THÈSE Aziza IBN HADJ HASSINE EVALUATION DE L`ACTIVITE

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THÈSE Aziza IBN HADJ HASSINE EVALUATION DE L`ACTIVITE
NNT : 2014 EMSE 0740
THÈSE
présentée par
Aziza IBN HADJ HASSINE
pour obtenir le grade de
Docteur de l’École Nationale Supérieure des Mines de Saint-Étienne
Spécialité : Sciences et Génie de l’Environnement
EVALUATION DE L’ACTIVITE OESTROGENIQUE DE
CONTAMINANTS ET DEVELOPPEMENT D’UN BIO-RECEPTEUR
D’AFFINITE POUR LA DETECTION D’UNE XENO-HORMONE
soutenue à Alès, le 23 avril 2014
Membres du jury
Président :
Rapporteurs :
Examinateur(s) :
Directeur(s) de thèse :
Loïc BLUM
Professeur, Directeur de l'ICBMS, Université de
Lyon I
Jean-Louis MARTY
Professeur, Université de Perpignan Via
Domitia,
Serge CHIRON
Directeur de recherche, Université de
Montpellier II
Catherine GONZALEZ Professeur, Ecole des mines d’Alès
Ingrid BAZIN
Chargé de recherche, Ecole des mines d’Alès
Jacques BOURGOIS
Professeur Emérite, Ecole des Mines de SaintEtienne
Remerciements
Je tiens à remercier le Professeur Catherine Gonzalez, mon directeur de thèse, de m’avoir
accueilli au sein de son équipe pour mon stage de master 2 et ensuite pour ma thèse. Vous avez été
toujours présente lors des moments clefs de cette thèse. Merci de votre confiance et votre soutien tant
sur le plan professionnel que personnel.
Je tiens à exprimer ma sincère reconnaissance au Dr Ingrid Bazin, Chargé de recherche à
l’Ecole des mines d’Alès, qui a également joué un rôle important pendant mon master et durant toute
ma thèse. Je tiens à lui exprimer ma profonde gratitude pour sa disponibilité de chaque instant, pour
son aide précieuse et ses conseils avisés durant les expérimentations et la rédaction de ce manuscrit.
Merci Ingrid !
Je tiens à remercier également le Professeur Miguel Lopez-Ferber, Directeur du LGEI de
l’Ecole des mines d’Alès, de m’avoir permis d’effectuer ma thèse au sein de son laboratoire.
J’exprime mes sincères remerciements au Professeur Loïc Blum, Directeur de l'ICBMS,
Université de Lyon I et au Professeur Jean-Louis Marty, Laboratoire IMAGES EA, Université de
Perpignan Via Domitia, pour avoir accepté d’être rapporteurs de ce manuscrit et d’apporter un
éclairage pertinent sur ce travail de recherche. Je souhaite également adresser mes remerciements à Mr
Serge Chiron, Directeur de recherche, Laboratoire HSM, Université Montpellier II et à Mr Jacques
Bourgois, Professeur Emérite, Centre SPIN-Département GSE, Ecole Nationale Supérieure des Mines
de Saint Etienne, pour accepter de juger ce manuscrit et participer au jury de ma soutenance.
Je remercie tout naturellement mes collègues de l’équipe EcoDiag qui m’ont aidé tout au
long de cette thèse et sans qui ce travail ne serait pas ce qu’il est. Je remercie particulièrement Sylvie,
Roro, Christine et Mumu.
Je remercie également tous les autres collaborateurs avec qui j’ai pu travailler durant ma
thèse ainsi que les membres du LGEI que je n’ai pu citer ici.
A Andrey. Tu as été un super collègue et ami tout au long de ce travail de thèse. Chaque jour
j’ai pu compter sur ton aide précieuse. Au moment où j’écris ces remerciements, je me remémore tous
les moments qu’on a pu passer ensemble depuis l’été 2011. Je te souhaite plein de bonheur et de
réussite pour la suite.
A Andrey (toujours le même !), Romain, Imtiaz, Rita et Nibal que j’ai appris à connaître et à
apprécier durant ces 3 années de thèse. Merci pour votre aide et votre soutien dans les moments de
doute. Le travail au sein du laboratoire m’a permis de faire votre rencontre et je n’oublierai pas les
bons moments que nous avons passé ensemble. A bientôt !
A mon Papou. Cette thèse c’est aussi la tienne.
Depuis le début chaque jour, chaque instant tu as été là pour me soutenir. Tu as été là quand
le doute s’installait et tu as toujours eu ton oreille attentive pour m’écouter te raconter les derniers
résultats du jour. Je n’aurai jamais assez de ces quelques lignes dans ce manuscrit pour te remercier
pour ton amour. Je crois savoir que tu es content que tout cela s’achève enfin.
Table des matières
Liste des figures....................................................................................................................................... iv
Liste des Tableaux ....................................................................................................................................v
Liste d’abréviations ................................................................................................................................. vi
Introduction ......................................................................................................................................... 1
Chapitre I : Synthèse bibliographique ................................................................................................ 2
I. Contrôle de la qualité de l’eau et des rejets : micropolluants à activité endocrinienne et législation
européenne............................................................................................................................................... 6
Mécanismes de la perturbation endocrinienne .............................................................................. 12
II.
A.
Fonctionnement du système hormonal ...................................................................................... 12
B.
Récepteurs stéroïdiens sexuels .................................................................................................. 14
1)
Organisation structurelle ....................................................................................................... 14
2)
Récepteur aux oestrogènes : ER ............................................................................................ 16
3)
Mécanismes d’action du récepteur aux oestrogènes.............................................................. 16
Définition des perturbateurs endocriniens : un débat d’actualité .............................................. 18
III.
A.
Mécanismes de la perturbation endocrinienne .......................................................................... 19
B.
Xéno-hormones et récepteur aux oestrogènes ........................................................................... 21
C.
Cas particulier : les xéno-estrogènes et le récepteur à la dioxine .............................................. 25
D.
Action à faible dose et en mélange de perturbateurs endocriniens............................................ 29
Perturbateurs endocriniens : substances d’origines multiples ................................................... 31
IV.
Hormones .................................................................................................................................. 32
A.
1)
Hormones naturelles .............................................................................................................. 32
2)
Hormones synthétiques ......................................................................................................... 33
Xéno-hormones d’origine naturelle ........................................................................................... 33
B.
1)
Phyto-oestrogènes ................................................................................................................. 33
2)
Myco-oestrogènes ................................................................................................................. 33
Xéno-hormones d’origine anthropique...................................................................................... 34
C.
1)
Xéno-hormones d’origines industrielles................................................................................ 34
2)
Produits de consommation courante et d’hygiène corporelle, les parabènes ........................ 37
V. Evaluation des altérations des écosystèmes en lien avec la présence des perturbateurs
endocriniens........................................................................................................................................... 39
A.
Effet sur les invertébrés ............................................................................................................. 39
B.
Poissons/Amphibiens ................................................................................................................ 40
C.
Effet sur les mammifères ........................................................................................................... 42
i
Observations chez l’Homme ..................................................................................................... 43
D.
VI.
Perturbateurs endocriniens dans les effluents et les milieux aquatiques ............................... 44
A.
Présences des parabènes ............................................................................................................ 45
B.
Présence des mycotoxines ......................................................................................................... 46
C.
Autres perturbateurs endocriniens ............................................................................................. 47
VII.
Détection des perturbations endocriniennes et des xéno-hormones. ......................................... 48
Détection de la perturbation endocrinienne de contaminants et d’effluents.............................. 48
A.
1)
Bioessais pour détecter la perturbation endocrinienne .......................................................... 48
a)
Méthodes in vivo ................................................................................................................... 48
b)
Méthodes in vitro................................................................................................................... 49
b.1. Tests de liaison au récepteur................................................................................................... 49
b.2 Tests de prolifération cellulaire. .............................................................................................. 49
b.3 Dosage de l’activité oestrogèno-mimétique; le Yeast Estrogen Screen (YES) et autres tests
utilisant le gène rapporteur. ........................................................................................................... 50
2)
Immunoessais pour détecter la perturbation endocrinienne .................................................. 52
Détection des xéno-hormones avérées ...................................................................................... 55
B.
1)
Méthodes physico-chimiques ................................................................................................ 55
2)
Bioessais, méthodes immunochimiques ................................................................................ 56
3) Détection de la perturbation oestrogénique dans l’environnement et les eaux usées via le
Yeast Estrogen Screen (YES) ........................................................................................................ 58
Biocapteurs pour le suivi des PE dans l’environnement ........................................................... 61
C.
1)
Définition............................................................................................................................... 61
2)
Bio-récepteurs d’affinité........................................................................................................ 63
3)
Bio-récepteurs métaboliques et cellulaires ............................................................................ 65
4)
Application des biocapteurs pour le contrôle environnemental ............................................ 65
Chapitre II : Résultats et discussions ..................................................................................................... 69
I.
Observation et détection des effets biologiques des xéno-oestrogènes ......................................... 70
A. Observation des effets biologiques sur les écosystèmes côtiers tunisiens : étude des
déformations squelettiques chez Aphanius faciatus. ......................................................................... 71
B. Détermination de l’activité oestrogénique d’échantillons réels et de contaminants par le Yeast
Estrogen Screen (YES) ...................................................................................................................... 84
1. Activité oestrogénique d’effluents de stations d’épuration du Sahel tunisien et
présence de parabènes ............................................................................................................... 84
2. Activité oestrogéniques de colorants alimentaires dans le Yeast Estrogen Screen
(YES) .......................................................................................................................................... 102
ii
3.
II.
Activité oestrogénique de colorants textiles dans le Yeast Estrogen Screen (YES)
110
Développement d’un nouveau bio-récepteur d’affinité pour la détection des xéno-oestrogènes 118
Conclusion générale et perspectives.................................................................................................... 126
Références bibliographiques ............................................................................................................... 131
iii
Liste des figures
Figure 1 : Système endocrinien chez l’homme ...................................................................................... 12
Figure 2 : Organisation structurelle des récepteurs stéroïdiens .......................................................... 15
Figure 3: Différentes voies de signalisation cellulaire du récepteur ER et de l’oestradiol. . ............... 17
Figure 4 : Modes d’action des perturbateurs endocriniens .................................................................. 20
Figure 5 : Activation illégitime du récepteur des oestrogènes ............................................................. 21
Figure 6 : Voies de signalisation des oestrogènes médiées par les récepteurs membranaires et
nucléaires. ............................................................................................................................................. 25
Figure 7: Structure et mécanismes moléculaires du récepteur nucléaire AhR. .................................... 26
Figure 8 : Intéraction de la signalisation du récepteur AhR ................................................................ 27
Figure 9:Activation illégitime de la voie de signalisation du ER (récepteur des oestrogènes) par le
récepteur de la dioxine activé AhR. ....................................................................................................... 28
Figure 10: Interaction de la signalisation des dioxines avec les oestrogénes. ..................................... 29
Figure 11 : Quelques exemples de xéno-hormones ............................................................................... 35
Figure 12 : Déformation de la colonne vertébrale chez des médakas âgés de 10 semaines................. 42
Figure 13 : Substances à action endocrinienne dans les eaux résiduaires d’une station d’épuration
allemande .............................................................................................................................................. 47
Figure 14 : Principe du YES (Yeast Estrogen Screen) .......................................................................... 51
Figure 15 : Schéma présentant les 3 principes utilisés pour la technique ELISA ................................ 54
Figure 16 : Schéma du principe de fonctionnement d'un biocapteur .................................................... 61
Figure 17 : Représentation des différents types de bio-récepteurs ....................................................... 62
Figure 18 : Localisation géographique des sites d’échantillonnage .................................................... 72
Figure 19 : Niveau de pollution en métaux et en HAP au niveau des quatre sites étudiés. .................. 73
iv
Liste des Tableaux
Tableau 1 : Substances prioritaires de la DCE et leurs effets endocrinniens. ........................................ 9
Tableau 2 : Relation entre les hormones endocrines et les réponses correspondantes ....................... 13
Tableau 3 : Récepteurs des hormones stéroïdes ................................................................................... 15
Tableau 4 : Cibles des perturbateurs endocriniens ............................................................................. 20
Tableau 5 : Structures des trois catégories de ligands du récepteur aux oestrogènes humains. .......... 22
Tableau 6 : Classes de perturbateurs endocriniens. Archives des maladies professionnelles et de
l’environnement .................................................................................................................................... 32
Tableau 7 : Sources de perturbateurs endocriniens entrant dans les eaux environnementales ........... 45
Tableau 8 : Comparaison des limites de détection, des valeurs de EC50 et des durées des essais pour
les différents tests in vitro. ..................................................................................................................... 52
Tableau 9 : Techniques d'analyse utilisées pour la quantification des différentes classes de
perturbateurs endocriniens dans l'environnement aquatique ............................................................... 55
Tableau 10 : Exemples de kits commerciaux. ....................................................................................... 57
Tableau 11 : Niveaux des EEQ trouvés dans différentes matrices environnementales analysées dans de
nombreux pays en utilisant le test in vitro YES ..................................................................................... 60
Tableau 12 : Biocapteurs électrochimiques pour l'analyse environnementale. ................................... 63
Tableau 13 : Biocapteurs électrochimiques pour l'analyse environnementale. ................................... 66
Tableau 14 : Liste des polluants organiques analysés par les systèmes RIANA ou AWACSS .............. 68
Tableau 15 : Activité oestrogénique exprimée en équivalent oestradiol (EEQ) ................................... 87
Tableau 16 : Activité oestrogénique relative des cinq colorants alimentaires (1g/l). ......................... 103
v
Liste d’abréviations
Abs : anticorps
AChE : Acétylcholinestérase
Ags : antigènes
AhR : récepteur de la dioxine et des hydrocarbures aromatiques
AMPc : adénosine mono phosphate cyclique
PAL : phosphatase alcaline
AP : Alkylphénols
APCI : Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique
APE : Alkylphénols Polyéthoxylates
AR : récepteurs des androgènes
Arnt : Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator
BaP : Benzo(a)pyrène
BChE : Butyrylcholinesterase
bHLH-PAS : Basic Helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim
BLYES : Bioluminescent Yeast Assay
BPA : bisphénol A
BuP : butyl parabène
BzP : benzyl parabène
CEVAM : Centre européen pour la validation de méthodes alternatives
CFC : chlorofluocarbones
CIRC : Centre international de recherche sur le cancer
CMR : Cancerigène, Mutagène, Reprotoxique
CPRG : chlorophénol rouge-beta-D-galactopyranoside
DAD : détection à barrette de diodes
DBD : DNA Binding Domain
DCE : Directive Cadre sur l’eau
DDD : dichlorodiphényldichloroéthane
4,4’-DDE : 4,4'- Dichlorodiphényldichloroéthane
DDT : 4,4'-(2,2,2-trichloroethane-1,1-diyl)bis(chlorobenzene)
DES : diéthylstilbestrol
DHEA : déhydroépiandrostérone
DHT : dihydrotestostérone
DON : déoxynivalénol
DRE : éléments de réponse à la dioxine
E1 : oestrone
E102 : tartazine
E127 : érytrosine B
E2 : oestradiol
E3 : oestriol
E310 : propyl gallate
EAP : éthoxylates d’alkylphénol
EDSTAC : Agence de protection de l’environnement des USA
EE2 : éthinylestradiol
EEQ : Equivalent Estradiol
EFSA : Autorité européenne de sécurité des aliments
EGF : epidermal growth factor
vi
ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
ENP : éthoxylates de nonylphénol
EOP : éthoxylates d’octylphénol
ER α, β et γ : récepteur aux oestrogènes α, β et γ
ER-CALUX : Chemical-Activated LUciferase gene eXpression ceU bioassay system
ERE : élément de réponse aux oestrogènes
ESI : Ionisation Electrospray
EtP : éthyl parabène
FI-lA : Flow-injection immunoassay
GC : chromatographie en phase gazeuse
GFP : green fluorescent protein
GR : récepteurs glucocorticoïdes
HAP : hydrocarbures polyaromariques
hER : récepteur humain des estrogène
HRE : Hormone Receptor Element
HRMS : spectrométrie de masse haute résolution
IC : chromatographie ionique
IGF-1 : insulin-like growth factor
ITP : Inositol triphosphate
IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry
LBD : Ligand Binding Domain
LC : chromatographie en phase liquide
LH : hormone lutéinisante
LOD : limite de détection
LOQ : limite de quantification
LYES : Lyticase assisted Yeast Estrogen Screen
MAP kinase : Mitogen-activated protein kinase
MeP : méthyl parabène
MIP : Polymères à Empreinte Moléculaire
MPA : medroxyprogesterone acetate
MS : spectrométrie de masse
MS/MS : spectrométrie de masse en tandem
NLS : localisation nucléaire
NP : nonylphénol
NQE : normes de qualité environnementale
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
OTA : ochratoxine A
PAE : Esters de l’acide phtalique
PBDE : Ethers diphényles polybromés
PCB : polychlorobiphényles
PCDD : Dibenzo-p dioxines polychlorées
PCDF : Dibenzofuranes polychlorés
PE : perturbateur endocrinien
POP : polluants organiques persistants
PPSP : produits pharmaceutiques et de soins personnels
PR : récepteurs de la progestérone
PrP : propyl parabène
REACH : Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals
vii
RIA : Radioimmunoasay
RNs : récepteurs nucléaires stéroïdiens
RXR : récepteur X des rétinoïdes
SERM : Selective Estrogen Receptor Modulator
SPR : Surface plasmon résonance
STEP : Station d'épuration des eaux usées
T : testostérone
TBBA :Tetrabromobisphénol A
TBT : tributylétain
ThR : récepteur de l'hormone de la thyroïde
TIRF : Total internal reflection fluorescence microscope
UV : ultra-violet
Vg : vitellogénine
XRE : éléments de réponse aux xénobiotiques
YES : Yeast Estrogen Screen
viii
1
Introduction
Depuis plusieurs années, les préoccupations concernant les effets de la pollution,
générée par les activités anthropiques, sur la santé humaine et animale s’immiscent de plus en
plus au cœur des débats politiques et scientifiques. En particulier, la prise de conscience des
autorités sanitaires, des gouvernements et du grand public, concernant la présence de
substances environnementales susceptibles de perturber le système endocrinien n’a cessé de
progresser depuis le début des années 1990. D’origine naturelle ou synthétique, les
perturbateurs endocriniens (PE) peuvent altérer le fonctionnement du système hormonal des
animaux et des Hommes. Ces substances pourraient donc induire des effets néfastes sur la
santé d’un organisme, de sa descendance, ou d’une population, et constituer un danger
sanitaire qui est encore aujourd’hui mal évalué.
Même si les effets néfastes des PE sur la santé ne sont que soupçonnés, des
programmes de recherche et des groupes de travail ont été mis en place afin d’évaluer
l’étendue des problèmes relatifs aux PE, en vue de développer des stratégies de prévention et
d’intervention. Ainsi, l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé) a chargé l’IPCS
(International Programm on Chemical Safety) de préparer un rapport décrivant l’évaluation
globale de la littérature scientifique sur les PE. L’US-EPA (Agence de Protection Américaine
de l’Environnement) et l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement
Economiques) ont également établi des programmes ayant comme objectifs : (i) d’accroître
l’échange d’informations et la coordination des activités de recherche relatifs aux PE; (ii)
d’élaborer et de réviser les lignes directrices pour les essais visant à détecter les PE; (iii) de
développer des tests de criblage robustes, reproductibles et pertinents, capables de détecter les
composés ayant une activité œstrogénique, anti-œstrogénique, androgénique ou antiandrogénique; (iv) et d’harmoniser les méthodes de caractérisation des dangers et des risques.
De ces travaux sont issues les premières recommandations ("Guidelines") 407 de l’OCDE
datant de 1995 qui portent sur l’étude des effets des diverses substances chimiques sur un
modèle animal (rongeur). Cependant, ces tests ne sont toujours pas homologués pour détecter
les effets des PE du fait de leur complexité d’actions (courbes dose-réponse spécifiques,
impact des mélanges).
De ce fait, surveiller les risques liés aux substances chimiques, en particulier les
polluants qui provoquent des perturbations endocriniennes, est un des enjeux importants de la
1
mise en œuvre des réglementations. En témoigne le récent rapport de l'office parlementaire du
sénat qui affirme que « Dans tous les cas, l'adoption de tests reconnus est un point
fondamental. Il permettra de faire évoluer la législation européenne en la matière et de
prendre pleinement en compte l'enjeu des perturbateurs endocriniens pour la santé et
l'environnement par les agences compétentes. » (http://www.senat.fr/rap/r10-765/r1076519.html). Il est également recommandé de poursuivre la démarche d’investigation sur les
effets des xéno-hormones à moyen et long terme.
Aujourd'hui, le sujet des perturbateurs endocriniens reste largement focalisé sur les
problèmes de reproduction, notamment chez certaines espèces de poissons, et les problèmes
liés à certains cancers chez l’homme. Classiquement, un perturbateur endocrinien est « une
substance exogène qui interfère avec la synthèse, la sécrétion, la libération, le transport, le
métabolisme, la fixation, l’action ou l’élimination des hormones naturelles du corps
responsables de l’homéostasie, de la reproduction et du développement ». Ces substances
chimiques d'origine naturelle ou artificielle étrangères à l'organisme, pouvant interférer avec
l’organisme, sont dits xéno-hormones. Parmi ces dernières, se retrouvent les xéno-estrogènes
qui miment l’effet de l’oestradiol et qui peuvent se lier aux récepteurs cellulaires de la même
façon que les oestrogènes. Ces xéno-estrogènes, de nature très variée, peuvent être d’origine
naturelle (phyto-oestrogène, myco-estrogène) et d’origine anthropique (pesticides, produits
d’origine industrielle, produits pharmaceutiques et de soin corporels,…). Ces substances ont
des effets oestrogéniques démontrés via des tests in vitro et in vivo.
Les tests in vitro sont basés sur des cellules de mammifères, des levures
génétiquement transformées répondant spécifiquement à une perturbation oestrogénique. Les
tests in vitro les plus utilisés sont l’E-screen (cellule MCF7 exprimant le récepteur alpha aux
oestrogénes) et le Yeast Estrogen Screen (levure Saccharomyces cerevisiae transfectée avec le
gène codant pour le récepteur humain aux œstrogènes). Cependant, un problème majeur, dans
l'utilisation de ces tests in vitro pour analyser les échantillons environnementaux, est la
présence de composés inhibiteurs/cytotoxiques. Ces échantillons sont, en effet, souvent
contaminés par des substances autres que les xéno-estrogènes qui peuvent interférer avec la
croissance et la viabilité des cellules animales. En revanche cette cytotoxicité est moindre
pour les levures, ce qui leur confère une meilleure fiabilité pour le dosage de l’activité
oestrogéno-mimétique des échantillons environnementaux (eaux usées, eaux de surface).
2
Concernant le dosage de l’activité oestrogénique par des tests in vivo, les modèles
vivants utilisés sont principalement des rongeurs (poids des organes génitaux) et des poissons
(taux de production de la protéine vitellogénine, biomarqueur de l’activité oestrogénique). Les
essais in vivo présentent l’avantage de mesurer l’impact réel de la perturbation (effet additif,
synergique, inhibiteur etc..) sur des organismes vivants. Ils permettent d’intégrer le
métabolisme et donc d’étudier la dégradation d’un produit actif ou la transformation d’un
produit inactif en produit actif. Deux types de tests in vivo existent pour mesurer une activité
oestrogénique ou androgénique : le test utérotrophique chez la souris ou la rate et le test de
Hershberger chez le rat.
Concernant la préservation de la qualité des milieux aquatiques, la DCE (2000) a fixé
un certain nombre de polluants (substances prioritaires) à surveiller en précisant des normes
de qualité environnementales en fonction des masses d’eau. Cependant, la DCE ne prend pas
en compte la mesure des effets potentiels des substances (notamment l’effet oestrogénique)
même si ces substances sont classées CMR (Cancérogènes, Mutagènes et toxiques pour la
Reproduction) et PBT (Persistantes, Bio-accumulables et Toxiques).
La détection de ces substances prioritaires s’effectue classiquement par des méthodes
d’analyse physico-chimique de laboratoire qui répondent aux exigences des seuils de qualité
environnementale mais ne sont pas compatibles avec des systèmes de gestion et d’alerte sur
site. Par contre, dans une optique d’anticipation de pollutions accidentelles ou de dégradation
du milieu aquatique, des systèmes tels que les biocapteurs sont tout à fait pertinents et peuvent
apporter des informations complémentaires aux mesures réalisées en laboratoire. Ces
dernières années, les recherches portent sur le développement de biocapteurs pour l’analyse
de polluants dans des matrices environnementales (triazines, isoproturon, DDT et ses dérivés,
bisphénol A, nonylphénol,…). Ces biocapteurs associent un biorécepteur, espèce biologique
permettant la reconnaissance sélective de la molécule cible, et un transducteur permettant de
détecter et/ou de quantifier les substances dans les eaux (eaux potables, eaux de surface
notamment).
Dans ce contexte, ce travail de thèse aborde plusieurs approches permettant d’évaluer
la perturbation oestrogénique (observation in vivo et mesure in vitro avec le YES) et de
détecter des xéno-estrogènes spécifiquement (biorécepteur affine). Cette thèse s’articule
autour de 3 volets d’étude :
3
① Un premier volet porte sur l’investigation des effets des xéno-hormones sur les
écosystèmes en identifiant, tout d’abord, l’impact des perturbateurs oestrogéniques sur les
malformations squelettiques observées chez une espèce de poisson autochtone (aphanius
faciatus) du Golfe de Gabes (Tunisie). Parallèlement, les principaux polluants chimiques
(métaux, HAP) liés potentiellement à cette perturbation ont été recherchés afin de corréler
leur présence aux activités anthropiques (urbaines, agricoles et industrielles) présentes sur le
site étudié.
② Un deuxième volet se focalise sur la quantification par HPLC de parabènes, xénooestrogènes connus, soupçonnés de provoquer certains cancers, et sur l’évaluation de leurs
effets en utilisant le Yeast Estrogen Screen (YES). Le YES permet d’évaluer l’activité
oestrogénique des matrices complexes comme les effluents de station d’épuration. La
distribution des parabènes entre différents compartiments/fractions (eau, boues, MES) et
l’activité oestrogénique au niveau de stations d'épuration tunisiennes ont été analysées en
combinant des évaluations chimiques et biologiques.
Dans l’optique de mettre en évidence les effets oestrogéniques de substances
d’origines industrielles, d’autres composés (colorants textiles et alimentaires) ont été testés en
utilisant le YES. En effet, ces colorants sont susceptibles d’être présents dans des effluents
industriels et peuvent impacter le milieu récepteur, notamment pour les pays où l’industrie
textile est fortement développée (Pays du Maghreb, Inde,…).
③ Enfin, la dernière partie du manuscrit est consacrée à la mise au point d’un outil
bio-analytique de substance spécifique. Cette partie est novatrice car elle porte sur le
développement d’un bio-récepteur de nature peptidique pour détecter des myco-oestrogènes,
comme l’ochratoxine A. Cette mycotoxine étant difficilement immunogène, il n’existe que de
rare anticorps spécifiquement dirigés contre cette molécule. Les (bio)récepteurs alternatifs
développés jusqu’à présent sont des aptamères ADN et des MIP (polymère à empreinte
moléculaire) qui ont une affinité pour la mycotoxine.
Ce manuscrit est classiquement structuré et comprend :
- Un premier chapitre présentant une synthèse bibliographique qui décrit les
mécanismes de la perturbation endocrinienne, les perturbateurs endocriniens (xéno-hormones
d’origine naturelle et anthropique), l’état de l’art sur les altérations des écosystèmes dues aux
4
PE et les différentes méthodes de détection des effets et des xéno-hormones (effets
oestrogéniques, biocapteurs). Un focus sur les parabènes, les mycotoxines et les colorants
permet d’établir un constat sur leur présence dans les eaux.
- Un second chapitre basé sur 5 publications ouvre sur une discussion à partir des
principaux résultats concernant la mesure des effets oestrogéniques in vivo et in vitro et le
développement d’un biorécepteur affine pour l’ochratoxine A. Par conséquent, la partie
« matériel et méthodes » est incluse dans chacun des articles.
- Une conclusion met en valeur les résultats majeurs et aborde les perspectives de ce
travail de thèse.
5
1
Chapitre I : Synthèse bibliographique
2
5
I.
Contrôle de la qualité de l’eau et des rejets : micropolluants
à activité endocrinienne et législation européenne.
Il est généralement admis qu’un polluant est «un altéragène (c'est-à-dire un composé
étranger aux cycles vitaux des organismes ou xénobiotiques) biologique, physique ou
chimique, qui au-delà d'un certain seuil, et parfois dans certaines conditions (potentialisation),
développe des impacts négatifs sur tout ou partie d'un écosystème ou de l'Environnement en
général» (AFNOR). On parlera de micropolluants lorsque ces substances sont retrouvées à des
concentrations de l’ordre du microgramme par litre, pouvant diffuser au sein de différents
compartiments des écosystèmes et impacter les organismes vivants même à de faibles teneurs.
Les polluants chimiques peuvent se diviser en 2 groupes :
- Les polluants organiques comme les pesticides (organochlorés tel que le DDT), les
polychlorobiphényles (PCB), les hydrocarbures polyaromatiques (HAP), les dioxines et
furannes, les chlorofluocarbones (CFC) et les phtalates.
- Les polluants inorganiques comme les métaux. Les plus fréquemment rencontrés
dans l’environnement sont le cadmium, l’arsenic, le cuivre, le plomb etc…
Les micropolluants présents dans l’eau correspondent à une multitude de composés
dont les effets sur les organismes vivants peuvent être toxiques à de très faibles concentrations
(inférieures ou de l’ordre du microgramme par litre). La contamination des eaux de surface
par ces polluants est due essentiellement à des rejets directs (égouts non raccordés à un
système d’épuration, par exemple), à un dysfonctionnement des stations d’épuration, à des
rejets industriels ou au ruissellement de l’eau sur des surfaces contaminées. Les eaux
souterraines sont, quant à elles, potentiellement contaminées suite à l’infiltration des
micropolluants dans le sol et le sous-sol. On distingue les apports ponctuels où les sources de
pollution sont clairement identifiées (rejets industriels, pollution accidentelle, rejets des eaux
usées domestiques), des sources diffuses liées principalement aux activités agricoles,
touristiques et aux retombées atmosphériques. Les effets des micropolluants sur les
écosystèmes aquatiques sont très variables, car ils ne dépendent pas uniquement du niveau de
concentration dans l’eau, mais également d’autres caractéristiques, comme par exemple, le
mode de pénétration dans les organismes, leurs actions sur des systèmes physiologiques etc…
6
Pour protéger les ressources (eau de surface ou eau souterraine), des actions ont été
engagées au travers de la loi sur l’eau du 3 Janvier 1992 (LOI n° 92-3 du 3 janvier 1992 sur
l'eau, JORF n°3 du 4 janvier 1992 page 187 http://www.legifrance.gouv.fr) puis plus
récemment, la Directive Cadre sur l’eau (DCE) a été élargie à l’échelle européenne un cadre
réglementaire pour assurer la préservation des écosystèmes aquatiques et le maintien de la
qualité des eaux (2000/60/CE du 23 octobre 2000). Ces différentes actions ciblant au départ
une réduction des flux de polluants organiques ont été étendues à la réduction des rejets de
substances toxiques et à la limitation d’émission des micropolluants comme les pesticides ou
des macropolluants tels que le phosphore ou l’azote jusqu’à aboutir à la DCE établissant un
cadre pour atteindre un bon état des eaux en 2015. Ce cadre vise également une réduction
progressive des rejets et des émissions de substances prioritaires jusqu’à une suppression de
ces substances d’ici 2021. Cette directive établit des normes de qualité environnementale
(NQE) et limite la concentration de trente-trois substances et de huit autres polluants dans les
eaux de surface (tableau 1). Cette liste comprend onze substances dangereuses prioritaires, qui
sont toxiques, persistantes et qui s’accumulent dans les tissus animaux et végétaux. Ces
substances présentent un risque à long terme, il s’agit plus particulièrement des métaux
lourds, des pesticides et des hydrocarbures.
