les cellules cancéreuses.
107
2. Les différents dendrimères
Il existe cinq principaux dendrimères communément utilisés en nanomédecines :
-
Les polyamidoamines (PAMAM)
-
Les dendrimères de poly-lysine
-
Les polyesters
-
Les polypropylimines (PPI)
-
Les dendrimères d’acide propionique
Deux d’entres eux sont actuellement commercialisés : les PANAM ou encore les PPI
(Astramol) [423-424]. Les dendrimères peuvent être utilisés pour le ciblage tumoral, et les
multifonctions des dendrimères peuvent être un atout majeur quant aux diverses possibilités
d’incorporation d’agents thérapeutiques anti-cancéreux ou d’imagerie.
C. Les nanoparticules polymériques
1.
Composition et synthèse
De nombreux nano-systèmes utilisés dans la recherche préclinique voire clinique sont
des nanoparticules polymériques (PNP : Polymeric Nanoparticle), qui ont été très largement
étudiés en tant que transporteurs de composés thérapeutiques [425]. La principale
caractéristique de ces nano-systèmes réside dans le fait qu’ils sont composés de matériaux
biocompatibles et biodégradables. La plupart de ces nanoparticules sont basées sur un
principe d’auto-assemblage grâce à des copolymères composés de deux ou plusieurs chaines
polymériques aux propriétés hydrophiles variables. Ces copolymères s’auto-assemblent en
une structure « core-shell » (Cœur-écorce ou coquille) en milieu aqueux [403]. Plus
spécifiquement, les blocs hydrophobes forment le « cœur » de la structure de façon à limiter
son exposition au milieu aqueux environnant, alors que les blocs hydrophiles forment la
« coquille » qui préserve le cœur et son cargo [426], créant ainsi une structure protégée et
adaptée à la libération de composés thérapeutiques. Cette capsule protectrice permet d’éviter
les interactions entre les composés et les cellules saines environnantes, participant ainsi à
limiter la toxicité de ces nanoparticules. Cependant cette méthode de synthèse d’autoassemblage est loin d’être unique. Il existe notamment une autre méthode nommée PRINT
pour « Particle Replication in Nonwetting Templates », qui permet de synthétiser des
particules de taille, forme et composition précise [427]. Tout comme beaucoup d’autres nanosystèmes, la méthode de synthèse des PNP conditionne leurs applications potentielles. Les
108
PNP peuvent donc se présenter sous forme de nanosphères et les composés peuvent être
adsorbés à la membrane, encapsulés dans la matrice, ou sous forme de nanocapsules formées
d’un cœur liquide encapsulant le composé et d’une capsule solide.
2.
Activité biologique des PNP
Ces DDS ont démontré une augmentation d’efficacité thérapeutique, une réduction de
la toxicité, une activité biologique prolongée, et la capacité de co-délivrer plusieurs composés
en même temps avec un effet synergique [428]. Les PNP ont été conçus tant pour
l’encapsulation de petites molécules que de macromolécules tels des gènes, acides nucléiques
ou encore peptides [406,429]. Parmi les différents polymères, les PEG et l’acide poly(lacticco-glycolic) (PLGA) sont très utilisés pour la médecine translationnelle puisqu’étant des
polymères biocompatibles. Ils permettent de prolonger le temps de circulation des particules
dans le sang en limitant leur interaction avec des protéines du plasma et en empêchant leur
reconnaissance par le système réticulo-endoplasmique (RES). En effet, le PLGA est le
polymère le plus utilisé, approuvé par la FDA aux Etats Unis ainsi que par la EMA (European
Medicine Agency), notamment grâce à sa biocompatibilité, se monomérisant facilement dans
l’organisme en acide lactique et acide glycolique [430].
Cependant, bien que le PLGA ait démontré des effets thérapeutiques intéressants dans
des essais précliniques, ces nanoparticules peuvent être retirées de la circulation par le
système RES, qui agit en opsonisant les nanoparticules qui sont ensuite phagocytées par les
macrophages [431]. A l’origine utilisés pour favoriser la stabilité stérique des nanoparticules
de façon à augmenter la demi-vie plasmatique des nanoparticules, les PEG sont les polymères
les plus communément utilisés pour la modification des surfaces des nanoparticules [432].
D. Les nanotubes de carbone
1.
Composition des nanotubes de carbone
Parmi les nombreux types de nano-systèmes étudiés et exploités pour une application
en nanomédecine, les nanotubes de carbones (CNT) ont attiré l’attention pour leurs diverses
applications biomédicales de par leurs propriétés uniques [433]. Les CNT sont des
nanomatériaux graphitiques de carbone creux et structurés (Figure 13). Ils ont la particularité
d’avoir une forme en nano-aiguille, ce qui leur permet de rentrer dans les cellules selon
différentes voies, telles qu’une diffusion passive à travers la bicouche lipidique ou encore la
voie active d’endocytose [434]. De nombreuses études se sont intéressées aux CNT comme
109
biomatériaux pour une application biomédicale de thérapie ciblée, notamment de par leurs
propriétés biologiques, physiques et chimiques uniques, leur structure monolithique creuse
mais aussi leur plasticité quant aux différents groupements présents sur leur surface externe.
Figure 13 : Structure
nanotube de carbone.
schématique
d’un
Les CNT peuvent être à monofeuillet (A : Single-walled
Carbon Nanotubes, SWNT) ou à feuillets multiples (B :
Multi-walled Carbon Nanotubes, MWNT).
Source : https://woomyoung.co.kr
Les CNT sont classés selon deux groupes distincts, basés sur leur structure. D’une part
les SWCNT pour single-walled CNT et les MWCNT pour multi-walled CNT. Les SWCNT
consistent en une couche de carbone cylindrique unique d’un diamètre de 0,4 à 2nm selon leur
température de synthèse. A l’inverse, les MWCNT sont composés de plusieurs couches de
carbones cylindriques, dont les diamètres dépendent de la position des tubes (1 à 3 nm pour
les tubes intérieurs, 2 à 100 nm pour les tubes extérieurs) [435]. Selon le type de synthèse
employé pour produire les CNT, les propriétés sont variables. Les techniques adoptées pour
synthétiser les CNT varient donc selon la fonction que l’on souhaite attribuer aux CNT. Ainsi,
les SWCNT sont préférables dans une optique de stratégie thérapeutique ciblée. Ils
bénéficient en effet d’une configuration unidimensionnelle et d’une capacité de chargement
en composés thérapeutiques particulièrement élevée du fait de leur surface importante [436].
Il a été démontré que l’accrochage de composés thérapeutiques sur des SWCNT augmentait
leur demi-vie plasmatique, ce qui favorise l’accumulation des composés au niveau du site
ciblé. De plus, une étude a montré l’élimination fonctionnelle de ces biomatériaux et leur
biocompatibilité, faisant de ces nano-systèmes des candidats prometteurs en termes de
libération ciblée de composés thérapeutiques [437]. Il est à noter que les SWCNT sont aussi
utilisés pour l’imagerie, ayant l’avantage, contrairement à certaines nanoparticules semiconductrices, de n’engendrer aucune fluctuation du spectre de fluorescence. Les MWCNT
sont eux utilisés pour le traitement thermique des cancers [438]. En effet, suite à un
rayonnement infrarouge, les MWCNT libèrent des vibrations de forte énergie au sein du tissu,
produisant ainsi un réchauffement localisé qui peut être exploité pour la destruction ciblée des
cellules tumorales. Possédant un nuage électronique plus important que les SWCNT et aussi
110
des nanotubes métalliques plus nombreux, les MWCNT captent les rayons infrarouges plus
facilement et rapidement.
2.
Les CNT en tant que DDS
Bien que les CNT aient été étudiés en tant qu’agents d’imagerie ou pour l’ablation
tumorale thermique [399], leurs caractéristiques sont surtout exploitées pour en faire des DDS
pour des stratégies anti tumorales notamment. Ainsi les méthodes d’accrochage de molécules
biologiques sur les CNT sont diverses. Les composés biologiques peuvent en effet être
attachés à la membrane grâce à une interaction avec les groupes fonctionnels présents à la
surface, ou encore être chargés à l’intérieur, appelé respectivement l’enrobage ou le
remplissage des CNT [439] (Figure 14).
Figure
14 :
Méthodes
fonctionnalisation des CNT.
de
La fonctionnalisation des CNTs à simple feuillet
peut se faire via des interactions π non
covalentes (A), un enroulement non covalent (B)
ou encore des liaisons covalentes (C).
Source : James M Tour Group Rice
University,
http://www.jmtour.com/about/photos_gr
aphics/nanotubes/
Tout comme les autres nanomatériaux discutés ici, des techniques d’amélioration de
leur hydrophilie ou hydrophobie sont possibles pour améliorer l’efficacité de leur ciblage
spécifique. Ainsi, des réactions acido-basiques entre les CNT et des acides forts peuvent
conduire à la formation de groupements carboxyliques à leur surface, augmentant leur
dispersion dans les milieux aqueux. Une autre alternative réside dans l’accrochage covalent
ou non de matériaux hydrophiles, comme par exemple l’ajout de groupements PEG à la
surface des CNT, qui augmente ainsi leur hydrophilie, leur biocompatibilité et diminue leur
immunogénicité [440].
Bien que les caractéristiques présentées par les CNT, qu’ils soient SW ou MW,
représentent des atouts non négligeables pour une application biomédicale, les recherches
111
n’en sont encore qu’au stade préclinique et nécessitent de plus amples approfondissements
pour les envisager en clinique chez l’homme.
E. Les nanoparticules virales
1.
Virus et structure virale
Les nano-systèmes basés sur les virus ont émergé depuis peu en tant que transporteurs
d’agents thérapeutiques. Les virus sont des complexes biochimiques constitués de matériel
génomique et protéique. Ce sont des systèmes dynamiques qui s’auto-assemblent, formant des
structures hautement symétriques et polyvalentes. Cet auto-assemblage peut se faire selon
différentes tailles et formes offrant ainsi des caractéristiques structurales faisant des virus des
candidats prometteurs pour les nanomédecines [441]. De plus, ils sont particulièrement
robustes, peuvent être produits en grandes quantités et ceci à moindre coût et ont l’atout d’être
biocompatibles et biodégradables, ce qui n’est pas le cas des matériaux de synthèse.
Différents types de virus comme les adénovirus ou les bactériophages ont été exploités pour
l’application de thérapies anti-tumorales ciblées grâce à des modifications génétiques et
chimiques des virus [442]. De plus, différents types de composés peuvent être incorporés soit
dans l’ADN viral pour la thérapie génique par exemple, soit encapsulés au sein de
l’architecture virale pour le ciblage spécifique des tumeurs ou encore pour l’amélioration de
certaines techniques d’imagerie. Les nanoparticules peuvent être dotées de différentes
fonctions et ce grâce à différentes chimies conjuguées. Ainsi différents types de ligands tels
que des petites molécules, des protéines ou encore des nanoparticules additionnelles peuvent
être accrochées aux nanoparticules virales par ingénierie génétique, bio-conjugaison
chimique, minéralisation ou encore encapsulation [443]. Néanmoins, la conception de
nouveaux nano-systèmes doit considérer au préalable la compréhension des effets toxiques
associés.
2.
Les bactériophages
Les bactériophages, aussi appelés phages, sont des virus procaryotes qui affectent les
cellules hôtes et exploitent leur machinerie biosynthétique pour reproduire de nombreuses
quantités de copies de leur propre matériel. Le principal avantage des nanoparticules virales
réside dans la faible pathogénicité encourue, et donc des effets secondaires limités. Il existe
plusieurs types de phages composés de matériel génomique variable et avec des formes et
112
processus de réplication différents. Certains phages peuvent notamment être recouverts de
peptides pour améliorer leur échappement des endosomes ou leur localisation nucléaire [444].
Les phages les plus utilisés en nanomédecine et notamment pour la thérapie génique
sont les bactériophages filamenteux M13, présentant l’intérêt de n’avoir aucun tropisme pour
les cellules de mammifères contrairement à certains adénovirus. Cependant, l’efficacité de la
libération de leur contenu génique reste modeste, ce qui a conduit à essayer de combiner les
avantages des adénovirus avec ceux des bactériophages en un seul et même système [445]. Ce
système phage/adénovirus ainsi synthétisé démontre un meilleur ciblage tumoral comparé au
phage seul, et fut utilisé en combinaison de l’agent anti-cancéreux Ganciclovir®. Des études
précliniques menées sur les virus de Cowpea mosaic virus et Cowpea chlorotic mottle virus,
dérivés de plante, de même que sur les phages Qβ et M13 ont montré la biodistribution des
nanoparticules sans effets toxiques associés [446]. Cette alternative offre des perspectives
prometteuses pour l’amélioration des techniques d’imagerie, mais aussi pour l’application de
stratégies thérapeutiques de ciblage tumoral. Cependant, leur étude n’en n’est pour l’instant
qu’au stade préclinique, et une recherche plus poussée est nécessaire pour mieux comprendre
le devenir de ces nanoparticules virales et leur effet toxique à long terme.
3.
Les limites des nanoparticules virales
Lors du développement de nanoparticules virales, les questions de toxicité et
pathogénicité demeurent primordiales. De ce fait, les bactériophages et virus dérivés de
plantes possèdent un atout majeur comparé aux adénovirus, l’homme n’étant généralement
pas un hôte naturel de ce genre de virus.
De plus, un certain nombre de paramètres peuvent altérer l’efficacité des
nanoparticules tant par leur capacité de ciblage spécifique que par l’absence de toxicité
associée. En effet, un équilibre entre pénétration, accumulation et élimination de la circulation
est nécessaire, mais variable selon l’objectif associé à la construction de la nanoparticule.
Ainsi, une demi-vie plasmatique augmentée favorise l’accumulation dans le site ciblé, mais le
risque de toxicité ou augmentation de bruit de fond dans le domaine de l’imagerie sont plus
grands. De plus, les charges à la surface des nanoparticules influencent leurs propriétés de
nano-transporteurs, et des modifications chimiques ou génétiques peuvent être utilisées pour
modifier ces charges et ainsi modifier leurs propriétés pharmacocinétiques. Ainsi, de
nombreux processus chimiques de modification des charges nanoparticulaires passent par une
113
modification des résidus de lysines à la surface des phages, altérant notamment leur demi-vie
plasmatique [447].
F. Les nanoparticules inorganiques
1.
Composition et applications cliniques
Un autre type de nanoparticules largement étudié correspond aux nanoparticules
inorganiques, aussi appelées nanoparticules métalliques. Les coques nanométalliques formant
le pourtour de la nanoparticule sont composées de métaux inertes tels que le titane, l’oxyde de
fer ou l’or. Ces nanoparticules montrent des propriétés intéressantes pour un relargage
contrôlé de composés thérapeutiques [448]. Cependant, ils suscitent aussi l’intérêt en
imagerie, et notamment en tant qu’agent de contraste dans les applications cliniques. Les
nanoparticules d’oxyde de fer et d’oxyde de fer super-paramagnétiques (SPIO) ont été
longuement exploitées comme agents de contraste, augmentant en effet le contraste négatif et
permettant l’obtention d’images plus définies des zones d’intérêt en imagerie IRM. Ces
systèmes ont donc été utilisés pour l’amélioration du contraste en IRM, mais également pour
le relargage ciblé de composés thérapeutiques [449]. Les SPIO peuvent libérer des composés
utilisés dans les thérapies anti-tumorales tels la doxorubicine ou le méthotrexate [450-451].
2.
Les nanoparticules d’or
Parmi les diverses nanoparticules dites métalliques, les plus connues et plus exploitées
sont les particules d’or, qui ont suscité l’intérêt tant par leur application diagnostique, que par
leur intérêt thérapeutique. En effet, différents sous types de nanoparticules d’or ont pu être
recensés selon leurs tailles, formes et propriétés physiques : les nanosphères, « nanocoques »
ou encore les « nano-cages ». Leur caractère unique en termes de taille, propriétés physiques
et chimiques les ont caractérisées comme des nanoparticules particulièrement stables,
adaptées à la libération de composés thérapeutiques [452]. Les nanoparticules de forme
colloïdale ont notamment un grand potentiel pour outrepasser les limites de la libération de
composés thérapeutiques des autres DDS, grâce à leur biocompatibilité, leur faible toxicité et
leur petite taille [453]. La surface des nanoparticules d’or représente une composante
importante dans le relargage de composés thérapeutiques. En effet, il a été montré que leurs
propriétés de surface régule la prise en charge des composés par les cellules tumorales, leur
relargage, ainsi que leur distribution intracellulaire [453]. Ainsi des modifications de ces
propriétés de surface peuvent contrôler l’accumulation des composés au niveau du site
114
tumoral. Certaines études ont d’ailleurs montré l’efficacité des nanoparticules d’or dans
l’amélioration des effets thérapeutiques des agents chimiothérapeutiques appartenant à la
famille des platines (cisplatine, carboplatine ou encore oxaplatine) [454].
De par leurs propriétés physico-chimiques diverses, les nanoparticules inorganiques
représentent de bons agents pour l’application de la théranostique, les nanoparticules d’or
notamment, ayant montré des propriétés intéréssantes pour la détection de cancers [455].
3.
Les limites des nanoparticules métalliques
Chaque nanoparticule métallique possède des propriétés physico-chimiques uniques,
et en dépit de leurs puissants atouts comme par exemple leur inertie ou encore
biocompatibilité, une importante part de ces nano-systèmes est retenue dans les tissus après
administration. L’accumulation et la rétention de particules métalliques dans les tissus
aspécifiques peuvent conduire à une toxicité notoire, ce qui a entraîné la plupart des
recherches portant sur les nanoparticules inorganiques à se focaliser sur leur utilisation en
imagerie médicale dans un but diagnostique plutôt que thérapeutique.
Nous avons présenté ici quelques systèmes, mais il existe d’autres DDS et la recherche
dans le domaine des nanomédecines est de plus en plus poussée pour développer des
structures optimales pour leur application médicale. Le but ultime de relargage des composés
spécifiquement dans la tumeur peut se faire selon deux modalités distinctes : un ciblage actif
ou un ciblage passif.
II. Le ciblage passif : « passive targetting »
Le principe essentiel sur lequel se base le ciblage passif appliqué à des thérapies
antitumorales est l’effet EPR, décrit depuis plus de 30 ans. Le principal avantage de ce ciblage
passif, sans nécessité d’avoir de ligand-recepteur, réside dans le plus large spectre de tumeurs
susceptibles de répondre positivement à ce type de stratégie thérapeutique. En effet, les
épitopes spécifiques ciblés lors de stratégies de ciblage actif sont très variables selon le stade
de développement de la maladie, et souvent sujet à la variabilité inter-individuelle. Ainsi, le
ciblage passif offre de plus grandes perspectives quant au bénéfice thérapeutique pour le
patient, mais aussi pour la découverte de nouvelles méthodes de diagnostic.
115
A. Les fondements de l’effet EPR
1.
Historique
L’intérêt portant sur la vascularisation tumorale date d’il y a plus d’un siècle avec les
travaux pionniers de E. Goldmann en 1907. Il décrit ainsi que les vaisseaux sanguins de
l’organe dans lequel la tumeur se développe sont perturbés par une croissance chaotique, avec
une dilatation et une torsion des vaisseaux atteints [456]. L’idée d’une accumulation
préférentielle des macromolécules au niveau du site tumoral et la notion d’effet EPR
n’intervient que plus tard, il y a de cela plus de 30 ans, avec les travaux de Matsumura et
Maeda [457]. En effet, les preuves d’une accumulation et d’une rétention de macromolécules
thérapeutiques dans la tumeur furent apportées d’après leur étude sur des copolymères appelés
SMANCS (styrene and maleic acid conjugated to the antitumor protein neocarzinostatin
(NCS)). En étudiant la biodistribution des SMANCS ainsi que d’autres protéines de masse
supérieure à 30 kDa (albumines murine et bovine, IgGs), ils démontrèrent leur distribution
préférentielle au niveau de la tumeur, accompagnée de leur rétention prolongée à cet endroit.
En effet, l’analyse suite à l’injection de Bleu d’Evans couplé à de l’albumine dans un modèle
de rongeurs montre une concentration du colorant spécifiquement dans la tumeur. De plus, ils
montrèrent que l’accumulation des macromolécules dans la tumeur était inversement
proportionnelle à leur taux d’élimination.
2.
La perméabilité accrue
Les travaux de Folkman sont parmi les premiers à décrire la physiologie, anatomie et
mise en place du réseau vasculaire tumoral [458-459]. Il est admis depuis lors, que suite à la
croissance tumorale, les tumeurs dépassant une certaine taille (2-3 mm) sécrètent des facteurs
pro-angiogéniques, telle l’angiogénine, de façon à promouvoir une néo-angiogenèse et
développer ce qui sera qualifié d’hypervascularisation tumorale [460-461]. En effet, le réseau
vasculaire qualifiée de « normal » présent initialement dans l’environnement tumoral se
retrouve insuffisant pour les apports nutritionnels et oxygéniques nécessaires face au
développement et à la croissance de la masse tumorale. Les cellules vont alors sécréter des
facteurs de croissance qui vont stimuler les capillaires environnants pour la création de
nouveaux vaisseaux [462]. Un des facteurs clés décrits dans les années 1980, sécrété
spécifiquement par les cellules tumorales est le VPF (vascular permeability factor) [463-464],
de nos jours connu sous le nom du facteur pro-angiogénique VEGF [458-459,465], stimulant
la perméabilité des vaisseaux tant tumoraux que fonctionnels. Des études ultrastructurales ont
116
permis de mieux comprendre comment les cellules endothéliales répondaient au VEGF. Les
cellules tumorales sécrètent généralement plusieurs isoformes du VEGF [466], qui se lient
aux récepteurs VEGFR-1/Flt, VEGFR-2/Flk ou encore à certaines neuropillines. Chaque
isoforme induit une augmentation de la perméabilité vasculaire, mais étant donné leur
divergence dans leurs interactions avec les protéines de la matrice extracellulaire, cela conduit
à des aberrations structurales dans l’architecture des vaisseaux néo-synthétisés [467]. Cette
néo-angiogenèse est défectueuse, les vaisseaux rapidement synthétisés étant en effet
irréguliers et présentant une discontinuité dans l’épithélium. Ceci conduit à une porosité
accrue du fait de jonctions interstitielles plus relâchées et d’un défaut de membrane basale,
normalement présente dans le système vasculaire fonctionnel [468-469]. Selon le type de
tumeur, sa localisation, ainsi que son environnement, les fenestrations ainsi créées dans les
parois des vaisseaux sanguins peuvent avoir une taille variable : 200 à 2000 nm [470]. Des
travaux en microscopie électronique comparant l’anatomie de vaisseaux sains et tumoraux ont
montré une nette différence anatomo-morphologique [471-473]. Ainsi, lorsque des composés
de taille macromoléculaire rejoignent cette circulation anormale et discontinue, les
fenestrations et jonctions interstitielles relâchées laissent place à une extravasation facile vers
le site tumoral. De plus, alors que les fenestrations offrent des échappatoires aux colloïdes
pour l’extravasation, les discontinuités et les irrégularités des vaisseaux néoformés affectent la
circulation sanguine et la pression hydrostatique des vaisseaux [469,474]. Ainsi une pression
diminuée pourrait être associée à une diminution des forces convectives responsables de
l’extravasation des nanomatériaux de la circulation sanguine. Ceci constitue donc la
composante perméabilité accrue de l’effet EPR (Figure 15).
117
Figure 15 : Ciblage de nanoparticules dans le tissu tumoral par l’effet EPR.
Dans le tissu sain, l’endothélium est caractérisé par des jonctions serrées qui empêchent le passage de
macromolécules. A l’inverse, dans le tissu tumoral, les jonctions interstitielles entre les cellules des vaisseaux
sont très relâchées ce qui permet aux nanoparticules de rejoindre la matrice intracellulaire par l’effet EPR. De
plus, le VEGF secrété par les cellules tumorales, les cellules du stroma et les macrophages augmentent la
perméabilité et stimulent l’angiogenèse et la migration des cellules endothéliales vers la tumeur.
Source: Taurin et al, Anticancer nanomedecine and tumor vascular permeability: Where is
the missing link?, 2012, [475].
3.
La rétention accrue
Parallèlement à cette perméabilité dite accrue dans le développement du réseau
vasculaire tumoral, le drainage lymphatique est déficient. Dans une situation physiologique
saine, le fluide extracellulaire est constamment drainé grâce aux vaisseaux lymphatiques, avec
une vélocité d’environ 0,1 à 2 µM/s [476]. Ceci permet un drainage et un renouvellement
continu du liquide interstitiel et le recyclage des solutés extravasés à la circulation. Les
travaux pionniers de Maeda et Matsumura ont rapporté un drainage lymphatique ralenti dans
les tumeurs comparé aux tissus sains [457], avec une élimination des macromolécules
diminuée dans les tissus tumoraux. Ce système lymphatique déficient fut observé par ces
mêmes investigateurs, en étudiant le Lipidol®, un agent de contraste lipidique utilisé en
radiographie. Ils rapportent ainsi un développement très pauvre du réseau lymphatique dans
les tissus tumoraux [477]. Dans les tumeurs, cette fonction de drainage lymphatique est donc
déficiente, conduisant à une récupération minimale du liquide interstitiel [478]. Comme
mentionné précédemment, les forces convectives, qui font partie des facteurs régulant cette
circulation lymphatique, sont perturbées, empêchant ainsi les colloïdes extravasés de partir
118
dans la circulation lymphatique. Alors que des molécules plus petites peuvent diffuser
librement et donc être drainées et retourner facilement dans la circulation pour leur recyclage
[479-481], les plus grosses molécules sont handicapées par leur plus important rayon
hydrodynamique. Par conséquent, les macromolécules ayant atteint l’espace périvasculaire
tumoral ne rejoignent pas le réseau lymphatique pour leur élimination et sont donc retenues au
niveau de la tumeur. Ceci constitue donc la composante « rétention accrue » de l’effet EPR.
B. La taille et la charge des nanoparticules : des facteurs clés de
l’effet EPR
Les travaux pionniers de Maeda et Matsumura sur la description de l’effet EPR
suscitèrent beaucoup d’intérêt et d’excitation quant à de nouvelles perspectives prometteuses
pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ainsi de nombreux types tumoraux furent étudiés,
ce qui conduisit à une meilleure appréhension et compréhension de cet effet [469,482]. Ainsi
il est maintenant reconnu que le drainage lymphatique s’opérant dans un environnement
tumoral n’est pas homogène au sein de la masse tumorale. Les vaisseaux se trouvant au cœur
de la masse sont confrontés à un stress mécanique plus important, ce qui se répercute sur une
perte de fonction biologique plus importante au cœur de la tumeur en comparaison des
vaisseaux en périphérie moins sensibles à cette pression mécanique [478]. Il y a maintenant
plus d’une dizaine d’années, Stacker et ses collaborateurs ont soumis l’idée selon laquelle le
processus métastatique pourrait être lié à une activité lymphatique résiduelle dans la tumeur
[483]. Ainsi, la distribution de nanoparticules dans une tumeur est contrôlée et régulée par
différents facteurs : l’extravasation des colloïdes depuis la circulation sanguine, leur diffusion
dans le tissu extravasculaire, leur interaction avec des cibles intra ou extracellulaires dans
l’environnement tumoral et leur faible élimination par le système lymphatique. Les
phénomènes d’extravasation et de diffusion dans le tissu tumoral résultent principalement des
forces diffusives et convectives et peuvent être influencés par la biologie de la tumeur ainsi
que par les caractéristiques des composants qui diffusent.
1.
L’extravasation
L’extravasation de colloïdes depuis la circulation jusqu’au site tumoral dépend de leur
concentration dans la circulation sanguine, de la perméabilité des vaisseaux, ainsi que de la
nature de l’environnement extravasculaire. Sans rentrer dans des détails mathématiques, ce
phénomène peut être décrit de nombreuses façons, et certains l’ont décrit par une équation
mathématique générale [469]. Cependant, son application expérimentale reste périlleuse du
119
fait du grand nombre de variables impliquées, mais elle peut aider à la représentation et
compréhension des conséquences de chaque facteur biologique impliqué dans ce phénomène
d’extravasation. Bien que l’extravasation soit un phénomène connu dans le domaine de
l’oncologie et des nanotechnologies, un certain nombre de phénomènes impliqués restent
obscurs. Notamment, la distinction entre le matériel extravasé au niveau des vaisseaux et le
matériel récupéré par les cellules endothéliales dans la néovascularisation est difficile. Ainsi,
alors que certains décrivent une augmentation des interactions avec les cellules endothéliales
par la présence de charges cationiques, induisant de ce fait une augmentation de la pression
intravasculaire [484-485], d’autres considèrent ces interactions comme étant le produit d’une
absorption et d’une endocytose par l’épithélium [486-487]. D’autre part, les caractéristiques
physicochimiques des colloïdes affectent leur extravasation en influençant notamment leur
diffusion, leur perméabilité à travers les vaisseaux, et leur interaction avec les composants de
la matrice extracellulaire (ECM). Bien que l’extravasation soit un phénomène clé admis dans
le ciblage passif spécifique par l’effet EPR, de nombreux aspects quant à sa régulation
notamment sont à approfondir de façon à avoir une compréhension plus poussée de ce
phénomène.
2.
L’environnement tumoral extravasculaire
L’environnement tumoral est un milieu complexe où sont mis à mal les principes
anatomiques et physiologiques des tissus sains. Comme discuté précédemment, la croissance
tumorale et la sécrétion de facteurs pro-angiogéniques contribuent à la création d’un réseau
vasculaire hautement désorganisé, et à un microenvironnement extravasculaire engorgé. Cet
environnement est principalement constitué de fibres de collagène, de glycosaminoglycanes
(GAG), avec une distribution non homogène des solutés, protéines et débris cellulaires. Une
fois les nanoparticules extravasées, c’est la nature même de l’ECM qui va contrôler les
mouvements diffusifs et convectifs des nanoparticules. Ainsi les GAG, tels que l’acide
hyaluronique ou l’héparane sulfate, liés de façon covalente à des protéines (collagène,
laminine), affectent la viscosité et la fluidité de l’environnement, agissant ainsi sur la mobilité
des nanoparticules au sein de cette matrice [488]. De la même façon, la désorganisation du
réseau de collagène joue sur la diffusion des nanoparticules et leur mobilité à travers la
matrice [489].
Compte tenu des inconvénients du ciblage passif et de son application limitée dans des
stratégies anti-tumorales spécifiques, de nombreuses études se sont focalisées sur le
120
développement d’un autre type de ciblage pour améliorer la spécificité et l’activité biologique
des composés thérapeutiques : le ciblage actif.
III. Le ciblage actif : « active targeting »
Le ciblage actif, aussi appelé « active targeting », fait appel à l’utilisation de ligands
pour atteindre spécifiquement les cellules cibles. Ces ligands de ciblage sont attachés aux
composés thérapeutiques ou aux nano-systèmes pour aller se fixer spécifiquement sur des
récepteurs exprimés sur les cellules tumorales cibles. Pour un ciblage actif idéal et une
efficacité thérapeutique optimale, il faut que les systèmes ligands-nanoparticules atteignent
l’environnement du site à cibler. La plupart du temps, la stratégie de ciblage actif passe donc
par une accumulation des DDS au niveau du site cible par effet EPR, puis le ciblage actif peut
se faire lorsque le ligand se fixe sur son récepteur. L’approche de ciblage actif doit donc
combiner une augmentation des interactions cellules-nanoparticules avec une internalisation
des composés thérapeutiques, tout en évitant la perturbation de la biodistribution globale des
nano-systèmes. L’efficacité du système utilisé dépend de nombreux facteurs tels que
l’architecture des nanoparticules, le type de ligands disponibles ainsi que leur chimie
d’accrochage, ce qui rend la conception de nanoparticules à ciblage actif encore plus
complexe. De plus, les capacités de ciblage des nanoparticules dans ce type de stratégie se
voient également perturbées selon les voies d’administration ou encore la fixation aspécifique
de certaines protéines lors du transit des nanoparticules. Enfin, les propriétés physicochimiques de densité du ligand, la taille des nanoparticules, ou encore le choix du ligand sont
des facteurs qui influencent l’efficacité de ciblage actif des nano-systèmes considérés.
A. Les fondements du ciblage actif
1.
Le principe
Le principe de base sur lequel s’appuie le ciblage actif est la reconnaissance spécifique
d’un ligand par des cellules cibles. Les ligands les plus représentatifs sont les anticorps, les
protéines, les peptides, les acides nucléiques, les sucres ou encore les petites molécules telles
que les vitamines [490]. Les molécules ciblées sont le plus souvent des protéines, sucres ou
encore lipides présents à la surface des cellules ou organes cibles [491]. Les interactions entre
les ligands présents à la surface des nanoparticules fonctionnalisées et leurs antigènes cibles
sont améliorées par la polyvalence dans l’architecture des nanoparticules : la multiplicité des
copies de ligand à la surface des nanoparticules augmente l’affinité de ces dernières pour leur
121
cible [492]. L’évaluation de l’efficacité d’un système de ciblage actif est déterminée par deux
facteurs importants : la spécificité de ciblage ainsi que les capacités de délivrance de
composés au niveau du site ciblé. La spécificité de ciblage est contrôlée par le ligand et les
nanoparticules, par la biodistribution du système ligand-nanoparticules et la manière dont ce
système interagit avec les tissus ou cellules non ciblées. Les capacités de relargage sont
directement reliées à l’architecture, structure et nature des nanoparticules [406]. A l’heure
actuelle, les systèmes de ciblage actif sont davantage envisagés comme des stratégies
complémentaires prometteuses pour l’amélioration des stratégies basées sur l’effet EPR, afin
d’augmenter le bénéfice thérapeutique de ces nanomédecines anti-tumorales.
2.
Le ciblage actif : un challenge thérapeutique ?
Un des gros challenges du ciblage actif réside dans la nécessité des nanoparticules de
se trouver dans les proches alentours du site ciblé pour que l’interaction ligand-récepteur soit
possible dans les meilleures conditions [493]. Comme précédemment discuté, l’élimination
des nanoparticules de la circulation sanguine affecte l’efficacité des nano-systèmes
considérés. Ce paramètre était déjà important dans l’application d’une stratégie de ciblage
passif, mais il l’est encore plus pour le ciblage actif. En effet, du fait de cette nécessité de se
trouver dans le proche environnement de son site d’action, les nanoparticules doivent pouvoir
être présentes assez longtemps dans la circulation, le temps de rejoindre le site ciblé.
L’augmentation de l’affinité des nanoparticules pour les cellules cibles par ces ligands ne
suffit pas toujours à contrebalancer ce processus d’élimination physiologique. La demi-vie
plasmatique des nanoparticules est donc un paramètre clé dans les stratégies de ciblage actif
qui doit être optimisé pour atteindre un ciblage optimal.
De récentes études menées in vitro et in vivo visaient à améliorer l’internalisation par
les cellules cibles des nanoparticules grâce à la construction d’un système nanoparticulaire
unique portant plusieurs ligands [494-495]. Bien que prometteuse, cette stratégie nécessite
une meilleure compréhension afin de prouver son réel bénéfice pour une application antitumorale clinique.
B. Les stratégies de conjugaison/accrochage des ligands
Puisque l’affinité des nanoparticules est directement liée à la densité des ligands
qu’elles contiennent, les approches utilisées pour accrocher les ligands aux nanoparticules
apparaissent comme un facteur primordial dans la synthèse de DDS à ciblage actif. Le plus
122
souvent, les ligands sont accrochés aux nanoparticules par des liaisons covalentes, mais ils
peuvent aussi être adsorbés à leur surface grâce à des complexes d’affinité [496]. Ainsi, les
biomatériaux utilisables étant organiques ou inorganiques avec des caractéristiques physicochimiques qui leur sont propres, le type de nanoparticule utilisé va aussi déterminer la
difficulté dans le processus d’accrochage des ligands au nano-systèmes. Par exemple, la
fonctionnalisation de composés à la surface de nanoparticules d’or peut se faire par réaction
directe avec des groupements thiols. A l’inverse, certains composés inorganiques nécessitent
l’introduction de groupements fonctionnels tels que NH2 ou OH pour augmenter leur
réactivité. Dans tous les cas, la stabilité de la construction du système ligand-nanoparticule
dicte l’affinité du ligand et sa capacité de rétention à leur surface.
1.
La pré et post-conjugaison
La conjugaison du ligand à la nanoparticule peut se faire avant ou après l’assemblage
de la formulation nanoparticulaire, ce qui est nommé respectivement pré- et post-conjugaison.
a) La pré-conjugaison
La pré-conjugaison est assez directe et peut se faire avec des petites molécules,
peptides ou aptamères [497-498]. C’est une méthode moins adaptée aux protéines natives
ayant des structures secondaires complexes, exposant souvent les composants à des solvants
organiques. Cette pré-conjugaison a l’avantage d’être brève et d’éviter ainsi des réactions
secondaires, et permet un meilleur contrôle des propriétés physico-chimiques des
nanoparticules. De plus, elle offre une certaine liberté dans le choix du ligand, et facilite les
étapes de purification après formulation des nanoparticules.
b) La post-conjugaison
La méthode de post-conjugaison consiste à accrocher un ligand à une nanoparticule
déjà formulée. Tout type de ligand peut répondre à cette méthode : anticorps, protéines,
peptides, petites molécules, et est souhaitable lorsque la stabilité du système peur représenter
un problème dans les milieux organiques ou encore lorsque la présence du ligand serait un
frein à la bonne formulation des nanoparticules. La méthode choisie dépend donc du ligand
souhaité et des biomatériaux utilisés.
123
2.
Les stratégies synthétiques de conjugaison
a) La liaison peptidique
Il existe plusieurs méthodes pour synthétiser les conjugaisons ligands-nanoparticules.
La formation d’une liaison peptidique entre le ligand et les nanoparticules se fait le plus
souvent en activant des groupements carboxyliques qui réagiront avec des groupements
nucléophiles, tels que l’amine, sur le ligand. Bien que cette méthode soit directe et réalisable à
la fois en milieu aqueux et organique, la sélectivité de la conjugaison et l’orientation finale du
ligand dépendent du nombre de fonctions nucléophiles présentes sur le ligand.
Une autre méthode vise à former une liaison thioether entre le ligand et les
nanoparticules en couplant un groupement maléimide des nanoparticules ou polymères avec
un groupement thiol présent à la surface du ligand, dans les cystéines de certaines protéines
du ligand par exemple.
b) La chimie-click
Plus récemment, une méthode très sélective et à grand rendement de bio-conjugaison,
appelée « chimie-click », a été développée [499]. Elle consiste en une unique étape
réactionnelle impliquant des hétéroatomes avec ou sans catalyseurs. Ce concept de « click »
fait justement référence à l’obtention d’un produit grâce à une réaction unique suite à des
transformations chimiques spécifiques versatiles de haute énergie. Par exemple, les groupes
alcynes présents sur des peptides ou des petites molécules peuvent former un lien avec des
groupements azides à la surface des nanoparticules sans générer de réactions secondaires. La
chimie-click est un principe de réaction plutôt qu’une réaction à part entière, permettant
d’obtenir des molécules complexes de manière simple et efficace. L’une des principales
réactions de chimie-click, d’ailleurs considérée aujourd’hui comme l’archétype de la chimieclick, est la cycloaddition-1,3 dipolaire de Huisgen, impliquant l’addition de groupements
azides et alcynes. L’utilisation du cuivre comme catalyseur, les effets de l’eau dans cette
réaction, la stabilité et la facilité d’accrochage de ces groupements, ainsi que la rapidité qu’ils
ont à se relier, sont parmi les atouts majeurs de ce processus de connexion unique qui a
redéfini la notion de réaction « parfaite » [500]. Cependant, le cuivre utilisé comme catalyseur
présente une certaine toxicité, ce qui nécessite de s’en débarrasser une fois la réaction
terminée, avec une purification laborieuse. Ainsi, des réactions de chimie-click sans
124
catalyseur de cuivre ont été développées, avec des cycloadditions de cyclooctyne, ou triazol
amine.
3.
Les approches non covalentes
Les interactions streptavidine-biotine peuvent être utiles pour contrebalancer les
limitations apportées par les bio-conjugaisons synthétiques vues précédemment [496]. Les
nanoparticules recouvertes d’avidines ont en effet une grande affinité avec des ligands dits
« biotinylés ». En effet, la biotine est souvent utilisée pour sa petite taille et le fait qu’elle
n’altère pas les propriétés et fonctions des ligands. Cette méthode est plus versatile, et a
surtout été utilisée pour des preuves de concepts appliqués à des anticorps, peptides ou
aptamères. En effet, le principal inconvénient de cette méthode est qu’elle peut causer une
certaine immunogénicité due à la présence de protéines exogènes à la surface, faisant de cette
méthode une stratégie peut compatible avec une utilisation chez l’homme. De plus, l’avidine
pouvant se lier à la biotine de façon polyvalente, des cross-linkings entre des éléments
constituants des nanoparticules ne sont pas à négliger.
C. L’influence de l’architecture d’une nanoparticule à ciblage actif
Le principal problème du ciblage actif réside dans le fait que la conjugaison d’un
ligand avec des nanoparticules peut potentiellement changer les propriétés et fonctions des
composés thérapeutiques, mais aussi des ligands et nanomatériaux impliqués [497]. Pour
mieux comprendre les propriétés de nanoparticules à ciblage actif, il est donc nécessaire de
déterminer comment les propriétés physico-chimiques des nanoparticules peuvent affecter les
interactions avec leurs cibles.
1.
La densité des ligands
La densité des composés thérapeutiques d’intérêt à la surface des nanoparticules agit
directement sur leur affinité pour leur substrat. D’une manière thermodynamique, la liaison du
ligand à son substrat a comme un effet boule de neige et facilite les liaisons ultérieures des
autres ligands. Les nombreuses interactions biologiques des nanoparticules avec les
membranes cellulaires obligent une agrégation des récepteurs au niveau de la bicouche. Ceci
permet l’internalisation des nanoparticules par invagination de la membrane. Ces événements
thermodynamiques et biologiques empêchent le détachement des nanoparticules des
membranes entraînant donc une augmentation de l’avidité. Ainsi, de nombreuses études ont
montré que l’augmentation de la densité des ligands résultait le plus souvent en une
125
amélioration et une augmentation de l’internalisation cellulaire [501-502]. Cependant, la
relation entre l’augmentation de la densité de ligands et l’amélioration de l’internalisation
cellulaire des composés thérapeutiques n’est pas toujours linéaire et peut dans certains cas
avoir des effets délétères. L’effet « coopératif » des ligands peut saturer le système et une
augmentation trop poussée de la densité des ligands peut conduire à des effets négatifs quant
aux propriétés de reconnaissance ligand-substrat des cellules [502-503]. Ce phénomène a été
observé in vivo, où l’augmentation de la densité des ligands était telle qu’elle modifie la
structure des nanoparticules, entraînant une modification de leur circulation dans le sang et de
leur biodistribution. Il est donc nécessaire d’adapter la densité des ligands au modèle d’étude
et aux biomatériaux utilisés.
2.
Taille et forme des nanoparticules
La taille et la forme des nanomatériaux sont deux éléments à prendre en considération
dans les étapes précoces de conception de nanoparticules à ciblage actif. La taille doit toujours
être considérée comme élément important par rapport à l’accumulation des nanoparticules au
sein de la tumeur, mais aussi par rapport à l’internalisation cellulaire. Cependant, la taille
n’est pas la seule caractéristique impliquée, puisque les interactions cellules-nanoparticules
sont étroitement liées à la nature et aux propriétés physico-chimiques de chaque
nanomatériaux. De plus, outre l’influence de la taille dans l’accumulation tumorale des
nanoparticules et leur internalisation cellulaire, la forme des nanomatériaux semble influencer
les cinétiques et voies d’internalisation des nanoparticules en modulant les interactions entre
les nanomatériaux et la surface cellulaire [504].
3.
Charge électronique et l’ hydrophobicité
La charge de la nanoparticule nue peut influencer le rendement de conjugaison entre
cette dernière et le ligand ainsi que sa répartition spatiale [501]. Des forces répulsives ou
attractives entre la surface de la nanoparticule et le ligand peuvent en effet entraver un bon
rendement de conjugaison. La charge nette du système nanoparticule-ligand a aussi son
importance puisque qu’elle détermine l’efficacité des nanoparticules à ciblage actif. Les
nanoparticules chargées positivement interagissent avec les membranes cellulaires chargées
négativement de manière non spécifique. De plus, les ligands étant le plus souvent des
molécules chargées, la charge nette du système nanoparticule-ligand est déterminée par la
combinaison entre la densité des ligands, la nature des nanomatériaux utilisés, ainsi que la
stratégie de formulation des nanoparticules.
126
Outre la charge, le degré d’hydrophobicité a aussi son importance, notamment en
termes d’architecture spatiale du système. L’hydrophobicité nette du nanosystème peut en
effet stimuler des interactions non spécifiques, ou modifier la répartition et la disponibilité des
composés délivrés aux cellules cibles. Bien que des études menées in vitro et in vivo reflètent
l’importance de la charge des systèmes nanoparticule-ligand dans leur efficacité
thérapeutique, les paramètres exacts pour obtenir une stratégie de ciblage anti-tumorale idéale
restent confus.
D. Les ligands de ciblage
Le choix du ligand est un élément déterminant pour l’efficacité d’une stratégie de
ciblage actif. Les anticorps représentent le premier type de ligands utilisé pour du ciblage
actif, de par leur haut degré de spécificité mais aussi leur grande disponibilité. Depuis, il a été
décrit un certains nombre d’autres types de ligands possibles tels que des protéines, des
peptides, des acides nucléiques ou encore de petites molécules, chacun présentant des atouts
et inconvénients pour une stratégie de ciblage actif [505].
1.
Les anticorps et leurs fragments
a) Structure
Un anticorps est une grosse glycoprotéine en forme de Y qui peut reconnaître des
éléments spécifiques de différentes cibles qu’on appelle les antigènes. La région qui se trouve
au sommet de l’anticorps, appelée la région hypervariable ou aussi fragment Fab, est une
région fonctionnelle dimérique qui peut adopter un très large panel de structures différentes,
offrant divers sites de liaison possibles et donc la reconnaissance spécifique d’une grande
variété d’antigènes. Le fragment constituant la base de l’anticorps appelé fragment Fc est
quant à lui beaucoup moins variable et responsable de la reconnaissance par le MPS et le
système immunitaire.
b) Anticorps et ciblage actif
Depuis les années 1980, les anticorps sont les ligands de référence pour le ciblage actif
appliqué en clinique, et plus de 30 anticorps différents ont été validés dont le rituximab,
trastuzumab, cetuximab et bevacizumab, ciblant le VEGF. La combinaison des anticorps à la
surface de nanoparticules vise à combiner leur spécificité et affinité avec les propriétés
uniques des nanoparticules. Cependant, bien que ces systèmes démontrent une nette
127
amélioration de l’internalisation cellulaire in vitro, les nanoparticules à ligands d’anticorps
posent un certain nombre de limites et font face à certains challenges qui limitent grandement
leur pertinence in vivo.
c)
Les limites des anticorps
Les anticorps présentent trois principaux inconvénients limitant leur utilisation
clinique [506-507]. Tout d’abord, les anticorps sont de grosses protéines avec un poids
moléculaire et un rayon hydrodynamique importants. Cette importante taille limite leur
capacité de conjugaison à la surface des nanoparticules et augmente de façon notoire le
diamètre total du nano-système. Pour parer à ce problème, de plus petits fragments
d’anticorps ont été proposés mais les monomères (Fab) et dimères des fragments d’anticorps
(F(ab)’2) restent des éléments volumineux.
Le rôle physiologique des anticorps est de débarrasser la circulation sanguine de
potentiels antigènes en facilitant leur reconnaissance par les cellules du système immunitaire
et du MPS. La conjugaison d’anticorps sur des nanoparticules a donc pour conséquence leur
rapide élimination de la circulation sanguine. Ces nanoparticules ont donc un temps de
circulation très réduit [507-508]. L’utilisation des fragments Fab uniquement, en retirant les
fragments Fc, résulte en une amélioration du temps de circulation des nanoparticules, mais
compromet toujours la demi-vie plasmatique comparé aux nanoparticules nues [509].
De plus, les nanoparticules couplées à des anticorps sont des structures très sensibles à
leur environnement (chaleur, concentration en sels et enzymes), et très peu résistantes à des
solvants organiques. Cela pose donc un problème technique lors de la synthèse de ces
systèmes, et notamment d’efficacité de préparation, de restriction de stabilité et de structure.
2.
Les protéines
a) Les protéines naturelles
La structure tridimensionnelle des protéines permet la formation de site de liaison et
de ce fait la reconnaissance spécifique de certains substrats [510]. Des protéines autres que les
anticorps peuvent donc aussi être considérées comme de potentiels ligands pour des stratégies
de ciblage actif. Il existe de nombreuses protéines naturelles qui ont des cibles endogènes
pouvant être exploitées pour des applications thérapeutiques. Parmi elles, l’une des plus
abondantes et étudiées en tant que ligand est la transferrine (Tf), une grosse glycoprotéine de
128
80 kDa [511]. Dans des conditions physiologiques, la Tf est responsable du transport et de la
régulation de la concentration en fer dans les environnements biologiques. A la surface des
cellules, elle se lie au récepteur à la transferrine (Tf-R) avec une haute affinité pour son
internalisation. L’intérêt de l’utilisation de cette protéine dans des applications thérapeutiques
anti-tumorales réside dans le fait que les Tf-R sont surexprimés à la surface des cellules
cancéreuses. Cette stratégie est actuellement en essai cliniques pour différents types de
nanoparticules [512].
b) Les protéines de synthèse
Outre les protéines naturelles, il est possible d’exploiter des protéines de synthèse
comme ligands de ciblage. Ainsi, les « Affibodies » ou encore les protéines répétées Ankyrine
(ARP : Ankyrine Repeat Protein) ont été développés pour envelopper les nanoparticules dans
un but de ciblage actif [513]. Cette méthode a l’avantage d’utiliser des ligands artificiels de
haute affinité qui ne rentrent pas en compétition avec des protéines endogènes naturelles
hautement abondantes dans l’organisme.
Les aptamères de peptides sont aussi des protéines de fusion qui peuvent être utilisés
comme ligands, où de petits domaines peptidiques variables (10 à 12 acides aminés (AA))
sont confinés dans un scaffold protéique constant [514]. Cette structure unique avec une
boucle de 10 à 12 AA offre des affinités de liaison semblables à celles retrouvées dans les
constructions à base d’anticorps. Le scaffold protéique, sorte d’échafaudage, peut être
n’importe quelle protéine soluble compacte, comme par exemple la thioredoxine-A
bactérienne. Tout comme les anticorps, les protéines utilisées comme ligands présentent les
mêmes inconvénients que les anticorps en relation avec leur taille, leur durée plasmatique et
leurs problèmes de synthèse.
3.
Les peptides
Les peptides sont de petites séquences d’AA linéaires ou cycliques. Les peptides se
différencient généralement des protéines par leur taille inférieure à 50 AA. Ces plus petites
séquences entraînent un plus petit poids moléculaire et des structures tridimensionnelles plus
simples, ce qui permet d’améliorer la stabilité et résistance aux conditions environnementales,
tout en permettant des méthodes de synthèse et de conjugaison plus simples. Ainsi leur petite
taille permet l’application des méthodes de conjugaison discutées précédemment de préformulation pour la construction des systèmes de nanoparticules. Ces avantages combinés aux
129
améliorations de techniques de screening d’isolation des combinaisons ligand-substrat ont
contribué à l’augmentation de l’utilisation de peptides en tant que ligands pour du ciblage
actif à visée thérapeutique.
La famille des peptides RGD (Arginine-Glycine-Aspartate) est parmi la plus
largement étudiée. Ces peptides se lient spécifiquement et avec une haute affinité aux
récepteurs d’intégrines αvβ3 [497]. De ce fait, de nombreux peptides contenant des séquences
RGD ont été synthétisés pour cibler des cellules endothéliales mais aussi des cellules
cancéreuses surexprimant le récepteur à l’αvβ3. Cependant, en dépit de leur utilisation
massive, l’important ciblage non spécifique des RGD limite leur application à la libération de
composés thérapeutiques en raison de l’expression importante des intégrines αvβ3 dans les
tissus sains ou enflammés. De plus, certaines propriétés intrinsèques telles que la géométrie
moléculaire de certains peptides peuvent affecter leur efficacité de ciblage. Ainsi une étude
portant sur la relation entre structure et activité des peptides RGD sous forme linéaire ou
cyclique a montré que le peptide cyclique avait un pouvoir anti-tumoral dix fois supérieur à
son homologue linéaire [515].
Les peptides représentent également un moyen de cibler le réseau vasculaire pour
faciliter la pénétration des nanoparticules et ainsi optimiser l’effet EPR. Ainsi les peptides
capables de traverser la barrière endothéliale permettent de faciliter le transport des
nanoparticules et donc d’améliorer la libération de leur cargo dans les cellules et les organites
cibles. Les peptides ainsi synthétisés ont des séquences variables, et permettent de faciliter la
pénétration des nanoparticules dans les tissus grâce à leur interaction avec la neuropiline-1
[516].
En dépit des avantages présentés par les peptides, le devenir des nanoparticules qui en
sont recouvertes reste incertain. Les peptides conjugués aux nanoparticules peuvent en effet
avoir une activité activatrice ou inhibitrice de leur cible [517]. Cette activité peut modifier le
devenir des nanoparticules et notamment leur internalisation, soulevant la nécessité
d’approfondir notre compréhension de ce système avant son application au domaine des
nanomédecines.
130
4.
Les acides nucléiques
a) Structure et application
Une autre classe de ligands différente des aptamères de peptides sont les aptamères
basés sur les acides nucléiques et leurs dérivés. Ils sont construits suivant un court
oligonucleotide simple brin d’ADN, d’ARN ou d’acides nucléiques modifiés [518]. La
conformation structurale unique des aptamères d’acides nucléiques leur confère un haut degré
d’affinité et de spécificité. Ainsi il a été isolé un grand nombre d’aptamères, caractérisés par
une forte affinité pour différents types de cibles dont des protéines ou des petites molécules
[519]. Les aptamères à base d’acides nucléiques ont l’avantage de pouvoir être isolés
facilement et ce pour une variété de substrats et avec une grande affinité. De plus, la
simplicité de leur dérivation chimique et leur reproductibilité de synthèse en font
d’intéressants candidats en nanomédecine. Tout comme les protéines, les aptamères d’acides
nucléiques existent de manière naturelle dans les riboswitches (ou riborégulateurs), mais la
plupart de ceux utilisés pour la conception et la synthèse de nanoparticules à ciblage actif sont
artificiellement conçus. Cependant, bien que les nombreuses possibilités de séquences offrent
des options de liaison virtuellement infinies, l’élément clé demeure dans l’isolement et la
purification des ligands spécifiques.
b) Limites
Bien qu’ayant démontré des avantages non négligeables précliniques, les acides
nucléiques comme ligands de ciblage actif posent certains problèmes quant à leur utilisation
en clinique [520]. Dans un premier temps, les acides nucléiques sont rapidement dégradés par
les nucléases dans les environnements biologiques, compromettant ainsi la stabilité des
ligands à la surface des nanoparticules. Bien que des solutions et stratégies aient été exploitées
pour limiter cette dégradation, les résultats restent insuffisants pour la dégradation spontanée
des acides nucléiques conjugués à la surface des nanoparticules.
Ensuite, comme les autres systèmes discutés précédemment, les acides nucléiques
posent le problème de la taille finale du nanosystème. Bien que la taille des acides nucléiques
en soi ne soit pas très importante, c’est leur structure rigide qui apparente leur longueur à celle
des protéines. Ainsi, le rayon hydrodynamique global du nano-système devient trop important
pour une bonne diffusion dans les tissus cibles [518]. De plus, le squelette de phosphodiesters
des acides nucléiques leur confère des charges négatives, ce qui affecte leur temps de
131
circulation dans le sang, diminuant ainsi leur distribution dans les tissus tumoraux. Enfin, le
coût de production de ces nano-systèmes reste important malgré les récentes avancées
technologiques dans le domaine.
5.
Les petites molécules
a) Les folates
Parmi les petites molécules synthétiques ou naturelles identifiées comme potentiels
ligands, l’une des plus communes est l’acide folique et ses dérivés de folates. Les folates ont
en effet été massivement utilisés pour leur haut degré d’affinité et de spécificité pour les
récepteurs aux folates (FR), qui sont très souvent sur-exprimés à la surface de bon nombre de
tumeurs humaines dont les cancers de l’ovaire, du cerveau, du sein, du colon, du rein et du
poumon [521-522]. Cependant, l’expression des FR a été reportée comme patient-dépendante,
ce qui nécessite l’application d’une médecine personnalisée pour la réussite de telle stratégie.
De plus, les FR ne sont pas seulement surexprimés au niveau des cellules tumorales mais sont
constitutivement synthétisés dans de nombreux tissus sains et dans l’épithélium sain de
nombreux organes, limitant la spécificité de tel nano-système pour les cellules touchées.
b) Les carbohydrates
La famille des carbohydrates dont le mannose, le glucose, le galactose et leurs dérivés
ont aussi été exploités comme ligands de ciblage actif. Les carbohydrates sont reconnus à la
surface des cellules par des protéines ubiquitaires appelées lectines. L’une des premières
stratégies de ciblage actif anti-tumorale était basée sur un conjugué de doxorubicine
incorporant des galactosamines dans le but de cibler les cellules primaires et métastatiques de
cancer du foie. Bien qu’ayant montré une efficacité insuffisante en phase II, il a été montré
que ce type de ligand conférait toutefois un certain niveau d’efficacité de ciblage de ces
conjugués [523].
c)
L’ACUPA
Enfin, l’un des systèmes basés sur les petites molécules en tant que ligands ayant
connu le plus de succès est basé sur l’ACUPA (S,S-2-3[3-[5-amino-1-carboxypentyl]-ureido]pentanedioic acid), une petite molécule ciblant un marqueur spécifique du cancer de la
prostate : le PSMA (prostate specific membrane antigen) [524]. Certaines de ces constructions
ont démontré des propriétés de ciblage spécifique intéressantes, ont complété les phases
cliniques primaires et sont étudiées pour poursuivre leur caractérisation clinique.
132
d) Avantages des petites molécules comme ligands
Les molécules de faible poids moléculaire ont des propriétés défiant les composés
décrits précédemment. En effet, elles ont l’avantage d’être de petite taille, limitant donc les
effets sur la demi-vie plasmatique des composés et facilitant leur accès aux cellules ciblées.
De plus, elles ont un coût de production très faible et sont des molécules stables. Il est
beaucoup plus simple de synthétiser ces molécules, qui offrent la possibilité de conjugaison
aux nanoparticules par des méthodes de pré-formulation.
L’identification de nouveaux ligands avec une forte affinité pour le substrat d’intérêt
représente le challenge le plus important lors de l’utilisation de petites molécules pour le
ciblage actif. Les techniques de screening des petites molécules posent en effet certaines
difficultés, et nécessitent des procédures de screening à grande échelle minutieuses. C’est
pourquoi les paires ligand/substrat cliniquement pertinentes sont rares, et la plupart des
exemples de nanoparticules à ciblage actif utilisant des petites molécules comme ligands
reposent sur des molécules connues [525].