Cependant, la DCE ne prend pas encore en compte l’effet de ces substances
prioritaires sur les écosystèmes et les humains notamment la perturbation endocrinienne. En
effet, la perturbation endocrinienne correspond à l’altération de la fonction endocrine par un
agent exogène qui interfère avec la production, le métabolisme, le transport, la libération, la
liaison, l’action ou l’élimination des ligands naturels responsables du maintien de
l’homéostasie et de la régulation du développement de l’organisme. Or, comme présenté
tableau 1, certaines substances prioritaires, déjà soumises à des interdictions ou prises en
compte dans des réglementations européennes via la législation sur les pesticides, via la
Directive Cadre et via la législation REACH (en référence à leur caractère CMR :
Cancerigène, Mutagène, Reprotoxique), ont potentiellement des effets sur le système
endocrinien. De ce fait, dans le cadre de la «Stratégie communautaire concernant les
perturbateurs endocriniens», la Commission Européenne a constitué une liste de 60
substances prioritaires parmi plus de 550 suspectées de perturber le système endocrinien. De
la même façon, 21 substances sur les 33 notifiées par la DCE ont été identifiées comme
perturbateurs endocriniens potentiels (tableau 1). Mais la question de l’évaluation de l’impact
des polluants ayant des effets perturbateurs endocriniens dans l’environnement est soulevée
7
dans le cadre des réglementations récentes. En effet, lors de la Conférence environnementale
de 2012, le gouvernement français s’est engagé à élaborer une stratégie nationale sur les
perturbateurs endocriniens et le Parlement Européen « envisage la mise en œuvre d’une
nouvelle législation au plus tard en Juin 2015 afin de réexaminer de manière approfondie les
règles actuelles relatives aux perturbateurs endocriniens » (Résolution du Parlement
européen du 14 mars 2013 sur la protection de la santé publique contre les perturbateurs
endocriniens (2012/2066(INI)), http://www.europarl.europa.eu ). Des études complémentaires
sont actuellement en cours pour permettre à la Commission d’étudier la prise en compte de
ces composés dans les futures règlementations.
8
Tableau 1 : Substances prioritaires de la DCE et leurs effets endocrinniens.
N°UE
(1)
N°UE
DCE
(2)
Nom de la substance
Effet perturbateur endocrinien
Référence
Alachlore
N°CAS
(Chermical
Abstracts
Service)
15972-60-8
1
Liaison compétitive aux récepteurs d'oestrogènes et de la progestérone. Interactions avec le récepteur cellulaire
pregnane X, interférant avec la production des enzymes responsables du métabolisme des hormones stéroïdes
Mikamo et al., 2003
Cocco et al., 2002
3
2
Anthracène
120-12-7
Liaison avec le récepteur des oestrogènes
Schneider et al., 1976
Pasqualini et al., 1990
131
3
Atrazine
1912-24-9
L'inhibition des androgènes avec un faible effet oestrogénique.
Perturbation du contrôle hypothalamique au niveau d'hormones et de la prolactine. Induction de l'activité de
l'aromatase
Dommages au niveau des glandes surrénales dommages et réduction du métabolisme des stéroïdes.
Cocco et al., 2002
Cooper et al., 2000
Hayes et al., 2003
7
4
Benzène
71-43-2
5
Pentabromodiphényéther
32534-81-9
Altérations du fonctionnement du système thyroïdien
Petrović et al., 2001
6
Cadmium et ses
composés
7440-43-9
Le cadmium est un puissant oestrogène et androgène in vivo et in vitro, il interagit directement avec les récepteurs
des oestrogènes et des androgènes
Takiguchi et al., 2005
7
C 10-13-chloroalcanes
85535-84-8
8
9
Chlorfenviraphos
Chlorpyrifos
470-90-6
2921-88-2
Faible effet oestrogénique
Activité antagoniste aux androgènes.
Vinggaard et al., 1999
Kang et al., 2004
10
11
101-06-2
75-09-2 _
I 17-81-7
Induction des niveaux sériques de la testostérone
Ge et al., 2007
13
1,2-dichluroéthane
Dichlorométhane
Di(2-éthylhexyl)phtalate
(DEHP).
Diuron
330-54-1
Activité inhibitrice des androgènes
Thibaut et al., 2004
14
Endosulfan
115-29-7
Liaison compétitive aux récepteurs d'androgènes, activité oestrogénique, stimulation de la production du récepteur
des oestrogènes, inhibition de l'activité de l'aromatase
Andersen et al., 2002
Lemaire et al., 2004
35
Fluoranthène
206-44-0
Agoniste du récepteur des oestrogènes
Plíšková et al., 2005
Vondráček et al., 2002
83
16
Hexachlorobenzène
118-74-1
Altération du récepteur des oestrogènes et du Src/HER1
Peña et al., 2012
84
17
Hexachlorobutadiene
87-68-3
Néphrotoxique
Green et al., 2003
85
18
Hexachlorocyclohexane
008-73-1
Réduction du cycle œstral et des concentrations de progestérone. Augmentation des concentrations sériques
d'insuline et d'oestradiol, diminution des concentrations de thyroxine. Liaison compétitive aux récepteurs aux
androgènes, oestrogènes et progestérone.
Rawlings et al., 1998
Beard et al., 1999
12
59
62
76
9
N°UE
(1)
92
N°UE
DCE
(2)
19
Isoproturon
N°CAS
(Chermical
Abstracts
Service)
34123-59-6
Activation du récepteur cellulaire Pregnane X
Lemaire et al., 2006
20
21
Plomb et ses composés
Mercure et ses composés
Naphthalène
7439-92,-1
7439-97-6
91-20-3
Interfère avec la spermatogenèse et influence les niveaux des hormones reproductives physiologiques
Iavicoli et al., 2009
Iavicoli et al., 2009
23
Nickel et ses composés
7440-02-0
Erα agoniste
Darbre, 2006
Nonylphénols
25154-52-3
Activation du récepteur cellulaire Pregnane X
Masuyama et al., 2000
Octylphénol
Pentachlorobenzène
Pentachlorophénol
1806-26-4
608-93-5
87-86-5
Xéno-oestrogène
Inhibe la production des hormones thyroïdes
Faible activité estrogénique et anti-androgénique
Oehlmann et al., 2000
Cocco et al., 2002
Cocco et al., 2002
Benzo(a)pyrène
50-32-S
Changements dans l'expression des gènes stéroïdogènes des testicules chez les rats à divers stades de développement
Liang et al., 2012
Benzo(b)fluoranthène
205-99-2
AhR agoniste
Kummer et al., 2001
Benzo(g,h,i)pérylène
Indéno(1,2,3-cd)pyrène
207-08-9
191-24-2
193-39-5
Simazine
Composés du
tributylétain
Trichlorobenzènes
(tous les isomeres)
Trichlorométhane
121-34-9
M-73-3
Induction de l'activité de l'aromatase et augmentation de la production des oestrogènes
Inhibe de façon compétitive la conversion des androgènes en oestrogènes. Inhibe la production de certains
androgènes
Sanderson et al., 2000
Thibaut et al., 2004
Trifluraline
1582-09-8
Interagit avec le récepteur cellulaire de pregnane X, interférant avec la production d'enzymes responsables du
métabolisme des hormones stéroïdes.
Eriko et al., 2003
96
24
101
106
25
26
27
29
30
117
118
31
23
32
124
33
46
1
1
2
71
3
77
4
130
5
Nom de la substance
Effet perturbateur endocrinien
Référence
1200248-1
47.66-3
DDT total
Sans objet
p-p’-DDT
50-29-3
Aldrine
309-00-2
Dieldrine
60-57-1
Endrine
72-20-8
Isodrine
465-73-6
Imite l'action des oestrogènes, antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en
inhibant la transcription génétique qu'ils induisent. Favorise la prolifération des cellules sensibles aux androgènes.
Imite les actions des oestrogènes indirectement en stimulant la production de leurs récepteurs
Antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en inhibant la transcription génétique
qu'ils induisent
Antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en inhibant la transcription génétique
qu'ils induisent
Imite les actions des oestrogènes indirectement en stimulant la production de leurs récepteurs
Antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en inhibant la transcription génétique
qu'ils induisent
10
McKinlay et al., 2008
Lemaire et al., 2004
Lemaire et al., 2004
Lemaire et al., 2004
N°UE
(1)
N°UE
DCE
(2)
13
111
6
7
121
8
Nom de la substance
Tétrachlorure de carbone
Tétrachloroéthylène
Trichloréthylène
N°CAS
(Chermical
Abstracts
Service)
56-23-5
Effet perturbateur endocrinien
Référence
Perturbateur endocrinien non listé
INERIS
127-18-4
79-01-6
(1) N° UE : nombre mentionné correspondant au classement par ordre alphabétique issu de la communication de la Commission européenne au Conseil du 22 juin 1982.
(2) N ° UE DCE : nombre mentionné corresponantd au classement issu de l'annexe X de la DCE
11
Pour mieux comprendre les enjeux qui résident dans l’établissement de critères
scientifiques permettant d’identifier les substances dites « perturbateur endocrinien » en vue
de leur éventuelle interdiction, il convient d’expliquer succinctement le fonctionnement du
système hormonal.
II.
Mécanismes de la perturbation endocrinienne
A. Fonctionnement du système hormonal
Les animaux pluricellulaires possèdent deux mécanismes de coordination des activités
des tissus et des organes : la communication nerveuse et la communication hormonale. La
première sert à coordonner les mouvements grâce à la propagation de signaux électriques
entre cellules nerveuses, la seconde, par un transfert de signaux chimiques, permet de réguler
l'activité d'un ou plusieurs organes ou organismes en modifiant le comportement et les
interactions.
Figure 1 : Système endocrinien chez l’homme
Ces substances chimiques « médiatrices » dites hormones sont sécrétées par les
glandes endocrines et sont transportées par le système de circulation générale (le sang) pour
exercer une action spécifique sur des cellules cibles. Les glandes endocrines (figure 1), telles
que la thyroïde, les gonades, l’hypophyse, les surrénales, le pancréas endocrine, sécrètent des
hormones comme la thyroxine, l’oestrogène et la testostérone, l’adrénaline, l’insuline. Ces
substances sont des messagers chimiques qui, en se liant à des récepteurs avec une grande
affinité, vont induire des réactions spécifiques et réguler la croissance, le métabolisme, le
12
comportement et le développement, incluant le développement sexuel et la reproduction. Le
tableau 2 présente les différentes fonctions nécessitant des hormones pour développer des
actions vitales pour l'organisme.
Tableau 2 : Relation entre les hormones endocrines et les réponses correspondantes (Ministère de
l’Ecologie et du Développement Durable, Décembre 2003)
Fonctions
Reproduction
Hormones
Androgènes, oestrogènes,
progestérone, hormones
hypophysaires (LH, FSH,
prolactine).
Croissance et
développement
Hormones de croissance,
hormones thyroïdiennes,
insuline, glucocorticoïde,
androgènes, oestrogènes,
progestérone.
Vasopressine aldostérone,
hormone parathyroïdienne
progestérone.
Maintien de
l'environnement interne
Disponibilité énergétique
Insuline, glucagon, hormones
thyroïdiennes.
Réponses
Production de gamètes, facteurs
de croissance, lactation,
gestation.
Instauration des caractéristiques
secondaires et du comportement
sexuel.
Large action sur la croissance.
Contrôle du volume et de la
pression. Contrôle de la balance
des électrolytes. Contrôle des os,
des muscles et de la graisse.
Régulation du métabolisme.
Les organes effecteurs, organes cibles de l’activité hormonale, possèdent, au niveau de
leur cellule, des molécules fixant l’hormone (récepteurs spécifiques de l’hormone). Les
cellules possèdent différents récepteurs et peuvent donc reconnaître plusieurs types
d’hormone.
Ces récepteurs peuvent être présents sur la membrane d'une cellule (récepteurs
membranaires). C'est le cas des récepteurs d'hormones peptidiques qui sont souvent des
protéines transmembranaires de type récepteurs couplés aux protéines G, récepteurs sensoriels
ou récepteurs ionotropes. Ces récepteurs peuvent produire trois types de réponse cellulaire :
a- une réponse électrophysiologique correspondant aux récepteurs canaux-ioniques,
b- une réponse métabolique responsable de modifications post-traductionnelles des
protéines,
c- une réponse transcriptionnelle activant ou inhibant l'expression de certains gènes.
13
Généralement ces types de réponse se traduisent par la production d'un ou plusieurs
intermédiaires intracellulaires dits messagers secondaires comme l’adénosine monophosphate
cyclique ou AMP cyclique (AMPc) ou par l’intermédiaire de cascades de phosphorylations.
Les récepteurs peuvent être des récepteurs nucléaires intervenant dans la modulation de la
transcription des gènes impliqués dans la prolifération, la différenciation cellulaire, le
développement, l’homéostasie et le métabolisme (Gronemeyer et al 2004). Ce sont des
protéines solubles activées par la liaison de la molécule informative. Ils sont normalement
localisés dans le noyau. Mais il existe des exceptions comme pour les récepteurs stéroïdiens
(récepteurs des glucocorticoïdes, des oestrogènes ou des androgènes) qui sont situés dans le
cytosol en absence de ligand et la liaison de ce dernier induit la translocation du récepteur
dans le noyau.
B. Récepteurs stéroïdiens sexuels
1) Organisation structurelle
Les stéroïdes participent au développement des vertébrés et à l’accomplissement de
plusieurs fonctions physiologiques. Les récepteurs des hormones stéroïdiennes sont des
récepteurs nucléaires et sont constitués de trois sections formant les principales régions du
récepteur thyroïdien comme illustré figure 2 (Bain et al., 2007) :
- La région N-terminal (A-B) comprend 20 acides aminés pour le récepteur de la vitamine
D et 600 acides aminés pour celui des minéralo-corticoïdes. Cette région contient un
activateur de la transcription AF1 (Activation Function) agissant de façon constitutive
indépendamment du ligand.
- La région C, domaine de liaison à l’ADN, dit le DBD (DNA Binding Domain),
comprend 8 cystéines en position stable qui permettent la formation de deux structures en
« doigts de zinc ». Ce domaine est essentiel à l'activation de la transcription. La fixation du
ligand entraîne un changement dans la configuration du récepteur permettant la liaison à une
séquence HRE (Hormone Receptor Element) sur le gène cible. La spécificité de liaison du
récepteur à son HRE est déterminée par le premier domaine protéique en « doigt de zinc ». Le
second domaine en « doigt de zinc » permet la dimérisation du récepteur.
- La région D, située entre le domaine de liaison à l’ADN et la région E, correspond au
domaine de fixation de l'hormone, et permet le contrôle du transit du récepteur à partir du
14
cytoplasme où il est synthétisé, vers le noyau. Cette région est également un site de rotation
permettant des modifications spatiales.
- La région E/F, domaine de liaison à l'hormone, le LBD (Ligand Binding Domain) est
située à l'extrémité carbonylée du récepteur. Cette région permet, outre la liaison à l'hormone,
la dimérisation des récepteurs et l'activation de la transcription par une zone fonctionnelle
appelée AF2. C'est aussi l'endroit de liaison aux protéines chaperonnes. Contrairement à AF1,
l'activité de l’AF2 dépend totalement de la fixation de l'hormone au récepteur (Drummond
2006).
Figure 2 : Organisation structurelle des récepteurs stéroïdiens
Les récepteurs stéroïdiens sont divisés en trois groupes (tableau 3) en fonction des
hormones qui se lient comme les oestrogènes, la progestérone, la testostérone, les
glucocorticoïdes et les minéralo-corticoïdes.
Tableau 3 : Récepteurs des hormones stéroïdes
Sous Famille : Récepteur des hormones stéroïdes
1- Récepteur des oestrogènes-α (ERα; NR3A1)
Groupe A : Récepteur des oestrogènes
(hormone sexuelle : oestrogènes)
2- Récepteur des oestrogènes-β (ERβ; NR3A2)
Groupe B : récepteur liés aux récepteurs des
oestrogènes
Groupe C : Récepteurs des 3-ketostéroïdes
1- Récepteur liés aux récepteurs des oestrogènes-α
(ERRα; NR3B1)
2- Récepteur liés aux récepteurs des oestrogènes-β
(ERRβ; NR3B2)
3- Récepteur liés aux récepteurs des oestrogènes-γ
(ERRγ; NR3B3)
1- Récepteur des glucocorticoïdes (GR; NR3C1)
(Cortisol)
2- Récepteur des minéralocorticoïdes (MR;
NR3C2) (Aldostérone)
3- Récepteur de la progestérone (PR; NR3C3)
(hormone sexuelle : Progestérone)
4- Récepteur des androgènes (AR; NR3C4)
(hormone sexuelle : Testostérone
15
2) Récepteur aux oestrogènes : ER
Le récepteur aux oestrogènes (ER) est un membre de la famille des récepteurs nucléaires
dont la fonction, médiée par l’oestradiol, est l’activation de la transcription de gènes
impliqués notamment dans la croissance, la différenciation cellulaire et les fonctions
reproductrices. Il existe trois formes de récepteur aux oestrogènes : ERα, ERβ et ERγ (ou
ERβa). Les isotypes α et β sont retrouvés chez toutes les espèces alors que l’isotype γ n’a été
identifié que chez certaines espèces de poissons (Hawkins et al., 2000; Ma et al., 2000;
Menuet et al., 2002). Afin d’assurer sa fonction de facteur de transcription, le récepteur aux
oestrogènes, une fois traduit dans le cytoplasme, doit se diriger vers le noyau. Celui-ci met en
jeu les importines (transporteurs) présentes au sein des pores nucléaires qui reconnaissent les
signaux de localisation nucléaire (NLS : Nuclear Localization Signal) portés par le récepteur.
Jusqu’au début des années 1980, le modèle classique d’action des récepteurs aux hormones
stéroïdiennes proposait que les récepteurs étaient exclusivement cytoplasmiques en l’absence
de ligand et n’étaient dirigés vers le noyau qu’en présence de celui-ci (Jensen et al., 1968). Il
est clair aujourd’hui que l’isotype α du récepteur aux oestrogènes est nucléaire et cette
localisation est indépendante de la présence de l’hormone (Stenoien et al., 2000 a et b).
3) Mécanismes d’action du récepteur aux oestrogènes
Les récepteurs aux oestrogènes peuvent agir selon deux mécanismes différents. Le
premier permet de réguler la transcription des gènes cibles par le biais de la fixation du
récepteur intracellulaire à son élément de réponse aux oestrogènes (ERE) au sein du
promoteur de gènes cibles ou par des interactions protéine-protéine; ce mécanisme est
communément appelé mécanisme génomique. Il existe 3 voies de signalisation génomique
(figure 3) :
1- La voie classique ou ERE-dépendant (voie1),
2- La voie ERE-indépendante (voies 2 et 3),
3- La voie ligand-indépendante (voie 4).
Comme présenté figure 3, pour la signalisation classique (voie 1), le récepteur ER
liganté à l’oestradiol (E2) se lie sous forme dimérique à une séquence spécifique dite ERE.
Dès lors, des coactivateurs sont recrutés ainsi que la machinerie transcriptionnelle et le tout
aboutit alors à l’activation de la transcription du gène cible. Concernant les voies ERE-
16
indépendantes (voies 2 et 3, figure 3), le complexe ER-E2 peut induire la transcription des
gènes cibles en se liant directement à des protéines spécifiques Sp1 ou AP-1 (formé des
protéines c-Fos et c-Jun) liées respectivement à des domaines nucléotidiques riches en
glutamine ou TRE (TPA (12-Otetradecanoylphorbol 13-acetate) Response Element)
(Krishnan et al., 2010). La troisième voie de signalisation génomique est ligand-indépendant
(voie 4, figure 3). Cette activation est produite principalement par des facteurs de croissance
comme l’EGF (Epidermal Growth Factor) et l’IGF-1 (Insulin-like Growth Factor). Ceux-ci
phosphorylent le récepteur des oestrogènes au résidu de sérine 118 par l’intermédiaire de la
MAP kinase. Le récepteur interagit avec le coactivateur p68 RNA hélicase et active la
transcription du gène en interagissant avec l’ERE (Flint et al., 2002; Moore et Faller 2013;
Koterba et Rowan 2006; Kallen et al., 2004). Le second mécanisme est non-génomique. Les
stéroïdes, agissant par l’intermédiaire de récepteurs membranaires, entraînent une cascade de
réactions dont des phosphorylations et modulent des fonctions physiologiques rapides telles
que la régulation du flux calcique.
4
Figure 3: Différentes voies de signalisation cellulaire du récepteur ER et de l’oestradiol. Il existe trois
voies de signalisation génomique: Voie 1 : La voie classique ou ERE-dépendant, Voies 2 et 3 : voies
ERE-indépendante, Voie 4 : voie ligand-indépendante. Il y a une voie de signalisation non-génomique
(Le Grand, thèse de doctorat 2009).
17
III.
Définition des perturbateurs endocriniens : un débat
d’actualité
Ce terme est apparu dans la littérature scientifique depuis 1993 (Colborn et al., 1993).
Pourtant la définition des «perturbateurs endocriniens» ou PE n’est toujours pas arrêtée et fait
encore débat (Sénat français, juillet 2011).
Une première définition a été proposée par Kavlock et al., (Kavlock et al., 1996 ) :
«Un perturbateur endocrinien est une substance exogène qui interfère avec la synthèse, la
sécrétion, la libération, le transport, le métabolisme, la fixation, l’action ou l’élimination des
hormones naturelles du corps responsables de l’homéostasie, de la reproduction et du
développement». Un perturbateur endocrinien (PE) est défini en 1998 par l’Agence de
protection de l’environnement des USA (EDSTAC, 1998) comme un agent exogène
(substance chimique d’origine naturelle ou artificielle) ou un mélange de substances exogènes
qui agissent sur le système endocrinien et qui ont des effets néfastes au niveau d’un organisme
intact, de sa progéniture et/ou des (sous)-populations. Au cours du congrès européen sur les
perturbateurs endocriniens (European Commission, 1997), une autre définition a été proposée
: «un perturbateur endocrinien est une substance exogène qui provoque des effets néfastes sur
un organisme sain ou sa progéniture dus à une modification des fonctions endocrines».
Quoi qu’il en soit, identifier un perturbateur endocrinien revient donc à identifier une
molécule pouvant être reliée à une activité hormonale; si elle se lie au récepteur ou si elle
modifie l’action de certaines hormones, elle peut être considérée comme un perturbateur
endocrinien. Mais pour certaines substances, ayant une activité plus ou moins importante sur
le système endocrinien, l’EFSA (Autorité européenne de sécurité des aliments) a proposé de
distinguer deux groupes de molécules : celles qui produisent des effets délétères et celles qui
suscitent une réponse de l’organisme non problématique ou encore qui produisent des effets
adaptatifs (Sénat français, 12 juillet 2011). Cette définition revient à adopter celle établie par
l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé) en 2002 qui définit les perturbateurs endocriniens
comme étant des «substances chimiques d'origine naturelle ou artificielle étrangères à
l'organisme qui peuvent interférer avec le fonctionnement du système endocrinien et induire
ainsi des effets délétères sur cet organisme ou sur ses descendants» (Sénat français, 12 juillet
2011). De ce fait, une xéno-hormone (ou speudo-hormone) n’est pas une hormone véritable,
mais est une substance naturelle ou synthétique qui se comporte comme une hormone. Les
18
xéno-estrogènes sont des substances qui «miment» l’oestradiol, hormone naturelle, et qui
peuvent se lier aux récepteurs cellulaires de la même façon que les oestrogènes.
A. Mécanismes de la perturbation endocrinienne
De nombreuses molécules de l’environnement ont la capacité de modifier le
fonctionnement du système endocrinien. Étant donnée la diversité des fonctions
physiologiques impliquant le système endocrinien, les mécanismes par lesquels ces
substances peuvent perturber le système endocrinien sont complexes.
En effet, les perturbateurs endocriniens (PE) peuvent agir sur le système endocrinien en
interférant à plusieurs niveaux : synthèse, stockage et libération des hormones, transport,
métabolisme, ou encore liaison avec les récepteurs nucléaires constituant les cibles naturelles
des hormones. Les perturbateurs endocriniens peuvent interférer avec le fonctionnement du
système hormonal de différentes façons (figure 4) :
a. Ils peuvent imiter l’action d’une hormone naturelle. Ils se fixent alors sur le
récepteur cellulaire et entraînent une réponse normale : effet agoniste.
b. Ils peuvent se lier au récepteur hormonal et empêcher l’émission d’un signal.
Ils entravent alors l’action des hormones : effet antagoniste.
Le plus souvent, ces mécanismes d’action des PE résultent d’une combinaison des
deux mécanismes agoniste et antagoniste.
Les autres modes d'action des PE peuvent être de perturber la synthèse, le transport, le
métabolisme et la sécrétion des hormones, altérant ainsi les concentrations des hormones
naturelles dans l'organisme.
19
Figure 4 : Modes d’action des perturbateurs endocriniens ; Pol II pour ARN Polymérase II
En conséquence, la classification des perturbateurs endocriniens a été effectuée en
fonction de leur activité connue ou soupçonnée par rapport aux récepteurs hormonaux, et des
mécanismes de perturbation car leurs cibles sont multiples comme l’indique le tableau 4. Il
est, en effet, difficile voire impossible de classer les PE en fonction de leur structure
chimique.
Tableau 4 : Cibles des perturbateurs endocriniens (sénat francais, rapport 12 Juillet 2011)
20
B. Xéno-hormones et récepteur aux oestrogènes
a. Interaction directe avec les récepteurs hormonaux nucléaires : Action
génomique des perturbateurs endocriniens
Le mécanisme d’action génomique le plus connu est la liaison du perturbateur endocrinien
aux récepteurs nucléaires stéroïdiens (RNs) tel un imposteur (xéno-hormone), modifiant
l’expression des gènes comme facteurs de transcription. Après fixation des xéno-hormones,
les RNs exercent leurs activités génomiques en tant que facteurs de transcription qui
reconnaissent des séquences ADN spécifiques, au niveau de promoteurs de leurs gènes cibles,
en activant (effet agoniste) ou en inhibant (effet antagoniste) illégitimement l’expression des
gènes.
Parmi ces récepteurs stéroïdiens la majeure partie des PE décrits sont les molécules ayant
des effets oestrogéniques et sont capables de mimer l’effet biologique du 17 β œstradiol et de
cibler les récepteurs aux oestrogènes (ER) (Wilson et al., 2007; Le et al., 2003).
Les xéno-oestrogènes peuvent aussi illégitimement activer le récepteur nucléaire des
oestrogènes. Ils agissent comme l’oestradiol, par une voie classique qui suppose la
dimérisation du récepteur alpha (ERα) ou du récepteur béta (ERβ), les deux isoformes du
récepteur aux oestrogènes. Ce dimère reconnait les éléments de réponse localisés sur les
promoteurs de gènes cibles (figure 5) et induit leur transcription.
Figure 5 : Activation illégitime du récepteur des oestrogènes (d’après Massaad et Barouki, 1999) (RE
: récepteur des oestrogènes; ERE : Elément de réponse aux oestrogènes)
21
Les xéno-hormones peuvent être agonistes, antagonistes ou agoniste/antagoniste. En
réalité, leur mécanisme d‘action est mieux compris s’il est comparé à celui d’agents
pharmacologiques appelés SERM (Selective Estrogen Receptor Modulator) comme le 4hydroxythamoxifène ou encore l’éthinyloestradiol présentés tableau 5. D’autres molécules
sont des antagonistes pures comme L’ICI 182.780 et l’ICI 164.384 (Wakeling et al., 1991;
Zhu et al., 2008), ou présentent les deux modes d’action pour le récepteur aux oestrogènes
comme le 4-hydroxythamoxifène.
Tableau 5 : Structures des trois catégories de ligands du récepteur aux oestrogènes humains.
Agonistes purs
naturels
17β-Estradiol
synthétiques
Ethynylestradiol
Agonistes/Antagonistes mixtes
Diethylstilbestrol
4Hydroxytamoxiféne
Raloxiféne
Antagonistes purs
ICI 182.780
ICI 164.384
22
La grande majorité des xéno-oestrogènes sont des molécules agonistes et ils ont une
meilleure affinité pour le récepteur alpha comme le nonyphénol et ses différents isomères
(Arukwe et al., 2002; Gabriel et al., 2008), le cadmium (Nesatyy et al., 2006) et certains
colorants alimentaires (Axon et al., 2012) .
Certaines molécules ont une meilleure affinité pour le récepteur béta (ERβ). C’est le
cas de phyto-oestrogènes comme la génistéine (chez les mammifères), la biochanine A ou la
daidzéine, et la benzophénone. Dans une majorité des cas, les xéno-estrogènes ont une affinité
pour les deux récepteurs alpha et béta comme le bisphénol A (Kuiper et al., 1998), les
parabènes, les écrans UV (Gomez et al., 2005), le diéthylstilbestrol (DES) (exerçant une
fonction agoniste et ayant une affinité importante vis-à-vis des deux isotypes du récepteur aux
oestrogènes) ou le glyphosate (Thongprakaisang et al., 2013). Enfin, certaines molécules ont
une activité agoniste sur le récepteur alpha (ERα) et antagoniste sur le récepteur béta (ERβ).
C’est le cas de pesticides comme le méthoxychlore ou le chlordécone (Le Maire et al., 2010).
Ceci illustre le fait que de nombreuses molécules potentiellement retrouvées dans
l’environnement peuvent avoir des effets complexes sur le système hormonal.
Mais les mécanismes des perturbateurs endocriniens ne se limitent pas à celui-ci. Ils
peuvent également cibler le récepteur de l'hormone de la thyroïde (ThR) (Jagnytsch et al.,
2006), des récepteurs glucocorticoïdes (GR) (Neel et al., 2013), des récepteurs de la
progestérone (PR) (Scippo et al., 2004), le récepteur de la dioxine et des hydrocarbures
aromatiques (AhR) (Jeuken et al., 2003). Ces molécules peuvent aussi cibler le récepteur des
androgènes (AR) (récepteur des hormones sexuelles mâles comme la testostérone et son
métabolite, la dihydrotestostérone). Ce récepteur est principalement exprimé dans le testicule,
il est présent dans la prostate, les glandes surrénales, les reins, le cerveau et l’hypophyse. Le
rôle du récepteur AR dans les organes mâles est très similaire à celui des récepteurs ER dans
les organes femelles. Les plus puissants agonistes connus sont la testostérone et son
métabolite, le DHT (dihydrotestostérone) qui se lient plus fortement aux récepteurs aux
androgènes et l’acétate de médroxyprogestérone (MPA) (Okamoto et al., 2012; BiancoMiotto 2014).
b. Action non génomique des perturbateurs endocrin iens
Au-delà de la voie de signalisation classique passant par l’activité nucléaire du
récepteur, les perturbateurs endocriniens provoquent des effets moins classiques, par
l’intermédiaire de certaines voies de signalisation membranaires (notamment calcium
23
dépendant) suite à l’activation d’un récepteur membranaire. Plusieurs travaux ont permis
d’identifier notamment des récepteurs aux stéroïdes localisés dans la membrane
cytoplasmique qui sont identiques aux récepteurs nucléaires car ils sont reconnus par les
mêmes anticorps (Powell et al., 2001). Les travaux décrits dans la littérature ont montré que,
les stéroïdes ou des xéno-hormones, sont capables d’induire une action non génomique via un
second messager après leur fixation sur les récepteurs membranaires ou sur leurs isoformes
(Falkenstein et al., 2000). En effet, de nombreuses études ont été réalisées sur l’activité non
génomique des xéno-oestrogènes notamment pour expliquer leur rôle dans des
disfonctionnements physiologiques, métaboliques et dans des déficits fonctionnels à court
terme et à long terme au niveau de la cellule et des tissus (tératogenèse et cancer) (Watson et
al., 2007; Watson et al., 2013, Hisamoto et al., 2001 ). Il a été montré, par exemple, que
l’œstradiol (E2) peut se lier au récepteur ERα membranaire (identique au récepteur ERα
nucléaire) et induire une cascade de protéines kinase qui aboutit à la division cellulaire
(Falkenstein et al., 2000; Bulayeva et al 2004; Watson et al., 2005). Il est aussi impliqué dans
l’activation de la production d’AMPc et d’IP3 (inositol triphosphate) dans certains tissus
(Grove et Korach, 1987; Ignar-Trowbridge et al., 1991; Aronica et al., 1994; McEwen et
Alves, 1999). Certains xéno-estrogènes comme le diéthylstilbestrol, le coumestrol, le
bisphénol A, ou le nonylphénol, induisent des réponses non génomiques par des voies très
diverses qui peuvent, par exemple, conduire à l’activation des voies des MAP kinases
(Watson et al., 2007; Watson et al 2010). Un schéma simplifié des voies de signalisation
contrôlées par le récepteur des oestrogènes membranaire et cytoplasmique est présenté figure
6.