D’après les nombreuses études menées et notre compréhension actuelle des systèmes de
nanoparticules à ciblage actif, il est facile de visualiser les difficultés et challenges apportés
par de telle stratégie. Ainsi, le ciblage actif n’est à l’heure actuelle pas envisagé comme
système à part entière, mais davantage comme une stratégie complémentaire au ciblage passif
pour augmenter l’efficacité thérapeutique des composés ainsi vectorisés.
IV. Nanomédecines et cancer
Bien que les nanomédecines suscitent désormais un intérêt grandissant, le
développement et le transfert à la clinique demeurent laborieux. Dans cette partie sont
présentées quelques unes des applications cliniques de systèmes nanoparticulaires discutés
précédemment.
A. Avantages des nanotechnologies pour une application clinique
Les nanotechnologies offrent des avantages très prometteurs pour leur application dans
des stratégies thérapeutiques. Quelques uns de ces avantages sont listés ci-dessous :
-
Les nanoparticules facilitent la combinaison de composés actuellement utilisés en
clinique, par l’encapsulation de plusieurs molécules, permettant ainsi une synergie de
libération des composés, et un effet combinatoire optimal.
133
-
L’exposition spatio-temporelle de chaque drogue peut être contrôlée plus précisément
par leur encapsulation.
-
Des composés jusqu’alors écartés car trop peu solubles peuvent à nouveau être
envisagés pour leur utilisation thérapeutique [526-527].
-
L’encapsulation des composés thérapeutiques leur confère un certain degré de
protection [528].
-
Les nanoparticules permettent de modifier les propriétés des composés dans la
circulation sanguine (soit leur demi-vie plasmatique) et de leur distribution tissulaire
[529-530].
-
La fonctionnalisation des composés thérapeutiques sur des nanoparticules permet à la
fois de limiter la forte toxicité et d’améliorer les propriétés physicochimiques des
molécules qui peuvent parfois représenter un frein à leur utilisation en clinique.
Ce ne sont que quelques unes des multiples propriétés intéressantes que représentent
les DDS en cancérologie, qui ont amené de nombreuses équipes à développer des systèmes
pour leur évaluation chez l’homme.
B. Applications cliniques de certains DDS
1.
Liposomes et clinique
Parmi les composés de nanomédecine validés en clinique, seule une construction est
approuvé pour son utilisation en clinique: le paclitaxel albumine-stabilisée (nab-PTX :
albumin-stabilised paclitaxel). Il est administré aux patients atteints d’un cancer du sein
métastatique ne répondant pas aux traitements standardisés [531]. Une combinaison de nabPTX avec la gemcitabine a récemment montré un intérêt thérapeutique notoire chez des
patients atteints de cancer du pancréas en augmentant de 25% la médiane de survie en
comparaison de la gemcitabine utilisée seule [532].
Dans les débuts de la recherche de nouvelles voies d’administration de composés
thérapeutiques, les premières générations de liposomes ont vu leur premier « succès » avec
l’encapsulation de la doxorubicine [533]. Les auteurs démontrèrent en effet une rétention de
la doxorubicine et une diminution de l’accumulation dans le tissu cardiaque environnant,
diminuant ainsi la toxicité. L’utilisation de la doxorubicine encapsulée dans un liposome a fait
ses preuves en diminuant la cytotoxicité sur des cellules cardiaques [534-535].
134
2.
Nanoparticules de polymères et clinique
Suite aux travaux de Maeda sur l’effet EPR, de nombreux transporteurs de composés
thérapeutiques, les « drug carriers », de taille nanoparticulaire furent développés. Les
SMANCS furent les premiers conjugués polymériques cliniques approuvés en 1993 au Japon
pour le carcinome hépatocellulaire [536] .
Des nanoparticules de PLGA encapsulant du paclitaxel démontrèrent une importante
augmentation des effets cytotoxiques de ce composé sur différents types de cellules tumorales
comparé au composé seul [537-538]. Une étude portée sur le cancer de la prostate montre les
bénéfices de ces nano-systèmes grâce à l’encapsulation de siRNAs dans des nanoparticules
lipidiques cationiques coatées de PLGA [539]. Somme toute, les nanoparticules de PLGA ont
montré des bénéfices thérapeutiques dans différents types de modèles, avec l’encapsulation de
différents types de molécules telles que des folates [540] ou encore des ligands de ciblage
spécifiques [541].
L’encapsulation de composés anti-cancéreux dans des PNP recouvertes de PEGlécithine et de PLGA fonctionnalisées avec des aptamères d’antinucleoline AS1411 a montré
son intérêt quant à l’augmentation de l’efficacité d’encapsulation, ainsi que l’augmentation de
la libération des composés thérapeutiques pour le ciblage spécifique dans le traitement du
cancer [542]. De même, des PNP recouvertes de PEG-PGLA et fonctionnalisées avec des
aptamères ont montré une augmentation d’efficacité du paclitaxel dans le traitement du
gliome [543]. Enfin, cette même structure de PNP chargée de cisplatine montre une efficacité
supérieure comparée au composé délivré seul dans le traitement du cancer de la prostate
[544].
3.
Nanoparticules virales et clinique
Les interactions naturelles entre le virus de CPMV et les cellules de mammifères ont
été démontrées sur un modèle murin de sclérose en plaque, en ciblant les zones
d’inflammation du système nerveux central grâce à ces nanoparticules virales. Cette étude a
démontré une accumulation spécifique des nanoparticules au niveau de l’endothélium de la
barrière hémato-encéphalique, ainsi que dans le parenchyme de certaines zones enflammées
ou lésées du cerveau. Ces résultats montrent ainsi l’intérêt potentiel de l’utilisation de
nanoparticules virales avec le CPMV pour cibler les maladies induisant une inflammation du
système nerveux central [545].
135
C. Stratégie de ciblage actif et clinique
A l’heure actuelle, le développement de stratégies de ciblage actif le plus avancé en est
au stade préclinique. Cependant, seuls des nano-systèmes couplés à des anticorps pour un
ciblage actif ont été validés pour une utilisation en clinique. En effet, quatre anticorps ciblant
des récepteurs spécifiques CD20, CD25 et CD33 couplés à des nanoparticules ont été utilisés
avec succès pour traiter le lymphome non Hodgkinien ou la LMA [546].
Le ciblage actif a été exploité avec succès pour augmenter l’internalisation de
nanoparticules par les cellules cibles et ainsi augmenter l’efficacité thérapeutique de leur
cargo. Des anticorps anti-HER2 (human epidermal growth factor receptor-2) sur la surface de
liposomes ont montré une augmentation de l’internalisation des nanoparticules à l’intérieur
des cellules exprimant HER2. A l’inverse, l’injection de liposomes sans anticorps ou
l’injection des liposomes avec des anticorps à des souris portant des cellules n’exprimant pas
HER2 montrait une accumulation des nanoparticules dans l’espace périvasculaire, et une
interaction réduite avec les cellules tumorales cibles [547].
1.
Les anticorps comme ligands
Bien que les nano-systèmes à ciblage actif utilisant des anticorps comme ligands
posent des limites non négligeables, certains de ces systèmes ont atteint le stade clinique,
notamment le MCC-465 et le SGT-53. Le MCC-465 est un immunoliposome encapsulant de
la doxorubicine, recouvert de PEG et avec un anticorps GAH monoclonal humain qui réagit
positivement avec 90% des tissus stomacales tumoraux et négativement avec les tissus sains.
Le MCC-465 a notamment été évalué pour le traitement de cancers gastriques. Cette
construction a montré des résultats positifs dans des études précliniques avec une
biodistribution adéquate et une efficacité importante dans la libération de doxorubicine dans
les cellules cancéreuses de l’estomac [548]. Le SGT-53 est formé lui aussi d’un système
liposomal, mais avec comme composé thérapeutique de l’ADN plasmidique ciblant la
protéine p53 pour son inhibition. Le système de ciblage est un anticorps Fab, composé d’un
fragment à chaîne unique qui cible les récepteurs à transferrines à la surface des cellules
tumorales. Ce système a montré une inhibition évidente de la croissance tumorale dans
plusieurs types de cancers (tête et cou, prostate, sein), il est considéré comme prometteur pour
son utilisation dans de futurs essais cliniques [549]. D’autre part, un groupe de l’université de
Basel a récemment publié une étude très prometteuse sur 29 patients avec des tumeurs solides
136
traités avec des liposomes PEGylés incluant de la doxorubicine et ayant comme ligand un
fragment Fab ciblant les récepteurs à l’EGFR (le cetuximab) [550].
2.
Les peptides comme ligands
Un exemple de peptides à séquences RDG testé en clinique est le peptide cyclique
cyclo(-RGDfV-), aussi connu sous le nom de Cilengitide, utilisé comme agent antiangiogénique dans certaines thérapies anti-tumorales [551].
Plusieurs modèles de peptides ciblant le réseau endothélial pour faciliter la pénétration
des nanoparticules dans les cellules cibles ont montré un intérêt notoire. Sugahara et al ont
ainsi montré que des peptides RGD permettaient d’améliorer l’efficacité de libération des
composés thérapeutiques au niveau du site tumoral [552]. Plusieurs études ont montré que la
conjugaison de peptides cycliques LyP-1 à des nanoparticules permettait d’une part leur
pénétration à travers les vaisseaux sanguins [516], et d’autre part l’augmentation d’efficacité
de ciblage des cellules lymphatiques tumorales comparé aux nanoparticules nues [553].
3.
Les aptamères d’acides nucléiques comme ligands
La faisabilité de l’utilisation d’aptamères d’acides nucléiques conjugués à des
nanoparticules fut démontrée en 2004 pour le ciblage d’un marqueur spécifique du cancer de
la prostate : le PSMA. Le ciblage de ce marqueur par ce nano-système permet une plus forte
diminution de la croissance tumorale, accompagné d’une augmentation de la médiane de
survie [426]. Depuis lors, la preuve de concept a été réalisée in vivo pour des nanoparticules
incorporant divers types de composés.
4.
Les petites molécules comme ligands de ciblage actif
L’utilisation des folates comme ligands conjugués à des nanoparticules co-encapsulant
du paclitaxel et du yitrium-90 a montré une amélioration de la médiane de survie dans un
modèle de xénogreffe de cancer de l’ovaire [554]. De plus, chez l’homme, des marqueurs
fluorescents conjugués à des folates ont été utilisés pour améliorer la réduction tumorale
chirurgicale via une visualisation intra-tumorale spécifique [555]. De plus, l’accrochage de
200 molécules d’ACUPA sur des nanoparticules chargées de docetaxel permet un ciblage
optimal des cellules cancéreuses de prostate positives au PSMA, sans interférer avec la
cinétique de circulation des nanoparticules.
137
D. Des nano-systèmes acido-sensibles pour le traitement du
cancer
Un certain nombre de nanosystèmes de libération de composés pour les thérapies en
oncologie ont été conçus sur la base d’une libération acido-dépendante. Au sein d’un
organisme, le pH est loin d’être constant. En effet, il varie selon les tissus et les organes, mais
aussi selon le stade d’avancement de la maladie (ischémie, infection, inflammation,
tumorigenèse…). Ainsi, au sein des tumeurs le pH varie entre 5,8 et 7,8 alors qu’il est
d’environ 7,4 dans les tissus sains [556]. En plus de la variabilité de pH rencontrée au niveau
tissulaire, le niveau d’acidité varie également au niveau sub-cellulaire à l’intérieur même des
cellules. Ainsi les compartiments acides des endosomes et lysosomes ont un pH compris entre
4,5 et 5,5 [557]. Ce gradient de pH a toute son importance puisque les composés ou
transporteurs thérapeutiques conçus pour des stratégies anti-tumorales ont une activité
biologique fonctionnelle par le biais de leur internalisation par endocytose dans les
compartiments acides [558]. La libération pH-dépendante des composés thérapeutiques
apparaît donc comme une stratégie prometteuse pour contrôler le relargage de composés
toxiques uniquement au niveau des cellules tumorales.
1.
Objectifs des nano-systèmes à relargage acido-sensible
Idéalement, les nano-systèmes à libération pH-dépendante de leur cargo doivent être
capables de :
-
retenir et stabiliser les composés à pH physiologique,
-
relarguer rapidement le composé lorsque le pH acide ciblé est atteint,
-
assurer une concentration du composé intracellulaire qui atteint la dose thérapeutique
souhaitée.
Divers systèmes ont été conçus pour répondre au mieux à ces attentes et s’approcher
d’un modèle de libération acido-sensible idéal. Chaque stratégie développée dans ce domaine
ne sera pas détaillée dans cette introduction, mais il est important de nommer quelques unes
des principales méthodes.
2.
Des DDS pH-dépendants « ionisables »
Une première approche consiste à introduire dans la formulation nanoparticules des
groupements dits « ionisables » tels que des groupements amides, acide phosphorique ou
138
encore acide carboxylique. Ces groupements sont capables d’accepter ou de donner des
protons, et vont subir des modifications pH-dépendantes de certaines de leurs propriétés
physiques ou chimiques ayant pour conséquence le relargage des composés [559].
3.
Des peptides de fusion
Les peptides fusogéniques acido-sensibles sont des molécules organiques qui
fusionnent avec la membrane des endosomes lorsqu’elles sont exposées à de faibles pH dans
les endosomes. Ces peptides peuvent être utilisés pour une libération hautement efficace de
molécules thérapeutiques ou de gènes. Par exemple, le GALA (Glu-Ala-Leu-Ala) est l’unité
de répétition majeure d’un peptide de 30 AA pouvant être utilisé en tant que DDS [559].
4.
Des chaînes acido-sensibles
Une autre stratégie vise à utiliser des chaînes acido-sensibles pour accrocher de façon
covalente les composés à la surface d’une nanoparticule déjà formulée, ou pour la
construction d’une nouvelle formulation nanoparticulaire. Ces chaînes sont stables à pH
neutres, et dégradées/hydrolysées à pH acide. Cette propriété unique en font de très bons
candidats pour des DDS à libération pH-dépendante. Les principales chaînes conçues sont
résumées dans le Tableau 7.
139
Nom
Chaîne acidosensible
Produits de
dégradation
Orthoester
Ester
Hydrazone
Imine
Cis-aconityl
Acetal/ketal
Tableau 7 : Exemples des chaînes acido-sensibles les plus communes et leurs produits de
dégradation.
Source: adapté depuis Liu et al., pH-sensitive nano-systems for drug delivery in cancer
therapy, 2014, [559].
5.
L’intégration de précurseurs de dioxyde de carbone
L’une des dernières stratégies à avoir vu le jour vise à incorporer des précurseurs de
dioxyde de carbone (CO2) dans la formulation nanoparticulaire tels que le bicarbonate HCO3-..
Ces précurseurs vont produire du CO2 dans un environnement acide, ce qui conduit à la
désintégration du transporteur et au relargage du composé d’intérêt [560]. Ce principe est basé
sur le fait que l’ion hydrogénocarbonate HCO3- réagit avec les protons des milieux acides pour
produire de l’acide carbonique, qui se décompose facilement en CO2 et en eau (HCO3- + H+
→ H2O + CO2↑). Les principaux précurseurs utilisés sont le bicarbonate de sodium (NaHCO3)
et le bicarbonate d’ammonium (NH4HCO3).
140
E. Nanomédecine et MPM
Au vu du succès de certaines stratégies thérapeutiques de nanomédecines, certains
composés ont été évalués pour le traitement du MPM.
1.
Les liposomes
a) Liposome-L-NDDP
Un analogue du cisplatine : le cis-bisneodecanoato-trans-R,R-1,2-diaminocyclohexane
platinum(II) (L-NDDP) encapsulé dans une formulation liposomale a été évalué dans un essai
clinique de phase II chez 33 patients atteints de MPM [561]. Les patients recevaient le
composé par voie intrapleurale et les effets du taux de réponse clinique étaient observés par
biopsie thoracoscopique. Les résultats montrent qu’un traitement avec une formulation
liposomale de L-NDDP engendre une toxicité significative mais gérable pour le traitement du
MPM. Bien que le taux de réponse clinique soit encourageant avec le traitement, les zones du
développement du MPM qui ne sont pas en contact avec la plèvre échappe à l’exposition au
traitement et limite donc son efficacité chez certains patients. Bien que prometteur, le rôle
exact et l’optimisation de la formulation du L-NDDP restent à approfondir.
b) Liposomes-doxorubicine
De la doxorubicine sous forme liposomale (Doxil®) a été évaluée en phase clinique II
chez des patients atteints de mésothéliome. Ces liposomes sont recouverts de méthoxypoly
(éthylène glycol), ce qui évite la capture par le RES. De plus leur demi-vie plasmatique est
prolongée et leurs profils de toxicité sont plus prometteurs que ceux des liposomes nus. Les
résultats de cette phase II suggère que la construction liposomale de doxorubicine a une
fonction biologique active pour le traitement du mésothéliome, sans engendrer de toxicité
notoire [562].
c)
Liposomes-daunorubicine
De la daunorubicine sous forme liposomale a été évaluée pour le traitement du MPM.
Une phase clinique II a permis d’évaluer le taux de réponse, la toxicité et la survie chez 14
patients atteints de MPM [563]. Le bilan de cette étude est négatif, le traitement à la
daunorubicine liposomale ne démontrant en effet pas d’activité clinique efficace pour le
traitement de patients atteints de MPM. De plus, la plupart des patients subissaient une
141
toxicité sévère avec une neutropénie de grades 3 ou 4. La daunorubicine sous forme
liposomale n’est donc pas adaptée au traitement du MPM.
2.
SWCNT
Comme précédemment discuté, les nanotubes de carbones à simple feuillet (SWCNT)
ont suscité grand intérêt pour leur application thérapeutique. Une étude in vitro menée sur des
cellules mésothéliales saines et malignes a cherché à déterminer les diverses altérations de
signalisations moléculaires engendrées par un traitement avec des SWCNT [564]. Ainsi
l’exposition des cellules tumorales aux SWCNT induit la production de ROS, augmente la
mort cellulaire, augmente les dommages à l’ADN et active un certain nombre de protéines
engagées dans des mécanismes impliqués dans le développement tumoral du MPM. Cette
étude soulève l’intérêt des SWCNT pour aborder le traitement du MPM, et apporte des
résultats satisfaisants pour le passage aux études in vivo.
3.
Nanoparticule de Paclitaxel
Des nanoparticules chargées en paclitaxel (Pax-eNP : paclitaxel-loaded expansile
nanoparticles) conçues pour une libération endosomale du composé à pH 5 étaient évaluées
dans un modèle murin de xénogrèfe de MM humain [565]. Les auteurs comparent les effets
d’une cytochirurgie de réduction, le traitement avec les nanoparticules ou leur combinaison.
Les résultats montrent que la chirurgie seule ne permet pas l’amélioration de la survie globale
des souris, alors que le traitement avec les nanoparticules seules ou en combinaison de la
chrirurgie permet une augmentation significative de la survie globale des souris.
4. Films polymériques de cisplatine
Des films polymériques pour une libération ciblée de cisplatine ont été évalués dans
un modèle de rat de MPM [566]. Des disques polymériques de 4,5 cm de diamètre pour une
libération locale de cisplatine étaient construits avec du hyaluronate et/ou du chitosane. Des
films chargés ou non en cisplatine, ou du cisplatine seul étaient administrés aux animaux.
L’évaluation des effets du traitement se basait sur la taille de la tumeur en premier lieu, et la
toxicité éventuelle associée au traitement. En conclusion, le cisplatine avec le Hyaluronatechitosan était significativement efficace pour réduire le volume tumoral comparé au cisplatine
seul. De plus, les films de hyalurontae ou hyaluronate-chitosane chargés avec du cisplatine
assurent une demi-vie plasmatique prolongée du cisplatine, sans augmentation de la toxicité.
142
Conclusion
Les nanomédecines, bien que représentant de réels challenges pour la médecine chez
l’homme, constitue un domaine prometteur dans le domaine de l’oncologie.
143
OBJECTIFS
OBJECTIFS DE LA THÈSE
Le MPM est une tumeur très agressive de la plèvre, caractérisé par un développement
très lent et une médiane de survie ne dépassant pas 12 mois après diagnostic. Les méthodes
d’identification d’un MPM restent laborieuses avant d’obtenir un diagnostic précis, et les
thérapies actuelles n’apportent qu’un très modeste bénéfice aux patients. Il apparaît donc
nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour aborder le traitement du
MPM d’une manière plus efficace. Les travaux que j’ai effectué durant mon doctorat ont donc
porté sur l’amélioration des traitements conventionnels du MPM, par deux méthodes
distinctes.
Il est maintenant admis que cancer et épigénétique sont étroitement liés. En effet, il
existe différents types de modifications épigénétiques qui ont lieu dans de très nombreux
types de cancers. Parmi elles, les modifications de l’état d’acétylation des histones
représentent l’un des changements les plus importants. Dans des conditions physiologiques, il
existe un équilibre entre l’état acétylé ou déacétylé des histones, régit par deux familles
d’enzymes : les histones acétyl transferases (HAT) et les histones deacetylases (HDAC). Cet
équilibre a un impact direct sur le degré de compaction de la chromatine, et donc sur la
disponibilité du matériel génétique à être transcrit. Dans un grand nombre de cancers, cet
équilibre tend vers une augmentation de la déacétylation des histones, conduisant à une
compaction de la chromatine et donc à un matériel génétique beaucoup moins disponible à la
transcription. Il en résulte une suppression de l’expression de certains gènes suppresseurs de
tumeurs. La stratégie vise donc à inhiber les enzymes responsables de cette déacétylation,
notamment par des inhibiteurs d’histones déacétylases (iHDAC), de façon à faire basculer
l’équilibre vers une augmentation de l’acétylation des histones et donc promouvoir
l’expression de certains gènes suppresseurs de tumeurs. Bien que de nombreux iHDAC soient
actuellement en cours d’évaluation préclinique et clinique, et que quatre soient approuvés en
clinique, les propriétés pharmacodynamiques et les effets secondaires sévères limitent leur
utilisation. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles stratégies d’administration pour
exploiter ces molécules. Ceci constitue le premier grand objectif de ma thèse : l’étude d’un
nouveau mode d’administration par leur vectorisation sur une nanoparticule.
Ainsi durant mon travail de thèse, en collaboration avec l’équipe de chimie du Dr
Philippe Bertrand à Poitiers et en collaboration avec l’équipe de polyméristes du Dr Valérie
Héroguez à Bordeaux, j’ai pu obtenir des iHDAC greffés à des nanoparticules, et j’ai
caractérisé leurs effets in vitro et in vivo dans un modèle de mésothéliome malin.
144
OBJECTIFS
De plus, je me suis intéressée aux mécanismes d’action des iHDAC, notamment aux
phénomènes d’oxydo-réduction et à la manière dont ces molécules pouvaient être impliquées
dans la production de radicaux libres et ainsi améliorer les effets des traitements actuels. Les
cellules tumorales subissent un stress oxydatif plus important que les cellules saines,
notamment en raison des processus de transformation oncogénique, d’altération de l’activité
métabolique et d’augmentation de la production de ROS (reactive oxygen species). Cette
augmentation intracellulaire de ROS dans les cellules tumorales peut avoir des conséquences
critiques sur la tumorigenèse, favorisant la prolifération des cellules cancéreuses ou encore la
perturbation de la stabilité génétique des cellules. Ainsi mon étude m’a conduit à regarder
l’effet de différentes molécules sur la production de ROS et leur corrélation avec une
apoptose des cellules tumorales. De plus, l’approbation de molécules de synthèse pour leur
application clinique chez l’homme étant à l’heure actuelle un frein majeur dans l’avancée de
la recherche en santé, notamment de par leur profil de toxicité sévère une fois administrés aux
patients, il devient prometteur de s’intéresser à des sources naturelles pour l’obtention de
nouveaux composés thérapeutiques. Une molécule naturelle est alors apparue comme
prometteuse dans notre modèle d’étude : le PEITC, connue pour ses propriétés anti-tumorales
et son implication dans des processus de ROS. Comme décrit dans l’introduction, le
traitement de chimiothérapie de première ligne pour le MPM est une combinaison de
cisplatine avec l’anti-métabolite de pémétrexed. Cependant, cette combinaison n’a montré que
de modestes effets bénéfiques, et d’importants effets secondaires.
Ainsi, dans mon travail de caractérisation de moyens d’amélioration des stratégies
thérapeutiques actuellement appliquées au traitement du MPM, le deuxième objectif de ma
thèse a consisté à évaluer la combinaison cisplatine-PEITC dans un modèle de MPM.
Les objectifs de ma thèse étaient donc :
1. Evaluer un nouveau mode d’administration des iHDAC par vectorisation sur des
nanovecteurs acido-sensibles.
2. Evaluer les effets thérapeutiques d’une combinaison cisplatine-PEITC dans un
modèle de mésothéliome pleural malin.
145
RÉSULTATS - Article I
Article I: Design of pH Responsive Clickable Prodrugs Applied to Histone
Deacetylase Inhibitors: A New Strategy for Anticancer Therapy
Régis Delatouche a, Iza Denis b,c,d, Marion Grinda a, Fatima El Bahhaj a, Estelle Baucher b,c,d, Floraine Collette
e
, Valérie Héroguez e, Marc Grégoire b,c,d, Christophe Blanquart b,c,d,⇑, Philippe Bertrand a,⇑.
a : Institut de Chimie des Milieux et Matériaux de Poitiers, CNRS, UMR 7285, Université de Poitiers, Poitiers cedex, France
b : Inserm U892, Nantes, France
c : Université Nantes, Nantes, France
d : CNRS 6299, Nantes, France
e : Laboratoire de Chimie des Polymères Organiques, CNRS, UMR 5629, Université de Bordeaux, Pessac, France
Introduction
Epigénétique et cancer sont étroitement liés et depuis quelques années, les
modifications épigénétiques apparaissent comme un mécanisme important de la régulation de
l’expression génique par des modifications post-traductionnelles de la chromatine, associées à
de nombreuses maladies chez l’homme, dont une grande majorité de cancers. Les
modifications de la méthylation de l’ADN ou de l’acétylation des histones sont les altérations
épigénétiques les plus fréquentes dans le cancer et sont notamment responsables de la
suppression de l’expression de gènes suppresseurs de tumeurs. Parmi les nombreux facteurs
impliqués dans les mécanismes de modifications épigénétiques, les histones déacétylases
(HDACs) apparaissent comme des cibles thérapeutiques prometteuses pour le développement
de nouvelles stratégies anti-tumorales. Il existe un équilibre entre acétylation et déacétylation
des histones dans des conditions physiologiques, qui permettent une régulation de la
compaction de la chromatine et par extension de l’expression génique. Ainsi une
augmentation de l’acétylation des histones, catalysée par les histones acétyl transférases
(HATs) permet une décompaction de la chromatine et une transcription favorisée. A l’inverse,
la déacétylation des histones, régulée par les HDACs, induit une compaction de la chromatine
et donc une diminution de la transcription des gènes. Ainsi, la stratégie vise à utiliser des
inhibiteurs d’HDACs (iHDAC), de façon à faire tendre l’équilibre vers une transcription
génique favorisée. Le vorinostat et la romidepsine sont les seuls iHDAC actuellement
approuvés pour le traitement du lymphome T cutané. Cependant, les iHDCAs présentent des
limites importantes : demi-vie plasmatique courte, responsable d’une efficacité limitée sur les
tumeurs solides, faible spécificité, toxicité hématologique majeure. Il est donc nécessaire
d’améliorer les conditions d’administration de ces molécules au potentiel thérapeutique
prometteur. Nous proposons dans cette étude la caractérisation de prodrogues d’iHDAC
greffés sur des chaînes acido-sensibles par chimie-click, de façon à obtenir une libération
146
spécifique des composés dans les cellules tumorales et ainsi limiter leur toxicité et augmenter
leur bénéfice thérapeutique.
Matériels et Méthodes
Trois types de chaînes acido-sensibles différents ont été synthétisées par le laboratoire
du Dr Philippe Bertrand (Institut de Chimie des Milieux et Matériaux de Poitiers UMR 7285),
et greffées à deux iHDAC : le SAHA (vorinostat) et le CI-994 (N-acetyl-dinaline).
L’évaluation des prodrogues ainsi obtenues a été réalisée in vitro sur des cellules de
mésothéliome pleural malin (MPM), et dont le but était de définir la chaîne optimale pour une
stabilité du composé à pH neutre et un relargage spécifique à pH acide pour sa
fonctionnalisation ultérieure sur une nanoparticule. La détermination des temps d’hydrolyse
des prodrogues selon le pH était réalisée par incubation des prodrogues dans des solutions
tampons à pH déterminé, puis soumises à hydrolyse acide. La caractérisation biologique des
prodrogues était réalisée par des expériences de viabilité cellulaire par Uptiblue pour
l’évaluation de la cytotoxicité des composés, et des expériences de BRET (bioluminescence
resonance energy transfer) pour analyser la fonction inhibitrice des iHDAC sous leur forme de
prodrogue. La méthode de BRET, précédemment décrite au laboratoire [567], permet une
mesure indirecte de l’acétylation des histones dans des cellules vivantes.
Résultats et Discussion
Les taux d’hydrolyse des prodrogues soumises à hydrolyse acide dans des solutions
tampons suggèrent une chaîne optimale par iHDAC avec une stabilité satisfaisante à pH
neutre et une libération pH dépendante du composé. Il apparaît cependant que le SAHA sous
forme de prodrogue présente des caractéristiques plus satisfaisantes que les prodrogues de CI994, au vu des échelles de temps de libération des composés en fonction du pH.
L’augmentation dose-dépendante du signal de BRET par ces prodrogues suggère une activité
iHDAC fonctionnelle dans un modèle cellulaire de MPM. De plus, cette activité iHDAC était
corrélée à une cytotoxicité dans ce même modèle cellulaire. Les résultats de la caractérisation
biologique confirment que les prodrogues de SAHA présentent des résultats plus
encourageants que les prodrogues de CI-994. Cependant, l’augmentation de l’acétylation des
histones n’est pas aussi importante avec le SAHA vectorisé qu’avec la molécule seule, ce qui
peut s’expliquer par la demi-vie plasmatique courte du SAHA (≈2h). L’équilibre entre la
libération du SAHA de la prodrogue et sa dégradation ne permet pas d’atteindre les
147
concentrations intracellulaires obtenues avec la molécule libre. Le CI-994 est une molécule
beaucoup plus stable que le SAHA. La conception du SAHA sous forme de prodrogue lui est
donc plus profitable que le CI-994. En conclusion, nous montrons ici un système capable de
libérer un iHDAC fonctionnel dans les cellules de façon pH dépendante corrélée à une
cytotoxicité dans un modèle cellulaire de MPM. Ces prodrogues d’iHDAC obtenues par
chimie click apparaissent donc comme des candidats potentiels pour de nouvelles stratégies
d’administration de composés thérapeutiques. Elles sont adaptées à une fonctionnalisation
ultérieure sous forme de nanoparticules pour combiner un système acido-sensible avec un
ciblage spécifique des tumeurs par un effet EPR nanoparticulaire.
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
RÉSULTATS - Article II
Article II: Nanoparticles Produced by Ring-Opening Metathesis
Polymerization Using Norbornenyl-poly(ethylene oxide) as a Ligand-Free
Generic Platform for Highly Selective In Vivo Tumor Targeting
Fabien Gueugnon,†Iza Denis,†Daniel Pouliquen,†Floraine Collette,‡Regis Delatouche,§Valerie Heroguez,‡,∥Marc
Gregoire,†Philippe Bertrand,*,§,∥and Christophe Blanquart*,†,∥
†
Inserm, U892, CNRS, UMR 6299, and University of Nantes, 8 Quai Moncousu, 44007 Nantes cedex 1, France
Laboratoire de Chimie des Polymeres Organiques, CNRS, UMR 5629, Bordeaux, 16 Avenue Pey-Berland, F-33607 Pessac,
France
§
Institut de Chimie des Milieux et Materiaux de Poitiers, CNRS, UMR 7582, Poitiers, 4 rue Jacques Fort, B27, F-86022
Poitiers cedex,France
‡
Introduction
Le mésothéliome pleural malin (MPM) et l’adénocarcinome pulmonaire (ADK) sont deux
types de cancers qui nécessitent de nouvelles perspectives thérapeutiques étant donné le trop
modeste bénéfice apporté par les traitements actuels. De nouvelles structures constituées de
molécules actives greffées à des liposomes ou des DDSs (Drug Delivery Systems) d’albumine
ont été évaluées dans des modèles de MPM [568] et d’ADK [569]. L’augmentation
escomptée de l’efficacité des composés thérapeutiques se base sur un ciblage spécifique de la
tumeur par diffusion passive des molécules via l’effet EPR (Enhanced Permeability and
Retention). La polymérisation de nanoparticules de norbornène (NB) par une méthode de
polymérisation par ouverture de cycle par métathèse ROMP (Ring Opening Metathesis
Polymerisation) est actuellement en cours d’évaluation pour préparer des polymères aux
applications diverses [570-572] et sont de potentielles alternatives aux actuels DDSs. Nous
décrivons dans ce travail la caractérisation chimique et biologique de nanoparticules de
norbornène recouvertes de chaines de poly-ethylène oxide (PEO) sans ligand obtenus par
ROMP pour une application dans le traitement du MPM ou de l’ADK.
Matériel et méthodes
La polymérisation des nanoparticules par ROMP était réalisée au laboratoire du Dr
Valérie Héroguez (Laboratoire de Chimie des Polymeres Organiques, CNRS, UMR 5629,
Bordeaux) à température ambiante sous atmosphère d’argon. La conversion du NB était
déterminée par chromatographie à gaz avec le dodécane comme standard interne. La taille des
nanoparticules était déterminée par DLS (dynamic light scattering) et microscopie
électronique à transmission (MET). Les nanoparticules nues ou fluorescentes par couplage à
de la rhodamine B étaient obtenues comme précédemment décrit (19) par copolymérisation de
160
NB avec des macromonomères initiée par le catalyseur de Grubbs de première génération.
Avant l’analyse biologique, les nanoparticules étaient épurées de toute présence d’éthanol,
méthanol, solvant organique et solubilisées dans de l’eau. Deux lignées cellulaires d’ADK et
trois de MPM établies au sein du laboratoire à partir de prélèvements de liquides pleuraux de
patients étaient utilisées pour la caractérisation biologique in vitro des nanoparticules. Une
lignée d’ADK (A549) était une lignée commerciale. L’évaluation de la viabilité cellulaire
était réalisée par la méthode d’Uptiblue. La cinétique d’endocytose des nanoparticules était
réalisée par mesure de la fluorescence après lyse des cellules préalablement incubées avec des
nanoparticules fluorescentes. L’internalisation des nanoparticules était visualisée par
microscopie à fluorescence grâce à l’observation de cellules incubées à 37°C ou 4°C avec des
nanoparticules fluorescentes en présence ou non de Cytochalaine D. La colocalisation des
nanoparticules avec les compartiments acides était évaluée grâce à un marquage LAMP-1 de
cellules de MPM et d’ADK incubées en présence de nanoparticules fluorescentes, puis
observation par microscopie. Enfin la biodistribution des nanoparticules était réalisée dans un
modèle murin immunodéprimée syngénique de xénogreffe de mésothéliome péritonéal malin
avec prélèvements et imagerie des organes de souris 1h, 6h, 24h, 72h et 96h après injection de
nanoparticules fluorescentes.
Résultats et Discussion
La méthode que nous décrivons permet d’obtenir un DDS d’environ 300nm, dont la
fonctionnalisation avec des composés thérapeutiques est également facilement réalisable par
une réaction de chimie-click de type azoture-alcyne. La caractérisation biologique dans des
modèles cellulaires de MPM et d’ADK montre une internalisation passive des nanoparticules
dans les cellules, par un mécanisme actif d’endocytose, probablement par macropinocytose
indépendante de la clathrine. De plus, nous montrons une colocalisation des nanoparticules
avec les compartiments acides, confirmant ainsi la compatibilité de cette structure à un
système acido-sensible. Enfin nous démontrons la spécificité de ciblage de la tumeur par ces
nanoparticules, qui s’accumulent préférentiellement dans le tissu tumoral sans affecter les
organes sains environnants. Ainsi le modèle de nanoparticule que nous décrivons ici pourrait
être d’un réel intérêt pour un ciblage spécifique de la tumeur et représente une alternative
prometteuse aux actuels DDSs en associant l’effet EPR avec un système de libération acidosensible. Cette formulation permet ainsi de limiter la toxicité et d’augmenter le bénéfice
clinique de composés thérapeutiques aux bénéfices cliniques trop modestes dans des modèles
de cancers aux traitements conventionnels trop peu efficaces.
161
162
163
164
165
166
167
168
RÉSULTATS - Article III - IV
Article
III:
Histone Deacetylase Inhibitor-Polymer Conjugate
Nanoparticles for Acid-Responsive Drug Delivery
Iza Denis1, Fatima el Bahhaj3, Floraine Collette2, Régis Delatouche3, Fabien Gueugnon1, Daniel Pouliquen1,
Loic Pichavant2, Valérie Héroguez2, Marc Grégoire1, Philippe Bertrand3*, Christophe Blanquart1*.
Article IV: Passive Tumor Targeting with Vorinostat-Polymer Conjugate
Nanoparticles for Acid-Responsive Drug Delivery.
Loic Pichavant2, Valérie Héroguez2, Marc Grégoire1, Philippe Bertrand3, Christophe Blanquart1.
1 : Inserm U892, CNRS 6299, Université de Nantes, Nantes, France
2 : Laboratoire de Chimie des Polymères Organiques, CNRS, UMR 5629, Université de Bordeaux, Pessac, France
3 : Institut de Chimie des Milieux et Matériaux de Poitiers, CNRS, UMR 7285, Université de Poitiers, Poitiers cedex, France
Introduction
Le Mésothéliome Pleural Malin (MPM) est une tumeur très agressive de la plèvre
caractérisée par un développement très lent et le plus souvent causée par une exposition
prolongée à l’amiante. Le pronostic de cette maladie est très mauvais, en raison des méthodes
de diagnostic insuffisantes, mais aussi du modeste bénéfice apporté par les thérapies actuelles.
De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc nécessaires pour traiter le MPM. Il a été
observé dans de nombreux types de cancers, dont le MPM, des modifications épigénétiques.
Parmi les différents acteurs prenant part à la régulation de ces mécanismes, les enzymes
d’histones déacétylases sont d’un grand intérêt. En effet, elles agissent en synergie avec les
histones acétyl transférases (HAT) pour réguler la transcription des gènes en agissant sur le
degré de compaction de la chromatine. Ainsi, la déacétylation des histones induit une
compaction de la chromatine, les gènes étant alors moins disponibles à la transcription, ce qui
peut conduire à la suppression de l’expression de gènes suppresseurs de tumeurs. Les
inhibiteurs d’histones déacétylases apparaissent (iHDAC) donc comme des candidats
prometteurs pour aborder le traitement du MPM. Cependant, divers essais cliniques
démontrent les limites et toxicités de ces composés, soulevant alors la nécessité de développer
de nouvelles molécules ou de nouveaux modes d’administration. De précédentes études se
sont intéressées à l’application des nanomédecines pour le traitement du MPM, en greffant de
la doxorubicine à des liposomes, et démontrent une amélioration des effets thérapeutiques de
la molécule accompagnée d’une toxicité limitée [562]. Nous proposons donc de vectoriser les
iHDAC sur des nanoparticules de norbornène (NB) via une chaîne acido-sensible de façon à
169
avoir un ciblage spécifique de la tumeur par un effet EPR (Enhanced Permeability and
Retention) et un relargage pH dépendant des composés dans les cellules tumorales. Nous
avons précédemment décrit un modèle de nanoparticules de NB obtenues par polymérisation
par ouverture de cycle par métathèse ROMP (Ring-Opening Metathesis Polymerisation) qui
s’accumulaient spécifiquement dans la tumeur par effet EPR [573]. De plus, trois iHDAC
sous forme de prodrogues ont été synthétisés et caractérisés dans des modèles cellulaires de
mésothéliome malin: deux iHDAC actuellement approuvés en clinique : le SAHA (vorinostat)
pour le traitement du lymphome T cutané et le tacedinaline (CI-994) pour les syndromes
épileptiques, et un iHDAC de synthèse le NODH, un analogue de la trichostatine A. Les deux
articles présentés ici correspondent aux études de caractérisation des nanoparticules de CI-994
et de SAHA.
Pour les deux études, les méthodes d’évaluation des nanoparticules in vitro sont
semblables. Les nanoparticules de NB [573] et les prodrogues acido-sensibles [574] étaient
synthétisées et caractérisées comme précédemment décrit. La caractérisation biologique des
nanoparticules fonctionnalisées in vitro a été réalisée sur des cellules de MPM et
d’adénocarcinome pulmonaire (ADCA). La méthode de BRET précédemment mise au point
au laboratoire [567] nous a permis d’analyser l’activité iHDAC des composés, et par
extension de s’assurer d’un bon relargage des composés à l’intérieur des cellules. De plus, des
expériences de viabilité cellulaire par Uptiblue, et d’induction d’apoptose par marquage à
l’annexine V des cellules traitées avec les nanoparticules nues ou vectorisées, nous ont permis
d’observer l’effet cytotoxique des nanoparticules nues ou chargées avec des iHDAC.
Un modèle murin syngénique ectotopique immunodéprimé de cellules de
mésothéliome péritonéal malin a été utilisé pour évaluer les propriétés anti-tumorales des
nanoparticules de SAHA. Des cellules murines de mésothéliome péritonéal (AK7) étaient
injectées en sous cutané dans un modèle de souris immunodéprimées, puis les souris (5 par
groupe) étaient traitées, par injection en intraveineuse de SAHA seul ou vectorisé sur des
nanoparticules fluorescentes (couplées à la rhodamine B) ou non. Les organes et tumeurs des
souris traitées aux nanoparticules fluorescentes étaient récupérés et imagés à la fin de
l’expérience pour évaluer l’intensité de fluorescence grâce au bio-imageur Biospace. La
toxicité des traitements a été évaluée par la mesure du poids du foie, de la rate et des reins
mais aussi par réalisation de formule sanguine.
170
Résultats/Discussion
Caractérisation des nanoparticules de CI-994 :
Le traitement des cellules avec le CI-994 seul ou vectorisé induit une augmentation du
signal de BRET avec le temps. Le CI-994 administré seul est capable d’être internalisé plus
rapidement dans les cellules comparées à sa forme vectorisée, mais sa durée d’action est
limitée dans le temps. Après 36h de traitement, le maximum de signal de BRET induit est
similaire entre la molécule libre et vectorisée. Les nanoparticules sont donc capables d’être
internalisées dans les cellules, et les iHDAC vectorisés ont une activité biologique
fonctionnelle aussi efficace que la molécule administrée librement. De plus, alors que la
molécule seule perd son activité au cours du temps, sa forme vectorisé lui confère une
stabilité et permet donc de prolonger son activité iHDAC au cours du temps. Les études de
viabilité montrent d’une part que les nanoparticules nues ne sont pas toxiques, et d’autre part
que l’augmentation de l’acétylation des histones observée peut être corrélée avec une
cytotoxicité dose-dépendante sur les deux types cellulaires. Le CI-994 vectorisé a un effet
cytotoxique équivalent à la molécule seule dans les cellules d’ADCA alors que les cellules de
MPM sont moins sensibles à la forme nanoparticulaire. Cette différence de sensibilité peut
s’expliquer par la capacité d’endocytose réduite dans les cellules de MPM comparées aux
cellules d’ADCA [573], notamment de par leur morphologie, avec la présence de
microvillosités sur la face externe de la membrane [575]. La vectorisation du CI-994
n’empêche donc pas la cytotoxicité de la molécule les deux types cellulaires. Nous
démontrons dans ce travail la capacité des nanoparticules à libérer le CI-994 spécifiquement à
l’intérieur des cellules tumorales, et à restaurer l’activité biologique de ces composés. De
plus, l’augmentation de l’acétylation des histones conférée par la vectorisation des iHDAC est
corrélée à une cytotoxicité dose-dépendante. Une évaluation in vivo de l’activité de cette
formulation est maintenant nécessaire, pour mettre en évidence son réel bénéfice
thérapeutique, et notamment sa capacité de ciblage tumoral accompagnée d’une absence de
toxicité systémique, comparé à la molécule seule.
Caractérisation des nanoparticules de SAHA :
La caractérisation in vitro des nanoparticules de SAHA suit le même raisonnement que
celle des nanoparticules de CI-994 et utilise les mêmes techniques. L’évaluation de
l’acétylation des histones grâce à la méthode de BRET montre une augmentation dosedépendante du signal de BRET avec les nanoparticules de SAHA, les nanoparticules nues
171
n’ayant aucun effet. Les nanoparticules de SAHA sont donc capables de pénétrer à l’intérieur
des cellules, et d’assurer une activité biologique fonctionnelle du SAHA. D’après la cinétique
de traitements avec du SAHA seul ou vectorisé, la molécule seule induit un maximum de
signal de BRET à 20h, avec une chute rapide du signal par la suite. Les nanoparticules ont un
effet plus lent, le maximum de BRET induit étant obtenu au bout de 40h, sans chute du signal.
Le SAHA libre diffuse très rapidement dans les cellules et a un effet transitoire, étant
particulièrement instable et avec une demi-vie plasmatique courte. Sa vectorisation comprend
un mécanisme d’internalisation dans les cellules puis de libération du SAHA, et permet
d’augmenter son temps de demi-vie, et donc in fine d’augmenter ses effets thérapeutiques au
cours du temps. La molécule se trouve stabilisée par sa vectorisation, et par extension ses
effets d’iHDAC prolongés. Comme pour les nanoparticules de CI-994, l’augmentation de
l’acétylation des histones engendrée par les nanoparticules de SAHA était corrélée à une
cytotoxicité sur des cellules de MPM, et à une induction d’apoptose dose-dépendante. Les
résultats prometteurs in vitro nous ont conduits à évaluer le potentiel anti-tumoral du SAHA
vectorisé dans un modèle murin syngénique de mésothéliome malin. Nous avions
précédemment démontré que les nanovecteurs fluorescents s‘accumulaient spécifiquement
dans la tumeur [573]. Dans ce modèle, la biodistribution était réalisée avec ces mêmes
nanoparticules fluorescentes, sur lesquelles étaient greffées des prodrogues de SAHA avec
une chaîne acido-sensible. Dans ce cas, les souris étaient traitées dans les mêmes conditions
que les autres groupes, par plusieurs injections successives. Le sacrifice des souris, la
récupération des organes et des tumeurs étaient réalisés à la toute fin de l’expérience pour les
imager et quantifier la fluorescence. A nouveau, les nanoparticules s’accumulent
spécifiquement dans la tumeur. L’accrochage de la prodrogue de SAHA avec une chaîne
acido-sensible n’entrave donc en rien la biodistribution spécifique des nanoparticules dans la
tumeur. L’analyse de la masse tumorale de souris traitées avec du SAHA seul ou vectorisé ne
révèle pas de régression tumorale quel que soit le traitement. Une analyse histologique de
coupes de tumeurs montre que bien que le SAHA vectorisé n’entraine pas d’augmentation
d’induction des cellules en apoptose, une augmentation de l’acétylation des histones est
observée, comparé à la molécule seule. Il semblerait donc que le SAHA vectorisé permette la
libération d’une dose suffisante dans la tumeur pour induire une modification de l’expression
génique et notamment l’expression de gènes suppresseurs de tumeurs. De plus, comme le
soulevait une précédente étude, le SAHA vectorisé, bien que modeste dans l’amélioration de
ses effets thérapeutiques, permettrait de sensibiliser les cellules à d’autres agents
172
thérapeutiques lors d’un traitement multimodal [576]. Enfin, l’analyse du poids des organes et
des formules sanguines a mis en évidence l’absence de toxicité des traitements.
Ces résultats montrent donc l’intérêt de la vectorisation du SAHA tant pour la
diminution des effets secondaires qu’entraîne une administration systémique de SAHA seul
que pour une amélioration de la fonction biologique de la molécule. Nous montrons un
ciblage et une libération spécifique des nanoparticules au niveau du site tumoral, avec une
amélioration des effets d’inhibition des HDACs comparé à la molécule seule, permettant
d’avoir des doses intracellulaires suffisantes pour une régulation de l’expression de certains
gènes et notamment des gènes suppresseurs de tumeurs. Ceci suggère la pertinence d’utiliser
ce type de structures non seulement pour l’amélioration des effets intrinsèques de la molécule,
mais également pour la sensibilisation des cellules à d’autres agents thérapeutiques lors de
traitements combinatoires.
173
Histone Deacetylase Inhibitor-Polymer Conjugate
Nanoparticles for Acid-Responsive Drug Delivery
Iza Denis1, Fatima el Bahhaj3, Floraine Collette2, Régis Delatouche3, Fabien Gueugnon1,
Daniel Pouliquen1, Loic Pichavant2, Valérie Héroguez2, Marc Grégoire1, Philippe
Bertrand3*, Christophe Blanquart1*.
1. Inserm, U892, Nantes, F-44000, France; CNRS, UMR 6299, Nantes, F-44000, France;
University of Nantes, Nantes, F-44000, France. 8 quai Moncousu, 44007 Nantes cedex 1,
France.
2. Laboratoire de Chimie des Polymères Organiques. CNRS, UMR 5629, Bordeaux. 16
Avenue Pey-Berland, F-33607 Pessac, France.
3. Institut de Chimie des Milieux et Matériaux de Poitiers. CNRS, UMR 7582, Poitiers. 4 rue
Jacques Fort, B27, F-86000 Poitiers, France.
KEYWORDS: polymeric nanoparticle, epigenetic inhibitor, drug delivery, controlled release,
stimuli-responsive.
174
ABSTRACT
We report the synthesis of acid–responsive polymeric nanoparticles (NPs) consisting
of a polymer-histone deacetylase inhibitor conjugate. An innovative aspect of this drug
delivery particle lies in the NP conjugation of a histone deacetylase (HDAC) inhibitor,
Tacedinaline (CI-994), introduced with a clickable acid-responsive prodrug during monomer
synthesis, prior to polymerization. The other novelty is due to the selected norbornene (NB)polyethylene oxide (PEO) macromonomer allowing standardization of the polymerization
process by Ring-Opening Metathesis Polymerization (ROMP) and functionalization through
azide-alkyne click chemistry. We demonstrate that the synthesized polymer gave 300 nm
core-shell spherical nanoparticles with low dispersity (0.04), high water dispersability thanks
to the PEO shell and well controlled HDAC inhibitor prodrug loading. Bioluminescence
Resonance Energy Transfer (BRET) assay in living cells and viability experiments
demonstrated efficient cellular internalization without additional chemistry, drug release
inside cells with restoration of the HDAC inhibition and induction of apoptosis. Such NPs
should minimize drug release in vivo during blood circulation and trigger intracellular
delivery after endocytosis, holding promises for improved efficacy of this class of epigenetic
inhibitors. This standardized synthesis paves the way for multifunctional nanoparticles
synthesis.
175
INTRODUCTION
Epigenetic modifications, which are responsible for heritable changes of genes activity
that are independent of changes in DNA sequence, are hallmark of several pathologies
including cancers. These modifications called epigenetic marks consist in reversible chemical
modifications on DNA and post translational modifications (PTMs) of histones, mediated by
the opposite actions of several protein families, defined as epigenetic marks writers, erasers
and readers[1]. All these modifications are used to fined-tune gene expression through changes
in chromatin structure. Deregulation of these subtle mechanisms is implicated in various
diseases including cancers[2], neurodegenerescence or metabolic disorders like diabetes. A
major disease-related mechanism where epigenetics is involved is the abnormal expression of
key regulatory genes. The epigenetic proteins families[3] encompass DNA methyl transferases
and cytosine oxidases leading to DNA demethylation, histone acetyl transferases (HAT) and
deacetylases (HDAC) whose opposite activities equilibrate histone acetylation, and histone or
protein arginine methyl transferases (HMT and PRMT) with the histone demethylases
counterparts (HDM). Other less studies PTMs like ubiquitylation have also their writers,
erasers and readers. HDAC are one of the most studied epigenetic targets for their over
expression in cancer cells leading to histone hypoacetylation involved in tumor suppressor
genes (TSG) down regulation, like p21[4]. Inhibitors of epigenetic targets have been
investigated in the past two decades as an alternative strategy to fight diseases resulting from
the over expressions or modified activity of these epigenetic proteins. HDAC inhibitors have
been the most studied and are nowadays considered alone or in combinations against various
diseases like cancer[5] in particular when current therapies failed[6,7]. HDACi induce an
increase of acetylated histones, leading to chromatin relaxation, increasing gene transcription.
HDACi have displayed interesting anti-tumour properties[8] due to the stimulation of TSG
expression but these molecules, like many other chemotherapeutics, have weaknesses limiting
their efficacy: fast metabolism, clearance, and lack of selectivity leading to side effects. Many
HDAC inhibitors are glucuronylated or can be degraded by oxidative processes[9,10] and
induced resistance has been reported. Tacedinaline (CI-994), is a member of the benzamiderelated HDACi group, for which some resistance has been described[11]. Tacedinaline inhibits
preferentially the nuclear HDAC class I (HDAC1-3)[12] directly participating in the
stimulation of TSG expression in cancer cell lines. Tacedinaline has higher half live than
other HDAC inhibitors, in part due to moderate protein binding in vivo, allowing for
determination of histone deacetylation effect in a wider time range as shown by [ 3H] radio176
labelled derivative[13]. Despite these long-ranging effects, the results obtained in clinic were
disappointing [7]. This demonstrates that stability is not the major weakness of this class of
drugs and probably that diffusion in tumor tissues and systemic toxicity also constitute major
barriers for clinical efficacy as well as possible resistance.
In the field of anticancer strategies with chemotherapeutics of limited bioavailability,
several types of drug delivery systems (DDS) have been proposed to protect the molecules
from metabolic activities, to circumvent solubility limitations and/or to selectively deliver
compounds in cancer cells in order to decrease systemic toxicity. Typical examples of
clinically used DDS are Doxil®, a liposome formulation containing doxorubicine, or
Abraxane®, an albumin-paclitaxel conjugate. Alternatively, polymer conjugates were also
investigated with a particular emphasis for pH-mediated release[14] through endocytosis[15].
pH-mediated release is a practical solution avoiding complex prodrug syntheses, like those
developed for glycosidases-based release. This latter solution also presents intrinsic
limitations when the glucuronidase strategy is used because glucuronidation is a metabolic
route for several HDAC inhibitors. With the more recent discovery of epigenetics targets and
the corresponding inhibitors, the literature shows that classical prodrugs were investigated,
with release mechanisms mostly based on esterases that can be found anywhere in vivo.
Indeed only few examples of DDS applications designed for epigenetics have been reported
that are mainly in reality for epigenetically repositioned compounds[16]. Developing novel
strategies to improve HDAC inhibitors benefits could thus come from delivery systems
adapted to such compounds. Several benefits can result from DDS[17], in particular their
internalization by endocytosis by-passing the P-glycoprotein (PGP) or Multidrug Resistance
like Protein mechanisms, a common limitation in chemotherapy observed with molecules
entering cells by diffusion. When applied to compounds like the HDAC inhibitor tacedinaline,
the DDS strategy can fail due to the limited compound solubility in the solvent conditions
used for preparing DDS micelles. Indeed, loading could be improved by converting HDAC
inhibitors into more soluble compounds by new design. This re-development stage could be
avoided by a simpler approach where current inhibitors are converted to prodrugs[18] soluble
in solvents used to prepared DDS and able to release the inhibitors by specific mechanisms
found in cancer cells, like acidification during endocytosis. In this respect we previously
synthesized the acid-responsive prodrug 3 (Scheme 1) for tacedinaline, with the
polyethylenoxide chain to improve water solubility[19]. This novel releasing system was
designed for cleavage at mildly acidic pH corresponding to the pH found in
177
endosomes/lysosomes generated during the endocytosis-mediated internalization. This type of
prodrug has demonstrated convenient stability at physiological pH and effective release at low
acidic pH. This tacedinaline prodrug has also shown good restoration of the initial HDAC
inhibition, correlated with cancer cell death. These results with small molecule prodrugs used
alone cannot totally exclude partial diffusion in vivo outside cancer cells and to normal cells.
It was thus envisioned to attach this prodrug to DDS able to enter cancer cells and protecting
the prodrug from external metabolism. With inhibitor release obtained in cancer cells, one can
expect reduced diffusion in normal cells, reducing unwanted side effects. Exploiting
endocytosis for DDS internalization allows for both DDS and the prodrug to be respectively
degraded and cleaved when exposed to the acidic endosome/lysosome pathways. Several
methods are available to connect prodrugs to DDS, a currently popular one being the
bioconjugation based on the click chemistry concept[20,21,
22]
involving the reaction between
alkyne and azide groups.
These rationals were the basis for initial introduction of an alkyne group on the PEOend chain of the prodrug system 3 to allow future grafting to DDS by click chemistry,
implying that the DDS should bear azide groups. Within the several polymeric nanoparticles
systems available[23] living RingOpening Metathesis Polymerization (ROMP) has recently
emerged as an alternative method to produce therapeutic DDS and offers opportunities for
well-defined spherical core-shell polymeric nanoparticles. This method allows for copolymers
synthesis[24,25], general functionalization by the click chemistry concept[26], chemical
modifications for improved cellular internalization[27,28] adding folate targeting[29], and
pH[30,31] or thermo-responsive release[32]. We demonstrated that such biopolymers can be
obtained from macromonomers adapted to the click chemistry reaction and that the final
nanoparticles can natively enter cancer cells by endocytosis without any additional
chemistry[33,34].
We hypothesized that the generic azido-norbornenyl-PEO macromonomer 4 (Scheme
1) involved in our ROMP-DDS synthesis could be made functional with our alkyne-bearing
tacedinaline acid-responsive prodrug 3[19]. In this contribution we report our investigations in
the synthesis of such pH responsive tacedinaline-bearing DDS and its physical and chemical
characterizations. Delivery in cells followed by the restoration of HDAC inhibition was
confirmed, correlated with the anti-tumor properties on malignant pleural mesothelioma
(MPM) and lung adenocarcinoma (ADCA) cancer cells, two forms of aggressive thoracic
178
cancers, whose first line chemotherapies gave poor results. These experiments confirmed that
the prodrug properties were not altered by the grafting on the DDS.
MATERIALS AND METHODS
Materials
Ethanol (96%, purissium grade pur, Xilab), dichloromethane (96%, purissium grade
pur, Xilab) and dimethyl formamide (DMF, 99.8%, Panreac) were degassed before use. The
solvents were degassed according to the freeze-pump-thaw procedure. Tetrahydrofuran (THF,
J.T.
Baker)
diethyl
ether
anhydrous
(J.T.