Ces activités non génomiques sont extrêmement rapides, elles se déroulent dans les
minutes qui suivent l’activation du récepteur membranaire et ne sont pas affectées par les
inhibiteurs de la transcription ou de la synthèse protéique tels que l’actinomycine D ou le
cycloheximide (Jagla, 2007). Cependant ces activités restent ligands dépendantes, étant donné
que l’administration d’un ligand antagoniste permet leur inhibition. De telles activités ont été,
entre autres, décrites pour le AR (Baron et al., 2004) et le PR (Boonyaratanakornkit et al.,
2001 ). Ces effets peuvent d'ailleurs avoir des conséquences sur la régulation de gènes.
24
Figure 6 : Voies de signalisation des oestrogènes médiées par les récepteurs membranaires et
nucléaires. Les voies classiques (I et II) dépendent de l’interaction directe de l’oestrogène avec ER.
Les voies non-classiques (III et IV) dépendent l’interaction avec un récepteur non-stéroïdien (III) ou
avec un ER (IV) membranaire (Lorenzo et al., 2003)
De la même manière, l’interférence des xéno-hormones dans le métabolisme des
hormones peut avoir des effets qui s’additionnent à ceux engendrés par leur activité agoniste
ou antagoniste. L’activité de presque toutes les enzymes impliquées dans la stéroïdogenèse
peut être modifiée par les xéno-hormones (Whitehead et Rice., 2006). Ce qui altère la
concentration des hormones naturelles dans l’organisme et induit un dysfonctionnement du
système hormonal.
C. Cas particulier : les xéno-estrogènes et le récepteur à la dioxine
Le récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) est un facteur de transcription
activé par la fixation de ligands. Le récepteur AhR semble intervenir dans le développement
des invertébrés. Par exemple, chez Drosophila melanogaster, l’homologue du récepteur AhR
intervient dans le développement des segments et des antennes (Emmons et al., 1999) et son
ADN complémentaire, connu depuis 1992, révèle des domaines de forte homologie avec les
protéines Per (Period) et Sim (Single-Minded) de Drosophila melanogaster. Il fait partie de la
famille dite bHLH-PAS (basic Helix-Loop-Helix/Per-AhR-Sim) (Hankinson 1995; Swanson
et Bradfield, 1993), distincte des récepteurs nucléaires à laquelle appartient le récepteur aux
25
oestrogènes. Ce motif «PAS» (PER-AhR-SIM), caractérise les membres d’une nouvelle
super-famille de protéines incluant Arnt (AhR nuclear translocator), partenaire d’hétérodimérisation de AhR. Parmi les ligands qui se fixent sur l’AhR, citons les hydrocarbures
aromatiques polycycliques (HAP) comme le benzopyrène, les polychlorobiphényles (PCB) et
les dioxines. Un certain nombre de phyto-oestrogènes sont des antagonistes du récepteur AhR
tels que la génistéine ou le resvératrol. Ce récepteur reconnaît plus de 250 ligands dont 75
dioxines, mais le ligand naturel reste inconnu malgré quelques molécules candidates (Denison
et Nagy, 2003). Le rôle du récepteur à la dioxine est particulier car il peut interagir avec le
récepteur ER et peut soit l’activer ou soit l’inhiber, ce qui explique la confusion du statut anti
ou pro- oestrogénique de la dioxine.
Le récepteur AhR se caractérise par un domaine N-terminal complexe appelé «bHLHPAS» (basic Helix-Loop-Helix/Per-AhR-Sim), responsable de la liaison à l’ADN, de
l’hétérodimérisation et de la liaison du ligand (figure 7A). Ce domaine définit une famille de
transactivateurs qui comprend, outre le récepteur AhR, son partenaire d’hétérodimérisation
nucléaire ARNT (Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator) (Rowlands et Gustafsson,
1997). L’hétérodimère AhR-Arnt identifie des séquences «XRE» (Xenobiotic Responsive
Element). La partie C-terminale du récepteur AhR contient des régions trans-activatrices et
une fonction de répression de la transcription. AhR présente une rare aptitude aux interactions
avec d’autres protéines telles que les chaperonnes (HSP90),
B
A
Figure 7: Structure et mécanismes moléculaires du récepteur nucléaire AhR. (A) : illustration de
l’architecture de domaine et des ligands apparentés pour ces récepteurs. bHLH : hélice-boucle-hélice
de base; PAS : Per-ARNT -Sim domaine; AD : domaine d'activation; AF : fonction d'activation. (B)
mécanismes de régulation des gènes médiés par AhR. ERE, un élément de réponse aux oestrogènes
(inspiré de Ohtake et al., 2009).
26
Le fonctionnement de l’AhR est semblable à celui de certains récepteurs stéroïdiens
(figure 7B) (Ohtake et al., 2007, 2008). Il se localise dans le cytoplasme et une fois lié à un
ligand, le complexe recrute une protéine de translocation appelée translocateur nucléaire du
récepteur des hydrocarbures aromatiques (ARNT). Le complexe ligand-AhR-Arnt agit
comme facteur de transcription sur l'élément de réponse aux xénobiotiques (XRE : xenobiotic
response element) sur le promoteur du gène concerné, comme c'est le cas pour le gène codant
pour le CYP1Al. Cette fixation au XRE va permettre de recruter l'ARN polymérase favorisant
la transcription des gènes cibles, dont beaucoup codent pour des enzymes de détoxication, en
ARNm. Ainsi le taux de transcription est favorisé par la fixation de facteurs de transcription.
Parmi les gènes dits AhR-dépendants figurent ceux codant pour un grand nombre d'enzymes
de biotransformation (évitant toute accumulation de métabolites intermédiares potentiellement
toxiques pour la cellule) incluant:
- des enzymes de phase I telles que le CYP 1 A 1, CYP 1 A2, CYP 1 B 1 et CYP2s 1,
- des enzymes de phase II telles que la NAD(P)H-Nqo 1 (nicotinamide adénine dinucléotide
phosphate-quinone oxidoréductase), la GSTA 1 (glutathion-Stransferase A 1) et l'UGT1 A6
(UDP-glucuronosyltransférase) (Rivera et al., 2002) (figure 8). La fixation de ligands comme
les dioxines provoque également l’activation de gènes de la prolifération, de la régulation du
cycle cellulaire et de l’inflammation.
Figure 8 : Intéraction de la signalisation du récepteur AhR avec A, la modulation de la synthèse
d’enzyme de biotransformation et du métabolisme (enzyme de phase I et de phase II) et avec B,
l’élimination du récepteur ER par le protéasome (inspiré de Matthews et Gustafsson, 2006)
27
Outre les effets géniques du récepteur AhR, plusieurs travaux ont montré que ce
récepteur pouvait exercer ses effets en activant des cascades de signalisation différentes.
Ainsi, plusieurs kinases semblent être la cible de ce récepteur, comme la p38 kinase et la JNK
(c-Juhn N-terminal Kinase) (Weiss et al., 2005; Diry et al., 2006).
Il existe un mode d’activation non conventionnel du récepteur AhR qui, en absence
d’hormone, induit tout de même des gènes oestrogéno dépendants. Les mécanismes d’action
qui induisent cet effet, ont été, notamment, démontrés par Ohtake et al., 2003. Ce dernier peut
former un hétérodimère avec le récepteur ERα et ainsi agir comme co-régulateur pour
stimuler la transcription contrôlée normalement par le récepteur ERα (figure 9).
Figure 9:Activation illégitime de la voie de signalisation du ER (récepteur des oestrogènes) par le
récepteur de la dioxine activé AhR. En l’absence d’oestrogène, la voie de signalisation du ER peut
être activée par des interactions entre le récepteur ER et le récepteur de la dioxine activé (d’après
Massaad et Barouki, 1999)
En effet, plusieurs études in vivo et in vitro ont confirmé un lien entre l’activité du
récepteur ERα et celle du récepteur AhR. Par exemple, en transférant le gène codant pour le
récepteur ERα à des cellules ne pouvant pas exprimer ce récepteur et ne pouvant pas répondre
à la dioxine, Thomson et al., ont montré que ces cellules étaient de nouveau capables de
répondre à la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine en déclenchant une réponse oestrogénique.
De même, des agonistes du récepteur AhR peuvent l’être également pour le récepteur ERα, on
parle alors de xéno-oestrogènes bivalents. De même, il est désormais admis que le récepteur à
la dioxine AhR possède des voies de signalisation et d’activation qui se croisent avec celles
28
du récepteur aux oestrogènes ERα et également avec celles du récepteur aux androgènes (AR)
(figure 10).
Figure 10: Interaction de la signalisation des dioxines avec les oestrogénes. Interaction des voies
signalisation du récepteur AhR et du récepteur ERα via une association directe entre AhR et ERα. Les
ligands du récepteur AhR induisent une association de AhR avec Erα. Ce nouveau complexe agit
comme une unité fonctionnelle pour réguler la transcription (inspiré de Matthews et Gustafsson ,
2006).
Il a été également montré que le récepteur AhR exerce à l’égard du récepteur ER une
activité «ubiquitine E3 ligase» et oriente le récepteur ER vers le protéasome favorisant ainsi
sa dégradation (Ohtake et al., 2007; Matthews et Gustafsson, 2006). Il résulte de ces derniers
travaux que les dioxines perturbent considérablement les régulations hormonales
oestrogéniques : en présence d’hormone, ces polluants exercent un rôle antagoniste, alors
qu’en absence d’hormone, ils sont capables d’induire transitoirement des gènes hormonodépendants (figure 10).
D. Action à faible dose et en mélange de perturbateurs endocriniens
Compte tenu de la particularité des PE à produire leurs effets via des mécanismes de
signalisation physiologique, leurs cibles sont difficiles à évaluer et la perturbation du système
endocrinien peut, dans certains cas, apparaître à des concentrations bien plus faibles que celles
qui alarment habituellement les toxicologues. Tout comme les hormones naturelles, les PE
29
présentent des relations non linéaires entre la concentration de la molécule et le nombre de
récepteurs liés, ainsi qu'entre le nombre de récepteurs liés et l'effet biologique maximal
(Vandenberg et al., 2012). Les effets de faibles concentrations ont été très souvent pris en
compte notamment pour le bisphénol A (vom Saal et al., 2007). De nombreuses études ont
démontré que comme les hormones, les PE peuvent avoir des effets à de faibles doses (dose
physiologique) et ces effets ne sont plus présents ou différents à des doses élevées (pouvant
être considérées comme toxiques) (Wetherill et al., 2007; Piccart et al., 2003).
Si on commence à mieux appréhender les effets de ces composés lorsqu'un organisme
est exposé à une seule de ces molécules, on connait beaucoup moins bien l'effet de ces
composés lorsqu'ils sont présents en mélange. Or, les contaminations par les PE étant
pratiquement toujours multiples, il apparaît pertinent de pouvoir évaluer les effets des
mélanges. La compréhension de ces effets est rendue complexe car un même PE peut avoir
plusieurs mécanismes d’action tels que des effets oestrogéniques dans certains systèmes et
anti-androgéniques dans d’autres (Viñas, et al., 2013). De plus, différentes études ont déjà
montré que même si chacun des composés est présent à une concentration inférieure à celle où
il induit un effet, le mélange de ces composés à ces mêmes concentrations peut néanmoins
causer un effet (Silva et al., 2002; Rajapakse et al., 2002). Des études ont donc évalué les
effets d’addition (Bazin et al., 2010), de synergie (Laetz et al., 2009) ou d’antagonisme
(Tanida et al., 2009) entre molécules. Ces effets sont d’autant plus importants pour les
perturbateurs endocriniens que certains induisent des effets agonistes (éthinyloestradiol,
nonylphénol), antagoniste (tamoxifène) et peuvent avoir des mécanismes d’action différents
(liaison aux récepteurs, modification du métabolisme) (voir partie II A Mécanismes de la
perturbation endocrinienne) (Monosson et al., 2005; Cizmas et al., 2004). De même, il a été
démontré que des mélanges multi-composants d'oestradiol et d'autres xéno-oestrogènes
induisent la synthèse d’une protéine spécifique, la vitellogénine chez le poisson. Cette
protéine est un biomarqueur de la perturbation endocrinienne. En comparant le taux
d’induction par les contaminants pris isolément et deux à deux, on peut prédire l’effet dû au
mélange (Brian et al., 2005). Ce système de prédiction basé sur des effets cocktails, utilisant
des bioessais in vitro, a permis d’évaluer les effets de mélange de nombreux perturbateurs
endocriniens (Bazin et al 2010).
La prévisibilité des effets de la combinaison de plusieurs molécules a été démontrée
avec des systèmes encore plus complexes que celui de l’induction de la vitellogénine chez les
poissons. Dans un modèle de toxicité pour le développement du rat, il a été montré que les
30
combinaisons d'antagonistes des récepteurs aux androgènes vont agir de manière additive et
ainsi induire des changements physiologiques chez l’animal lors de sa vie fœtale,
caractéristiques de la perturbation de l'action des androgènes (Hass et al., 2007). Des
observations similaires ont été faites avec des combinaisons d’anti-androgènes qui agissent
par le biais de mécanismes différents (Christiansen et al., 2009; Rider 2008). Des études avec
des perturbateurs thyroïdiens ont également montré des effets additifs à faibles doses (Crofton
et al., 2005).
Compte tenu des propriétés des PE, par rapport aux divers scenarii d’exposition des
populations, la recherche se focalise actuellement sur les mélanges de substances à doses
environnementales (de l’ordre du microgramme ou du nanogramme par littre).
IV.
Perturbateurs endocriniens : substances d’origines
multiples
Les différentes activités humaines génèrent une diversité de substances et des quantités
toujours croissantes d’agents physiques, chimiques ou biologiques ayant un pouvoir
contaminant et des risques potentiels sur la santé humaine, animale et/ou végétale.
Parmi les effets négatifs pouvant être développés par ces contaminants, la perturbation
endocrinienne est, à l’heure actuelle, un des impacts sur l’écosystème qui est de plus en plus
étudié.
Cependant, il faut noter que les substances, ayant des effets potentiellement
perturbateurs sur le système endocrinien, peuvent avoir deux origines : naturelle et
anthropique (tableau 6).
31
Tableau 6 : Classes de perturbateurs endocriniens. Archives des maladies professionnelles et de
l’environnement 2008, L. Multigner, P. Kadhel
Différentes classes de substances à action endocrine
Hormones
stéroïdes
naturelles
Produits
pharmaceutiques
Produits
dentaires
Produits
vétérinaires
Produits de
combustion
Oestrone, 17α-oestradiol, oestriol (hormones sexuelles)
DES (Distilbène), 17 α-éthynil-oestradiol (contraceptif), kétokonazole
(traitement du pityriasis, pommade), tamoxifène (traitement de certains cancers
du sein)….
Bisphénol A
DES, trenbolones (augmentent la masse musculaire)…
Dioxines, furanes, HAP (hydrocarbure aromatique polycyclique)…
Produits à usage
industriel ou
domestique
Phtalates, bisphénol A, styrène (polystyrène),
Polybromodiphényl éthers (PBDE), polychlorobiphényls, organoétains
Alkylphénols, parabènes (conservateurs dans les produits de beauté),
Arsenic, cadmium…
Produits
phytosanitaires
Phytooestrogènes
Mycotoxines
Organochlorés (DDT, chlordécone…), vinchlozoline (retirée en avril 2007),
linuron (herbicide), atrazine, simazine, linuron…
Isoflavones (soja, trèfle)…
Zéaralénone, ochratoxine A…
A. Hormones
1) Hormones naturelles
Les hormones stéroïdes représentent une large classe de molécules lipophiles. Elles
agissent principalement sur des sites variables pour la régulation de nombreuses fonctions
physiologiques. C’est pour cela quelles sont essentielles pour une physiologie normale. Il
existe
deux
principales
classes
d’hormones
:
les
androgènes
comme
le
déhydroépiandrostérone (DHEA), la dihydrotestostérone (DHT) ou la testostérone (T) et les
oestrogènes comme l’œstrone (E1), l’œstradiol (E2) et l’oestriol (E3). Ces hormones sont
importantes dans la différentiation sexuelle, la reproduction ainsi que pour le maintien d’une
santé optimale chez l’adulte. L’activation ou l’inhibition inappropriée des récepteurs stéroïdes
par ces hormones est l’un des modèles les plus utilisés pour l’étude de la perturbation, plus
particulièrement, l’interférence avec la signalisation des récepteurs des oestrogènes. Plusieurs
études ont rapporté la prévalence des oestrogènes naturels dans les effluents de station
d’épuration (Pillon et al., 2005, Johnson et al., 2005, Khanal et al., 2006, Limpiyakorn et al.,
2011). Ces auteurs ont mis en évidence le rôle néfaste de ces substances, comme étant une
32
source de composés pouvant entrainer, du fait de leur présence «anormale» dans
l’environnement, des perturbations endocriniennes sur les écosystèmes naturels.
2) Hormones synthétiques
Les oestrogènes synthétiques sont utilisés comme contraceptifs (éthinyloestradiol
(EE2), mestranol), dans le traitement des pathologies reproductives (clomifen) ou le cancer
(tamoxifen, raloxifen). Ces produits pharmaceutiques agissent par compétition avec les
hormones endogènes, par blocage ou en activant certaines voies métaboliques, ou encore en
remplacement des oestrogènes endogènes.
B. Xéno-hormones d’origine naturelle
1) Phyto-oestrogènes
Les phyto-oestrogènes, composés dérivant des plantes, possèdent des structures
chimiques similaires aux oestrogènes. Ce sont des perturbateurs endocriniens non stéroïdes et
sont retrouvés dans de nombreux aliments comme le soja.
Dans la littérature, l’aptitude de ces composés à se lier aux récepteurs des oestrogènes est de
plus en plus rapportée. En effet, ces composés induisent des réponses oestrogéniques dans les
essais in vitro (Stopper et al., 2005), chez certains mammifères (Hopert et al., 1998; Burton et
Wells, 2002) ainsi que des effets délétères sur la faune naturelle (Colborn et al., 1993; Dusza
et al., 2006; Jefferson et al, 2007; Rochester et Millam, 2009). D’autres phyto-composés
comme les coumestranes (principalement le coumestrol), et des isflavonones présentent une
activité anti-oestrogénique dans les cellules MCF-7 (Han et al., 2002).
2) Myco-oestrogènes
Certaines mycotoxines produites par les champignons, en particulier fusarium
(Kuiper-Goodman, 1987) telles que la zéaralénone, la déoxynivalénol (DON), ou encore la
toxine T-2, sont des substances pouvant avoir une activité endocrinienne (Ndossi et al., 2012)
et qui sont retrouvées à de fortes concentrations dans les produits alimentaires comme les
céréales (maïs, orge) et l’huile végétale. Elles sont capables de se lier, avec une bonne affinité,
aux récepteurs des oestrogènes (ERα et ERβ) (Balaguer et al., 2001). De récentes études ont
également montré l’impact de l’ochratoxine A sur le système endocrinien (Frizzell 2013a et
b). Jusqu’alors, cette mycotoxine produite par les genres Aspargillus et Penicillium était
connue pour avoir des effets sur la reproduction (Gharbi et al., 1993), sur la spermatogenèse
33
(Biro et al., 2003), sur le système immunitaire et également des effets cancérogènes (classée
groupe 2B par le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC)). De ce fait, le
Comité scientifique de l'alimentation humaine de la Commission européenne a estimé, dans
son avis du 17 septembre 1998, qu'il serait prudent de réduire autant que possible l'exposition
à l'ochratoxine A. Ainsi, la concentration doit se situer près de la valeur inférieure des doses
journalières tolérables comprises entre 1,2 à 14 ng/kg p.c./jour (poids corporel/jour). La
teneur maximale de cette mycotoxine dans les vins pour une commercialisation en Europe est
de 2 µg/l. Le Canada et les Etats Unis refusent l'importation des vins présentant plus de 1 μg/l
d'ochratoxine A. Cette mycotoxine peut également avoir un impact sur la sécrétion des
certaines hormones comme la testostérone (Shashi, et al., 2011), et sur l’hormone lutéinisante
(LH) (Hassan et al., 2010). L’ochratoxine A semble avoir une action sur le système
endocrinien via les voies non génomiques (Frizzell et al., 2013a et b).
C. Xéno-hormones d’origine anthropique
Outre les phyto-oestrogènes et les myco-oestrogènes, les xéno-hormones font
référence à des milliers de produits et appartiennent à diverses familles de produits chimiques
: les organochlorés, les dioxines; les alkylphénols …. On les retrouve dans les formulations,
les solvants, les produits issus du pétrole etc… Ils regroupent des produits de l’industrie
chimique (phtalates, bisphénol A, métaux lourds, etc.), des produits phytosanitaires utilisés en
agriculture (herbicides, fongicides, insecticides, etc.) et des produits de consommation
courante (cosmétiques, conservateurs, produits alimentaires etc…).
1) Xéno-hormones d’origines industrielles
a) Produits chimiques
Les substances synthétiques sont conçues pour une utilisation industrielle en tant que
solvants, surfactants ou lubrifiants (ex. nonylphénol ou polychlorobiphényle/PCB), et sont
retrouvés dans les plastiques (ex. bisphénol A). D’autres sont utilisées comme pesticides (ex.
méthoxychlore, dichlorodiphényltrichloroéthane/DDT, lindane), fongicides (ex. vinclozoline,
bénomyl), substances médicamenteuses (ex. flutamide), et produits de consommation
courante (ex., cosmétiques, produits d’entretien). Les composés organochlorés sont utilisés
comme solvants, pesticides dont les insecticides et les fongicides ou encore comme
réfrigérants ou molécules intermédiaires de synthèse en chimie et pharmacie. Les plus connus
sont les pesticides (DDT, aldrine, chlordécone, dieldrine, chlordane, heptachlore, endrine,
34
mirex, chlorobiphényle (BPC), toxaphène, lindane, etc.), les polychlorobiphényles (PCB) et
les dioxines qui pour certains ne sont plus utilisés à ce jour (Convention de Stockholm) et
d’autres sont interdits en France et en Europe. Quelques structures de ces xéno-hormones sont
illustrées (figure 11). En raison de leur caractère lipophile, les organochlorés sont réputés
persistants et se concentrent dans les tissus adipeux. Certains d’entre eux perturbent ainsi le
système endocrinien. Ces composés font partie des composés organiques persistants (POPs)
qui possèdent des temps de demi-vies pouvant atteindre plusieurs décades.
Figure 11 : Quelques exemples de xéno-hormonesd’après le site Internet de la National Library of
Medicine 2007
Le mode d’action, de ces molécules, comme perturbateur endocrinien est très varié.
Par exemple, les effets oestrogéniques des PCB peuvent se produire suite aux interactions
directes avec le récepteur aux oestrogènes (ER) (Fielden et al., 1997; Ma et al., 2000). Le
DDT, insecticide longtemps utilisé, est un des perturbateurs endocriniens les plus étudiés
(Yang et al., 2006). Son métabolite le 4,4'-Dichlorodiphényldichloroéthane (4,4’-DDE) est un
composé anti-androgénique reconnu (Kelce et al 1995).
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques regroupent plusieurs composés, le plus
connu étant le Benzo(a)pyrène (BaP). Leur principal mécanisme de toxicité est induit via
l’activation du récepteur à la dioxine (récepteur AhR) pouvant indirectement produire des
effets endocriniens (Ma et al., 2000).
35
Les détergents du type éthoxylates d’alkylphénol (EAP) et éthoxylates d’octylphénol
(EOP) sont utilisés par l’industrie métallurgique pour dégraisser les surfaces métalliques. Les
éthoxylates de nonylphénol (ENP) se retrouvent, quant à eux, dans des produits d’entretien
domestique. Après leur utilisation, ces composés biodégradés en station d’épuration
engendrent la formation de produits bio-réfractaires comme le nonylphénol (NP) qui est
persistant et toxique. Il a été démontré que le nonylphénol et ses dérivés sont des composés
induisant une activité oestrogénique en se fixant notamment sur le récepteur ERα (Guenther et
al., 2002; Preuss et al., 2006; Bechi et al., 2006; Gabriel et al., 2008). Le NP et ses dérivés
sont connus pour s’accumuler dans les espèces aquatiques et entraîner la féminisation des
poissons bien qu’il soit 10 000 fois moins oestrogénique de l’oestradiol (Jobling et Sumpter
1995).
Les constituants du plastique comme le bisphénol A et les phtalates peuvent engendrer
respectivement des effets oestrogéniques et anti-androgéniques par la liaison au récepteur des
oestrogènes et au récepteur des androgènes (vom Saal et al., 2005). Le bisphénol A peut
également fixer le récepteur AhR (Bonefeld-Jorgensen et al., 2007, ), et le récepteur des
hormones thyroïdiennes (ThR) (Zoeller et al., 2005). Les phatlates interfèrent également avec
les voies des androgènes et des oestrogènes. La perturbation des activités androgéniques a été
montrée par le développement sexuel anormal des rats exposés aux contaminants et son
impact sur la fertilité des hommes (Dalsenter et al., 2006; Latini et al., 2006). De plus, des
expériences in vitro ont montré le potentiel anti-androgénique de ces xéno-hormones (Lee et
al., 2007).
Certains métaux comme le plomb, le cadmium, l’arsenic, le mercure, le zinc ou le
nickel, peuvent induire des perturbations endocriniennes chez l’animal (Iavicoli et al., 2009;
Bogdan et al., 2011). A des concentrations non cytotoxiques (comprises entre 2 et 225 µg/l)
l’arsenic inhibe l’effet de l’oestradiol dans les cellules MCF7. De même, le mercure encore
employé en technique dentaire peut avoir une action de perturbation qui induirait un
dérèglement de plusieurs glandes, des ovaires et des testicules provoquant des troubles de
l’immunité, des troubles de la reproduction et un accroissement des cancers du sein (Tan et
al., 2009; Wirth et al., 2010). A des concentrations de l’ordre du nanogramme par millilitre, le
cadmium interfère avec la synthèse des oestrogènes, des androgènes et de la progestérone
(Massanyiet al., 2000; Takiguchi et Yoshihara, 2006).
36
b) Colorants
Les colorants sont impliqués dans un grand éventail de domaines : industrie textile,
imprimerie, industrie pharmaceutique, cosmétique et agro-alimentaire. L’industrie des
colorants constitue aujourd’hui un secteur important de la chimie : la production mondiale est
estimée à plus de 800.000 tonnes par an dont 140.000 tonnes s’échappent dans les effluents au
cours des différentes étapes d’application et de confection (Cooper, 1995; Zollinger, 1987).
Parmi les nombreuses familles de colorants synthétiques, les colorants azoïques sont les plus
largement utilisés (60 à 70 %). Ces colorants possèdent une ou plusieurs liaisons azoïques
(R1-N=-R2) en association avec un ou plusieurs groupements aromatiques, ce qui les rend
très stables et relativement peu biodégradables. De nombreuses études ont montré, d’autre
part, des effets toxiques et/ou carcinogènes des colorants azoïques (Mathur et Bhatnagar
2007; Schneider et al., 2004). Dans le cas des colorants azoïques, l'augmentation de
l'incidence du cancer de la vessie, observée chez les travailleurs de l'industrie textile, a été liée
à une exposition prolongée à ces colorants. Un rapport d'experts du « Comité Cosmetic
Ingredient Review » a confirmé que certains colorants d'anthraquinone, comme le Disperse
Blue 7, utilisé dans l'industrie cosmétique comme colorant pour cheveux et dans l’industrie
textile, induisent de la génotoxicité chez les bactéries (Final report on the safety assessment of
disperse blue 7, 2007). De même il a été montré que des rejets d’industrie de peinture avaient
une activité dioxine like (AhR) et cette activité a été corrélée à la présence de colorants
spécifiques (Chouet al., 2007). D’un point de vue environnemental, les activités
oestrogéniques n’ont pas été décrites pour les colorants textiles. Les impacts sur le système
endocrinien, que pourraient avoir ces composés, ont été observés pour le résorcinol, un
antiseptique utilisé pour produire des colorants comme le bleu de résorcine, le vert de
résorcine, utilisés pour le tannage ou le textile (Lam et al., 2013). En revanche, des études ont
décrit des effets oestrogéniques dues à la présence de colorants alimentaires. La tartazine
(E102) ou l’érythrosine (E127) affectent la réponse du récepteur aux oestrogènes (ER) en se
fixant sur l’élément de reconnaissance oestrogénique (ERE) dans les cellules HTB 133
(cellules hepitéliales de glande mammaire). Ces résultats sont confirmés par le bioessais Escreen (Roychoudhury et Giri 1989; Lundin-Schiller 2008).
2) Produits de consommation courante et d’hygiène corporelle, les parabènes
Parmi les produits de soin corporel et d’hygiène (PPSP pour produits pharmaceutiques
et de soins personnels), on retrouve des produits pharmaceutiques, des antibiotiques et des
produits de soins personnels (comme les parfums synthétiques à base de musc) mais aussi
37
certains conservateurs comme les parabènes. Les médicaments excrétés par les humains et les
stéroïdes déjectés par les animaux d’élevage représentent d’autres sources de perturbateurs
endocriniens retrouvés dans l’eau. Des études récentes ont montré que le paracétamol et les
anti inflammatoires perturbent le système endocrinien (Vanderford et al., 2003 et 2006,
Westerhoff et al., 2005; Albert et al., 2013). Certains analgésiques ont des effets antiandrogéniques chez le fœtus du rat et chez l’homme (Mazaud-Guittot et al., 2013; Kristensen
et al., 2011).
Les parabènes sont des esters de l’acide parahydroxybenzoïque ou encore des
parahydroxybenzoate d'alkyles dont le groupement alkyle, peut être un radical méthyl, éthyl,
propyl, butyl, isobutyl ou benzyl. En général, les parabènes sont des composées stables qui
résistent à l’hydrolyse en solution acide (Soni et al., 2005; Eriksson et al., 2009). La
concentration en parabène admise dans les cosmétiques peut atteindre 1 % (Tavares et al.,
2009). Cependant la Directive Européenne 76/768/EC autorise une concentration maximale
dans les produits cosmétiques de 0,4 % pour un seul ester et 0,8 % (en masse) pour un
mélange d’esters.
En raison de leurs propriétés antibactérienne et antifongique, les parabènes sont
employés comme conservateurs, en particulier dans les produits cosmétiques et certaines
spécialités pharmaceutiques (Jonkers et al., 2009; Elder, 1984). Une enquête, récente, réalisée
en Espagne sur 215 produits cosmétiques a montré que les parabènes sont utilisés dans 99 %
des crèmes et des lotions, et 77 % des démaquillants (Tavares et al., 2009). Ils peuvent
également être présents dans les dentifrices (Benijts et al., 2004). Dès 1998, des études in
vitro, s’intéressant aux mécanismes d’action de ces composés, ont mis en évidence la capacité
des parabènes à se lier au récepteur oestrogénique. Cette activité oestrogénique serait fonction
de la longueur des chaînes alkyles (méthyl, éthyl, propyl, butyl) (Routledge et al., 1998; Bazin
et al., 2010). Des essais réalisés sur des cellules MCF‐7 (lignée de cellules tumorales
mammaires), ont démontré l’effet oestrogénique additif entre les parabènes et le 17β‐
oestradiol (Van Meeuwen et al., 2008). Une activité anti-androgénique a également été
observée in vitro avec les méthyl, propyl et butyl parabènes. En effet, à partir d’une
concentration de 10 μM, ils sont capables d’inhiber l’activité transcriptionnelle induite par la
testostérone respectivement de 40 %, 33 %, et 19 % (Chen et al., 2007). Enfin, les parabènes
pourraient exercer une activité «indirecte» de perturbation sur le système endocrinien par
38
l’inhibition des sulfotransférases, enzymes nécessaires à la régulation de l’action des
oestrogènes in vivo.
V.
Evaluation des altérations des écosystèmes en lien avec la
présence des perturbateurs endocriniens
Les évidences sont nombreuses en matière d’écotoxicologie et d’impact sur la faune
principalement aquatique. En effet, de nombreuses études ont montré un lien entre la présence
de polluants, induisant des effets du système endocrinien (notamment des effets sur la
régulation des hormones stéroïdiennes), et des anomalies survenues sur la reproduction et le
développement de certaines populations comme observé chez les alligators, les gastéropodes
ou certains poissons (Toppari et al., 1996).