Baker),
N,N,N',N'',N''-
pentamethyldiethylenetriamine (PMDETA, 99%, Aldrich), Na2SO4 (99%, Alfa Aesar),
norbornene (99% GC, Aldrich), Grubbs first generation catalyst Cl2(PCy3)2Ru=CHPh
(Aldrich, stored in a glovebox under Argon atmosphere), dodecane (99%, Aldrich),
triethylamine (TEA, 99%, Acros Organics), ethyl vinyl ether (99% stab. with ca. 0.1% N,Ndiethylalanine, Alfa Aesar), Trizma®base (99.9%, Aldrich) were used without further
purification. CuBr (98%, Aldrich) was purified in acetic acid and stored under inert
atmosphere (glovebox). Macromonomers 4 and 5 were prepared according to procedures
described in the literature. The polymerization reaction was carried out at room temperature
under inert atmosphere (glovebox). 1H NMR studies were completed via a Bruker
spectrometer 400 MHz, in CDCl3 or in acetone D6 at 25 °C. Size exclusion chromatography
(SEC) equipment consists of a JASCO HPLC pump type 880-PU, TOSOHAAS TSK gel
columns, a Varian refractive index detector, and a JASCO 875 UV-vis absorption detector,
with THF as the mobile phase and the calibration curve was performed using polystyrene
standards. Gas chromatography measurements were performed with a Varian 3900 apparatus
having a Factor Four Capillary Column VF-1ms 15Mx0.25MM ID DF=0.25 (injector:
T=250°C ; oven: Initial temperature : 50°C during 2 min followed by a temperature rate of
10°C/min until 250°C ; detector: T=300°C). DLS measurements were performed using a
MALVERN zetasizer Nano ZS equipped with He-Ne laser (4 mW and 633 nm). Before
measurements, latexes were diluted about 800 times to minimize multiple scatterings caused
by high concentration. The scattering angle used was 173°.
Methods
179
Prodrug-functionalized macromonomer 6 (Scheme 1, Figure 1)
Alkyne 3 (394 mg, 0.55 mmol), macromonomer 5 (1.445 g, Mn=3933 g.mol-1, 0.37
mmol), and PMDETA (153 µL, 0.74 mmol) were dissolved in of DMF (15 mL) and the
mixture degassed according to the freeze-pump-thaw procedure. CuBr (105 mg, 0.74 mmol)
was added under inert atmosphere (glovebox). The mixture was stirred during 4 days under
argon at room temperature. CH2Cl2 (90 mL) was added to the reaction mixture and the
solution washed with H2O (10x60 mL), dried (Na2SO4), filtrated and the solvent evaporated.
The crude macromonomer 6 was dissolved in THF (50 mL) and precipitated in diethyl ether
(250 mL), filtrated, dried under vacuum and finally lyophilized in dioxane. The
macromonomer 6 was stored under argon before use. 1H NMR in Acetone D6: (
in ppm)
9.44 (m) ; 8.05 (d, J=8.5 Hz, 2H); 7.94 (s, 1H); 7.85 (s, 1H); 7.78 (d, J=8.6 Hz, 2H); 7.65 (d,
J=7.6 Hz, 4H); 7.3-7.1 (m, 8H); 6.75-6.55 (m, 2H); 6.15 (d; J=7.9 Hz, 2H); 6.13-6.01 (m,
3H); 4.57 (s; 2H); 4.55-4.45 (m, 4H); 3.60 (m, 275H); 3.5-2.9 (m; H cycles NB); 2.14 (s; 3H).
Functionalization yield of macromonomer 6 (Fprodrug) was 88%; SEC in THF: (RI) Mn=3390
g.mol-1 (styrene eq.); PDI=1.09.
1H
NMR Based calculation of macromonomer 6 molecular weight Mn
The macromonomer 6 can be view as a mixture of unfunctionalized (12%) and
functionalized (88%) macromonomers. The number average molecular weight (MnNMR) of 6
can be calculated by using the 1H NMR spectra following the equation:
MnNMR = 0.88 x (MNB + MEO x DPn + MProdrug ) + 0.12 x (MNB + MEO x DPn + MOH)
MnNMR = 0.88 x (123 + (44 x 85) + 785) + 0.12 x (123 + (44 x 85) + 45) = 4559 g mol-1
where MNB is the molecular weight of the PEO -functionalization, MEO is the molecular
weight of an ethylene oxide unit, MProdrug is the molecular weight of -end group of
macromonomer 6, MOH is the molecular weight of -end group of unfunctionalized
macromonomer 4. DPn is the number average polymerization degree DPn = (IPEO/4)/(INB/2),
IPEO is the integration of the protons signal of the PEO chain, INB, is the integration of the
signals of the ethylenic protons of the norbornenyl entity.
Synthesis of NPs 7 (Scheme 1, Figure 2)
Grubbs first generation complex (10 mg, 1.2 10-5 mol) was dissolved in CH2Cl2/EtOH
(5 mL, 50/50% v/v). Both norbornene (387 mg, 4.1 10-3 mol) and macromonomers 4 (125 mg
180
3.2 10-5mol) and 6 (190 mg, 4.2 10-5mol) were first dissolved in CH2Cl2/EtOH (7 mL, 35/65%
v/v) and added to the catalyst solution. NEt3 (0.1 mL) was added to maintain the pH solution
higher than 7. The mixture is stirred during 24 h. At the end of polymerization Ruthenium
end-capped chains were deactivated by addition of 0.3 mL of ethyl vinyl ether. The
conversion of macromonomers was determined by SEC with dodecane as internal standard
(SEC retention times: tSECmacromonomers = 18.75 min; tSECdodecane = 31.70 min). The conversion of
NB was determined by gas chromatography with dodecane as internal standard (GC retention
times: tGCNb = 1.77 min; tGCdodecane = 8.55 min).
Cell culture
The pleural mesothelial cell line, MeT-5A, and the lung adenocarcinoma cell line,
A549, were obtained from American Type Culture Collection (ATCC). The mesothelioma
cell lines Meso13, Meso34 and Meso56 and the lung adenocarcinoma cell lines ADCA 153
and ADCA 72 were established from the pleural fluids of patients
[40]
. All cell lines were
maintained in RPMI medium (Invitrogen) supplemented with 2 mM L-glutamine, 100 IU/ml
penicillin, 0.1 mg/ml Streptomycine and 10% heat inactivated fetal calf serum (FCS)
(Eurobio).
BRET experiments (Figure 3)
MeT-5A cells were seeded at a density of 1.5x105 cells per 35 mm dish. Transient
transfections were performed 1 day later using Attractene (Qiagen), according to the
manufacturer’s protocol. For BRET experiments, MeT-5A cells were transfected with 0.6 µg
Rluc-Brd cDNA and 1 µg YFP-fused histone H3 cDNA[35]. One day after transfection, cells
were transferred into 96-well microplates (microplate 96 well, white, Berthold Technologies)
at a density of 3x104 cells per dish. All BRET measurements were performed the following
day at room temperature using the Mithras LB 940 microplate analyzer (Berthold
Technologies). Cells were pre-incubated for 15 min in PBS in the presence of 2.5 µM
coelenterazine (Interchim), following which light-emission acquisition at 485 and 530 nm was
carried out. Plates were measured five times. The BRET signal was expressed in milliBRET
units (mBu). The BRET unit has been defined previously as the ratio 530/485 nm obtained
when the two partners are present, corrected by the ratio 530/485 nm obtained under the same
experimental conditions, when only the partner fused to Renilla luciferase is present in the
assay.
181
Determination of cell viability (Figure 4)
Cell growth was monitored using Uptiblue reagent (Interchim). Reduction of this
compound by the cell results in the formation of a fluorescent compound quantified by
measuring fluorescence at 595 nm after excitation at 532 nm using a Typhoon apparatus (GE
Healthcare). Cells were seeded in 96-well plates at a density of 5x103 cells/well in culture
medium. Twenty-four hours later, compounds solutions or nanoparticles were added for 72 h.
Uptiblue (5%, v/v) was then added to the culture medium for 2 h at 37 °C. Fluorescence was
quantified by measuring emission at 595 nm after excitation at 532 nm using a Typhoon
apparatus.
Evaluation of temperature on NPs 7 toxicity (Figure 5)
Cells were seeded in 96-well plates at a density of 5x103 cells/well in culture medium.
Twenty-four hours later, cells were treated with 1.72 mg/ml NPs 7 (85 µM CI-994) for 8 h at
4°C or 37°C. Then, media were changed and cells were incubated at 37°C for additional 64 h.
Cell viability was evaluated using Uptiblue cell counting reagent as described above.
Detection of apoptosis (Figure 6)
Apoptosis was quantified using the Annexin V-fluorescein-isothiocyanate (FITC)
apoptosis detection kit (Becton Dickinson), which labels phosphatidylserine externalized in
the early phases of apoptosis. Cells were seeded at a density of 1x105 per well of 6-wells
plates and treated with NPs 7 1.72 mg/mL (85 µM CI994). After 48 h of culture, floating and
adherent cells were combined, washed twice with cold PBS, resuspended in 100 μL of
annexin binding buffer (10 mmol/L Hepes, 140 mmol/L NaCl, 2.5 mmol/L CaCl 2, pH 7.4),
incubated for 15 min at room temperature with 2.5 μL of Annexin V-FITC and 2.5 μL of
propidium iodide and analyzed by flow cytometry (FACSCalibur; Becton Dickinson). Ten
thousand events were collected and analyzed with the FACS Flowjo Software.
Statistical analysis
Statistical analyses were performed using GraphPad prism, (Prism 5, Windows).
Statistical comparisons were made using an unpaired t-test.
RESULTS AND DISCUSSION
Synthesis
182
The key macromonomer 6 (Scheme 1) was synthesized by azide-alkyne click
chemistry from macromonomer 5[34] and derivative 3[19] best suited for tacedinaline release at
endosomal/lysosomal pH 5. Good yields in Huisgen' cycloaddition required 2 equivalents of
CuBr and the ligand PMDETA and 1.5 equivalents of the alkyne 3. The formation of the
macromonomer 6 was confirmed by 1H NMR (Figure 1). Protons signals for the prodrug part
were assigned according to the 1H NMR of the starting prodrug 3, as no major shifts were
observed after cycloaddition, except disappearance of the alkyne proton signal. For the PEONB part, characteristic proton signals were observed: the NB double bond (=5.9-6.2 ppm,
protons a), PEO chain (=3.2-4.0 ppm, protons b), and the new triazole ring signal (=7.8
ppm, proton e). Comparing the PEO protons b and NB protons a integration ratios before and
after the funtionalization, we could assume the conservation of the polymerizable part in the
macromonomer 6. Regarding the integration ratios for triazole ring proton e and the NB
double bond protons a signals, a functionalization yield of about 88% could be calculated.
Grubbs I catalyzed copolymerization of macromonomers 4 and 6 with NB 1 gave the
copolymer 7 forming well defined spherical NPs in our dispersed media conditions with a
hydrophobic polynorbornene core and a hydrophilic PEO shell.
The composition of the latex was determined according to consumed starting
monomer and macromonomers with a reported method detailed in experimental section
[34]
.
NB is polymerized to completion while overall macromonomer conversion () was about
90%. It is assumed than both macromonomers 4 and 6 are consumed with the same rate (we
approximate than the -functionalization did not modify the reactivity of the macromonomers
4 and 6). The amount of prodrug per gram of polymer can be calculated according to the
following formula:
µ
where FProdrug is the functionalization yield of macromonomer 6 (0.88), n6 is the amount of
macromonomer 6 introduced for the NPs synthesis, isthe overall conversion of the
macromonomers 4 and 6, mi is the weight of the compound i introduced for the synthesis of
the NPs.
The polymer concentration can be estimated with the equation:
183
where V is the volume of the latex solution (12 mL).
Taking into account the amount of prodrug per gram of polymer and the polymer
concentration the prodrug concentration can be evaluated to 2.13 µmol/mL.
The NPs 7 were then characterized by DLS (Figure 2). The average size of the NPs in
CH2Cl2/EtOH as solvents was 350 nm with a narrow dispersity (0.04). The amount of linked
prodrug per NP (nProdrug/NP) can also be calculated by multiplying the number of prodrug per
gram of polymer with the weight of a NP using the following equation[36]:
where VNP is the volume of a NP (VNP = DNP3/6) (Figure 2), ρNP is the density of the NPs
approximated to equal to 1 g/mL, NA is the Avogadro constant
The NPs were transferred in an aqueous solution of Trizma®base (10 mM) by
successive evaporation and an ultrafiltration step to give a final latex concentration of 6.9
mg/mL (prodrug concentration: 0.336 µmol/mL). The final particle size in aqueous solution
was 320 nm. With non-functionalized NPs[34], the PEO shell expansion tends to increase the
NP size in aqueous medium. Functionalized NPs 7 size decreased after their transfer in water
due to the hydrophobic nature of the prodrug, which balance the PEO expansion.
NPs 7 should then be submitted to biological endocytosis-mediated internalization in
cells to release the bioactive compound 2 upon acidification. Thus inhibitor 2 being
covalently linked to NPs 7 by a pH responsive group, exposition to acidic vesicles like
endosomes/lysosomes during endocytosis should give a functional release. This in turn will
give diffusion of compound 2 in cells and restoration of HDAC inhibition. Unfunctional NPs
8 used as biological negative control was described previously [34].
To confirm the NPs internalization and HDAC release hypothesis, we used a
bioluminescent resonance energy transfer (BRET) assay developed by some of us based on
interactions between acetylated histones and bromodomain (BrD)-containing proteins[37]
(Figure 3). In short, cells were transfected with two cDNA, one coding for BrD fused with a
luciferase and one coding for histone H3 fused with yellow fluorescent protein, leading to the
184
expression of the two recombinant proteins in cell nucleus. HDAC inhibition results in higher
levels of acetylated histones, increased interactions of the two tagged proteins and in turn
increased BRET signal. The BRET response being obtained only if the compounds of interest
are entering the cells to inhibiting HDACs, this assay can indicate both the cellular
internalization of the nanoparticles and the release of the HDAC inhibitors of interest if the
BRET signal is increased. Cells were treated for 16h with increasing concentrations of CI-994
2 or NPs 7 to give effective BRET signal induction. Free CI-994 induced a strong BRET at
concentration below 25 M that decreased for higher concentrations, indicating the
appearance of a possible toxicity (Figure 3A). In contrast, the BRET signal induced by NPs 7
was lower but maintained in relative higher amount even at higher equivalent CI-994
concentrations.
From these results of dose response experiments, BRET kinetics experiments were
performed over 48h with ADCA and MPM cells (Figure 3B) treated with 10µM CI-994 and
1.72 mg/mL NPs 7. After 24h treatment, HDAC inhibition effect for CI-994 was stabilized
and then decreased after 36h while the effect of NPs 7 was increased all along the experiment
(Figure 3B). Figure 3C indicates that the maximum BRET signal induction obtained with CI994 and NPs 7 during the kinetic experiments were similar but not at the same time. The
release kinetic obtained with NPs 7 is similar to the one obtained with the prodrug alone
[19]
demonstrating that the acido-sensitive release property of CI-994 is not altered in the DDS.
These results showed that free CI-994 is able to rapidly enter cells compared to NPs 7 but
with a limited activity over time, a result coherent with its half live (around 1 day)[7]. In
contrast, NPs 7 effect is continuous over time suggesting that the internalization barrier and
subsequent release are two events delaying the BRET signal induction. When cancer cells are
treated with HDAC inhibitor the expected biological effect is cell death induction mediated by
stimulation of TSG. Thus the restored HDAC inhibition can be correlated with toxicity
towards cancer cells. To verify this hypothesis, we used 3 lung ADCA and 3 MPM cell lines,
representing 2 types of aggressive thoracic cancer cells. In figure 4, toxicity of NPs 7 was
compared with free CI-994 against ADCA and MPM cell lines and unfunctional NPs 8
(Scheme 1) used as reference. No toxic effects of NPs 8 at 2 mg/mL were observed on the two
types of cancer cell lines tested. The decrease of ADCA cells viability (Figure 4A) obtained
with increasing doses of NPs 7 was similar to the effect of free CI-994 demonstrating that CI994 activity was not altered by the grafting to the DDS. However, on MPM cells (Figure 4B),
toxicity of NPs 7 was lower than the one of free CI-994. In these experiments, the decreased
185
viability induced by NPs 7 can be exclusively attributed to CI-994 release regarding the
polymer concentration. Indeed, NPs 7 were used at a polymer concentration of 1.72 mg/mL
which is lower than the nontoxic NPs 8 concentration tested (2 mg/mL).
The requirement of an active internalization of NPs 7 to obtain toxicity was
demonstrated by viability experiments performed on cells treated with NPs 7 or CI-994
(Figure 5) at 4°C to block active internalization mechanisms and at 37°C as control. Effect of
NPs 7 on cell viability was completely abolished at 4°C compared to 37°C for the two types
of cancer cell lines tested. This result demonstrated that NPs 7 need an active mechanism for
internalization, likely clathrin-independent receptor-mediated macropinocytosis as we
previously described
[33]
and excluded an eventual spontaneous release of CI-994 in the
medium.
Apoptosis of cancer cells is increased upon HDACi treatments in vitro. Treatments of
ADCA and MPM cell lines with 1.72 mg/mL NPs 7 (85µM CI-994) for 48 h (Figure 6)
showed effective apoptosis revealed by Annexin-V labelling. As observed for viability, lung
ADCA cells were more sensitive to NPs 7-induced apoptosis than MPM cells. The difference
of sensitivity of the two types of cancer cell lines tested towards NPs 7 can be explained by
the low endocytic activity of mesothelial cells[38] confirmed by our previous work[34] in which
we showed that MPM cells displayed a weak NPs endocytic capacity compared to lung
ADCA cells. This difference of properties results here, in a lower level of intracellular CI-994
and then to a lower toxicity of NPs 7 on MPM cells compared to lung ADCA cells.
CONCLUSIONS
We described an easy and effective method to introduce acid-responsive HDACi
prodrug on azido-PEO-NB macromonomers by click chemistry as an entry toward
nanoparticles prepared by ROMP. This synthetic method should allow accessing
multifunctional particles if more specific cell targeting or internalization is required by adding
dedicated functions on the starting azido-macromonomer, like RGD substrate of integrins or
cell penetrating peptides. The NB and PEO parts of the macromonomer allow for the
formation of well-defined core (NB)-shell (PEO) spherical nanoparticles with homogenous
300 nm sizes, all parameters not modified by the introduction of the prodrug component. The
positioning of the PEO part at the surface of the nanoparticles introduce native stealth
properties that may also not be modified by the introduction of the prodrug component
present in only 1 % relative to the NB part. We demonstrated that HDACi vectorization is a
186
viable alternative with such NPs entering cells by an active mechanism without additional
chemistry. The release of the HDAC inhibitor in cells was validated by our BRET assay and
this release was correlated with cell viability and apoptosis. Several other classes of
compounds are currently studied as epigenetic target inhibitors in various diseases (inhibitors
of histone methylation and demethylation, DNA methyl transferases, protein arginine methyl
transferases, sirtuins). This work opens the way for future delivery of these emerging
chemotherapeutics. In a previous study [33], we also demonstrated that a fluorescent version of
this DDS can accumulate mainly in tumor in vivo by exploiting the enhanced permeability
and retention effect (EPR) described in tumor tissues[39], being thus a promising carrier to
circumvent clearance and metabolism of chemotherapeutics and to improve the clinical
benefit of HDACi in particular for solid tumor therapy by decreasing side effects.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by Agence Nationale de la Recherche (ANR) for RD, FG
and FC grants (ANR-08-PCVI-030), Région Poitou-Chanrentes for FEB grant, Centre
National de la Recherche Scientifique (CNRS), the Ligue National Contre la Cancer for ID
grant, the Ligue Contre le Cancer: committees of Morbihan, Sarthe, Vendée et LoireAtlantique, Poitou-Charentes, ARSMESO44, Nantes University Hospital, and COST action
TD0905.
ABREVIATIONS
DDS, drug delivery system; HDAC, histone deacetylases; SEC, size exclusion
chromatography; TLC, thin layer chromatography; NB, norbornene; PEO, polyethylene
oxide; ROMP, Ring-Opening Metathesis Polymerization; BRET, Bioluminescence Resonance
Energy Transfer; PTM, post translational modifications; TSG, tumor suppressor genes;
PMDETA, pentamethyldiethylenetriamine; ADCA, Adenocarcinoma; MPM, Malignant
Pleural Mesothelioma.
REFERENCE
1. D. Dhanak, Cracking the Code: The Promise of Epigenetics, ACS Med. Chem. Lett. 2012,
3: 521−3.
2. P.A. Jones, S.B. Baylin, The fundamental role of epigenetic events in cancer, Nat. Rev.
Genet. 2002, 3: 415-28.
187
3. C. H. Arrowsmith, C. Bountra, P. V. Fish, K. Lee, M. Schapira, Epigenetic protein
families: a new frontier for drug discovery, Nature Rev. Drug Discov. 2012, 11:
384-400.
4. M. A. Glozak, E. Seto, Histone deacetylases and cancers, Oncogene 2007, 26: 5420-32.
5. A.A. Lane and B.A. Chabner, Histone deacetylase inhibitors in cancer therapy, J. Clin.
Oncol. 2009, 27: 5459-68
6. S. S. Nair, R. Kumar, Chromatin remodeling in cancers: a gateway to regulate gene
transcription, Mol. Oncol. 2012, 6: 611-9.
7. N. Martinet, P. Bertrand, Interpreting clinical assays for histone deacetylase inhibitors,
Cancer Management and Research 2011, 3: 117-41.
8. P. Bertrand, Inside HDAC with HDAC inhibitors, Eur. J. Med. Chem. 2010, 45: 2095116.
9. R. A. Parise, J. L. Holleran, J. H. Beuner, S. Ramalingam, M. J. Egorin, A liquid
chromatography-electrospray ionization mass spectrometry assay for
quantitation of the histone deacetylase inhibitor, vorinostat (suberoyl anilide
hydroxamic acid, SAHA), and its metabolites in human serum, J. Chrom. B 2006,
840: 108-15
10. L. Du, D. G. Musson, A. Q. Wang, Stability studies of vorinostat and its two
metabolites in human plasma, serum and urine, J. Pharm. Biomed. Anal. 2006, 42:
556-64
11. I. Gojo, A. Jiemjit, J. B. Trepel, A. Sparreboom, W. D. Figg, S. Rollins, M. L. Tidwell, J.
Greer, E. J. Chung, M.-J. Lee, S. D. Gore, E. A. Sausville, J. Zwiebel, J. E. Karp,
Phase 1 and pharmacologic study of MS-275, a histone deacetylase inhibitor, in
adults with refractory and relapsed acute leukemias. Blood 2007, 109:2781-90.
12. N. Khan, M. Jeffers, S. Kumar, C. Hackett, F. Boldog, N. Khramtsov, X. Qian, E. Mills,
S. C. Berghs, N. Carey, P. W. Finn, L. S. Collins, A. Tumber, J. W. Ritchie, P. B.
Jensen, H. S. Lichenstein, M. Sehested, Determination of the class and isoform
selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors, Biochem. J. 2008, 409:
581-9
13. Y. Wang, Y. L. Zhang, K. Hennig, J. P. Gale, Y. Hong, A. Cha, M. Riley, F. Wagner, S. J.
Haggarty, E. Holson, J. Hooker, Epigenetics 2013, 8: 756-64.
14. a) M. Hruby, C. Konak, K. Ulbrich, Polymeric micellar pH-sensitive drug delivery
system for doxorubicin, J. Control. Release 2005, 103: 137-48. (b) L.M. Kaminskas,
B.D. Kelly, V.M. McLeod, G. Sberna, D.J. Owen, B.J. Boyd, C.J.H. Porter,
Characterisation and tumour targeting of PEGylated polylysine dendrimers
bearing doxorubicin via a pH labile linker, J. Control. Release 2011, 152: 241-8.
15. G. Scita, P. P. Di Fiore, The endocytic matrix, Nature 2010, 463: 464-73.
16. F. El Bahhaj, F. J. Dekker, N. Martinet, P. Bertrand, Drug Discov. Today 2014, doi:
10.1016/j.drudis.2014.03.017.
17. E. Markovsky, H. Baabur-Cohen, A. Eldar-Boock, L. Omer, G. Tiram, S. Ferber, P. Ofek,
D. Polyak, A. Scomparin, R. Satchi-Fainaro, Administration, distribution,
metabolism and elimination of polymer therapeutics, J. Controlled Release 2012,
161: 446–60.
18. Y. Ishii, Y. Hattori, T. Yamada, S. Uesato, Y. Maitani, Y. Nagaoka, Histone deacetylase
inhibitor prodrugs in nanoparticle vector enhanced gene expression in human
cancer cells. Eur. J. Med. Chem. 2009, 44: 4603-10.
19. R. Delatouche, I. Denis, M. Grinda, F. El Bahhaj, E. Baucher, F. Collette, V. Héroguez,
M. Grégoire, C. Blanquart, P. Bertrand, Eur. J. Pharm. Biopharm. 2013, 85: 862-72.
188
20. C.D. Hein, X.-M. Liu, D. Wang, Click Chemistry, a Powerful Tool for Pharmaceutical
Sciences, Pharm. Res. 2008, 25: 2216-30.
21. R.Huisgen, 1,3-dipolar cycloadditions, Past and future, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
1963, 2: 565-98.
22. H. C. Kold, M. G. Fin, K. B. Sharpless, Click chemistry: Diverse chemical function
from a few good reactions, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 40: 2004-21.
23. A. Nori, J. Kopecek, Intracellular targeting of polymer-bound drugs for cancer
chemotherapy, Adv. Drug Delivery Rev. 2005, 57: 609.
24. K. Nomura, M. M. Abdellatif, Precise synthesis of polymer containing end groups by
living ring-opening metathesis polymerization (ROMP): Efficient tools for
synthesis of block/graft copolymers, Polymer 2010, 51: 1861.
25. J. K. Pontrello, M. J. Allen, E. S. Underbakke, L. L. Kiessling, Solid-phase synthesis of
polymers using the ring-opening metathesis polymerization, J. Am. Chem. Soc.
2005, 127: 14536-7.
26. J. A. Johnson, Y. Y. Lu, A. O. Burts, Y. Xia, A. C. Durrell, D. A. Tirrell, R. H. Grubbs,
Drug-loaded, bivalent-bottle-brush polymers by graft-through ROMP,
Macromolecules 2010, 43: 10326-35.
27. E. M. Kolonko, L. L. Kiessling, A polymeric domain that promotes cellular
internalization, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130: 5626-7.
28. E. M. Kolonko, J. K. Pontrello, S. L. Mangold, L. L. Kiessling, General synthetic route
to cell-permeable block copolymers via ROMP, J. Am Chem Soc. 2009, 131: 732733.
29. K. Miki, K. Oride, S. Inoue, Y. Kuramochi, R. R. Nayak, H. Matsuoka, H. Harada, M.
Hiraoka, K. Ohe, Ring-opening metathesis polymerization-based synthesis of
polymeric nanoparticles for enhanced tumor imaging in vivo: Synergistic effect of
folate-receptor targeting and pegylation, Biomaterials 2010, 31: 934-42
30. R. N. Vijayakameswara, R. M. Shivshankar, K. Abhinoy, D. S. Jayasri, S. Raja,
Norbornene derived doxorubicin copolymers as drug carriers with pH responsive
hydrazone linker, Biomacromolecules 2012, 13: 221.
31. L. Pichavant, C. Bourget, M. C. Durrieu, V. Héroguez, Synthesis of pH-sensitive
particles for local delivery of an antibiotic via dispersion ROMP, Macromolecules
2011, 44: 7879-87.
32. A. C. Le Meur, C. Aymonier, V. Héroguez, Breathing nanoparticles for controlling
thermo-sequential on/off drug delivery, ChemPhysChem. 2012, 13: 692-4.
33. F. Gueugnon, I. Denis, D. Pouliquen, F. Collette, R. Delatouche, V. Héroguez, M.;
Grégoire, P. Bertrand, C. Blanquart, Nanoparticles produced by ring-opening
metathesis polymerization using norbornenyl-poly(ethylene oxide) as a ligandfree generic platform for highly selective in vivo tumor imaging,
Biomacromolecules 2013, 14: 2396-402.
34. F. Colette, R. Delatouche, C. Blanquart, F. Gueugnon, M. Gregoire, P. Bertrand, V.
Héroguez, Easy and effective method to produce functional particles for cellular
uptake, J. Polym. Sci., Part A 2012, 51: 176-89.
35. C. Blanquart, M. François, C. Charrier, P. Bertrand, M. Gregoire, Pharmacological
characterization of histone deacetylase inhibitor and tumor cell-growth inhibition
properties of new benzofuranone compounds, Curr. Cancer Drug Targets 2011, 11:
919-28.
36. L. Pichavant, G. Amador, C. Jacqueline, B. Brouillaud, V. Héroguez, M. C. Durrieu, pHcontrolled delivery of gentamicin sulfate from orthopedic devices preventing
nosocomial infections, J. Controlled Release 2012, 162: 373-81.
189
37. D. S. Hewings, T. P. C. Rooney, L. E. Jennings, D. A. Hay, C. J. Schofield, P.E. Brennan,
S. Knapp, S. J. Conway, Progress in the Development and Application of Small
Molecule Inhibitors of Bromodomain−Acetyl-lysine Interactions, J. Med. Chem.
2012, 55: 9393-413.
38. S. E. Mutsaers, The mesothelial cell, Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004, 36: 9-16.
39. H. Maeda, Tumor-selective delivery of macromolecular drugs via the EPR effect:
background and future prospects, Bioconjugate Chem. 2010, 21: 797-802.
190
RÉSULTATS - Article III – Article IV
FIGURES AND SCHEMES CAPTIONS
Scheme 1: Nanoparticles synthesis*.
*: i) a) MsCl; b) NaN3 ii) CuBr (2eq.), PMDETA (2eq.), 3 (1.5 eq.) iii) 4 (1% mol), 1 (98%
mol) and 6 (1% mol), Grubbs I, CH2Cl2/EtOH 35/65 v/v, 20°C, 24h.
Figure 1: 1H NMR of macromoner 6.
Figure 2: Distribution of the NPs 7 size by intensity measure by DLS in the solvent mixture
(EtOH/CH2Cl2) and in water.
Figure 3: Pharmacological characterization of NPs 7 using BRET in living cells. MeT-5A
cells were transfected with phRluc-C1 BrD and pEYFP-C1 histone H3 expression vectors. A)
Cells were treated for 16 h with increasing doses of CI-994 and NPs7. B) Cells were treated
with 10µM CI-994 or 1.72 mg/mL NPs 7 (85µM CI-994) during 8, 24h, 36 h or 48h. Results
were expressed as the induced-BRET signal. C) Graphic represents the maximal inducedBRET signal measured in kinetic experiment for each molecule independently of the time of
treatment. Results are the means ± S.E.M of three independent experiments.
Figure 4: Effect of CI-994, NPs 7 and 8 on A) lung ADCA and B) MPM cells viability. Lung
ADCA and MPM cells were treated with 2 mg/ml of NPs 8 and increasing concentrations of
CI-994 or NPs 7 for 72 h. Results are the means ± S.E.M of the results obtained on three
different lung ADCA and MPM cell lines. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
Figure 5: Temperature effect on cells viability after treatment with NPs 7 of A) lung ADCA
and B) MPM cells with 1.72 mg/mL NPs 7 (85µM CI-994) for 8 h at 4°C or 37°C. Then,
media were changed and cells were incubated at 37°C for additional 64 h. Cell viability was
expressed as the percent of control. Results are the means ± S.E.M of the results obtained on
three different lung ADCA and MPM cell lines. *p<0.05
Figure 6: Apoptosis of A) ADCA and B) MPM cell lines treated with 1.72 mg/mL NPs 7
(85µM CI-994) for 48 h. Apoptosis was evaluated using Annexin-V-FITC labeling and flow
cytometry analysis. Results are the means ± S.E.M of the results obtained on three different
lung ADCA and MPM cell lines. *p<0.05
191
FIGURES AND SCHEMES
Scheme 1
3
3
1
2
ii, 3
57
57
4, R = OH
5, R = N3
i
6
430
1+ 4
3
4
57
iii, 1, 4
3
7
57
3
iii
72
430
8
65
192
Figure 1
193
Figure 2
194
Figure 3
195
Figure 4
ADCA
A
NPs 7
CI-994
**
*** ***
**
**
***
MPM
B
NPs 7
**
*
CI-994
**
**
***
**
196
Figure 5
Figure 6
197
Vorinostat-Polymer Conjugate Nanoparticles for
Acid-Responsive Delivery and Passive Tumor
Targeting.
Daniel Pouliquen1, Loic Pichavant2, Valérie Héroguez2, Marc Grégoire1, Philippe
Bertrand3,4*, Christophe Blanquart1,4*.
1. Inserm, UMR 892, Nantes, F-44000, France; CNRS, UMR 6299, Nantes, F-44000, France;
University of Nantes, Nantes, F-44000, France. 8 quai Moncousu, 44007 Nantes cedex 1,
France.
Avenue Pey-Berland, F-33607Pessac, France.
Jacques Fort, B27, F-86000 Poitiers, France.
4. Réseau épigénétique du Cancéropôle Grand Ouest.
KEYWORDS: polymeric nanoparticle, vorinostat, drug delivery, controlled release, pHresponsive.
ABSTRACT
In vivo histone deacetylase inhibition by Vorinostat at clinically acceptable dosing is
limited by its poor pharmacokinetics properties. A new type of non-toxic pH-responsive
delivery system has been synthesized by Ring-Opening Metathesis Polymerization, allowing
in vivo selective distribution in tumor leading to histone reacetylation by Vorinostat. The
delivery system is synthesized by generic click chemistry, possesses native stealth properties
for passive tumor targeting, and does not need additional chemistry for cellular
internalization.
198
1. INTRODUCTION
Vorinostat (Figure 1, suberoyl anilide hydroxamic acid: SAHA) is approved by FDA
for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma[1] because of its potent activity based on
inhibition of the zinc-dependent histone deacetylases (HDAC), one of the epigenetic protein
targets over expressed in cancer cell lines. The HDAC inhibitory effect of SAHA at
micromolar concentrations leads to reacetylation of chromatin with in turn stimulation of
tumor suppressor gene expression, inducing differentiation[2], growth arrest at G1 and G2-M
cell cycle[3] or apoptosis. Several clinical trials have involved SAHA[4], alone or in
combination with conventional compounds to fight various types of cancers. A transcriptomic
study revealed that SAHA modifies the expression of 40% of all genes in cells, explaining
probably in part the side effects observed[5]. Like many other chemotherapeutics, SAHA is
rapidly metabolized[6] in vivo by glucuronidation[7] as well as oxidative degradation of the
alkyl chain to 4-anilino-4-oxobutanoic acid[8], and induced resistance has been described[9],
all leading to poor results in clinic.
To improve the therapeutic index of SAHA delivery strategies can be used[10,11] as
illustrated in figure 1. The advantages of drug delivery systems (DDS) are well established:
they can prolong half-life of the loaded compounds, have possibilities for multi-therapies,
help to circumvent resistance with by-passing the efflux pumps, can be modified for targeting
a specific cancer cell type and finally they can deliver compounds inside cells via
endocytosis[12] exploiting pH variations for release[13]. They can also be designed to achieve
passive tumor targeting due to the enhanced permeability and retention effect observed in
tumor tissue that does not exists in normal tissues[14]. Several epigenetic inhibitors have thus
been delivered by various means[15]. SAHA nanocarriers were developed such as
cyclodextrins[16] or poly(ethylene oxide) (PEO)-polylactic acid (PLA) copolymers[17]. Such
DDS have improved SAHA solubility, up to 40 fold with PEO-PLA when used with
intravenous (IV) injection in rats at 10 to 50 mg/kg of Vorinostat.
199
Fig. 1. Principle for SAHA-bearing polymeric nanoparticles syntheses and releasing
mechanism.
Most studies with DDS bearing HDACi are designed for in vitro testing or to determine
the pharmacokinetics in blood but the tumor targeting and the functional effect in vivo, e.g.
chromatine reacetylation in tumors, are not determined. To date, in vivo models for HDACi
delivery were used mainly for blood analysis and for models with mice bearing tumor
xenografts, the nanocarriers lacking fluorescent reporters useful for biodistribution studies. If
several models of cancer cells are available for in vivo studies, focus on cancers with poor
prognostic or inefficient care should be better considered. Finding solutions for such hard
cases could in turn give also better solutions for other types of cancers. Malignant
mesothelioma (MM) is a form of lung cancer caused by asbestos exposure[18]. The first line
therapy for MM is a combination of pemetrexed and cisplatin leading to only few months'
survival and all other single or combined treatments tested also failed with free or delivered
molecules. Recent clinical studies on MM suggested that an epigenetic-based approach,
eventually in combination, could be valuable[19]. However, whereas Vorinostat displays
interesting anti-tumor properties in vitro against MM, it failed in phase III trials probably due
to its poor pharmacokinetics properties.
We hypothesized that a pH-responsive DDS for Vorinostat could improve its delivery
in MM tumors and cells by passive targeting and endocytosis and could contribute to find an
200
innovative strategy for this poor prognostic cancer type. This could lead to efficient histone
re-acetylation in vivo by HDAC inhibition with possible impact on tumor progression. We
previously demonstrated that Ring-Opening Metathesis co-Polymerization (ROMP)[20,21] of
functional norbornenyl macromonomers of poly(ethylene oxide) (PEO) with norbornene
(NB) can give ROMP-DDS adapted to both passive targeting and endocytosis. Rhodamine
fluorescent functional nanoparticles (NPs) were selectively accumulated in vivo in tumors by
the EPR effect due to the PEO-shell structure of this ROMP-DDS introducing native stealth
properties. Native cellular internalization was also demonstrated in vitro. In addition,
copolymer synthesis was made easier with the generic azidomacromonomer 4 (Scheme 1)
well suited for functionalization by click chemistry. Using an alkyne-clickable pH-responsive
prodrug of SAHA[22] we envisioned the preparation of pH-responsive ROMP-DDS from this
azidomacromonomer 4.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Materials
Ethanol (96%, purissium grade pur, Xilab), dichloromethane (96%, purissium grade
pur, Xilab) and dimethyl formamide (DMF, 99.8%, Panreac) were degassed before use.
Tetrahydrofuran (THF, J.T. Baker) diethyl ether anhydrous (J.T. Baker), N,N,N',N'',N''pentamethyldiethylenetriamine (PMDETA, 99%, Aldrich), Na2SO4 (99%, Alfa Aesar),
norbornene (99% GC, Aldrich), Grubbs first generation catalyst Cl2(PCy3)2Ru=CHPh
(Aldrich, stored in a glovebox under Argon atmosphere), dodecane (99%, Aldrich),
triethylamine (TEA, 99%, Acros Organics), ethyl vinyl ether (99% stab.with ca. 0.1% N,Ndiethylalanine, Alfa Aesar), Trizma®base (99.9%, Aldrich) were used without further
purification. CuBr (98%, Aldrich) was purified in acetic acid and stored under inert
atmosphere (glovebox). Macromonomers 3, 4, and 5, unfunctionalized NPs 10 and pHresponsive SAHA prodrug 6 were prepared as previously described[20-22] .
2.2. Synthesis of the SAHA prodrug functionalized macromonomer 7
(Scheme 1)
The prodrug-functionalized macromonomer 7 was obtain by a Huisgen 1,3cycloaddition between 4 and 6. 249 g of 4 (Mn=3350 g/mol; n=7.5 10-5 mol; 1eq), 92 mg of 6
(M=726 g/mol; 1.2 10-4 mol; 1.5eq) and 35 µL of PMDETA (d=0.83; M=173 g/mol; n=1.8
10-4 mol; 2eq) were dissolved in 4.25 mL of DMF. Then the mixture was degassed according
201
to the freeze-pump-thaw procedure. 24 mg of CuBr (M=143 g/mol; n=1.8 10-4 mol; 2eq)
were then added under inert atmosphere (glovebox). The mixture was stirred during 4 days
under argon at room temperature. Then, 50 mL of dichloromethane was added to the reaction
mixture and the solution was washed ten times with 30 mL of water and dried with Na2SO4.
The solution was filtrated, the solvent was evaporated and the macromonomer was dissolved
in 30 mL of THF and precipitated in 200 mL of diethyl ether, filtrated, dried under vacuum
and finally lyophilized in dioxane. The macromonomer 7 was stored under argon before use
1H NMR (CDCl3)  : 9.49 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.48 (m, 2H SAHA), 7.16 (m,
3H SAHA+8H toluyl+CDCl3 signal), 6.05-5.85 (m, 2H), 4.57 (s, 2H), 4.43 (m, 4H), 3.76 (m,
4H), 3.57 (m, 312H), 3.32-2.68 (m, NB signals), 2.22 (s, 8H (2H SAHA)), 2.0-0.25 (m, 10H
SAHA+NB signals); SEC (THF): (RI) Mn=3690 g/mol (styrene eq.); PDI=1.18. The
functionalization yield was determined by using the ratio between integration of the ethylenic
protons and the integration of the proton of the formed triazole ring. F=80%
2.3. Synthesis of nanoparticles 8 (Scheme 1)
NPs 8 were obtained by Ring-Opening-Metathesis coPolymerization of norbornene 2
with macromonomers 3 and 7 in dispersion. Solvents were degassed according to the freezepump-thaw procedure. The reaction was carried out at room temperature under inert
atmosphere (glovebox). In a typical experiment, 10 mg (n=1.2 10-5 mol) of Grubbs first
generation complex were dissolved in 5 mL of dichloromethane/ethanol mixture (50/50%
v/v). Both norbornene 2 (0.490 g; M=94 g/mol; n=5.2 10-3 mol) and macromonomers 3 and 7
(m3=0.179 g; Mn;3=3450 g/mol; m7= 0.214 g; Mn;7=4125 g/mol; n3=n7=5.2 10-5mol) were
first dissolved in 9 mL of CH2Cl2/EtOH solution (35/65% v/v) (1 mL of this mixture was
sampled for analyses) and added to the catalyst solution. 0.1 mL of NEt3 were added to
maintain the pH solution higher than 7. The mixture was stirred during 24 h. At the end of
polymerization Ruthenium end-capped chains were deactivated by addition of 0.2 mL of
ethyl vinyl ether.
2.4. Synthesis of nanoparticles 9 (Scheme 1)
Grubbs first generation complex (10 mg; 1.2 10-5 mol) was dissolved in CH2Cl2/EtOH
(5 mL; 50/50% v/v). Both norbornene 2 (0.490 g; 5.2 10-3 mol) and macromonomers 5 (242
mg; 4660 g/mol; 5.2 10-5 mol) and 7 (214 mg; 4125 g/mol; 5.2 10-5 mol) were first dissolved
in CH2Cl2/EtOH (9 mL; 35/65% v/v). 8 mL of the latter solution were added to the catalyst
solution (1 mL was sampled for analyses). NEt3 (0.1 mL) was added to maintain the pH
202
solution higher than 7. The mixture is stirred during 24 h. At the end of polymerization
Ruthenium end-capped chains were deactivated by addition of 0.3 mL of ethyl vinyl ether.
2.5. Macromonomers and polymers analysis (Scheme 1, Figures 2 and 3)
1H NMR studies were completed via a Bruker spectrometer 400 MHz, in CDCl3 at 25
°C. Size exclusion chromatography (SEC) equipment consists of a JASCO HPLC pump type
880-PU, TOSOHAAS TSK gel columns, a Varian refractive index detector, and a JASCO
875 UV-vis absorption detector, with THF as the mobile phase and the calibration curve was
performed using polystyrene standards. The conversion of macromonomers was determined
by SEC with dodecane as internal standard (SEC retention times: tSECmacromonomers = 18.75
min; tSECdodecane = 31.70 min). The conversion of NB was determined by gas chromatography
with dodecane as internal standard with a Varian 3900 apparatus having a Factor Four
Capillary Column VF-1ms 15Mx0.25MM ID DF=0.25 (injector: T=250 °C; oven: Initial
temperature: 50 °C during 2 min followed by a temperature rate of 10 °C/min until 250 °C ;
detector: T=300 °C; GC retention times: tGCNb = 1.77 min; tGCdodecane = 8.55 min). DLS
measurements were performed using a MALVERN zetasizer Nano ZS equipped with He-Ne
laser (4 mW and 633 nm). Before measurements, latexes were diluted about 800 times to
minimize multiple scatterings caused by high concentration. The scattering angle used was
173°.
2.6. Cell culture
The pleural mesothelial cell line, MeT-5A, was obtained from American Type Culture
Collection (ATCC). The mesothelioma cell lines Meso13, Meso34 and Meso56 were
established from the pleural fluids of mesothelioma patients. All cell lines were maintained in
RPMI medium (Invitrogen) supplemented with 2 mM L-glutamine, 100 IU/ml penicillin, 0.1
mg/mL Streptomycine and 10% heat inactivated fetal calf serum (FCS) (Eurobio).
2.7. Transfections studies
MeT-5A cells were seeded at a density of 1.5x105 cells per 35 mm dish. Transient
transfections were performed one day later using Attractene (Qiagen), according to the
manufacturer’s protocol. For BRET experiments, MeT-5A cells were transfected with 0.6 µg
Rluc-Brd cDNA and 1 µg YFP-fused histone H3 cDNA[23]. One day after transfection, cells
were transferred into 96-well microplates (microplate 96 well, white, Berthold Technologies)
at a density of 3x104 cells per dish in 180 µl of culture medium. Treatments were performed
203
by the addition of 20 µl of a 10 fold concentrated sample solution. BRET measurements were
performed as described below.
2.8. BRET measurements
All BRET measurements were performed at room temperature using the Mithras LB
940 microplate analyzer (Berthold Technologies). Cells were pre-incubated for 15 min in
PBS in the presence of 2.5 µM coelenterazine (Interchim), following which light-emission
acquisition at 485 and 530 nm was carried out. Plates were measured five times. The BRET
signal was expressed in milliBRET units (mBu). The BRET unit has been defined previously
as the ratio 530/485 nm obtained when the two partners are present, corrected by the ratio
530/485 nm obtained under the same experimental conditions, when only the partner fused to
Renilla luciferase is present in the assay.
2.9. Determination of cell viability
Cell growth was monitored using Uptiblue reagent (Interchim). Reduction of this
compound by the cell results in the formation of a fluorescent compound quantified by
measuring fluorescence at 595 nm after excitation at 532 nm using a Typhoon apparatus (GE
Healthcare). Cells were seeded in 96-well plates at a density of 5x103 cells/well in culture
medium. Twenty-four hours later, compounds solutions or nanoparticles were added for 72 h.
Uptiblue (5%, v/v) was then added to the culture medium for 2 h at 37 °C. Fluorescence was
quantified by measuring emission at 595 nm after excitation at 532 nm using a Typhoon
apparatus (GE Healthcare).
2.10. Detection of apoptosis
Apoptosis was quantified using the Annexin V-allophycocyanin (APC) apoptosis
detection kit (Becton Dickinson), which labels phosphatidylserine externalized in the early
phases of apoptosis. Cells were seeded at a density of 1.105 per well of 6-wells plates and
treated with NPs 10 1 mg/ml or NPs 8 1 mg/ml (45 µM SAHA). After 48 h of culture,
floating and adherent cells were combined, washed twice with cold PBS, resuspended in 100
μL of annexin binding buffer (10 mmol/L Hepes, 140 mmol/L NaCl, 2.5 mmol/L CaCl 2, pH
7.4), incubated for 15 min at room temperature with 2.5 μL of Annexin V-FITC and 2.5 μL
of propidium iodide and analyzed by flow cytometry (FACSCalibur; Becton Dickinson). Ten
thousand events were collected and analyzed with the FACS Flowjo Software.
204
2.11. Animal experiments
These experiments were carried out in compliance with the guidelines of the European
Union for the care and use of animals in research protocols. The experiments were approved
by ethical committee for animal experiment (CEEA.PdL 2013.6).
Bio-distribution experiments
3x106 AK7 murine mesothelioma cells (AK7) per mouse were administered
subcutaneously in the foot pad of five nude mice (CD-1, Charles River) (day 0). Mice were
given six successive i.v. injections of NPs 9 (160 mg/kg), respectively, at days 14, 16, 19, 21,
23 and 26. All animals were necropsied on days 28/29. Tumor, liver, ovary, brain, spleen and
kidneys were collected and analyzed for fluorescence emission. Fluorescence was observed at
630 nm using Photon Imager (Biospace Lab) after excitation at 580 nm and pictures were
analyzed using PhotoVision+ software (Biospace Lab).
In vivo activity of nanoparticles 8 and 10.
3x106 AK7 murine mesothelioma cells (AK7) per mouse were administered
subcutaneously in the foot pad of three groups of five nude mice (CD-1, Charles River) (day
0). Group 1 did not receive any further treatment. Groups 2, 3 and 4 were respectively given
six successive i.v. injections of SAHA (50 mg/kg), NPs 10 (160 mg/kg) or NPs 8 (160 mg/kg,
1.9 mg/kg SAHA equivalent) at days 14, 16, 19, 21, 23 and 26. All animals were necropsied
on days 28/29. Mice, Liver, kidneys and spleen were weighted. Blood analyses, using a MS95 analyzer (Melet Schloesing laboratories), were performed and tumors were collected to
perform immunohistochemical analyses.
2.12. Immunohistochemistry
Tumors were fixed in 4% CH2O in PBS, embedded in paraffin, cut into 5-µm sections.
Immunohistochemistry was performed on tumor slices (paraffin-embedded) by Cellular and
Tissular Imaging Core Facility of Nantes University (MicroPICell) using standard
techniques. The primary antibodies used were anti-activated caspase 3 (Abcam) and antihistone H3 acetyl (specific of acetylated lysines 9, 14, 18, 23, and 27) (Active motif) as
recommended by the manufacturers. N-Histofine Simple Stain Mouse MAX Peroxidase
(Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan) was used as the detection reagent. Pictures were
obtained using a NanoZoomer 2.0HT (Hamamatsu).
205
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Preparation and characterization of macromonomer 7.
This communication presents the development of NPs 8 (Scheme 1) as DDS for SAHA
with the determination of its biological activities in vitro and in vivo. Fluorescent copolymer
9 was also prepared to demonstrate i) that multifunctional NPs can be prepared with
controlled ratio of functionalities and ii) that combining the fluorescent macromonomer 5 and
the pH-responsive SAHA macromonomer 7 does not modify the biodistribution in vivo
compared to NP prepared with macromonomer 5 only.
Tol =
2
1 Vorinostat (SAHA)
76
3, R = OH
4, R = N 3
i
76
5, ref 12
4, ii
6
3
76
7
3
2+3+7
iii
1
1
110
8
76
76
2+5+7
3
iii
110
1
1
9
76
2
110
76
10
76
3
Scheme 1. Macromonomers and copolymers synthesesa. i) a) MsCl; b) NaN3 ii) CuBr,
PMDETA; iii) Grubbs I; EtOH/CH2Cl2, TEA.
Macromonomer 7 (Scheme 1) was prepared by click chemistry between alkyne prodrug
6 and the macromonomer 4[21] prepared with average PEO length n =76. The clickable
prodrug 6 was best suited for the release of SAHA in mildly acidic pH with convenient
206
stability at physiological pH to avoid release of active molecule in blood vessels. Using
copper catalyzed Huisgen' cycloaddition in the presence of PMDETA as copper ligand, azide
4 reacted with alkyne 6 to give macromonomers 7 in good yields (80%, supporting
information for characterization), determined by using the ratio between integration of
ethylenic protons a (Figure 2) and integration of proton e of the formed triazole ring on the
1
H NMR spectra. Chemical shifts were attributed by comparison to starting materials (Figure
S1, supplementary information).
3.2. Preparation and characterization of nanoparticles 8 and 9
Combinations of NB+3+7 gave access to SAHA functional NPs 8 whereas difunctional
NPs 9 were prepared by combining NB and 7 and the fluorescent macromonomer 5 (Scheme
1). The general protocol for NPs 8 and 9 synthesis by ROMP with Grubbs I catalyst in
dispersed media involved NB (100 eq.) and macromonomer 7 (1 eq.) mixed with
macromonomers 3 (for NP 8, 1 eq.) or 5 (for NP 9, 1 eq). We used the same amount of
SAHA-macromonomer 7 in both NPs 8 and 9 syntheses to allow for comparative studies in
vitro and in vivo. For all NPs batches, NB and macromonomer conversions were determined
respectively by gas chromatography and size exclusion chromatography, and provided in
each case conversions higher than 99% for NB and higher than 90% for the macromonomers
(supplementary
information).
Regarding
the
initial
amounts
of
monomer
and
macromonomers and their conversions, we determined that the final latexes were composed
of polymerized chains in a ratio 110:1:1 for the macromonomer units 2:7:(3 or 5) (Table S1,
supplementary information). For biological purposes, these NPs were transferred in aqueous
solutions, carried out by successive evaporation and purification by ultra-filtration by diluting
the dispersion in order to obtain a polymer concentration of 20 mg/mL (0.9 mM of SAHA).
207
Fig. 2. 1H NMR characterization of macromonomer 7.
12
10
Intensity (A.U.)
8
6
4
2
0
0
-2
200
400
600
800
1000
Size (d. nm)
EtOH/CH2Cl2
H2O
Fig. 3. DLS measurement of nanoparticles 8 dispersed in EtOH/CH2Cl2 mixture and in water.
All these nanoparticles were finally characterized by DLS in order to confirm their
colloidal stabilities (Figure 3) and determined their sizes in the reaction medium and in water
208
after their transfer (Table S1). The unfunctionalized NPs 10[20] were used as negative controls
in biological experiments. In clinic, Dose Limiting Toxicity for SAHA is below 300 mg per
day (about 1 mmol). This suggests that our NPs with 1% SAHA loading should be used at a
maximum 100 mmol per day to obtain the same amount of free SAHA. Taking into account
the fast metabolism of SAHA in vivo (<2h), we hypothesized that using such NPs should
help optimizing SAHA delivery for higher local effect, allowing reduced SAHA dosing and
in turn reduced toxicity.
3.3. HDAC inhibition with nanoparticles 8 and 9.
With NPs 8 bearing SAHA we first investigated the restoration of HDAC inhibition
with a bioluminescent resonance energy transfer (BRET) assay[23] designed to measure
histone H3 acetylation in living cells. When performing on living cells, this assay also
confirmed NPs cellular internalization. Dose-dependent BRET induction experiments were
performed on cells treated for 16h with SAHA and NPs 8, 10 to determine their
pharmacological properties (Figure 4A and 4B). SAHA-bearing NPs 8 were compared to NPs
10 as SAHA-negative control and free SAHA as positive control. As expected, NPs 8
triggered dose-dependent BRET signals induction, and then a dose-dependent increase of
histone H3 acetylation, while NPs 10 negative control gave no significant signal (Figure 4A).
NPs 8 doses higher than 22.5 µM of equivalent SAHA (500 µg/mL of polymer) led to a
reduction of BRET signal probably corresponding to an intrinsic effect of the NPs on cells,
suggesting a safe window below 500µg/mL polymer concentration for experiments on cells
in culture. SAHA gave an enhanced BRET signal induction (Figure 4B, 273.22 ± 44.66
mBu), five times higher than NPs 8 (61.11 ± 7.26 mBu).
209
Fig. 4. Pharmacological characterization of NPs 8 and 10 and SAHA using BRET. MeT-5A
cells were transfected with phRluc-C1 BrD and pEYFP-C1 histone H3. A) Cells were treated
for 16 h with increasing doses of the different molecules. B) Graphic represents the maximal
induced-BRET signal measured for each molecule in the dose response experiment. C) and
D) Cells were treated with 5 µM SAHA or 0.25 mg/mL NPs 8 (11.25 µM SAHA) during 8h,
24h, 36h or 48h. C) Results were expressed as the induced-BRET signal. D) Results were
expressed as the percent of the maximal induced-BRET signal measured during kinetic
experiments. E) Graphic represents the maximal induced-BRET signal measured for each
molecule independently of the time of treatment. Results are the means ± S.E.M of three
independent experiments.
BRET induction kinetics at IC50 concentrations (Figure 4C and 4D, 5 M SAHA and
0.25 mg/mL NP 8 = 11.25 µM SAHA) showed a fast response for SAHA rapidly delivered in
cells by diffusion with a maximum BRET induction at 20h, followed by a rapid signal
reduction. In contrast, NPs 8 triggered a lower, delayed (40h) and continuous BRET signal
induction, suggesting two cellular events required for HDAC inhibition by NPs 8 : cellular
internalization and SAHA release. In kinetic conditions SAHA alone gave two fold more
BRET induction than SAHA-bearing NPs. (Figure 4E, 331.88 ± 22.79 mBu for SAHA and
158.73 ± 9.71 mBu for NPs 8). The same kinetics were previously obtained for prodrug 6[21]
demonstrating that once grafted onto NPs, SAHA release from the pH-responsive system in
living cells is not modified. This common BRET profile revealed that the fast SAHA
210
metabolism (< 2h) when used alone is overcome due to the high concentration reached within
the cells after one shot, leading to high and transient histone H3 acetylation. In contrast, NPs
8 allow reaching equilibrium between SAHA release and metabolism consumption resulting
in the presence of a relatively constant SAHA concentration in cells after 24h and then, to a
moderate and constant histone H3 acetylation over time.
3.4. Viability of cells treated with nanoparticles 8 and 10.
Viability experiments (Figure 5A and B) demonstrated an absence of bare NPs 10
toxicity on cells whereas the same polymer concentrations of NPs 8 significantly decreased
cancer cells viability in a dose-dependent manner (Figure 5A). When compared to free
SAHA, NPs 8 toxicity was lower (Figure 5B), a result consistent with BRET experiments
(Figure 4) and thus correlated to the level of histone H3 acetylation. Indeed, SAHA was toxic
in our cell model at 10 µM with no more cells viable while at least 50% cells remained alive
with NPs 8 at 100 µM equivalent SAHA. HDAC inhibition is correlated with apoptosis in
cancer cell lines, confirmed in our case by annexin-V staining, whereas as expected,
unfunctional NPs 10 triggered no apoptosis. NPs 8 at 45 µM equivalent SAHA (1mg/mL
polymer) gave a dramatic increase of apoptosis at 48h, even higher after 72h (Figure 5C and
D). This was correlated with the delayed release of SAHA from NPs 8 and was consistent
with previous effects obtained on histone H3 acetylation and cell viability. Regarding our
results, we can confirm that our NPs were internalized by cells, and that subsequently, these
NPs should traffic through the endosome/lysosomes pathways where increased acidity can be
exploited to release SAHA in a pH dependent manner. The functionality of our NPs in vitro
warranted further investigation in vivo to validate a possible effect in tumors by exploiting
the enhanced permeability and retention effect[14]. We previously demonstrated, thanks to
biodistribution studies with a fluorescent version of our NPs conducted in mice, that such
NPs accumulated mainly within the tumor[21]. Here, we first confirmed that the introduction
of the pH responsive form of SAHA covalently linked to fluorescent NPs did not modify NPs
behaviour in vivo.
211
Fig. 5. Biological characterization of NPs and SAHA. Viability of MM cells was evaluated
following treatments with increasing amounts of NPs 10 (A), NPs 8 (A and B) or SAHA (B)
for 72 h. MM cells were treated with 1 mg/mL of NPs 10 or NPs 8 (45 µM SAHA; 1 mg/mL
polymer) for 48 h (C) or 72 h (D) and apoptosis induction was measured by annexin-V-APC
labelling.