A. Effet sur les invertébrés
La recherche sur les systèmes endocriniens invertébrés a été principalement axée sur la
reproduction des mollusques aquatiques, les insectes et les crustacés. La modification du sexratio et la production de vitellogénine, précurseur protéique des réserves énergétiques de
l'oeuf chez de nombreuses espèces animales en réponse à des oestrogènes endogènes, peuvent
être induits chez les crustacés et les mollusques placés dans les exutoires d’eaux usées
(Gagné, et al., 2001; 2003; Pampaninet al., 2005; Matozzo et Marin, 2008; 2007) transformant
ainsi la dynamique de la population. Une autre perturbation endocrinienne, très connue, est le
pseudo-hermaphrodisme ou imposex. Celui-ci se traduit par le développement de caractères
sexuels mâles chez les femelles tel que le développement d'organes génitaux mâles (pénis et
canal déférent par exemple). Ce phénomène apparait surtout chez les populations de
gastéropodes marins. Ce phénomène a été largement observé en Asie du sud-est (Ellis et
Pattisina, 1990), en Alaska (Short et al., 1989), au Royaume Uni (Bryan et al., 1986) et aux
Etats-Unis (Smith, 1981). La cause majeure du pseudo-hermaphrodisme est l’exposition à des
organo-étains, en particulier le tributylétain (TBT) (biocide organométallique massivement
utilisé des années 1960 à 2000 comme antifouling pour les bateaux). Ces substances sont
connues pour être très toxiques pour les mollusques, même à des teneurs extrêmement faibles
et sont rencontrées dans les eaux côtières. Les premiers travaux ont montré que cette anomalie
était due à l’inhibition de l’aromatase conduisant à des concentrations plasmatiques accrues
en testostérone (Heidrich et al., 2001). De récents travaux ont déduit que ce phénomène était
39
sans doute dû à l’induction de la voie des récepteur X de rétinoïdes (RXR) (Lima et al., 2011),
ce qui implique que les effets sur la différentiation sexuelle sont donc indirects.
B. Poissons/Amphibiens
Les travaux pionniers de Sumpter (Purdom et al., 1994; Jobling, et Sumpter 1995), sur
la truite arc en ciel (Oncorhynchus mykiss), démontrant les effets des perturbateurs
endocriniens sur la féminisation des poissons, ont été un élément déclencheur pour montrer
l’urgence et l’intérêt d’étudier l’impact de ces composés sur les écosystèmes aquatiques. Les
amphibiens et les poissons (truite arc-en-ciel notamment) sont utilisés comme indicateurs de
facteurs de stress environnementaux du fait de leur développement larvaire (en phase
aqueuse) qui expose en permanence l'embryon aux composés potentiellement présents dans
l'eau de surface. En effet, les œufs n’ont pas de coquille de protection (Henry et al., 2000). La
sensibilité des amphibiens aux perturbateurs endocriniens peut être déterminée à l’aide
d’organismes modèles tel que le xénope (Xenopus laevis). L’effet de ces perturbateurs sur la
biologie de la reproduction, le système thyroïdien et le développement neural (Urbatzkaa et
al., 2007; Cevasco et al., 2008) a été observé chez cet organisme. Les oestrogènes conduisent
à la féminisation, les anti-oestrogènes neutralisent la différenciation sexuelle, les androgènes
provoquent une masculinisation, tandis que les anti-androgènes ont des effets féminisants.
(Kloas et Lutz, 2006).
Les effets des perturbateurs endocriniens sur les paramètres de la reproduction chez les
poissons sont bien documentés à la fois sur le terrain et au laboratoire. Le premier exemple
documenté d’une perturbation sexuelle généralisée dans une population de poissons remonte à
1998 (Jobling et al., 1998). Un des indicateurs le plus analysé est la féminisation des poissons.
Une forte incidence d'intersexualité et une augmentation significative des concentrations de
vitellogénine (Vg) dans le plasma ont alors été observées chez des gardons (Rutilus rutilus)
mâles capturés en aval de huit stations d’épuration au Royaume-Uni. Plus tard, des analyses
chimiques ont révélé la présence d’oestrogènes naturels et synthétiques ainsi que des
alkylphénols et du bisphénol A dans ces effluents (Jobling et al., 2004). Ces chercheurs ont lié
la présence de gonades intersexuées chez Rutilus rutilus avec des modifications dans la
maturation sexuelle et une diminution de la production de gamètes et de la fertilité (Jobling et
al 2002 a; 2002 b). Les travaux similaires de Munkittrick et al. (Munkittrick et al., 1991) ont
montré que l’exposition des poissons «white sucker» (Castostomis commersoni) du Lac
Supérieur (Etats-Unis) à des effluents d’usines de pâtes à papier réduisait la taille des gonades
40
et la capacité de reproduction. De même, une étude de Hashimoto et al. (2000) montre qu’au
Japon, 15 % des flets sauvages (Pleuronectes yokohamae) mâles capturés dans la baie de
Tokyo, recevant une grande quantité d’effluents industriels et domestiques, avaient des
ovocytes dans leurs testicules (Hashimoto et al., 2000). Des études menées en laboratoire
montrent que l'éthinyloestradiol peut être utilisé pour améliorer la production d'œufs chez les
poissons femelles, et induit une démasculinisation des mâles. Les oestrogènes naturels,
oestradiol et oestrone ont des effets similaires, l'oestradiol étant le plus puissant (Arcand-Hoy
et Benson, 1998; Gordon et al., 2004). D’autres études ont démontré des effets néfastes chez
le mosquito fish dus à des composés tels que l’éthinyloestradiol, le tamoxifen, ou le
méthyldihydrotestostérone. Sur les populations de poissons, on observe une diminution de la
masculinisation et du taux de spermatozoïdes (Larsson et Forlin 2002; Toft et Guillette 2005;
Cheshenko et al., 2008), l’apparition des phénomènes d'intersexualité (Vigano et al., 2001;
Van Aerle et al., 2001), et un impact sur la croissance et la différenciation sexuelle chez le
poisson chat (Sridevi et al., 2013).
Le développement embryonnaire des poissons peut également être altéré par la
présence de perturbateurs endocriniens. Les malformations squelettiques sont les plus
spectaculaires dans la mesure où le squelette constitue la charpente de l’animal. Elles ont été
décrites surtout chez les espèces d’élevage, mais elles sont également bien connues dans la
nature (Dawson, 1964). Elles affectent les différentes parties du squelette, mais les plus
répandues sont celles du rachis : lordose et scoliose (Madsen et Dalsgaard, 1999). Ces
malformations résultent soit d’anomalies du développement et affectent alors la morphologie
générale (tératologie) et/ou la croissance, soit de facteurs écophysiologiques variés : carences
alimentaires (Rao et Raghuramulu, 1995), perturbations hormonales (Antunes et Da Cunha,
2002; Dulcic, 2003). Ainsi, suite à l’exposition, en laboratoire, d’œufs de médaka japonais
(Oryzias latipes) à des extraits de sédiments contaminés par des polluants organiques, les
embryons peuvent présenter une déformation marquée de la colonne vertébrale absente chez
les individus témoins (figure 12) (Cachot et al., 2007 ; Kessabi et al., 2012). Des observations
similaires ont été mentionnées pour d’autres espèces en présence de composés comme la
dioxine, les HAP, les PCB (Cachot et al., 2005; 2006; Yamauchi et al., 2006; Gagnon and
Rawson, 2009; Kessabi et al., 2012).
41
Figure 12 : Déformation de la colonne vertébrale chez des médakas âgés de 10 semaines. A : Médaka
japonnais-Oryzias latipes; B : individu normal; C : individu présentant une lordose sévère (cachot et
al., 2005)
C. Effet sur les mammifères
Les mammifères marins sont particulièrement vulnérables aux effets des perturbateurs
endocriniens persistants. Comme les humains, ils ont une durée de vie longue et occupent des
niveaux trophiques supérieurs. En outre, ils ont de grandes réserves de graisse qui agissent
comme des puits pour les composés lipophiles qui sont ensuite libérés en quantité pendant la
grossesse, l'allaitement et les périodes de famine. Des niveaux élevés de PCB et d'autres POP
(polluants organiques persistants) ont souvent été enregistrés, parfois à des niveaux connus
pour provoquer des anomalies de la reproduction. Les Pinnipèdes, comme les otaries, ont reçu
plus d'attention que les cétacés et en raison de leur taille. Dans les populations sauvages des
anomalies de la reproduction ont été signalées dans les zones polluées par ces substances et,
dans certains cas, ces anomalies sont en corrélation avec le niveau de contaminants présents
dans le corps. C’est le cas d’une étude faite dans la mer de Wadden (Jensen et al., 1979) qui a
recensé une diminution du taux de reproduction des phoques dans cette zone et qui a été
corrélée à une pollution par les PCB provenant du Rhin. Les taux élevés de troubles de la
reproduction, l’augmentation de l'expression de CYP1A1 (due à une activation du récepteur
AhR), et de kystes ovariens, indiquant une ovulation anormale, ont été observés dans les
populations de cétacés se nourrissant dans les zones contaminées (Fossi et al., 2013; 2006).
Concernant les mammifères terrestres, un lien, entre les polluants et la perturbation de
la fonction endocrinienne, a été donné comme une explication possible de la diminution de
populations et des anomalies de la reproduction de plusieurs espèces en particulier les
panthères et les loutres (Roos et al., 2001; Elmeros et al., 2006). En 1995, la population de
panthères de Floride ne comptait plus que 30 à 46 individus dont certains présentaient des
42
anomalies au niveau des systèmes reproducteur et immunitaire (Facemire et al., 1995). Les
anomalies de la reproduction se caractérisaient par des spermatozoïdes anormaux, une faible
concentration spermatique et des cas de cryptorchidie. Bien que la consanguinité soit une
cause possible de ces anomalies, l'exposition à des xéno-estrogènes peut également induire
des effets chez ces panthères. En effet, de fortes doses de mercure, de sélénium et de plusieurs
organochlorés ont été détectées dans les tissus d'une panthère morte. De plus, les ratons
laveurs, la principale proie de ces panthères, accumulent de fortes quantités de pesticides
organochlorés via leur alimentation. Néanmoins, une relation causale entre ces perturbateurs
endocriniens et les anomalies de la reproduction n'a pu être établie.
D. Observations chez l’Homme
Chez l’homme, les observations ont permis de mettre en évidence qu’une exposition
fœtale ou périnatale aux perturbateurs endocriniens peut entraîner une différentiation sexuelle
et des malformations urogénitales suivies d’une diminution des capacités de reproduction à
l’âge adulte (Anway et al., 2005).
Parallèlement plusieurs symptômes, regroupés sous le terme de « Syndrome de
Dysgénésie Testiculaire » (Bay et al., 2006), témoignent d’une altération des fonctions du
système reproducteur chez l’homme depuis une vingtaine d’années comme des malformations
génitales, une baisse de qualité du sperme et une augmentation des cancers des testicules et de
la prostate (Sharpe et Skakkebaek , 1993; Storgaard et al., 2006).
Chez la femme, des études épidémiologiques mettent en avant une tendance à la
puberté précoce, des irrégularités menstruelles, une fertilité altérée (Massart et al., 2003), une
augmentation d’enfants prématurés, de cancers du sein et des organes génitaux (Coumoul, et
Barouki, 2002; Hilakivi-Clarke, 2006). L’exemple le plus connu est celui de l’utilisation du
diéthylstilbestrol chez les femmes enceintes entre les années 1938 et 1971 pour prévenir
l’arrêt spontané des grossesses. Suite à l’exposition in utero, la descendance a été sujette à un
nombre anormalement élevé de cancers du vagin et à une légère augmentation des risques du
cancer du sein, alors que les garçons ont été sujets à des anomalies dans le développement du
système reproducteur et à une augmentation des risques du cancer de la prostate et des
testicules (Schrager et Potter, 2004).
43
L’origine des troubles du système de reproduction n’est pas clairement établie à ce jour
mais il est possible que ces symptômes soient les conséquences d’une exposition multiple et
sur le long terme aux perturbateurs endocriniens.
VI. Perturbateurs endocriniens dans les effluents et les milieux
aquatiques
Les effluents de station d’épuration représentent la source la plus importante
d’insertion de PE dans le milieu récepteur. La grande majorité des perturbateurs endocriniens
utilisés en milieu urbain ou domestique se retrouve dans les eaux usées. En effet, ces
composés sont principalement d’origine domestique (hormones naturelles ou de synthèse,
lessives, cosmétiques..) et industrielle. Les rejets convergent vers les stations de traitement où
certains perturbateurs endocriniens sont très mal éliminés dans les STEP classiques. Ils se
déversent donc dans le milieu aquatique via les effluents. Cette voie de rejet est celle des
hormones de synthèse et de produits de cosmétique comme les parabènes. Les herbicides,
utilisés en agriculture, sont généralement entraînés par lessivage et se déversent directement
dans le milieu naturel (sources diffuses) (tableau 7). Les principaux perturbateurs
endocriniens déversés de cette façon sont les oestrogènes issus de l’élevage, les produits
phytosanitaires et les résidus s’infiltrant dans le sous-sol des sites contaminés (cas des
colorants industriels par exemple). De ce fait, de nombreuses études ont démonté que la
perturbation endocrinienne de certains effluents, aussi bien en Europe que dans d’autres pays
n’était pas négligeable (Dagnino et al., 2010). Cette activité biologique exprimée en
Equivalent oestradiol (EEQ) est mesurée par différent tests in vivo et in vitro (voir section
VII) (Cargouet et al., 2007; Nelson et al., 2007) et montrent que, dans certaines stations
d’épuration, cette activitée peut varier de 10 ng/l à 130 ng/l EEQ (selon les études et les tests
utilisés) au niveau des eaux arrivant dans la STEP (Murk et al., 2002). Cette activité passe en
deça la vingtaine de nanograme par litre (activité allant de 16ng/l à 0,03 ng/l EEQ) à la sortie
des stations d’épuration. Dans les eaux de surface, l’activité oestrogénique atteind 1,5 ng/l
EEQ (Pillon et al., 2005).
44
Tableau 7 : Sources de perturbateurs endocriniens entrant dans les eaux environnementales (Birkett
et Lester, 2003)
Source
Eaux usées
domestiques
Eaux usées
industrielles
Décharge
industrielle
Peinture pour
bateaux
Écoulement agricole
(récoltes)
Écoulement agricole
(animaux)
Ruissellement
urbain
Lixiviats de
décharge publique
Déposition par l'air
Eaux naturelles
Eau réceptrice
Substances susceptibles d'être
présentes
Eau de surface
Eau souterraine
Eau souterraine (alimentation)
Eau de surface, Eau
souterraine
Eau de surface, Eau
souterraine
Agents de surface, HAP, PCB,
PBDE, pesticides, PAE, BPA
Dioxines, PBDE, TBBA, PAE,
PCB, HAP, pesticides, BPA
Eau de surface
TBT
Eau de surface, Eau
souterraine
Eau de surface, Eau
souterraine
Eau de surface, Eau
souterraine
Pesticides, AP, APE PBDE,
HAP
Eau souterraine
HAP, PBDE, TBBA, BPA, PAE
Eau de surface, Eau
souterraine
Eau de surface, Eau
souterraine
HAP, PCB, PCDD, PCDF,
PBDE, TBBA, pesticides
HAP, oestrogènes stéroïdes
(phyto-estrogènes)
Oestrogènes stéroïdes, Agents
de surface, PAE, BPA
Oestrogènes stéroïdes
Pesticides, HAP
A. Présences des parabènes
Bien que les stations d’épuration permettent un abattement de ces composés (Lee et
al., 2005), le méthyl, l’éthyl, le propyl et le butyl parabènes ont été détectés dans des effluents
à des concentrations de l’ordre du ng/l (Paxeus, 1996; Lee et al., 2005; Canosa et al., 2006).
En entrée de station d’épuration, le composé majoritaire, largement retrouvé, est le
méthylparabène car il est le plus utilisé comme conservateur aussi bien dans les produits
cosmétiques que dans l’alimentation (Geara-Matta , 2013). Ses concentrations peuvent
atteindre le milligramme par litre dans certains pays européens comme le Danemark
(Andersen et al., 2007), le Royaume-Uni (Kasprzyk‐Hordern et al., 2008) ou encore
l’Espagne (González‐Mariño I et al., 2009). Les autres parabènes sont également retrouvés et
le moins présent est le benzyl parabène du fait de son interdiction (Canosa et al., 2006). En
sortie de station d’épuration, en raison d’un abattement important de ces composés lors du
traitement secondaire (Eriksson et al., 2009), ils sont retrouvés à des concentrations plus
45
faibles. Certaines études mentionnent des concentrations très faibles de l’ordre du
nanogramme par litre voir en dessous des limites de détection (Lee et al., 2005; Canosa et al.,
2006; Pedrouzo et al., 2009) et d’autres montrent, au contraire, une présence plus importante
de ces composés. En effet, il a été retrouvé des concentrations pouvant atteindre, par exemple
en Suisse, 423 ng/l pour le méthylparabène et 16 ng/l pour le benzyl parabène (Jonkers et al.,
2009a et b). De ce fait, ces composés peuvent être présents dans les eaux de surface (Brausch
et al., 2010). Ils ont été détectés par exemple en Espagne (González‐Mariño et al., 2009), en
Belgique (Benijts et al., 2004) et aux Etats Unis (Renz et al., 2013). Ces concentrations
peuvent atteindre 147 ng/l d’éthylparabène dans les rivières indiennes (Ramaswamy et al.,
2010).
B. Présence des mycotoxines
Les mycotoxines sont des métabolites secondaires produits par plusieurs variétés de
champignons du genre Fusarium, Aspargillus et Penicilium, qui se développent surtout dans
les denrées périssables. Bien que la plupart des études se soient intéressées à leur présence
dans l’alimentation, quelques-unes les ont identifiées dans l’eau. Des études ont montré la
présence de mycotoxines dont certaines sont connues pour leur activité oestrogénique comme
la zéaralénone ou la déoxynivalénol (DON) (Hartmann et al., 2007). Gromadzka et al., en
2009. La zéaralénone est, en effet, présente dans les milieux aquatiques à des concentrations
pouvant atteindre 43,7 ng/l dans certaines rivières polonaises (Gromadzka et al., 2009). La
présence de mycotoxine est expliquée par le développement de la fusariose (genre Fusarium)
dans les cultures. Le drainage par les pluies entraine la toxine dans le milieu naturel
(Hartmann et al., 2008). Le genre Fusarium produit également des mycotoxines appartenant à
la famille des trichothécènes comme la déoxynivalénol. Les concentrations de ce composé
naturel peut atteindre 20 ng/l dans les rivières du canton de Zurich en Allemagne (Bucheli et
al., 2008). Des études faites sur trois stations d’épuration suisses ont montré que la DON est
omniprésente dans les effluents à des concentrations allant de 32 à 118 ng/l (Wettstein et al.,
2010). Concernant l’ochratoxine A produite par le genre Penicillium, sa présence est
prédominante dans les rejets vinicoles (Nogueira et al., 2007) et dans le sol (Mortensen et al.,
2003). D’autres mycotoxines comme les aflatoxines, sont retrouvées en mélange avec les
fumonisines ou trichothécènes dans l’environnement (Hoerger et al., 2009).
46
C. Autres perturbateurs endocriniens
De nombreux autres composés sont retrouvés dans l’environnement dont certains
agissent sur le système endocrinien. C’est le cas des hormones naturelles (oestradiol et ses
dérivés). Par exemple, une étude faite sur les eaux résiduaires aux environs de Paris a montré
que les concentrations de ces hormones sont très variables. Les concentrations vont de 51 à
0,6 ng/l en entrée de station d’épuration pour l’oestradiol. Certaines hormones naturelles et
synthétiques de type oestrogène telles que l’oestrone, le 17-α-oestradiol et le 17-αéthinyloestradiol subsistent encore dans les effluents. En effet, cette même étude montre
qu’en sortie de station, les concentrations de ces composés varient de 19 à 1,2 ng/l (Cargouet
et al., 2001). Or, ces hormones sont actives à faibles concentrations, quelques ng/l, qui sont
susceptibles d’induire des effets sur l’écosystème aquatique. Des alkylphénols, le bisphénol
A, des phtalates et HAP ont été retrouvés en sortie de station d’épuration et dans les eaux de
surface (Céspedes et al., 2008; Voutsa et al., 2006 Sun et al., 2013). Comme ces composés
sont largement utilisés dans l’industrie, l’agriculture et dans les activités domestiques
(détergents), ils peuvent être retrouvés dans l’environnement à un niveau de concentration
supérieur à celui des hormones (μg/l). La figure 13 montre les composés potentiellement
retrouvés dans l’environnement ainsi que leurs concentrations (Wintgens et Melin, 2001).
Figure 13 : Substances à action endocrinienne dans les eaux résiduaires d’une station d’épuration
allemande (Wintgens et Melin, 2001).
47
VII. Détection des perturbations endocriniennes et des xéno-hormones.
Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées pour détecter la perturbation
endocrinienne et pour identifier les molécules responsables de ces effets. Des tests in vivo et
in vitro sont disponibles et permettent d’évaluer les effets (notamment les effets
oestrogéniques et anti oestrogéniques). Cependant, lorsqu’il s’agit d’identifier et de quantifier
plus précisément une substance dans une matrice donnée, les analyses physico-chimiques sont
plus adaptées.
A. Détection de la perturbation endocrinienne de contaminants et
d’effluents
1) Bioessais pour détecter la perturbation endocrinienne
a) Méthodes in vivo
Les essais in vivo présentent l’avantage de mesurer l’impact réel de la perturbation
(effet additif, synergique, inhibiteur etc..) sur des organismes vivants (Campbell et al., 2006).
Ces tests ont principalement recourt à l’utilisation de poissons comme la truite arc-en ciel
(dont l’induction de la vitellogénine est un biomarqueur très utilisé pour déterminer l’activité
oestrogénique), de rongeurs, d’algues, de plantes (Sumpter et Jobling 1995; Garcia- Reyero et
al., 2004). Les méthodes, pour les essais in vivo, sont bien définies et utilisées depuis
plusieurs décennies. Elles permettent d’intégrer de multiples mécanismes d’action et
d’évaluer les effets sur le système endocrinien globalement. Par exemple chez les rongeurs,
c’est l’expression de gènes endogènes ou des changements de phénotypes qui permettent
d’indiquer l’effet.
Deux types de tests réglementaires existent pour mesurer une activité oestrogénique ou
androgénique. Le test utérotrophique chez la souris ou le rat consiste à mesurer
l’augmentation du poids de l’utérus après 3-7 jours de traitement par de l’oestradiol ou le
produit dont l’activité oestrogénique est à tester. Le test de Hershberger, chez le rat, consiste à
mesurer l’augmentation du poids d’organes comme le gland pénien, les vésicules séminales
ou la prostate ventrale après 10 jours de traitement par un produit dont l’activité androgénique
est à tester (Vandenberg et al., 2007).
D’autres tests, pas encore validés par le CEVAM (Centre européen pour la validation
de méthodes alternatives) utilisant la technique de gène rapporteur in vivo, ont été développés
ces dernières années. Ces tests utilisent des animaux transgéniques (zébrafish, xénope ou
48
souris) dont le gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein) est sous le
contrôle d’un promoteur activable par les oestrogènes ou les androgènes. De tels modèles
existent pour les récepteurs ER chez le zébrafish (AromataseB-GFP et ERE-Luciférase)
(Legler et al., 2002a; Tong et al., 2009). Comme tous les modèles in vivo, ils présentent
l’avantage d’intégrer le métabolisme et donc d’étudier la dégradation d’un produit actif ou la
transformation d’un produit inactif en produit actif.
b) Méthodes in vitro
La caractérisation du potentiel «perturbateur endocrinien» de diverses substances
chimiques et de divers effluents a été réalisée grâce à des tests in vitro. Concernant la
perturbation oestrogénique, ces essais peuvent être classés en trois catégories : la mesure de
l’affinité d’un produit chimique à se lier au récepteur humain des oestrogènes (hER), la
prolifération de cellules «E-Screen-Assay», l’expression du gène rapporteur «YES-Assay».
b.1. Tests de liaison au récepteur.
Les tests de liaison à un récepteur particulier sont utilisés pour détecter des molécules
capables d’interagir directement avec un récepteur endocrinien, comme les récepteurs α et β
des oestrogènes ou le récepteur des androgènes. Ces tests permettent de mesurer l’affinité de
liaison du récepteur pour les ligands testés. Ils sont basés sur l’étude de la compétition entre la
molécule testée non radiomarquée et un ligand standard radiomarqué pour le récepteur (Leush
et al., 2006; Snyder et al., 2003). Le défaut principal de ces tests est qu’ils ne fournissent
aucune information sur l’activité hormonale du composé testé. Ils ne permettent pas, en effet,
de faire la différence entre une activité agoniste ou antagoniste par exemple (Farré et al.,
2005). Il est donc impératif d’utiliser un autre test fonctionnel in vitro pour la déterminer.
b.2 Tests de prolifération cellulaire.
Le test E-Screen est l’exemple le plus connu pour ce type de tests. Il est basé sur la
propriété que les cellules du cancer du sein MCF-7 sont capables de proliférer en présence
d’une molécule oestrogénique dans le milieu de culture (Soto et al., 1995). Ce test a permis de
déterminer l’oestrogénicité d’effluents de STEP et d’eaux de surface. Ce test est l’un des plus
sensibles pour analyser l’oestrogénicité des molécules et permet de distinguer une activité
agoniste ou non. Ainsi, une molécule est considérée comme un antagoniste pur lorsque (i) elle
n’affecte pas le nombre de cellules en absence d’oestrogène, (ii) elle bloque les effets
prolifératifs de l’oestradiol, et (iii) ce blocage est réversible en augmentant la dose
49
d’oestradiol tout en gardant constante la concentration de l’antagoniste (Sonnenschein and
Soto, 1998).
Ce test est utilisé pour détecter l’activité oestrogénique d’effluent et sa sensibilité peu
atteindre le nanogramme par litre (Bicchi et al., 2010; Kuch et al., 2010.) Néanmoins, du fait
de la sensibilité du test aux conditions de culture (sous-clones cellulaires différents, lots de
sérum), la variabilité des résultats en laboratoire est relativement importante (Eertmans et al.,
2003). Des tests de prolifération cellulaire ont également été développés pour détecter les
molécules ayant une activité androgénique ou anti-androgénique. Ces tests «A-Screen»
utilisent les cellules de carcinome de la prostate d’origine humaine LNCaP-TAC, dont la
prolifération est dépendante de la présence d’un androgène dans le milieu de culture
(Sonnenshein et Soto, 1998).
b.3 Dosage de l’activité oestrogèno-mimétique; le Yeast Estrogen Screen (YES) et autres
tests utilisant le gène rapporteur.
Ces tests se basent sur le modèle simple des cellules (cellules de mammifère ou
levure), qui expriment un gène sous le contrôle de promoteurs définis, répondant à des
substances spécifiques, et qui produisent ainsi un signal facilement quantifiable (Balaguer et
al., 1996). Les cellules sont transfectées de façon transitoire ou stable avec un plasmide
vecteur portant les séquences ADN d’un élément de réponse à une hormone (Hormone
Response Element ou HRE) couplées à un gène rapporteur comme celui de la β-galactosidase
ou de la luciférase.
Par exemple, le «YES-assay», utilisant des cellules de levure (Fawell et al., 2001;
Garcia-Reyero et al., 2001; Kirk et al., 2002; Hugget et al., 2003; Aerni et al., 2004; Gibson et
al., 2005; Vermeirssen et al., 2006) est souvent utilisé en raison de sa manipulation simple. Ce
test est basé sur la souche recombinante de la levure saccharomyces cerevisiae, qui contient,
dans son génome, un gène codant pour le récepteur humain aux oestrogènes (hER). Elle
contient également un plasmide portant l’élément de réponse aux oestrogènes (ERE)
contrôlant lui-même l’expression du gène rapporteur lac-Z qui code pour la β-galactosidase
(Routledge et Sumpter, 1996) (figure 14).
50
Figure 14 : Principe du YES (Yeast Estrogen Screen)
Ainsi en présence d’oestrogènes, la β-galactosidase est synthétisée. Elle métabolise un
substrat spécifique présent dans le milieu de culture comme le CPRG (chlorophénol rougebeta-D-galactopyranoside), conduisant à une coloration rouge due à la libération de
chlorophénol ou comme le 4-méthylumbellriferyl-β-D-galactopyranoside (MuGal) conduisant
à une florescence à 460 nm (Boever et al., 2001). L’intensité de la coloration ou de la
fluorescence est un indicateur de l’oestrogénicité de la molécule ou de l’effluent testé. Des
versions modifiées appelées «Lyticase assisted Yeast Estrogen Screen» (LYES) (Schultiset
Metzger, 2004) et le «Bioluminescent Yeast Assay» (BLYES) (Sanseverino et al., 2010) ont
été également développées. D'autres essais utilisent des cellules humaines du cancer du sein.
Elles contiennent déjà le récepteur humain aux oestrogènes, et elles sont transfectées, dans
certains cas, avec la luciférase dans le test ER-CALUX (Chemical-Activated LUciferase gene
eXpression ceU bioassay system) (Murk et al., 2002; Van der Linden et al., 2008), dans le test
T47D-KBluc ( exprimant les récepteurs alpha et beta aux oestrogènes), (Wilson et al 2004) ou
dans le test MELN (Cellule MCF-7 exprimant le récepteur alpha aux oestrogènes) (Cargouët
et al., 2004; Pillon et al., 2005; Cargouët et al., 2006). Ces essais montrent un grand intérêt
pour la détermination rapide de l'oestrogénicité des composés naturels et artificiels et
d’effluents.
51
Tableau 8 : Comparaison des limites de détection, des valeurs de EC50 et des durées des essais pour
les différents tests in vitro.
Test in vitro
Cellule
Limite de
détection
ng/l
EC50
Reference
(ng E2/l)
Durée de
l’essai
(jours)
ER-CALUX
T47D
0,1
1,6
3
Murk et al., 2002 ;Vethaak et al.,
2002
YES
Levure
2,7
27
2
Murk et al., 2002
<1
4
Hugget et al., 2003
3
3
Kirk et al., 2002
2
5
Arijs et al., 2002; Folmar et al., 2002
57
2
Folmar et al., 2002
60
3
Beresford et al., 2000
1,3-2,2
6
Körner et al., 1998, 1999, 2000
0,3-2,7
6
Körner et al., 2001
1
8
Gutendorf et Westendorf, 2001
E-Screen
MCF-7
0,27
Parmi les deux tests les plus utilisés, le test YES a montré une sensibilité environ dix
fois plus faible que l’ER-CALUX, et selon les tests utilisés les sensibilités peuvent variées
(tableau 8) (Leusch et al., 2010. Murk et al 2002). La limite de détection du test l’ER-CALUX
est de 0,1 ng/l. Pour mieux appréhender l’effet des effluents où les substances se retrouvent en
mélange, les équipes de recherche proposent donc un ensemble de tests où plusieurs effets
hormonaux sont analysés, par exemple l’activité oestrogénique et l’activité androgénique
(Grover et al., 2011).
2) Immunoessais pour détecter la perturbation endocrinienne
Ces bioessais, appelés immunoessais, se basent sur les propriétés de liaison entre
anticorps (Abs) et antigènes (Ags). Les technologies immunochimiques les plus
représentatives pour les analyses environnementales regroupent différents systèmes :
52
«enzyme-linked immunosorbent assay» (ELISA), «Radioimmunoasay» (RIA) (Snyder et al.,
2003), «Flow-injection immunoassay» (FIlA), «Immunoaffinity column » (Farré et al., 2005).
Le test ELISA offre plusieurs avantages par rapport aux autres immunoessais. Il est,
en effet, basé sur une technique immuno-enzymatique de détection permettant de visualiser
une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée, le plus souvent, produite par
l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps. De plus, il est robuste,
fournissant des mesures rapides, et demande peu de qualification pour son utilisation (Auriol
M., Thèse de doctorat 2007). Ainsi, cette méthode est très répandue pour les analyses
environnementales (Gascon et al., 1997; Goda et al., 2000; Valentini et al., 2002; Schneider et
al., 2004). Les principales enzymes utilisées sont la peroxydase de raifort (HRP), la
phosphatase alcaline (AP) et la β-galactosidase. Les désavantages de cette méthode
concernent les effets de matrice et les réactions croisées (Farré et al., 2005).