3.5. In vivo effects of nanoparticles 8, 9 and 10.
Therefore, mice bearing subcutaneous tumor were injected intravenously with 160
mg/kg of NPs 9 (schedule in Figure S2, supplementary information). All mice survived after
treatment and were euthanized for tumors collection and analysis of biodistribution by
fluorescent imaging. Figure 6A and B showed that NPs 9 were also mainly accumulated in
tumor, while no signal was observed in liver, kidneys, brain, and ovaries, (All mice pictures
are provided in supplementary information Figure S3). Taking into account that fluorescent
SAHA-bearing NPs 9 showed the same biodistribution as SAHA-free fluorescent NPs and
that the fluorescent probe was not expected to change the biodistribution, NPs 8, 10 and free
SAHA were compared in vivo. MM tumor cells were injected in 4 groups, each made of 5
mice corresponding to 1) group control not treated and groups treated with 2) SAHA, 3) NPs
10 and 4) NPs 8 (Schedule Figure S2). Activated caspase-3 staining did not reveal an evident
higher amount of apoptotic areas in the tumors of mice treated with NPs 8 compared to
untreated mice, SAHA or NPs 10-treated mice (Figure 7, top row).
212
Fig. 6. Biodistribution of NPs 9 in a mouse model of subcutaneous mesothelioma.
Nude mice bearing AK7 tumors were injected with 160 mg of NPs 9 per kg of mice in the tail
vein. A) Representative picture of fluorescence observed on dissected tumor (Tu), liver (Li),
ovary (Ov), brain (Br), spleen (Sp) and kidneys (Ki). B) Quantification of NPs 9
biodistribution. Results are means ± S.E.M. of results obtained on 5 mice.
However, global histone H3 acetylation was clearly increased in tumors of NPs 8
treated mice (brown labelled cell nuclei) (Figure 7 bottom row and Figure S4, supplementary
information) compared to untreated, SAHA or NPs 10 treated mice. This effect was obtained
whereas the equivalent amounts of injected SAHA in NPs 8 (1.9 mg/kg) were more than 25
fold lower than those of free SAHA (50 mg/kg). The absence of major apoptosis induction by
NPs 8 and the increase of histone H3 acetylation suggest that SAHA doses delivered into the
tumor could be sufficient to increase tumor suppressor gene expression and then sensitize
cells to other drugs.
Fig. 7. Tumors were analyzed by immunohistochemistry using anti-activated caspase-3
or anti-acetylated histone H3 antibodies. Nude mice bearing subcutaneous AK7 tumors were
treated with intravenous injection of NPs 10 (160 mg/kg), SAHA (50 mg/kg) or NPs 8 (1.9
mg/kg SAHA, 160 mg/kg polymer).
213
3.6. In vivo toxicity of nanoparticles 8 and 10.
In order to detect an eventual toxicity of the treatments, mice blood samples were
collected, blood formula analyzed, and mice, liver, spleen and kidneys were weighed.
Comparing all groups, no variation in the levels of erythrocytes, thrombocytes and leucocytes
was observed nor in the weight of mice and of the different organs (Figure S5 and S6,
supplementary information).
4. CONCLUSION
SAHA is currently approved for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma but to
date did not give satisfactory results on solid and diffuse tumors and particularly on MM. The
poor solubility, fast metabolism and high toxicity of SAHA, notably thrombopenia, are
responsible for limited dosing in clinic (DLT 300-400 mg/day). Improving SAHA delivery in
solid tumors in vivo was made possible thanks to a pH-responsive DDS able to passively
target tumors with subsequent cellular internalization independent of receptor-mediated
endocytosis. Following internalization, the inhibitor is slowly released in cells, avoiding
potential side effects arising from diffusion outside tumoral zone. This strategy should limit
the clearance and metabolism for better clinical results. Our pH responsive DDS, easily
produced by ROMP, appeared as a good strategy to increase SAHA-induced acetylation in
solid tumors. Such tools can be used to decipher chromatin reacetylation effects in vivo as an
entry to a better understanding of the in vivo chemical biology of HDAC inhibitors and by
extension the other chromatin modifying enzyme inhibitors. This reacetylation is also an
entry point to sensitize malignant cells to other anti-cancer drugs, such epigenetic strategy
being currently highly investigated. This could thus lead to a decrease of the doses currently
administrated in clinical trials, and to an increase of therapeutic benefits.
SUPPLEMENTARY
DATA TO THIS ARTICLE :
1
H NMR spectra of reference
intermediates, details for the characterization of macromonomers and calculations for the
composition of new nanoparticles, details for in vivo schedule and effect on all mice groups
with
toxicological
assessments,
can
be
found
online
at
http://dx.doi.org/10.1016/j.jconrel.xxxxxxx.
CORRESPONDING AUTHOR
*PB: [email protected]; CB : [email protected].
214
ACKNOWLEDGMENT
Authors thank Agence Nationale de la Recherche (ANR) for RD, FG and FC grants (ANR08-PCVI-030), Région Poitou-Charentes for FEB grant, the Ligue National Contre la Cancer
for ID grant, the Ligue Contre le Cancer: committees of Morbihan, Sarthe, Vendée, LoireAtlantique et Charente-Maritime, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS),
ARSMESO44, Nantes University Hospital, and COST action TD0905.
REFERENCES
1. M. Duvic, J. Vu, Vorinostat: a new oral histone deacetylase inhibitor approved for
cutaneous T-cell lymphoma. Expert Opin. Investig. Drugs 2007, 16: 1111-20.
2. V. M. Richon, Y. Webb, R. Merger, T. Sheppard, B. Jursic, L. Ngo, F. Civoli, R.
Breslow, R. A. Rifkind, P. A. Marks, Second generation hybrid polar compounds
are potent inducers of transformed cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U S
A 1996, 93: 5705-8.
3. L. M. Butler, D. B. Agus, H. L. Scher, B. Higgins, A. Rose, C. Cordon-Cardo, H. T.
Thaler, R. A. Rifkind, P. A. Marks, V. M. Richon, Suberoylanilide hydroxamic
acid, an inhibitor of histone deacetylase, suppresses the growth of prostate
cancer cells in vitro and in vivo. Cancer Res. 2000, 60: 5165-70.
4. N. Martinet, P. Bertrand, Interpreting clinical assays for histone deacetylase inhibitors.
Cancer Manag. Res. 2011, 3: 117-41.
5. M. J. Peart, G. K. Smyth, R. K. van Laar, D. D. Bowtell, V. M. Richon, P. A. Marks, A. J.
Holloway, R. W. Johnstone, Identification and functional significance of genes
regulated by structurally different histone deacetylase inhibitors. Proc. Natl.
Acad. Sci. U S A. 2005, 102: 3697-702.
6. M. Flipo, J. Charton, A. Hocine, S. Dassonneville, B. Deprez, R. Deprez-Poulain,
Hydroxamates: relationships between structure and plasma stability. J. Med.
Chem. 2009, 52: 6790-802.
7. L. Du, D. G. Musson, A. Q. Wang, Stability studies of vorinostat and its two
metabolites in human plasma, serum and urine. J. Pharm. Biomed. Anal. 2006, 42:
556-64.
8. R. A. Parise, J. L. Holleran, J. H. Beuner, S. Ramalingam, M. J. Egorin, A liquid
chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometric assay for
quantitation of the histone deacetylase inhibitor, vorinostat (suberoylanilide
hydroxamicacid, SAHA), and its metabolites in human serum. J. Chrom. B. 2006,
840: 108-15.
9. K. J. Dedes, I. Dedes, P. Imesch, A. O. von Bueren, D. Fink, A. Fedier, Acquired
vorinostat resistance shows partial cross-resistance to 'second-generation' HDAC
inhibitors and correlates with loss of histone acetylation and apoptosis but not
with altered HDAC and HAT activities. Anticancer Drugs 2009, 20: 321-33.
10. D. Peer, J. M. Karp, S. Hong, O. C. Farokhzad, R. Margalit, R. Langer, Nanocarriers as
an Emerging Platform for Cancer Therapy. Nat. Nanotechnol. 2007, 2: 751-60.
11. L. Zhang, F. X. Gu, J. M. Chan, A. Z. Wang, R. S. Langer, O. C. Farokhzad,
Nanoparticles in Medicine: Therapeutic Applications and Developments. Clin.
Pharmacol. Ther. 2008, 83: 761-9.
12. G. Scita, P. P. Di Fiore, The endocytic matrix. Nature 2010, 463: 464-73.
215
13. S. Modi, M. G. Swetha, D. Goswami, G. D. Gupta, S. Mayor, Y. Krishnan, A DNA
Nanomachine That Maps Spatial and Temporal pH Changes Inside Living Cells.
Nat. Nanotechnol. 2009, 4: 325-30.
14. N. L. Sato, S. Niimura, N. Fujisawa, Y. Maeda, Characterization of vascular
permeability-increasing component isolated from solid tumors and the effect of
highly polymerized dextran sulfate on its activity. Jpn J. Pharmacol. 1986, 41:
163-71.
15. F. el Bahhaj, F. J. Dekker, N. Martinet, P. Bertrand, Delivery of epidrugs. Drug Discov.
Today 2014, http://dx.doi.org/10.1016/j.drudis.2014.03.017.
16. E. Hockly, V. M. Richon, B. Woodman, D. L. Smith, X. Zhou, E. Rosa, K. Sathasivam,
S. Ghazi-Noori, A. Mahal, P. A. Lowden, J. S. Steffan, J. L. Marsh, L. M. Thompson,
C. M. Lewis, P. A. Marks, G. P. Bates, Suberoylanilide hydroxamic acid, a histone
deacetylase inhibitor, ameliorates motor deficits in a mouse model of
Huntington's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2003, 100: 2041-6.
17. E. A. Mohamed, Y. Zhao, M. M. Meshali, C. M. Remsberg, T. M. Borg, A. M. Foda, J.
K. Takemoto, C. L. Sayre, S. E. Martinez, N. M. Davies, M. L. Forrest, Vorinostat
with sustained exposure and high solubility in poly(ethylene glycol)-b-poly(DLlactic acid) micelle nanocarriers: characterization and effects on
pharmacokinetics in rat serum and urine. J. Pharm. Sci. 2012, 101: 3787-98.
18. a) F. Guillot, B. Boutin, C. Blanquart, J. F. Fonteneau, M. Robard, M. Gregoire, D.
Pouliquen, Vaccination with epigenetically treated mesothelioma cells induces
immunisation and blocks tumour growth. Vaccine 2011, 29: 5534-43; b) D.
Barbone, P. Cheung, S. Battula, S. Busacca, S. G. Gray, D. B. Longley, R. Bueno, D.
J. Sugarbaker, D. A. Fennell, V. C. Broaddus, Vorinostat eliminates multicellular
resistance of mesothelioma 3D spheroids via restoration of Noxa expression.
PLoS One 2012, 7: e52753; c) J. L. Hurwitz, I. Stasik, E. M. Kerr, C. Holohan, K. M.
Redmond, K. M. McLaughlin, S. Busacca, D. Barbone, V. C. Broaddus, S. G. Gray,
K. J. O'Byrne, P. G. Johnston, D. A. Fennell, D. B. Longley, Vorinostat/SAHAinduced apoptosis in malignant mesothelioma is FLIP/caspase 8-dependent and
HR23B-independent. Eur. J. Cancer 2012, 48: 1096-107.
19. F. Vandermeers, S. N. Sriramareddy, C. Costa, R. Hubaux, J.-P. Cosse, L. Willems, The
role of epigenetics in malignant pleural mesothelioma. Lung Cancer 2013, 81: 3118.
20. F. Collette, R. Delatouche, C. Blanquart, F. Gueugnon, M. Grégoire, P. Bertrand, V.
Héroguez, An easy and effective method to produce functionalized particles for
cellular uptake. J. Pol. Sci. Part A: Polymer Chemistry 2013, 51: 176-89.
21. F. Gueugnon, I. Denis, D. Pouliquen, F. Collette, R. Delatouche, V. Héroguez, M.
Gregoire, P. Bertrand, C. Blanquart, Nanoparticles produced by Ring-Opening
Metathesis Polymerization using norbornenyl-poly(ethylene oxide) as a ligandfree generic platform for highly selective in vivo tumor targeting.
22. R. Delatouche, I. Denis, M. Grinda, F. el Bahhaj, E. Baucher, F. Collette, V. Héroguez,
M. Gregoire, C. Blanquart, P. Bertrand, Design of pH responsive clickable prodrugs
applied to histone deacetylases inhibitors: a new strategy for anticancer therapy .
Eur. J. Pharm. Biopharm. 2013, 85: 862-72.
23. C. Blanquart, M. Francois, C. Charrier, P. Bertrand, M. Gregoire, Pharmacological
characterization of histone deacetylase inhibitor and tumor cell-growth
inhibition properties of new benzofuranone compounds. Curr. Cancer. Drug
Targets 11. 2011, 919-28.
216
SUPPORTING INFORMATION
217
Figure S1. Comparison of 1H NMR spectra of starting materials and macromonomer 7
Characterization of macromonomers 7.
The macromonomer 7 can be view as a mixture of unfunctionalized (20%) and
functionalized (80%) macromonomers. The number average molecular weight (MnNMR) of 7
can be calculated by using the 1H NMR spectra following the equation:
MnNMR = 0.8 x (MNB + MEO x DPn + MProdrug ) + 0.2 x (MNB + MEO x DPn + MOH)
MnNMR = 0.8 x (123 + (44 x 76) + 809.9) + 0.2 x (123 + (44 x 76) + 45) = 4125 g/mol.
where MNB is the molecular weight of the PEO -functionalization, MEO is the molecular
weight of an ethylene oxide unit, MProdrug is the molecular weight of -end group of
macromonomer 7, MOH is the molecular weight of -end group of unfunctionalized
macromonomer 4. DPn is the number average polymerization degree DPn = (IPEO/4)/(INB/2),
IPEO is the integration of the protons signal of the PEO chain, INB, is the integration of the
signals of the ethylenic protons of the norbornenyl entity.
Composition of nanoparticles 8 and 9.
The composition of NPs 8 and 9 was determined according to consumed starting monomer
and macromonomers. NB 2 exhibits a total conversion while global macromonomer
conversion () was 90%. It is assumed than both macromonomers 3, 5, 7 are consumed with
the same rate (we approximate than the -functionalization does not act on their reactivity).
By this way, we can determine the amount of SAHA per gram of polymer with the following
equation:
Where F7 is the -functionalization yield of macromonomer 7 (F7=0.8), n7 is the amount of
macromonomer 7 introduced for the NPs synthesis (µmol), 
is the global conversion
ratio of the macromonomers 3, 5 and 7 (=0.9), mi is the weight of the compound i introduced
for the synthesis of the NPs (g).
The polymer concentration can be estimated with the equation:
(g/mL)
where V is the volume of the latex solution (13 mL).
218
Taking into account the amount of SAHA prodrug per gram of polymer and the polymer
concentration the SAHA concentration can be evaluated with the equation:
The NPs have been characterized by DLS (Table S1, Figure 2).
The amount of linked SAHA prodrug molecule per NP (nSAHA/NP) can then be calculated by
multiplying the amount of SAHA per gram of polymer with the weight of one NP using the
following equation:
where VNP
is the volume of one NP (VNP= DNP3/6), ρNP is the density of the NPs
approximated to equal to 1 g/mL, Na is the Avogadro constant.
The NPs were transferred in an aqueous solution of Trizma®base (10 mM) by successive
evaporation and an ultrafiltration steps to give a final latex concentration of 20 mg/mL.
NP
s
Copolyme
r
compositi
on
Particle diameter
(nm) and
polydispersity
[polymer
]1mg/mL
[polymer
]
[SAHA]
2
2
µmol/m
In
µmol/g
mg/mL
L
EtOH/CH In H2O
2:3:5:7
2Cl2
280
320
20
110:1:0:1
44
65
0.9
3.0 105
8
(0.15)
(0.21)
290
340
20
110:0:1:1
41
69
0.8
3.1 105
9
(0.17)
(0.27)
230
450
20
51
10 110:2:0:0
(0.31)
(0.58)
Table S1. Characterization of functionalized NPs.1 in EtOH/CH2Cl2. 2 in Trizma®base. 3 SAHA
molecules per NP
219
Injection iv:
- SAHA: 50mg/kg
- NPs 10 or 9: 160 mg/kg polymer
- NPs 8: 1.9mg/kg SAHA; 160 mg/kg polymer
Figure S2. In vivo schedule treatment.
Sp
Br
Tu
Ov
Ki
0
Sp
Sp
Li
Li
100
0
Sp
Ov
Ki
Ov
Sp
Tu
Ov
Ov
Tu
Tu
Tu
Ki
Br
Li
100
0
Li
Li
Br
Ki
100
0
Ki
Br
100
0
Br
100
Figure S3. Bio-distribution of NPs 9 in a mouse model of subcutaneous mesothelioma. Nude
mice bearing AK7 tumors were injected with 160 mg of NPs 9 per kg of mice in the tail vein
as described in the schedule treatment figure S2. Pictures correspond to the fluorescence
observed on dissected tumor (Tu), liver (Li), ovary (Ov), brain (Br), spleen (Sp) and kidneys
(Ki) from 5 mice.
220
CT
NPs 10
SAHA
NPs 8
Figure S4. Effect of NPs 8 and 10 and SAHA on histone H3 acetylation in tumors. Nude
mice bearing subcutaneous AK7 tumors were treated with intravenous injection of NPs 10
(160 mg/kg), SAHA (50 mg/kg) or NPs 8 (1.9 mg/kg SAHA, 160 mg/kg polymer) as
described
in
the
schedule
treatment
figure
S2.
Tumors
were
analyzed
by
immunohistochemistry using anti-acetylated histone H3 antibodies. Each picture are
representatives of the results obtained on one mice from the different groups.
221
Figure S5. Effect of NPs 8, NPs 10 and SAHA on mice weight. All the mice were weighted
at the day of euthanasia. Lines correspond to the means.
Figure S6. Toxic and haematological effects of SAHA, NPs 10 and NPs 8. The day of mice
euthanasia, blood samples were collected and analyzed to determine (A) erythrocytes (B)
thrombocytes and (C) leucocytes. (D) liver, (E) spleen, (F) kidneys were collected and
weighted. Graphics represent the means ± S.E.M.
222
RÉSULTATS - Article V
Article V: Acidic pH responsive Polymer conjugate of trichostatin A
anlogue in combination with Decitabine to cure asbestos
cancer
Loic Pichavant2, Valérie Héroguez2, Marc Grégoire1, Christophe Blanquart1, Philippe Bertrand3.
1. Inserm, U892, Nantes, F-44000, France; CNRS, UMR 6299, Nantes, F-44000, France; Univ Nantes, Nantes, F-44000,
France. 8 quai Moncousu, 44007 Nantes cedex 1, France.
2. Laboratoire de Chimie des Polymères Organiques. CNRS, UMR 5689, Bordeaux. 16 Avenue Pey-Berland, F-33607
Pessac, France.
3. Institut de Chimie des Milieux et Matériaux de Poitiers. CNRS, UMR 7582, Poitiers. 4 rue Michel Brunet, B28, F-86000
Poitiers, France.
Introduction
Les composés thérapeutiques ciblant les mécanismes épigénétiques font actuellement
l’objet de nombreuses études précliniques et cliniques, et quatre sont approuvés chez
l’homme. Cependant, les limites, toxicités et effets secondaires sévères associés en
contrepartie des effets thérapeutiques prometteurs qu’ils démontrent nécessitent de trouver de
nouvelles voies d’administration de ces composés. Ainsi, nous proposons la vectorisation
d’un analogue de la trichostatine A néo-synthétisé (NODH), greffé par chimie-click via une
chaîne acido-sensible sur des nanoparticules de norbornène que nous avons précédemment
décrit [573]. Le mésothéliome pleural malin (MPM) est une tumeur très agressive de la
plèvre, caractérisée par une médiane de survie inférieure à 12 mois après diagnostic et un
bénéfice limité des thérapies conventionnelles. Il est donc nécessaire de développer de
nouvelles stratégies pour traiter le MPM. Nous avons précédemment décrit la caractérisation
de nanoparticules de CI-994 et de SAHA (articles soumis) in vitro et in vivo dans des modèles
de MPM, et nous montrons dans cette étude comment la vectorisation du NODH conduit à
une régression tumorale plus efficace que la molécule libre dans un modèle de mésothéliome
malin.
La caractérisation in vitro des nanoparticules de NODH est similaire à celle des
nanoparticules de CI-994 ou de SAHA. Dans cette présente étude, nous avons souhaité nous
placer dans un modèle murin le plus équivalent possible à la physiopathologie, et avons donc
utilité un modèle immunocompétent orthoptique avec injection des mêmes cellules AK7 mais
directement dans la cavité intra-péritonéale. Concernant les traitements, la différence dans
cette étude réside dans un pré-traitement avec un agent hypométhylant : la décitabine, sur la
223
base d’une observation faite au laboratoire selon laquelle la combinaison d’agents
hypométhylants tel que la décitabine avec des iHDAC permettait une réduction de la masse
tumorale plus efficace qu’avec l’iHDAC seul [286]. Ainsi, les souris ont reçu deux préinjections de décitabine, puis quatre injections de nanoparticules nues, d’iHDAC seul ou
d’iHDAC vectorisé. Deux doses d’iHDAC étaient testées, avec une dose injectée équivalente
entre le composé seul et le composé vectorisé. Les tumeurs étaient récupérées après
euthanasie, pesées et coupées pour analyse histologique. D’autre part, le modèle murin étant
différent de celui précédemment décrit, la biodistribution des nanoparticules fluorescentes fut
reconduite de façon à s’assurer d’une accumulation spécifique des nanoparticules dans la
tumeur par effet EPR. Une biodistribution fut donc réalisée sur 96h, avec euthanasie,
récupération des organes et imagerie de la fluorescence 1h, 6h, 24h, 72h et 96h après injection
de nanoparticules fluorescentes. La toxicité des traitements a été évaluée par la mesure du
poids du foie, de la rate et des reins mais aussi par réalisation de formule sanguine.
Résultats/Discussion
Les études in vitro montrent une capacité des nanoparticules de NODH à augmenter
l’acétylation des histones et à diminuer la viabilité des cellules de MPM. Les nanoparticules
nues n’entraînent ni signal de BRET, ni toxicité. La comparaison avec le NODH seul ne
permet pas de conclure sur une amélioration des effets du NODH une fois vectorisé.
Cependant, les nanoparticules sont capables de pénétrer dans les cellules, de libérer le NODH,
qui possède une activité iHDAC fonctionnelle corrélée avec une cytotoxicité. De plus, la
biodistribution dans ce modèle de tumeur diffuse montre une accumulation spécifique des
nanoparticules dans la tumeur, sans affecter les organes environnants. Enfin, la caractérisation
in vivo des nanoparticules de NODH révèle tout l’intérêt de la vectorisation de cet iHDAC.
L’analyse des masses tumorales montre une régression tumorale massive voire quasi-totale
chez les souris traitées avec du NODH vectorisé. Cette même dose infra-thérapeutique
délivrée seule n’induit aucune régression tumorale et les tumeurs sont semblables à celles des
souris non traitées. L’utilisation d’une dose de NODH libre cinq fois supérieure permet
d’aboutir à cette régression tumorale massive. Un groupe contrôle dans lequel les souris
étaient traitées uniquement avec de la Décitabine ne montre aucune régression tumorale non
plus, confirmant ce qui avait précédemment été décrit quant à l’absence d’activité antitumorale intrinsèque de cette molécule. Enfin, alors qu’une nette infiltration du pancréas par
la tumeur était observée dans les groupes des souris non traitées ou traitées avec le NODH
224
seul, la forme nanoparticulaire permet d’empêcher l’infiltration du pancréas par les cellules
tumorales. La vectorisation du NODH permet donc l’utilisation de doses infra-thérapeutiques
de NODH pour cibler spécifiquement la tumeur par effet EPR et assurer la libération d’une
dose de composé suffisante pour entrainer la régression de la tumeur, sans affecter les cellules
circulantes et les organes sains environnants.
225
Acidic pH responsive Polymer conjugate of
trichostatin A anlogue in combination with
Decitabine to cure asbestos cancer.
Daniel Pouliquen1, Loic Pichavant2, Valérie Héroguez2, Marc Grégoire1, Christophe
Blanquart1, Philippe Bertrand3.
1. Inserm, U892, Nantes, F-44000, France; CNRS, UMR 6299, Nantes, F-44000, France;
Univ Nantes, Nantes, F-44000, France. 8 quai Moncousu, 44007 Nantes cedex 1, France.
Avenue Pey-Berland, F-33607 Pessac, France.
Michel Brunet, B28, F-86000 Poitiers, France.
KEYWORDS: tumor targeting, ROMP, nanoparticle, HDAC inhibitor, epigenetic, cancer
ABSTRACT
Epigenetic drugs used to renormalize gene expressions in tumour cells have
unfavourable pharmacokinetic and dynamic properties and require solutions for selective
delivery in vivo to complete cellular renormalization or re-sensitization for chemo-resistant
cells. The design of a general and efficient drug delivery system for all the chemical space of
epigenetic drugs is challenging, taking also into account the existing biological barriers that
must be by-passed to reach the tumour site. The use of a standardized chemistry and the
rational design of the biopolymer and loading of the drugs can lead not only to highly flexible
access to functional biopolymers but also to biopolymers having intrinsic capabilities to reach
tumour sites and enter cancer cells. Such functional biopolymers can be obtained by the
flexible Ring-Opening Metathesis Polymerization with drug loading designed for pHmediated release during endocytosis.
226
1.
INTRODUCTION
Despite the tremendous efforts made to fight cancer, using single or combined
chemotherapies, with more or less specific delivery strategies[1], some forms of cancers are
still looking for therapeutic curative treatments, in particular cancers affecting vital organs.
Finding efficient treatments for such hard cases could be valuable in general for other types of
cancer by possibly improving current treatments. Malignant Pleural Mesothelioma (MPM) is
one of the worst cancer types, mainly resulting from asbestos exposure. MPM first line
treatment lies in chemotherapy (Pemetrexed-cisplatin), but only gives an additional few
months’ survival. A possible improvement for MPM could be envisioned by specific delivery
of therapeutic compounds in the tumor. The effect of bioactive compounds can be improved
by using drug delivery systems (DDS), but this is not a trivial task as illustrated by the limited
number of clinically approved solutions such as the liposomal Doxil® or albumin-based
Abraxane®. The general rules for DDS design applied in cancers are i) passive targeting with
high selectivity for tumour tissues versus normal ones due to the enhanced permeability and
retention effect (EPR)
[2]
, ii) active targeting by selective recognition of cancer cell versus
normal cells, based on over expressed cancer biomarkers like folate receptors, integrins and
others and iii) loading the drug in an inactive form and get a specific release upon cancer celldependant biological stimuli, like enzymatic reactions or pH variations occurring in the tumor
microenvironment or endocytosis
[3]
. MPM is difficult to detect at early stage and the lack of
specific biomarkers does not allow for an active targeting approach. Thus MPM targeting
could be achieved with highly specific passive tumor targeting while release of bioactive
compounds would be ideally obtained in cancer cells to avoid any side effect resulting from
diffusion of compounds outside the tumor environment. Studies with conventional
chemotherapeutic agents to treat MPM, alone or in combination, as free molecules or attached
to DDS[4-6], all led to limited results. Recent data suggested that this lack of efficacy could be
related to epigenetic errors leading to aberrant gene expression in tumor cells[7].
In the past two decades, epigenetic has emerged as an important mechanism regulating
gene expression without affecting the DNA sequence. Abnormal epigenetic activities were
associated to various diseases like diabetes, neurological disorders and more specifically
cancer[8]. Inhibitors targeting epigenetic actors are thus receiving high attention as anticancer
compounds for innovative treatments, with aiming at stimulating tumor suppressor gene
(TSG) expression, as TSG are silenced in most cancer cell lines[9]. Despite the synthetic
efforts made in the field, only four compounds are approved today for clinical application.
227
Two compounds used in various cancers treatments are demethylating agents, inhibiting DNA
methyl transferases (DNMT)[21]. The two others are histone deacetylases (HDAC)
inhibitors[10] (HDACi), approved only for a cutaneous cancer type[11].
Several clinical trials have been designed to evaluate epigenetic strategies in MPM,
where conventional chemotherapeutic compounds were used with epigenetic small molecule
inhibitors, but the results were not convincing, as illustrated by the failure of Vorinostat in
phase III (http://www.asbestosnews.com), as well as other single or combined treatments[12].
Considering the fact that epigenetic-based strategies need time to show positive effect, Baylin
and Jones[13] demonstrated that lower doses and systemic administration of demethylating
agents gave better results in cancers compared to point to point higher dosing administrations.
If DNMT inhibitors were successfully applied in cancers, attempts to apply HDACi on solid
or diffuse tumors in vivo gave poor results. A reason for the lack of efficacy of HDACi is due
to their very short half life in vivo, possible protein interactions, and unselective
biodistribution leading to toxic side effects. Taking into account the results of Baylin and
Jones with demethylating agents and the in vivo lack of efficacy of HDACi we envisioned the
combination of these two classes of compounds to treat mesothelioma. In the case of HDACi,
we speculated that specific delivery should give better results by reducing metabolic
elimination.
If DDS or prodrugs for epigenetic inhibitors were previously reported[14], the use of
micromolar active compounds like SAHA does not lead to tumour reduction in vivo. Indeed
DDS should be more useful for compounds with very high potency that can be loaded in
small amount in DDS. In a previous work, we developed analogues of trichostatin A 1 (TSA)
and obtained the nanomolar active compound 2 able to stimulate TSG expression in non small
lung cancer cells[15]. Used in combination with cisplatin, this compound reduces resistance of
MPM cells[16]. With an optimized gram scale synthesis (Scheme 1, supplementary information
for detailed synthesis), compound 2 appeared as a good substitute to TSA for studying DDS
strategy. We have also reported a flexible synthesis of polymeric spherical core shell
nanoparticles as DDS based on the Ring-Opening Metathesis Polymerization (ROMP) of
functional norbornenyl-polyethylene oxide macromonomers[17]. This type of nanoparticles
showed efficient passive tumour targeting by the EPR effect and was internalized by an active
mechanism, probably chlatrin-independent macropinocytosis. This ROMP-DDS did not
require active targeting to be efficient and may match the needs for MPM treatment, with
passive targeting and local intracellular delivery of therapeutic compounds.
228
2.
RESULTS/DISCUSSION
In order to load the TSA analogue 2 on the DDS, we first prepared a pH-responsive
clickable prodrug 7 (Scheme S1 supplementary information) starting from the described
alkyne 6[18]. The presence of two toluyl groups was preferred according to previous results
with Vorinostat (Table S1). Alkyne clickable prodrug 7 was obtained, and its half life at
acidic and physiological pHs was determined. Compared to the equivalent Vorinostat prodrug
8b this new prodrug 7 appeared more labile (Table S1). Then, the prodrug in the presence of
the known azido-macromonomer 13[22] under copper catalysis reacted to produce the final
functional TSA analogue-bearing macromonomer 15, to be used for DDS synthesis. The
formation of the macromonomer 15 was verified by appearance of the hydrogen signal of the
new triazole ring. Functional core-shell nanoparticle (NP) 13 were then prepared in dispersed
media by mixing norbornene 11 with macromonomers 9 and 12 in a X:Y:Z molar ratio
(Scheme S2). Before biological uses NP 13 were transferred in aqueous solutions.
229
A
C
E
2
7
NP 13
2
7
NP 13
Bare NP
NP 13
B
2
7
NP 13
2
7
NP 13
D
F
2
7
NP 13
Figure 1: Pharmacological characterization of NPs 13. A to C) MeT-5A cells were transfected with phRlucC1 BrD and pEYFP-C1 histone H3. A) Cells were treated for 16 h with increasing doses of the different
molecules. B) Graphic represents the maximal induced-BRET signal measured for each molecule in the dose
response experiment. C) Cells were treated with 500nM of compound 2, 500nM compound 7 or 0.25 mg/mL
NPs 13 (6 µM compound 2) during 8h, 24h, 36h or 48h. Results were expressed as the induced-BRET signal. D)
Graphic represents the maximal induced-BRET signal measured for each molecule independently of the time of
treatment. E and F) Viability of MM cells was evaluated following 72h of treatments with increasing amounts of
NPs 13 (E and F), bare-NPs (E), compounds 2 (F) or 7 (F) for 72 h. Results are the means ± S.E.M of three
independent experiments.
We first compared the behaviour of the free TSA analogue 2 in vitro, its prodrug 7 and
the functional NP 13 regarding their ability to induce HDAC inhibition in cells with a
bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assay, allowing the measure of histone
H3 acetylation[19]. In this assay, an increase of the BRET signal reflects an increase of histone
H3 acetylation. Moreover, this assay conducted directly in living cells confirmed that the free
230
compound, prodrug 7 and NPs 13 were able to increase histone H3 acetylation (Figure 1 A to
D). Altough pharmacological properties of compound 2 were not altered in prodrug 7, the
activity of compound 2 was reduced when loaded in NPs. Indeed, the maximal induced-BRET
was obtained at 0.25 µM for compound 2, 0.5 µM for prodrug 7 and at 2.5 µM for NPs 13
(Figure 1A). A decrease of the BRET max, and then of the maximal histone H3 acetylation,
was also observe with NPs 13 compared to compound 2 and 7. However, this difference is not
significant (Figure 1B). The kinetic of histone H3 acetylation was similar for compound 2,
prodrug 7 and NPs 13, with a maximal BRET induction after 36h of treatment (Figure 1C).
As in the dose response experiments, the capacity of NPs 13 to increase histone H3
acetylation seemed to be reduced regarding the maximal induced-BRET signal obtained in
kinetic experiments (Figure 1D). All these results demonstrated that even if the activity of
compound 2 is reduced when grafted on NPs, NPs 13 can deliver HDACi into cells and
induce histone H3 acetylation. We then evaluated the toxicity of NPs 13 on mesothelioma
cells. While bare-NPs induced no toxicity for any tested concentrations of polymer, NPs 13
decreased cell viability from a dose of 0.05 mg/ml of polymer. This result showed that
induced toxicity was related to the delivery of HDACi and not to a side effect of the polymer
itself. When compared to compounds 2 and 7, NPs 13 were less toxic, which is consistent
with BRET measurements, thus to histone H3 acetylation.
In a previous work, we demonstrated that the nanovector we used specifically
accumulated in tumors in a mouse model of subcutaneous cancer. For this work we used an
orthotopic model of mesothelioma, producing diffuse tumours[17]. We first verified the passive
targeting properties of the ROMP-DDS in this model with a bioactive compound-free
fluorescent NP 14 (Scheme S3) to compare with the passive targeting obtained previously
with subcutaneous tumours. A solution of the fluorescent NP 14 (60 µg polymer/g) was
injected in the tail vein of mice and biodistribution was evaluated after 1h, 6h, 24h, 72h and
96h. Fluorescent imaging of isolated organs demonstrated a strong and specific accumulation
of NPs 14 in tumours over time (Figure 2). This accumulation increased in the first time
points and reached a plateau 72h after injection, then remained stable until 96h. This result
demonstrated that the nanovector was adapted for the delivery of active compound directly
into the tumours by passive targeting.
231
Figure 2. Biodistribution of NPs 14 in an orthotopic mouse model of mesothelioma. C57Bl/6 mice
bearing orthotopic AK7 tumours were injected with 60 μg of NPs 14 per g of mice in the tail vein. A to C)
Representative pictures of fluorescence observed on dissected tumour (Tu), blood (Bl), liver (Li), ovary (Ov),
brain (Br), spleen (Sp) and kidneys (Ki) 1h (A), 6h (B), 24h (C), 72h (D) and 96h after injection. B)
Quantification of NPs 14 accumulation in tumours over time. Results are means ± S.E.M. of results obtained on
5 mice. * p<0.05; ** p<0.01
Having demonstrated the specific biodistribution of the NPs into the tumour tissue, we
evaluated the anti-tumour activity of the functionalized NPs 13 in the murine orthotopic
model of mesothelioma. We previously demonstrated in this model that the combination of
HDACi with a hypomethylating agent, the decitabine, decreased tumour mass more
efficiently than compounds used alone[20]. In this study, four groups of five mice bearing
tumour were defined. Group 1 was untreated and groups 2 to 4 received two intraperitoneal
injection of 4µg/g of decitabine. Then, groups 2 to 4 were given successively four intravenous
injections of bare-NPs (80 µg/g), free NODH (0.25 µg/g) and NPs 13 (0.25 µg/g NODH, 16
µg/g polymer). The groups and the schedule corresponding to this experiment are illustrated
in supplementary data (Figure S1).
232
A
*
B
*
**
**
*
CT
C
CT
*
Bare NODH NODH NPs13
NPs
1x
5x
1x
NODH
D
NPs 13
Figure 3: In vivo anti-tumour activity of NPs 13. C57Bl6 mice bearing intra-peritoneal AK7 tumors were
treated with intravenous injection of bare-NPs (80 µg/g), NODH 1x (0.25 µg/g), NODH 5x (1.25 µg/g) or NPs
13 1x (0.25 µg/g NODH, 16 µg/g polymer) in association with decitabine 4µg/g. A) Graphic represents the
tumor weight measured at the end of the experiment. Results are means ± S.E.M. of results obtained on 5 mice.
* p<0.05; ** p<0.01. B to D) Representative histology pictures of pancreas from the control group (B), NODH
1x treated group (C) or NPs13 1x treated group (D). Arrows indicate areas of pancreatic invasion by tumour
cells.
Figure 3A shows that tumours’ weight were not modified following injections of bareNPs, showing the absence of effect in vivo of this polymer. The presence of decitabine in this
condition confirmed, as we previously observed[20], that this compound has no anti-tumour
effect by itself in the model of peritoneal mesothelioma herein described. Interestingly,
although intravenous (iv) NODH injections were not responsible for an anti-tumour effect, iv
NPs 13 injections, containing an equivalent amount of NODH (0.25 µg/g), massively
decreased (80%) tumours’ weight. The same anti-tumour effect than NPs 13 was obtained
with the injection of a dose of free NODH 5 times higher (1.25 µg/g) (Figure 3A). Moreover,
in untreated mice and in free NODH 1x injected mice, we observed cancer cells invasion in
233
large and numerous pancreatic areas (Figure 3 B and C), whereas NPs 13 injected mice did
not display any tumor cell invasion in their pancreatic tissue (Figure 3D). Thus, vectorization
of NODH clearly improves its anti-tumour properties in vivo by at least 5 times. All tested
conditions did not induce any toxicity in mice organism, determined by weighting liver,
kidneys and spleen and by determining blood formula, suggesting that injections of NPs 13
were safe (Figure S2). Although the in vitro study tended to show that NODH vectorization
decreased its activity, the in vivo study clearly demonstrated the opposite. This suggests that
the improvement of NODH activity in vivo was mainly obtained by the delivery of more
compounds in tumour site throught the exploitation of the EPR effect. In conclusion, our
strategy allows a specific accumulation of the active compound into the tumour by passive
targeting. By improving the delivery of the compound, the injected HDACi amount can be
significantly reduced (5 times lower) and yet to obtain the same anti-tumor effect than the free
HDACi, without any additional side effects.
234
SUPPLEMENTARY INFORMATION
4
4
vi, 2
vii
6
2+6
7
8a, R = Ph
8b, R = pToluyl
8c, R = pAnisyl
4
Scheme S1: Synthesis of clickable prodrug 7. Reaction conditions: ii) H2O:CH3CN, pH buffers.
Tol =
9, R = OH
10, R = N3
7+10
76
11
i
76
12
ii
4
9, 11
430
3
76
13
76
1
110
14
1
76
76
Scheme S2: Nanoparticle synthesis. Reaction conditions: ii) iii) pH < 7, H2O. TSAa = 2, 3B = 10, NP4 = 18,
NP5 = 20, NP00 = NP nue (OH), NP000= Rhoda seule, NP1 = 19
235
TSA 1
rac-2
ii
i
3
iii
4a, R = Me
4b, R = H
5
Scheme S3: Synthesis of compound 2. Reaction conditions: i) KHCO3 3eq., CH3I 6 eq. rt, 4 days. ii) iii) EDC,
NH2OH (freshly prepared from NH2OH.HCl, KOH, MeOH).
Previous synthesis of compound 2 was in 9 steps on milligram scale and used reductive amination with
NaBH3CN to prepare the dimethylamino group. On larger scale this reagent used in slightly acidic conditions is
not safe and was removed in our improved synthesis on gram scale. Analogue 2 was synthesized in 6 steps by
direct trimethylation of 4-amino-salicylic acid 3 to the major ester 4a easily separated from monométhylamino
ester 4b. Conversion of ester 4a to acid 5 as already reported allowed accessing compound 2 by direct
hydroxamic acid preparation in up to 4 g synthesis. TSAa = 2, 3B = 10, NP4 = 18, NP5 = 20, NP00 = NP nue
(OH), NP000= Rhoda seule, NP1 = 19
11b
10
pH 4.3
20 h
6h55min
pH 5.0
18h
pH 6
80h (3.3 days)
123h (5.1 days)
pH 7.3
4 days
2.5 days
Table S1: Half lives of prodrugs 10 and Vorinostat version at selected pHs.
Figure S1: Groups description and schedule of the in vivo experimental protocol
236
RÉFigure
SULTATSS3
- Article V
Leucocytes
A
CT
C
NODH
1x
NODH
5x
E
NODH
1x
NODH
5x
D
NODH
1x
NODH
5x
F
NPs13
1x
NODH
1x
NODH
5x
NPs13
1x
Kidneys
CT
NPs13
1x
Spleen
CT
CT
NPs13
1x
Thrombocytes
CT
Erythrocytes
B
NODH
1x
NODH
5x
NPs13
1x
NODH
5x
NPs13
1x
Liver
CT
NODH
1x
Figure S2. Toxic and haematological effects of NODH and NPs 13. C57Bl6 mice bearing intra-peritoneal
AK7 tumors were treated with intravenous injection of bare-NPs (80 µg/g), NODH 1x (0.25 µg/g), NODH 5x
(1.25 µg/g) or NPs 13 1x (0.25 µg/g NODH, 16 µg/g polymer) in association with decitabine 4µg/g. The day of
mice euthanasia, blood samples were collected and analyzed to determine (A) leucocytes (B) erythrocytes and
(C) [567]thrombocytes. (D) kidneys, (E) spleen, (F) liver were collected and weighted. Graphics represent the
means ± S.E.M of results obtained on 5 mice.
237
REFERENCES
1. Dawidczyk CM, Kim C, Park JH, Russell LM, Lee KH, Pomper MG et al.: State-of-theart in design rules for drug delivery platforms: lessons learned from FDAapproved nanomedicines. J Control Release 2014, 187: 133-144.
2. Sato NL, Niimura S, Fujisawa N, Maeda Y: Characterization of vascular permeabilityincreasing component isolated from solid tumors and the effect of highly
polymerized dextran sulfate on its activity. Jpn J Pharmacol 1986, 41: 163-171.
3. Scita G, Di Fiore PP: The endocytic matrix. Nature 2010, 463: 464-473.
4. Colson YL, Liu R, Southard EB, Schulz MD, Wade JE, Griset AP et al.: The performance
of expansile nanoparticles in a murine model of peritoneal carcinomatosis.
Biomaterials 2011, 32: 832-840.
5. Arrieta O, Medina LA, Estrada-Lobato E, Ramirez-Tirado LA, Mendoza-Garcia VO, de la
Garza-Salazar J: High liposomal doxorubicin tumour tissue distribution, as
determined by radiopharmaceutical labelling with (99m)Tc-LD, is associated
with the response and survival of patients with unresectable pleural
mesothelioma treated with a combination of liposomal doxorubicin and cisplatin.
Cancer Chemother Pharmacol 2014, 74: 211-215.
6. Arrieta O, Medina LA, Estrada-Lobato E, Hernandez-Pedro N, Villanueva-Rodriguez G,
Martinez-Barrera L et al.: First-line chemotherapy with liposomal doxorubicin plus
cisplatin for patients with advanced malignant pleural mesothelioma: phase II
trial. Br J Cancer 2012, 106: 1027-1032.
7. Vandermeers F, Neelature Sriramareddy S, Costa C, Hubaux R, Cosse JP, Willems L: The
role of epigenetics in malignant pleural mesothelioma. Lung Cancer 2013, 81: 311318.
8. Rius M, Lyko F: Epigenetic cancer therapy: rationales, targets and drugs. Oncogene
2012, 31: 4257-4265.
9. Arrowsmith CH, Bountra C, Fish PV, Lee K, Schapira M: Epigenetic protein families: a
new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov 2012, 11: 384-400.
10. Bertrand P: Inside HDAC with HDAC inhibitors. Eur J Med Chem 2010, 45: 20952116.
11. Duvic M, Vu J: Vorinostat: a new oral histone deacetylase inhibitor approved for
cutaneous T-cell lymphoma. Expert Opin Investig Drugs 2007, 16: 1111-1120.
12. Scherpereel A, Berghmans T, Lafitte JJ, Colinet B, Richez M, Bonduelle Y et al.:
Valproate-doxorubicin: promising therapy for progressing mesothelioma. A
phase II study. Eur Respir J 2011, 37: 129-135.
13. Kaiser J: Epigenetic drugs take on cancer. Science 2010, 330: 576-578.
14. El Bahhaj F, Dekker FJ, Martinet N, Bertrand P: Delivery of epidrugs. Drug Discov
Today 2014.
15. Charrier C, Clarhaut J, Gesson JP, Estiu G, Wiest O, Roche J et al.: Synthesis and
modeling of new benzofuranone histone deacetylase inhibitors that stimulate
tumor suppressor gene expression. J Med Chem 2009, 52: 3112-3115.
16. Gueugnon F, Cartron PF, Charrier C, Bertrand P, Fonteneau JF, Gregoire M et al.: New
histone deacetylase inhibitors improve cisplatin antitumor properties against
thoracic cancer cells. Oncotarget 2014, 5: 4504-4515.
17. Gueugnon F, Denis I, Pouliquen D, Collette F, Delatouche R, Heroguez V et al.:
Nanoparticles produced by ring-opening metathesis polymerization using
norbornenyl-poly(ethylene oxide) as a ligand-free generic platform for highly
selective in vivo tumor targeting. Biomacromolecules 2013, 14: 2396-2402.
238
18. Delatouche R, Denis I, Grinda M, El Bahhaj F, Baucher E, Collette F et al.: Design of pH
responsive clickable prodrugs applied to histone deacetylase inhibitors: a new
strategy for anticancer therapy. Eur J Pharm Biopharm 2013, 85: 862-872.
19. Blanquart C, Francois M, Charrier C, Bertrand P, Gregoire M: Pharmacological
properties of new benzofuranone compounds. Curr Cancer Drug Targets 2011, 11:
919-928.
20. Leclercq S, Gueugnon F, Boutin B, Guillot F, Blanquart C, Rogel A et al.: A 5-aza-2'deoxycytidine/valproate combination induces cytotoxic T-cell response against
mesothelioma. Eur Respir J 2011, 38: 1105-1116.
21. Martinet N, Michel BY, Bertrand P, Benhida Rachid: Small molecules DNA
methyltransferases inhibitors. Med Chem Commun 2012, 3: 263-273.
22. Colette F, Delatouche R, Blanquart C, Gueugnon F, Gregoire M, Bertyrand P et al. : An
easy and effective method to produce functionalized nanoparticles for cellular
uptake. J Polym Sci, Part A 2012, 51:176.
239
RÉSULTATS - Article VI
Article VI: Cisplatin in combination with phenethyl isothiocyanate
(PEITC), a new therapeutic strategy for malignant pleural
mesothelioma.
Iza Denis1-3, Laurent Cellerin1-4, Marc Gregoire1-3 and Christophe Blanquart1-3§.
1: Inserm, UMR892, Nantes, F-44000, France
2: CNRS, UMR6299, Nantes, F-44000, France
3: Université Nantes, Nantes, F-44000, France
4: Service d’Oncologie Médicale Thoracique et Digestive, Hôpital Laënnec, CHU de Nantes, France.
Introduction:
Le mésothéliome pleural malin (MPM) est une tumeur très agressive de la plèvre
caractérisée par un développement très lent et une médiane de survie après diagnostic ne
dépassant pas 12 mois. Le traitement de première ligne du MPM est une combinaison de
cisplatine avec l’anti-métabolite Pemetrexed, ayant montré dans plusieurs essais cliniques une
amélioration des effets thérapeutiques en comparaison avec le cisplatine seul [593].
Cependant, cette combinaison n’apporte qu’un bénéfice clinique limité et est responsable
d’effets secondaires importants. Il apparaît donc comme nécessaire de développer de
nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement du MPM. Les composés naturels pour
traiter le cancer sont désormais reconnus comme des alternatives à fort potentiel
thérapeutique. Ainsi, la consommation fréquente de crucifères permettrait de réduire les
risques de cancer [594]. Les propriétés anti-tumorales sont attribuées aux isothiocyanates
(ITCs), les produits de dégradation des glucosinolates présents dans ces végétaux. Parmi les
différents ITCs, nous nous sommes intéressés au phénéthyl isothiocyanate (PEITC), ayant
démontré des propriétés anti-tumorales particulièrement prometteuses. Dans le but d’une
amélioration des thérapies conventionnelles appliquées pour le traitement du MPM, nous
avons étudié les effets du PEITC seul ou en combinaison avec du cisplatine sur des cellules de
MPM.
Matériels et Méthodes:
Neuf lignées cellulaires de MPM établies au laboratoire directement à partir
d’échantillons de liquides pleuraux de patients et des cellules mésothéliales péritonéales
primaires ont servi de modèles d’étude. Les cellules étaient traitées avec du PEITC seul ou en
combinaison avec du cisplatine. Le co-traitement avec le N-acétyl-cystéine (NAC) permettait
de mettre en évidence un mécanisme de stress oxydatif. La viabilité cellulaire était mesurée
grâce à un agent métabolique, l’Uptiblue, et l’induction des cellules en apoptose par un
240
marquage à l’Annexine V. La détection de la production de ROS par les cellules était obtenue
par pré-incubation des cellules, avant traitement avec les composés d’intérêt, par une sonde
fluorescente spécifique (CM-H2DCFA). L’induction de dommages à l’ADN par les
molécules d’intérêt était évaluée par marquage des cellules après traitement avec un anticorps
spécifique du γ-H2AX puis observation des cellules sur lamelles par microscopie à
fluorescence.
Résultats/Conclusion:
Le PEITC entraîne une diminution de la viabilité cellulaire de manière dosedépendante. Cette cytotoxicité est entièrement corrélée à une production de ROS, mettant en
évidence l’induction d’un stress oxydatif par le PEITC. Le cisplatine augmente aussi la
cytotoxicité des cellules de MPM de façon dose-dépendante, mais la production de ROS ne
semble pas être le seul mécanisme impliqué dans sa cytotoxicité. En effet, le cisplatine est une
molécule qui a été découverte depuis de nombreuses années et dont les mécanismes d’action
sont multiples. La combinaison cisplatine-PEITC permet d’augmenter la cytotoxicité des
molécules sur des cellules de MPM comparé aux molécules seules, et d’outrepasser le
développement de mécanismes de résistance. En effet, alors que les molécules seules
permettent aux cellules d’acquérir des mécanismes de résistance au bout de 3 jours de
traitements, la combinaison conduit au bout de 9 jours à la mort de plus de 95% des cellules.
La combinaison permet en effet d’augmenter les dommages à l’ADN, ce qui pourrait
expliquer l’absence de résistance. En effet cisplatine et PEITC sont des molécules qui toutes
deux entraînent des dommages à l’ADN, mais de nature différente. Ceci oblige la cellule à
activer diverses voies de la machinerie de réparation des dommages à l’ADN, ce qui limite la
possibilité des cellules tumorales à devenir résistantes. De plus, la combinaison cisplatinePEITC n’est pas toxique sur les cellules mésothéliales saines, qui sont normalement présentes
dans le microenvironnement tumoral. Ceci peut s’expliquer par une plus grande tolérance des
cellules mésothéliales saines à supporter un stress oxydatif, notamment grâce à une protection
conférée par les cycles d’oxydo-réduction du glutathion ou l’activité de certaines catalases
[595]. Ces voies de signalisation anti-oxydantes sont souvent perturbées dans les cellules
mésothéliales malignes, conduisant à une accumulation des ROS dans ces cellules et in fine à
une induction des cellules en apoptose.
La combinaison cisplatine-PEITC permet donc d’augmenter la cytotoxicité des
molécules sur des cellules de MPM, d’augmenter les dommages à l’ADN, d’empêcher les
241
cellules traitées d’acquérir des mécanismes de résistance, ceci tout en demeurant sans toxicité
sur des cellules mésothéliales saines normalement présentes dans le microenvironnement
tumoral. Ce travail apporte pour la première fois des preuves de l’intérêt de combiner une
molécule naturelle, le PEITC, avec le cisplatine pour le traitement du MPM.
242
Cisplatin in combination with phenethyl
isothiocyanate (PEITC), a new therapeutic strategy
for malignant pleural mesothelioma.
Iza Denis1-3, Laurent Cellerin1-4, Marc Gregoire1-3 and Christophe Blanquart1-3§.
1: Inserm, UMR892, Nantes, F-44000, France
2: CNRS, UMR6299, Nantes, F-44000, France
3: Université Nantes, Nantes, F-44000, France
4: Service d’Oncologie Médicale Thoracique et Digestive, Hôpital Laënnec, CHU de Nantes,
France.
§ Corresponding author
243
ABSTRACT
Background: Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a very aggressive form of cancer
with a poor diagnosis and prognosis but mostly lacking effective treatments. Although it has
long been considered as a rare type of cancer, it has now become a major public health issue
as MPM incidence is expected to reach its highest peak in the 2020’s. The first line treatment
for MPM is a combination of cisplatin and Pemetrexed anti-metabolite, which displayed
limited efficacy and severe side effects. The naturally occurring compound phenethyl
isothiocyanate (PEITC) previously showed interesting anti-tumor properties on several cancer
cell lines. We thus aim at evaluating PEITC used alone or in combination with cisplatin in
order to improve MPM treatment.
Methods: Nine MPM cell lines established from patients’ pleural fluids in our laboratory and
belonging to a validated biocollection, were used to assess PEITC and cisplatin anti-tumor
properties. Primary mesothelial cells were used as controls. Compounds were used alone or in
combination. Their effects were evaluated on cell viability, apoptosis, Reactive Oxygen
Species (ROS) production and DNA damage.
Results: Both PEITC and cisplatin were cytotoxic on MPM cells in a dose dependent manner.
We herein showed that PEITC-induced cytotoxicity was exclusively due to the generation of
ROS, while it only remains a part of cisplatin-induced cell death mechanisms. Moreover, we
showed for the first time that cisplatin-PEITC combination allowed the potentialisation of
both compounds’ cytotoxic effects by inducing broad DNA damage and prevented the
emergence of resistant MPM cells. Interestingly, healthy primary mesothelial cells were not
sensitive to the combination treatment, highlighting the safety of such treatment on healthy
cells.
Conclusion: Altogether, this work provides strong evidences for the benefit of combining a
naturally occurring compound such as PEITC with cisplatin to treat MPM as well as its lack
of toxicity on healthy cells. Cisplatin-PEITC combination thus represents a promising strategy
to induce a selective toxicity towards malignant cells.
Key words: malignant mesothelioma, cisplatin, isothyocyanate, reactive oxygen species,
combination treatment.
244
1.
INTRODUCTION
Malignant pleural mesothelioma (MPM) is an aggressive neoplasm affecting the
mesothelial surfaces of pleural and peritoneal cavities[1] mainly arising from a chronic
exposure to and inhalation of asbestos[2]. Its aggressiveness and critical health care matter
mainly arise from its late diagnosis and poor prognosis (less than a year after diagnosis). The
first line treatment for Malignant pleural mesothelioma (MPM) lies in the combination of
cisplatin with an anti-metabolite: the Pemetrexed (Alimta). There are several clinical trials
relating this combination to treat MPM[3,4], that lead to better response compared to cisplatin
alone[5]. However, this improvement remains modest and only half of the patients respond to
the combination[6]. It is thus necessary to find new therapeutic approaches to treat MPM.
It has now been described for many years that frequent consumption of cruciferous
vegetables reduces the incidence of cancer[7]. The active compounds primarily responsible for
those cancer chemopreventive properties were described to be the glucosinolates[8,9], which
are substituted B-thioglucoside N-hydroxysulfates synthesized by the plant from 8 amino
acids. However, the inhibition of carcinogenesis seems to rather be attributable to some of
their breakdown products: the isothiocyanates (ITCs) [10].
ITCs anticarcinogenic properties mechanisms of action are still under investigation but
it is now established that it stems from their ability to disrupt multiple carcinogenic process
step. They were shown to reduce genetic damage, inhibit genetically damaged cell
proliferation thanks to the induction of apoptosis and cell cycle arrest, but were also involved
in malignant cells differentiation[11,12]. These anti-tumor effects may be due to the generation
of Reactive Oxygen Species (ROS) that was previously reported to be one of Benzyl ITC
(BITC) mechanisms of action[13,14].
In animal models, more than 20 ITCs were shown to inhibit carcinogenesis induced by
several chemical carcinogens[11,15]. In human, it has been reported that those vegetables are
good protective agents against several kinds of cancer: colorectal[16], lung[17] and possibly
prostate cancers[18]. Among all ITCs, it was shown in vivo that Phenethyl Isothiocyanate
(PEITC) was able to reach the highest plasma concentration after oral ingestion[19], at a
micromolar dose range. Interestingly, micromolar doses of PEITC applied to animal and cell
culture models were shown to prevent cancer, through several mechanisms that still need to
be further investigated[10,20]. We thus wondered whether combining cisplatin with PEITC
could be of potential therapeutic benefits for patients suffering from MPM, and if it could lead
to less side effects and more specificity on cancer cells.
245
For these purposes, we focused on the anti-tumor properties of PEITC alone or in
combination with cisplatin on a large collection of MPM cell lines freshly established from
patients’ pleural effusions in our laboratory. We demonstrated for the first time that PEITC is
cytotoxic for MPM cells through ROS production. Moreover, cisplatin-PEITC combination
allowed potentialisation of both compounds’ cytotoxic effects and prevented the emergence of
resistant MPM cells. Interestingly, healthy primary mesothelial cells were not sensitive to the
combination. Our results suggest that the combination cisplatin-PEITC could be of great
interest for MPM treatment.
2.
METHODS
Cell culture
The nine mesothelioma cell lines: Meso4, Meso11, Meso13, Meso34, Meso47,
Meso56, Meso76, Meso96 and Meso152 were established from pleural fluids of patients
[609]. These cells were characterized for the mRNA expression of the usual MPM markers by
immunohistochemistry (see additional file 1) and belong to a validated biocollection
(Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche n° DC-2011-1399 and
Commission Nationale de l'Informatique et des Libertés (CNIL) n°: 1657097). All cell lines
were maintained in RPMI medium (Invitrogen) supplemented with 2mM L-glutamine,
100IU/ml penicillin, 0.1mg/ml Streptomycin and 10% heat-inactivated fetal calf serum
(Eurobio) and cultured at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. The primary peritoneal mesothelial
cells (MC), MES-F, were purchased from Tebu-bio biosciences and cultured according to the
manufacturer’s recommendations.
Drugs
PEITC, N-acetyl-cystein (NAC) and cisplatin were purchased from Sigma-Aldrich.
Determination of cell viability
Cell viability was monitored using Uptiblue reagent (Interchim) as previously
described [567]. Cells were seeded in 96-well plates at a density of 5x103cells/well in culture
medium for 24h. Then compounds were added for an additional 72h and Uptiblue reagent
(5%, v/v) was then added to the culture medium for 2h at 37°C. Fluorescence was measured
at 595nM after excitation at 532nM using a Typhoon apparatus (GE Healthcare). For kinetic
experiments, culture medium containing Uptiblue was replaced by medium with or without
246
drug for 72h and the procedure for cell viability measurement was repeated twice. Results
were expressed as percentage of untreated cells.
Detection of Reactive oxygen species
Cells were seeded at a density of 1x106cells/well in 12 well plates. 24h after seeding,
cells were washed once with PBS and incubated for 30min at 37°C with the CM-H2DCFA
probe (Life Technologies), resuspended in PBS at a final concentration of 5µM, washed once
with PBS and treated with Cisplatin or PEITC alone or in combination. 24h after treatment,
cells and their supernatant were harvested and analyzed by flow cytometry (FACSCalibur;
Becton Dickinson). Ten thousand events were collected and analyzed with the FACS Flowjo
Software (Tree Star Inc).
Detection of apoptosis
Cells were seeded at a density of 1x106cells/well in 6-well plates and treated with
indicated concentrations. After 24h, floating and adherent cells were combined, labeled using
Annexin V-allophycocyanin (APC) (Becton Dickinson) following the manufacturer’s
instructions, and analyzed by flow cytometry (FACSCalibur; Becton Dickinson). Ten
thousand events were collected and analyzed with the FACS Flowjo Software (Tree Star Inc).
Microscopic experiments
Cells were seeded in culture medium on glass coverslips at a density of
5x104cells/well in 12 well plates. 24h later, drugs alone or in combination were added for
additional 24h. Cells were washed twice with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde in
PBS, 15min at room temperature. Cells were permeabilized with 0.05% Triton X-100 (Merck)
/0.05% Tween-20 (Sigma-Aldrich) in PBS (5min) and incubated with anti-H2A.X (phospho
S139) antibody at 1µg/ml (Abcam) in PBS/1% BSA for 1h. Cells were washed twice with
PBS and incubated with a DyLighttm 633 conjugated secondary antibody (Thermo Scientific)
for 1h. After an additional PBS wash, cell nuclei were stained with 1µg/ml Hoechst (SigmaAldrich) (5min). Coverslips were mounted in ProLong® Gold (Molecular Probes) and
fluorescence was visualized using the Axiovert200M microscopy system (Zeiss, Le Pecq,
France) with ApoTome module (X63 and numerial aperture 1.4).
247
Statistical analysis
Statistical analyses were performed using GraphPad prism, (Prism 5, Windows). Data
are expressed as the means ± S.E.M. of at least three experiments. Statistical comparisons
were made using the nonparametric Mann-Whitney test.
3.
RESULTS
PEITC increases MPM cells cytotoxicty through ROS production.
PEITC was previously demonstrated to exert cytotoxic effects on tumor cells by
increasing ROS intracellular level[23]. In order to evaluate the antitumor properties of PEITC,
cell cytotoxic assays were conducted on three MPM cell lines: Meso4, Meso11, Meso152,
treated with increasing doses of PEITC alone or in combination with NAC, a powerful
antioxidant amino acid. NAC was used to highlight the implication of ROS in PEITC-induced
cell death. Indeed, ROS production would be inhibited by NAC treatment. Cell cytotoxicty
with PEITC treatment was increased in a dose-dependent manner, and PEITC had a similar
potency on all cell lines. The IC50 value was 7.4 ± 0.2µM for MPM cell lines (Figure 1A).
PEITC-induced cytotoxicty was inhibited by a co-treatment with NAC, suggesting the
implication of ROS production in this effect.
Then, PEITC-induced ROS in MPM cells was investigated to determine whether it
could be part of the mechanisms involved in cytotoxic effects on cancer cells. Hydrogen
peroxide (H2O2) has very strong oxidizing properties and was used as a positive control for
ROS production. Cell death induction was measured with Annexin-V cells staining (Figure
1B). ROS production was assessed by flow cytometry thanks to cells pre-incubation with the
CM-H2DCFA specific fluorescent probe (Figure 1C). We observed, in a dose-dependent
manner, that PEITC-induced ROS generation was consistent with PEITC-induced cell death
in all tested cell lines (Figure 1B and C). In the presence of NAC, ROS generation and cell
cytotoxicity were decreased, strongly suggesting the causative link between ROS generation
and PEITC-induced cell death. As a control, H2O2 was shown to induce apoptosis and ROS
production in MPM cells.
Cisplatin increases MPM cytotoxicty partly in a ROS dependent manner.
Several studies demonstrated the implication of an oxidative stress generation in
cisplatin cytotoxic effects[24]. Thus, cisplatin dose-response experiments were carried out on
the same three MPM cell lines previously tested. All cell lines were sensitive to cisplatin in a
dose dependent manner. The IC50 value was 1.8 ± 0.21mg/L for MPM cell lines
(Figure
248
2A). Treatment with NAC decreased cisplatin-induced cell cytotoxicity of all tested cell lines,
arising from the possible induction of ROS by cisplatin.
To confirm the implication of an oxidative stress in the cytotoxic effect of cisplatin,
we similarly investigated whether cisplatin induced-cell death is related to a ROS production
and inhibited by NAC (Figures 2B and C). However, cisplatin-induced cell death did not
entirely correlate with a production of ROS. Indeed, although almost 40% of cells died from a
treatment with the highest concentration of cisplatin (25mg/L) (Figure 2B), yet no production
of ROS was detected (Figure 2C). Cells co-treated with cisplatin (25mg/L) and NAC seemed
to be more resistant to death than those untreated with NAC: almost 40% of cells died with
cisplatin alone while about 23% of MPM cells died with the combination. As a control, H2O2
induced ROS production and MPM cell death. H2O2 effects were totally inhibited by a cotreatment with NAC, demonstrating its efficacy to block ROS-induced cell death.
Cisplatin-PEITC combination potentiates their cytotoxic effect through
enhanced DNA damage.
Studies carried out on other cancer types such as non-small cell lung cancer, ovarian,
testicular or cervical cancer demonstrated the implication of DNA damage in cisplatin and
PEITC cytotoxic effects[25,26]. We herein evaluated on MPM cells the combination cisplatinPEITC on DNA damage by looking at the phosphorylation on serine 139 of histone H2A.X
(P-H2A.X), a specific marker for DNA damage[27] (Figure 3 and additional figure 2). No
DNA damage was triggered by PEITC alone, according to P-H2A.X staining, in any cell line.
While no DNA damage was observed in MPM cells after cisplatin treatment alone,
combination of cisplatin with PEITC strongly enhanced P-H2A.X signal. This result suggests
a potentialisation of both compounds effect on DNA damage, indeed triggering more lesions
than compounds used alone. Combination of cisplatin with PEITC would thus potentiate their
apoptotic effect through DNA damage.
Cisplatin-PEITC combination enhances MPM cytotoxicity and prevents
generation of resistant cells.
Cisplatin and PEITC cytotoxic effects after 72h of treatment were assessed using
Uptiblue viability assay. Both compounds were used alone or in combination on MPM cells
seeded in 96 well plates. Three concentrations of PEITC were evaluated, and cisplatin
concentration (0.8mg/L) was used to trigger approximately 40% of cell death (Figure 4A).
MPM cell lines died in a dose dependant manner at all three PEITC concentrations. Cell death
249
was significantly enhanced with combined compounds after 72h at all PEITC concentrations.
It was the most obvious with the 6µM PEITC concentration, as there was almost 80% of cell
death with the combination, when each compound alone only induced about 40% of cell
death. Furthermore, the effect of PEITC and cisplatin on MPM cells viability over time was
assessed over nine days in order to establish a kinetic of both compounds used alone or in
combination (Figure 4B). Viability was measured after 3, 6 and 9 days of treatment and
showed that cisplatin-PEITC combination significantly potentiated both compounds’
cytotoxic effects. After 3 days of combined treatment, there was about 34% viable cells while
compounds alone led to approximately 60% of viable cells. At day 9, there were about 28%
viable cells with cisplatin alone and 47% with PEITC. However, cisplatin-PEITC
combination led to less than 5% viable cells after 9 days of treatment, thus suggesting a strong
synergy when both compounds were combined. Indeed, the combination not only led to a
significant increase of cell death but more importantly prevented the emergence of
chemoresistance, making of this strategy a good candidate to treat reluctant cancer such as
MPM.
Cisplatin and PEITC combination is well tolerated by primary mesothelial
cells.
Aiming at evaluating the toxicity of cisplatin-PEITC combination on healthy cells,
primary MC were treated with cisplatin and PEITC alone or in combination for 72h.
Microscopic pictures (Figure 5A) and viability assay (Figure 5B) showed that MC were not
affected by either compounds alone or combined. Moreover, a comparison between MPM and
primary MC clearly illustrates the safety of our strategy for healthy cells while inducing
almost 100% MPM cell death (Figure 5C). This experiment suggests that the combination
could be injected in pleural cavities with no side effect on cells of healthy pleura.
Additional MPM cell lines are also sensitive to Cisplatin-PEITC combination.
The absence of cisplatin-PEITC toxicity on MC led us to compare the sensitivity of six
additional MPM cell lines from our biocollection (Figure 6). Half of MPM tested cell lines
(Meso13, Meso34 and Meso56) displayed a strong resistance phenotype to cisplatin or PEITC
after the second treatment repetition. Cytotoxic effect and cell death were significantly
enhanced by combining both compounds, but theirs kinetics were variable according to each
cell line. Indeed, combination best efficiency was observed at day 3 for Meso47, 56 and 76
and at day 6 for Meso13, 34 and 96. However, for all cell lines, combining both compounds
250
significantly improved their cytotoxic effects, compared to compounds alone, indeed leading
to less than 10% of viable cells after 9 days of treatment.
4.
DISCUSSION
Treatment of MPM represents a major public health challenge given its
aggressiveness, poor prognosis after diagnosis and more importantly its lack of effective
curative therapies. The first line treatment consists in a combination of cisplatin with the
Pemetrexed anti-metabolite[3,4]. Although this combination showed greater results than drugs
used alone, the benefit for patients remains insufficient. The investigation of new therapeutic
strategies to approach this thoracic malignancy thus became a necessity.
ITCs, arising from the hydrolysis of glucosinolates contained in cruciferous
vegetables, are well known for their anti-carcinogenic properties[10]. Growth of several kinds
of cancer cells was shown to be inhibited by ITCs: leukemia[28,29], prostate cancer[30], breast
cancer[31,32], colorectal cancer[33]. PEITC, a member of ITCs family, was described as an
important anti-carcinogenic compound in humans[10,20]. Using MPM cell lines established in
our laboratory from patients’ pleural fluids, we demonstrated for the first time that these cells
were sensitive to this compound. Furthermore, we showed that PEITC-induced MPM cell
death by apoptosis was fully dependent on ROS production.
However, the benefit of MPM first line treatment is insufficient and needs to be
improved. A previous study demonstrated an interesting potentialisation of cisplatin effect
when combined to PEITC in a model of lung cancer[34]. This study suggested that PEITC
could be a good candidate to improve the effect of cisplatin on MPM cells.
We first characterized the effect of cisplatin on our MPM cell lines. We observed a
dose dependent toxicity of cisplatin through apoptosis induction partly dependent on an
oxidative stress, as demonstrated by the use of NAC. We then demonstrated that PEITCinduced cytotoxic effects were entirely mediated through oxidative stress generation in cells,
while there was more than this mechanism involved in cisplatin-induced cell death
mechanisms of action. Although a couple of studies recently investigated the impact of
cisplatin-PEITC combination on other cancer types[35,36], our work focuses for the first time
on MPM, and brings new insights for a better approach of this incurable disease. Healthy and
malignant mesothelioma models had previously been investigated using similar strategies
acting on the induction of an oxidative stress alone or in combination with cisplatin,
confirming the relevance of these strategies[37,38]. However, we here showed for the first time
251
that cisplatin-PEITC combination significantly enhanced MPM cell death, potentiated DNA
damage and more importantly is safe for healthy cells and prevents the emergence of resistant
cells.
Although cisplatin and PEITC showed interesting anti-tumor activity after 72h when
used alone, repeated treatments led to the apparition of resistant cells characterized by a loss
of compounds’ efficacy to increase cell cytotoxicity over time. Indeed, we observed, in more
than half of MPM tested cell lines, a decrease of sensitivity or a resistance towards each
molecule. This could explain the poor therapeutic benefit of cisplatin on MPM patients and
could also suggest that PEITC used alone would have limited efficacy in clinic. The
mechanisms of action of these two molecules were already described and mainly result in the
formation of DNA damage[25,26]. Our results confirmed the adaptive capacities of tumor cells
to this class of chemotherapeutics-induced lesions. However, DNA damage induced by
cisplatin or PEITC is of different nature thus implying the involvement of distinct pathways
of the DNA damage response (DDR) for cells to by-pass those lesions. MPM patients
sensitivity to cisplatin was previously correlated to mRNA expression of the excision repair
cross-complementation group 1 (ERCC1) involved in the nucleotide excision repair (NER)
pathway[39]. ROS production in cells acts by different mechanisms to damage DNA bases, but
mainly affects guanine that gets transformed into 8-oxo-2’deoxyguanosine (8-oxoG)
[40]
. The
main DNA repair mechanism involved to remove ROS-induced DNA lesions is the base
excision repair (BER) pathway[40]. Therefore, we hypothesized that by combining cisplatin
with PEITC, both BER and NER pathways would be mobilized. The possibility to raise
resistant cells would thus be limited due to the difficulty for a cell to set up two pathways of
the DDR at the same time. Our results demonstrated that all tested cell lines were sensitive to
cisplatin-PEITC combination, reaching less than 5% of viable cells after three repetitions of
treatment. We thus showed a correlation between cisplatin-PEITC cytotoxicty and DNA
damage potentialisation triggered by the combination, as illustrated by the recruitment of the
phosphorylated histone H2A.X to the DNA[27]. These last results therefore demonstrated that
the DDR machineries were overwhelmed, preventing the generation of resistant cells.
Interestingly, cisplatin-PEITC combination induced absolutely no toxicity on primary
mesothelial cells (MC) while same treatment induced MPM cell death. By performing
repetitive treatments over nine days, we also demonstrated that the combination prevented the
emergence of resistant tumor cells. Indeed, we confirmed that the combination was efficient
on nine MPM cell lines while more than half of them became resistant to drugs used alone.
These results suggest that cisplatin-PEITC combination could be an interesting strategy to
252
treat MPM using a local administration regarding its lack of toxicity on MC. The higher
sensitivity of MPM cells to the combined treatment compared to MC probably results from
the capacity of MC to support mild and severe oxidative stress, thanks to gluthatione redox
cycle and catalase-mediated protection [41]. Usually these anti-oxydant pathways are altered in
malignant cells and associated with an increased metabolic activity. These changes lead to a
higher level of ROS in malignant cells compared to healthy cells, which contributes to
promote oncogenic properties such as generation of resistant cells to conventional therapies
but also to sensitive cells to strong oxidative stress[40]. This combination already demonstrated
its efficacy on breast cancer[35] and leukemia cells[42] while displaying no toxicity on their
healthy counterpart, suggesting a good tolerability of healthy cells towards cisplatin-PEITC
combination.
Therefore, a local administration of cisplatin-PEITC combination in pleural cavity
could be a promising strategy to induce selective toxicity towards malignant cells. Altogether,
cisplatin-PEITC combination would enhance cancer cell death compared to compounds used
alone and prevent the emergence of cell resistance, while remaining safe for primary
mesothelial cells.
CONCLUSIONS
The combination of cisplatin with the natural compound PEITC induced a strong
MPM cell death, while remaining safe for primary mesothelial cells, and limited emergence of
cell resistance compared to drugs when used alone. Therefore, this combination could
represent a promising strategy for the treatment of this aggressive pathology.
253
LIST OF ABBREVIATIONS
8-oxoG: 8-oxo-2’deoxyguanosine
APC: allophycocyanin
BER: Base excision repair
BITC: Benzyl isothiocyanate
DDR: DNA damage response
DNA: Deoxyribonucleic acid
ERCC1: Excision repair cross-complementation group 1
ITC: Isothiocyanate
MC: Mesothelial cells
MPM: Malignant pleural mesothelioma
NAC: N-acetyl-cystein
NER: Nucleotide excision repair
PEITC: Phenethyl isothiocyanate
ROS: Reactive oxygen species
COMPETING INTERESTS
The authors declare that they have no competing interests.
AUTHORS’ CONTRIBUTIONS
ID and CB designed and performed experiments; LC provided the patients’ pleural fluids
from which the MPM cell lines were established, ID and CB wrote the manuscript; MG
participated to the redaction of the manuscript; all authors have given final approval.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by INSERM, CNRS, the Ligue National Contre la Cancer for ID
grant, the Ligue inter-regionale Contre le Cancer: committees of Morbihan, Sarthe, Vendée
Loire-Atlantique and Poitou-Charentes, ARSMESO44. The authors thank MicroPICell and
Cytocell core facilities for the microscopic and the flow cytometry experiments, respectively.
254
REFERENCES
1. Kelly RJ, Sharon E, Hassan R: Chemotherapy and targeted therapies for unresectable
malignant mesothelioma. Lung Cancer 2011, 73: 256-263.
2. Wagner JC, Sleggs CA, Marchand P: Diffuse pleural mesothelioma and asbestos
exposure in the North Western Cape Province. Br J Ind Med 1960, 17: 260-271.
3. Vogelzang NJ, Rusthoven JJ, Symanowski J, Denham C, Kaukel E, Ruffie P et al.: Phase
III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in
patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol 2003, 21: 2636-2644.
4. van Meerbeeck JP, Gaafar R, Manegold C, Van Klaveren RJ, Van Marck EA, Vincent M et
al.: Randomized phase III study of cisplatin with or without raltitrexed in
patients with malignant pleural mesothelioma: an intergroup study of the
European Organisation for Research and Treatment of Cancer Lung Cancer
Group and the National Cancer Institute of Canada. J Clin Oncol 2005, 23: 68816889.
5. Fennell DA, Gaudino G, O'Byrne KJ, Mutti L, van Meerbeeck J: Advances in the
systemic therapy of malignant pleural mesothelioma. Nat Clin Pract Oncol 2008,
5: 136-147.
6. Remon J, Lianes P, Martinez S, Velasco M, Querol R, Zanui M: Malignant
mesothelioma: New insights into a rare disease. Cancer Treat Rev 2012.
7. Glade MJ: Food, nutrition, and the prevention of cancer: a global perspective.
American Institute for Cancer Research/World Cancer Research Fund,
American Institute for Cancer Research, 1997. Nutrition 1999, 15: 523-526.
8. Fenwick GR, Heaney RK, Mullin WJ: Glucosinolates and their breakdown products in
food and food plants. Crit Rev Food Sci Nutr 1983, 18: 123-201.
9. Johnson IT: Glucosinolates: bioavailability and importance to health. Int J Vitam Nutr
Res 2002, 72: 26-31.
10. Hayes JD, Kelleher MO, Eggleston IM: The cancer chemopreventive actions of
phytochemicals derived from glucosinolates. Eur J Nutr 2008, 47 Suppl 2: 73-88.
11. Zhang Y, Talalay P: Anticarcinogenic activities of organic isothiocyanates: chemistry
and mechanisms. Cancer Res 1994, 54: 1976s-1981s.
12. Conaway CC, Yang YM, Chung FL: Isothiocyanates as cancer chemopreventive
agents: their biological activities and metabolism in rodents and humans. Curr
Drug Metab 2002, 3: 233-255.
13. Sahu RP, Zhang R, Batra S, Shi Y, Srivastava SK: Benzyl isothiocyanate-mediated
generation of reactive oxygen species causes cell cycle arrest and induces
apoptosis via activation of MAPK in human pancreatic cancer cells.
Carcinogenesis 2009, 30: 1744-1753.
14. Xiao D, Powolny AA, Singh SV: Benzyl isothiocyanate targets mitochondrial
respiratory chain to trigger reactive oxygen species-dependent apoptosis in
human breast cancer cells. J Biol Chem 2008, 283: 30151-30163.
15. Hecht SS: Chemoprevention by isothiocyanates. J Cell Biochem Suppl 1995, 22: 195209.
16. van Poppel G, Verhoeven DT, Verhagen H, Goldbohm RA: Brassica vegetables and
cancer prevention. Epidemiology and mechanisms. Adv Exp Med Biol 1999, 472:
159-168.
17. London SJ, Yuan JM, Chung FL, Gao YT, Coetzee GA, Ross RK et al.: Isothiocyanates,
glutathione S-transferase M1 and T1 polymorphisms, and lung-cancer risk: a
prospective study of men in Shanghai, China. Lancet 2000, 356: 724-729.
255
18. Giovannucci E, Rimm EB, Liu Y, Stampfer MJ, Willett WC: A prospective study of
cruciferous vegetables and prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev
2003, 12: 1403-1409.
19. Ji Y, Kuo Y, Morris ME: Pharmacokinetics of dietary phenethyl isothiocyanate in
rats. Pharm Res 2005, 22: 1658-1666.
20. Keum YS, Jeong WS, Kong AN: Chemopreventive functions of isothiocyanates. Drug
News Perspect 2005, 18: 445-451.
21. Gueugnon F, Leclercq S, Blanquart C, Sagan C, Cellerin L, Padieu M et al.:
Identification of novel markers for the diagnosis of malignant pleural
mesothelioma. Am J Pathol 2011, 178: 1033-1042.
919-928.
23. Minarini A, Milelli A, Fimognari C, Simoni E, Turrini E, Tumiatti V: Exploring the
effects of isothiocyanates on chemotherapeutic drugs. Expert Opin Drug Metab
Toxicol 2014, 10: 25-38.
24. Martins NM, Santos NA, Curti C, Bianchi ML, Santos AC: Cisplatin induces
mitochondrial oxidative stress with resultant energetic metabolism impairment,
membrane rigidification and apoptosis in rat liver. J Appl Toxicol 2008, 28: 337344.
25. Rabik CA, Dolan ME: Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated
with platinating agents. Cancer Treat Rev 2007, 33: 9-23.
26. Antosiewicz J, Ziolkowski W, Kar S, Powolny AA, Singh SV: Role of reactive oxygen
intermediates in cellular responses to dietary cancer chemopreventive agents.
Planta Med 2008, 74: 1570-1579.
27. Sharma A, Singh K, Almasan A: Histone H2AX phosphorylation: a marker for DNA
damage. Methods Mol Biol 2012, 920: 613-626.
28. Xu K, Thornalley PJ: Studies on the mechanism of the inhibition of human leukaemia
cell growth by dietary isothiocyanates and their cysteine adducts in vitro.
Biochem Pharmacol 2000, 60: 221-231.
29. Xu K, Thornalley PJ: Signal transduction activated by the cancer chemopreventive
isothiocyanates: cleavage of BID protein, tyrosine phosphorylation and activation
of JNK. Br J Cancer 2001, 84: 670-673.
30. Gong A, He M, Krishna Vanaja D, Yin P, Karnes RJ, Young CY: Phenethyl
isothiocyanate inhibits STAT3 activation in prostate cancer cells. Mol Nutr Food
Res 2009, 53: 878-886.
31. Lee JW, Cho MK: Phenethyl isothiocyanate induced apoptosis via down regulation of
Bcl-2/XIAP and triggering of the mitochondrial pathway in MCF-7 cells. Arch
Pharm Res 2008, 31: 1604-1612.
32. Kang L, Wang ZY: Breast cancer cell growth inhibition by phenethyl isothiocyanate
is associated with down-regulation of oestrogen receptor-alpha36. J Cell Mol Med
2010, 14: 1485-1493.
33. Prawan A, Saw CL, Khor TO, Keum YS, Yu S, Hu L et al.: Anti-NF-kappaB and antiinflammatory activities of synthetic isothiocyanates: effect of chemical structures
and cellular signaling. Chem Biol Interact 2009, 179: 202-211.
34. Wu WJ, Zhang Y, Zeng ZL, Li XB, Hu KS, Luo HY et al.: beta-phenylethyl
isothiocyanate reverses platinum resistance by a GSH-dependent mechanism in
256
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
cancer cells with epithelial-mesenchymal transition phenotype. Biochem
Pharmacol 2013, 85: 486-496.
Wang X, Govind S, Sajankila SP, Mi L, Roy R, Chung FL: Phenethyl isothiocyanate
sensitizes human cervical cancer cells to apoptosis induced by cisplatin. Mol Nutr
Food Res 2011, 55: 1572-1581.
Di Pasqua AJ, Hong C, Wu MY, McCracken E, Wang X, Mi L et al.: Sensitization of
non-small cell lung cancer cells to cisplatin by naturally occurring
isothiocyanates. Chem Res Toxicol 2010, 23: 1307-1309.
Aceto N, Bertino P, Barbone D, Tassi G, Manzo L, Porta C et al.: Taurolidine and
oxidative stress: a rationale for local treatment of mesothelioma. Eur Respir J
2009, 34: 1399-1407.
Shi Y, Felley-Bosco E, Marti TM, Stahel RA: Differential effects of lovastatin on
cisplatin responses in normal human mesothelial cells versus cancer cells:
implication for therapy. PLoS One 2012, 7: e45354.
Zimling ZG, Sorensen JB, Gerds TA, Bech C, Andersen CB, Santoni-Rugiu E: Low
ERCC1 expression in malignant pleural mesotheliomas treated with cisplatin and
vinorelbine predicts prolonged progression-free survival. J Thorac Oncol 2012, 7:
249-256.
Storr SJ, Woolston CM, Martin SG: Base excision repair, the redox environment and
therapeutic implications. Curr Mol Pharmacol 2012, 5: 88-101.
Kinnula VL, Everitt JI, Mangum JB, Chang LY, Crapo JD: Antioxidant defense
mechanisms in cultured pleural mesothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 1992,
7: 95-103.
Lee Y, Kim YJ, Choi YJ, Lee JW, Lee S, Chung HW: Enhancement of cisplatin
cytotoxicity by benzyl isothiocyanate in HL-60 cells. Food Chem Toxicol 2012, 50:
2397-2406.
257
FIGURES’ LEGENDS
Figure 1: Effect of PEITC on MPM cell lines.
Three cell lines of MPM (Meso4, 11 and 152) were treated with increasing doses of
PEITC alone or combined to NAC (5mM) for 72h. Cell viability was determined using
Uptiblue reagent. Values represent the mean ± SEM from three independent measurements. B
and C, MPM cell lines were treated with three doses of PEITC alone or combined to NAC
(5mM) for 24h. Cell death (B) was measured by flow cytometry, after Annexin-V-APC cell
staining. Cell death induction is expressed in percentage of annexin-V-APC labeled cells.
ROS detection (C) was performed with flow cytometry thanks to a specific molecular probe
CM-H2DCFA. Fluorescence values are expressed in Relative Mean Fluorescence Intensity
(RMFI). Values represent the mean ± SEM from three independent measurements on three
distinct cell lines.
Figure 2: Effect of cisplatin on MPM cell lines.
Three cell lines of MPM were treated with increasing doses of cisplatin alone or
combined to NAC (5mM) for 72h. Cell viability was determined using Uptiblue reagent.
Values represent the mean ± SEM from three independent measurements. B and C, MPM cell
lines were treated with three doses of cisplatin alone or combined to NAC (5mM) for 24h.
Cell death (B) was measured by flow cytometry, after Annexin-V-APC cell staining. Cell
death induction is expressed in percentage of annexin-V-APC labeled cells. ROS detection
(C) was performed with flow cytometry thanks to a specific molecular probe CM-H2DCFA.
Fluorescence values are expressed in RMFI. Values represent the mean ± SEM from three
independent measurements on three distinct cell lines.
Figure 3: Cisplatin-PEITC combination induces the DNA recruitment of the histone
H2A.X phosphorylated form in MPM cells.
Cells were treated with cisplatin (0.8mg/l) and PEITC (4µM) alone or in combination
for 24h prior to PAF 4% fixation and immunofluorescence staining for P-H2AX.
Representative images of MPM cells (Meso152) stained for P-H2A.X (pink), stained with
DAPI (Blue) for nuclei labeling and merge pictures.
258
Figure 4: Effect of PEITC and cisplatin alone or in combination on MPM cells viability
A, MPM cell viability assays were performed after 72h of cisplatin and/or PEITC
treatments using Uptiblue cell counting reagent. Three concentrations of PEITC were used (2,
4 and 6µM), alone or in combination with cisplatin at 0.8mg/l. Values represent the mean ±
SEM from three independent measurements on three distinct cell lines. B, treatments with
cisplatin (0.8mg/l) and/or PEITC (6µM) were performed every three days to assess cell
viability over 9 days. Viability was measured at day 3, 6 and 9 using Uptiblue cell counting
reagent. Compounds concentration was adapted to 96 well plate and cell number, in order to
reach at most 40% cell death after 72h of treatment. Values represent the mean ± SEM from
three independent measurements on three distinct MPM cell lines. * p<0.05
Figure 5: Effect of PEITC and cisplatin alone or in combination on primary mesothelial
cells
Primary mesothelial cells were treated with cisplatin (0.8mg/l) and/or PEITC (6µM)
for 72 hours. A, Microscopy pictures were taken, and B, viability assays were performed. C,
Comparison of cisplatin-PEITC combination on MPM and MC cells. Graphics represent the
mean ± SEM of triplicates. ** p<0.01, *** p<0.001
over time.
MPM cells treatments with cisplatin (0.8mg/l) and/or PEITC (6µM) were performed
every three days to assess cell viability over 9 days. Viability was measured at day 3, 6 and 9
using Uptiblue cell counting reagent. Values represent the mean ± SEM of triplicates. *
p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001
259
ADDITIONAL FILES
Additional file 1: Characterisation of MPM and lung ADCA cell lines established from
patients’ pleural effusion.
Description of data: Expression of mRNA of usual immunohistochemical markers
used to diagnose MPM were measured using real-time PCR. A, mRNA expression of MPM
markers Wilm’s Tumor antigen (WT1) and podoplanin (PDPN). B, mRNA expression of lung
ADCA markers Thyroid transcription factor-1 (TTF-1) and Carcinoembryonic antigen-related
cell adhesion molecule-6 (CEACAM6).
Additional file 2: Effect of PEITC and Cisplatin alone or in combination on the DNA
recruitment of the phosphorylated form of histone H2A.X in MPM cells.
Description of data: Cells were treated with cisplatin (0.8mg/l) and PEITC (4μM)
alone or in combination for 24h prior to PAF 4% fixation and immunofluorescence staining
for P-H2AX. Representative images of MPM cells (Meso11 and Meso4) stained for P-H2A.X
(pink), stained with DAPI (Blue) for nuclei labeling and merge pictures.
260
FIGURES
Figure 1: Effect of PEITC on MPM cell lines.
261
Figure 2: Effect of cisplatin on MPM cell lines.
262
Figure 3: Cisplatin-PEITC combination induces the DNA recruitment of the histone
H2A.X phosphorylated form in MPM cells.
Figure 4: Effect of PEITC and cisplatin alone or in combination on MPM cells viability.
263
Figure 5: Effect of PEITC and cisplatin alone or in combination on primary mesothelial
cells.
264
over time.
265
Additional file 1: Characterisation of MPM and lung ADCA cell lines established from
patients’ pleural effusion
266
Additional file 2: Effect of PEITC and Cisplatin alone or in combination on the DNA
recruitment of the phosphorylated form of histone H2A.X in MPM cells.
267
DISCUSSION
DISCUSSION
Le MPM est un cancer particulièrement agressif avec un mauvais pronostic vital, et
une efficacité des thérapies conventionnelles très modeste. La principale cause du MPM est
une exposition chronique à l’amiante, le plus souvent dans un contexte professionnel (90%
des cas de MPM) [9]. Bien que considéré comme un cancer rare de par le faible nombre de
cas déclarés par an, un pic d’incidence est attendu entre les années 2015 et 2025, en raison de
l’utilisation massive de l’amiante dans les constructions immobilières durant l’après-guerre
[2]. A l’heure actuelle, il n’existe qu’un seul traitement de première ligne standardisé pour le
MPM : la combinaison du cisplatine avec du pémétrexed. Cette combinaison n’apporte qu’un
gain de survie modeste aux patients (2,8 mois), et nombreux sont ceux non éligibles à cette
approche [74].
Il apparaît donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour
aborder le traitement du MPM, ou tout du moins améliorer les stratégies d’ores et déjà en
place, de façon à se rapprocher de soins curatifs plutôt que palliatifs. Au cours de ma thèse,
j’ai donc étudié deux approches distinctes ayant un but commun : l’amélioration des
traitements actuellement appliqués au traitement du MPM.
Il y a maintenant plus de 30 ans était soulevé un lien entre modifications épigénétiques
et cancer [190], et il est désormais décrit dans de nombreux types de cancers, dont le MPM,
des aberrations de la méthylation de l’ADN [269-271] ou de l’acétylation des histones [272].
Ainsi, les modifications épigénétiques observées dans certains types de cancers ont
rapidement été corrélées à un rôle dans la tumorigenèse, à différents stades de développement
(de l’initiation jusqu’au processus métastatique). Les altérations des mécanismes
épigénétiques tels que la méthylation de l’ADN ou les modifications d’acétylation des
histones sont le fruit d’altérations, en amont, des enzymes responsables de l’équilibre de ces
processus. Ainsi, de nombreuses molécules ont été développées pour cibler spécifiquement
ces enzymes et contrecarrer les aberrations épigénétiques en partie responsables de la
progression tumorale. L’hypoacétylation des histones est observée fréquemment dans les
cancers, et conduit à une compaction de la chromatine, laissant les gènes peu disponibles à la
transcription. Ainsi, un certain nombre de TSG se retrouvent réprimés. Les enzymes
responsables de la déacétylation des histones, les HDACs, sont donc apparues comme de
potentielles cibles thérapeutiques et un certain nombre d’inhibiteurs d’HDACs ont été
développés (iHDAC). Ces inhibiteurs permettent l’augmentation de l’acétylation des histones,
ce qui agit directement sur le degré de compaction de la chromatine qui devient alors
268
DISCUSSION
beaucoup plus relâchée, favorisant la transcription du matériel génétique et notamment des
TSG. Malgré les effets très encourageants in vitro, les iHDAC présentent de nombreuses
limites in vivo. En effet, bien que le vorinostat et la romidepsine soient actuellement
approuvés en clinique pour le traitement du lymphome T cutané, les effets secondaires
associés, les propriétés pharmacodynamiques décevantes et le bénéfice trop modeste pour les
patients dégagent la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Mon projet de thèse s’est donc construit dans un premier temps autour d’un
objectif pour répondre à cette nécessité : améliorer les modalités d’administrations des
iHDAC grâce à la formulation de nanoparticules chargées avec ces inhibiteurs, grâce à une
collaboration avec le Dr Philippe Bertrand (Institut de Chimie des Milieux et Matériaux de
Poitiers-UMR 7285) et avec le Dr Valérie Héroguez (LCPO Laboratoire de Chimie des
Polymères Organiques). Trois iHDAC différents ont été utilisés pour cette étude : le CI-994,
le SAHA et le NODH, un dérivé de la trichostatine A. Ce dernier, actif à des doses de l’ordre
du nanomolaire, a été développé par le laboratoire du Dr Philippe Bertrand et caractérisé en
collaboration avec notre équipe [591-592].
Comme exposé dans l’introduction, les nanomédecines appliquées à la cancérologie
représentent un domaine prometteur en plein essor. Le but premier est de parvenir à cibler
spécifiquement les cellules tumorales, sans affecter les tissus ou organes sains environnants.
La dose de composés thérapeutiques qui atteint la tumeur est donc optimisée, et l’exposition
des tissus sains et potentiels effets secondaires néfastes associés sont minimisés. J’ai donc
cherché à combiner les avantages du ciblage des mécanismes épigénétiques, avec ceux des
nanomédecines, en produisant des nanoparticules chargées avec des iHDAC. La stratégie se
basait sur deux principes majeurs : l’effet EPR, et la présence d’une chaîne acido-sensible
pour l’accrochage des iHDAC permettant une libération acido-sensible des composés. J’ai
ainsi pu obtenir des iHDAC fonctionnalisés sur des nanoparticules, d’une taille comprise entre
290 et 390 nm, par conséquent théoriquement compatibles avec l’effet EPR. En effet, la taille
macromoléculaire de ces constructions leur confère une adaptabilité à l’effet EPR pour avoir
un ciblage spécifique des composés au niveau du site tumoral et en évitant ainsi une toxicité
aspécifique sur les tissus ou organes sains. Comme mentionnée dans l’introduction, la
conception de DDSs acido-sensibles a suscité un grand intérêt pour leur application dans des
stratégies thérapeutiques anti-tumorales. Ainsi, en plus de l’effet EPR, notre stratégie se basait
sur un système de libération pH-dépendant des composés grâce à la présence d’une chaîne
acido-sensible pour greffer les iHDAC à la nanoparticule.
269
DISCUSSION
La première étape dans l’étude de ce nouveau mode d’administration des iHDAC
visait à caractériser le vecteur afin de s’assurer de sa compatibilité avec le modèle d’étude que
j’ai utilisé au cours de ma thèse et surtout avec l’effet EPR. En 1975, Helmut Ringsdorf
propose la théorie selon laquelle l’accrochage de composés thérapeutiques sur des
transporteurs macromoléculaires tels que des polymers synthétiques pourraient être utilisés
pour libérer les composés spécifiquement dans leurs cellules cibles, permettant ainsi
d’augmenter leur efficacité thérapeutique tout en minimisant les effets secondaires associés.
Depuis, un certain nombre de polymères organiques utilisés en tant que DDSs ont été étudiés,
tels que l’HPMA (N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide) [628], le PGA (polyglutamic acid)
ou le PEO. La polymérisation de l’hydrocarbone cyclique de NB par ROMP est actuellement
en cours d’évaluation pour la préparation de polymères pour diverses applications chimiques.
En effet, les polymères obtenus par ROMP sont des alternatives émergentes de DDSs
possédant les caractéristiques requises pour en faire de bons systèmes de relargage : ciblage
spécifique des tumeurs, reconnaissance des cellules et internalisation intracellulaire,
chargement d’un cargo (composé thérapeutique par exemple), imagerie in vitro et/ou in vivo.
Ainsi, nous avons obtenu des préparations de nanoparticules de poly-NB plus ou moins
complexes mais avec une méthode convergente de conception par chimie-click (cycloaddition
de Huisgen). Des études préliminaires menées par nos collègues polyméristes et chimistes
décrivent les différentes formulations conçues, et démontrent ainsi que les particules
monofonctionnelles optimales sont obtenues par chimie-click avec des azido-nanoparticules,
où les groupements azotures sont positionnés sur la surface externe pour une
fonctionnalisation post-formulation de la nanoparticule.
Durant mon travail de thèse, j’ai dans un premier temps procédé à la caractérisation
biologique des nanovecteurs, grâce à une formulation nanoparticulaire greffée à un composé
fluorescent : la rhodamine B. Les objectifs in vitro visaient à savoir si ces vecteurs étaient
bien reconnus, correctement internalisés et s’ils étaient colocalisés avec les compartiments
acides une fois internalisés. La caractérisation in vivo avait pour but de vérifier si le système
répondait bien à l’effet EPR pour avoir un ciblage spécifique de la tumeur. J’ai démontré que
les nanovecteurs sont bien pris en charge par les cellules, internalisés par un phénomène
d’endocytose et plus particulièrement de macropinocytose, et qu’ils sont compatibles avec un
système acido-sensible étant donné leur colocalisation avec les compartiments acides. De
plus, j’ai réalisé une étude de la biodistribution des nanovecteurs dans un modèle murin
syngénique ectotopique immunodéprimé de MM et dans un modèle murin syngénique
orthotopique immunocompétent de MM. Dans les deux cas, l’étude réalisée sur une durée
270
DISCUSSION
d’une semaine m’a permis de confirmer la spécificité des nanovecteurs pour la tumeur et la
compatibilité du nano-système avec l’effet EPR. En effet, j’ai pu montrer que les
nanovecteurs s’accumulent spécifiquement dans le tissu tumoral sans affecter ni s’accumuler
dans les autres organes de l’organisme, par lesquels ils ne passent que de manière transitoire.
Les deux modèles murins que j’ai utilisés pour réaliser l’étude de biodistribution des
nanovecteurs montrent une accumulation spécifique des nanoparticules fluorescentes couplées
à la rhodamine B dans les tumeurs. Il est important de mentionner que la rhodamine B
attribue, de par sa structure, une charge globalement positive à la nanoparticule, ce qui sous
entend des propriétés hydrophiles. Bien qu’il soit envisageable que la suppression de la
composante conférant l’hydrophilie au système (la rhodamine B dans notre cas) altère la
biodistribution des nanoparticules, les résultats obtenus avec les nanoparticules vectorisées
avec le NODH tendent à prouver le contraire. En effet, en l’absence de rhodamine B, les
nanoparticules de NODH parviennent à entraîner une régression tumorale massive sans
toxicité sur les tissus sains, ce qui suggère donc une biodistribution uniquement dans la
tumeur. Deux études menées par Monopoli et al., [629] et Cedervall et al., [630] démontrent
l’importance de l’aspect hydrophobe et/ou hydrophile des nanoparticules pour leur
biodistribution. En effet, il est reconnu et décrit que les polymères hydrophiles bénéficient
d’une stabilité stérique et d’une protection contre leur élimination prématurée [631] [632].
Le métabolisme et l’élimination rapide des nanoparticules représentent un des
problèmes majeurs de ce modèle théoriquement idéal de ciblage spécifique du tissu tumoral
dans des conditions sans risque pour les organes sains environnants. Si le but est de cibler
activement un organe ou un tissu tumoral différent des organes de drainage, ce qui est le cas
de la stratégie que j’ai étudiée, il est nécessaire de développer des moyens pour éviter
l’élimination précoce des particules de la circulation. Le système MPS, aussi connu sous le
nom de système RES, est défini par une famille de cellules comprenant les précurseurs de la
moelle osseuse, les monocytes du sang ainsi que les macrophages [633]. L’élimination
d’éléments exogènes est caractérisée par trois étapes : l’opsonisation par les protéines
d’opsonines qui s’adsorbent elles-mêmes spontanément à la surface des corps étrangers, la
reconnaissance des éléments opsonisés par les monocytes ou macrophages circulants, et enfin
leur élimination par endocytose/phagocytose et accumulation simultanée dans les organes à
haute activité phagocytaire (foie et rate). Cependant, cette prise en charge par le système
immunitaire et notamment l’accumulation prématurée dans les organes du RES a été exploitée
pour le traitement de métastases hépatiques en chargeant de la doxorubicine dans des
nanosphères
de polyisohexlycyanoacrylate (PACA) [634]. Ainsi, un concept
de
271
DISCUSSION
nanoparticules inefficace pour le traitement de certaines tumeurs solides pourrait s’avérer
particulièrement prometteur pour le traitement de maladies qui affectent les principaux
organes de drainage tels que le foie, la rate ou les reins.
Cependant, le système que j’ai étudié avait pour objectif un ciblage spécifique de la
tumeur sans accumulation et toxicité sur les autres organes. Pour ce faire, le système a été
construit de façon à avoir un temps de circulation rallongé dans la circulation et une absence
de prise en charge par le RES. Bien que certaines méthodes exploitent le ciblage direct des
macrophages du MPS par une injection au préalable de doses importantes de nanoparticules
placebo pour les saturer et empêcher leur activité d’endocytose, cette technique a peu d’avenir
dans une application clinique chez l’homme puisqu’elle entraine la suppression du système
immunitaire.
Les nanoparticules que j’ai étudiées présentent une capacité de ciblage spécifique de la
tumeur, et ce grâce à l’effet EPR, à une augmentation du temps de circulation des
nanoparticules et une diminution de leur prise en charge par le RES, grâce à l’ajout de
groupements hydrophiles de PEO sur les nanoparticules et de chaînes de PEG au niveau de la
prodrogue. En effet, la recherche dans le domaine des nanomédecines s’est concentrée sur le
développement de moyens pour éviter cette élimination précoce des corps nanoparticulaires
de la circulation sanguine, et une stratégie prometteuse est apparue : la fonctionnalisation à la
surface des nanoparticules de groupements hydrophiles, permettant d’augmenter le temps de
résidence des nanoparticules dans le sang, de limiter la biodistribution non spécifique, et de
cibler spécifiquement des tissus ou cellules. Ainsi, l’ajout de groupements PEO aux
nanoparticules pour augmenter leur temps de circulation, leur biodisponibilité et limiter leur
immunogénicité et leur élimination prématurée a été étudié depuis longtemps [635], c’est le
processus de « PEGylation », en référence aux groupements de PEG, qui sont des dérivés des
PEO. Le PEO a ainsi été démontré comme étant le polymer le plus efficace pour supprimer
les processus d’opsonisation [636]. Ainsi, la fonctionnalisation de chaînes de PEO à la surface
du système que j’ai évalué a permis d’outrepasser cette limite et d’éviter la prise en charge
prématurée des nanoparticules par les cellules du MPS. De plus, l’ajout de groupements PEG
sur les chaînes acido-sensibles permet de conférer aux nanoparticules une répulsion pour les
interactions protéiques, évitant ainsi leur opsonisation et leur élimination prématurée [637].
Alors que certains la considéreront comme novatrice, cette stratégie est en fait inspirée d’un
phénomène naturel intrinsèque aux globules rouges. Les érythrocytes sont en effet capables
d’éviter les macrophages et de transporter leur cargo d’oxygène avec une durée de vie de 110
à 120 jours. Ces cellules bénéficient de multiples facteurs physico-chimiques et
272
DISCUSSION
physiologiques qui leur permettent d’avoir cette spécificité de demi-vie plasmatique
rallongée, et en particulier une barrière protectrice à leur surface composée de groupements
d’oligosaccharides hydrophiles, permettant d’éviter leur opsonisation et donc leur
reconnaissance ultérieure par les macrophages.
De plus, les nanoparticules de NB que j’ai étudiées bénéficient de l’effet EPR pour
cibler et atteindre spécifiquement les tumeurs. La caractérisation de la taille des
nanoparticules que j’ai étudiées, élément clé dans les modalités d’action de l’effet EPR,
démontre leur compatibilité avec l’effet EPR. Les tumeurs ayant atteint une certaine taille ont
besoin de leur propre approvisionnement pour poursuivre leur développement, et génèrent une
néo-angiogenèse, dite défectueuse. Dans des conditions physiologiques, l’endothélium
vasculaire existe sous différentes formes : continu, fenestré ou discontinu. L’endothélium
continu, avec des jonctions interstitielles resserrées caractérise les artères, les vaisseaux [638639] et les capillaires pulmonaires [640]. L’endothélium fenestré est caractéristique de la
majorité des glandes de l’organisme [641], de la muqueuse digestive et des reins, avec des
espaces de l’ordre de 60 nm. L’endothélium discontinu est lui spécifique du foie et de la
moelle osseuse, et génère des jonctions de 50 à 100 nm [642]. La néo-angiogenèse tumorale
génère un endothélium discontinu avec une organisation anarchique et des jonctions
interstitielles relâchées, et l’effet EPR permet à des macromolécules ou DDS d’une taille de
200 nm à 800 nm [470,643] de passer au travers des vaisseaux pour aller s’accumuler
préférentiellement dans le tissu tumoral. Le système que j’ai étudié avait une taille comprise
entre 290 nm et 390 nm. Etant donné la taille des espaces interstitiels dans l’endothélium
fenestré ou discontinu alimentant les organes sains, la taille du nano-système permet donc d’y
éviter son accumulation et par extension toute toxicité aspécifique, contrairement à la plupart
des études de biodistribution réalisées ces 20 dernières années qui décrivent des modèles avec
une accumulation aspécifique des nano-systèmes dans les organes de drainage tels que le foie,
les reins ou la rate, pouvant engendrer une toxicité subséquente non souhaitée et une
diminution de l’efficacité de l’agent thérapeutique vectorisé. Ainsi, une étude menée sur des
nanoparticules chargées avec de la doxorubicine démontre l’intérêt anti-tumoral de sa
vectorisation, mais la biodistribution montre une accumulation dans le foie et les reins [644].
Ainsi au cours de ma thèse, j’ai pu caractériser une formulation nanoparticulaire qui
permettait un ciblage spécifique de la tumeur dans un modèle murin immunodéprimé et
immunocompétent de MM, tout en évitant une accumulation aspécifique dans les organes
sains, grâce à sa taille adaptée à l’effet EPR, à la fonctionnalisation à sa surface de chaînes
PEO et PEG permettant une augmentation de sa demi-vie plasmatique, une stabilité stérique,
273
DISCUSSION
ainsi qu’un échappement au RES, des caractéristiques rarement regroupées dans un seul et
même système.
Le principal écueil du système que j’ai étudié au cours de ma thèse réside dans son
devenir dans l’organisme une fois injecté. En effet, cette question demeure en suspend et
nécessite des recherches plus poussées dans le but d’envisager cette stratégie chez l’homme.
Les nanoparticules de NB que j’ai étudiées ne m’ont en effet pas permis de réaliser des
analyses d’imagerie moléculaire, un domaine en plein essor dans le monde des
nanomédecines, tant pour le diagnostic de certaines maladies que pour le suivi des patients.
L’imagerie moléculaire correspond à la visualisation, la caractérisation et la mesure de
processus biologiques aux niveaux moléculaire et cellulaire chez l’homme ou d’autres
systèmes vivants [645]. Ainsi je propose deux méthodes pour comprendre le devenir des
nanoparticules de NB : un radiomarquage pour leur suivi dans l’organisme, ou l’attribution
d’un caractère magnétique. Les nanoparticules radiomarquées présentent de nombreux
avantages comparées à d’autres sondes d’imagerie. La méthode de radiomarquage permet une
sensibilité de détection très élevée et en plus de générer de l’imagerie qualitative, et une
imagerie quantitative de haute précision [646]. Le principal isotope utilisé pour l’imagerie de
nano-systèmes est le technétium 99m (99mTc) [647-649]. Cependant, le temps de demi-vie du
99m
Tc est court de l’ordre de 6h, ce qui limite grandement la durée de l’étude de
biodistribution qui ne peut pas dépasser 6h. L’utilisation du cuivre 64 (64Cu) permet d’étendre
modestement la durée de la biodistribution du fait de sa demi-vie deux fois plus longue (≈12h)
[650-651]. Les demi-vies relativement courtes de ces isotopes limitent leur utilisation pour
des études de biodistribution sur de longues périodes. Il serait donc préférable d’utiliser un
isotope à demi-vie plus longue. Plusieurs radioiodines semblent de bons candidats, tels que
l’iodine 131 (131I) [652] ou encore l’iodine 125 (125I) [653], avec des demi-vies d’environ 8 et
60 jours respectivement.
L’autre méthode que je propose pour améliorer la compréhension du devenir des
nanoparticules que j’ai caractérisées est de l’agrémenter d’une composante magnétique.
L’idée d’exploiter le magnétisme, pour augmenter l’accumulation de la concentration de
composés thérapeutiques dans un tissu cible via un aimant implanté directement dans le site à
cibler ou en appliquant un champ magnétique extérieur, date des années 1970. Les premières
expériences précliniques à s’intéresser à ce phénomène ont été réalisées en 1979 avec des
microsphères magnétiques d’albumine chargées avec de la doxorubicine pour le traitement du
cancer dans un modèle de rat [654]. Par la suite, l’imagerie moléculaire in vivo a été identifiée
comme une opportunité extraordinaire pour étudier des maladies de manière non-invasive au
274
DISCUSSION
niveau moléculaire par l’Institut National du Cancer des Etats Unis [655]. Ainsi, l’IRM est
apparue comme un candidat prometteur, offrant certains avantages tels qu’une absence de
toxicité (par irradiation par exemple), une résolution spatiale inégalable ou encore la genèse
d’images tridimensionnelles [656]. Les nanoparticules magnétiques, et principalement celles à
base d’oxydes de fer [657], présentent des avantages non négligeables pour leur utilisation en
tant qu’agents d’imagerie et l’idée d’utiliser des nanoparticules magnétiques pour une
visualisation optimale de la biodistribution de nanoparticules apparaît donc comme une
alternative prometteuse. Cependant, de nombreuses études précliniques ont été menées pour
une application en oncologie, mais en dépit des résultats prometteurs, les premiers essais
cliniques évaluant cette stratégie n’ont pas permis de faire valider des nanoparticules
magnétiques pour leur utilisation en clinique [658-659], en raison de leur toxicité,
biodistribution aspécifique et élimination précoce par le RES.
Ainsi le couplage du système que j’ai étudié avec une composante magnétique fait
appel à un domaine en plein essor dans la recherche en nanomédecines appelé la
« théranostique », c’est-à-dire la conception de structures permettant d’avoir à la fois un outil
de diagnostic, apportant également un bénéfice thérapeutique [660].
Cette stratégie apporterait un bénéfice non seulement en termes de ciblage spécifique
des cellules tumorales, mais aussi pour le suivi et l’imagerie des systèmes injectés pour
comprendre leur biodistribution. Cependant, il est possible d’envisager une alternative dans le
cas de non biodégradation de nanomatériaux utilisés pour la conception des formulations
actives et leur rétention dans l’organisme. Répondant à l’effet EPR, les nanoparticules
s’accumulent dans la tumeur, et sous pH acide, libèrent leur cargo. Si ces nanomatériaux ne
sont effectivement pas biodégradables, leur accumulation pourrait conduire à la formation
d’un tissu cicatriciel, qu’il serait alors aisé de retirer par chirurgie une fois le traitement
terminé.
Le système que j’ai étudié au cours de ma thèse pour caractériser un nouveau mode
d’administration des iHDAC était non seulement basé sur le principe d’EPR mais aussi sur
une propriété acido-sensible des nanoparticules pour un relargage des composés pHdépendant. Un système de libération acido-sensible de la doxorubicine a été évalué, avec un
dérivé d’hydrazone au niveau de la chaîne latérale [661], mais à ma connaissance, cette
libération acido-sensible des composés n’a encore jamais été adaptée aux iHDAC.
Durant ma thèse, j’ai étudié la vectorisation de trois iHDAC aux nanoparticules de
NB. Le CI-994 fut utilisé pour représenter les iHDAC de la classe des benzamides, et basé sur
les résultats préliminaires obtenus par nos collaborateurs sur les anilines. De plus, le CI-994 a
275
DISCUSSION
démontré des activités anti-tumorales dans un certain nombre de modèles in vitro et in vivo de
divers cancers murins et humains [662]. Une étude portée sur une combinaison de CI-994
avec des agents chimiothérapeutiques conventionnels (cytarabine, daunorubicine et
mitoxantrone) dans un modèle de rat de LMA soulève les bénéfices thérapeutiques de cette
stratégie [663]. De plus, un essai clinique de phase I étudiant une combinaison de CI-994 avec
de la capécitabine était encourageant pour engager une phase II [264]. Le deuxième iHDAC
de mon étude était le SAHA, choisi pour son importance clinique puisqu’actuellement
approuvé pour le traitement du lymphome T cutané, mais aussi en raison de son élimination
rapide et de ses propriétés pharmacocinétiques limitées. Le SAHA est métabolisé en moins
d’une heure après son injection par glucuronidation [664] et β-oxydation, faisant de ce
composé un candidat qui bénéficierait grandement de sa fonctionnalisation sur un système de
libération pH-dépendant. Le SAHA est étudié dans diverses applications thérapeutiques, en
combinaison avec d’autres agents conventionnels, en phase I ou II, mais souffre le plus
souvent de sa demi-vie plasmatique trop courte, ainsi que de la toxicité engagée sur les
cellules saines circulantes. Le troisième iHDAC auquel je me suis intéressée pour sa
vectorisation était le NODH, un « nouvel » iHDAC de synthèse dérivé de la trichostatine A
produit par le Dr Philippe Bertrand, présentant des propriétés anti-tumorales prometteuses sur
des cellules de NSCLC et de MPM à des doses de l’ordre du nanomolaire [591][592]. Le but
ultime étant l’accrochage de la prodrogue à une nanoparticule, le système acido-sensible a été
modifié de façon à y intégrer un deuxième groupement azoture-alcyne pour générer un autre
site de liaison par chimie-click. Trois chaînes à double site de liaison azoture-alcyne pour la
chimie-click ont été conçues et accrochées au CI-994, SAHA et NODH pour la formulation
des prodrogues. Au cours de mon travail de thèse et en collaboration avec les chimistes et
polyméristes, j’ai évalué la chaîne optimale assurant une stabilisation du composé à pH
neutre, et un relargage rapide à pH acide, permettant ainsi une activité biologique uniquement
après endocytose et donc une toxicité minimale sur les cellules du sang. Les bénéfices
cliniques des iHDAC pourraient être nettement améliorés par ce système de libération acidosensible, grâce à une diminution de la toxicité hématologique, et un effet prolongé dans le
temps [574].
Néanmoins, il existe d’autres types de stratégies visant à avoir une libération du
composé actif uniquement dans les cellules tumorales par effet EPR. Le nano-système que j’ai
utilisé était formulé avec une chaîne acido-sensible, de façon à tirer profit de l’acidification du
tissu tumoral durant la carcinogenèse et du pH acide des endosomes/lysosomes générés lors
de l’internalisation de composés par endocytose. Cependant, d’autres études ont évalué le
276
DISCUSSION
potentiel de chaînes de liaison non acido-sensibles et exploitent des libérations de composés
spécifiques grâce à un clivage enzymatique. Divers types de tumeurs ou de tissus lésés sont
caractérisés par des expressions enzymatiques spécifiques, et certaines stratégies visent à
coupler des agents thérapeutiques à des nanoparticules via une liaison reconnue uniquement et
spécifiquement par ces enzymes, permettant ainsi le relargage des composés thérapeutiques
dans le site ciblé uniquement. Ainsi une étude a montré le potentiel anti-tumoral de
nanoparticules de dextrans chargées avec de la doxorubicine ou du methotrexate via une
liaison spécifiquement reconnue par les métalloprotéases de la matrice MMP2 et MMP9,
surexprimées dans bon nombre de cancers [665]. Cependant, un certain nombre de limites
sont associées à ce type de liaisons, comme par exemple la prise en compte du degré de
spécificité de l’enzyme pour la chaîne greffée sur la nanoparticule ou encore du potentiel
clivage dans des tissus aspécifiques générant une toxicité non souhaitée sur des organes sains
[666].