Le principe de la mesure repose sur la reconnaissance structurelle de la molécule cible.
Le système immuno-enzymatique est décliné en différents principes (figure 15) :

Dosages avec réactif limitant : méthodes par compétition ou méthodes indirectes
(figure 15 A) : l'antigène à doser entre en compétition avec l'antigène marqué pour la
liaison à l'anticorps; la totalité des sites anticorps disponibles est liée. On mesure la
fraction liée qui diminue exponentiellement avec la concentration en Ag à doser. On
peut procéder en phase liquide homogène ou en phase solide hétérogène; dans ce
dernier cas, la séparation des fractions libre et liée est facilitée. Cette méthode
s'applique à tous les antigènes quelle que soit leur taille, y compris les haptènes.

Dosage d'un antigène par méthode sandwich (ELISA sandwich) (figure 15 B) :
l'antigène doit posséder deux épitopes différents; il est pris en "sandwich" entre deux
anticorps. Il est ensuite révélé par un anticorps marqué. On mesure la fraction liée qui
augmente avec la concentration en antigène à doser (linéairement pour de faibles
concentrations).
53
Figure 15 : Schéma présentant les 3 principes utilisés pour la technique ELISA : (A) méthodes par
compétition, (B) Dosage d'un antigène par méthode sandwich (Lafont, 2005)
Les premières méthodes ELISA proposées pour détecter la perturbation endocrinienne
ont été développées pour la vitellogénine, biomarqueur de la perturbation oestrogénique
exprimée chez le poisson (indiquant une exposition à des oestrogènes mimétiques). Pour cela,
un anticorps monoclonal a été développé afin de mettre au point le test ELISA (Tyler et al.,
2002). Dans ce test, la xéno-hormone n’est pas directement mesurée mais c’est l’effet
engendré par le/les perturbateurs qui est détecté (Nilsen et al., 2004; Meucci et al., 2005;
Eidem et al., 2006; Verderame et al., 2011.) De même, ces tests ELISA développés, pour
détecter de très faibles concentrations de vitellogénine (6 µg/l) chez certains poissons comme
le Cyprinus carpio, permettent de déterminer l’effet «perturbateur endocrinien» notamment
oestrogénique et anti-oestrogéniques de composés chimiques pour lesquels ces effets
n’avaient pas encore été déterminés (Ebrahimi et al., 2007; 2005).
Les méthodes de «screening» des perturbateurs endocriniens incluent des tests réalisés
in vivo et in vitro. In vivo, les perturbateurs endocriniens sont capables d’interférer à différents
niveaux des mécanismes complexes de régulation du système endocrinien. Ces tests
permettent ainsi d’observer les effets engendrés par une molécule testée en prenant en compte
l’ensemble de ces interactions. Mais ils ne permettent pas d’identifier et de quantifier les
xéno-hormones à des concentrations de l’ordre du nanogramme par litre.
54
B. Détection des xéno-hormones avérées
1) Méthodes physico-chimiques
Parmi toutes les techniques analytiques, la chromatographie en phase gazeuse (GC) et
la chromatographie en phase liquide (LC) couplées à la spectrométrie de masse (MS) ou en
tandem (MS/MS) sont aujourd’hui les moyens les plus adaptés pour l’analyse des
perturbateurs endocriniens (Stanczyk et Clark, 2010). Les limites de détection relevées
tableau 9 en témoignent.
Tableau 9 : Techniques d'analyse utilisées pour la quantification des différentes classes de
perturbateurs endocriniens dans l'environnement aquatique
Classe de
polluants
Hormones
stéroïdes
Alkylphénols
Phtalates
Bisphénol A
Type d'échantillon
Séparation
Détection
LD (ng/l)
Référence
Entrée station/
Sortie station
Sortie station
Sortie station
LC
MS/MS
Stavrakakis et al., 2003
GC
LC
IC-MS
DAD
MS (ESI)
de 0,1 à
0,3
112
2-500
Entrée station/Sortie
station
Sortie station
LC
0,08-0,9
Baronti et al., 2000
LC
MS/MS
(ESI)
MS/MS
5-10
Lagana et al, 2004
Sortie station
Entrée station/
Sortie station
Entre station/Sortie
station
Sortie station
Sortie station
GC
LC
MS/MS
MS/MS
1
0,2-0,5
Kelly, 2000
Johnson et al., 2000
LC
MS/MS
de 0,5 à 10
Stavrakakis et al., 2008
LC
LC
APCI-MS
APCI/ESI
500
20-100
Castillo et al.. 2000
Petrovic et al., 2003
Sortie station
LC
500
20-100
Ahel et al, 2000
Petrovic et al., 2003
Entrée station/
Sortie station
Entre station/Sortie
station
Entrée station/
Sortie station
Entre station/ Sortie
station
LC
LC
UV
APCI/ESI
MS
APCI-MS
UV
MS-APCI
0,06-0,1
500
11
0,06-0,1
Castllo et al,
Ahel et al, 2000
Stavrakakis et al., 2008
Castllo et al,
GC
GC
LC
GC
MS
MS/MS
n. p.
11
Lee et Peart, 2000
Stavrakakis et al., 2008
Entre station/ Sortie
station
LC
MS/MS
n. p.
Lee et Peart, 2000
LD = Limite de détection
55
Xiao et al., 2001
De Alda et Barcelo,
2001
Le couplage chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse (LC/MS)
permet d’analyser des composés non volatils, ou des composés thermiquement instables qui
ne pourraient pas être analysés par GS/MS ou seulement après une première étape de
dérivation chimique. De plus, la conception des interfaces d’ionisation (ESI Ionisation
Electrospray et APCI Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique) ont permis d’améliorer
les limites analytiques. Concernant les oestrogènes naturels et synthétiques, leur
détermination dans les eaux usées est une tâche difficile à cause de la complexité de la
matrice et leur analyse en GC-MS et GC-MS/MS est difficile. La LC-MS et la LC-MS/MS
sont des technologies applicables à un large éventail de matrices et ne requiert pas de
dérivation préalable.
2) Bioessais, méthodes immunochimiques
Dans la section VII.A, les méthodes in vitro ont été présentées comme des outils
analysant la perturbation du système endocrinien. Cependant, certaines méthodes in vitro
peuvent identifier des xéno-hormones.
Bien que le dosage immuno-isotopique ou RIA (Radioimmunoessay), méthode en
phase liquide utilisant un anticorps secondaire radioactif, soit efficace pour déterminer la
présence d’oestradiol et de stéroïdes (Xing et al., 1983; Riffle et al., 2013), la technique
ELISA est une technique valable pour détecter et doser plusieurs polluants environnementaux
connus pour perturber les systèmes endocriniens.
Ainsi la technique ELISA a été développée pour détecter de façon spécifique le bisphénol A
(Verderame et al., 2011; Lu et al., 2012) avec une limite de détection variant de 0,1 à 0,05
µg/l selon l’anticorps utilisé. Plus récemment, des tests ELISA multiplex ont été developpés
(Marquette et al., 2012), pour la détection et le dosage simultané de plusieurs produits
chimiques, dont certains sont des perturbateurs endocriniens, comme par exemple le 2,4Dichlorophenoxyacetic (Desmet et al., 2013).
Les applications biologiques se sont développées sur des échantillons type plasma,
urine, par exemple, et se sont étendues aux applications environnementales, d’abord axées sur
des échantillons d’eau plus ou moins complexes (eaux de surface, eaux souterraines, effluents
de station d’épuration). Il est désormais possible de trouver de nombreux kits commerciaux
pour détecter des substances chimiques pouvant perturber le système endocrinien (comme les
PCB) ou des kits plus globaux détectant les oestrogènes. Selon les modèles, il est possible de
56
doser soit réellement un des oestrogènes (oestradiol, oestrone, éthynilestradiol), soit des
analogues structuraux des oestrogènes. De même des tests ELISA ont été développés pour
détecter l’oestradiol (Chiu et al., 2011; Handelsman et al., 2013) avec une limite de détection
de 1nM (Xin et al., 2009; 2008). Les techniques utilisant la chimiluminescence permettent de
détecter l’E2 à des concentrations pouvant atteindre 1,48 ng/l (Xin et al., 2010). Le tableau 10
donne une liste non exhaustive de kits actuellement disponibles. Il présente des kit qui
diffèrent au niveau des molécules ou familles de molécules ciblées, du type de matrice
environnementale et de la gamme de concentrations.
Tableau 10 : Exemples de kits commerciaux. Les NQE (définitives ou en proposition,
http://www.ineris.fr/substances/fr/page/9) sont données à titre indicatif.
Paramètre
Méthode
Matrice
Gamme de
calibration
NQE
Acétochlore et autres
acétanilides
Particules magnétiques
Eau, sol
0,10 à 2,5 µg/l
0,3 pg/l (alachlor)
0,3 µg/l (alachlor)
Alachlore
Particules magnétiques
Sol, eau
0,05 à 5,0 µg/l
Aldicarbe
Particules magnétiques
Eau
0,25 à 100µg/l
Alkyphénols éthoxylés
Microplaques
Eau, effluent
20 à 1000 µg/l
Alkylphénols
Microplaques
Eau, effluent
5 à 500 µg/l
Alkylphénols
Ethoxylates
Particules magnétiques
Eau
20 à 1000 µg/l
Microplaques
Eau
20 à 1000 µg/l
Atrazine et triazines
Particules magnétiques
Sol, eau
0,04 à 5,0 µg/l
Microplaques
Eau
0,02 à 1,5 µg/l
Microplaques
Eau, sédiment,
sol,
0,03 à 3 µg/l
Composés benzéniques
Mesure «total BTEX»
Particules magnétiques
Eau, sol
0,9 à 30 mg/l
(sol)
0,02 à 3,0 mg/l
(eau)
Bisphénol A
Particules
Effluent
5 à 500 µg/l
Particules magnétiques
Eau
0,05 à 10,0 µg/l
Carbendazime/Bénomyl
Particules magnétiques
Eau
0,10 à 5,0 µg/l
Carbaryl
Particules magnétiques
Eau
0,25 à 5,00 µg/l
Carbofuran
Particules magnétiques
Eau
0,25 à 5,00 µg/l
Chlorpyrifos
Particules magnétiques
Eau
0,22 à 3,0 µg/l
0,3 µg/l
(alkylphénols)
16 µg/l (atrazine)
0,01 à 0.07 mg/l
0,03 µg/l
DDT/DDE/DDD
Particules magnétiques
Eau, sol
1,25 à 75,0 µg/l
Diuron et phénylurée
Particules magnétiques
Eau, sol
0,03 à 3,0 µg/l
0,2 µg/l
2,4-D
Particules magnétiques
Eau
Sol
0,7 à 50 µg/l
0,15 à 7,5 mg/l
0,3 µg/l
Oestrogènes totaux
Particules/Microplaques
Eau
0,1 à 3,0 µg/l
Isoproturon
Particules/
Microplaques
Eau
0,05 à 0,5 µg/l
LAS surfactant alkylés
Particules magnétiques
Eaux, effluent
20 à 1000 µg/l
Méthomyl
Particules magnétiques
Eau
0,45 à 15,0 µg/l
57
0,3 µg/l
Paramètre
Méthode
Matrice
Gamme de
calibration
NQE
Métalochlor
Particules magnétiques
Eau, sol
0,05 à 5,0 µg/l
0,3µg/l (alachlor)
PCB
Particules magnétiques
Sol
20, 50, 100,
500mg/l
Eau
Sol
10 µg/l2000 mg/l
2-2000 mg/l
Eau
Sol
0.5 à 10µg/l
0,5 à 10 mg/l
HAP
Pentachlorophénol
Particules magnétiques
Particules magnétiques
Eau
Sol
HAP totaux
0,02 à 2,4 µg/l
1 à 1000 mg/l
Eau
Sol
Equivalent
phénanthrène
0,93 à 66,5 µg/l
0,2 à 5,0 mg/l
Eau
Sol
Equivalent
benzo[a]pyrène
0,04 à 10,0 µg/l
10 à 500 µg/l
Eau
Sol
5 à 500 µg/l
0,5 à 50 mg/l
Eau
Sol
0,06 à 10 µg/l
0,1 à 10,0 mg/l
0,4 µg/l
3) Détection de la perturbation oestrogénique dans l’environnement et les
eaux usées via le Yeast Estrogen Screen (YES)
Bien que le test YES s’avère moins sensible que les tests utilisant les cellules de
mammifère comme l’ER-CALUX, dans le cas de cours d’eau recevant des flux importants
d’eaux usées, ce test semble être une solution adaptée pour déterminer la teneur en
oestrogènes (Nelson et al., 2007). En effet, un problème majeur, dans l'utilisation de tests in
vitro pour analyser les échantillons environnementaux, est la présence de composés
inhibiteurs/cytotoxiques. Ces échantillons sont souvent contaminés par des substances autres
que les xéno-oestrogènes et peuvent interférer avec la croissance et la viabilité des cellules
animales. En revanche, cette cytotoxicité est moindre pour les levures. Finalement le choix du
système cellule de mammifère/levure va dépendre de la balance entre la limite de détection à
atteindre (c’est-à-dire la sensibilité du test) et le rapport coût/facilité de mise en œuvre. De
plus, le système «levure» a un certain nombre d'avantages par rapport à d'autres systèmes. En
effet, il ne présente pas de récepteurs d'hormones stéroïdiennes endogènes. Par conséquent, ce
58
système manque d’interactions complexes entre l'ER et d'autres récepteurs (Routledge et
Sumpter, 1996). En outre, étant donné que l'ER est transfecté dans la cellule, il n'y a aucune
préoccupation concernant l'effet des récepteurs mutants ou variants, qui sont connus pour être
présents dans des lignées de cellules contenant leur récepteur comme les cellules MCF-7
(Pfeffer et al., 1996). Un inconvénient du bioessais à base de levure est la présence d'une
paroi cellulaire et des mécanismes de transport actifs qui peuvent être différents de ceux
trouvés dans les cellules de mammifères et qui sont susceptibles d'affecter l'activité de
certains composés testés (Legler et al., 2002b).
Dans les échantillons d'eau, peuvent se retrouver en mélange des substances
oestrogéniques de faible puissance (comme les alkylphénols) pouvant être présents en grande
quantité et des composés ayant une activité oestrogénique très élevée (comme les oestrogènes
synthétiques ou naturels) présents à l’état de trace. Le comportement additif de l'activité
oestrogénique des substances individuelles dans un mélange a été démontré et constitue la
base pour évaluer quantitativement la teneur totale de l'activité oestrogénique dans un
échantillon via l'utilisation de dosages in vitro. Ainsi, l’oestrogénicité totale d’un échantillon
est comparée à l’amplitude de réponse provoquée par l’hormone naturelle E2. De ce fait, pour
pouvoir calculer une activité oestrogénique totale en fonction de la réponse des tests, les
résultats obtenus sont comparés à la concentration du 17-β oestradiol (hormone naturelle) qui
produirait le même effet biologique en utilisant le bioessais. On définit alors un indice
exprimé en équivalent 17-ß-oestradiol (EEQ) correspondant au potentiel oestrogénique.
Lorsque cet effet est évalué pour un composé ou un mélange de composés, il faut alors définir
ce facteur d'équivalence en 17-ß-oestradiol (FFA ou EEF selon les données de la littérature) :
où Ci est la concentration de l'espèce i.
Les potentiels oestrogéniques de certains composés ont été ainsi déterminés et ils sont
spécifiques à chaque bioessai utilisé (Nguyen 2011).
L'utilisation de l'essai in vitro YES a démontré une activité oestrogénique des eaux
usées et des eaux de surface dans de nombreux pays. En effet, de nombreuses études ont donc
été faites avec le YES sur des matrices complexes comme les eaux de station d’épuration de
façon à déterminer les concentrations en xéno-oestrogènes présents. Ce bioessais a été utilisé
59
en entrée et en sortie de stations d’épuration (Xm et al., 2008; Tilton et al., 2002). Par
exemple, dans une enquête nationale néerlandaise (Vethaak et al., 2002), le test YES a été
appliqué pour mesurer l'activité oestrogénique d’échantillons d'eaux usées et d’eaux de
surface. Dans presque la moitié des échantillons d'eau de surface, la réponse de l'essai YES
était inférieure à la limite de détection. L'activité oestrogénique des eaux de surface de la
Meuse est, en moyenne, de 0,04 ng/l EEQ (moyenne obtenue sur trois saisons
échantillonnage). La plupart des effluents des STEP ont également montré une activité
oestrogénique en-dessous de la limite de détection. En général, l'activité oestrogénique est
intensément réduite (de 88 à 99,9% d'élimination) par un traitement des eaux usées.
Cependant, il est apparu que l'activité oestrogénique dans les effluents était plus élevée que
dans les eaux réceptrices (Vethaak et al., 2002).
Une étude menée, en Belgique, sur des rivières et des effluents des eaux usées de
STEP municipales a montré que l’activité oestrogénique de l'eau de surface était plus
importante par rapport à celle de l'effluent (Witters et al., 2001). Sur 16 échantillons analysés,
les activités oestrogéniques varient de 2 à 85 ng/l EEQ et plus de 7 échantillons ont des
valeurs dépassant 10 ng/l EEQ (Witters et al., 2001). De même, Thomas et al., (2001) ont
utilisé le test YES pour évaluer l’activité oestrogénique d’eaux usées et de surface (estuaire au
Royaume-Uni) et ont trouvé un maximum de 24 ng/l EEQ (Thomas et al., 2001). Des études
similaires ont été faites aux Etats-Unis (Huggett et al., 2003), en France, ou encore au Japon
(Tashiro et al., 2003). Le tableau 11 résume les données de la littérature concernant
l’utilisation du YES dans des matrices environnementales.
Tableau 11 : Niveaux des EEQ trouvés dans différentes matrices environnementales analysées dans de
nombreux pays en utilisant le test in vitro YES. (Onda et al., 2002; Arijs et al., 2002)
Matrice
Affluents d'eaux
usées
Effluents d'eaux
usées
EEQ
35-72 (ng/l)
0,1 to 150 (pM)
< LD (4,46 ng/l)
0,1-15 (ng/l)
21-147 (ng/l)
4-35 (ng/l)
< LD (81,4 ng/l)
Eau de surface
<24 (ng/l)
10 (ng/l)
< LD (23,5 ng/l)
< LD : inférieur à la limite de détection
Pays
Japon
Chine
Belgique
Etats Unis
Etats Unis
Japon
Belgique
Angleterre
Japon
Afrique du sud
60
Référence
Onda et al., 2002
Li et al., 2008
Witters et al., 2001
Huggett et al., 2003
Tilton et al., 2002
Onda et al ., 2002
Witters et al., 2001
Thomas et al., 2001
Tashiro et al., 2003
Arijs et al., 2002
C. Biocapteurs pour le suivi des PE dans l’environnement
Dans un contexte de contrôle et de surveillance de la qualité des ressources en eau, la
détection de substances cibles, pouvant engendrer des effets sur le système hormonal,
nécessite de développer des biocapteurs compatibles avec une mesure sur site et plus
spécifiquement intégrés dans un système d’alerte en ligne répondant aux préoccupations des
gestionnaires et traiteurs d’eau.
1) Définition
Un biocapteur est un système analytique qui convertit une réponse biologique en un
signal physique mesurable (Blum et Coulet, 1991). Il associe un bio-récepteur, espèce
biologique permettant la reconnaissance sélective de la molécule cible, et un transducteur
permettant de détecter et/ou de quantifier les biomolécules dans les aliments, les matrices
environnementales ou dans les liquides biologiques (figure 16). Selon l’IUPAC (International
Union of Pure and Applied Chemistry), un biocapteur doit être petit et compact, avoir un
signal réversible, donner des concentrations fiables et établir une connexion réelle entre le
matériel biologique et le transducteur.
Figure 16 : Schéma du principe de fonctionnement d'un biocapteur d’après Minh, 1991
Les biocapteurs peuvent être classés suivant différents critères

Par type de bio-récepteur : enzymes, anticorps, cellules entières…

Par mode de transduction : optique, électrochimique, thermique ou massique.

Par type d'interaction entre le bio-récepteur et la substance cible : affinité, biocatalyse,
hybridation.
61
Le choix du bio-récepteur dépend de l’analyte recherché. Au fil des années,
différents bio-récepteurs ont été développés. Les plus communs sont les enzymes, les
anticorps, les acides nucléiques (ADN, ARN) et les récepteurs de molécules biologiquement
actives (hormones, toxines, facteurs de croissance). Il est également possible de concevoir des
biocapteurs à base de cellules entières (Rodriguez-Mozaz et al., 2004) (figure 17).
Figure 17 : Représentation des différents types de bio-récepteurs (Montrose, A. thèse de doctorat
2013)
Le type de transducteur est choisi en fonction des modifications biochimiques et/ou
physico-chimiques se produisant au niveau du bio-récepteur. Le transducteur convertit ces
changements en signaux électriques mesurables qui sont amplifiés et traités par des circuits
électroniques. Les plus utilisés reposent sur l’optique, la calorimétrie, la piézoélectricité et
l’électrochimie. L’objectif du développement d’un biocapteur est d’aboutir à un dispositif de
taille réduite (portatif) permettant de détecter, d’alerter, voire de doser directement un
polluant, de façon rapide, de préférence sans nécessiter l’ajout d’autres réactifs ou de
prétraitement de l’échantillon (Dejous, 2005).
Concernant les PE, deux classes de biocapteurs sont pris en compte : les biocapteurs
qui mesurent les effets perturbateurs du système endocrinien, et les biocapteurs qui répondent
à la présence d'une substance spécifique (ou groupe de substances) fondés sur la
reconnaissance spécifique d'une biomolécule. Les bio-récepteurs les plus utilisés pour
développer ces biocapteurs sont des bio-récepteurs d’affinité (anticorps, acide nucléique ou
récepteur membranaire) ou des bio-récepteurs métaboliques. Le tableau 12 résume les
applications possibles des biocapteurs dans l’environnement pour détecter les perturbateurs
endocriniens.
62
Tableau 12 : Biocapteurs électrochimiques pour l'analyse environnementale, d’après Farré et al 2009
Analyte
Atrazine
Isoproturon
Type et base
Test d'inhibition avec détection optique
Dosage indirect avec détection TIRF
Triazines
Test d'inhibition avec détection SPR
Surface inhibition test avec détection de
changement de l'indice réfraction
Immunodosages compétitifs avec détection
par fluorescence
Immunodosage compétitif avec détection
SPR
Immunocapteur optique basé sur la
fluorescence
Immunocapteur optique basé sur la
fluorescence
Pesticides
DDT et
dérivés
Hormones
Bisphénol A
Alkylphenols
et leurs
éthoxylates
Nonylphénol
Surfactants
Immunocapteur SPR
Immunocapteur utilisant la transduction
électrochimique
Immunocapteur utilisant la transduction
électrochimique
Biocapteur ampérométrique à cellules
entières en utilisant Pseudomonas et
Achromobacter
Sensibilité
1–10 μg/L
0.01–
0.14 μg/L
0.16 μg/L
15 μg/ml
Ref.
Skladal, 1999
Mallat et al., 2001
Harris et al., 1999
Bier et al., 1994
Tschmelak et al., 2005
15 ng/L
Mauriz et al., 2007
Sub-ng/L
Tschmelak, et al., 2006
Rodriguez-Mozaz et al.,
2004
Marchesini, et al., 2005
μg/L
Rose et al., 2002
10 μg/L
Evtugyn et al., 2006
25 mg/l
Taranova et al., 2002
2) Bio-récepteurs d’affinité
Dans cette classe de bio-récepteurs, se retrouvent principalement les anticorps, les
récepteurs membranaires et les acides nucléiques. Ils forment un complexe, le plus souvent
réversible, avec l’analyte et présentent l’avantage d’avoir une grande sélectivité et une forte
affinité pour son ligand.
Les biocapteurs utilisant des anticorps, ou immunoglobines et leurs dérivés sont
appelés immunocapteurs. Ils reposent sur la reconnaissance moléculaire spécifique des
anticorps avec les antigènes correspondants. De tels biocapteurs ont été développés pour
détecter les perturbateurs endocriniens et leurs effets.
En effet, le développement d’immunocapteurs optiques et électrochimiques permettent
de détecter des PE comme le bisphénol A (Gerardo et al., 2005; Rodriguez-Mozaz et al.,
2007) à des concentrations pouvant atteindre 0,4 µg/l. En utilisant la technologie SPR
(Surface Plasmon Resonance), la limite de détection peut atteindre 0,14 µg/l de bisphénol A
dans les effluents de stations d’épuration, ce qui est comparable aux résultats obtenus par le
test ELISA ou par HPLC (Hegnerová et al., 2010). Cette technologie permet également de
63
détecter le benzo-a-pyrène, l’atrazine et le nonylphénol à des concentrations de 0,07 µg/l, 0,16
µg/l et 0,26 µg/l respectivement. Le temps d’analyse est de 45 min (Dostálek et al., 2007).
D’autres substances chimiques comme certains pesticides, des alkylphénols sont analysés en
utilisant des immunocapteurs. L’oestradiol peut également être détecté dans des échantillons
d’urine et des échantillons d’eau (Ojeda et al., 2012; Butler et al., 2006). De récents travaux
ont permis d'optimiser la détection de cette hormone naturelle couplée à la détection du
diéthylstilbestrol dans des gammes de concentrations allant de 0,095 ng/l à 100 µg/l (Zhang et
al., 2014).
De même, la détection des effets de produits chimiques ou d’effluents peut être
réalisée en utilisant des biocapteurs d’affinité. Des anticorps monoclonaux anti vitellogénine
de carpe ont été développés (An et al., 2007) pour permettre le développement de biocapteurs
électrochimiques, optiques ou piézoélectriques (Darain et al., 2004; Bulukin et al., 2007; Kim
et al., 2008a). La détection de cette protéine dans le plasma des poissons est un indicateur
d’exposition environnementale aux oestrogènes.
Des biocapteurs d’effet oestrogénique exploitent les capacités de ces substances à se
fixer sur le récepteur aux oestrogènes immobilisé à la surface d’un transducteur. Le récepteur
aux oestrogènes est alors un bio-recepteur constituant un élément du biocapteur. Le récepteur
oestrogénique d’origine humaine est le plus souvent utilisé (Murata et al., 2003). Différents
modes de transduction comme la fluorescence (McLachlan et al., 2011), la SPR, la
voltamétrie cyclique (Murata et al., 2001; Zheng et al., 2013) ont été proposés. Des systèmes
portables utilisant la technologie SPR ont été développés (Soelberg et al., 2005). Un
biocapteur comportant des nanotubes de carbone fonctionnalisé avec le récepteur
oestrogénique humain (ERα) utilisant un transistor à effet de champ comme transducteur a été
proposé. Le temps de réponse est extrêmement rapide (2 min).
Le développement d’aptamères ADN ou ARN et le développement des MIP
(Polymères à Empreinte Moléculaire) ont permis de remplacer les anticorps comme biorécepteur d’affinité et de détecter des molécules de petites tailles (<400 Da dites hapten). Ces
molécules ont été développées pour plusieurs composés ayant des activités oestrogéniques
comme le bisphénol A (Jo et al., 2011; Ragavan et al., 2013.), l’oestradiol (Yildirim et al.,
2012) ou encore certains myco-estrogènes comme l’ochratoxine A (Rhouati et al., 2013;
Hayat et al., 2013). Les MIP ont l’avantage d’être moins affectés par la matrice de
l'échantillon. En revanche leur affinité pour le ligand est inférieure à celle des anticorps.
64
3)
Bio-récepteurs métaboliques et cellulaires
Les bio-récepteurs catalytiques ou métaboliques sont souvent choisis pour leur
capacité de reconnaissance et leur forte activité à de faibles concentrations. A la différence
des bio-récepteurs d’affinité, la réponse du biocapteur métabolique est basée sur une réaction
catalysée par des macromolécules. Concernant les perturbateurs endocriniens, les biorécepteurs enzymatiques ont été utilisés afin de développer des biocapteurs sensibles pour la
détection du bisphénol A ou de certains pesticides. Pour les premiers, la tyrosinase cible les
composés phénoliques (Portaccio et al., 2010; Wu et al., 2012; Dempsey et al., 2004.).
L'acétylcholinestérase ou AChE est une hydrolase dont l’activité est inhibée en présence de
certains insecticides organophosphorés et carbamates. Ces propriétés ont largement été
utilisées pour développer des biocapteurs (Dhull et al., 2013; Zejli et al., 2008; Andreescu et
Marty, 2006; Bucur et al., 2006; Ganesana et al., 2011). Les biocapteurs à enzymes
permettent d’atteindre un seuil de détection satisfaisant mais posent des problèmes de stabilité
dans le temps.
Les biocapteurs cellulaires ou microbiens utilisent des microorganismes vivants
comme élément de reconnaissance pour mesurer les changements physiologiques causés par
un stimulus interne ou externe. Plusieurs types de microorganismes ont été utilisés, des
bactéries, des levures, des algues, pour détecter la perturbation endocrinienne ou des
composés classés comme perturbateurs endocriniens (Taranova et al., 2002; Védrine et al.,
2003). Ces biocapteurs cellulaires peuvent mesurer l’activité métabolique (consommation
d’O2, production de CO2 etc..) et leur état rend compte d’une toxicité oestrogénique (Van
Ginkel et al., 2010). En revanche, leur réponse est moins rapide que celle d'un biocapteur
enzymatique. Certains bio-récepteurs sont des microorganismes génétiquement modifiés qui
ont été développés pour mesurer un contaminant spécifique. Par exemple, biocapteur basé sur
une souche de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiés qui, en présence d'un
composé oestrogénique produit la luciférase de luciole et a été appliquée pour la détection
d’une myco-estrogène, la zéaralénone (Välimaa et al., 2010).
4) Application des biocapteurs pour le contrôle environnemental
L'application de nouveaux biocapteurs à des échantillons environnementaux est l’étape
finale du développement du système de détection. Les échantillons les plus souvent analysés
sont les eaux de surfaces, les eaux potables et les eaux souterraines. Les applications dans les
matrices réelles sont primordiales pour déterminer leur effet sur la réaction biologique. Cette
65
dernière peut être affectée par le pH, la force ionique de la matrice ou l’apport d’autres
substances naturelles comme le carbone organique dissous qui peut, par exemple, interférer
avec les interactions antigène-anticorps (Wanekaya et al., 2008). De nombreux biocapteurs
enzymatiques ont été appliqués à l’analyse de contaminants dans des échantillons
environnementaux. Le plus souvent, l’élément de transduction associé est électrochimique
(détection ampérométrique ou potentiométrique). Le principal avantage de ce mode de
transduction est son faible coût, une bonne reproductibilité et la possibilité d’utiliser des
électrodes jetables. L'instrumentation est également facilement disponible, peu coûteuse et
compacte, ce qui permet d'effectuer des mesures sur site. Les limites des mesures
ampérométriques sont dues aux interférences potentielles de composés électro-actifs présents
dans l'échantillon lorsque l'on travaille à des potentiels élevés. L'utilisation de médiateurs
d'oxydoréduction permet de limiter ces problèmes d'interférences. De ce fait de nombreuses
applications ont été développées dans le domaine de l’environnement (tableau 13). Par
exemple, l’équipe de Kim et al., a optimisé une électrode à tyrosinase pour mesurer des
pesticides dans des échantillons d’eau (Kim et al., 2008b).
Tableau 13 : Biocapteurs électrochimiques pour l'analyse environnementale. D’après Farré et al 2009
Analyte/Effet
Biocapteur : type et base
Matrice
AChE, BChE. détection
Potentiométrique
Tyrosinase immobilisée sur
différents supports de carbone avec
une détection ampérométrique
Immunocapteur potentiométrique
Echantillons
synthétiques
Eau potable
et eau de
surface
Eau
Electrodes de diamant dopée au
bore et avec une tyrosinase
modifiée, détection
ampérométrique
ADN ampérométrique
Eau
10−6 M pour le
bisphénol A
Eau
Babkina
et al.,
2005
Organophosphate
s
Mono-Nanotube de Carbone
Biocapteur avec cellules entières
détection ampérométrique
Eau
Parathion
Activité enzymatique parathion
hydrolase avec une détection
ampérométrique
Biocapteur ampérométrique basé
Eau de
rivière
4,0 × 10−11,
1,0 × 10−10,
1,0 × 10−9,
5,0 × 10−9 M
pour le Cu(II),
Pb(II), Cd(II),
Fe(III),
respectivement
concentration du
phosphate dans
les systèmes
marins est de
0,04 mg/l
10 µg/l
Phenanthrene
Fahnrich
Carbamates
Bisphénol A
Bisphénol A
Bisphénol A, 17-βestradiol
Métaux lourds
Hydrocarbures
66
Eau
Limite de
Détection
1,5 × 10−5–
2,5 × 10−3 M
0,02 μM
0.6 ng/ml
Ref.
Ivanov et
al., 2000
Mita et
al., 2007
Piao et
al., 2008
Notsu et
al., 2002
Liu et
al., 2007
Sacks et
al., 2000
Analyte/Effet
aromatiques
polycycliques
Surfactants
Biocapteur : type et base
Matrice
sur des électrodes sérigraphiées
Biocapteur ampérométrique
bactérien
Eau
Limite de
Détection
LOD de 2 µg/l
0,25 mg/l
Ref.
et al.,
2003
Taranova
et al.,
2004
Par la suite, des travaux ont été entrepris pour automatiser ces systèmes. Quelques
outils ont été développés, par exemple le système RIANA est un immunocapteur optique qui
détermine la concentration de pesticides et de perturbateurs endocriniens. Il a été utilisé dans
différentes matrices environnementales comme les eaux de rivière, les eaux des surfaces, les
aqueducs. Le système AWACSS est une amélioration du système RIANA qui permet de
détecter 32 composés simultanément par réaction immunologique (Rodriguez-Mozaz et al.,
2009) . Ces deux systèmes automatiques de détection, fruits de travaux de recherche au
niveau européen, ont été appliqués à l’analyse de pesticides présents dans des échantillons
réels, de certaines substances prioritaires (DCE) et de perturbateurs endocriniens. Le tableau
14 présente les polluants analysés, les limites de détection ainsi que les matrices étudiées.
67
Tableau 14 : Liste des polluants organiques analysés par les systèmes RIANA ou AWACSS, soit seul,
soit en multi-analytes d'Après Rodriguez-Mozaz et al., 2008.
Analytes
LOD (ng/l])
Matrice aqueuse
Référence
Paraquat
10
Eau Milli-Q et rivière
Mallat et al., 2001
Isoproturon
10
Eau Milli-Q et rivière
Mallat et al., 2001
Triazines
60-200
Eau de rivière
Mallat et al., 1999
Propanil
0,6
Eau Milli-Q
Bisphénol A
14
Station hydraulique
Progestérone
0,37
Eau Milli-Q, eau potable et
rivière
Tschmelak et al.,
2004
Rodriguez-Mozaz et
al., 2005
Tschmelak et al.,
2004
Testostérone
0,2
Eau de surface
Estrone
0.2
1
Eau Milli-Q
Tschmelak et al.,
2006
Hua et al., 2005
Sulphonamides
2.7-6.6
Eau potable, eau de surface et
souterraine
Tschmelak et al.,
2004
Eau Milli-Q
Barzen et al., 2002
Détermination multi-analytes
Atrazine
30
Simazine
Isoproturon
30
110
Alachlore
70
2,4-D
70
PCP
4 230
Isoproturon
50
Atrazine
160
Estrone
80
Bisphénol A
5
Atrazine
2
Eau Milli-Q et eau de surface
Estrone
19
Eau souterraine
Isoproturon
I6
Rodriguez-Mozaz et
al., 2004; 2006
2,4-D : 2,4-dichlorophénoxyacétique, PCP : Pentachlorophénol
68
Tschmelak et al.,
2004
Chapitre II : Résultats et discussions
69
I. Observation et détection des effets biologiques des xéno-oestrogènes
Pour protéger quantitativement et qualitativement les masses d’eau ainsi que les
habitats des espèces qu’elle abrite, il est nécessaire d’utiliser des outils permettant d’établir un
diagnostic sur leur état chimique et biologique. La surveillance de la qualité de l’eau et de
surcroît de la qualité de l’environnement peut se faire suivant deux approches : (i) la détection
des polluants et leur quantification; (ii) l’évaluation des effets des polluants sur les organismes
vivants, soit à l’échelle des individus, soit à l’échelle des populations et des communautés
(Adams, 2002). La première approche, renseigne sur la nature du polluant et sa concentration,
mais ne renseigne pas sur l’impact qu’il peut avoir sur un organisme. La seconde approche
permet l’évaluation des perturbations environnementales et anthropiques sur les organismes et
sur les écosystèmes à plus ou moyen long terme. Ces organismes, choisis selon le temps de
réponse aux perturbations ou selon leur représentativité du milieu, sont des bio-indicateurs de
l’état de l’environnement et donc de la qualité des eaux. Le choix des indicateurs dépend donc
de la problématique abordée. Les indicateurs qui ont un temps de réponse court (heures,
jours), comme les bioessais in vitro (Microtox, Daphtoxkit), ont certes une signification
écologique
faible
mais
permettent
d’identifier
des
effets
de
contaminants
pris
individuellement ou en mélange et ainsi détecter des signaux précoces de la perturbation
environnementale. Combinés à la détection et à la quantification des polluants, ces outils
renseignent sur l’état de l’environnement sur une période donnée.
Le premier aspect abordé ici est l’utilisation d’indicateurs, ayant un temps réponse
relativement lent (mois, années), dont la signification écologique est forte et permet une
bonne évaluation des effets à long terme d’une perturbation. Dans ce cadre, les poissons ou
les amphibiens sont très régulièrement utilisés comme bio-indicateurs pour la détection d’une
perturbation anthropique. Ils ont été durant longtemps (et le sont encore) ceux qui indiquent la
présence de perturbateurs endocriniens en raison de la grande similitude de leur système
hormonal avec celui de l’homme (Casanova-Nakayamaet al., 2011). Les études portent, le
plus souvent, sur l’étude de la production de la vitellogénine (protéine permettant la
production du jaune des œufs chez les poissons femelles) (Petrovicet al., 2002). La production
de cette protéine, en présence d’un contaminant chimique peut être activée chez les sujets
mâles. Parmi ces « imposteurs endocriniens », on retrouve des produits chimiques comme le
nonylphénol, le bisphénol A, les PCB, certains pesticides utilisés en agriculture, certains
métaux lourds, certains produits de soin comme les parabènes, les muscs mais aussi des
effluents particuliers comme des effluents de papetières. Les effluents contenant ces
70
contaminants peuvent donc avoir un réel impact sur la qualité de l’environnement et
notamment sur la qualité des environnements côtiers (estuaires). Or, ces zones particulières
sont des habitats de choix pour certaines espèces de poissons. Dans un premier temps, nous
avons étudié l’impact des rejets de certaines industries déversés dans le golfe de Gabès, sur
les malformations squelettiques d’une variété de poisson fortement présent dans ces zones,
l’Aphanius fasciatus.
Dans un second temps, les travaux mettront en évidence la pertinence de l’utilisation
de bioessais in vitro comme le Yeast Estrogen Screen (YES) pour détecter ces « imposteurs
hormonaux » dans les eaux environnementales et pour déterminer le potentiel oestrogénique
de composés industriels. Ces composés sont des composés naturels ou des substances
synthétiques provenant de produits de consommation courante ou d’activités industrielles et
présentent un effet endocrinien involontaire. C’est en transitant via les stations d’épuration
que ces contaminants gagnent les cours d’eau où ils produisent des effets perturbateurs
visibles et inquiétants impactant l’intersexualité des poissons. Or, l’efficacité d’une station
d’épuration (STEP) et le contrôle de la qualité des rejets est évaluée sur la base de paramètres
physico-chimiques et non sur les effets résiduels engendrés par les contaminants. Parmi ces
effets résiduels, l’effet oestrogénique est l’un des plus recherchés. Le bioessais YES est donc
utilisé pour détecter ces effets résiduels spécifiquement au niveau des stations d’épuration ou
dans des cours d’eau fragilisés par les apports d’effluent industriels et de STEP. Ce bioessais
est également un outil intéressant pour identifier les nouveaux polluants dits pseudooestrogènes (ou xéno-oestrogènes).
A. Observation des effets biologiques sur les écosystèmes côtiers tunisiens : étude des
déformations squelettiques chez Aphanius faciatus.
Au cours de ces dernières décennies de nombreux travaux scientifiques tentent de
montrer l’effet des contaminants environnementaux sur le système de reproduction et de
développement des organismes aquatiques notamment. Cette première partie est consacrée à
l’analyse de certains perturbateurs endocriniens oestrogéniques communément retrouvés dans
l’environnement côtier du golfe de Gabès recevant des rejets industriels et urbains contenant
des métaux lourds (Cu, Zn et Cd), des HAP, des oestrogènes (E1, E2, E3 et EE2), pour
expliquer la fréquence élevée des déformations squelettiques observées chez une espèce de
poisson Aphanius fasciatus collectée dans cette région.
71
L’étude est limitée autour du Golfe de Gabès sur quatre sites (figure 18). Le site S1 dit
côte de Luza est le site de référence. Les trois autres sites se différencient par les types de
rejets qu’ils reçoivent. Le site S2 est la côte limitrophe de Sfax et est sujet à de fortes
pollutions industrielles (usines de traitement du phosphate et industries chimiques). La côte de
Kniss (site S3) et l’Oued Hamdoun (S4) sont soumis à une pollution due à l’activité agricole
des villages avoisinants, aux activités de la zone industrielle de Monastir, aux activités
aquacoles et aux activités urbaines. L’étude est menée sur une période qui s’étend de 2007 à
2010. Les résultats de ces travaux ont été publiés dans Chemosphere, Volume 90, Issue 11,
Mars 2013, Pages 2683–2689.
Figure 18 : Localisation géographique des sites d’échantillonnage
La présence de contaminants dans les milieux aquatiques se traduit souvent par
diverses
manifestations
sur
les
espèces
autochtones au
niveau
morphologiques,
histopathologiques et cellulaire…Certaines de ces manifestations peuvent être utilisées
comme biomarqueurs d'exposition. L’évaluation des malformations squelettiques est l'une des
méthodes les plus simples pour étudier les effets de la contamination sur les poissons en
raison de la facilité de reconnaissance par rapport aux autres types de biomarqueurs (Sun et
al., 2009). Dans cette étude, une évaluation des anomalies squelettiques a été faite chez des
individus prélevés dans les quatre zones. Les résultats obtenus montrent que le pourcentage de
déformations dans la population d’Aphanius fasciatus, analysée sur le site de référence S1,
avoisine 5%, ce qui est cohérent avec les résultats de la littérature (Sassi et al., 2010). Les
sites S3 et S4, qui reçoivent des rejets urbains et industriels présentent moins de 5% de
déformations. En revanche, la fréquence des malformations est 8 fois plus élevée pour le site
pollué S2 que pour le site témoin S1. En effet, le pourcentage de déformations avoisine 18%
72
pour le site S2 entre 2007 et 2010 et peut atteindre 30% lors de la période de reproduction des
poissons.
Afin d’identifier les causes possibles des déformations retrouvées dans le site S2, nous
avons analysé l’occurrence des polluants qui pourraient être produits par une activité
industrielle comme les métaux, les HAP et certains oestrogènes naturels et synthétiques. Les
résultats montrent que la côte industrielle de Sfax (site S2) est la plus polluée. Elle présente
une forte teneur en métaux en comparaison aux autres sites. Par exemple, ce site contient 67
µg/l de zinc dans l’eau, et une teneur en HAP non négligeable (0,1 à 2 µg/g dans les
sédiments). La teneur en cadmium est vingt fois plus élevée que les autres sites (figure 19).
De plus, les malformations observées sont corrélées avec la présence de taux élevés de
cadmium pour le site S2. Des travaux précédents ont montré qu’une contamination en
cadmium pouvait induire des déformations chez le poisson zèbre (Cheng et al., 2000).
Figure 19 : Niveau de pollution en métaux et en HAP au niveau des quatre sites étudiés.
Les résultats obtenus par HPLC montrent, pour tous les sites, la présence
d’oestrogènes. Les principaux composés retrouvés sont l’oestrone, l’oestriol et le 17βoestradiol. Les activités oestrogéniques mesurées ne montrent pas de différence entre les sites.
L’activité oestrogénique ne permet donc pas d’expliquer la fréquence des déformations
observées.
En revanche, l’ensemble de ces résultats montre une corrélation entre la présence de
contaminants (HAP et éléments trace) en mélange dans l’environnement et les déformations
squelettiques observées chez Aphanius fasciatus.
73
Une étude précédente (Kessabi et al., 2010) met en évidence des dosages d’ARNm
codant pour le cytochrome P4501A (CYP1A) dans les poissons normaux et anormaux
prélevés dans le site S2. Les dosages montrent que le taux d’ARNm CYP1A est 10 fois plus
important dans les organismes anormaux. De plus, ce taux d’ARNm chez les organismes
normaux prélevés dans le site S2 est comparable à celui retrouvé chez les organismes
normaux prélevés dans la zone témoin S1. En revanche le taux d’ARNm codant pour la
vitellogénine est le même pour les organismes normaux et anormaux quel que soit le site de
prélèvement. Or, il a été montré que le récepteur à la dioxine (AhR) intervient dans
l’activation de certains gènes comme celui de CYP1A (voir chapitre 1, IIB). Des travaux ont
démontré que cette expression peut être induite par des hydrocarbures aromatiques et
récemment par le cadmium (Kluxen et al., 2012) et qu’il y a une relation entre la signalisation
du récepteur des oestrogènes et celui de la dioxine like AhR (Matthews et Gustafsson, 2006;
Swedenborg et Pongratz, 2010). Ces résultats semblent conforter nos travaux qui montrent un
effet combiné des métaux lourds (principalement le cadmium) et des HAP et qui induirait une
fréquence élevée de malformations squelettiques chez Aphanius fasciatus. En revanche les
causes précises de cette déformation ne sont pas élucidées, cette co-exposition induit une
modification des enzymes de biotransformation et indirectement a des effets sur la croissance
osseuse de ces espèces. Ce travail est une approche préliminaire pour caractériser les impacts
morphologiques chez Aphanius fasciatus dus à des contaminants transportés par des rejets
industriels dans le Glofe de Gabès.
74
Chemosphere 90 (2013) 2683–2689
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Chemosphere
journal homepage: www.elsevier.com/locate/chemosphere
Possible chemical causes of skeletal deformities in natural populations
of Aphanius fasciatus collected from the Tunisian coast
Kaouthar Kessabi a,⇑, Ali Annabi a, Aziza Ibn Hadj Hassine b, Ingrid Bazin b, Wissem Mnif c,
Khaled Said a, Imed Messaoudi a
a
b
c
LR11ES41: Génétique, Biodiversité et Valorisation des Bioressources, Institut de Biotechnologie, Université de Monastir, Monastir 5000, Tunisia
Ecole des Mines d’Ales, Centre LGEI, 6 av. de Clavieres, 30319 Ales Cedex, France
Laboratoire de Biochimie, Unité de Recherche 02/UR/09-01, Institut Supérieur de Biotechnologie, de Monastir, Université de Monastir, 5000 Monastir, Tunisia
h i g h l i g h t s
" Patterns of skeletal deformities were detected in natural population of Aphanius fasciatus.
" The high incidence of spinal deformities was observed in the most polluted site.
" The most polluted site is contaminated mainly by heavy metals and organic compounds.
" Relation between the observed deformities and chemical pollution was suggested.
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 9 March 2012
Received in revised form 8 November 2012
Accepted 24 November 2012
Available online 20 December 2012
Keywords:
Aphanius fasciatus
Skeletal deformities
Endocrine disruption
Organic pollution
Metallic pollution
Tunisian coasts
a b s t r a c t
This study attempt to quantify and identify skeletal deformities in natural populations of Aphanius
fasciatus collected from the Tunisian coast and tends to found a possible relationship between these
anomalies and several types of pollutants presents in the environment. Fish were collected from one reference area (S1: coast of Luza) and three polluted areas (S2: industrialized coast of Sfax, S3: coast of
Khniss and S4: Hamdoun’Oued). Various patterns of skeletal deformities were diagnosed using double
staining technics, and the levels of heavy metals (Cd, Cu and Zn), various polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and estrogenic compounds were determined in water and sediment from different sites.
Spatio-temporal variation of the spinal deformities frequencies in A. fasciatus show that high incidence
of spinal anomalies has been recorded in population collected from S2 in comparison to three other ones.
Morphological results indicated that skeletal deformities of adult A. fasciatus were grouped into 13 categories that described abnormalities on spines, vertebrae, arcs and mandibles. A total of 1025 abnormalities were quantified. The results of chemical analysis showed that the levels of heavy metals and PAHs
were significantly higher in S2 than in S1, S3 and S4. High level of estrogenic activity was observed only in
S4. A possible correlation between environmental exposures to a mixture of pollutants in coastal waters
in S2 and spinal deformities in A. fasciatus was suggested.
Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
Spinal deformities have been reported in natural fish populations as well as in farmed fish (Aunsmo et al., 2008; Ayed et al.,
2008; Kessabi et al., 2009; Bardon et al., 2009; Messaoudi et al.,
2009a; Sun et al., 2009). However, skeletal malformations in
farmed fish are very common and are a major problem in aquaculture (Koumoundourous et al., 2001a,b). Whereas, the observation
of spinal deformities in wild specimens of teleost fish is relatively
rare (Dahlberg, 1970; Da Chuna and Antunes, 1999).
⇑ Corresponding author. Tel.: +216 73465405; fax: +216 73465404.
E-mail address: [email protected] (K. Kessabi).
0045-6535/$ - see front matter Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.chemosphere.2012.11.047
While, skeletal malformations in aquaculture appear to be related to a complex interaction of genetic, procedural and infectious/immunological factors (Lall and Lewis-McCrea, 2007;
Aunsmo et al., 2008, 2009; Bardon et al., 2009), the presence of
deformities in natural populations are most likely related to pollution (Lemly, 2002; Kessabi et al., 2009; Messaoudi et al., 2009a).
Indeed, it has been suggested that spinal deformities in natural
populations of fish serve as a biomarkers of environmental pollution (De La Cruz-Aguero and Perezgomez-Alvarez, 2001; Antunes
and Lopes Da Cunha, 2002; Xuan Yang, 2004).
It is well known that a wide variety of chemicals can cause
skeletal deformities through such mechanisms by altering the
development and bone formation. These include heavy metals such
2684
K. Kessabi et al. / Chemosphere 90 (2013) 2683–2689
as lead (Pb) (Bengtsson and Larsson, 1986), cadmium (Cd), many
organophosphorus pesticides, polycyclic aromatic hydrocarbons
(PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs), toxaphene (Cheng
et al., 2000; Teraoka et al., 2002) and natural estrogenic compounds such as ethinylestradiol (EE2) (Boudreau et al., 2004) and
17 beta-œstradiol (E2) (Urushitani et al., 2002).
The Mediterranean killifish, Aphanius fasciatus (Valenciennes,
1821) is a small cyprinodont fish inhabiting brackish waters in
coastal habitats of the central and eastern Mediterranean Sea. It
tolerates a wide range of physico-chemical parameters, such as
temperature (5–39 °C) and salinity (0–180 g L 1). We have recently
described, in natural populations of this species collected from the
Gulf of Gabes in Tunisia, a complex spinal deformities consisting of
a consecutive repetition of scoliosis, lordosis, and kyphosis from
the head to the caudal fin. Deformed fish were eight times more
frequent in the industrialized coast of Sfax than in the coast of Luza
which is unaffected by human activities, possibly indicating a
relationship between pollution levels and spinal deformities
(Messaoudi et al., 2009b). However, a direct relationship between
observed spinal deformities and pollution was not determined in
this species.
Therefore, this study attempt to quantify and identify skeletal
deformities in A. fasciatus populations which is naturally exposed
to several types of pollutants. For this purpose fish were collected
from three polluted localities: S2, S3 and S4, and from a reference
site S1. In addition, heavy metals (Cd, Cu and Zn), PAHs, estrogenic
activities and estrogenic compounds were also determined in
water and sediment of these sites in order to establish a relationship between these pollutants and the high incidence of spinal
deformities detected in A. fasciatus.
important industrial activities, mainly crude phosphate treatments
and chemical industries, was chosen as a most polluted site. This
site is contaminated with heavy metals, essentially Cd. The S1,
located 50 km north of S2 apparently unaffected by human activities, was used as reference sample site (Barhoumi et al., 2009;
Messaoudi et al., 2009b). Pollution in S3 caused by human
activities is related to the proximity of the industries in Monastir
South, aquaculture activities, the penetration of the water weir
South Bay loaded Khniss of pollutants from the village and neighboring areas of culture, and, particularly through the wadi and the
activity of washing the wool. The discharge of hot water by Power
station via S4 used for overflow sewage, contributes to a sizeable
rise in water temperature, this temperature can reach 36 °C. It also
contributes to environmental enrichment in nutrients especially
ammonium which is an indicator of urban pollution.
2. Material and methods
2.2.1. Skeletal deformities analysis
The double staining method was used to evaluate anomalies
observed in specimens. Normal fish and fish showing a morphological deformity were fixed in buffered 10% formalin and stained
using the ‘‘Alcian Blue-Alizarin Red’’ double staining method (Park
and Kim, 1984). Alcian Blue 8 GX (Sigma) was used to stain
cartilage in blue followed by Alizarin RedS (Sigma) to stain calcified
2.1. Study sites and sampling
2.1.1. Sites characterization
Sampling sites were selected in the Tunisian coast (Fig. 1), three
polluted sites and a reference one. The S2, surrounded by
2.1.2. Sample collection
Fish were caught with a hand nets. Caught fish were counted and
the percentage of deformed fish was calculated from 2007 to 2010.
75 normal specimens (mean total length 3.14 ± 0.36 cm; mean total
weight 0.54 ± 0.17 g) and 77 deformed specimens (mean total
length 2.79 ± 0.34 cm; mean total weight 0.45 ± 0.15 g) were collected for the morphological study.
Water samples were collected from all localities at a depth of
0.5 m in clean bottles from the different areas. The upper 5 cm of
sediments were also collected. Sampling bottles were previously
cleaned by soaking with 10% nitric acid (HNO3) and rinsed with
ultrapure water.
2.2. Analytical procedures
Fig. 1. Location of the sampling sites. S1: coast of Luza: S2: industrial coast of Sfax; S3: Khniss; S4: Hamdoun’Oued.
2685
K. Kessabi et al. / Chemosphere 90 (2013) 2683–2689
structures in red. The combination of KOH and peroxide treatment
tends to increase the transparency of soft tissues and allow clear
observation of skeletal structure.
at 0.4 ml min
220 nm.
1
. A UV detector was used to detect estrogens at
2.3. Statistical analysis
2.2.2. Metal analysis
Water samples were stabilized at pH 2 with 1 M nitric acid prior
to direct determination of total metal concentrations. Sediment
samples were oven-dried for 48 h at 100 °C and 100 mg of each
sample was mineralized at 250 °C with a set of acids composed
of 1 ml of nitric acid, 2 ml of fluorhydric acid and 0.5 ml of
perchloric acid and then adjusted to 10 ml with deionised water.
Samples were analyzed to determine Cd, Cu and Zn concentrations
using a graphite furnace AAS technique (ZEEnit 700). Samples were
analyzed in triplicate. The variation coefficient was usually less
than 10%. Metal concentrations are reported as lg g 1 of dry
weight for sediments and as lg L 1 for water samples.
2.2.3. PAHs (polycyclic aromatic hydrocarbons) determination
The assays performed were carried out according to the protocol of CEAEQ (www.ceaeq.gouv.qc.ca). PAHs levels in sediment
were determined by gas chromatography coupled with mass
spectrometry. The following compounds were analyzed: acenaphthylene, acenaphthene, naphthalene, phenanthrene, anthracene,
fluoranthene, pyrene, benzo(a) anthracene, chrysene, benzo(b) fluoranthene, benzo (e, a)pyrene, benzo(g, h, i) perylene, and dibenzo
[a, h] anthracene. Data are reported as lg of PAHs/ g dry weight.
2.2.4. YES assay
Both agonist and antagonist activities of chemical dyes were
examined using the Yeast strain BY4741 (García-Reyero et al.,
2001). This recombinant yeast strain carries the b-galactosidase reporter gene under the control of the estrogen responsive element
ERE. The test consisted on the measurement of the b-galactosidase
activity (fluorescence at 460 nm after excitation at 355 nm;
Fluoroskan, Twinkle LB 970, BERTHOLD Technologies) after 6 h of
exposure to the solutions to be analyzed.
Within each experiment, an internal control was set up for the
reference estrogen, 17b-estradiol on one plate. The upper part of
each plate was filled with the solvent control (methanol), nine concentrations of E2 (1.0 10 12, 1.0 10 11, 1.0 10 10, 1.0 10 9,
1.0 10 8, 1.0 10 7, 1.0 10 6, 1.0 10 5 and 1.0 10 4 M).
For the effluent samples, dilution series (1–1000) of concentrated extract were prepared in distillated water. Each test for
effluent samples was evaluated at least three times by independent
experiments. Agonist activities of effluent samples were measured
as % of maximal fluorescence intensity produced by 17b-estradiol.
2.2.5. Estrogens detection
The derived estrogens were separated on a waters 2695 HPLC
machine, coupled with UV detector DAD996. The injection of
40 ll of samples was performed at 25 °C. The column was a C18
Ascentis C18, 5 cm 4.6 mm I.D., 5 lm; the mobile phase was a
mixture of water: acetonitrile (55:45); and the flow rate was set
For the skeletal deformities, results were reported as percentage
of fish affected and comparisons were performed with chi-square
test. For metal concentrations, data are given as means ± SE, and
differences were assessed by one-way ANOVA followed by protected least significant difference Fisher’s test. Values were considered statistically significant when p < 0.01.
3. Results
3.1. Incidence of spinal deformities in A. fasciatus
Spinal deformities were visible on the fish body immediately
upon catching. The results of spatial distribution among different
sites show that the percentage of deformed fish was significantly
higher (p < 0.0001) in S2 from 2007 to 2010 compared to the three
other sites (Table 1).
3.2. Skeletal anomalies: description and frequencies
Skeletal anomalies of adult A. fasciatus were grouped into 13
categories that described abnormalities on spines, vertebrae arcs
and mandibles. A total of 1025 anomalies were observed: 460 in
the vertebrae, 478 in the spines, 73 in the arcs and 14 in mandibles.
The number of anomalies recorded in normal fish was 31 (3.02%)
and 994 in deformed fish (96.97%). The most common abnormalities described are shown in Fig. 2. The frequencies of fish affected
with different skeletal anomalies are reported in Table 2.
3.3. Chemical analysis
The water physico-chemical parameters of sampling sites are
summarized in Table 3. Our results showed that the industrialized
coast of Sfax (S2) appeared as the most polluted site. In fact, PAHs
and heavy metals, especially Cd and Cu, were predominant in S2
compared to the three other sites (S1, S3 and S4). Physico-chemical
parameters such as pH, conductivity and dissolved O2 are similar in
all studied sites, while the highest temperature was recorded in the
Hamdoun river (S4).
Results presented in Fig. 3 showed that spatial variations of
incidence of spinal deformities in A. fasciatus populations and CdLire phonétique that spinal deformities that contents in water and
sediment of studied sites were very similar.
3.4. Estrogenic activities
Our results show that the high level of estrogenic activity was
observed only in S4 (60.5% in water and 99.65% of relative
Table 1
Spatio-temporal distribution of spinal deformities (percentages) in A. fasciatus populations from studied sites.
Year
2007
Sites
T
D
%
2008
T
D
%
2009
T
D
%
T
D
%
S1
S2
S3
S4
341
263
225
220
9
46
4
5
2.63
17.49*
1.77
2.27
477
518
250
268
20
80
7
3
4.19
15.44*
2.8
1.12
440
394
263
228
13
72
5
4
2.95
18.27*
1.9
1.75
500
500
219
264
20
71
3
5
4
14.2*
1.36
1.89
T: Total number of fish examined.
D: Number of deformed fish.
S1: Luza; S2: industrialized coast of Sfax; S3: Khniss and S4: Hamdoun river.
*
p < 0.0001: Significance from samples of the three other sites throughout the year.
2010
2686
K. Kessabi et al. / Chemosphere 90 (2013) 2683–2689
Fig. 2. Examples of skeletal anomalies in A. fasciatus. (a): Normal specimen, (b): deformed specimen, (c): normal vertebral column profile, (d): the black arrow points to
absence of spine, the white arrow points to fused spines. (e): The black arrow points to bifurcated spine, the white arrow points to broken spine. (f): The black arrow points to
short spine, the white arrows point to detachment of spines. (g): Abnormal shape of three consecutive spines, (h): fused vertebrae, (i): hypertrophied vertebrae, (j): the black
arrow points to atrophied vertebrae, the white arrows point to a Hypertrophied arcs, (k): detached arcs and (l): prognathe.
Table 2
Number (N) and frequencies (F) of normal and deformed A. fasciatus affected with
different skeletal anomalies.
Normal (n = 75)
Deformed (n = 77)
N
F
N
F
Anomalies of spines
Fused spines
Bifurcation
Detachment
Broken spines
Absence of spines
Short spines
Abnormal shape
3
6
8
0
0
0
0
0.63
8
10.66
0
0
0
0
46
77
77
39
20
19
49
59.74*
100*
100*
50.64*
25.97*
24.67*
63.63*
Anomalies of vertebrae
Fused vertebrae
Atrophy
Hypertrophy
4
3
2
5.33
4
2.66
77
50
65
100*
64.93*
84.41*
Anomalies of arcs
Arc detachment
Arc hypertrophy
Prognathe
0
0
0
0
0
0
27
15
14
35.06
19.48
18.18
n: Number of specimens examined
p < 0.0001: Significance from normal fish.
*
estrogenic activity in suspended mater). A light difference was observed between S1, S2 and S3 (Table 4). The results related to the
estrogenic compounds, detected by HPLC analysis in water and
suspended mater (SM) of different areas of study; indicate the
presence of estrone in water and 17b-estradiol and estriol in SM
collected from S4 (Table 4).
4. Discussion
The aim of this study was to diagnose skeletal deformities and
found a possible relationship between these deformities and several types of pollutants present in the environment.
Skeletal deformities, one of the most serious pathological effects in fishes, are well known for many fish species from different
areas of the world (Tutman et al., 2000; Ayed et al., 2008; Sun et al.,
2009). Assessing morphological deformities represent one of the
most straight forward methods to study the effects of contamination on fish because of the ease of recognition and examination
when compared with other types of biomarkers.
In our previous study, we have showed that CYP1A mRNA levels
in deformed A. fasciatus collected from the industrial coast of Sfax
(S2) were 10 times higher than the normal ones, suggesting a link
between the extent of deformity of impacted fish and their exposure to CYP1A-inducing pollutants (dioxins, dioxin-like PCBs,
PAHs) in the environment (Kessabi et al., 2010). In the present
study, population from the industrialized coast of Sfax (S2) was
found to have higher frequency of abnormal fishes as compared
to A. fasciatus from the other sites. PAHs and heavy metals have
been found in water and sediments of S2 with high levels as compared to other sites, suggesting a combined effect of these pollutants leading to different types of skeletal deformities observed
in A. fasciatus. This ecological situation is closely connected with
the promoted industrial development and intense human activities. This region differs greatly in many environmental aspects
and observed population differences in malformation frequency
might be explained by influence of environmental pollution. In
fact, the pollution in this coast is due essentially to the presence
of continuous discharge of pollutants from local industrial activities (Hamza-Chaffai and Pellerin, 2003) and from the phosphogypsum. Several reports have also indicated high metal concentrations
in soft tissues of Reditapes decussatus (Hamza-Chaffai and Pellerin,
2003; Smaoui-Damak et al., 2003) and in the fish Scorpaena porcus
(Hamza-Chaffai et al., 1995) from this coast.
The present study showed that spatial variations of incidence of
spinal deformities in A. fasciatus populations and CdLire phonétique that spinal deformities that contents in water and sediment
of studied sites were very similar. An increase in spinal deformities
rate induced by exposures of fish to Cd were reported by many
2687
K. Kessabi et al. / Chemosphere 90 (2013) 2683–2689
Table 3
Sites description.