Au cours de mon travail de thèse, j’ai donc procédé à la caractérisation in vitro des
nanoparticules vectorisées avec le CI-994, SAHA et NODH dans des cellules de MPM et des
cellules d’adénocarcinome pulmonaire (ADCA). Concernant les nanoparticules de CI-994,
l’analyse in vitro par la méthode de BRET dans des cellules de MPM m’a permis de montrer
la capacité des nanoparticules à être internalisées dans les cellules, à assurer la libération des
iHDAC et à restaurer à la molécule une activité d’inhibition fonctionnelle. Une diminution de
la viabilité cellulaire dose-dépendante corrélée à une induction d’apoptose était observée avec
la molécule seule, équivalente à la forme vectorisée dans les cellules d’ADCA mais moins
importante dans les cellules de MPM. Ces nanoparticules démontrent donc une libération
effective du CI-994 dans les cellules de MPM et d’ADCA par un mécanisme actif, associée à
une activité iHDAC fonctionnelle corrélée à une diminution de la viabilité cellulaire et une
induction des cellules en apoptose dans les deux modèles cellulaires. De même, la
caractérisation in vitro des nanoparticules de SAHA a permis de mettre en évidence une
capacité des nanoparticules à être internalisées par les cellules et à restaurer au SAHA une
activité iHDAC fonctionnelle. Cette activité est corrélée à une augmentation de la mort
cellulaire et à une induction d’apoptose dose-dépendante. Cependant, l’augmentation
d’acétylation des histones avec le SAHA vectorisé était moins importante que la molécule
libre. La caractérisation in vitro des nanoparticules de NODH m’a permis de confirmer
l’intérêt de vectoriser des molécules telles que les iHDAC pour une application thérapeutique
anti-tumorale, bien que les résultats in vitro soient quelque peu décevants étant donné les
effets anti-tumoraux majeurs du NODH observés auparavant. J’ai pu montrer que les trois
277
DISCUSSION
formes de NODH (libre, prodrogue ou nanoparticule) permettent une augmentation de
l’acétylation des histones. La vectorisation du NODH n’empêche donc pas une activité
iHDAC fonctionnelle du composé. Cependant, la capacité des nanoparticules à induire une
augmentation de l’acétylation des histones était inférieure à celle de la molécule seule. J’ai
montré dans ce modèle que l’effet cytotoxique observé avec le NODH vectorisé n’était pas lié
à la nanoparticule mais bien au composé. La caractérisation in vitro du modèle de NODH
vectorisé a donc permis de montrer que la nanoparticule était capable de libérer le NODH
dans les cellules avec une activité iHDAC fonctionnelle, corrélée à une diminution de la
viabilité dose-dépendante. De plus, il ne faut pas oublier que cette molécule est active à des
doses de l’ordre du nanomolaire et que ces nanoparticules restent plus actives que celles
fonctionnalisées avec du SAHA ou du CI-994.
Toutes les cellules n’ont pas les mêmes capacités d’endocytose, et ne répondent donc
pas de la même façon à des structures de type nanoparticules. Ainsi j’ai exploité cette
possibilité pour comprendre la différence de sensibilité aux nanoparticules de CI-994
observée entre les cellules d’ADCA et de MPM. La différence de morphologie entre ces deux
types cellulaires et notamment la présence de microvillosités sur le pourtour des cellules de
MPM peut expliquer cette sensibilité différente, leur conférant une activité d’endocytose
limitée [575], observation que nous avons confirmée dans des travaux au laboratoire [573].
Cependant, bien que ces effets du CI-994 vectorisé ne soient pas aussi importants qu’avec la
molécule seule, cette dernière diffuse librement dans les tissus, et dans le cas d’une
administration systémique par exemple, va aller toucher toutes les cellules qu’elle rencontre.
La nanoparticule ne libérera le composé qu’à des pH acides, c’est-à-dire dans les tissus
tumoraux. Ainsi, si la viabilité globale des cellules traitées avec le CI-994 vectorisé reste
supérieure à celle de la molécule seule, il ne faut pas oublier le contexte de cytotoxicité
spécifique et ciblé que cette stratégie cherche à atteindre.
L’effet sur l’augmentation d’acétylation des histones est similaire entre le CI-994 et sa
forme vectorisée, alors que le SAHA semble perdre de son efficacité lorsqu’il est vectorisé.
Ces résultats étaient assez surprenants, étant donné l’efficacité thérapeutique bien supérieure
du SAHA dans les études précliniques et cliniques [667-668] comparé au CI-994 [264]. De
plus, le SAHA est un pan-inhibiteur des classes I et II [669] alors que la classe des benzamide
dont fait partie de CI-994 sont des inhibiteurs beaucoup moins puissants [670]. Une des
explications réside dans le temps de demi-vie très différent de ces deux molécules. Le SAHA
a une demi-vie de 2h alors que le CI-994 est beaucoup plus stable et bien que son temps de
demi-vie ne soit pas exactement connu, il demeure largement supérieur à celui du SAHA. Une
278
DISCUSSION
étude préclinique sur un modèle de primate l’évalue à 7,4h [662] et une phase I chez l’homme
le défini compris entre 7,4 et 14h [670]. Ainsi, alors qu’une fois libérées les molécules de CI994 s’accumulent et agissent de concert sur une durée prolongée, les molécules de SAHA sont
rapidement éliminées et donc l’équilibre entre libération et dégradation ne permet pas
d’atteindre les concentrations intracellulaires obtenues avec le SAHA libre ou avec le CI-994
vectorisé. En effet, la stabilité des molécules de CI-994 leur permet d’avoir un effet prolongé
dans le temps, et de s’accumuler au fur et à mesure que les molécules se libèrent.
Il est important de mentionner que les travaux réalisés in vitro limitent l’analyse de
l’effet de systèmes de type nanoparticule en raison de l’impossibilité à évaluer l’effet EPR. En
effet, les expériences menées in vitro sont réalisées sur des cellules adhérentes, sans
microenvironnement tumoral ni vascularisation, ce qui supprime la composante EPR du
système. Les études réalisées sur des sphéroïdes de cellules cancéreuses sont de plus en plus
nombreuses [671-672] et cette stratégie représente une alternative intéressante aux
expériences
sur
cellules
adhérentes,
générant
des
conditions
plus
proches
du
microenvironnement tumoral pathophysiologique. Somme toute, ces stratégies demeurent
insuffisantes lors de l’étude de systèmes basés sur une diffusion passive par effet EPR et une
évaluation in vivo du système est nécessaire.
Les résultats obtenus in vitro doivent être considérés comme préliminaires, et j’ai
procédé dans la suite de mon travail à une analyse des nanoparticules de SAHA et de NODH
dans deux modèles murins distincts, de façon à se placer dans des conditions adaptées à l’effet
EPR. Le modèle murin utilisé pour le SAHA était le même que précédemment utilisé pour la
caractérisation des nanovecteurs [573], soit un modèle syngénique immunodéprimé ectopique
de mésothéliome malin. L’évaluation de la masse des tumeurs après traitement ne révèle pas
de régression tumorale avec le SAHA vectorisé. Bien que les nanoparticules de SAHA
n’induisent pas d’augmentation significative de la mort cellulaire dans les tumeurs, l’analyse
histologique des tumeurs montre une nette augmentation de l’acétylation des histones dans les
souris traitées avec le SAHA vectorisé. Ces résultats montrent donc encore une fois l’intérêt
de vectoriser les iHDAC pour restaurer leur activité d’inhibition des HDACs. Pour l’étude des
nanoparticules de NODH, j’ai souhaité me rapprocher le plus possible des conditions
physiopathologiques de la maladie et j’ai utilisé un modèle immunocompétent orthotopique
de MM. Une étude de la biodistribution des nanoparticules fluorescentes dans ce modèle,
réalisées dans les mêmes conditions que précédemment décrit [573], m’a permis de montrer
une accumulation spécifique des nanoparticules dans les tumeurs diffuses sans affecter les
autres organes. Au sein du laboratoire, nous avions précédemment démontré dans ce même
279
DISCUSSION
modèle qu’une combinaison iHDAC/agent hypométhylant (décitabine) permettait une
régression tumorale plus efficace que les composés utilisés seuls [286]. Ainsi, dans notre
étude, non seulement nous avons voulu évaluer l’impact de la vectorisation du NODH sur ses
activités anti-tumorales, mais aussi les conséquences d’une combinaison avec un agent
hypométhylant sur la régression tumorale. Ainsi, les souris étaient prétraitées à la décitabine
avant d’être traitées avec du NODH seul ou vectorisé, ou des nanoparticules nues. L’analyse
des masses de tumeurs révèle que le NODH vectorisé induit une régression tumorale massive
(80%), alors qu’une dose équivalente de NODH seul ou les nanoparticules nues n’ont aucun
effet. De plus, comme précédemment observé [286], la présence de la décitabine sans effet sur
la régression tumorale démontre bien que ce composé n’a pas de propriétés anti-tumorales
intrinsèques. L’injection de cinq fois plus de NODH seul permet d’obtenir une régression
tumorale similaire à celle observée avec une dose vectorisée cinq fois inférieure. De plus,
outre la régression tumorale massive suite au traitement avec le NODH vectorisé, la
vectorisation permettait également d’éviter l’infiltration du pancréas par les cellules
tumorales. Ainsi, bien que les résultats in vitro tendent à montrer que la vectorisation du
NODH diminue ses capacités anti-tumorales, ce travail de caractérisation in vivo permet de
démentir ces observations préliminaires. J’ai en effet démontré ici que la vectorisation du
NODH permet d’améliorer les effets anti-tumoraux du NODH in vivo et d’induire une
régression tumorale massive. De plus, la vectorisation de NODH permet de diminuer les
doses, tout en améliorant les effets anti-tumoraux du composé.
D’autres études ont démontré l’intérêt des nanomédecines pour induire une régression
tumorale dans des modèles murins immunocompétents, mais rares sont celles qui démontrent
une absence totale de toxicité sur d’autres tissus. Ainsi, une étude portant sur la photo-thermie
pour l’ablation de tumeurs a exploité la propriété d’absorption dans le proche infrarouge de
nanoparticules d’or de type « nanoshell » dans un modèle murin immunocompétent de cancer
du colon. Les auteurs montrent des effets anti-tumoraux significatifs suite à l’illumination des
tumeurs par un laser de longueur d’onde dans le proche infrarouge (808nm) [673]. Comme
dans de nombreuses autres études, la toxicité des nano-systèmes utilisés n’était pas évaluée, ni
sur les cellules circulantes, ni sur les autres organes. Dans mon étude, j’ai démontré que les
nanoparticules nues n’étaient pas toxiques, et que les formulations actives étaient sans toxicité
sur les cellules circulantes du sang, et qu’elles n’affectaient pas non plus les organes
environnants.
Une récente étude portant sur l’évaluation de nanolipoplex chargés avec du SAHA
montre aussi le manque d’efficacité anti-tumorale de ce type de structure, mais soulève tout
280
DISCUSSION
son intérêt lorsqu’elles sont utilisées en combinaison avec un autre agent anti-tumoral [576].
Ainsi les auteurs soulèvent la capacité du SAHA vectorisé à sensibiliser les cellules à un
traitement combinatoire, suggérant l’intérêt d’utiliser cette molécule vectorisée pour améliorer
certains traitements appliqués actuellement, aux effets bénéfiques trop modestes. Dans mon
travail, je n’ai pas observé de corrélation entre l’augmentation de l’acétylation des histones
par les nanoparticules de SAHA et une induction des cellules tumorales en apoptose. Les
doses de SAHA libérées dans les tumeurs sont donc suffisantes pour avoir une activité
d’inhibition des HDACs fonctionnelle, et donc pourraient induire in fine une augmentation de
la transcription de TSG. Ainsi, combinées à d’autres types d’agents anti-tumoraux, ces
nanoparticules de SAHA pourraient permettre la sensibilisation des cellules à d’autres
traitements combinatoires, et permettraient donc une amélioration des effets thérapeutiques
anti-tumoraux du traitement. La vectorisation du SAHA ne permet donc pas d’obtenir de
régression tumorale directe, mais elle pourrait améliorer et restaurer son activité biologique
d’inhibiteur d’HDACs, ce qui serait d’un bénéfice clinique significatif si combiné à un autre
régime anti-tumoral. Dans la poursuite de l’étude de cette hypothèse, il serait intéressant de
combiner les nanoparticules de SAHA avec différentes molécules couramment utilisées en
clinique associées à des effets secondaires trop sévères, telles que la doxorubicine ou le
cisplatine. De plus, les vecteurs n’étant fonctionnalisés qu’avec 1% de SAHA, une
augmentation de la quantité de composé par particule pourrait permettre d’obtenir un effet
toxique in vivo sur les tumeurs.
La croissance des cellules tumorales AK7 conduit à la formation de tumeurs
morphologiquement différentes selon le modèle murin. Dans le modèle immunodéprimé
utilisé pour l’étude des nanoparticules de SAHA, la tumeur générée est une tumeur solide,
dont le centre se trouve rapidement dans des conditions d’hypoxie avec la croissance rapide
de la tumeur. A l’inverse, l’injection orthotopique des cellules tumorales dans le modèle
immunocompétent génère une tumeur beaucoup plus diffuse, dont la croissance reste
fulgurante, mais beaucoup plus étendue, et donc sans genèse de zones d’hypoxie. Dans
l’hypothèse d’un ciblage des nanoparticules par effet EPR, la présence de zones d’hypoxie
pourrait empêcher les nanoparticules d’atteindre le cœur de la tumeur et in fine empêcherait
une activité optimale des nanoparticules. Ceci pourrait expliquer pourquoi les nanoparticules
de NODH s’avèrent grandement efficaces alors que les nanoparticules de SAHA n’ont aucun
impact sur la régression tumorale. Pour vérifier cette hypothèse, il serait intéressant de
reproduire la même expérience sur un modèle immunocompétent avec des nanoparticules de
SAHA.
281
DISCUSSION
Il est à mentionner que le modèle de cellules utilisé dans mon étude in vivo pose aussi
ses limites. En effet, les cellules AK7 sont caractérisées par une prolifération très rapide, et un
temps de doublement compris entre 12 et 24h. Or dans les trois modèles utilisés, les effets
maximums des nanoparticules sont obtenus après 36h de traitement. La prolifération
fulgurante de ces cellules pourrait donc être tellement rapide que les nanoparticules n’ont pas
le temps d’assurer leur activité optimale. Il serait donc intéressant de pouvoir mener la
caractérisation de ces formulations dans un autre modèle cellulaire, à croissance moins rapide.
Enfin, l’étude que j’ai menée ici permet de statuer sur l’induction d’une régression
tumorale massive par le traitement avec des nanoparticules de NODH. Cependant, il n’est pas
possible de parler de traitement curatif. Les résultats ne donnent en effet pas d’éléments
concernant la survie des souris après le traitement. Ainsi, une étude de survie menée sur les
souris traitées avec les nanoparticules de NODH permettrait de mettre en évidence la capacité
des nanoparticules à guérir les souris du mésothéliome malin, outre leur capacité à induire la
régression de la tumeur.
L’ensemble de ces travaux sur la vectorisation du SAHA, CI-994 ou encore NODH
montre l’intérêt thérapeutique de la vectorisation d’iHDAC pour le traitement du MM. De
plus, j’ai mis en évidence les propriétés prometteuses du NODH quant à son application
clinique pour traiter le MPM.
La seconde partie de mon travail de thèse, toujours dans un but d’amélioration des
stratégies thérapeutiques appliquées au traitement du MPM, a consisté à évaluer les effets
d’une nouvelle combinaison de cisplatine avec un agent naturel : le PEITC. De nombreuses
études rapportent les effets anti-tumoraux du PEITC sur divers types de cancer [674-675], et
bien que quelques unes montrent des propriétés anti-tumorales du PEITC dans le NSCLC
[622,676-677], il n’existe à l’heure actuelle aucun travail évaluant les effets du PEITC dans
un modèle de MPM. Bien qu’il soit désormais admis que les composés naturels représentent
une source importante de composés à fort potentiel thérapeutique, c’est un domaine qui
demeure trop peu exploité, particulièrement pour le MPM. A notre connaissance, seules deux
molécules naturelles ont été évaluées sur des cellules de MPM : la quercétine [678] et les
diterpènes du café [396].
In fine, le but de mon travail visait à permettre une amélioration des traitements
appliqués au traitement du MPM, dont le bénéfice thérapeutique demeure insatisfaisant et
insuffisant. Bien que le cisplatine fasse partie des agents anti-cancéreux les plus
communément appliqués pour divers types de cancer de par ses propriétés anti-tumorales
notoires, cette molécule a ses limites et son administration en monothérapie demeure
282
DISCUSSION
insuffisante. Quelques études ont mis en évidence l’intérêt thérapeutique de la combinaison de
cisplatine avec le PEITC dans différents types de cancer. L’une d’elles a ainsi montré la
capacité du PEITC à renverser la résistance au cisplatine de cellules de cancer gastrique [679].
De plus, le PEITC était capable de sensibiliser des cellules de cancer du col de l’utérus au
cisplatine [621]. Dans un modèle de NSCLC, le PEITC sensibilisait les cellules au cisplatine
[622] et permettait d’améliorer la toxicité du cisplatine délivré dans des nanoparticules
liposomales [680].
Partant de ce constat, j’ai axé mon travail sur l’évaluation de la combinaison
cisplatine-PEITC. Le travail a donc consisté à évaluer les propriétés anti-carcinogènes du
PEITC seul ou en combinaison avec du cisplatine sur des cellules de MPM, établies
directement au laboratoire à partir de prélèvements de liquide pleuraux de patients et
appartenant désormais à une biocollection officielle (Ministère de l’Enseignement Supérieur
et de la Recherche n° DC-2011-1399 and Commission Nationale de l'Informatique et des
Libertés (CNIL) n°: 1657097). Il a précédemment été montré que le PEITC possédait une
activité cytotoxique sur des cellules tumorales par le biais de l’induction de la production de
ROS [610]. Des expériences de doses-réponses réalisées sur trois lignées de MPM m’ont
permis de montrer que le PEITC diminuait la viabilité cellulaire de manière dose-dépendante.
De plus, cette cytotoxicité était corrélée à une production de ROS par les cellules. Cette
corrélation était moins évidente pour le cisplatine, pour lequel la mort cellulaire induite ne
semblait que partiellement due à l’induction d’un stress oxydatif. En effet, l’activité
cytotoxique du cisplatine passe par divers mécanismes, parmi lesquels figurent l’induction des
cellules en apoptose, les dommages à l’ADN ou encore l’inhibition de la machinerie de
réparation de dommages à l’ADN (review Alderden 2006 « The Discovery and Development
of Cisplatine »).
De précédentes études suggéraient l’implication des dommages à l’ADN dans les
mécanismes cytotoxiques du PEITC et du cisplatine [612-613]. J’ai montré que la
combinaison cisplatine-PEITC permettait d’augmenter la cytotoxicité des composés par le
biais d’induction de dommages à l’ADN. En plus d’augmenter leur effet cytotoxique, la
combinaison des deux composés permettait d’empêcher le développement de mécanismes de
résistance par les cellules tumorales. Les dommages à l’ADN générés par le cisplatine et le
PEITC sont de nature différente, ce qui entraîne l’activation de différentes voies de la
réparation des dommages à l’ADN. En effet, les réparations des dommages causés par le
cisplatine impliquent le mécanisme de NER (nucleotide excision repair) [625] alors que la
réparation des dommages causés par l’induction des ROS par le PEITC se fait via le BER
283
DISCUSSION
(base excision repair) [626]. Face à cette combinaison, les cellules sont soumises à diverses
sources de dommage à l’ADN, nécessitant l’activation de plusieurs voies de la machinerie de
réparation de dommage à l’ADN, ce qui rend beaucoup plus compliqué la mise en place de
mécanismes de résistance. Enfin, cette combinaison n’entraînait aucune toxicité sur des
cellules mésothéliales saines, mettant en évidence le caractère non toxique d’une telle
combinaison pour les cellules saines présentes dans le microenvironnement tumoral. La
différence de sensibilité à la combinaison cisplatine-PEITC entre les cellules de MPM et les
cellules mésothéliales saines peut s’expliquer par une capacité des cellules saines à mieux
supporter des conditions de stress oxydatif, grâce à une protection qui leur est conférée par
l’activité du glutathion et de certaines catalases [595]. Ces mécanismes de protection sont
souvent altérés dans les cellules malignes et sont associés avec une augmentation de l’activité
métabolique intracellulaire. Ces changements conduisent à une augmentation du niveau de
ROS dans les cellules malignes comparé aux cellules saines, ce qui contribue à favoriser leur
caractère oncogène [626]. En contrepartie, les cellules tumorales subissent un stress oxydatif
plus important que les cellules saines, en raison des processus de transformation oncogénique,
d’altération de l’activité métabolique et d’augmentation de la production de ROS [681] [682684], ce qui les rend plus sensibles à des composés qui rajoutent un stress oxydatif
supplémentaire, comparé aux cellules saines. De plus, cette absence de toxicité sur les cellules
saines est un phénomène qui a aussi été observé dans d’autres types de cancers. Une étude
menée sur un modèle de cancer du col de l’utérus montre ainsi l’absence de toxicité de la
combinaison de cisplatine-PEITC sur les cellules épithéliales mammaires saines [621], et
d’autres auteurs montrent le caractère non toxique d’une combinaison de cisplatine avec le
BITC sur des lymphocytes humains normaux dans un modèle de leucémie [627]. De plus,
d’autres stratégies cherchant à augmenter le stress oxydatif intracellulaire pour obtenir un
effet cytotoxique anti-tumoral montrent le caractère non toxique d’une telle stratégie sur des
cellules de mésothéliome [623-624].
Cependant, les résultats que j’ai obtenus dans cette étude in vitro ne prennent pas en
considération le microenvironnement tumoral ou les conditions physiopathologiques de
développement de la maladie. Une évaluation in vivo de l’injection intrapleurale de la
combinaison cisplatine-PEITC dans un modèle murin de MPM permettrait donc de confirmer
les résultats obtenus in vitro. Les premiers travaux à soulever la nécessité d’améliorer les
modèles d’étude de MPM ont mis en place un modèle murin de MPM par une implantation
orthotopique chirurgicale dans la cavité pleurale de souris immunodéprimées NUDE de tissu
tumoral intact récupéré chez un patient atteint de MPM [685]. Plus tard, une autre étude a mis
284
DISCUSSION
au point un modèle murin de MPM dans des souris immunodéprimées SCID (severe
combined immunodeficiency), par une injection orthotopique de lignées cellulaires de MPM
humaines [686]. De plus, l’utilisation d’un modèle de rat n’est pas à exclure, notamment pour
l’étude de récidives de MPM. Certains auteurs ont en effet mis en place un modèle chez le rat
pour étudier diverses thérapies intrapleurales, grâce à une injection de cellules syngéniques de
MPM directement dans la cavité pleurale [687].
Cependant, bien que l’utilisation d’un modèle murin permette de se rapprocher des
conditions physiopathologiques du MPM, le microenvironnement tumoral murin demeure
différent de celui retrouvé chez l’homme, de même que les effets secondaires observés. A titre
d’exemple, le principal effet secondaire du SAHA observé chez l’homme est une
thrombopénie, alors que des souris traitées avec du SAHA n’ont pas de diminution du nombre
de plaquettes. Pour améliorer mon étude de la combinaison cisplatine-PEITC, il apparaît donc
comme nécessaire de prendre en considération le microenvironnement tumoral retrouvé chez
l’homme. Des co-cultures de cellules de MPM avec les cellules présentes dans ce
microenvironnement tumoral permettraient donc de vérifier les effets thérapeutiques de la
combinaison dans des conditions plus proches de la réalité. La co-culture de cellules de MPM
avec des macrophages permettrait de vérifier l’efficacité anti-tumorale de la combinaison,
malgré les propriétés de stimulation de la prolifération cellulaire des macrophages. En effet,
les macrophages, présents dans le microenvironnement tumoral de bon nombre de cancers,
favorisent la prolifération des cellules tumorales, notamment par la production de facteurs de
croissance [688]. De plus, la co-culture de cellules de MPM avec des macrophages et des
cellules mésothéliales saines, également présentes dans le microenvironnement tumoral,
permettrait de vérifier que l’utilisation d’une combinaison induisant un stress oxydatif n’est
pas toxique sur les cellules saines en présence des macrophages, qui produisent déjà des ROS
[689].
La combinaison cisplatine-PEITC injectée directement dans la cavité pleurale pourrait
représenter une stratégie prometteuse pour induire une toxicité sélective envers les cellules
malignes, épargnant les cellules mésothéliales saines présentes dans le microenvironnement
tumoral. En effet, des essais cliniques ont précédemment exploité l’injection intrapleurale de
différentes types de composés pour traiter le MPM [690-691], dont un essai actuellement en
cours (http://clinicaltrials.gov/show/NCT02054052). Ce travail montre donc l’intérêt et le
bénéfice thérapeutique de combiner le cisplatine avec le PEITC, non seulement pour
améliorer les effets cytotoxiques des molécules, mais aussi pour éviter aux cellules de
285
DISCUSSION
développer des mécanismes de résistance, ceci dans un environnement qui demeure non
toxique pour les cellules saines.
Mes travaux de thèse m’ont donc permis de caractériser et d’analyser deux alternatives
distinctes pour améliorer les traitements thérapeutiques actuellement appliqués en clinique
pour le traitement du MPM. La combinaison du cisplatine avec l’agent naturel de PEITC
pourrait offrir une voix d’administration intrapleurale grâce à son absence de toxicité sur les
cellules mésothéliales saines, et apparaît comme une stratégie à fort potentiel thérapeutique
pour le traitement du MPM. De plus, j’ai caractérisé un nouveau mode d’administration de
composés thérapeutiques in vitro et in vivo pour le traitement du MPM par la vectorisation de
trois iHDAC. La stratégie que j’ai étudiée, basée sur l’effet EPR et sur un système de
libération acido-sensible des composés, représente une alternative très prometteuse pour le
traitement du MPM. J’ai non seulement montré l’intérêt d’une telle stratégie pour cibler
spécifiquement les tumeurs sans affecter les tissus et organes sains environnants, mais je
démontre également par ce travail l’amélioration de l’activité des iHDAC in vivo une fois
vectorisés. Lors de mon travail, une molécule récemment synthétisée, le NODH, est apparue
comme particulièrement prometteuse. La vectorisation du NODH a en effet permis
l’induction d’une régression tumorale massive. Cette étude m’a donc permis de prouver
l’intérêt thérapeutique du concept de vectorisation appliqué aux iHDAC pour le traitement du
MPM.
Ces travaux m’ont donc permis d’une part de rappeler l’intérêt de la biodiversité pour
la découverte de nouvelles molécules à fort potentiel thérapeutique, et d’autre part de mettre
en évidence tout l’intérêt des nanomédecines pour le traitement du MPM.
286
RÉFÉRENCES
RÉFÉRENCES
1. Bianchi C, Bianchi T: Malignant mesothelioma: global incidence and relationship with
asbestos. Ind Health 2007, 45: 379-387.
2. Ahmed I, Ahmed Tipu S, Ishtiaq S: Malignant mesothelioma. Pak J Med Sci 2013, 29:
1433-1438.
3. Klemperer P, Coleman BR: Primary neoplasms of the pleura. A report of five cases. Am
J Ind Med 1992, 22: 1-31.
4. Husain AN, Colby TV, Ordonez NG, Krausz T, Borczuk A, Cagle PT et al.: Guidelines for
pathologic diagnosis of malignant mesothelioma: a consensus statement from the
International Mesothelioma Interest Group. Arch Pathol Lab Med 2009, 133:
1317-1331.
5. Klebe S, Brownlee NA, Mahar A, Burchette JL, Sporn TA, Vollmer RT et al.:
Sarcomatoid mesothelioma: a clinical-pathologic correlation of 326 cases. Mod
Pathol 2010, 23: 470-479.
6. Klebe S, Mahar A, Henderson DW, Roggli VL: Malignant mesothelioma with
heterologous elements: clinicopathological correlation of 27 cases and literature
review. Mod Pathol 2008, 21: 1084-1094.
7. Nasreen N, Khodayari N, Mohammed KA: Advances in malignant pleural mesothelioma
therapy: targeting EphA2 a novel approach. Am J Cancer Res 2012, 2: 222-234.
8. Robinson BW, Musk AW, Lake RA: Malignant mesothelioma. Lancet 2005, 366: 397408.
9. Craighead JE: Epidemiology of mesothelioma and historical background. Recent
Results Cancer Res 2011, 189: 13-25.
10. Delgermaa V, Takahashi K, Park EK, Le GV, Hara T, Sorahan T: Global mesothelioma
deaths reported to the World Health Organization between 1994 and 2008. Bull
World Health Organ 2011, 89: 716-724, 724A-724C.
11. Neumann V, Loseke S, Nowak D, Herth FJ, Tannapfel A: Malignant pleural
mesothelioma: incidence, etiology, diagnosis, treatment, and occupational health.
Dtsch Arztebl Int 2013, 110: 319-326.
12. Neumann V, Loseke S, Tannapfel A: Mesothelioma and analysis of tissue fiber
content. Recent Results Cancer Res 2011, 189: 79-95.
13. Boffetta P: Epidemiology of peritoneal mesothelioma: a review. Ann Oncol 2007, 18:
985-990.
14. Wagner JC, Sleggs CA, Marchand P: Diffuse pleural mesothelioma and asbestos
exposure in the North Western Cape Province. Br J Ind Med 1960, 17: 260-271.
15. Sporn TA: Mineralogy of asbestos. Recent Results Cancer Res 2011, 189: 1-11.
16. Stayner LT, Dankovic DA, Lemen RA: Occupational exposure to chrysotile asbestos
and cancer risk: a review of the amphibole hypothesis. Am J Public Health 1996,
86: 179-186.
17. Rodelsperger K, Woitowitz HJ, Bruckel B, Arhelger R, Pohlabeln H, Jockel KH: Doseresponse relationship between amphibole fiber lung burden and mesothelioma.
Cancer Detect Prev 1999, 23: 183-193.
18. Holt PF: Translocation of inhaled dust to the pleura. Environ Res 1983, 31: 212-220.
19. Adamson IY, Bakowska J: KGF and HGF are growth factors for mesothelial cells in
pleural lavage fluid after intratracheal asbestos. Exp Lung Res 2001, 27: 605-616.
20. Jaurand MC, Kaplan H, Thiollet J, Pinchon MC, Bernaudin JF, Bignon J: Phagocytosis of
chrysotile fibers by pleural mesothelial cells in culture. Am J Pathol 1979, 94: 529538.
287
RÉFÉRENCES
21. Liu W, Ernst JD, Broaddus VC: Phagocytosis of crocidolite asbestos induces oxidative
stress, DNA damage, and apoptosis in mesothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol
2000, 23: 371-378.
22. Yegles M, Saint-Etienne L, Renier A, Janson X, Jaurand MC: Induction of metaphase
and anaphase/telophase abnormalities by asbestos fibers in rat pleural
mesothelial cells in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol 1993, 9: 186-191.
23. Hansen K, Mossman BT: Generation of superoxide (O2-.) from alveolar macrophages
exposed to asbestiform and nonfibrous particles. Cancer Res 1987, 47: 1681-1686.
24. Levresse V, Renier A, Fleury-Feith J, Levy F, Moritz S, Vivo C et al.: Analysis of cell
cycle disruptions in cultures of rat pleural mesothelial cells exposed to asbestos
fibers. Am J Respir Cell Mol Biol 1997, 17: 660-671.
25. Zanella CL, Posada J, Tritton TR, Mossman BT: Asbestos causes stimulation of the
extracellular signal-regulated kinase 1 mitogen-activated protein kinase cascade
after phosphorylation of the epidermal growth factor receptor. Cancer Res 1996,
56: 5334-5338.
26. Saenz-Robles MT, Sullivan CS, Pipas JM: Transforming functions of Simian Virus 40.
Oncogene 2001, 20: 7899-7907.
27. Carbone M, Kratzke RA, Testa JR: The pathogenesis of mesothelioma. Semin Oncol
2002, 29: 2-17.
28. Cutrone R, Lednicky J, Dunn G, Rizzo P, Bocchetta M, Chumakov K et al.: Some oral
poliovirus vaccines were contaminated with infectious SV40 after 1961. Cancer
Res 2005, 65: 10273-10279.
29. Carbone M, Pass HI, Rizzo P, Marinetti M, Di Muzio M, Mew DJ et al.: Simian virus 40like DNA sequences in human pleural mesothelioma. Oncogene 1994, 9: 17811790.
30. Gazdar AF, Butel JS, Carbone M: SV40 and human tumours: myth, association or
causality? Nat Rev Cancer 2002, 2: 957-964.
31. Carbone M, Ly BH, Dodson RF, Pagano I, Morris PT, Dogan UA et al.: Malignant
mesothelioma: facts, myths, and hypotheses. J Cell Physiol 2012, 227: 44-58.
32. Balsara BR, Bell DW, Sonoda G, De Rienzo A, du Manoir S, Jhanwar SC et al.:
Comparative genomic hybridization and loss of heterozygosity analyses identify a
common region of deletion at 15q11.1-15 in human malignant mesothelioma.
Cancer Res 1999, 59: 450-454.
33. Bjorkqvist AM, Wolf M, Nordling S, Tammilehto L, Knuuttila A, Kere J et al.: Deletions
at 14q in malignant mesothelioma detected by microsatellite marker analysis. Br
J Cancer 1999, 81: 1111-1115.
34. Lee AY, Raz DJ, He B, Jablons DM: Update on the molecular biology of malignant
mesothelioma. Cancer 2007, 109: 1454-1461.
35. Weiner SJ, Neragi-Miandoab S: Pathogenesis of malignant pleural mesothelioma and
the role of environmental and genetic factors. J Cancer Res Clin Oncol 2009, 135:
15-27.
36. Robinson BW, Lake RA: Advances in malignant mesothelioma. N Engl J Med 2005,
353: 1591-1603.
37. Murthy SS, Testa JR: Asbestos, chromosomal deletions, and tumor suppressor gene
alterations in human malignant mesothelioma. J Cell Physiol 1999, 180: 150-157.
38. Bianchi AB, Mitsunaga SI, Cheng JQ, Klein WM, Jhanwar SC, Seizinger B et al.: High
frequency of inactivating mutations in the neurofibromatosis type 2 gene (NF2)
in primary malignant mesotheliomas. Proc Natl Acad Sci U S A 1995, 92: 1085410858.
288
RÉFÉRENCES
39. Cheng JQ, Lee WC, Klein MA, Cheng GZ, Jhanwar SC, Testa JR: Frequent mutations
of NF2 and allelic loss from chromosome band 22q12 in malignant mesothelioma:
evidence for a two-hit mechanism of NF2 inactivation. Genes Chromosomes
Cancer 1999, 24: 238-242.
40. McClatchey AI, Giovannini M: Membrane organization and tumorigenesis--the NF2
tumor suppressor, Merlin. Genes Dev 2005, 19: 2265-2277.
41. Illei PB, Rusch VW, Zakowski MF, Ladanyi M: Homozygous deletion of CDKN2A and
codeletion of the methylthioadenosine phosphorylase gene in the majority of
pleural mesotheliomas. Clin Cancer Res 2003, 9: 2108-2113.
42. Lopez-Rios F, Chuai S, Flores R, Shimizu S, Ohno T, Wakahara K et al.: Global gene
expression profiling of pleural mesotheliomas: overexpression of aurora kinases
and P16/CDKN2A deletion as prognostic factors and critical evaluation of
microarray-based prognostic prediction. Cancer Res 2006, 66: 2970-2979.
43. Xio S, Li D, Vijg J, Sugarbaker DJ, Corson JM, Fletcher JA: Codeletion of p15 and p16
in primary malignant mesothelioma. Oncogene 1995, 11: 511-515.
44. Prins JB, Williamson KA, Kamp MM, Van Hezik EJ, Van der Kwast TH, Hagemeijer A
et al.: The gene for the cyclin-dependent-kinase-4 inhibitor, CDKN2A, is
preferentially deleted in malignant mesothelioma. Int J Cancer 1998, 75: 649-653.
45. Hirao T, Bueno R, Chen CJ, Gordon GJ, Heilig E, Kelsey KT: Alterations of the
p16(INK4) locus in human malignant mesothelial tumors. Carcinogenesis 2002,
23: 1127-1130.
46. Ladanyi M: Implications of P16/CDKN2A deletion in pleural mesotheliomas. Lung
Cancer 2005, 49 Suppl 1: S95-98.
47. Avruch J, Xavier R, Bardeesy N, Zhang XF, Praskova M, Zhou D et al.: Rassf family of
tumor suppressor polypeptides. J Biol Chem 2009, 284: 11001-11005.
48. Toyooka S, Carbone M, Toyooka KO, Bocchetta M, Shivapurkar N, Minna JD et al.:
Progressive aberrant methylation of the RASSF1A gene in simian virus 40
infected human mesothelial cells. Oncogene 2002, 21: 4340-4344.
49. Bott M, Brevet M, Taylor BS, Shimizu S, Ito T, Wang L et al.: The nuclear
deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1
losses in malignant pleural mesothelioma. Nat Genet 2011, 43: 668-672.
50. Fox S, Dharmarajan A: WNT signaling in malignant mesothelioma. Front Biosci 2006,
11: 2106-2112.
51. Uematsu K, Kanazawa S, You L, He B, Xu Z, Li K et al.: Wnt pathway activation in
mesothelioma: evidence of Dishevelled overexpression and transcriptional
activity of beta-catenin. Cancer Res 2003, 63: 4547-4551.
52. Mazieres J, He B, You L, Xu Z, Lee AY, Mikami I et al.: Wnt inhibitory factor-1 is
silenced by promoter hypermethylation in human lung cancer. Cancer Res 2004,
64: 4717-4720.
53. Klune JR, Dhupar R, Cardinal J, Billiar TR, Tsung A: HMGB1: endogenous danger
signaling. Mol Med 2008, 14: 476-484.
54. Yang H, Bocchetta M, Kroczynska B, Elmishad AG, Chen Y, Liu Z et al.: TNF-alpha
inhibits asbestos-induced cytotoxicity via a NF-kappaB-dependent pathway, a
possible mechanism for asbestos-induced oncogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A
2006, 103: 10397-10402.
55. Yang H, Rivera Z, Jube S, Nasu M, Bertino P, Goparaju C et al.: Programmed necrosis
induced by asbestos in human mesothelial cells causes high-mobility group box 1
protein release and resultant inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A 2010, 107:
12611-12616.
289
RÉFÉRENCES
56. Liu JY, Brass DM, Hoyle GW, Brody AR: TNF-alpha receptor knockout mice are
protected from the fibroproliferative effects of inhaled asbestos fibers. Am J
Pathol 1998, 153: 1839-1847.
57. Liu Z, Klominek J: Chemotaxis and chemokinesis of malignant mesothelioma cells to
multiple growth factors. Anticancer Res 2004, 24: 1625-1630.
58. Masood R, Kundra A, Zhu S, Xia G, Scalia P, Smith DL et al.: Malignant mesothelioma
growth inhibition by agents that target the VEGF and VEGF-C autocrine loops.
Int J Cancer 2003, 104: 603-610.
59. O'Kane SL, Pound RJ, Campbell A, Chaudhuri N, Lind MJ, Cawkwell L: Expression of
bcl-2 family members in malignant pleural mesothelioma. Acta Oncol 2006, 45:
449-453.
60. Dhaene K, Wauters J, Weyn B, Timmermans JP, van Marck E: Expression profile of
telomerase subunits in human pleural mesothelioma. J Pathol 2000, 190: 80-85.
61. Scherpereel A, Astoul P, Baas P, Berghmans T, Clayson H, de Vuyst P et al.: [Guidelines
of the European Respiratory Society and the European Society of Thoracic
Surgeons for the management of malignant pleural mesothelioma]. Zhongguo Fei
Ai Za Zhi 2010, 13: C23-45.
62. Gill RR: Imaging of mesothelioma. Recent Results Cancer Res 2011, 189: 27-43.
63. Campbell NP, Kindler HL: Update on malignant pleural mesothelioma. Semin Respir
Crit Care Med 2011, 32: 102-110.
64. Pinto C, Novello S, Torri V, Ardizzoni A, Betta PG, Bertazzi PA et al.: Second Italian
consensus conference on malignant pleural mesothelioma: state of the art and
recommendations. Cancer Treat Rev 2013, 39: 328-339.
65. Henderson DW, Reid G, Kao SC, van Zandwijk N, Klebe S: Challenges and
controversies in the diagnosis of mesothelioma: Part 1. Cytology-only diagnosis,
biopsies, immunohistochemistry, discrimination between mesothelioma and
reactive mesothelial hyperplasia, and biomarkers. J Clin Pathol 2013, 66: 847-853.
66. BTS statement on malignant mesothelioma in the UK, 2007. Thorax 2007, 62 Suppl 2:
ii1-ii19.
67. Reuss J: Sonography of the pleura. Ultraschall Med 2010, 31: 8-22, quiz 23-25.
68. Whitaker D: The cytology of malignant mesothelioma. Cytopathology 2000, 11: 139151.
69. King J, Thatcher N, Pickering C, Hasleton P: Sensitivity and specificity of
immunohistochemical antibodies used to distinguish between benign and
malignant pleural disease: a systematic review of published reports.
Histopathology 2006, 49: 561-568.
70. Cury PM, Butcher DN, Corrin B, Nicholson AG: The use of histological and
immunohistochemical markers to distinguish pleural malignant mesothelioma
and in situ mesothelioma from reactive mesothelial hyperplasia and reactive
pleural fibrosis. J Pathol 1999, 189: 251-257.
71. Attanoos RL, Griffin A, Gibbs AR: The use of immunohistochemistry in distinguishing
reactive from neoplastic mesothelium. A novel use for desmin and comparative
evaluation with epithelial membrane antigen, p53, platelet-derived growth factorreceptor, P-glycoprotein and Bcl-2. Histopathology 2003, 43: 231-238.
72. Kato Y, Tsuta K, Seki K, Maeshima AM, Watanabe S, Suzuki K et al.:
Immunohistochemical detection of GLUT-1 can discriminate between reactive
mesothelium and malignant mesothelioma. Mod Pathol 2007, 20: 215-220.
73. Monaco SE, Shuai Y, Bansal M, Krasinskas AM, Dacic S: The diagnostic utility of p16
FISH and GLUT-1 immunohistochemical analysis in mesothelial proliferations.
Am J Clin Pathol 2011, 135: 619-627.
290
RÉFÉRENCES
74. Scherpereel A, Astoul P, Baas P, Berghmans T, Clayson H, de Vuyst P et al.: Guidelines
of the European Respiratory Society and the European Society of Thoracic
Surgeons for the management of malignant pleural mesothelioma. Eur Respir J
2010, 35: 479-495.
75. Klebe S, Nurminen M, Leigh J, Henderson DW: Diagnosis of epithelial mesothelioma
using tree-based regression analysis and a minimal panel of antibodies. Pathology
2009, 41: 140-148.
76. Attanoos RL, Webb R, Dojcinov SD, Gibbs AR: Malignant epithelioid mesothelioma:
anti-mesothelial marker expression correlates with histological pattern.
Histopathology 2001, 39: 584-588.
77. Benjamin H, Lebanony D, Rosenwald S, Cohen L, Gibori H, Barabash N et al.: A
diagnostic assay based on microRNA expression accurately identifies malignant
pleural mesothelioma. J Mol Diagn 2010, 12: 771-779.
78. Robinson BW, Creaney J, Lake R, Nowak A, Musk AW, de Klerk N et al.: Mesothelinfamily proteins and diagnosis of mesothelioma. Lancet 2003, 362: 1612-1616.
79. Hollevoet K, Reitsma JB, Creaney J, Grigoriu BD, Robinson BW, Scherpereel A et al.:
Serum mesothelin for diagnosing malignant pleural mesothelioma: an individual
patient data meta-analysis. J Clin Oncol 2012, 30: 1541-1549.
80. Sapede C, Gauvrit A, Barbieux I, Padieu M, Cellerin L, Sagan C et al.: Aberrant splicing
and protease involvement in mesothelin release from epithelioid mesothelioma
cells. Cancer Sci 2008, 99: 590-594.
81. Robinson BW, Creaney J, Lake R, Nowak A, Musk AW, de Klerk N et al.: Soluble
mesothelin-related protein--a blood test for mesothelioma. Lung Cancer 2005, 49
Suppl 1: S109-111.
82. Cui A, Jin XG, Zhai K, Tong ZH, Shi HZ: Diagnostic values of soluble mesothelinrelated peptides for malignant pleural mesothelioma: updated meta-analysis.
BMJ Open 2014, 4: e004145.
83. Hollevoet K, Nackaerts K, Thimpont J, Germonpre P, Bosquee L, De Vuyst P et al.:
Diagnostic performance of soluble mesothelin and megakaryocyte potentiating
factor in mesothelioma. Am J Respir Crit Care Med 2010, 181: 620-625.
84. Ordonez NG: Value of mesothelin immunostaining in the diagnosis of mesothelioma.
Mod Pathol 2003, 16: 192-197.
85. Pass HI, Goparaju C: Fibulin-3 as a biomarker for pleural mesothelioma. N Engl J
Med 2013, 368: 190.
86. Hollevoet K, Sharon E: Fibulin-3 as a biomarker for pleural mesothelioma. N Engl J
Med 2013, 368: 189.
87. Hollevoet K, Nackaerts K, Gosselin R, De Wever W, Bosquee L, De Vuyst P et al.:
Soluble mesothelin, megakaryocyte potentiating factor, and osteopontin as
markers of patient response and outcome in mesothelioma. J Thorac Oncol 2011,
6: 1930-1937.
88. Pinato DJ, Nya P, Sharma R, Mauri FA: CD24: a potential new marker in
differentiating malignant mesothelioma from pulmonary adenocarcinoma. J Clin
Pathol 2013, 66: 256-259.
89. Tabata C, Shibata E, Tabata R, Kanemura S, Mikami K, Nogi Y et al.: Serum HMGB1
as a prognostic marker for malignant pleural mesothelioma. BMC Cancer 2013,
13: 205.
90. Sethi S, Ali S, Philip PA, Sarkar FH: Clinical advances in molecular biomarkers for
cancer diagnosis and therapy. Int J Mol Sci 2013, 14: 14771-14784.
291
RÉFÉRENCES
91. Sturchio E, Amadori A, Businaro J, Ficociello B, Ferrazza P, Colosio C et al.: [Possible
use of microRNAs as biomarkers for monitoring of workers exposed to asbestos].
G Ital Med Lav Ergon 2012, 34: 571-573.
92. Santarelli L, Strafella E, Staffolani S, Amati M, Emanuelli M, Sartini D et al.:
Association of MiR-126 with soluble mesothelin-related peptides, a marker for
malignant mesothelioma. PLoS One 2011, 6: e18232.
93. Kirschner MB, Cheng YY, Badrian B, Kao SC, Creaney J, Edelman JJ et al.: Increased
circulating miR-625-3p: a potential biomarker for patients with malignant
pleural mesothelioma. J Thorac Oncol 2012, 7: 1184-1191.
94. Sekido Y: Molecular pathogenesis of malignant mesothelioma. Carcinogenesis 2013,
34: 1413-1419.
95. Treasure T, Sedrakyan A: Pleural mesothelioma: little evidence, still time to do trials.
Lancet 2004, 364: 1183-1185.
96. Rice D: Surgical therapy of mesothelioma. Recent Results Cancer Res 2011, 189: 97125.
97. Teh E, Fiorentino F, Tan C, Treasure T: A systematic review of lung-sparing
extirpative surgery for pleural mesothelioma. J R Soc Med 2011, 104: 69-80.
98. Muers MF, Stephens RJ, Fisher P, Darlison L, Higgs CM, Lowry E et al.: Active
symptom control with or without chemotherapy in the treatment of patients with
malignant pleural mesothelioma (MS01): a multicentre randomised trial. Lancet
2008, 371: 1685-1694.
99. Vogelzang NJ, Rusthoven JJ, Symanowski J, Denham C, Kaukel E, Ruffie P et al.: Phase
III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in
patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol 2003, 21: 2636-2644.
100. Grosso F, Scagliotti GV: Systemic treatment of malignant pleural mesothelioma.
Future Oncol 2012, 8: 293-305.
101. van Meerbeeck JP, Gaafar R, Manegold C, Van Klaveren RJ, Van Marck EA, Vincent M
et al.: Randomized phase III study of cisplatin with or without raltitrexed in
patients with malignant pleural mesothelioma: an intergroup study of the
European Organisation for Research and Treatment of Cancer Lung Cancer
Group and the National Cancer Institute of Canada. J Clin Oncol 2005, 23: 68816889.
102. Wang Y, Zhao R, Chattopadhyay S, Goldman ID: A novel folate transport activity in
human mesothelioma cell lines with high affinity and specificity for the newgeneration antifolate, pemetrexed. Cancer Res 2002, 62: 6434-6437.
103. Ceresoli GL, Zucali PA, Favaretto AG, Grossi F, Bidoli P, Del Conte G et al.: Phase II
study of pemetrexed plus carboplatin in malignant pleural mesothelioma. J Clin
Oncol 2006, 24: 1443-1448.
104. Santoro A, O'Brien ME, Stahel RA, Nackaerts K, Baas P, Karthaus M et al.:
Pemetrexed plus cisplatin or pemetrexed plus carboplatin for chemonaive
patients with malignant pleural mesothelioma: results of the International
Expanded Access Program. J Thorac Oncol 2008, 3: 756-763.
105. Hughes A, Calvert P, Azzabi A, Plummer R, Johnson R, Rusthoven J et al.: Phase I
clinical and pharmacokinetic study of pemetrexed and carboplatin in patients
with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol 2002, 20: 3533-3544.
106. Castagneto B, Zai S, Dongiovanni D, Muzio A, Bretti S, Numico G et al.: Cisplatin and
gemcitabine in malignant pleural mesothelioma: a phase II study. Am J Clin
Oncol 2005, 28: 223-226.
292
RÉFÉRENCES
107. Baas P, Ardizzoni A, Grossi F, Nackaerts K, Numico G, Van Marck E et al.: The
activity of raltitrexed (Tomudex) in malignant pleural mesothelioma: an EORTC
phase II study (08992). Eur J Cancer 2003, 39: 353-357.
108. Mansour M, Mourad C: Phase II study of single agent oral vinorelbine as first-line
treatment in patients with HER-2 negative metastatic breast cancer. Cancer
Chemother Pharmacol 2013, 72: 429-435.
109. Caffo O, Dipasquale M, Murgia V, Veccia A, Galligioni E: An evaluation of the
pharmacokinetics and clinical use of vinorelbine for NSCLC treatment. Expert
Opin Drug Metab Toxicol 2013, 9: 1037-1051.
110. Steele JP, Shamash J, Evans MT, Gower NH, Tischkowitz MD, Rudd RM: Phase II
study of vinorelbine in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin
Oncol 2000, 18: 3912-3917.
111. Sorensen JB, Frank H, Palshof T: Cisplatin and vinorelbine first-line chemotherapy
in non-resectable malignant pleural mesothelioma. Br J Cancer 2008, 99: 44-50.
112. Henss H, Fiebig HH, Schildge J, Arnold H, Hasse J: Phase-II study with the
combination of cisplatin and doxorubicin in advanced malignant mesothelioma of
the pleura. Onkologie 1988, 11: 118-120.
113. Ardizzoni A, Rosso R, Salvati F, Fusco V, Cinquegrana A, De Palma M et al.: Activity
of doxorubicin and cisplatin combination chemotherapy in patients with diffuse
malignant pleural mesothelioma. An Italian Lung Cancer Task Force
(FONICAP) Phase II study. Cancer 1991, 67: 2984-2987.
114. Chahinian AP, Antman K, Goutsou M, Corson JM, Suzuki Y, Modeas C et al.:
Randomized phase II trial of cisplatin with mitomycin or doxorubicin for
malignant mesothelioma by the Cancer and Leukemia Group B. J Clin Oncol
1993, 11: 1559-1565.
115. Manegold C, Symanowski J, Gatzemeier U, Reck M, von Pawel J, Kortsik C et al.:
Second-line (post-study) chemotherapy received by patients treated in the phase
III trial of pemetrexed plus cisplatin versus cisplatin alone in malignant pleural
mesothelioma. Ann Oncol 2005, 16: 923-927.
116. Bearz A, Talamini R, Rossoni G, Santo A, de Pangher V, Fasola G et al.: Re-challenge
with pemetrexed in advanced mesothelioma: a multi-institutional experience.
BMC Res Notes 2012, 5: 482.
117. Dhalluin X, Scherpereel A: Chemotherapy and radiotherapy for mesothelioma.
Recent Results Cancer Res 2011, 189: 127-147.
118. Baldini EH: External beam radiation therapy for the treatment of pleural
mesothelioma. Thorac Surg Clin 2004, 14: 543-548.
119. Krug LM, Pass HI, Rusch VW, Kindler HL, Sugarbaker DJ, Rosenzweig KE et al.:
Multicenter phase II trial of neoadjuvant pemetrexed plus cisplatin followed by
extrapleural pneumonectomy and radiation for malignant pleural mesothelioma.
J Clin Oncol 2009, 27: 3007-3013.
120. Bolukbas S, Manegold C, Eberlein M, Bergmann T, Fisseler-Eckhoff A, Schirren J:
Survival after trimodality therapy for malignant pleural mesothelioma: Radical
Pleurectomy, chemotherapy with Cisplatin/Pemetrexed and radiotherapy. Lung
Cancer 2011, 71: 75-81.
121. Van Schil PE, Baas P, Gaafar R, Maat AP, Van de Pol M, Hasan B et al.: Trimodality
therapy for malignant pleural mesothelioma: results from an EORTC phase II
multicentre trial. Eur Respir J 2010, 36: 1362-1369.
122. Hasani A, Alvarez JM, Wyatt JM, Bydder S, Millward M, Byrne M et al.: Outcome for
patients with malignant pleural mesothelioma referred for Trimodality therapy
in Western Australia. J Thorac Oncol 2009, 4: 1010-1016.
293
RÉFÉRENCES
123. Zucali PA, Ceresoli GL, De Vincenzo F, Simonelli M, Lorenzi E, Gianoncelli L et al.:
Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev
2011, 37: 543-558.
124. Pinato DJ, Mauri FA, Ramakrishnan R, Wahab L, Lloyd T, Sharma R: Inflammationbased prognostic indices in malignant pleural mesothelioma. J Thorac Oncol 2012,
7: 587-594.
125. Kao SC, Pavlakis N, Harvie R, Vardy JL, Boyer MJ, van Zandwijk N et al.: High blood
neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant
mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res 2010, 16:
5805-5813.
126. Leigh RA, Webster I: Lymphocytic infiltration of pleural mesothelioma and its
significance for survival. S Afr Med J 1982, 61: 1007-1009.
127. Hegmans JP, Hemmes A, Hammad H, Boon L, Hoogsteden HC, Lambrecht BN:
Mesothelioma environment comprises cytokines and T-regulatory cells that
suppress immune responses. Eur Respir J 2006, 27: 1086-1095.
128. Roulois D, Vignard V, Gueugnon F, Labarriere N, Gregoire M, Fonteneau JF:
Recognition of pleural mesothelioma by mucin-1(950-958)/human leukocyte
antigen A*0201-specific CD8+ T-cells. Eur Respir J 2011, 38: 1117-1126.
129. Roulois D, Blanquart C, Panterne C, Gueugnon F, Gregoire M, Fonteneau JF:
Downregulation of MUC1 expression and its recognition by CD8(+) T cells on the
surface of malignant pleural mesothelioma cells treated with HDACi. Eur J
Immunol 2012, 42: 783-789.
130. Gregoire M: What's the place of immunotherapy in malignant mesothelioma
treatments? Cell Adh Migr 2010, 4: 153-161.
131. Bograd AJ, Suzuki K, Vertes E, Colovos C, Morales EA, Sadelain M et al.: Immune
responses and immunotherapeutic interventions in malignant pleural
mesothelioma. Cancer Immunol Immunother 2011, 60: 1509-1527.
132. Hegmans JP, Veltman JD, Lambers ME, de Vries IJ, Figdor CG, Hendriks RW et al.:
Consolidative dendritic cell-based immunotherapy elicits cytotoxicity against
malignant mesothelioma. Am J Respir Crit Care Med 2010, 181: 1383-1390.
133. Calabro L, Morra A, Fonsatti E, Cutaia O, Amato G, Giannarelli D et al.:
Tremelimumab for patients with chemotherapy-resistant advanced malignant
mesothelioma: an open-label, single-arm, phase 2 trial. Lancet Oncol 2013, 14:
1104-1111.
134. Webster I, Cochrane JW, Burkhardt KR: Immunotherapy with BCG vaccine in 30
cases of mesothelioma. S Afr Med J 1982, 61: 277-278.
135. Hassan R, Ebel W, Routhier EL, Patel R, Kline JB, Zhang J et al.: Preclinical
evaluation of MORAb-009, a chimeric antibody targeting tumor-associated
mesothelin. Cancer Immun 2007, 7: 20.
136. Hassan R, Cohen SJ, Phillips M, Pastan I, Sharon E, Kelly RJ et al.: Phase I clinical
trial of the chimeric anti-mesothelin monoclonal antibody MORAb-009 in
patients with mesothelin-expressing cancers. Clin Cancer Res 2010, 16: 6132-6138.
137. Russell SJ, Peng KW, Bell JC: Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol 2012, 30: 658670.
138. Gauvrit A, Brandler S, Sapede-Peroz C, Boisgerault N, Tangy F, Gregoire M: Measles
virus induces oncolysis of mesothelioma cells and allows dendritic cells to crossprime tumor-specific CD8 response. Cancer Res 2008, 68: 4882-4892.
139. Guillerme JB, Boisgerault N, Roulois D, Menager J, Combredet C, Tangy F et al.:
Measles virus vaccine-infected tumor cells induce tumor antigen cross-
294
RÉFÉRENCES
presentation by human plasmacytoid dendritic cells. Clin Cancer Res 2013, 19:
1147-1158.
140. Boisgerault N, Guillerme JB, Pouliquen D, Mesel-Lemoine M, Achard C, Combredet C
et al.: Natural oncolytic activity of live-attenuated measles virus against human
lung and colorectal adenocarcinomas. Biomed Res Int 2013, 2013: 387362.
141. Silberhumer GR, Brader P, Wong J, Serganova IS, Gonen M, Gonzalez SJ et al.:
Genetically engineered oncolytic Newcastle disease virus effectively induces
sustained remission of malignant pleural mesothelioma. Mol Cancer Ther 2010, 9:
2761-2769.
142. Dodelet VC, Pasquale EB: Eph receptors and ephrin ligands: embryogenesis to
tumorigenesis. Oncogene 2000, 19: 5614-5619.
143. Nasreen N, Mohammed KA, Antony VB: Silencing the receptor EphA2 suppresses
the growth and haptotaxis of malignant mesothelioma cells. Cancer 2006, 107:
2425-2435.
144. Mohammed KA, Wang X, Goldberg EP, Antony VB, Nasreen N: Silencing receptor
EphA2 induces apoptosis and attenuates tumor growth in malignant
mesothelioma. Am J Cancer Res 2011, 1: 419-431.
145. Barbieri F, Wurth R, Favoni RE, Pattarozzi A, Gatti M, Ratto A et al.: Receptor
tyrosine kinase inhibitors and cytotoxic drugs affect pleural mesothelioma cell
proliferation: insight into EGFR and ERK1/2 as antitumor targets. Biochem
Pharmacol 2011, 82: 1467-1477.
146. Liu Z, Klominek J: Inhibition of proliferation, migration, and matrix
metalloprotease production in malignant mesothelioma cells by tyrosine kinase
inhibitors. Neoplasia 2004, 6: 705-712.
147. Govindan R, Subramanian J: Optimising therapy for EGFR-addicted NSCLC: just
the start. Lancet Oncol 2012, 13: 216-217.