Parameter
S1
S2
S3
S4
8.5
20.3
54.5
8.4
8.4
21.4
54.6
8.5
8.5
24
56
8.5
8.4
29.6
56.3
8.4
0.03 ± 0.01
3.06 ± 1.54
12.28 ± 1.47
0.62 ± 0.02*
15.29 ± 3.39*
67,25 ± 7.96*
0.02 ± 0.004
2.73 ± 0.79
12.85 ± 1.5
0.03 ± 0.01
2.43 ± 0.49
11.62 ± 1.78
Heavy metals sediment
(lg g 1 dry weight)
Cd
Cu
Zn
0.05 ± 0.01
3.05 ± 1.19
32.00 ± 9.57
1.78 ± 0.15*
36.84 ± 2.44*
143.66 ± 31.08*
0.04 ± 0.01
11.98 ± 2.06
20.35 ± 1.86
0.05 ± 0.01
4.74 ± 1.21
18.38 ± 3.00
PAHs sediment
(lg g 1 dry weight)
Acenaphtylene
Acenaphtene
Naphthalene
Phenanthrene
Anthracene
Fluoranthene
Pyrene
Benzo(a)anthracene
Chrysene
Benzo(b)fluoranthene
Benzo(e)pyrene
Benzo(a)pyrene
Benzo(g,h,i)perylene
Dibenzo[a,h]anthracene
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
0.05
0.05
0.06
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
0.12
0.1
<DL
0.29
0.28
0.23
0.25
0.17
0.09
0.2
0.26
<DL
<DL
<DL
0.07
0.09
<DL
0.21
0.22
0.13
0.09
0.11
0.07
0.17
0.18
<DL
<DL
<DL
0.06
0.05
<DL
0.18
0.25
0.2
0.15
0.22
0.09
0.23
0.22
<DL
R PAHs
0.16
1.99
1.34
1.65
pH
Temperature (°C)
Conductivity (mS cm
O2 (ppm)
Heavy metals
Water (lg L
Cd
Cu
Zn
1
1
)
)
PAHs: total concentration of PAHs presents in each site; <DL: inferior to limit of detection; S1: Luza; S2: industrialized coast of Sfax; S3: Khniss and S4: Hamdoun river.
*
p < 0.0001 (Significance from samples of S1, S3 and S4).
Table 4
Estrogenic activities (%) and estrogenic compounds detected in water (W) and
suspended mater (SM) of studied sites.
Sites
S1
S2
S3
S4
Estrogenic activity (%)
Estrogenic compounds
W
SM
W
SM
17.18
22.46
20.39
60.5
6.85
5.16
6.68
99.65
E2
<LD or NF
<LD or NF
E1
E2,
E1,
E2,
E2,
EE2
E3
EE2
E3
NF: compound not found.
<LD: inferior to limit of detection.
(E1: estrone; E2: 17b-estradiol; E3: estriol; EE2: ethynilestradiol).
S1: Luza; S2: industrialized coast of Sfax; S3: Khniss and S4: Hamdoun river.
Fig. 3. Cd levels and distribution of spinal deformities frequencies in A. fasciatus
collected from studied sites.
authors (Bervoets and Blust, 2003; Sassi et al., 2010). Myoxocephalus quadricornis exposed for 1 year to an artificial heavy metalcontaining effluent displayed spinal curvature and increased
frequency of vertebral deformities (Bengtsson and Larsson, 1986).
A causal relationship between high environmental levels of heavy
metals, especially Cd, and skeletal anomalies in fish has been
suggested by Bengtsson et al. (1985). Buhringer et al. (1990) found
highest Cd levels in the bones in rainbow trout, Oncorhynchus
mykiss suffering from deformities compared to healthy individuals.
Most of the evidence on Cd influence on induction of spinal
deformities in fish is from laboratory studies. Resorption of Ca from
the bone to compensate for disturbed Ca homeostasis, under Cd
influence, is suggested as the main mechanism behind the
observed deformities in these studies (Bengtsson and Larsson,
1986; Bervoets and Blust, 2003; Sassi et al., 2010). Cheng et al.
(2000) showed that the frequency of malformations in zebrafish
embryos increased with Cd concentration in culture media and
demonstrated a reduced myotome formation in Cd-induced spinal
deformity. These authors suggested that fish embryonic malformations induced by Cd might be mediated through ectopic expression
of developmental regulatory genes.
PAHs comprise a large class of widespread environmental
contaminants produced by both natural and anthropogenic
sources. Due to their persistence and accumulation in soils and
sediments, these compounds are now widely dispersed in the
biosphere, notably in sediments of estuaries and coastal marine
2688
K. Kessabi et al. / Chemosphere 90 (2013) 2683–2689
areas throughout the world. It was frequently reported that spinal
deformities can be experimentally induced in fish upon exposure
to different organic and inorganic substances, including metals,
metalloids and organic substances like PAHs, organochlorine compounds OC and dioxins (Yamauchi et al., 2006; Cachot et al., 2007;
Miller et al., 2007; Holth et al., 2008; Gagnon and Rawson, 2009).
Given their high estrogenic potency and their high prevalence
in the aquatic environment, the natural estrogens such as E1
(estrone), E2 (17 beta-estradiol), E3 (estriol) and the synthetic
estrogens, are of particular concern in the risk assessment of endocrine disrupting compounds for wildlife (Kramer et al., 1998;
Bjerselius et al., 2001; Van den Belt et al., 2001, 2002). Estrogens
are potent chemicals of which the estrogenic effects can be observed in laboratory studies at 1 ng L 1 (Routeledge et al., 1998).
In addition, length of the exposure period influenced the incidence
of morphological abnormalities as abnormalities worsened as
exposure progressed. This temporally cumulative effect was also
observed in response to EE2 treatment, in which a 60-d exposure
of Fundulus heteroclitus produced abnormalities at lower concentrations than a 25-d exposure (Boudreau et al., 2004). Although
S3 and S4 are polluted and show high values of PAHs, and S4 shows
an estrogenic activity up to 100%, the percentage of spinal deformities is low compared to S2. This confirms that estrogenic
compounds or PAHs alone are not able to give a high rate of malformations in A. fasciatus.
The causes of the occurrence of spinal deformities in natural
populations of fish are complicated and, to a large extent, unknown. They may be a response to a number of biotic factors and
abiotic factors which are not related to pollution. Nevertheless,
the observed association of the relatively high prevalence of spinal
deformity in A. fasciatus and the important accumulation of heavy
metals and PAHs in the industrialized coast of Sfax, seems to be
very interesting and suggest that these mixture of chemical pollutants may represent a potential risk to induce spinal deformities in
natural population of A. fasciatus. However, clear and confirmed
association of skeletal abnormalities in A. fasciatus from the industrialized coast of Sfax with contaminants still requires additional
research.
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B. Détermination de l’activité oestrogénique d’échantillons réels et de contaminants par
le Yeast Estrogen Screen (YES)
Parmi l’infinie variété des interactions avec un système biologique que peuvent avoir
les composés chimiques, l’attention s’est focalisée sur les composés susceptibles d’interférer
avec les réponses du système endocrinien via des récepteurs hormonaux. En particulier, un
système a été retenu, le récepteur aux oestrogènes étudié grâce à des systèmes de levures
recombinantes YES (Yeast Estrogen Screen).
Dans cet essai, des cellules de levure Saccharomyces cerevisiae ont été transfectées de
manière stable avec le gène codant pour le récepteur aux oestrogènes humain et un plasmide
contenant la séquence ERE et le gène rapporteur lac-Z codant pour l'enzyme β-galactosidase.
L'activation du récepteur hER, par liaison d'un ligand, provoque l'expression de gène lacZ, qui
produit la β-galactosidase. Cette enzyme est sécrétée dans le milieu de culture où elle
métabolise le substrat chromogène, le Mugal (4-méthylumbellriferyl-β-D-galactopyranoside),
qui produit alors un composé qui fluorescence à 460 nm après une excitation à 355 nm.
L’intensité de cette fluorescence est proportionnelle à l’activité oestrogénique d’un
échantillon d’eau ou au potentiel oestrogénique d’un composé chimique. Le 17 β-oestradiol
(E2) est utilisé comme composé de référence. Une série de dilutions de E2 est dosée
parallèlement aux échantillons. L'activité oestrogènique de chaque échantillon est ensuite
comparée à celle de E2.
Pour déterminer si les composés étudiés possèdent une activité anti-oestrogénique, du
17 β oestradiol (10-9 M) est ajouté au milieu. L'aptitude des composés ou de l’échantillon à
inhiber la synthèse de la β-galactosidase induite par l’E2 est alors déterminée (Routledge et
al., 1997; Sohoni et Sumpter 1998)
1.
Activité oestrogénique d’effluents de stations d’épuration du Sahel tunisien et présence de
parabènes
Les molécules à activité oestrogénique sont parmi les principaux perturbateurs
endocriniens transférés vers les milieux naturels via les eaux usées. Ils sont susceptibles de
provoquer, à des concentrations de l’ordre du ng/l, des altérations de la croissance, du
comportement et de la reproduction. Une des sources majeures de ces molécules sont les êtres
humains et les animaux qui les excrètent naturellement via leurs urines. Il existe également
des xéno-oestrogènes utilisés comme conservateurs dans l’alimentation ou dans les produits
de soins corporels comme les parabènes. Le propyl et le butyl-parabène sont des
84
conservateurs employés dans les produits de soin personnel ou comme additifs alimentaires.
Le propylparabène a des propriétés oestrogéniques et anti-androgèniques et il diminue la
production de spermatozoïdes chez les rats mâles. Le butylparabène présente une plus forte
activité oestrogénique et il a aussi des effets sur les hormones thyroïdiennes; il affecte la
mobilité des spermatozoïdes et leur nombre ainsi que le métabolisme des graisses. Toutes ces
molécules se retrouvent donc dans les eaux usées urbaines.
L’objectif de ce travail de recherche est d’étudier le devenir de ces xéno-estrogènes,
les parabènes, lors du traitement des eaux usées par les stations d’épuration. La distribution
des parabènes (eau, boues, MES) et l’activité oestrogénique au niveau de stations d'épuration
ont été analysées en combinant des évaluations chimiques et biologiques. La zone d’étude est
située sur le littoral tunisien. Ces travaux ont été publiés dans European Journal of Water
Quality en 2011 (vol 42 p 91-103).
Dans cette étude, l’activité oestrogénique des échantillons est exprimée en pourcent
par rapport à l’activité oestrogénique produite par une concentration de 10-9 M de 17 βoestradiol (E2). Ici l’EC50 est la concentration pour laquelle la réponse transcriptionnelle du
YES atteint 50% de sa valeur par rapport à des concentrations saturantes de 17 β-oestradiol.
L’EC50 est exprimée en équivalent oestradiol.
A l’issu de cette étude, il apparait que l’activité oestrogénique mesurée sur les eaux
d’entrée et de sortie, des trois stations, est relativement comparable. Elle est comprise entre 20
et 30% de l’activité de l’oestradiol E2 (10-9 M) en entrée et 40 et 60% en sortie selon les
stations. La comparaison de la concentration effective (EC50) de ces échantillons avec celle de
la substance de référence (17 β-oestradiol) montre que la charge équivalente en oestradiol
avoisine 10-9 M. Concernant les échantillons de boues, l’activité oestrogénique est plus
importante avec des EC50 pouvant atteindre 10-8M. Les matières en suspension ont une
activité oestrogénique plus faible.
Pour les trois stations d’épuration les concentrations en parabènes ont été mesurées par
HPLC pour les phases dissoutes, les matières en suspension et les boues. Les cinq parabènes
analysés sont le méthyl parabène (MeP), l’éthyl parabène (EtP), le propyl parabène (PrP), le
butyl parabène (BuP) et le benzyl parabène (BzP). La concentration des parabènes dans les
eaux résiduaires varie de 0,2 à 566 µg/l avec comme parabène majoritaire le méthylparabéne
(MeP). La concentration en MeP est très élevée dans la station A. Pour les autres stations, la
85
concentration de ce dernier est autour de 3µg/l. La station A reçoit des effluents provenant de
l’industrie textile. Des échantillons de cet effluent ont été analysés et il apparait que la
concentration en MeP atteint 400µg/l, ce qui peut expliquer, du moins en partie, les
concentrations relevées au niveau de cette station. Le méthylparabéne est retrouvé dans cette
station au niveau des matières en suspensions analysées en sortie. Parallèlement, le
méthylparabéne, l’éthylparabéne, le propylparabéne, le benzylparabéne et le buthylparabéne
ont été mesurés sur les fractions solides (boues et matières en suspension). Les concentrations
mesurées sont beaucoup plus élevées que celles retrouvées dans la littérature, jusqu’à 3500
µg/g de matière sèche pour l’éthylparabéne dans les boues activées II.
L’ensemble de ces résultats montre que l’abattement le plus important des parabènes a
lieu au niveau des bassins de traitement biologique (bassin d’activation I et II). En effet, les
concentrations dans les eaux traitées, à l’exception du méthylparabéne dans la station A, ne
dépassent pas 4µg/l. Par contre, l’activité oestrogénique en sortie de STEP est autour de 60%.
Dans notre cas, les parabènes n’expliquent pas la majeure partie de l’activité oestrogénique
détectée en entrée et en sortie de STEP, la présence d’autres xéno-estrogènes et/ou de leurs
produits de dégradation n’est pas à exclure.
Des résultats complémentaires ont montrés que les parabènes, bien que très présents
dans les différents compartiments étudiés ne pouvaient pas expliquer la totalité de
l’oestrogénicité évaluée par le Yeast Estrogene Screen. Les équivalents œstradiols (EEQ) ont
été calculés pour chaque concentration de parabène, déterminée en HPLC, et ces EEQ ont été
sommés pour obtenir un équivalent œstradiol calculé (EEQ calculé
parabènes) selon la
formule suivante :
où Ci est la concentration du parabène i, et FFAi est le potentiel oestrogénique du parabène i
établi avec le Yeast Estrogen Screen (Nguyen 2011).
Cette activité oestrogénique, exprimée en équivalent oestradiol (EEQ calculé
parabènes), est comparée à l’activité oestrogénique totale évaluée par le YES (EEQ mesuré
YES). Les résultats présentés tableau 15 montrent que l’activité oestrogénique due à la
présence des parabènes représente moins de 10% de l’activité oestrogénique totale évaluée
par le YES. Dans le cas des boues épaissies, leur activité représente un peu plus de 20% de
86
l’activité totale. Les parabènes, ne sont donc pas les principaux perturbateurs oestrogéniques
présents dans ces effluents et d’autres composés non analysés (car non recherchés)
contribuent à cette activité oestrogénique évaluée par le bioessais.
Tableau 15 : Activité oestrogénique exprimée en équivalent oestradiol (EEQ)
EEQ calculé (M)
parabènes
EEQ mesuré (M)
(bioessais YES)
EEQ calculé/EEQ
mesuré en %
EEQ calculé (M)
parabènes
EEQ mesuré (M)
(bioessais YES)
% EEQ
parabènes/EEQt
EEQ calculé (M)
parabènes
EEQ mesuré (M)
(bioessais YES)
% EEQ
parabènes/EEQt
Entrée
Sortie
station A
Boues de
retour
4,7 E-12
7,9 E-13
1,2 E-10
2,0 E-10
1,8 E-09
2,4%
Boues
activées I
Boues
épaissies
1,2 E-10
Boues
activées
II
1,2 E-09
2,0 E-09
9,0 E-09
5,0 E-09
1,0 E-09
0,04%
6,3%
1,3%
24,6%
22,5%
Entrée
Sortie
station B
Boues de
retour
Boues
activée
Boues
épaissies
2,2 E-12
2,0 E-13
1,3 E-10
1,2 E-10
Boues
activée
II
1,3 E-09
2,5 E-11
1,8 E-09
2,0 E-09
9,6 E-09
5,3 E-09
1,2 E-09
8,88
0,01
6,37
1,20
25,36
19,46
Entrée
Sortie
Station C
Boues de
retour
Boues
activée
Boues
épaissies
9,6 E-12
2,0 E-13
8,3 E-11
2,6 E-11
Boues
activée
II
nd
3,0 E-10
1,0 E-08
1,3 E-08
2,0 E-08
1,0 E-09
3,21
0,002
0,64
0,13
22,27
2,2 E-10
2,3 E-10
2,2 E-10
Les mesures établies sur la filière eau, démontrent que la biodégradation (traitement
biologique) et l’adsorption des parabènes sur la phase particulaire semblent être les processus
majoritaires dans l’élimination des parabènes (pas de traitement cible pour les parabènes).
Cette hypothèse est renforcée par les taux élevés de parabènes mesurés dans les boues
épaissies en fin de traitement. Certains composés ont une affinité pour les boues et pour les
matières en suspension, devenant ainsi un réservoir potentiel pour ces composés. En
conclusion, cette étude a permis de réaliser un bilan complet sur trois STEP en considérant
tous les compartiments, ainsi que l’activité oestrogénique associée. Peu d’études ont effectué
ces mesures sur un seul site. Les résultats enrichissent les informations disponibles dans la
87
littérature concernant la présence de parabènes dans la fraction dissoute et la fraction
particulaire et l’impact spécifique de chacune des étapes du traitement, qui restaient peu
étudiées jusqu’à présent. Ils confirment d’autres résultats obtenus précédemment sur le rôle
des parabènes vis-à-vis de l’activité oestrogénique. Les effluents et les boues contiennent des
teneurs en oestrogène très élevées. Ceci souligne l’importance d’approfondir les
connaissances sur la dynamique et la biodégradation des xéno-estrogènes de manière générale
par les boues activées et leur devenir au cours du traitement des boues d’épuration.
88
Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103
# ASEES, 2012
DOI: 10.1051/wqual/2012002
Disponible en ligne sur :
www.water-quality-journal.org
Activité estrogénique et détection
des parabènes dans trois stations
d’épuration du Sahel tunisien
Ibn Hadj Hassine AZIZA1, Bazin INGRID1*, Um KHÉMARY1,
Bartegi AGHLEB2 et Catherine GONZALEZ1
École des Mines d’Alès, Laboratoire de Génie de l’Environnement Industriel et des Risques
Industriels et Naturels, 6 avenue de Clavières, 30319 Ales Cedex, France
2
Department of Biology, Faculty of Sciences – King Faisal University, P.O. Box 1759,
31982 Al Hassa, Saudi Arabia
*Auteur de correspondance : [email protected]
1
(Article reçu le 5 mars 2012 ; accepté le 11 mai 2012)
Résumé – La présence dans l’environnement de composés chimiques
ayant des propriétés hormono-mimétiques génère des inquiétudes sur
leur devenir et leurs effets sur les organismes aquatiques. Parmi leurs
nombreux modes d’action, ces substances ont la capacité de se fixer
aux récepteurs des hormones stéroïdiennes comme le récepteur des
œstrogènes (ER) en mimant l’effet d’hormones naturelles et induisant
ainsi une perturbation du fonctionnement normal du système endocrine.
Ils sont liés très souvent au changement dans le « sex-ratio » et la
réduction du taux de fécondité chez certains vertébrés. Les substances
à activité estrogénique peuvent être d’origine naturelle comme l’estradiol ou les phyto- et myco-estrogènes, mais également d’origine
synthétique comme l’éthynylestradiol, les alkylphénols (surfactants),
certains pesticides ou des résidus de cosmétiques. Suite à leur utilisation, ils se retrouvent dans les filières de traitement des eaux usées.
Parmi ces molécules, les parabènes, conservateurs fréquemment
utilisés dans les produits cosmétiques, les crèmes, les produits pharmaceutiques, sont introduits dans l’environnement via les rejets
urbains. Du fait de leur activité estrogénique, ils font partie des
composés chimiques dont le niveau de concentration dans l’environnement est à surveiller.
Dans cette étude, trois stations d’épuration ont été sélectionnées afin
d’avoir une vision actuelle sur la présence des substances
estrogéniques dans les eaux usées et sur leur élimination. Dans un
premier temps, l’activité estrogénique, à l’aide de test in vitro (Yeast
Estrogen Screen, YES), a été mesurée en entrée, en sortie de station
d’épuration, et dans les boues, afin d’évaluer la variabilité de ces
Article published by EDP Sciences
92
I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103
activités dues à des polluants estrogéniques. La présence de cinq
parabènes, les plus utilisés dans l’industrie pharmaceutique
et alimentaire (benzylparabène, buthylparabène, ethylparabène,
propylparabène and méthylparabène), a été également recherchée au
moyen de l’HPLC/DAD. Le test YES a montré que les échantillons de
boues ont la plus forte activité estrogénique avec une EC50 (concentration effective médiane) qui varie de 1E−07 M à 1E−09 M EEQ (equivalent estradiol). Cette activité est largement suffisante pour induire des
perturbations endocriniennes chez les organismes aquatiques. Par ailleurs, les analyses en HPLC-DAD ont montré la présence des cinq
parabènes dans les échantillons prélevés en entrée et en sortie de
station. Ces composés sont présents dans l’eau (mg.L−1), les matières
en suspension (μg.L−1) et s’accumulent dans les boues (mg.g−1). C’est
la première étude qui montre la présence de parabènes dans des
effluents tunisiens et la possibilité d’associer cette « pollution » à une
activité hormonale dans les trois matrices citées au-dessus,
spécialement les boues qui sont souvent utilisées dans certaines
activités agricoles.
Mots-clés : Station d’épuration, parabènes, YES (yeast estrogen
screen), HPLC-DAD
Abstract – Estrogenic activity and parabens occurrence in three
Tunisian wastewater treatment plants. The occurrence of chemicals
in the environment, with hormonal activity, increases concern about
their fate and effects on the aquatic organisms. Among their various
mechanism of action, these compounds have the ability to bind steroid
hormones receptors like the oestrogen receptor (ER) and mimic natural
hormone effects: inducing disruption on the endocrine system functioning. They are usually related to sex-ratio disequilibrium and decrease of
fertility on some vertebrates fertility. Estrogens can be natural hormone
like estradiol, phyto and myco-estrogens, or synthetic such as ethynylestradiol, alkylphenols (surfactant), some pesticides and cosmetics.
After use, those compounds are found in the different sector of wastewater treatment plants. Among those molecules, parabens and preservatives usually used on cosmetics, creams, pharmaceutics, are
introduced in the environment through urban effluent. Due to their estrogenic activity, levels of those compounds in the environment must be
monitored.
In this study, three wastewater treatment plants were chosen to have
an actual point of view on the occurrence of estrogens on the urban
wastewater and their removal. First of all, estrogenic activity of the
influent, effluent samples, and sludge were investigated using in vitro
test (Yeast Estrogen Screen, YES) to evaluate variability in the estrogenic activity that can be attributed to estrogenic contaminants.
The occurrence of five parabens among most used ones in pharmaceutical and food corporations (bénzylparabène, buthylparabène,
ethylparabène, propylparabène and méthylparabène), were assessed
using HPLC/DAD. Sludge showed the highest estrogenic activity with an
EC50 (half maximum effective concentration) between 1E−07 M and 1E
−09 M EEQ (estradiol equivalent). This activity is enough to induce
endocrine disruption in the aquatic organisms. On the other hand,
I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103
93
HPLC-DAD analysis showed the presence of the five investigated parabens in the influent and effluent samples. Those compounds were
detected in water (mg.L−1), suspended matters (μg.L−1) and accumulates in sludge (mg.g−1).
This is the first study reporting the presence of parabens in Tunisian
wastewater and the ability to associate this “pollution” to hormonal
activity in the three matrices mentioned above, especially the sludge,
which is often used in some agricultural activities.
Keywords: Wastewater treatment plants, parabens, estrogens, YES
(yeast estrogen screen), HPLC-DAD
1.
INTRODUCTION
De nombreuses études font état de la présence dans l’environnement aquatique
de substances toxiques de classes chimiques et d’origines très diverses. Toutefois au
regard des 41 substances prioritaires listées dans la Directive Européenne (DCE),
l’émergence de nouveaux types de contaminants comme les parabènes pose
problème aux scientifiques et gestionnaires de l’environnement pour établir une
évaluation réaliste du risque pour l’environnement. Les parabènes sont des alkyle
esters de l’acide p-hydroxybenzoïque, ils sont utilisés comme antimicrobiens contre
les moisissures et les levures dans de nombreux produits alimentaires, pharmaceutiques et cosmétiques. Les parabènes les plus utilisés sont le méthyl parabène (MeP)
suivi par de l’éthyl parabène (EtP), du n-propyle (PpP), du n-butyl (BuP) parabène et
du benzyl parabènes (BzP) (Rastogi et al., 1995). L’activité de ces composés est
proportionnelle à la longueur de la chaı̂ne alkyle. Certains parabènes sont utilisés à
des concentrations inférieures à 1 % dans les produits cosmétiques comme les
crèmes, les rouges à lèvres, les lotions pour la peau, les shampooings, etc.
Cependant, depuis plusieurs années ces composés sont un sujet médiatique sensible suite à une étude montrant leurs implications dans certains cancers (Darbre,
2006). Plusieurs études ont montré le pouvoir estrogénique des parabènes : le méthyl
parabène, l’éthyl parabène, le n-propyle et le n-butyl parabène ont été identifiés comme
faiblement estrogéniques par la méthode de dosage des récepteurs d’estrogènes chez le
rat. En utilisant la méthode du « Yeast estrogen screen receptor » (YES), leur activité
estrogénique est 100 000 à 30 000 fois moins estrogénique que le 17β estradiol
(composé de référence) selon la longueur de la chaı̂ne alkyle (Routledge et al.,
1998 ; Bazin et al., 2010). Le benzyl parabène présente l’activité la plus importante,
activité qui au cours de certains tests s’est révélée être plus élevée que celle induite par
le bisphénol A (Honma et al., 2002). Des résultats similaires ont été démontrés par des
tests in vitro (Okubo et al., 2001 ; Morohoshi et al., 2005). Le n-butyl parabène a
montré une activité estrogénique dans des essais utérotrophiques chez le rat (Routledge
et al., 1998). Darbre et al. (2003) a également rapporté une augmentation de la masse
utérine chez la rate induite par une exposition au benzyl parabène.
En ce qui concerne les essais sur organismes aquatiques, le n-propyle induit chez
le male médaka une augmentation du taux de la vitellogénine (VTG) (Inui et al.,
2003). Des injections intrapéritonéales d’éthyl parabène, n-propyle et n-butyl
parabène chez la truite arc-en ciel induisent une réponse estrogénique équivalente
94
I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103
à celle obtenue suite à une injection de 100–300 mg.kg−1 de VTG (Pedersen et al.,
2000 ; Alslev et al., 2005). Plusieurs études ont conclu que l’effet de certains
parabènes sur le système endocrinien est similaire à celui induit par les estrogènes
endogènes et pourraient affecter le développement ou la maturation sexuelle de
nombreuses espèces vivantes (Oishi 2001, 2002a, 2002b ; Kang et al., 2002 ;
Lemini et al., 2004 ; Tavares et al., 2009).
D’un point de vue environnemental, peu d’études ont été menées pour déterminer le
niveau de présence et le devenir de ces composés dans les milieux aquatiques. Les
parabènes sont potentiellement « relargués » dans le milieu aquatique via les effluents
domestiques. Bien que les stations d’épuration permettent un abattement de ces
composés (Lee et al., 2005), le méthyl, éthyl, propyl et butyl parabènes ont été
détectés dans des effluents à des concentrations de l’ordre du ng.L−1 (Paxeus, 1996 ;
Lee et al., 2005 ; Canosa et al., 2006) ainsi qu’au niveau de certains sols et sédiments
(Núñez et al., 2008). L’éthyl parabène a été détecté dans les sédiments fluviaux japonais
sur deux sites d’échantillonnage à des concentrations de 3,3 mg.kg−1, les quatre autres
composés étant à la limite de détection (Japan Ministry of Environment, 2002).
L’objectif de ce travail est d’étudier l’effet oestrogénique, grâce à un outil in vitro
(biotest YES), d’effluents de trois stations d’épuration (STEP) tunisiennes recevant
différentes eaux résiduaires (eaux usées urbaines et touristiques, rejets d’industries,
rejets agricoles). Le niveau de concentration des cinq principaux parabènes (benzyl
parabène, buthyl parabène, éthyl parabène, propyl parabène et méthyl parabène) a
ensuite été déterminé par HPLC-DAD dans ces échantillons. Une comparaison entre
ces deux types d’information permet d’évaluer l’implication des parabènes dans la
toxicité endocrinienne à laquelle les organismes aquatiques de diverses masses
d’eaux (rivières ou eaux côtières) peuvent être soumis.
2. MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.1. Sites de prélèvement
Les échantillons ont été collectés au niveau de trois stations d’épuration dont
deux d’entre elles présentent des capacités de traitements similaires (Tab. I). Le
prélèvement a été fait au mois de mars 2010 en entrée et sortie de chaque station (le
prélèvement est fait sur 24 h), et de chaque compartiment des boues (un prélèvement
ponctuel est fait au niveau des boues activées I et II, et des boues épaissies).
Ces trois stations notées A, B et C sont localisées sur le littoral tunisien (fig. 1)
et traitent des eaux résiduaires venant de plusieurs origines :
–
–
–
Station A : les eaux résiduaires urbaines et industrielles (essentiellement textile),
Station B : les eaux résiduaires urbaines, industrielles et touristiques,
Station C : les eaux résiduaires urbaines et agricoles.
Des échantillons d’eaux et de matières en suspension ont été prélevés en entrées, en
sortie. Des échantillons de boues ont été recueillis à différents niveaux de la filière de
traitement : boues de retour, boues activées (I et II) et enfin les boues épaissies (sortie
de filière).
I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103
95
Tableau I. Paramètres caractérisant les stations étudiées.
Table I. Parameters characterizing studied stations.
Type
Eau
Population
Débit (m3.J−1)
DBO5 (kg.J−1)
DCO (kg.J−1)
148 000
165 000
17 700
13500
15500
1500
3125
3350
600
8440
9040
780
Station A
Station B
Station C
Fig. 1. Localisation géographique des trois stations d’épuration.
Fig. 1. Geographical location of the three wastewater treatment plants.
2.2. Préparation des échantillons
2.2.1. Phase dissoute
À partir de 1,5 L d’eau en entrée de chaque station, les matières en suspension
sont séparées par centrifugation. L’eau est ensuite extraite sur phase solide selon la
méthode décrite par Pillon et al. (2005). Cette méthode permet de concentrer les
échantillons d’eau sur une colonne de C18 (5 g, 20 mL) en mode inverse. La colonne
est préalablement conditionnée avec du méthanol et l’élution est faite avec du
méthanol puis avec de l’hexane. L’éluat obtenu est ensuite évaporé à 40 °C et le
résidu obtenu est dissous dans 2 mL de méthanol.
2.2.2. Phase particulaire (MES-Matières en Suspension) et boues
Les MES et les boues ont été homogénéisées puis lyophilisées. Les MES et les
boues sont extraites avec un mélange de solvant dichlorométhane/méthanol (2/1 ;
96
I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103
80 mL) sous agitation pendant 15 min. Après centrifugation (2 min à 3500 rpm), le
surnagent est filtré sur GF/C puis séché avec du sulfate de sodium anhydre. Les
extraits sont ensuite évaporés à l’aide d’un évaporateur rotatif à 40 °C puis repris dans
2 mL de méthanol. Les extraits méthanol sont conservés à −20 °C en attente de
l’analyse.
2.3. Test de l’activité estrogénique
La Souche de levure recombinante YES (Yeast Estrogen Screen) a été fournie par
le Professeur Barceló Damià (Madrid, Espagne) et contient deux plasmides le pVit
(contenant dans cet ordre l’élément ERE, le promoteur CYC et le gène rapporteur Bgal) et le pHHE0 (contient l’ADNc pour le récepteur des œstrogènes sous le contrôle
du promoteur ADH1) (García-Reyero et al., 2001; Bazin et al., 2010). Le principe du
test de l’activité estrogénique se base sur l’expression d’un gène rapporteur LacZ et la
mesure de l’activité de ce gène suite à l’activation des récepteurs des estrogènes
(activité β-galactosidase). Le test est fait selon le principe décrit par Bazin et al.
(2010). Le 17β-estradiol est utilisé comme composé référant. Une analyse par HPLC/
DAD est faite sur les échantillons du Galaizon de façon à connaı̂tre la présence ou
non de molécules connues à activité estrogénique Cet échantillon est considéré
comme un témoin négatif n’induisant pas de réponse transcriptionnelle chez le
Yeast Estrogen Screen.