148. Foster JM, Radhakrishna U, Govindarajan V, Carreau JH, Gatalica Z, Sharma P et al.:
Clinical implications of novel activating EGFR mutations in malignant peritoneal
mesothelioma. World J Surg Oncol 2010, 8: 88.
149. Yasumitsu A, Tabata C, Tabata R, Hirayama N, Murakami A, Yamada S et al.: Clinical
significance of serum vascular endothelial growth factor in malignant pleural
mesothelioma. J Thorac Oncol 2010, 5: 479-483.
150. Kindler HL: Systemic treatments for mesothelioma: standard and novel. Curr Treat
Options Oncol 2008, 9: 171-179.
151. Kindler HL, Karrison TG, Gandara DR, Lu C, Krug LM, Stevenson JP et al.:
Multicenter, double-blind, placebo-controlled, randomized phase II trial of
gemcitabine/cisplatin plus bevacizumab or placebo in patients with malignant
mesothelioma. J Clin Oncol 2012, 30: 2509-2515.
152. Gotoh A, Kanno T, Nagaya H, Nakano T, Tabata C, Fukuoka K et al.: Gene therapy
using adenovirus against malignant mesothelioma. Anticancer Res 2012, 32: 37433747.
153. Volta V, Ranzato E, Martinotti S, Gallo S, Russo MV, Mutti L et al.: Preclinical
demonstration of synergistic Active Nutrients/Drug (AND) combination as a
potential treatment for malignant pleural mesothelioma. PLoS One 2013, 8:
e58051.
154. Shukla A, Miller JM, Cason C, Sayan M, MacPherson MB, Beuschel SL et al.:
Extracellular signal-regulated kinase 5: a potential therapeutic target for
malignant mesotheliomas. Clin Cancer Res 2013, 19: 2071-2083.
155. Waddington CH: The epigenotype. 1942. Int J Epidemiol 2012, 41: 10-13.
295
RÉFÉRENCES
156. Rodenhiser D, Mann M: Epigenetics and human disease: translating basic biology
into clinical applications. CMAJ 2006, 174: 341-348.
157. Berger SL, Kouzarides T, Shiekhattar R, Shilatifard A: An operational definition of
epigenetics. Genes Dev 2009, 23: 781-783.
158. Ducasse M, Brown MA: Epigenetic aberrations and cancer. Mol Cancer 2006, 5: 60.
159. Kanwal R, Gupta S: Epigenetics and cancer. J Appl Physiol (1985) 2010, 109: 598-605.
160. Wu SC, Zhang Y: Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev
Mol Cell Biol 2010, 11: 607-620.
161. Kim JK, Samaranayake M, Pradhan S: Epigenetic mechanisms in mammals. Cell Mol
Life Sci 2009, 66: 596-612.
162. Bogdanovic O, Veenstra GJ: DNA methylation and methyl-CpG binding proteins:
developmental requirements and function. Chromosoma 2009, 118: 549-565.
163. Robertson KD: DNA methylation and human disease. Nat Rev Genet 2005, 6: 597610.
164. Yates PA, Burman RW, Mummaneni P, Krussel S, Turker MS: Tandem B1 elements
located in a mouse methylation center provide a target for de novo DNA
methylation. J Biol Chem 1999, 274: 36357-36361.
165. Carnell AN, Goodman JI: The long (LINEs) and the short (SINEs) of it: altered
methylation as a precursor to toxicity. Toxicol Sci 2003, 75: 229-235.
166. Robertson KD, Wolffe AP: DNA methylation in health and disease. Nat Rev Genet
2000, 1: 11-19.
167. Robertson KD, Uzvolgyi E, Liang G, Talmadge C, Sumegi J, Gonzales FA et al.: The
human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA
expression in normal tissues and overexpression in tumors. Nucleic Acids Res
1999, 27: 2291-2298.
168. Deplus R, Brenner C, Burgers WA, Putmans P, Kouzarides T, de Launoit Y et al.:
Dnmt3L is a transcriptional repressor that recruits histone deacetylase. Nucleic
Acids Res 2002, 30: 3831-3838.
169. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP: Most mammalian mRNAs are
conserved targets of microRNAs. Genome Res 2009, 19: 92-105.
170. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E: DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b
are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 1999,
99: 247-257.
171. Shen L, Zhang Y: 5-Hydroxymethylcytosine: generation, fate, and genomic
distribution. Curr Opin Cell Biol 2013, 25: 289-296.
172. Ivanov M, Barragan I, Ingelman-Sundberg M: Epigenetic mechanisms of importance
for drug treatment. Trends Pharmacol Sci 2014.
173. Kohli RM, Zhang Y: TET enzymes, TDG and the dynamics of DNA demethylation.
Nature 2013, 502: 472-479.
174. Hahn MA, Qiu R, Wu X, Li AX, Zhang H, Wang J et al.: Dynamics of 5hydroxymethylcytosine and chromatin marks in Mammalian neurogenesis. Cell
Rep 2013, 3: 291-300.
175. Pfeifer GP, Kadam S, Jin SG: 5-hydroxymethylcytosine and its potential roles in
development and cancer. Epigenetics Chromatin 2013, 6: 10.
176. Cedar H, Bergman Y: Linking DNA methylation and histone modification: patterns
and paradigms. Nat Rev Genet 2009, 10: 295-304.
177. Suganuma T, Workman JL: Signals and combinatorial functions of histone
modifications. Annu Rev Biochem 2011, 80: 473-499.
296
RÉFÉRENCES
178. Karlic R, Chung HR, Lasserre J, Vlahovicek K, Vingron M: Histone modification
levels are predictive for gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A 2010, 107:
2926-2931.
179. Bannister AJ, Kouzarides T: Regulation of chromatin by histone modifications. Cell
Res 2011, 21: 381-395.
180. Williamson R: Properties of rapidly labelled deoxyribonucleic acid fragments
isolated from the cytoplasm of primary cultures of embryonic mouse liver cells. J
Mol Biol 1970, 51: 157-168.
181. Bots M, Johnstone RW: Rational combinations using HDAC inhibitors. Clin Cancer
Res 2009, 15: 3970-3977.
182. Kouzarides T: Chromatin modifications and their function. Cell 2007, 128: 693-705.
183. Wang Z, Patel DJ: Small molecule epigenetic inhibitors targeted to histone lysine
methyltransferases and demethylases. Q Rev Biophys 2013, 46: 349-373.
184. Bojang P, Jr., Ramos KS: The promise and failures of epigenetic therapies for cancer
treatment. Cancer Treat Rev 2014, 40: 153-169.
185. Shogren-Knaak M, Peterson CL: Switching on chromatin: mechanistic role of histone
H4-K16 acetylation. Cell Cycle 2006, 5: 1361-1365.
186. Shogren-Knaak M, Ishii H, Sun JM, Pazin MJ, Davie JR, Peterson CL: Histone H4-K16
acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science 2006,
311: 844-847.
187. Shahbazian MD, Grunstein M: Functions of site-specific histone acetylation and
deacetylation. Annu Rev Biochem 2007, 76: 75-100.
188. Strahl BD, Allis CD: The language of covalent histone modifications. Nature 2000,
403: 41-45.
189. Yang XJ, Seto E: The Rpd3/Hda1 family of lysine deacetylases: from bacteria and
yeast to mice and men. Nat Rev Mol Cell Biol 2008, 9: 206-218.
190. Feinberg AP, Vogelstein B: Hypomethylation distinguishes genes of some human
cancers from their normal counterparts. Nature 1983, 301: 89-92.
191. Gama-Sosa MA, Slagel VA, Trewyn RW, Oxenhandler R, Kuo KC, Gehrke CW et al.:
The 5-methylcytosine content of DNA from human tumors. Nucleic Acids Res
1983, 11: 6883-6894.
192. Fraga MF, Ballestar E, Villar-Garea A, Boix-Chornet M, Espada J, Schotta G et al.: Loss
of acetylation at Lys16 and trimethylation at Lys20 of histone H4 is a common
hallmark of human cancer. Nat Genet 2005, 37: 391-400.
193. Seligson DB, Horvath S, McBrian MA, Mah V, Yu H, Tze S et al.: Global levels of
histone modifications predict prognosis in different cancers. Am J Pathol 2009,
174: 1619-1628.
194. Wei Y, Xia W, Zhang Z, Liu J, Wang H, Adsay NV et al.: Loss of trimethylation at
lysine 27 of histone H3 is a predictor of poor outcome in breast, ovarian, and
pancreatic cancers. Mol Carcinog 2008, 47: 701-706.
195. Shen L, Kondo Y, Guo Y, Zhang J, Zhang L, Ahmed S et al.: Genome-wide profiling of
DNA methylation reveals a class of normally methylated CpG island promoters.
PLoS Genet 2007, 3: 2023-2036.
196. Sincic N, Herceg Z: DNA methylation and cancer: ghosts and angels above the
genes. Curr Opin Oncol 2011, 23: 69-76.
197. Caballero OL, Chen YT: Cancer/testis (CT) antigens: potential targets for
immunotherapy. Cancer Sci 2009, 100: 2014-2021.
198. Sakai T, Toguchida J, Ohtani N, Yandell DW, Rapaport JM, Dryja TP: Allele-specific
hypermethylation of the retinoblastoma tumor-suppressor gene. Am J Hum Genet
1991, 48: 880-888.
297
RÉFÉRENCES
199. Wang Y, Fischle W, Cheung W, Jacobs S, Khorasanizadeh S, Allis CD: Beyond the
double helix: writing and reading the histone code. Novartis Found Symp 2004,
259: 3-17; discussion 17-21, 163-169.
200. Sanders SL, Portoso M, Mata J, Bahler J, Allshire RC, Kouzarides T: Methylation of
histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell
2004, 119: 603-614.
201. Esteller M: Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.
Nat Rev Genet 2007, 8: 286-298.
202. Zhao Q, Rank G, Tan YT, Li H, Moritz RL, Simpson RJ et al.: PRMT5-mediated
methylation of histone H4R3 recruits DNMT3A, coupling histone and DNA
methylation in gene silencing. Nat Struct Mol Biol 2009, 16: 304-311.
203. Vaissiere T, Sawan C, Herceg Z: Epigenetic interplay between histone modifications
and DNA methylation in gene silencing. Mutat Res 2008, 659: 40-48.
204. Kondo Y, Shen L, Issa JP: Critical role of histone methylation in tumor suppressor
gene silencing in colorectal cancer. Mol Cell Biol 2003, 23: 206-215.
205. McGarvey KM, Fahrner JA, Greene E, Martens J, Jenuwein T, Baylin SB: Silenced
tumor suppressor genes reactivated by DNA demethylation do not return to a
fully euchromatic chromatin state. Cancer Res 2006, 66: 3541-3549.
206. Okada Y, Feng Q, Lin Y, Jiang Q, Li Y, Coffield VM et al.: hDOT1L links histone
methylation to leukemogenesis. Cell 2005, 121: 167-178.
207. Nguyen CT, Weisenberger DJ, Velicescu M, Gonzales FA, Lin JC, Liang G et al.:
Histone H3-lysine 9 methylation is associated with aberrant gene silencing in
cancer cells and is rapidly reversed by 5-aza-2'-deoxycytidine. Cancer Res 2002,
62: 6456-6461.
208. Wang GG, Allis CD, Chi P: Chromatin remodeling and cancer, Part II: ATPdependent chromatin remodeling. Trends Mol Med 2007, 13: 373-380.
209. Deckert J, Struhl K: Histone acetylation at promoters is differentially affected by
specific activators and repressors. Mol Cell Biol 2001, 21: 2726-2735.
210. Ellis L, Atadja PW, Johnstone RW: Epigenetics in cancer: targeting chromatin
modifications. Mol Cancer Ther 2009, 8: 1409-1420.
211. Lee DH, O'Connor TR, Pfeifer GP: Oxidative DNA damage induced by copper and
hydrogen peroxide promotes CG-->TT tandem mutations at methylated CpG
dinucleotides in nucleotide excision repair-deficient cells. Nucleic Acids Res 2002,
30: 3566-3573.
212. Parry TE: Mutagenic mechanisms in leukemia and cancer: a new concept Cytosine
lack could be as mutagenic as cytosine deamination. Leuk Res 2006, 30: 10791083.
213. Donkena KV, Young CY, Tindall DJ: Oxidative stress and DNA methylation in
prostate cancer. Obstet Gynecol Int 2010, 2010: 302051.
214. Metias SM, Lianidou E, Yousef GM: MicroRNAs in clinical oncology: at the
crossroads between promises and problems. J Clin Pathol 2009, 62: 771-776.
215. Myzak MC, Dashwood RH: Histone deacetylases as targets for dietary cancer
preventive agents: lessons learned with butyrate, diallyl disulfide, and
sulforaphane. Curr Drug Targets 2006, 7: 443-452.
216. Guil S, Esteller M: DNA methylomes, histone codes and miRNAs: tying it all
together. Int J Biochem Cell Biol 2009, 41: 87-95.
217. Rius M, Stresemann C, Keller D, Brom M, Schirrmacher E, Keppler D et al.: Human
concentrative nucleoside transporter 1-mediated uptake of 5-azacytidine
enhances DNA demethylation. Mol Cancer Ther 2009, 8: 225-231.
298
RÉFÉRENCES
218. Huber-Ruano I, Pastor-Anglada M: Transport of nucleoside analogs across the
plasma membrane: a clue to understanding drug-induced cytotoxicity. Curr Drug
Metab 2009, 10: 347-358.
219. Khan C, Pathe N, Fazal S, Lister J, Rossetti JM: Azacitidine in the management of
patients with myelodysplastic syndromes. Ther Adv Hematol 2012, 3: 355-373.
220. Derissen EJ, Beijnen JH, Schellens JH: Concise drug review: azacitidine and
decitabine. Oncologist 2013, 18: 619-624.
221. Hollenbach PW, Nguyen AN, Brady H, Williams M, Ning Y, Richard N et al.: A
comparison of azacitidine and decitabine activities in acute myeloid leukemia cell
lines. PLoS One 2010, 5: e9001.
222. Soriano AO, Yang H, Faderl S, Estrov Z, Giles F, Ravandi F et al.: Safety and clinical
activity of the combination of 5-azacytidine, valproic acid, and all-trans retinoic
acid in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome. Blood 2007, 110:
2302-2308.
223. Voso MT, Santini V, Finelli C, Musto P, Pogliani E, Angelucci E et al.: Valproic acid at
therapeutic plasma levels may increase 5-azacytidine efficacy in higher risk
myelodysplastic syndromes. Clin Cancer Res 2009, 15: 5002-5007.
224. Sekeres MA, List AF, Cuthbertson D, Paquette R, Ganetzky R, Latham D et al.: Phase I
combination trial of lenalidomide and azacitidine in patients with higher-risk
myelodysplastic syndromes. J Clin Oncol 2010, 28: 2253-2258.
225. Mund C, Brueckner B, Lyko F: Reactivation of epigenetically silenced genes by DNA
methyltransferase inhibitors: basic concepts and clinical applications. Epigenetics
2006, 1: 7-13.
226. Villar-Garea A, Fraga MF, Espada J, Esteller M: Procaine is a DNA-demethylating
agent with growth-inhibitory effects in human cancer cells. Cancer Res 2003, 63:
4984-4989.
227. Lee BH, Yegnasubramanian S, Lin X, Nelson WG: Procainamide is a specific
inhibitor of DNA methyltransferase 1. J Biol Chem 2005, 280: 40749-40756.
228. Balch C, Yan P, Craft T, Young S, Skalnik DG, Huang TH et al.: Antimitogenic and
chemosensitizing effects of the methylation inhibitor zebularine in ovarian
cancer. Mol Cancer Ther 2005, 4: 1505-1514.
229. Hellebrekers DM, Jair KW, Vire E, Eguchi S, Hoebers NT, Fraga MF et al.: Angiostatic
activity of DNA methyltransferase inhibitors. Mol Cancer Ther 2006, 5: 467-475.
230. Kratzke RA, Wang X, Wong L, Kratzke MG, Green MR, Vokes EE et al.: Response to
the methylation inhibitor dihydro-5-azacytidine in mesothelioma is not associated
with methylation of p16INK4a: results of cancer and leukemia group B 159904. J
Thorac Oncol 2008, 3: 417-421.
231. Dhanak D, Jackson P: Development and classes of epigenetic drugs for cancer.
Biochem Biophys Res Commun 2014.
232. Minami J, Suzuki R, Mazitschek R, Gorgun G, Ghosh B, Cirstea D et al.: Histone
deacetylase 3 as a novel therapeutic target in multiple myeloma. Leukemia 2014,
28: 680-689.
233. Jurkin J, Zupkovitz G, Lagger S, Grausenburger R, Hagelkruys A, Kenner L et al.:
Distinct and redundant functions of histone deacetylases HDAC1 and HDAC2 in
proliferation and tumorigenesis. Cell Cycle 2011, 10: 406-412.
234. Peart MJ, Smyth GK, van Laar RK, Bowtell DD, Richon VM, Marks PA et al.:
Identification and functional significance of genes regulated by structurally
different histone deacetylase inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102: 36973702.
299
RÉFÉRENCES
235. Choudhary C, Kumar C, Gnad F, Nielsen ML, Rehman M, Walther TC et al.: Lysine
acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions.
Science 2009, 325: 834-840.
236. Sandor V, Senderowicz A, Mertins S, Sackett D, Sausville E, Blagosklonny MV et al.:
P21-dependent g(1)arrest with downregulation of cyclin D1 and upregulation of
cyclin E by the histone deacetylase inhibitor FR901228. Br J Cancer 2000, 83:
817-825.
237. Wharton W, Savell J, Cress WD, Seto E, Pledger WJ: Inhibition of mitogenesis in
Balb/c-3T3 cells by Trichostatin A. Multiple alterations in the induction and
activation of cyclin-cyclin-dependent kinase complexes. J Biol Chem 2000, 275:
33981-33987.
238. Kelly WK, Richon VM, O'Connor O, Curley T, MacGregor-Curtelli B, Tong W et al.:
Phase I clinical trial of histone deacetylase inhibitor: suberoylanilide hydroxamic
acid administered intravenously. Clin Cancer Res 2003, 9: 3578-3588.
239. Dokmanovic M, Marks PA: Prospects: histone deacetylase inhibitors. J Cell Biochem
2005, 96: 293-304.
240. Miller TA, Witter DJ, Belvedere S: Histone deacetylase inhibitors. J Med Chem 2003,
46: 5097-5116.
241. Minucci S, Pelicci PG: Histone deacetylase inhibitors and the promise of epigenetic
(and more) treatments for cancer. Nat Rev Cancer 2006, 6: 38-51.
242. Schemies J, Sippl W, Jung M: Histone deacetylase inhibitors that target tubulin.
Cancer Lett 2009, 280: 222-232.
243. North BJ, Verdin E: Sirtuins: Sir2-related NAD-dependent protein deacetylases.
Genome Biol 2004, 5: 224.
244. Biel M, Kretsovali A, Karatzali E, Papamatheakis J, Giannis A: Design, synthesis, and
biological evaluation of a small-molecule inhibitor of the histone
acetyltransferase Gcn5. Angew Chem Int Ed Engl 2004, 43: 3974-3976.
245. Fatkins DG, Zheng W: Substituting N(epsilon)-thioacetyl-lysine for N(epsilon)acetyl-lysine in peptide substrates as a general approach to inhibiting human
NAD(+)-dependent protein deacetylases. Int J Mol Sci 2008, 9: 1-11.
246. Slingerland M, Guchelaar HJ, Gelderblom H: Histone deacetylase inhibitors: an
overview of the clinical studies in solid tumors. Anticancer Drugs 2014, 25: 140149.
247. Patil V, Sodji QH, Kornacki JR, Mrksich M, Oyelere AK: 3-Hydroxypyridin-2-thione
as novel zinc binding group for selective histone deacetylase inhibition. J Med
Chem 2013, 56: 3492-3506.
248. Lobera M, Madauss KP, Pohlhaus DT, Wright QG, Trocha M, Schmidt DR et al.:
Selective class IIa histone deacetylase inhibition via a nonchelating zinc-binding
group. Nat Chem Biol 2013, 9: 319-325.
249. Zhang T, Rong N, Chen J, Zou C, Jing H, Zhu X et al.: SIRT1 expression is associated
with the chemotherapy response and prognosis of patients with advanced
NSCLC. PLoS One 2013, 8: e79162.
250. Zhao G, Cui J, Zhang JG, Qin Q, Chen Q, Yin T et al.: SIRT1 RNAi knockdown
induces apoptosis and senescence, inhibits invasion and enhances
chemosensitivity in pancreatic cancer cells. Gene Ther 2011, 18: 920-928.
251. Yuan H, Marmorstein R: Histone acetyltransferases: Rising ancient counterparts to
protein kinases. Biopolymers 2013, 99: 98-111.
252. Balasubramanyam K, Altaf M, Varier RA, Swaminathan V, Ravindran A, Sadhale PP et
al.: Polyisoprenylated benzophenone, garcinol, a natural histone acetyltransferase
300
RÉFÉRENCES
inhibitor, represses chromatin transcription and alters global gene expression. J
Biol Chem 2004, 279: 33716-33726.
253. Lund K, Adams PD, Copland M: EZH2 in normal and malignant hematopoiesis.
Leukemia 2014, 28: 44-49.
254. Mack SC, Witt H, Piro RM, Gu L, Zuyderduyn S, Stutz AM et al.: Epigenomic
alterations define lethal CIMP-positive ependymomas of infancy. Nature 2014,
506: 445-450.
255. Alimova I, Venkataraman S, Harris P, Marquez VE, Northcott PA, Dubuc A et al.:
Targeting the enhancer of zeste homologue 2 in medulloblastoma. Int J Cancer
2012, 131: 1800-1809.
256. Hojfeldt JW, Agger K, Helin K: Histone lysine demethylases as targets for anticancer
therapy. Nat Rev Drug Discov 2013, 12: 917-930.
257. Wellmann S, Bettkober M, Zelmer A, Seeger K, Faigle M, Eltzschig HK et al.: Hypoxia
upregulates the histone demethylase JMJD1A via HIF-1. Biochem Biophys Res
Commun 2008, 372: 892-897.
258. Trewick SC, McLaughlin PJ, Allshire RC: Methylation: lost in hydroxylation? EMBO
Rep 2005, 6: 315-320.
259. Metzger E, Wissmann M, Yin N, Muller JM, Schneider R, Peters AH et al.: LSD1
demethylates repressive histone marks to promote androgen-receptor-dependent
transcription. Nature 2005, 437: 436-439.
260. Lee MG, Wynder C, Cooch N, Shiekhattar R: An essential role for CoREST in
nucleosomal histone 3 lysine 4 demethylation. Nature 2005, 437: 432-435.
261. Huang Y, Stewart TM, Wu Y, Baylin SB, Marton LJ, Perkins B et al.: Novel oligoamine
analogues inhibit lysine-specific demethylase 1 and induce reexpression of
epigenetically silenced genes. Clin Cancer Res 2009, 15: 7217-7228.
262. Marchion DC, Bicaku E, Daud AI, Richon V, Sullivan DM, Munster PN: Sequencespecific potentiation of topoisomerase II inhibitors by the histone deacetylase
inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid. J Cell Biochem 2004, 92: 223-237.
263. Garcia-Manero G, Kantarjian HM, Sanchez-Gonzalez B, Yang H, Rosner G, Verstovsek
S et al.: Phase 1/2 study of the combination of 5-aza-2'-deoxycytidine with
valproic acid in patients with leukemia. Blood 2006, 108: 3271-3279.
264. Undevia SD, Kindler HL, Janisch L, Olson SC, Schilsky RL, Vogelzang NJ et al.: A
phase I study of the oral combination of CI-994, a putative histone deacetylase
inhibitor, and capecitabine. Ann Oncol 2004, 15: 1705-1711.
265. Yu C, Rahmani M, Conrad D, Subler M, Dent P, Grant S: The proteasome inhibitor
bortezomib interacts synergistically with histone deacetylase inhibitors to induce
apoptosis in Bcr/Abl+ cells sensitive and resistant to STI571. Blood 2003, 102:
3765-3774.
266. Fiskus W, Pranpat M, Bali P, Balasis M, Kumaraswamy S, Boyapalle S et al.:
Combined effects of novel tyrosine kinase inhibitor AMN107 and histone
deacetylase inhibitor LBH589 against Bcr-Abl-expressing human leukemia cells.
Blood 2006, 108: 645-652.
267. Borges S, Doppler HR, Storz P: A combination treatment with DNA
methyltransferase inhibitors and suramin decreases invasiveness of breast cancer
cells. Breast Cancer Res Treat 2014, 144: 79-91.
268. Chik F, Machnes Z, Szyf M: Synergistic anti-breast cancer effect of a combined
treatment with the methyl donor S-adenosyl methionine and the DNA
methylation inhibitor 5-aza-2'-deoxycytidine. Carcinogenesis 2014, 35: 138-144.
301
RÉFÉRENCES
269. Goto Y, Shinjo K, Kondo Y, Shen L, Toyota M, Suzuki H et al.: Epigenetic profiles
distinguish malignant pleural mesothelioma from lung adenocarcinoma. Cancer
Res 2009, 69: 9073-9082.
270. Fujii M, Fujimoto N, Hiraki A, Gemba K, Aoe K, Umemura S et al.: Aberrant DNA
methylation profile in pleural fluid for differential diagnosis of malignant pleural
mesothelioma. Cancer Sci 2012, 103: 510-514.
271. Destro A, Ceresoli GL, Baryshnikova E, Garassino I, Zucali PA, De Vincenzo F et al.:
Gene methylation in pleural mesothelioma: correlations with clinico-pathological
features and patient's follow-up. Lung Cancer 2008, 59: 369-376.
272. Vandermeers F, Neelature Sriramareddy S, Costa C, Hubaux R, Cosse JP, Willems L:
The role of epigenetics in malignant pleural mesothelioma. Lung Cancer 2013, 81:
311-318.
273. Johnstone RW: Histone-deacetylase inhibitors: novel drugs for the treatment of
cancer. Nat Rev Drug Discov 2002, 1: 287-299.
274. Lindemann RK, Newbold A, Whitecross KF, Cluse LA, Frew AJ, Ellis L et al.: Analysis
of the apoptotic and therapeutic activities of histone deacetylase inhibitors by
using a mouse model of B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104:
8071-8076.
275. Crisanti MC, Wallace AF, Kapoor V, Vandermeers F, Dowling ML, Pereira LP et al.:
The HDAC inhibitor panobinostat (LBH589) inhibits mesothelioma and lung
cancer cells in vitro and in vivo with particular efficacy for small cell lung cancer.
Mol Cancer Ther 2009, 8: 2221-2231.
276. Barbone D, Cheung P, Battula S, Busacca S, Gray SG, Longley DB et al.: Vorinostat
eliminates multicellular resistance of mesothelioma 3D spheroids via restoration
of Noxa expression. PLoS One 2012, 7: e52753.
277. Hurwitz JL, Stasik I, Kerr EM, Holohan C, Redmond KM, McLaughlin KM et al.:
Vorinostat/SAHA-induced apoptosis in malignant mesothelioma is FLIP/caspase
8-dependent and HR23B-independent. Eur J Cancer 2012, 48: 1096-1107.
278. Cao XX, Mohuiddin I, Ece F, McConkey DJ, Smythe WR: Histone deacetylase
inhibitor downregulation of bcl-xl gene expression leads to apoptotic cell death in
mesothelioma. Am J Respir Cell Mol Biol 2001, 25: 562-568.
279. Vandermeers F, Hubert P, Delvenne P, Mascaux C, Grigoriu B, Burny A et al.:
Valproate, in combination with pemetrexed and cisplatin, provides additional
efficacy to the treatment of malignant mesothelioma. Clin Cancer Res 2009, 15:
2818-2828.
280. Amatori S, Papalini F, Lazzarini R, Donati B, Bagaloni I, Rippo MR et al.: Decitabine,
differently from DNMT1 silencing, exerts its antiproliferative activity through
p21 upregulation in malignant pleural mesothelioma (MPM) cells. Lung Cancer
2009, 66: 184-190.
281. Amatori S, Bagaloni I, Viti D, Fanelli M: Premature senescence induced by DNA
demethylating agent (Decitabine) as therapeutic option for malignant pleural
mesothelioma. Lung Cancer 2011, 71: 113-115.
282. Ranzato E, Martinotti S, Magnelli V, Murer B, Biffo S, Mutti L et al.: Epigallocatechin3-gallate induces mesothelioma cell death via H2 O2 -dependent T-type Ca2+
channel opening. J Cell Mol Med 2012, 16: 2667-2678.
283. Wang Y, Rishi AK, Wu W, Polin L, Sharma S, Levi E et al.: Curcumin suppresses
growth of mesothelioma cells in vitro and in vivo, in part, by stimulating
apoptosis. Mol Cell Biochem 2011, 357: 83-94.
302
RÉFÉRENCES
284. Sigalotti L, Coral S, Altomonte M, Natali L, Gaudino G, Cacciotti P et al.: Cancer testis
antigens expression in mesothelioma: role of DNA methylation and
bioimmunotherapeutic implications. Br J Cancer 2002, 86: 979-982.
285. Weiser TS, Guo ZS, Ohnmacht GA, Parkhurst ML, Tong-On P, Marincola FM et al.:
Sequential 5-Aza-2 deoxycytidine-depsipeptide FR901228 treatment induces
apoptosis preferentially in cancer cells and facilitates their recognition by
cytolytic T lymphocytes specific for NY-ESO-1. J Immunother 2001, 24: 151-161.
286. Leclercq S, Gueugnon F, Boutin B, Guillot F, Blanquart C, Rogel A et al.: A 5-aza-2'deoxycytidine/valproate combination induces cytotoxic T-cell response against
mesothelioma. Eur Respir J 2011, 38: 1105-1116.
287. Ramalingam SS, Belani CP, Ruel C, Frankel P, Gitlitz B, Koczywas M et al.: Phase II
study of belinostat (PXD101), a histone deacetylase inhibitor, for second line
therapy of advanced malignant pleural mesothelioma. J Thorac Oncol 2009, 4: 97101.
288. Ryan QC, Headlee D, Acharya M, Sparreboom A, Trepel JB, Ye J et al.: Phase I and
pharmacokinetic study of MS-275, a histone deacetylase inhibitor, in patients
with advanced and refractory solid tumors or lymphoma. J Clin Oncol 2005, 23:
3912-3922.
289. Krug LM, Curley T, Schwartz L, Richardson S, Marks P, Chiao J et al.: Potential role of
histone deacetylase inhibitors in mesothelioma: clinical experience with
suberoylanilide hydroxamic acid. Clin Lung Cancer 2006, 7: 257-261.
290. Scherpereel A, Berghmans T, Lafitte JJ, Colinet B, Richez M, Bonduelle Y et al.:
Valproate-doxorubicin: promising therapy for progressing mesothelioma. A
phase II study. Eur Respir J 2011, 37: 129-135.
291. Nobili S, Lippi D, Witort E, Donnini M, Bausi L, Mini E et al.: Natural compounds for
cancer treatment and prevention. Pharmacol Res 2009, 59: 365-378.
292. Ariga T, Seki T: Antithrombotic and anticancer effects of garlic-derived sulfur
compounds: a review. Biofactors 2006, 26: 93-103.
293. Lansky EP, Newman RA: Punica granatum (pomegranate) and its potential for
prevention and treatment of inflammation and cancer. J Ethnopharmacol 2007,
109: 177-206.
294. Cortes JE, Pazdur R: Docetaxel. J Clin Oncol 1995, 13: 2643-2655.
295. Song JI, Dumais MR: From yew to us: the curious development of taxol. JAMA 1991,
266: 1281.
296. Adams JD, Flora KP, Goldspiel BR, Wilson JW, Arbuck SG, Finley R: Taxol: a history
of pharmaceutical development and current pharmaceutical concerns. J Natl
Cancer Inst Monogr 1993: 141-147.
297. Cragg GM, Newman DJ, Snader KM: Natural products in drug discovery and
development. J Nat Prod 1997, 60: 52-60.
298. Cragg GM, Newman DJ: Plants as a source of anti-cancer agents. J Ethnopharmacol
2005, 100: 72-79.
299. Mans DR, da Rocha AB, Schwartsmann G: Anti-cancer drug discovery and
development in Brazil: targeted plant collection as a rational strategy to acquire
candidate anti-cancer compounds. Oncologist 2000, 5: 185-198.
300. da Rocha AB, Lopes RM, Schwartsmann G: Natural products in anticancer therapy.
Curr Opin Pharmacol 2001, 1: 364-369.
301. Luduena RF: Multiple forms of tubulin: different gene products and covalent
modifications. Int Rev Cytol 1998, 178: 207-275.
302. Jordan MA, Wilson L: Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer
2004, 4: 253-265.
303
RÉFÉRENCES
303. Noble RL: The discovery of the vinca alkaloids--chemotherapeutic agents against
cancer. Biochem Cell Biol 1990, 68: 1344-1351.
304. Devita VT, Jr., Serpick AA, Carbone PP: Combination chemotherapy in the
treatment of advanced Hodgkin's disease. Ann Intern Med 1970, 73: 881-895.
305. Vincristine liposomal--INEX: lipid-encapsulated vincristine, onco TCS,
transmembrane carrier system--vincristine, vincacine, vincristine sulfate
liposomes for injection, VSLI. Drugs R D 2004, 5: 119-123.
306. Fahy J: Modifications in the "upper" velbenamine part of the Vinca alkaloids have
major implications for tubulin interacting activities. Curr Pharm Des 2001, 7:
1181-1197.
307. Yun-San Yip A, Yuen-Yuen Ong E, Chow LW: Vinflunine: clinical perspectives of an
emerging anticancer agent. Expert Opin Investig Drugs 2008, 17: 583-591.
308. Ngan VK, Bellman K, Hill BT, Wilson L, Jordan MA: Mechanism of mitotic block
and inhibition of cell proliferation by the semisynthetic Vinca alkaloids
vinorelbine and its newer derivative vinflunine. Mol Pharmacol 2001, 60: 225-232.
309. Winer EP, Berry DA, Woolf S, Duggan D, Kornblith A, Harris LN et al.: Failure of
higher-dose paclitaxel to improve outcome in patients with metastatic breast
cancer: cancer and leukemia group B trial 9342. J Clin Oncol 2004, 22: 2061-2068.
310. ten Tije AJ, Verweij J, Loos WJ, Sparreboom A: Pharmacological effects of
formulation vehicles : implications for cancer chemotherapy. Clin Pharmacokinet
2003, 42: 665-685.
311. Hennenfent KL, Govindan R: Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a
new bottle? Ann Oncol 2006, 17: 735-749.
312. Rowinsky EK, Calvo E: Novel agents that target tublin and related elements. Semin
Oncol 2006, 33: 421-435.
313. Dorr RT: Pharmacology of the taxanes. Pharmacotherapy 1997, 17: 96S-104S.
314. Hennequin C, Giocanti N, Favaudon V: S-phase specificity of cell killing by docetaxel
(Taxotere) in synchronised HeLa cells. Br J Cancer 1995, 71: 1194-1198.
315. Haldar S, Basu A, Croce CM: Bcl2 is the guardian of microtubule integrity. Cancer
Res 1997, 57: 229-233.
316. Hartmann JT, Lipp HP: Camptothecin and podophyllotoxin derivatives: inhibitors of
topoisomerase I and II - mechanisms of action, pharmacokinetics and toxicity
profile. Drug Saf 2006, 29: 209-230.
317. Cortes-Funes H, Coronado C: Role of anthracyclines in the era of targeted therapy.
Cardiovasc Toxicol 2007, 7: 56-60.
318. Williams SD, Birch R, Einhorn LH, Irwin L, Greco FA, Loehrer PJ: Treatment of
disseminated germ-cell tumors with cisplatin, bleomycin, and either vinblastine
or etoposide. N Engl J Med 1987, 316: 1435-1440.
319. Liu LF: DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annu Rev Biochem 1989,
58: 351-375.
320. Malonne H, Atassi G: DNA topoisomerase targeting drugs: mechanisms of action
and perspectives. Anticancer Drugs 1997, 8: 811-822.
321. Hsiang YH, Hertzberg R, Hecht S, Liu LF: Camptothecin induces protein-linked DNA
breaks via mammalian DNA topoisomerase I. J Biol Chem 1985, 260: 1487314878.
322. Garcia-Carbonero R, Supko JG: Current perspectives on the clinical experience,
pharmacology, and continued development of the camptothecins. Clin Cancer Res
2002, 8: 641-661.
323. Herzog TJ: Update on the role of topotecan in the treatment of recurrent ovarian
cancer. Oncologist 2002, 7 Suppl 5: 3-10.
304
RÉFÉRENCES
324. Douillard JY, Cunningham D, Roth AD, Navarro M, James RD, Karasek P et al.:
Irinotecan combined with fluorouracil compared with fluorouracil alone as firstline treatment for metastatic colorectal cancer: a multicentre randomised trial.
Lancet 2000, 355: 1041-1047.
325. Schafer FQ, Buettner GR: Redox environment of the cell as viewed through the redox
state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Biol Med 2001, 30:
1191-1212.
326. Jackson AL, Loeb LA: The contribution of endogenous sources of DNA damage to
the multiple mutations in cancer. Mutat Res 2001, 477: 7-21.
327. Reddy VG, Khanna N, Singh N: Vitamin C augments chemotherapeutic response of
cervical carcinoma HeLa cells by stabilizing P53. Biochem Biophys Res Commun
2001, 282: 409-415.
328. Clement MV, Ramalingam J, Long LH, Halliwell B: The in vitro cytotoxicity of
ascorbate depends on the culture medium used to perform the assay and involves
hydrogen peroxide. Antioxid Redox Signal 2001, 3: 157-163.
329. Halliwell B, Clement MV, Ramalingam J, Long LH: Hydrogen peroxide. Ubiquitous
in cell culture and in vivo? IUBMB Life 2000, 50: 251-257.
330. Palozza P, Calviello G, Serini S, Maggiano N, Lanza P, Ranelletti FO et al.: betacarotene at high concentrations induces apoptosis by enhancing oxy-radical
production in human adenocarcinoma cells. Free Radic Biol Med 2001, 30: 10001007.
331. Nohl H, Gille L, Staniek K: Intracellular generation of reactive oxygen species by
mitochondria. Biochem Pharmacol 2005, 69: 719-723.
332. Szocs K: Endothelial dysfunction and reactive oxygen species production in
ischemia/reperfusion and nitrate tolerance. Gen Physiol Biophys 2004, 23: 265295.
333. Meister A, Anderson ME: Glutathione. Annu Rev Biochem 1983, 52: 711-760.
334. Kalyanaraman B, Karoui H, Singh RJ, Felix CC: Detection of thiyl radical adducts
formed during hydroxyl radical- and peroxynitrite-mediated oxidation of thiols-a high resolution ESR spin-trapping study at Q-band (35 GHz). Anal Biochem
1996, 241: 75-81.
335. Pompella A, Visvikis A, Paolicchi A, De Tata V, Casini AF: The changing faces of
glutathione, a cellular protagonist. Biochem Pharmacol 2003, 66: 1499-1503.
336. Hayes JD, Flanagan JU, Jowsey IR: Glutathione transferases. Annu Rev Pharmacol
Toxicol 2005, 45: 51-88.
337. Abdulla M, Gruber P: Role of diet modification in cancer prevention. Biofactors 2000,
12: 45-51.
338. Kelland LR: Flavopiridol, the first cyclin-dependent kinase inhibitor to enter the
clinic: current status. Expert Opin Investig Drugs 2000, 9: 2903-2911.
339. Newcomb EW: Flavopiridol: pleiotropic biological effects enhance its anti-cancer
activity. Anticancer Drugs 2004, 15: 411-419.
340. Kinghorn AD: The discovery of drugs from higher plants. Biotechnology 1994, 26:
81-108.
341. Asea A, Ara G, Teicher BA, Stevenson MA, Calderwood SK: Effects of the flavonoid
drug quercetin on the response of human prostate tumours to hyperthermia in
vitro and in vivo. Int J Hyperthermia 2001, 17: 347-356.
342. Theodorescu D, Laderoute KR, Calaoagan JM, Guilding KM: Inhibition of human
bladder cancer cell motility by genistein is dependent on epidermal growth factor
receptor but not p21ras gene expression. Int J Cancer 1998, 78: 775-782.
305
RÉFÉRENCES
343. Drewa G, Wozqak A, Palgan K, Schachtschabel DO, Grzanka A, Sujkowska R:
Influence of quercetin on B16 melanotic melanoma growth in C57BL/6 mice and
on activity of some acid hydrolases in melanoma tissue. Neoplasma 2001, 48: 1218.
344. Allred CD, Allred KF, Ju YH, Virant SM, Helferich WG: Soy diets containing varying
amounts of genistein stimulate growth of estrogen-dependent (MCF-7) tumors in
a dose-dependent manner. Cancer Res 2001, 61: 5045-5050.
345. Cirla A, Mann J: Combretastatins: from natural products to drug discovery. Nat
Prod Rep 2003, 20: 558-564.
346. Shankar S, Singh G, Srivastava RK: Chemoprevention by resveratrol: molecular
mechanisms and therapeutic potential. Front Biosci 2007, 12: 4839-4854.
347. Signorelli P, Ghidoni R: Resveratrol as an anticancer nutrient: molecular basis, open
questions and promises. J Nutr Biochem 2005, 16: 449-466.
348. Renaud S, de Lorgeril M: Wine, alcohol, platelets, and the French paradox for
coronary heart disease. Lancet 1992, 339: 1523-1526.
349. Frankel EN, Waterhouse AL, Kinsella JE: Inhibition of human LDL oxidation by
resveratrol. Lancet 1993, 341: 1103-1104.
350. Jang M, Cai L, Udeani GO, Slowing KV, Thomas CF, Beecher CW et al.: Cancer
chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes.
Science 1997, 275: 218-220.
351. Kimura Y, Okuda H: Effects of naturally occurring stilbene glucosides from
medicinal plants and wine, on tumour growth and lung metastasis in Lewis lung
carcinoma-bearing mice. J Pharm Pharmacol 2000, 52: 1287-1295.
352. Brakenhielm E, Cao R, Cao Y: Suppression of angiogenesis, tumor growth, and
wound healing by resveratrol, a natural compound in red wine and grapes.
FASEB J 2001, 15: 1798-1800.
353. Lam TK, Gallicchio L, Lindsley K, Shiels M, Hammond E, Tao XG et al.: Cruciferous
vegetable consumption and lung cancer risk: a systematic review. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 2009, 18: 184-195.
354. Trachootham D, Zhang H, Zhang W, Feng L, Du M, Zhou Y et al.: Effective
elimination of fludarabine-resistant CLL cells by PEITC through a redoxmediated mechanism. Blood 2008, 112: 1912-1922.
355. Verhoeven DT, Goldbohm RA, van Poppel G, Verhagen H, van den Brandt PA:
Epidemiological studies on brassica vegetables and cancer risk. Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev 1996, 5: 733-748.
356. Verhoeven DT, Verhagen H, Goldbohm RA, van den Brandt PA, van Poppel G: A
review of mechanisms underlying anticarcinogenicity by brassica vegetables.
Chem Biol Interact 1997, 103: 79-129.
357. Fenwick GR, Heaney RK, Mullin WJ: Glucosinolates and their breakdown products
in food and food plants. Crit Rev Food Sci Nutr 1983, 18: 123-201.
358. Rask L, Andreasson E, Ekbom B, Eriksson S, Pontoppidan B, Meijer J: Myrosinase:
gene family evolution and herbivore defense in Brassicaceae. Plant Mol Biol 2000,
42: 93-113.
359. Wu X, Zhou QH, Xu K: Are isothiocyanates potential anti-cancer drugs? Acta
Pharmacol Sin 2009, 30: 501-512.
360. Zhang Y, Talalay P: Anticarcinogenic activities of organic isothiocyanates: chemistry
and mechanisms. Cancer Res 1994, 54: 1976s-1981s.
361. Wattenberg LW: Inhibition of carcinogenic effects of polycyclic hydrocarbons by
benzyl isothiocyanate and related compounds. J Natl Cancer Inst 1977, 58: 395398.
306
RÉFÉRENCES
362. Wattenberg LW: Inhibitory effects of benzyl isothiocyanate administered shortly
before diethylnitrosamine or benzo[a]pyrene on pulmonary and forestomach
neoplasia in A/J mice. Carcinogenesis 1987, 8: 1971-1973.
363. Morse MA, Amin SG, Hecht SS, Chung FL: Effects of aromatic isothiocyanates on
tumorigenicity, O6-methylguanine formation, and metabolism of the tobaccospecific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone in A/J
mouse lung. Cancer Res 1989, 49: 2894-2897.
364. Morse MA, Eklind KI, Amin SG, Hecht SS, Chung FL: Effects of alkyl chain length on
the inhibition of NNK-induced lung neoplasia in A/J mice by arylalkyl
isothiocyanates. Carcinogenesis 1989, 10: 1757-1759.
365. Yu R, Mandlekar S, Harvey KJ, Ucker DS, Kong AN: Chemopreventive
isothiocyanates induce apoptosis and caspase-3-like protease activity. Cancer Res
1998, 58: 402-408.
366. Xu K, Thornalley PJ: Signal transduction activated by the cancer chemopreventive
isothiocyanates: cleavage of BID protein, tyrosine phosphorylation and activation
of JNK. Br J Cancer 2001, 84: 670-673.
367. Fimognari C, Lenzi M, Hrelia P: Chemoprevention of cancer by isothiocyanates and
anthocyanins: mechanisms of action and structure-activity relationship. Curr
Med Chem 2008, 15: 440-447.
368. Trachootham D, Zhou Y, Zhang H, Demizu Y, Chen Z, Pelicano H et al.: Selective
killing of oncogenically transformed cells through a ROS-mediated mechanism
by beta-phenylethyl isothiocyanate. Cancer Cell 2006, 10: 241-252.
369. Hasegawa T, Nishino H, Iwashima A: Isothiocyanates inhibit cell cycle progression of
HeLa cells at G2/M phase. Anticancer Drugs 1993, 4: 273-279.
370. Matsui TA, Murata H, Sakabe T, Sowa Y, Horie N, Nakanishi R et al.: Sulforaphane
induces cell cycle arrest and apoptosis in murine osteosarcoma cells in vitro and
inhibits tumor growth in vivo. Oncol Rep 2007, 18: 1263-1268.
371. Xiao D, Singh SV: Phenethyl isothiocyanate inhibits angiogenesis in vitro and ex
vivo. Cancer Res 2007, 67: 2239-2246.
372. Dashwood RH, Ho E: Dietary agents as histone deacetylase inhibitors: sulforaphane
and structurally related isothiocyanates. Nutr Rev 2008, 66 Suppl 1: S36-38.
373. Myzak MC, Karplus PA, Chung FL, Dashwood RH: A novel mechanism of
chemoprotection by sulforaphane: inhibition of histone deacetylase. Cancer Res
2004, 64: 5767-5774.
374. Pledgie-Tracy A, Sobolewski MD, Davidson NE: Sulforaphane induces cell typespecific apoptosis in human breast cancer cell lines. Mol Cancer Ther 2007, 6:
1013-1021.
375. Ma X, Fang Y, Beklemisheva A, Dai W, Feng J, Ahmed T et al.: Phenylhexyl
isothiocyanate inhibits histone deacetylases and remodels chromatins to induce
growth arrest in human leukemia cells. Int J Oncol 2006, 28: 1287-1293.
376. Tewey KM, Chen GL, Nelson EM, Liu LF: Intercalative antitumor drugs interfere
with the breakage-reunion reaction of mammalian DNA topoisomerase II. J Biol
Chem 1984, 259: 9182-9187.
377. Hartford CM, Ratain MJ: Rapamycin: something old, something new, sometimes
borrowed and now renewed. Clin Pharmacol Ther 2007, 82: 381-388.
378. Kidd JG: Regression of transplanted lymphomas induced in vivo by means of
normal guinea pig serum. II. Studies on the nature of the active serum
constituent: histological mechanism of the regression: tests for effects of guinea
pig serum on lymphoma cells in vitro: discussion. J Exp Med 1953, 98: 583-606.
307
RÉFÉRENCES
379. Kidd JG: Regression of transplanted lymphomas induced in vivo by means of
normal guinea pig serum. I. Course of transplanted cancers of various kinds in
mice and rats given guinea pig serum, horse serum, or rabbit serum. J Exp Med
1953, 98: 565-582.
380. Bishop JF, Matthews JP, Young GA, Szer J, Gillett A, Joshua D et al.: A randomized
study of high-dose cytarabine in induction in acute myeloid leukemia. Blood 1996,
87: 1710-1717.
381. Ferreri AJ, Reni M, Foppoli M, Martelli M, Pangalis GA, Frezzato M et al.: High-dose
cytarabine plus high-dose methotrexate versus high-dose methotrexate alone in
patients with primary CNS lymphoma: a randomised phase 2 trial. Lancet 2009,
374: 1512-1520.
382. Jacobs AD: Gemcitabine-based therapy in pancreas cancer: gemcitabine-docetaxel
and other novel combinations. Cancer 2002, 95: 923-927.
383. Lund B, Neijt JP: Gemcitabine in cisplatin-resistant ovarian cancer. Semin Oncol
1996, 23: 72-76.
384. Toschi L, Finocchiaro G, Bartolini S, Gioia V, Cappuzzo F: Role of gemcitabine in
cancer therapy. Future Oncol 2005, 1: 7-17.
385. Poncet J: The dolastatins, a family of promising antineoplastic agents. Curr Pharm
Des 1999, 5: 139-162.
386. Bai R, Pettit GR, Hamel E: Dolastatin 10, a powerful cytostatic peptide derived from
a marine animal. Inhibition of tubulin polymerization mediated through the
vinca alkaloid binding domain. Biochem Pharmacol 1990, 39: 1941-1949.
387. Bedikian AY, Plager C, Stewart JR, O'Brian CA, Herdman SK, Ross M et al.: Phase II
evaluation of bryostatin-1 in metastatic melanoma. Melanoma Res 2001, 11: 183188.
388. Blackhall FH, Ranson M, Radford JA, Hancock BW, Soukop M, McGown AT et al.: A
phase II trial of bryostatin 1 in patients with non-Hodgkin's lymphoma. Br J
Cancer 2001, 84: 465-469.
389. Clamp AR, Blackhall FH, Vasey P, Soukop M, Coleman R, Halbert G et al.: A phase II
trial of bryostatin-1 administered by weekly 24-hour infusion in recurrent
epithelial ovarian carcinoma. Br J Cancer 2003, 89: 1152-1154.
390. Zonder JA, Shields AF, Zalupski M, Chaplen R, Heilbrun LK, Arlauskas P et al.: A
phase II trial of bryostatin 1 in the treatment of metastatic colorectal cancer. Clin
Cancer Res 2001, 7: 38-42.
391. Pavlick AC, Wu J, Roberts J, Rosenthal MA, Hamilton A, Wadler S et al.: Phase I study
of bryostatin 1, a protein kinase C modulator, preceding cisplatin in patients with
refractory non-hematologic tumors. Cancer Chemother Pharmacol 2009, 64: 803810.
392. Rinehart KL: Antitumor compounds from tunicates. Med Res Rev 2000, 20: 1-27.
393. Chun HG, Davies B, Hoth D, Suffness M, Plowman J, Flora K et al.: Didemnin B. The
first marine compound entering clinical trials as an antineoplastic agent. Invest
New Drugs 1986, 4: 279-284.
394. Bai X, Deng H: [Research progress on relationship between transcription factor Sp1
and tumor]. Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2010, 39: 215-220.
395. George SE, Ramalakshmi K, Mohan Rao LJ: A perception on health benefits of coffee.
Crit Rev Food Sci Nutr 2008, 48: 464-486.
396. Lee KA, Chae JI, Shim JH: Natural diterpenes from coffee, cafestol and kahweol
induce apoptosis through regulation of specificity protein 1 expression in human
malignant pleural mesothelioma. J Biomed Sci 2012, 19: 60.
308
RÉFÉRENCES
397. Mikulski SM, Costanzi JJ, Vogelzang NJ, McCachren S, Taub RN, Chun H et al.: Phase
II trial of a single weekly intravenous dose of ranpirnase in patients with
unresectable malignant mesothelioma. J Clin Oncol 2002, 20: 274-281.
398. Garattini S, La Vecchia C: Perspectives in cancer chemotherapy. Eur J Cancer 2001,
37 Suppl 8: S128-147.
399. Utreja P, Jain S, Tiwary AK: Novel drug delivery systems for sustained and targeted
delivery of anticancer drugs: current status and future prospects. Curr Drug
Deliv 2010, 7: 152-161.
400. Batra R, Davies JN, Wheatley D: Extensive arterial and venous thrombo-embolism
with chemotherapy for testicular cancer: a case report. Cases J 2009, 2: 9082.
401. Cukierman E, Khan DR: The benefits and challenges associated with the use of drug
delivery systems in cancer therapy. Biochem Pharmacol 2010, 80: 762-770.
402. Shi J, Votruba AR, Farokhzad OC, Langer R: Nanotechnology in drug delivery and
tissue engineering: from discovery to applications. Nano Lett 2010, 10: 3223-3230.
403. Zhang L, Gu FX, Chan JM, Wang AZ, Langer RS, Farokhzad OC: Nanoparticles in
medicine: therapeutic applications and developments. Clin Pharmacol Ther 2008,
83: 761-769.
404. Lammers T, Hennink WE, Storm G: Tumour-targeted nanomedicines: principles and
practice. Br J Cancer 2008, 99: 392-397.
405. Lammers T, Kiessling F, Hennink WE, Storm G: Drug targeting to tumors: principles,
pitfalls and (pre-) clinical progress. J Control Release 2012, 161: 175-187.
406. Kamaly N, Xiao Z, Valencia PM, Radovic-Moreno AF, Farokhzad OC: Targeted
polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical
translation. Chem Soc Rev 2012, 41: 2971-3010.
407. Bangham AD: Liposomes: the Babraham connection. Chem Phys Lipids 1993, 64:
275-285.
408. Bangham AD: Surrogate cells or Trojan horses. The discovery of liposomes.
Bioessays 1995, 17: 1081-1088.
409. Al-Jamal WT, Kostarelos K: Liposomes: from a clinically established drug delivery
system to a nanoparticle platform for theranostic nanomedicine. Acc Chem Res
2011, 44: 1094-1104.
410. Lasic DD: Novel applications of liposomes. Trends Biotechnol 1998, 16: 307-321.
411. Minisini AM, Andreetta C, Fasola G, Puglisi F: Pegylated liposomal doxorubicin in
elderly patients with metastatic breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther 2008, 8:
331-342.
412. Verma S, Dent S, Chow BJ, Rayson D, Safra T: Metastatic breast cancer: the role of
pegylated liposomal doxorubicin after conventional anthracyclines. Cancer Treat
Rev 2008, 34: 391-406.
413. Janib SM, Moses AS, MacKay JA: Imaging and drug delivery using theranostic
nanoparticles. Adv Drug Deliv Rev 2010, 62: 1052-1063.
414. Xie J, Lee S, Chen X: Nanoparticle-based theranostic agents. Adv Drug Deliv Rev
2010, 62: 1064-1079.
415. Gabizon A, Chisin R, Amselem S, Druckmann S, Cohen R, Goren D et al.:
Pharmacokinetic and imaging studies in patients receiving a formulation of
liposome-associated adriamycin. Br J Cancer 1991, 64: 1125-1132.
416. Wang AZ, Langer R, Farokhzad OC: Nanoparticle delivery of cancer drugs. Annu Rev
Med 2012, 63: 185-198.
417. Immordino ML, Dosio F, Cattel L: Stealth liposomes: review of the basic science,
rationale, and clinical applications, existing and potential. Int J Nanomedicine
2006, 1: 297-315.
309
RÉFÉRENCES
418. Lasic DD, Martin FJ, Gabizon A, Huang SK, Papahadjopoulos D: Sterically stabilized
liposomes: a hypothesis on the molecular origin of the extended circulation times.
Biochim Biophys Acta 1991, 1070: 187-192.
419. Sapra P, Allen TM: Ligand-targeted liposomal anticancer drugs. Prog Lipid Res
2003, 42: 439-462.
420. Svenson S, Tomalia DA: Dendrimers in biomedical applications--reflections on the
field. Adv Drug Deliv Rev 2005, 57: 2106-2129.
421. Menjoge AR, Kannan RM, Tomalia DA: Dendrimer-based drug and imaging
conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discov
Today 2010, 15: 171-185.
422. Medina SH, El-Sayed ME: Dendrimers as carriers for delivery of chemotherapeutic
agents. Chem Rev 2009, 109: 3141-3157.
423. Svenson S, Chauhan AS: Dendrimers for enhanced drug solubilization.
Nanomedicine (Lond) 2008, 3: 679-702.
424. Svenson S: Dendrimers as versatile platform in drug delivery applications. Eur J
Pharm Biopharm 2009, 71: 445-462.
425. Kim SH, Jeong JH, Chun KW, Park TG: Target-specific cellular uptake of PLGA
nanoparticles coated with poly(L-lysine)-poly(ethylene glycol)-folate conjugate.
Langmuir 2005, 21: 8852-8857.
426. Farokhzad OC, Jon S, Khademhosseini A, Tran TN, Lavan DA, Langer R:
Nanoparticle-aptamer bioconjugates: a new approach for targeting prostate
cancer cells. Cancer Res 2004, 64: 7668-7672.
427. Rolland JP, Maynor BW, Euliss LE, Exner AE, Denison GM, DeSimone JM: Direct
fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. J
Am Chem Soc 2005, 127: 10096-10100.
428. Jabir NR, Tabrez S, Ashraf GM, Shakil S, Damanhouri GA, Kamal MA:
Nanotechnology-based approaches in anticancer research. Int J Nanomedicine
2012, 7: 4391-4408.
429. Narang AS, Chang RK, Hussain MA: Pharmaceutical development and regulatory
considerations for nanoparticles and nanoparticulate drug delivery systems. J
Pharm Sci 2013, 102: 3867-3882.
430. Danhier F, Ansorena E, Silva JM, Coco R, Le Breton A, Preat V: PLGA-based
nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release 2012,
161: 505-522.
431. Fadeel B: Clear and present danger? Engineered nanoparticles and the immune
system. Swiss Med Wkly 2012, 142: w13609.
432. Becker R, Dembek C, White LA, Garrison LP: The cost offsets and cost-effectiveness
associated with pegylated drugs: a review of the literature. Expert Rev
Pharmacoecon Outcomes Res 2012, 12: 775-793.
433. Sahoo NG, Bao H, Pan Y, Pal M, Kakran M, Cheng HK et al.: Functionalized carbon
nanomaterials as nanocarriers for loading and delivery of a poorly water-soluble
anticancer drug: a comparative study. Chem Commun (Camb) 2011, 47: 52355237.
434. Lamprecht C, Liashkovich I, Neves V, Danzberger J, Heister E, Rangl M et al.: AFM
imaging of functionalized carbon nanotubes on biological membranes.
Nanotechnology 2009, 20: 434001.
435. Klumpp C, Kostarelos K, Prato M, Bianco A: Functionalized carbon nanotubes as
emerging nanovectors for the delivery of therapeutics. Biochim Biophys Acta 2006,
1758: 404-412.
310
RÉFÉRENCES
436. Feazell RP, Nakayama-Ratchford N, Dai H, Lippard SJ: Soluble single-walled carbon
nanotubes as longboat delivery systems for platinum(IV) anticancer drug design.
J Am Chem Soc 2007, 129: 8438-8439.
437. Liu Z, Davis C, Cai W, He L, Chen X, Dai H: Circulation and long-term fate of
functionalized, biocompatible single-walled carbon nanotubes in mice probed by
Raman spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105: 1410-1415.
438. Hirsch LR, Stafford RJ, Bankson JA, Sershen SR, Rivera B, Price RE et al.: Nanoshellmediated near-infrared thermal therapy of tumors under magnetic resonance
guidance. Proc Natl Acad Sci U S A 2003, 100: 13549-13554.
439. Arsawang U, Saengsawang O, Rungrotmongkol T, Sornmee P, Wittayanarakul K,
Remsungnen T et al.: How do carbon nanotubes serve as carriers for gemcitabine
transport in a drug delivery system? J Mol Graph Model 2011, 29: 591-596.
440. Kam NW, O'Connell M, Wisdom JA, Dai H: Carbon nanotubes as multifunctional
biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell
destruction. Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102: 11600-11605.
441. Plummer EM, Manchester M: Viral nanoparticles and virus-like particles: platforms
for contemporary vaccine design. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol
2010.
442. Nishimoto T, Yoshida K, Miura Y, Kobayashi A, Hara H, Ohnami S et al.: Oncolytic
virus therapy for pancreatic cancer using the adenovirus library displaying
random peptides on the fiber knob. Gene Ther 2009, 16: 669-680.
443. Young M, Willits D, Uchida M, Douglas T: Plant viruses as biotemplates for
materials and their use in nanotechnology. Annu Rev Phytopathol 2008, 46: 361384.
444. Martin ME, Rice KG: Peptide-guided gene delivery. AAPS J 2007, 9: E18-29.
445. Hajitou A, Trepel M, Lilley CE, Soghomonyan S, Alauddin MM, Marini FC, 3rd et al.:
A hybrid vector for ligand-directed tumor targeting and molecular imaging. Cell
2006, 125: 385-398.
446. Kaiser CR, Flenniken ML, Gillitzer E, Harmsen AL, Harmsen AG, Jutila MA et al.:
Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue
distribution and rapid clearance in vivo. Int J Nanomedicine 2007, 2: 715-733.
447. Prasuhn DE, Jr., Singh P, Strable E, Brown S, Manchester M, Finn MG: Plasma
clearance of bacteriophage Qbeta particles as a function of surface charge. J Am
Chem Soc 2008, 130: 1328-1334.
448. Minelli C, Lowe SB, Stevens MM: Engineering nanocomposite materials for cancer
therapy. Small 2010, 6: 2336-2357.
449. Polyak B, Friedman G: Magnetic targeting for site-specific drug delivery:
applications and clinical potential. Expert Opin Drug Deliv 2009, 6: 53-70.
450. Yu MK, Jeong YY, Park J, Park S, Kim JW, Min JJ et al.: Drug-loaded
superparamagnetic iron oxide nanoparticles for combined cancer imaging and
therapy in vivo. Angew Chem Int Ed Engl 2008, 47: 5362-5365.
451. Kohler N, Sun C, Wang J, Zhang M: Methotrexate-modified superparamagnetic
nanoparticles and their intracellular uptake into human cancer cells. Langmuir
2005, 21: 8858-8864.
452. Han G, Ghosh P, Rotello VM: Multi-functional gold nanoparticles for drug delivery.
Adv Exp Med Biol 2007, 620: 48-56.
453. Kim B, Han G, Toley BJ, Kim CK, Rotello VM, Forbes NS: Tuning payload delivery
in tumour cylindroids using gold nanoparticles. Nat Nanotechnol 2010, 5: 465-472.
311
RÉFÉRENCES
454. Brown SD, Nativo P, Smith JA, Stirling D, Edwards PR, Venugopal B et al.: Gold
nanoparticles for the improved anticancer drug delivery of the active component
of oxaliplatin. J Am Chem Soc 2010, 132: 4678-4684.
455. Shipp G: Ultrasensitive measurement of protein and nucleic Acid biomarkers for
earlier disease detection and more effective therapies. Biotechnol Healthc 2006, 3:
35-40.
456. Goldmann E: The Growth of Malignant Disease in Man and the Lower Animals,
with special reference to the Vascular System. Proc R Soc Med 1908, 1: 1-13.
457. Matsumura Y, Maeda H: A new concept for macromolecular therapeutics in cancer
chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the
antitumor agent smancs. Cancer Res 1986, 46: 6387-6392.
458. Folkman J: What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl
Cancer Inst 1990, 82: 4-6.
459. Folkman J: Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971, 285:
1182-1186.
460. Folkman J: Tumor angiogenesis. Adv Cancer Res 1974, 19: 331-358.
461. Folkman J, Greenspan HP: Influence of geometry on control of cell growth. Biochim
Biophys Acta 1975, 417: 211-236.
462. Bates DO, Hillman NJ, Williams B, Neal CR, Pocock TM: Regulation of
microvascular permeability by vascular endothelial growth factors. J Anat 2002,
200: 581-597.
463. Senger DR, Galli SJ, Dvorak AM, Perruzzi CA, Harvey VS, Dvorak HF: Tumor cells
secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites
fluid. Science 1983, 219: 983-985.
464. Dvorak HF, Nagy JA, Dvorak JT, Dvorak AM: Identification and characterization of
the blood vessels of solid tumors that are leaky to circulating macromolecules. Am
J Pathol 1988, 133: 95-109.
465. Maeda H, Fang J, Inutsuka T, Kitamoto Y: Vascular permeability enhancement in
solid tumor: various factors, mechanisms involved and its implications. Int
Immunopharmacol 2003, 3: 319-328.
466. Ferrara N, Keyt B: Vascular endothelial growth factor: basic biology and clinical
implications. EXS 1997, 79: 209-232.
467. Nagy JA, Chang SH, Dvorak AM, Dvorak HF: Why are tumour blood vessels
abnormal and why is it important to know? Br J Cancer 2009, 100: 865-869.
468. Jain RK: The next frontier of molecular medicine: delivery of therapeutics. Nat Med
1998, 4: 655-657.
469. Jain RK, Stylianopoulos T: Delivering nanomedicine to solid tumors. Nat Rev Clin
Oncol 2010, 7: 653-664.
470. Hobbs SK, Monsky WL, Yuan F, Roberts WG, Griffith L, Torchilin VP et al.:
Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and
microenvironment. Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95: 4607-4612.
471. Konerding MA, Miodonski AJ, Lametschwandtner A: Microvascular corrosion casting
in the study of tumor vascularity: a review. Scanning Microsc 1995, 9: 1233-1243;
discussion 1243-1234.
472. Hashizume H, Baluk P, Morikawa S, McLean JW, Thurston G, Roberge S et al.:
Openings between defective endothelial cells explain tumor vessel leakiness. Am J
Pathol 2000, 156: 1363-1380.
473. Skinner SA, Tutton PJ, O'Brien PE: Microvascular architecture of experimental colon
tumors in the rat. Cancer Res 1990, 50: 2411-2417.
312
RÉFÉRENCES
474. Carmeliet P, Jain RK: Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer
and other angiogenic diseases. Nat Rev Drug Discov 2011, 10: 417-427.
475. Taurin S, Nehoff H, Greish K: Anticancer nanomedicine and tumor vascular
permeability; Where is the missing link? J Control Release 2012, 164: 265-275.
476. Swartz MA, Fleury ME: Interstitial flow and its effects in soft tissues. Annu Rev
Biomed Eng 2007, 9: 229-256.
477. Iwai K, Maeda H, Konno T: Use of oily contrast medium for selective drug targeting
to tumor: enhanced therapeutic effect and X-ray image. Cancer Res 1984, 44:
2115-2121.
478. Padera TP, Stoll BR, Tooredman JB, Capen D, di Tomaso E, Jain RK: Pathology:
cancer cells compress intratumour vessels. Nature 2004, 427: 695.
479. Noguchi Y, Wu J, Duncan R, Strohalm J, Ulbrich K, Akaike T et al.: Early phase
tumor accumulation of macromolecules: a great difference in clearance rate
between tumor and normal tissues. Jpn J Cancer Res 1998, 89: 307-314.
480. Jain RK: Transport of molecules across tumor vasculature. Cancer Metastasis Rev
1987, 6: 559-593.
481. Swartz MA: The physiology of the lymphatic system. Adv Drug Deliv Rev 2001, 50: 320.
482. Rabanel JM, Aoun V, Elkin I, Mokhtar M, Hildgen P: Drug-loaded nanocarriers:
passive targeting and crossing of biological barriers. Curr Med Chem 2012, 19:
3070-3102.
483. Stacker SA, Achen MG, Jussila L, Baldwin ME, Alitalo K: Lymphangiogenesis and
cancer metastasis. Nat Rev Cancer 2002, 2: 573-583.
484. Stylianopoulos T, Soteriou K, Fukumura D, Jain RK: Cationic nanoparticles have
superior transvascular flux into solid tumors: insights from a mathematical
model. Ann Biomed Eng 2013, 41: 68-77.
485. Dellian M, Yuan F, Trubetskoy VS, Torchilin VP, Jain RK: Vascular permeability in a
human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer 2000, 82:
1513-1518.
486. Schmitt-Sody M, Strieth S, Krasnici S, Sauer B, Schulze B, Teifel M et al.: Neovascular
targeting therapy: paclitaxel encapsulated in cationic liposomes improves
antitumoral efficacy. Clin Cancer Res 2003, 9: 2335-2341.
487. Krasnici S, Werner A, Eichhorn ME, Schmitt-Sody M, Pahernik SA, Sauer B et al.:
Effect of the surface charge of liposomes on their uptake by angiogenic tumor
vessels. Int J Cancer 2003, 105: 561-567.
488. Alexandrakis G, Brown EB, Tong RT, McKee TD, Campbell RB, Boucher Y et al.:
Two-photon fluorescence correlation microscopy reveals the two-phase nature of
transport in tumors. Nat Med 2004, 10: 203-207.
489. Netti PA, Berk DA, Swartz MA, Grodzinsky AJ, Jain RK: Role of extracellular matrix
assembly in interstitial transport in solid tumors. Cancer Res 2000, 60: 2497-2503.
490. Saha RN, Vasanthakumar S, Bende G, Snehalatha M: Nanoparticulate drug delivery
systems for cancer chemotherapy. Mol Membr Biol 2010, 27: 215-231.
491. Yu B, Tai HC, Xue W, Lee LJ, Lee RJ: Receptor-targeted nanocarriers for
therapeutic delivery to cancer. Mol Membr Biol 2010, 27: 286-298.
492. Wang J, Tian S, Petros RA, Napier ME, Desimone JM: The complex role of
multivalency in nanoparticles targeting the transferrin receptor for cancer
therapies. J Am Chem Soc 2010, 132: 11306-11313.
493. Florence AT: "Targeting" nanoparticles: the constraints of physical laws and
physical barriers. J Control Release 2012, 164: 115-124.
313
RÉFÉRENCES
494. Li X, Zhou H, Yang L, Du G, Pai-Panandiker AS, Huang X et al.: Enhancement of cell
recognition in vitro by dual-ligand cancer targeting gold nanoparticles.
Biomaterials 2011, 32: 2540-2545.
495. Papademetriou IT, Garnacho C, Schuchman EH, Muro S: In vivo performance of
polymer nanocarriers dually-targeted to epitopes of the same or different
receptors. Biomaterials 2013, 34: 3459-3466.
496. Gao J, Feng SS, Guo Y: Antibody engineering promotes nanomedicine for cancer
treatment. Nanomedicine (Lond) 2010, 5: 1141-1145.
497. Shi J, Xiao Z, Kamaly N, Farokhzad OC: Self-assembled targeted nanoparticles:
evolution of technologies and bench to bedside translation. Acc Chem Res 2011,
44: 1123-1134.
498. Delehanty JB, Boeneman K, Bradburne CE, Robertson K, Bongard JE, Medintz IL:
Peptides for specific intracellular delivery and targeting of nanoparticles:
implications for developing nanoparticle-mediated drug delivery. Ther Deliv
2010, 1: 411-433.
499. Kolb HC, Finn MG, Sharpless KB: Click Chemistry: Diverse Chemical Function
from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl 2001, 40: 2004-2021.
500. Kolb HC, Sharpless KB: The growing impact of click chemistry on drug discovery.
Drug Discov Today 2003, 8: 1128-1137.
501. Gu F, Zhang L, Teply BA, Mann N, Wang A, Radovic-Moreno AF et al.: Precise
engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block
copolymers. Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105: 2586-2591.
502. Stefanick JF, Ashley JD, Kiziltepe T, Bilgicer B: A systematic analysis of peptide
linker length and liposomal polyethylene glycol coating on cellular uptake of
peptide-targeted liposomes. ACS Nano 2013, 7: 2935-2947.
503. Elias DR, Poloukhtine A, Popik V, Tsourkas A: Effect of ligand density, receptor
density, and nanoparticle size on cell targeting. Nanomedicine 2013, 9: 194-201.
504. Petros RA, DeSimone JM: Strategies in the design of nanoparticles for therapeutic
applications. Nat Rev Drug Discov 2010, 9: 615-627.
505. Allen TM: Ligand-targeted therapeutics in anticancer therapy. Nat Rev Cancer 2002,
2: 750-763.
506. Bartlett DW, Su H, Hildebrandt IJ, Weber WA, Davis ME: Impact of tumor-specific
targeting on the biodistribution and efficacy of siRNA nanoparticles measured by
multimodality in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104: 15549-15554.
507. Weinberg WC, Frazier-Jessen MR, Wu WJ, Weir A, Hartsough M, Keegan P et al.:
Development and regulation of monoclonal antibody products: challenges and
opportunities. Cancer Metastasis Rev 2005, 24: 569-584.
508. Brennan FR, Shaw L, Wing MG, Robinson C: Preclinical safety testing of
biotechnology-derived pharmaceuticals: understanding the issues and addressing
the challenges. Mol Biotechnol 2004, 27: 59-74.
509. Simard P, Leroux JC: In vivo evaluation of pH-sensitive polymer-based
immunoliposomes targeting the CD33 antigen. Mol Pharm 2010, 7: 1098-1107.
510. Chou LY, Ming K, Chan WC: Strategies for the intracellular delivery of
nanoparticles. Chem Soc Rev 2011, 40: 233-245.
511. Sahoo SK, Ma W, Labhasetwar V: Efficacy of transferrin-conjugated paclitaxelloaded nanoparticles in a murine model of prostate cancer. Int J Cancer 2004,
112: 335-340.
512. Cheng Z, Al Zaki A, Hui JZ, Muzykantov VR, Tsourkas A: Multifunctional
nanoparticles: cost versus benefit of adding targeting and imaging capabilities.
Science 2012, 338: 903-910.
314
RÉFÉRENCES
513. Nilsson FY, Tolmachev V: Affibody molecules: new protein domains for molecular
imaging and targeted tumor therapy. Curr Opin Drug Discov Devel 2007, 10: 167175.
514. Colas P: The eleven-year switch of peptide aptamers. J Biol 2008, 7: 2.
515. Colombo G, Curnis F, De Mori GM, Gasparri A, Longoni C, Sacchi A et al.: Structureactivity relationships of linear and cyclic peptides containing the NGR tumorhoming motif. J Biol Chem 2002, 277: 47891-47897.
516. Roth L, Agemy L, Kotamraju VR, Braun G, Teesalu T, Sugahara KN et al.:
Transtumoral targeting enabled by a novel neuropilin-binding peptide. Oncogene
2012, 31: 3754-3763.
517. Hild W, Pollinger K, Caporale A, Cabrele C, Keller M, Pluym N et al.: G proteincoupled receptors function as logic gates for nanoparticle binding and cell
uptake. Proc Natl Acad Sci U S A 2010, 107: 10667-10672.
518. Xiao Z, Farokhzad OC: Aptamer-functionalized nanoparticles for medical
applications: challenges and opportunities. ACS Nano 2012, 6: 3670-3676.
519. Zhu CL, Lu CH, Song XY, Yang HH, Wang XR: Bioresponsive controlled release
using mesoporous silica nanoparticles capped with aptamer-based molecular
gate. J Am Chem Soc 2011, 133: 1278-1281.
520. Keefe AD, Pai S, Ellington A: Aptamers as therapeutics. Nat Rev Drug Discov 2010,
9: 537-550.
521. Hilgenbrink AR, Low PS: Folate receptor-mediated drug targeting: from
therapeutics to diagnostics. J Pharm Sci 2005, 94: 2135-2146.
522. Markert S, Lassmann S, Gabriel B, Klar M, Werner M, Gitsch G et al.: Alpha-folate
receptor expression in epithelial ovarian carcinoma and non-neoplastic ovarian
tissue. Anticancer Res 2008, 28: 3567-3572.
523. Seymour LW, Ferry DR, Anderson D, Hesslewood S, Julyan PJ, Poyner R et al.:
Hepatic drug targeting: phase I evaluation of polymer-bound doxorubicin. J Clin
Oncol 2002, 20: 1668-1676.
524. Hrkach J, Von Hoff D, Mukkaram Ali M, Andrianova E, Auer J, Campbell T et al.:
Preclinical development and clinical translation of a PSMA-targeted docetaxel
nanoparticle with a differentiated pharmacological profile. Sci Transl Med 2012,
4: 128ra139.
525. Bertrand N, Wu J, Xu X, Kamaly N, Farokhzad OC: Cancer nanotechnology: the
impact of passive and active targeting in the era of modern cancer biology. Adv
Drug Deliv Rev 2014, 66: 2-25.
526. Kipp JE: The role of solid nanoparticle technology in the parenteral delivery of
poorly water-soluble drugs. Int J Pharm 2004, 284: 109-122.
527. Zhang L, Chan JM, Gu FX, Rhee JW, Wang AZ, Radovic-Moreno AF et al.: Selfassembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform.
ACS Nano 2008, 2: 1696-1702.
528. Whitehead KA, Langer R, Anderson DG: Knocking down barriers: advances in
siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov 2009, 8: 129-138.
529. Alexis F, Pridgen E, Molnar LK, Farokhzad OC: Factors affecting the clearance and
biodistribution of polymeric nanoparticles. Mol Pharm 2008, 5: 505-515.
530. Bertrand N, Leroux JC: The journey of a drug-carrier in the body: an anatomophysiological perspective. J Control Release 2012, 161: 152-163.
531. Miele E, Spinelli GP, Tomao F, Tomao S: Albumin-bound formulation of paclitaxel
(Abraxane ABI-007) in the treatment of breast cancer. Int J Nanomedicine 2009,
4: 99-105.
315
RÉFÉRENCES
532. Von Hoff DD, Ramanathan RK, Borad MJ, Laheru DA, Smith LS, Wood TE et al.:
Gemcitabine plus nab-paclitaxel is an active regimen in patients with advanced
pancreatic cancer: a phase I/II trial. J Clin Oncol 2011, 29: 4548-4554.
533. Gabizon A, Dagan A, Goren D, Barenholz Y, Fuks Z: Liposomes as in vivo carriers of
adriamycin: reduced cardiac uptake and preserved antitumor activity in mice.
Cancer Res 1982, 42: 4734-4739.
534. Geisberg CA, Sawyer DB: Mechanisms of anthracycline cardiotoxicity and strategies
to decrease cardiac damage. Curr Hypertens Rep 2010, 12: 404-410.
535. O'Brien ME, Wigler N, Inbar M, Rosso R, Grischke E, Santoro A et al.: Reduced
cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal
doxorubicin HCl (CAELYX/Doxil) versus conventional doxorubicin for first-line
treatment of metastatic breast cancer. Ann Oncol 2004, 15: 440-449.
536. Maeda H, Bharate GY, Daruwalla J: Polymeric drugs for efficient tumor-targeted
drug delivery based on EPR-effect. Eur J Pharm Biopharm 2009, 71: 409-419.
537. Danhier F, Lecouturier N, Vroman B, Jerome C, Marchand-Brynaert J, Feron O et al.:
Paclitaxel-loaded PEGylated PLGA-based nanoparticles: in vitro and in vivo
evaluation. J Control Release 2009, 133: 11-17.
538. Liang J, Luo Y, Zhao H: Synthetic biology: putting synthesis into biology. Wiley
Interdiscip Rev Syst Biol Med 2011, 3: 7-20.
539. Hasan W, Chu K, Gullapalli A, Dunn SS, Enlow EM, Luft JC et al.: Delivery of
multiple siRNAs using lipid-coated PLGA nanoparticles for treatment of prostate
cancer. Nano Lett 2012, 12: 287-292.
540. Liang C, Yang Y, Ling Y, Huang Y, Li T, Li X: Improved therapeutic effect of folatedecorated PLGA-PEG nanoparticles for endometrial carcinoma. Bioorg Med
Chem 2011, 19: 4057-4066.
541. Chittasupho C, Xie SX, Baoum A, Yakovleva T, Siahaan TJ, Berkland CJ: ICAM-1
targeting of doxorubicin-loaded PLGA nanoparticles to lung epithelial cells. Eur
J Pharm Sci 2009, 37: 141-150.
542. Aravind A, Jeyamohan P, Nair R, Veeranarayanan S, Nagaoka Y, Yoshida Y et al.:
AS1411 aptamer tagged PLGA-lecithin-PEG nanoparticles for tumor cell
targeting and drug delivery. Biotechnol Bioeng 2012, 109: 2920-2931.
543. Guo J, Gao X, Su L, Xia H, Gu G, Pang Z et al.: Aptamer-functionalized PEG-PLGA
nanoparticles for enhanced anti-glioma drug delivery. Biomaterials 2011, 32:
8010-8020.
544. Dhar S, Kolishetti N, Lippard SJ, Farokhzad OC: Targeted delivery of a cisplatin
prodrug for safer and more effective prostate cancer therapy in vivo. Proc Natl
Acad Sci U S A 2011, 108: 1850-1855.
545. Shriver LP, Koudelka KJ, Manchester M: Viral nanoparticles associate with regions
of inflammation and blood brain barrier disruption during CNS infection. J
Neuroimmunol 2009, 211: 66-72.
546. Jin SE, Jin HE, Hong SS: Targeted delivery system of nanobiomaterials in anticancer
therapy: from cells to clinics. Biomed Res Int 2014, 2014: 814208.
547. Kirpotin DB, Drummond DC, Shao Y, Shalaby MR, Hong K, Nielsen UB et al.:
Antibody targeting of long-circulating lipidic nanoparticles does not increase
tumor localization but does increase internalization in animal models. Cancer Res
2006, 66: 6732-6740.
548. Matsumura Y, Gotoh M, Muro K, Yamada Y, Shirao K, Shimada Y et al.: Phase I and
pharmacokinetic study of MCC-465, a doxorubicin (DXR) encapsulated in PEG
immunoliposome, in patients with metastatic stomach cancer. Ann Oncol 2004,
15: 517-525.
316
RÉFÉRENCES
549. Senzer N, Nemunaitis J, Nemunaitis D, Bedell C, Edelman G, Barve M et al.: Phase I
study of a systemically delivered p53 nanoparticle in advanced solid tumors. Mol
Ther 2013, 21: 1096-1103.
550. Mamot C, Ritschard R, Wicki A, Stehle G, Dieterle T, Bubendorf L et al.: Tolerability,
safety, pharmacokinetics, and efficacy of doxorubicin-loaded anti-EGFR
immunoliposomes in advanced solid tumours: a phase 1 dose-escalation study.
Lancet Oncol 2012, 13: 1234-1241.
551. Burke PA, DeNardo SJ, Miers LA, Lamborn KR, Matzku S, DeNardo GL: Cilengitide
targeting
of
alpha(v)beta(3)
integrin
receptor
synergizes
with
radioimmunotherapy to increase efficacy and apoptosis in breast cancer
xenografts. Cancer Res 2002, 62: 4263-4272.
552. Sugahara KN, Teesalu T, Karmali PP, Kotamraju VR, Agemy L, Girard OM et al.:
Tissue-penetrating delivery of compounds and nanoparticles into tumors. Cancer
Cell 2009, 16: 510-520.
553. Luo G, Yu X, Jin C, Yang F, Fu D, Long J et al.: LyP-1-conjugated nanoparticles for
targeting drug delivery to lymphatic metastatic tumors. Int J Pharm 2010, 385:
150-156.
554. Werner ME, Karve S, Sukumar R, Cummings ND, Copp JA, Chen RC et al.: Folatetargeted nanoparticle delivery of chemo- and radiotherapeutics for the treatment
of ovarian cancer peritoneal metastasis. Biomaterials 2011, 32: 8548-8554.
555. van Dam GM, Themelis G, Crane LM, Harlaar NJ, Pleijhuis RG, Kelder W et al.:
Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate
receptor-alpha targeting: first in-human results. Nat Med 2011, 17: 1315-1319.
556. Engin K, Leeper DB, Cater JR, Thistlethwaite AJ, Tupchong L, McFarlane JD:
Extracellular pH distribution in human tumours. Int J Hyperthermia 1995, 11:
211-216.
557. Lee ES, Oh KT, Kim D, Youn YS, Bae YH: Tumor pH-responsive flower-like
micelles of poly(L-lactic acid)-b-poly(ethylene glycol)-b-poly(L-histidine). J
Control Release 2007, 123: 19-26.
558. Bae YM, Park YI, Nam SH, Kim JH, Lee K, Kim HM et al.: Endocytosis, intracellular
transport, and exocytosis of lanthanide-doped upconverting nanoparticles in
single living cells. Biomaterials 2012, 33: 9080-9086.
559. Liu J, Huang Y, Kumar A, Tan A, Jin S, Mozhi A et al.: pH-sensitive nano-systems for
drug delivery in cancer therapy. Biotechnol Adv 2014, 32: 693-710.
560. Liu J, Ma H, Wei T, Liang XJ: CO2 gas induced drug release from pH-sensitive
liposome to circumvent doxorubicin resistant cells. Chem Commun (Camb) 2012,
48: 4869-4871.
561. Lu C, Perez-Soler R, Piperdi B, Walsh GL, Swisher SG, Smythe WR et al.: Phase II
study of a liposome-entrapped cisplatin analog (L-NDDP) administered
intrapleurally and pathologic response rates in patients with malignant pleural
mesothelioma. J Clin Oncol 2005, 23: 3495-3501.
562. Hillerdal G, Sorensen JB, Sundstrom S, Vikstrom A, Hjerpe A: Treatment of
malignant pleural mesothelioma with liposomized doxorubicine: prolonged time
to progression and good survival. A Nordic study. Clin Respir J 2008, 2: 80-85.
563. Steele JP, O'Doherty CA, Shamash J, Evans MT, Gower NH, Tischkowitz MD et al.:
Phase II trial of liposomal daunorubicin in malignant pleural mesothelioma. Ann
Oncol 2001, 12: 497-499.
564. Pacurari M, Yin XJ, Zhao J, Ding M, Leonard SS, Schwegler-Berry D et al.: Raw
single-wall carbon nanotubes induce oxidative stress and activate MAPKs, AP-1,
317
RÉFÉRENCES
NF-kappaB, and Akt in normal and malignant human mesothelial cells. Environ
Health Perspect 2008, 116: 1211-1217.
565. Schulz MD, Zubris KA, Wade JE, Padera RF, Xu X, Grinstaff MW et al.: Paclitaxelloaded expansile nanoparticles in a multimodal treatment model of malignant
mesothelioma. Ann Thorac Surg 2011, 92: 2007-2013; discussion 2013-2004.
566. Ampollini L, Sonvico F, Barocelli E, Cavazzoni A, Bilancia R, Mucchino C et al.:
Intrapleural polymeric films containing cisplatin for malignant pleural
mesothelioma in a rat tumour model: a preliminary study. Eur J Cardiothorac
Surg 2010, 37: 557-565.
919-928.
568. Hillegass JM, Blumen SR, Cheng K, MacPherson MB, Alexeeva V, Lathrop SA et al.:
Increased efficacy of doxorubicin delivered in multifunctional microparticles for
mesothelioma therapy. Int J Cancer 2011, 129: 233-244.
569. da Volta Soares M, Oliveira MR, dos Santos EP, de Brito Gitirana L, Barbosa GM,
Quaresma CH et al.: Nanostructured delivery system for zinc phthalocyanine:
preparation, characterization, and phototoxicity study against human lung
adenocarcinoma A549 cells. Int J Nanomedicine 2011, 6: 227-238.
570. Nomura K, Wang W, Fujiki M, Liu J: Notable norbornene (NBE) incorporation in
ethylene-NBE copolymerization catalysed by nonbridged half-titanocenes: better
correlation between NBE incorporation and coordination energy. Chem Commun
(Camb) 2006: 2659-2661.
571. Rao NV, Mane SR, Kishore A, Das Sarma J, Shunmugam R: Norbornene derived
doxorubicin copolymers as drug carriers with pH responsive hydrazone linker.
572. Yamamoto T, Fukushima T, Yamamoto Y, Kosaka A, Jin W, Ishii N et al.: Stabilization
of a kinetically favored nanostructure: surface ROMP of self-assembled
conductive
nanocoils
from
a
norbornene-appended
hexa-perihexabenzocoronene. J Am Chem Soc 2006, 128: 14337-14340.
573. Gueugnon F, Denis I, Pouliquen D, Collette F, Delatouche R, Heroguez V et al.:
Nanoparticles Produced by Ring-Opening Metathesis Polymerization Using
Norbornenyl-poly(ethylene oxide) as a Ligand-Free Generic Platform for Highly
Selective In Vivo Tumor Targeting. Biomacromolecules 2013, 14: 2396-2402.
574. Delatouche R, Denis I, Grinda M, El Bahhaj F, Baucher E, Collette F et al.: Design of
pH responsive clickable prodrugs applied to histone deacetylase inhibitors: a new
575. Mutsaers SE: The mesothelial cell. Int J Biochem Cell Biol 2004, 36: 9-16.
576. Kim JY, Shim G, Choi HW, Park J, Chung SW, Kim S et al.: Tumor vasculature
targeting following co-delivery of heparin-taurocholate conjugate and
suberoylanilide hydroxamic acid using cationic nanolipoplex. Biomaterials 2012,
33: 4424-4430.
577. Delatouche R, Denis I, Grinda M, Bahhaj FE, Baucher E, Collette F et al.: Design of pH
responsive clickable prodrugs applied to histone deacetylase inhibitors: A new
578. Collette F, Delatouche R, Blanquart C, Gueugnon F, Grégoire M, Bertrand P et al.: Easy
and effective method to produce functionalized particles for cellular uptake.
Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry 2013, 51: 176-189.
318
RÉFÉRENCES
579. Dawidczyk CM, Kim C, Park JH, Russell LM, Lee KH, Pomper MG et al.: State-of-theart in design rules for drug delivery platforms: lessons learned from FDAapproved nanomedicines. J Control Release 2014, 187: 133-144.
580. Sato NL, Niimura S, Fujisawa N, Maeda Y: Characterization of vascular
permeability-increasing component isolated from solid tumors and the effect of
highly polymerized dextran sulfate on its activity. Jpn J Pharmacol 1986, 41: 163171.
581. Scita G, Di Fiore PP: The endocytic matrix. Nature 2010, 463: 464-473.
582. Colson YL, Liu R, Southard EB, Schulz MD, Wade JE, Griset AP et al.: The
performance of expansile nanoparticles in a murine model of peritoneal
carcinomatosis. Biomaterials 2011, 32: 832-840.
583. Arrieta O, Medina LA, Estrada-Lobato E, Ramirez-Tirado LA, Mendoza-Garcia VO, de
la Garza-Salazar J: High liposomal doxorubicin tumour tissue distribution, as
determined by radiopharmaceutical labelling with (99m)Tc-LD, is associated
with the response and survival of patients with unresectable pleural
mesothelioma treated with a combination of liposomal doxorubicin and cisplatin.
Cancer Chemother Pharmacol 2014, 74: 211-215.
584. Arrieta O, Medina LA, Estrada-Lobato E, Hernandez-Pedro N, Villanueva-Rodriguez G,
Martinez-Barrera L et al.: First-line chemotherapy with liposomal doxorubicin plus
cisplatin for patients with advanced malignant pleural mesothelioma: phase II
trial. Br J Cancer 2012, 106: 1027-1032.
585. Rius M, Lyko F: Epigenetic cancer therapy: rationales, targets and drugs. Oncogene
2012, 31: 4257-4265.
586. Arrowsmith CH, Bountra C, Fish PV, Lee K, Schapira M: Epigenetic protein families:
a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov 2012, 11: 384-400.
587. Bertrand P: Inside HDAC with HDAC inhibitors. Eur J Med Chem 2010, 45: 20952116.
588. Duvic M, Vu J: Vorinostat: a new oral histone deacetylase inhibitor approved for
cutaneous T-cell lymphoma. Expert Opin Investig Drugs 2007, 16: 1111-1120.
589. Kaiser J: Epigenetic drugs take on cancer. Science 2010, 330: 576-578.
590. El Bahhaj F, Dekker FJ, Martinet N, Bertrand P: Delivery of epidrugs. Drug Discov
Today 2014.
591. Charrier C, Clarhaut J, Gesson JP, Estiu G, Wiest O, Roche J et al.: Synthesis and
modeling of new benzofuranone histone deacetylase inhibitors that stimulate
tumor suppressor gene expression. J Med Chem 2009, 52: 3112-3115.
592. Gueugnon F, Cartron PF, Charrier C, Bertrand P, Fonteneau JF, Gregoire M et al.: New
histone deacetylase inhibitors improve cisplatin antitumor properties against
thoracic cancer cells. Oncotarget 2014, 5: 4504-4515.
593. Fennell DA, Gaudino G, O'Byrne KJ, Mutti L, van Meerbeeck J: Advances in the
systemic therapy of malignant pleural mesothelioma. Nat Clin Pract Oncol 2008,
5: 136-147.
594. Glade MJ: Food, nutrition, and the prevention of cancer: a global perspective.
American Institute for Cancer Research/World Cancer Research Fund,
American Institute for Cancer Research, 1997. Nutrition 1999, 15: 523-526.
595. Kinnula VL, Everitt JI, Mangum JB, Chang LY, Crapo JD: Antioxidant defense
mechanisms in cultured pleural mesothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 1992,
7: 95-103.
596. Kelly RJ, Sharon E, Hassan R: Chemotherapy and targeted therapies for
unresectable malignant mesothelioma. Lung Cancer 2011, 73: 256-263.
319
RÉFÉRENCES
597. Remon J, Lianes P, Martinez S, Velasco M, Querol R, Zanui M: Malignant
mesothelioma: New insights into a rare disease. Cancer Treat Rev 2012.
598. Johnson IT: Glucosinolates: bioavailability and importance to health. Int J Vitam
Nutr Res 2002, 72: 26-31.
599. Hayes JD, Kelleher MO, Eggleston IM: The cancer chemopreventive actions of
phytochemicals derived from glucosinolates. Eur J Nutr 2008, 47 Suppl 2: 73-88.
600. Conaway CC, Yang YM, Chung FL: Isothiocyanates as cancer chemopreventive
agents: their biological activities and metabolism in rodents and humans. Curr
Drug Metab 2002, 3: 233-255.
601. Sahu RP, Zhang R, Batra S, Shi Y, Srivastava SK: Benzyl isothiocyanate-mediated
generation of reactive oxygen species causes cell cycle arrest and induces
apoptosis via activation of MAPK in human pancreatic cancer cells.
Carcinogenesis 2009, 30: 1744-1753.
602. Xiao D, Powolny AA, Singh SV: Benzyl isothiocyanate targets mitochondrial
respiratory chain to trigger reactive oxygen species-dependent apoptosis in
human breast cancer cells. J Biol Chem 2008, 283: 30151-30163.
603. Hecht SS: Chemoprevention by isothiocyanates. J Cell Biochem Suppl 1995, 22: 195209.
604. van Poppel G, Verhoeven DT, Verhagen H, Goldbohm RA: Brassica vegetables and
cancer prevention. Epidemiology and mechanisms. Adv Exp Med Biol 1999, 472:
159-168.
605. London SJ, Yuan JM, Chung FL, Gao YT, Coetzee GA, Ross RK et al.:
Isothiocyanates, glutathione S-transferase M1 and T1 polymorphisms, and lungcancer risk: a prospective study of men in Shanghai, China. Lancet 2000, 356:
724-729.
606. Giovannucci E, Rimm EB, Liu Y, Stampfer MJ, Willett WC: A prospective study of
cruciferous vegetables and prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev
2003, 12: 1403-1409.
607. Ji Y, Kuo Y, Morris ME: Pharmacokinetics of dietary phenethyl isothiocyanate in
rats. Pharm Res 2005, 22: 1658-1666.
608. Keum YS, Jeong WS, Kong AN: Chemopreventive functions of isothiocyanates. Drug
News Perspect 2005, 18: 445-451.
609. Gueugnon F, Leclercq S, Blanquart C, Sagan C, Cellerin L, Padieu M et al.:
Identification of novel markers for the diagnosis of malignant pleural
mesothelioma. Am J Pathol 2011, 178: 1033-1042.
610. Minarini A, Milelli A, Fimognari C, Simoni E, Turrini E, Tumiatti V: Exploring the
effects of isothiocyanates on chemotherapeutic drugs. Expert Opin Drug Metab
Toxicol 2014, 10: 25-38.
611. Martins NM, Santos NA, Curti C, Bianchi ML, Santos AC: Cisplatin induces
mitochondrial oxidative stress with resultant energetic metabolism impairment,
membrane rigidification and apoptosis in rat liver. J Appl Toxicol 2008, 28: 337344.
612. Rabik CA, Dolan ME: Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated
with platinating agents. Cancer Treat Rev 2007, 33: 9-23.
613. Antosiewicz J, Ziolkowski W, Kar S, Powolny AA, Singh SV: Role of reactive oxygen
intermediates in cellular responses to dietary cancer chemopreventive agents.
Planta Med 2008, 74: 1570-1579.
614. Sharma A, Singh K, Almasan A: Histone H2AX phosphorylation: a marker for DNA
damage. Methods Mol Biol 2012, 920: 613-626.
320
RÉFÉRENCES
615. Xu K, Thornalley PJ: Studies on the mechanism of the inhibition of human
leukaemia cell growth by dietary isothiocyanates and their cysteine adducts in
vitro. Biochem Pharmacol 2000, 60: 221-231.
616. Gong A, He M, Krishna Vanaja D, Yin P, Karnes RJ, Young CY: Phenethyl
isothiocyanate inhibits STAT3 activation in prostate cancer cells. Mol Nutr Food
Res 2009, 53: 878-886.
617. Lee JW, Cho MK: Phenethyl isothiocyanate induced apoptosis via down regulation
of Bcl-2/XIAP and triggering of the mitochondrial pathway in MCF-7 cells. Arch
Pharm Res 2008, 31: 1604-1612.
618. Kang L, Wang ZY: Breast cancer cell growth inhibition by phenethyl isothiocyanate
is associated with down-regulation of oestrogen receptor-alpha36. J Cell Mol Med
2010, 14: 1485-1493.
619. Prawan A, Saw CL, Khor TO, Keum YS, Yu S, Hu L et al.: Anti-NF-kappaB and antiinflammatory activities of synthetic isothiocyanates: effect of chemical structures
and cellular signaling. Chem Biol Interact 2009, 179: 202-211.
620. Wu WJ, Zhang Y, Zeng ZL, Li XB, Hu KS, Luo HY et al.: beta-phenylethyl
isothiocyanate reverses platinum resistance by a GSH-dependent mechanism in
cancer cells with epithelial-mesenchymal transition phenotype. Biochem
Pharmacol 2013, 85: 486-496.
621. Wang X, Govind S, Sajankila SP, Mi L, Roy R, Chung FL: Phenethyl isothiocyanate
sensitizes human cervical cancer cells to apoptosis induced by cisplatin. Mol Nutr
Food Res 2011, 55: 1572-1581.
622. Di Pasqua AJ, Hong C, Wu MY, McCracken E, Wang X, Mi L et al.: Sensitization of
non-small cell lung cancer cells to cisplatin by naturally occurring
isothiocyanates. Chem Res Toxicol 2010, 23: 1307-1309.
623. Aceto N, Bertino P, Barbone D, Tassi G, Manzo L, Porta C et al.: Taurolidine and
oxidative stress: a rationale for local treatment of mesothelioma. Eur Respir J
2009, 34: 1399-1407.
624. Shi Y, Felley-Bosco E, Marti TM, Stahel RA: Differential effects of lovastatin on
cisplatin responses in normal human mesothelial cells versus cancer cells:
implication for therapy. PLoS One 2012, 7: e45354.
625. Zimling ZG, Sorensen JB, Gerds TA, Bech C, Andersen CB, Santoni-Rugiu E: Low
ERCC1 expression in malignant pleural mesotheliomas treated with cisplatin and
vinorelbine predicts prolonged progression-free survival. J Thorac Oncol 2012, 7:
249-256.
626. Storr SJ, Woolston CM, Martin SG: Base excision repair, the redox environment and
therapeutic implications. Curr Mol Pharmacol 2012, 5: 88-101.
627. Lee Y, Kim YJ, Choi YJ, Lee JW, Lee S, Chung HW: Enhancement of cisplatin
cytotoxicity by benzyl isothiocyanate in HL-60 cells. Food Chem Toxicol 2012, 50:
2397-2406.
628. Nori A, Kopecek J: Intracellular targeting of polymer-bound drugs for cancer
chemotherapy. Adv Drug Deliv Rev 2005, 57: 609-636.
629. Monopoli MP, Walczyk D, Campbell A, Elia G, Lynch I, Bombelli FB et al.: Physicalchemical aspects of protein corona: relevance to in vitro and in vivo biological
impacts of nanoparticles. J Am Chem Soc 2011, 133: 2525-2534.
630. Cedervall T, Lynch I, Lindman S, Berggard T, Thulin E, Nilsson H et al.:
Understanding the nanoparticle-protein corona using methods to quantify
exchange rates and affinities of proteins for nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S
A 2007, 104: 2050-2055.
321
RÉFÉRENCES
631. Avgoustakis K: Pegylated poly(lactide) and poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles:
preparation, properties and possible applications in drug delivery. Curr Drug
Deliv 2004, 1: 321-333.
632. Otsuka H, Nagasaki Y, Kataoka K: PEGylated nanoparticles for biological and
pharmaceutical applications. Adv Drug Deliv Rev 2003, 55: 403-419.
633. Hume DA, Ross IL, Himes SR, Sasmono RT, Wells CA, Ravasi T: The mononuclear
phagocyte system revisited. J Leukoc Biol 2002, 72: 621-627.
634. Chiannilkulchai N, Driouich Z, Benoit JP, Parodi AL, Couvreur P: Doxorubicin-loaded
nanoparticles: increased efficiency in murine hepatic metastases. Sel Cancer Ther
1989, 5: 1-11.
635. Vittaz M, Bazile D, Spenlehauer G, Verrecchia T, Veillard M, Puisieux F et al.: Effect of
PEO surface density on long-circulating PLA-PEO nanoparticles which are very
low complement activators. Biomaterials 1996, 17: 1575-1581.
636. Moghimi SM, Hunter AC, Murray JC: Long-circulating and target-specific
nanoparticles: theory to practice. Pharmacol Rev 2001, 53: 283-318.
637. Blummel J, Perschmann N, Aydin D, Drinjakovic J, Surrey T, Lopez-Garcia M et al.:
Protein repellent properties of covalently attached PEG coatings on
nanostructured SiO(2)-based interfaces. Biomaterials 2007, 28: 4739-4747.
638. Predescu D, Palade GE: Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of
continuous microvascular endothelium. Am J Physiol 1993, 265: H725-733.
639. Simionescu M, Simionescu N, Palade GE: Morphometric data on the endothelium of
blood capillaries. J Cell Biol 1974, 60: 128-152.
640. Brigham KL: Estimations of permeability properties of pulmonary capillaries
(continuous endothelium). Physiologist 1980, 23: 44-46.
641. Ryan US, Ryan JW, Smith DS, Winkler H: Fenestrated endothelium of the adrenal
gland: freeze-fracture studies. Tissue Cell 1975, 7: 181-190.
642. Braet F, Wisse E, Bomans P, Frederik P, Geerts W, Koster A et al.: Contribution of
high-resolution correlative imaging techniques in the study of the liver sieve in
three-dimensions. Microsc Res Tech 2007, 70: 230-242.
643. Yuan F, Dellian M, Fukumura D, Leunig M, Berk DA, Torchilin VP et al.: Vascular
permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff
size. Cancer Res 1995, 55: 3752-3756.
644. Son YJ, Jang JS, Cho YW, Chung H, Park RW, Kwon IC et al.: Biodistribution and
anti-tumor efficacy of doxorubicin loaded glycol-chitosan nanoaggregates by
EPR effect. J Control Release 2003, 91: 135-145.
645. Mankoff DA: A definition of molecular imaging. J Nucl Med 2007, 48: 18N, 21N.
646. Hong H, Zhang Y, Sun J, Cai W: Molecular imaging and therapy of cancer with
radiolabeled nanoparticles. Nano Today 2009, 4: 399-413.
647. Subramanian S, Dandekar P, Jain R, Pandey U, Samuel G, Hassan PA et al.:
Technetium-99m-labeled poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles as an
alternative for sentinel lymph node imaging. Cancer Biother Radiopharm 2010, 25:
637-644.
648. Banerjee T, Singh AK, Sharma RK, Maitra AN: Labeling efficiency and
biodistribution of Technetium-99m labeled nanoparticles: interference by
colloidal tin oxide particles. Int J Pharm 2005, 289: 189-195.
649. Agashe HB, Babbar AK, Jain S, Sharma RK, Mishra AK, Asthana A et al.:
Investigations on biodistribution of technetium-99m-labeled carbohydrate-coated
poly(propylene imine) dendrimers. Nanomedicine 2007, 3: 120-127.
322
RÉFÉRENCES
650. Glaus C, Rossin R, Welch MJ, Bao G: In vivo evaluation of (64)Cu-labeled magnetic
nanoparticles as a dual-modality PET/MR imaging agent. Bioconjug Chem 2010,
21: 715-722.
651. Anderson CJ, Ferdani R: Copper-64 radiopharmaceuticals for PET imaging of
cancer: advances in preclinical and clinical research. Cancer Biother Radiopharm
2009, 24: 379-393.
652. Chen J, Zhu S, Tong L, Li J, Chen F, Han Y et al.: Superparamagnetic iron oxide
nanoparticles mediated (131)I-hVEGF siRNA inhibits hepatocellular carcinoma
tumor growth in nude mice. BMC Cancer 2014, 14: 114.
653. Chrastina A, Schnitzer JE: Iodine-125 radiolabeling of silver nanoparticles for in vivo
SPECT imaging. Int J Nanomedicine 2010, 5: 653-659.
654. Widder KJ, Senyei AE, Ranney DF: Magnetically responsive microspheres and other
carriers for the biophysical targeting of antitumor agents. Adv Pharmacol
Chemother 1979, 16: 213-271.
655. Weissleder R, Mahmood U: Molecular imaging. Radiology 2001, 219: 316-333.
656. Colombo M, Carregal-Romero S, Casula MF, Gutierrez L, Morales MP, Bohm IB et al.:
Biological applications of magnetic nanoparticles. Chem Soc Rev 2012, 41: 43064334.
657. Bellin MF: MR contrast agents, the old and the new. Eur J Radiol 2006, 60: 314-323.
658. Prijic S, Sersa G: Magnetic nanoparticles as targeted delivery systems in oncology.
Radiol Oncol 2011, 45: 1-16.
659. McBain SC, Yiu HH, Dobson J: Magnetic nanoparticles for gene and drug delivery.
Int J Nanomedicine 2008, 3: 169-180.
660. Gautier J, Allard-Vannier E, Herve-Aubert K, Souce M, Chourpa I: Design strategies of
hybrid metallic nanoparticles for theragnostic applications. Nanotechnology 2013,
24: 432002.
661. Patil R, Portilla-Arias J, Ding H, Konda B, Rekechenetskiy A, Inoue S et al.: Cellular
Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using
Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci
2012, 13: 11681-11693.
662. Riva L, Blaney SM, Dauser R, Nuchtern JG, Durfee J, McGuffey L et al.:
Pharmacokinetics and cerebrospinal fluid penetration of CI-994 (Nacetyldinaline) in the nonhuman primate. Clin Cancer Res 2000, 6: 994-997.
663. Hubeek I, Comijn EM, Van der Wilt CL, Merriman RL, Padron JM, Kaspers GJ et al.:
CI-994 (N-acetyl-dinaline) in combination with conventional anti-cancer agents is
effective against acute myeloid leukemia in vitro and in vivo. Oncol Rep 2008, 19:
1517-1523.
664. Du L, Musson DG, Wang AQ: Stability studies of vorinostat and its two metabolites
in human plasma, serum and urine. J Pharm Biomed Anal 2006, 42: 556-564.
665. Chau Y, Tan FE, Langer R: Synthesis and characterization of dextran-peptidemethotrexate conjugates for tumor targeting via mediation by matrix
metalloproteinase II and matrix metalloproteinase IX. Bioconjug Chem 2004, 15:
931-941.
666. Vartak DG, Gemeinhart RA: Matrix metalloproteases: underutilized targets for drug
delivery. J Drug Target 2007, 15: 1-20.
667. Kumagai T, Wakimoto N, Yin D, Gery S, Kawamata N, Takai N et al.: Histone
deacetylase inhibitor, suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat, SAHA)
profoundly inhibits the growth of human pancreatic cancer cells. Int J Cancer
2007, 121: 656-665.
323
RÉFÉRENCES
668. Richon VM, Garcia-Vargas J, Hardwick JS: Development of vorinostat: current
applications and future perspectives for cancer therapy. Cancer Lett 2009, 280:
201-210.
669. Marks PA, Breslow R: Dimethyl sulfoxide to vorinostat: development of this histone
deacetylase inhibitor as an anticancer drug. Nat Biotechnol 2007, 25: 84-90.
670. Prakash S, Foster BJ, Meyer M, Wozniak A, Heilbrun LK, Flaherty L et al.: Chronic
oral administration of CI-994: a phase 1 study. Invest New Drugs 2001, 19: 1-11.
671. Carlsson J, Nederman T: Tumour spheroid technology in cancer therapy research.
Eur J Cancer Clin Oncol 1989, 25: 1127-1133.
672. Goodman TT, Olive PL, Pun SH: Increased nanoparticle penetration in collagenasetreated multicellular spheroids. Int J Nanomedicine 2007, 2: 265-274.
673. O'Neal DP, Hirsch LR, Halas NJ, Payne JD, West JL: Photo-thermal tumor ablation in
mice using near infrared-absorbing nanoparticles. Cancer Lett 2004, 209: 171-176.
674. Morris ME, Dave RA: Pharmacokinetics and pharmacodynamics of phenethyl
isothiocyanate: implications in breast cancer prevention. AAPS J 2014, 16: 705713.
675. Yeh YT, Yeh H, Su SH, Lin JS, Lee KJ, Shyu HW et al.: Phenethyl isothiocyanate
induces DNA damage-associated G2/M arrest and subsequent apoptosis in oral
cancer cells with varying p53 mutations. Free Radic Biol Med 2014, 74C: 1-13.
676. Yan H, Zhu Y, Liu B, Wu H, Li Y, Wu X et al.: Mitogen-activated protein kinase
mediates the apoptosis of highly metastatic human non-small cell lung cancer
cells induced by isothiocyanates. Br J Nutr 2011, 106: 1779-1791.
677. Pawlik A, Szczepanski MA, Klimaszewska A, Gackowska L, Zuryn A, Grzanka A:
Phenethyl isothiocyanate-induced cytoskeletal changes and cell death in lung
cancer cells. Food Chem Toxicol 2012, 50: 3577-3594.
678. Chae JI, Cho JH, Lee KA, Choi NJ, Seo KS, Kim SB et al.: Role of transcription factor
Sp1 in the quercetin-mediated inhibitory effect on human malignant pleural
mesothelioma. Int J Mol Med 2012, 30: 835-841.
679. Tang T, Song X, Liu YF, Wang WY: PEITC reverse multi-drug resistance of human
gastric cancer SGC7901/DDP cell line. Cell Biol Int 2014, 38: 502-510.
680. Yang YT, Shi Y, Jay M, Di Pasqua AJ: Enhanced toxicity of cisplatin with
chemosensitizer phenethyl isothiocyanate toward non-small cell lung cancer cells
when delivered in liposomal nanoparticles. Chem Res Toxicol 2014, 27: 946-948.
681. Toyokuni S, Okamoto K, Yodoi J, Hiai H: Persistent oxidative stress in cancer. FEBS
Lett 1995, 358: 1-3.
682. Hileman EA, Achanta G, Huang P: Superoxide dismutase: an emerging target for
cancer therapeutics. Expert Opin Ther Targets 2001, 5: 697-710.
683. Kang D, Hamasaki N: Mitochondrial oxidative stress and mitochondrial DNA. Clin
Chem Lab Med 2003, 41: 1281-1288.
684. Behrend L, Henderson G, Zwacka RM: Reactive oxygen species in oncogenic
transformation. Biochem Soc Trans 2003, 31: 1441-1444.
685. Colt HG, Astoul P, Wang X, Yi ES, Boutin C, Hoffman RM: Clinical course of human
epithelial-type malignant pleural mesothelioma replicated in an orthotopictransplant nude mouse model. Anticancer Res 1996, 16: 633-639.
686. Yanagihara K, Tsumuraya M, Takigahira M, Mihara K, Kubo T, Ohuchi K et al.: An
orthotopic implantation mouse model of human malignant pleural mesothelioma
for in vivo photon counting analysis and evaluation of the effect of S-1 therapy.
Int J Cancer 2010, 126: 2835-2846.
324
RÉFÉRENCES
687. Opitz I, Lardinois D, Arni S, Hillinger S, Vogt P, Odermatt B et al.: Local recurrence
model of malignant pleural mesothelioma for investigation of intrapleural
treatment. Eur J Cardiothorac Surg 2007, 31: 773-778.
688. Hao NB, Lu MH, Fan YH, Cao YL, Zhang ZR, Yang SM: Macrophages in tumor
microenvironments and the progression of tumors. Clin Dev Immunol 2012, 2012:
948098.
689. Forman HJ, Torres M: Redox signaling in macrophages. Mol Aspects Med 2001, 22:
189-216.
690. Sartori S, Tassinari D, Ceccotti P, Tombesi P, Nielsen I, Trevisani L et al.: Prospective
randomized trial of intrapleural bleomycin versus interferon alfa-2b via
ultrasound-guided small-bore chest tube in the palliative treatment of malignant
pleural effusions. J Clin Oncol 2004, 22: 1228-1233.
691. Perng RP, Chen YM, Wu MF, Chou KC, Lin WC, Liu JM et al.: Phase II trial of
intrapleural paclitaxel injection for non-small-cell lung cancer patients with
malignant pleural effusions. Respir Med 1998, 92: 473-479.
325
VECTORISATION D’INHIBITEURS D’HISTONES DÉACÉTYLASES ET ÉVALUATION DU PHÉNÉTHYL
ISOTHIOCYANATE POUR L’AMÉLIORATION DES TRAITEMENTS DU MÉSOTHÉLIOME PLEURAL
MALIN.
Le mésothéliome pleural malin (MPM) est une tumeur très agressive de la plèvre
principalement liée à l’exposition à l’amiante. Le manque d’efficacité des traitements conventionnels
soulève la nécessité de trouver de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement du MPM.
Mon travail de thèse a consisté à caractériser deux alternatives distinctes pour l’amélioration des
thérapies conventionnelles anti-tumorales.
La première approche visait à améliorer les effets thérapeutiques des inhibiteurs d’histone
déacétylases (iHDAC) en caractérisant un nouveau mode d’administration par leur vectorisation sur
des nanoparticules acido-sensibles. Bien que quatre iHDAC soient actuellement approuvés en
clinique, leurs propriétés pharmacodynamiques et effets secondaires sévères limitent leur utilisation
chez l’homme. Ainsi, durant mon travail de thèse, j’ai caractérisé trois iHDAC vectorisés, in vitro et in
vivo dans un modèle de mésothéliome malin. Ce travail apporte les preuves de l’intérêt thérapeutique
d’une vectorisation des iHDAC pour traiter le MPM.
La seconde approche visait à étudier la molécule naturelle de phénéthyl isothiocyanate
(PEITC) pour l’amélioration du traitement de première ligne du MPM. L’approbation de molécules de
synthèse pour leur application clinique est un frein majeur dans l’avancée de la recherche en santé en
raison de leur toxicité sévère, et il devient prometteur de s’intéresser à des sources naturelles pour
l’obtention de nouveaux composés thérapeutiques. Mon étude a donc consisté en l’évaluation d’une
combinaison de cisplatine-PEITC dans un modèle de MPM, et j’ai montré en quoi cette alternative
pouvait être bénéfique pour le traitement du MPM.
Mots-clé : mésothéliome pleural malin - vectorisation - nanoparticules - libération acidosensible - iHDAC – PEITC.
VECTORIZATION OF HISTONES DEACETYLASES INHIBITORS AND EVALUATION OF PHENETHYL
ISOTHIOCYANATE FOR THE AMELIORATION OF MALIGNANT PLEURAL MESOTHELIOMA CURRENT
TREATMENTS.
Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a very aggressive form of tumor affecting the
pleura, mainly caused by occupational exposure to asbestos. The modest efficiency of current
treatments raises the necessity to develop new therapeutic approaches to treat MPM. My PhD
consisted in the characterization of two distinct alternatives aiming at improving current anti-tumoral
therapies.
The first objective of my work focused on the characterization of the vectorization of three
histone deacetylase inhibitors (HDACi) onto pH-dependent nanoparticles for specific targeting of the
tumor through the enhanced permeability and retention effect (EPR) to improve their therapeutic
effects. Although four HDACi are currently approved for clinical use, their pharmacodynamic
properties and severe side effects limit their application in humans. During my thesis, I characterized
three vectorized HDACi in vitro and in vivo in a malignant mesothelioma model. This work
demonstrates the therapeutic interest of vectorizing HDACi to treat MPM.
The second objective of my PhD was to study the naturally occurring compound phenethyl
isothiocyanate (PEITC) to improve MPM first line treatment. Approval of synthetic molecules for
their clinical use is a major concern given their severe toxicity, and it thus became interesting to
consider natural sources to obtain new therapeutic compounds. This work consisted in the evaluation
of the therapeutic effects of PEITC alone or in combination with cisplatine in a model of MPM, and
demonstrates how this alternative therapy could be beneficial for the treatment of MPM.
Key-words: malignant pleural mesothelioma - vectorization - nanoparticles – pH
dependent liberation - HDACi – PEITC.

Vectorisation d`inhibiteurs d`histones déacétylases et évaluation du

Transcription

Documents pareils

news juillet 2007

COMMANDE DE JOUETS NOËL 2006

Etudes des marqueurs diagnostic et immunologique du

Licence-L3-Maitrise Energie-Rouen

NEWS OCTOBRE 2007

Prise en charge du mésothéliome pleural malin en 2013

FO 17.3 Coordination-des-action-déducation-au

CHRU Lille