Afin de déterminer l’EC50 du 17β-estradiol (composé de référence), une courbe
de réponse a été réalisée pour neuf concentrations (1E−12, 1E−11, 1E−10, 1E−9, 1E
−8, 1E−7, 1E−6, 1E−5 et 1E−4 M).
De la même façon, une série de différentes dilutions des échantillons allant de 1
fois à 100 fois dilués, permet d’évaluer l’activité estrogénique de ces derniers et d’en
déduire leur EC50. Ici l’EC50 est définie comme la concentration où la réponse
transcriptionnelle atteint 50 % de sa valeur par rapport à des concentrations saturantes de ligand. Cette EC50 pour les échantillons est exprimée en équivalent
œstradiol.
2.4. Chromatographie liquide haute performance /détecteur DAD
(HPLC/DAD)
Méthyl parabène (MeP), éthyl parabène (EtP), n-propyl parabène (PrP), n-butyl
parabène (BuP), benzyl parabène (BzP), proviennent de Sigma-Aldrich (France).
Les solutions mères de chaque parabène et les solutions contenant les cinq parabènes
en mélange sont préparées dans du méthanol. Elles sont ensuite diluées dans une
solution eau/méthanol (60:40) pour obtenir les concentrations filles (100, 200, 300,
400 et 500 μg). Une analyse par HPLC/DAD est faite sur les échantillons du Galaizon
de façon à connaı̂tre la présence ou non de molécules connues à activité estrogénique.
L’analyse des parabènes dans les différents échantillons recueillis a été réalisée
par HPLC en phase inverse. L’appareil utilisé est une HPLC-DAD (Waters 2695)
couplée à un détecteur de DAD (Waters 996). Une colonne « Luna PFP C18 » (15 cm ×
4,6 mm ID) est utilisée avec une phase mobile eau/acétonitrile (60:40), un débit de
I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103
97
Tableau II. Limite de détection et de quantification
déterminées dans le solvant d’extraction.
Table II. Limit of detection and quantification determined
in the extraction solvent.
Composé
Methylparaben
Ethylparaben
Propylparaben
Butylparaben
Benzylparaben \br
LQ (μg.L−1)
LD (μg.L−1)
1,6
2
2,7
3,2
1,7
1
1
1
1
1
1 mL/min. La séparation et les analyses ont été effectuées à température ambiante.
La détection parabènes a été réalisée à 257 nm.
Les performances de la méthode d’analyse ont été évaluées en étudiant, la
linéarité, la répétabilité, la spécificité (eaux de rivière et effluents de STEP). Les
limites de détections et de quantification analytique sont déterminées dans le solvant
d’extraction (tab. II). Les limites de détection et de quantification pour les
échantillons (phase dissoute, MES, boues) sont calculées en tenant compte des
facteurs de concentration lors de l’extraction.
3. RÉSULTATS ET DISCUSSION
3.1. Détermination de l’activité estrogénique des eaux usées par le
Yeast Estrogen Screen
De nombreuses études publiées ont montré la faisabilité de l’utilisation des
modèles in vitro comme le biotest YES (Yeast Estrogen Screen) pour la détection
d’activité estrogénique due à des polluants organiques au sein de mélanges environnementaux complexes tels que des extraits d’effluents ou de sédiments. Ce test est
basé sur des levures génétiquement modifiées répondant aux contaminants
oestrogéniques. En présence d’oestrogènes, les échantillons à tester entraînent l’expression de la β-galactosidase. Son activité est mesurée par fluorescence à 460 nm
après excitation à 355 nm. En pratique, différentes dilutions des extraits à analyser
sont testées pour leur capacité à induire une réponse in vitro. Après avoir vérifié que
les échantillons de rivière (eau du Galaizon d’Alès) «qui n’ont pas de molécules
connues à activité estrogénique » n’induisent pas de réponse transcriptionnelle, les
résultats obtenus par le Yeast Estrogen Screen montrent que tous les sites de
prélèvement étudiés ont une activité estrogénique (tab. III). Lorsque les
échantillons ne sont pas dilués, leur activité estrogénique varie de 2,5 % à 85 %. Le
niveau d’œstrogénicité varie selon les stations mais également selon l’échantillon.
Les matières en suspension (MES) quel que soit le site de prelèvement ont une
activité estrogénique faible. Cette activité varie de 2,5 % à 8 % pour des échantillons
non dilués. De ce fait, la comparaison de la concentration effective (EC50) de ces
échantillons avec celle de la substance de référence (e.g. le 17β œstradiol) montre
que la charge équivalente en estradiol avoisine 10−11 M pour la phase particulaire
98
I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103
Tableau III. Activité estrogénique des échantillons exprimée en pourcent par rapport à
l’activité du 17β estradiol (10−9 M).
Table III. Sample estrogenic activity expressed as percent relative to the activity of 17 β
estradiol (10−9M).
Phase dissoute
Station A
Station B
Station C
MES
Boues
Entrée
Sortie
Entrée
Sortie
De
retour
Activée
26
19,5
32
39
39
61
8
6
2,5
6
5
6
51
56
85
72
76,5
83,5
Activée
II
62
69
ND
Épaissies
43,6
48
54
Tableau IV. EC50 des échantillons étudiés.
Table IV. EC50 of studied samples.
Phase dissoute
Station A
Station B
Station C
MES
Boues
Entrée
Sortie
Entrée
Sortie
Boues
de
retour
2E−10
2,5E−11
3E−10
1,8E−09
1,8E−09
1E−08
1,5E−11
1,5E−11
5E−10
1E−11
5E−12
1E−11
2E−09
2E−09
1E−08
Boues
activee I
Boues
activee
II
Boues
epaissies
9E−09
9,6E−09
3E−08
5E−09
5,3E−09
ND
1E−09
1,2E−09
2,1E−09
(tab. IV). Les échantillons de boues ont la plus forte activité, entre 43 % et 85 % selon
les échantillons et leurs EC50 peuvent atteindre 9 10−8 M équivalent œstradiol
(tab. IV). Concernant la phase dissoute, l’activité estrogénique est importante et varie
en entrée de station de 19,5 % à 32 % et en sortie de 39 % à 61 % selon les stations
(tab. III). Les EC50 des échantillons est de l’ordre de 10−9 et 10−8 M équivalent
œstradiol (tab. IV). Cette expérience montre que la contamination globale en
composés estrogéniques des effluents reste importante en sortie de station. Pour les
trois stations sélectionnées, l’activité oestrogénique, provenant des eaux résiduaires
urbaines, touristique et industrielles (station A et B), est moins élevée que celle des
eaux résiduaires urbaines combinées aux eaux résiduaires agricoles (Station C).
3.2. Détermination de la concentration de parabenes dans les eaux
usées par HPLC-DAD
Pour les 3 stations, les niveaux de contamination par les parabènes ont été
mesurés dans les différentes matrices (phase dissoute, MES, boues). Les résultats
obtenus ont été interprétés en tenant compte de l’effet de matrice des différents
échantillons. Les cinq parabènes ont été identifiés dans les échantillons d’eau à
l’entrée de chaque station. La concentration moyenne de la phase dissoute est de
l’ordre du μg.L−1, de l’ordre du μg.g−1 dans les MES (tab. V). Dans les boues, ces
I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103
99
Tableau V. Concentrations mesurées des cinq parabènes dans les phases dissoutes (μg.L−1)
et particulaires (μg.g−1).
Table V. Measured concentrations of five parabens in the dissolved phase (μg.L−1) and
particulate (μg.g−1).
Station A
Phase dissoute
MES
Methyl
Ethyl
Propyl
Buthyl
Benzyl
Methyl
Ethyl
Propyl
Buthyl
Benzyl
Station B
Station C
Entrée
Sortie
Entrée
Sortie
Entrée
Sortie
560
2,5
0,3
0,4
4
74
<LD
<LQ
<LD
<LD
443
<LD
0,1
0,1
0,2
268
64
101
<LD
<LD
3
1
1,6
1,3
1,5
<LQ
21
13,7
0
19
<LQ
<LD
0,04
<LD
0,2
<LD
<LD
<LD
<LD
<LD
1
2
2,7
16,3
2
<LD
<LD
<LD
413
<LD
3,4
<LD
<LD
<LD
0,04
<LD
13
<LD
<LD
<LD
Tableau VI. Concentrations mesurées des cinq parabènes dans les boues (μg.g−1).
Table VI. Measured concentrations of five parabens in sludge (μg.g−1).
Station A
Station B
Station C
Boues de retour
Boues activée
Boues activée II
Boues épaissies
Boues de retour
Boues activée
Boues activée II
Boues épaissies
Boues de retour
Boues activée
Boues épaissies
Methyl
Ethyl
Buthyl
Benzyl
117
79
112
185
121
88
113
189
112
<LQ
106
495
237
3503
954
595
237
2043
1080
137
170
505
253
246
2366
451
253
236
2445
464
168
50
464
<LD
2
87,8
<LQ
<LD
2,3
198,8
<LD
2,9
<LQ
<LQ
concentrations sont de l’ordre de la centaine de μg.g−1 pouvant aller au-delà du
mg.g−1 selon les prélèvements (tab. VI). Le méthyl parabène est le plus fréquemment
détecté dans les échantillons en entrée et en sortie des stations, sa concentration passe
de 560 μg.L−1 à 442 μg.L−1 pour la station A. Pour les autres stations, sa concentration avoisine 3 μg.L−1 en entrée et ce composé n’est plus quantifiable en sortie. La
station reçoit des effluents provenant d’une industrie textile. Des échantillons de cet
effluent ont été analysés et ont révélé une forte concentration de méthyl parabène, de
l’ordre de 400 μg.L−1 (résultats non présentés). La présence de méthyl parabène dans
les eaux de la station A est corrélée à la présence de ce même composé dans l’effluent
industriel qui alimente la station en partie. Concernant l’EtP, le BtP, le PrP et le BzP
en entrée comme en sortie, le niveau de contamination suit une répartition similaire
100
I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103
pour trois stations. Ces concentrations sont comprises entre 1 et 2,5 μg.L−1 en entrée
et ne sont plus quantifiables en sortie pour l’EtP. Le Prp, le BuP et le BzP sont en
général détectés en entrée et en sortie avec des concentrations de 1 μg.L−1 en sortie de
station. Le butyl est fortement présent en entrée de la station C (eaux résiduaires
urbaine et agricoles) avec des concentrations atteignant 16 μg.L−1. Dans la station
C, il y a un seul bassin d’activation contrairement aux deux autres stations où le butyl
parabène s’adsorbe fortement. Au niveau du bassin d’activation II, plus de 2000 μg.
g−1 de BuP sont accumulés dans les boues des stations A et B. La présence de ces
bassin d’activation semble influer sur la présence de ce composé dans les boues
épaissies, les MES et la phase dissoute (notamment en entrée de station) (tab. V). Ces
résultats sont en accord avec la littérature, et montrent que les composés les plus
fréquemment retrouvés sont le MeP, l’EtP, le PrP et le BuP du fait de leur grande
utilisation dans les produits cosmétiques (Lee et al., 2005 ; Jonkers et al., 2009 ;
Kasprzyk-Hordern et al., 2009 ; González-Mariño et al., 2011). Les concentrations
de ces composés peuvent atteindre 12,6 μg.L−1 dans la phase dissoute d’eau usées
collectées en entrée de station (Andersen et al., 2007). Récemment, une étude menée
dans les émissaires franciliens montre des concentrations de MeP atteignant des
concentrations de 21 μg.L−1 (Geara-Matta et al., 2011). Au niveau des MES, les
résultats sont moins homogènes entre les trois stations. Le MeP est retrouvé à de
fortes concentrations en entrée (75 μg.g−1) et en sortie (268 μg.g−1) de la station A
comme déjà observé dans la phase dissoute des effluents. De plus, de façon surprenante, l’EtP est présent en sortie de cette station alors que le composé est difficilement détecté en entrée. Au niveau des deux autres stations, l’EtP, le PrP et le BzP
sont détectés en entrée de la staion B et ne sont plus retrouvés en sortie. Au niveau de
la station C, le BtP est très fortement concentré dans les MES en entrée (413 μg.g−1).
Concernant les échantillons de boue, les cinq composés sont détectés et quantifiés.
Les composés les plus concentrés sont l’EtP suivi du BuP et du MeP à des concentrations allant respectivement de 136 μg.g−1 à 3500 μg.g−1 et de 50 μg.g−1 à 2500 μg.
g−1 et 79 μg.g−1 à 189 μg.g−1 (tab. VI). Le BzP se concentre dans les boues activées
du type II et n’est pas quantifié dans les autres échantillons. Le propyl n’est détecté
dans aucun échantillon. La particularité de la station A (récupération d’un effluent
industriel fortement chargé en méthyl parabène) conserve une concentration non
négligeable de se composés dans les trois niveaux des échantillons (phase dissoute,
MES et boues). Les parabènes sont des composés lipophiles avec un coefficient de
partage octanol/eau qui augmente avec la chaı̂ne carbonée (LogKow 1.66 pour le
methyl parabène ; 3.24 pour le butyl parabène) ce qui permet leur adsorption dans les
boues (tab. VI).
4. CONCLUSION
Cette étude est la première étude réalisée en Tunisie pour la quantification
simultanée de cinq parabènes dans la phase dissoute, les matières en suspension et
les boues de stations d’épuration. Nos résultats montrent que l’activité estrogénique
détectée par le test in vitro peut expliquer seulement en partie la présence de ces
composés dans les eaux et principalement dans les boues qui servent ensuite à
l’épandage en champs. En effet, les résultats obtenus par le test in vitro Yeast
Estrogen Screen, spécifique d’un mode d’action (substance ayant la capacité de se
fixer sur les récepteurs aux œstrogènes en mimant l’effet d’hormones naturelles),
I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103
101
sont dépendants des autres substances perturbatrices présentes dans des échantillons
complexes comme des effluents de stations d’épuration. Contrairement aux résultats
obtenus en HPLC/DAD (qui donne des concentrations de composés dans les
échantillons), la forte concentration de parabènes n’est pas toujours corrélée avec
l’activité transcriptionnelle du test in vitro. D’autres composés peuvent inhiber
l’activité transcriptionnelle ou d’autres composés non recherchés en HPLC/DAD
peuvent augmenter cette activité. En effet en entrée de la station A, l’activité du test
YES est plus faible que l’activité estrogénique théorique représentée par la présence
des parabènes détectés en HPLC/DAD. Les résultats montrent également que
l’activité agricole impacte de façon plus importante que l’activité touristique et
urbaine sur l’activité estrogénique dans la phase dissoute. Les prélèvements
effectués en entrée et en sortie des stations ayant été faits le même jour, la variation
de l’activité estrogénique et des parabènes journalière ne peut être interprété.
Cependant, il semble que ces stations n’aient pas la capacité d’élimer totalement et
de façon régulière l’activité estrogénique de certains parabènes comme le méthyl et
le benzylparabène. Certains de ces composés ont une affinité pour les boues et pour
les matières en suspension telle que ces derniers deviennent un réservoir environnemental pour ces composés notamment si les boues sont épandues aux champs.
L’ensemble de ces résultats montrent que le niveau de concentration dans l’environnement des parabènes est à surveiller. En effet, l’activité en tant que perturbateur
endocrinien des parabènes a été décrite pour la première fois par Routledge et al.
(1998) in vivo et in vitro. Dans le milieu aquatique, certaines études ont prouvé que
l’exposition à certains parabènes à de faibles concentrations (μg.L−1) induit une
réponse vitellogénique chez la truite arc-en-ciel juvénile (Alslev et al., 2005). Leur
EC50 étant comprise entre 5 et 30 mg.L−1 pour Daphnia magna, le méthyl- (MeP),
l’éthyl- (EtP) et le propylparabène (PrP) sont considérés comme modérément toxiques tandis que le butyl- (BuP) et le benzyl- (BzP) sont classés parmi les substances
très toxiques (1 < EC50 < 10 mg.L−1). Par comparaison avec d’autres composés tels
que le bisphénol A (EC50 = 10 mg.L−1) et les phtalates (4 < EC50 < 103 mg.L−1 pour
Daphnia magna), le suivi des parabènes dans l’environnement interpelle.
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2.
Activité oestrogéniques de colorants alimentaires dans le Yeast Estrogen Screen (YES)
Nous sommes exposés tous les jours à de nombreuses substances de synthèse issues de
l’industrie chimique par le biais de nombreuses sources dont notre alimentation. Certains
additifs et colorants retrouvés dans les denrées alimentaires ont la capacité de perturber notre
système hormonal. Comme nous l’avons vu dans l’article précédent, certains parabènes
comme le propyl et le butyl parabène sont des conservateurs et des additifs utilisés dans les
aliments qui ont la capacité de mimer l’oestrogène naturel. Par exemple, le propyl gallate
(E310) utilisé comme anti-oxydant est un xéno-estrogène (Amadasi et al., 200). Parmi ces
xéno-estrogènes se retrouvent également certains colorants comme la tartazine (E102),
l’érytrosine B (E127) ou encore le Sudan (rouge de Sudan) qui n’est plus autorisé dans
l’Union Européenne depuis 1995.
Ce volet de recherche a pour but de tester l’aptitude de cinq colorants alimentaires, à
induire une réponse oestrogénique en utilisant le YES (Yeast Estrogen Screen) et de comparer
cette activité à celle de cinq parabènes couramment utilisés (méthyl parabène (MeP), éthyl
parabène (EtP), propyl parabène (PrP), butyl parabène (BuP), benzyl parabène (BzP)). Et dont
l’activité oestrogénique est connue. Ces travaux ont été publiés dans Journal of Ecosystem &
Ecography Volume 3 : 128. 2013, Pages 1-5.
Dans cette étude nous avons testé, pour la première fois, l’induction de l’activité
oestrogénique de colorants alimentaires avec le YES. En effet, le YES a été développé pour
l’identification et la caractérisation de composés capables de se lier au récepteur des
oestrogènes (Roultdge et al., 1996). La spécificité de ce test au composé oestrogénique est
expliquée par le nature du récepteur aux oestrogènes où le site de liaison est plus flexible
(Bistan et al., 2012). De ce fait, le récepteur des oestrogènes devient une cible plus vulnérable
à un large éventail de composés qui possèdent des analogies structurales avec le 17 βoestradiol, comme les oestrogènes synthétiques, le bisphénol A, le nonylphénol et les phytooestrogènes.
Parmi les colorants testés, seuls deux composés ont la capacité d’induire une activité
oestrogénique avec le YES, l’E171 (Dioxyde de titane) et l’E132 (l’indigotine). Le tableau 16
présente les activités oestrogéniques de différents colorants. L’E171 a une activité
oestrogénique de 33% à une concentration de 1g/l. Cette activité oestrogénique est faible en
comparaison de celle induite par les 17β-oestradiol et les parabènes. En effet, ce colorant est
106 fois moins oestrogénique que le 17 β-oestradiol,
102
Tableau 16 : Activité oestrogénique relative des cinq colorants alimentaires (1g/l).
Composés
E2
E122
E104
E132
E 124
E171
Activité oestrogénique agoniste (E2 %)
100 (10-9M)
0
0
10
0.93
33
L’inhibition par 4-OH-TAM de l’activité oestrogénique induite par le colorant dans le YES
démontre que ce composé est un xéno-oestrogène comme les parabènes. Le 4-OH-TAM
inhibe l’induction du ERE.
103
Bazin et al., J Ecosys Ecograph 2013, 3:3
http://dx.doi.org/10.4172/2157-7625.1000128
Ecosystem & Ecography
Research
Article
Research
Article
Open
OpenAccess
Access
YES as a Tool for Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives
Compounds: E 104, E 122, E 124, E 132 and E 171
Ingrid Bazin1*, Aziza Ibn Hadj Hassine1, Wissem Mnif2 and Catherine Gonzalez1
1
2
Ecole des Mines d’Alès, LGEI center, 6 avenue de Clavière 30319 Alès Cedex, France
Laboratory of Biochemistry, Institute of Biotechnology, Monastir, Tunisia
Abstract
The toxicity (mutagenic and carcinogenic effects) of food dyes (used like food additive) has been well documented.
However the endocrine disrupting effects of these dyes have been poorly investigated. We studied five commercial
food dyes for their agonistic estrogen activity and do a comparison with estrogenic activity of some paraben (other
food additives compounds). Total estrogenic activities were measured using the Yeast Estrogen Screen bioassay
(YES). The estrogenic potency of the food dyes was measured by dose-response curves and compared to a doseresponse curve of 17-β-estradiol (E2), (reference compound). Estrogen EC50 values have been calculated using
standard linear regression methods. Among these compounds, three food dyes, indigotine (E 132), the monoazo
dye Ponceau 4R (E 124) and the inorganic dye titanium dioxide (E 171), revealed weak estrogenic activity. Negative
results were obtained for Quinoline Yellow (E 104).
Keywords: Food dyes; Paraben; Food additives; Estrogenic activity
Introduction
Food additives are artificial ingredients added to foods, medications
and cosmetics in order to enhance flavour, colour, and texture. They
facilitate the preparation and prevent spoiling. The most common food
additives are: Aspartame Monosodium Glutamate (MSG), Sodium
Nitrate, parabens and dyes like tartrazine (Yellow Dye #5). Although
many of these individual additives are included in small amounts
individual average consumption is estimated at about 5 pounds of
synthetic additives in total each year. If we include sugar data - as
it’s the most used additive by the food industry - then that number
increases to 135 pounds a year. Between them we can find food dyes
(like tartrazine the most widely used) and parabens (methylparaben,
ethylparaben, propylparaben, butylparaben and isobutylparaben). The
most common health issue that occurs from the intake of food additives
is the worsening of asthmatic symptoms and development of allergies.
But safety of some of them is well known. For example, the safety of
parabens has been debated overlooked to male and female breast,
testicular cancer and fertility, they are able to mimic estrogens [1-5].
Except quinolone, food colors are relatively weak mutagen and certified
as safe additives despite reports that some people have allergic reactions
towards them [6]. However, studies have revealed toxic effects of many
colorants [7].
All these compounds are classified as xenoestrogens. Xenoestrogens
are exogenous chemicals able to modulate endogenous estrogen
activity through, for example, structural similarities leads to receptors
interactions or estrogen metabolizing enzymes. A common mode of
action is with xenoestrogens shows an affinity for Estrogen Receptors
(ER) and subsequently causes endocrine disruption through this
interaction [8]. Other chemicals may bind to other receptors related to
ERs and modulate their functioning [9].
The Estrogen Receptor (ER) is the key factor that elicits estrogenic
response in vertebrates. Several structural trends have been identified
to be potential ligands for the ER. Various additives like parabens have
been proven to be endocrine disruptor compounds using either in
vivo or in vitro assay [10]. Recombinant Yeast Assays (RYA) (or Yeast
Estrogen Screen) based on use of estrogen receptors of vertebrates
are convenient functional assays to evaluate the potential endocrine
disruption of a substance [11]. But few studies have focused on the
J Ecosys Ecograph
ISSN:2157-7625 JEE, an open access journal
estrogenic activity of food dyes. Studies concern mainly food colors
such as tartazine (E 102), sudan I and erythrosine B (E 127) which
have effects on the chromosomal structure and can increase Estrogen
Receptor (ER) site-specific DNA binding effect to Estrogen Response
Element (ERE) in HTB 133 cells [12,13] and in the E-screen test [14].
Axon et al. [15] helped to identify several modulator of the human ER
among food additives such as tartazine and sunset yellow.
In the current work, we sought to detect the presence of xenobiotic
ER agonists between various food additives using the Yeast Estrogen
Screen (YES).
Materials and Methods
Selected compounds
Selected compounds methylparaben (MP), ethylparaben (EP),
n-propylparaben (PP), n-butylparaben (BP), and 17-β-estradiol (E2)
were purchased from Sigma-Aldrich (Table 1). All stock solutions were
prepared in methanol and serially diluted in distilled water to obtain
the targeted concentrations. For each paraben the endocrine activity
was assessed at various concentrations in the range of 10-9 to 10-3 M. The
methanol concentration in the exposure solutions, including controls
was 0.01% (v/v) in the tested solutions, which is a non-effective dose as
estimated in preliminary tests.
A selection of currently used dyes was chosen for this study.
These dyes were selected on the basis of their potential use food
industries (http://www.omicsonline.org/2155-6199/2155-6199-1-110.
php#Table1)
For each dye, a stock solution (0.1 M) was prepared by dissolving
*Corresponding author: Ingrid Bazin, Ecole des Mines d’Alès, LGEI center, 6
avenue de Clavière 30319 Alès Cedex, France, E-mail: [email protected]
Received May 27, 2013; Accepted June 25, 2013; Published June 27, 2013
Citation: Bazin I, Hassine AIH, Mnif W, Gonzalez C (2013) YES as a Tool for
Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives Compounds: E 104, E 122, E
124, E 132 and E 171. J Ecosys Ecograph 3: 128. doi:10.4172/2157-7625.1000128
Copyright: © 2013 Bazin I, et al. This is an open-access article distributed under
the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted
use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and
source are credited.
Volume 3 • Issue 3 • 1000128
Citation: Bazin I, Hassine AIH, Mnif W, Gonzalez C (2013) YES as a Tool for Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives Compounds: E
104, E 122, E 124, E 132 and E 171. J Ecosys Ecograph 3: 128. doi:10.4172/2157-7625.1000128
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Code foodstuf
CAS #
Class
Formula
E 218
99-76-3
------
C8H8O3
ethylparaben
E 214
120-47-8
------
C9H10O3
propylparaben
E 216
94-13-3
------
C10H12O3
butylparaben
------
94-26-8
------
C11H12O3
Azorubine,
E122
3567-69-9
monoazo
C20H12N2O7S2Na2
Quinoline
Yellow
E104
8004-92-0
quinophtalone
C18H9NO8S2Na2
indigotine
E132
860-22-0
indigoid
C16 H8N2O8S2Na2
Ponceau 4R
E 124
2611-036-2
monoazo
C20H11N2O10S3Na3
Titanium
Dioxyde
E171
13463-67-7
inorganic
TiO2
Table 1: compounds analyzed in this study.
in distilled water, followed by filtration through Whatmann No. 5
filter paper. All these dyes appeared perfectly soluble in water at this
concentration as assessed by the absence of precipitate. For each dye,
the endocrine activity was assessed at four concentrations in the range
of 1×10−6 M to 1×10-2 M. The natural fluorescence of the dyes and their
interference on the fluorescence emitted by yeast was determined
beforehand in order to avoid spurious signals generated by the YES test
in our experimental conditions. The fluorescence of each dye has been
measured in the absence of yeast cells and subtracted from the data
obtained for estrogenic tests. The cytotoxicity of each dye was evaluated
by measuring yeast growth at an O.D. of 600 nm.
Yeast estrogen screen assay (YES)
Yeast strain BY4741 (MATa ura3D0 leu2D0 his3D1 met15D0) was
obtained from Euroscarf, Frankfurt, Germany. Expression plasmid
pH5HE0 contains the human estrogen cloned into the constitutive
yeast expression vector pAAH5 [11]. Plasmid pVITB2x encompasses
the reporter gene beta-galactosidase from Escherichia coli fused to the
yeast CYC1 promoter and under the control of the pseudopalindromic
Estrogen Responsive Element ERE2 from Xenopus laevis vitellogenin
B1 gene (50-AGTCACTGTGACC-30 , two copies) [11]. The test
measures β-galactosidase activity with 4-methylumbelliferone β-Dgalactopyranoside (fluorescence at 460 nm and excitation at 355
nm) with a fluorimeter (Fluoroskan Twinkle LB 970, BERTHOLD
Technologies) after 6 h of exposure to the compounds. Tests were
performed in 96-well plates.
To determine the estrogen agonistic activity of studied compounds,
E2 was used as a positive control and distillated water was used as a
negative control. Stock solutions of MP, EP, PP BP (10-2 M), 17 β -estradiol
(10-3 M), and dyes (0.1 M) are prepared in methanol and serially diluted
in distilled water. The transformed yeast strain were grown overnight
at 30°C in a non-selective medium (YPD: 5 g/L yeast extract, 10 g/L
peptone, 20 g/L glucose, all from Sigma-Aldrich, France). The following
day, 15 µl of saturated culture is added to 15 ml of selective media
(SD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, DIFCO, Basel,
Switzerland; 20 g/L glucose, supplemented with 0.1 g/L of prototrofic
markers as required). The final culture was diluted in selective media
and adjusted to an optical density (DO) between 0.1-0.2 at 600 nm.
45 µl aliquots were transferred into a 96-well polypropylene microtiter
plate. 5 µl aliquots of each sample were then dispensed into wells in
quadruplicate. This experimentation was carried out 3 times in order to
obtain representative statistical data. After 6h incubation, 50 µl of YPER
(Pierce, Rockford, IL, USA) were added to each well and incubated at
30°C for 30 min. 50 µl of buffer Z ( 60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4,
10 mM KCl, 1 mM MgSO4, pH 7.0 plus 0.5% 2-mercaptoethanol
(Fluka), 1% Triton X-100 (Sigma), 4-methylubelliferyl β-DJ Ecosys Ecograph
ISSN:2157-7625 JEE, an open access journal
Galactoside (Sigma)) were added to the cell lysat then incubated at
room temperature for 30 min after a centrifugation at 1000 rpm for 1
min. The fluorescence was mesured at 460 nm (excitation at 355 nm
and emission at 460 nm). Confirmation of human ER activation by
xenobiotics was made with 4 Hydroxytamoxifen (4-OH-TAM). 0.5 µM
of 4-OH-TAM was added to yeast cell prior to addition of potential
ER activator. 4 OH-TAM competitively binds to estrogen receptors
on tumor cells and other tissue targets, producing a nuclear complex
that decreases DNA synthesis and inhibits estrogen effects. After 6h
exposure to binary mixture, β-D-galactosidase activity was determined.
Calculation of EC50 values: EC50 values, defined as the concentration
where transcriptional response reaches 50% of its value at saturating
concentration of ligand, were calculated from dose-response assays,
using 5 or 7 concentrations for parabens, 5 concentrations of dyes and
8 concentrations for 17-β-estradiol.
Results and Discussion
Natural and artificial azo dyes and parabens are widely used as
coloring agents for food ingredients, drugs and cosmetics. These
toxicological effects can vary from carcinogenicity and mutagenicity
to genotoxicity. Many azo dyes are genotoxic in short-term tests and
carcinogenic in laboratory animals [7]. The genotoxicity of these dyes
are controversial, it were classified as genotoxic in one review [7] but
not in another [16].
To our knowledge, food additives such as ponceau 4R, azorubine,
titanium dioxyde or indigotine have not been examined and/or
reported to be estrogenic chemicals. Accordingly, we investigated their
potency of action in the yeast/(ERE) 2-pLacZ reporter gene assay.
Figure 1 illustrates a typical dose–response for E2 on relative reporter
gene expression in yeast cells transfected with (ERE) 2-pLacZ. In our
experimental conditions the EC50 is 3.77*10-10 M (22 ng/L). These
data were used to calculate EC50% values for a range of compounds.
Table 2 and Figure 2 demonstrate that some formulation compounds
of cosmetics such as paraben esters, are human ER agonists [17], in
our assay. A correlation between the length of the paraben ester chain
and the estrogenicity has been also pointed out [17,18]. In addition
the cosmetic and food additives titanium dioxide and indigotine were
also shown to be ER_ agonists (Figure 2). They induce a concentrationdependent response in yeast cell. As shown in Figure 2, the estrogenic
potency of food dyes is very weak compared to that of E2 or some
parabens. As previously reported [15], the food dye quinolone yellow
120
100
80
Relative activity (%)
compound
methylparaben
60
40
20
0
1E-13 1E-12 1E-11 1E-10 1E-09 1E-08 1E-07 1E-06 1E-05 1E-04 1E-03
E2 concentration (M)
Figure 1: Dose-response curve for 17β estradiol (E2) in distilled water .
Average ± standard deviation (n=3).
Volume 3 • Issue 3 • 1000128
Citation: Bazin I, Hassine AIH, Mnif W, Gonzalez C (2013) YES as a Tool for Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives Compounds: E
104, E 122, E 124, E 132 and E 171. J Ecosys Ecograph 3: 128. doi:10.4172/2157-7625.1000128
Page 3 of 5
was not shown to be an ER agonist (Figure 2). Table 2 demonstrates
that food colorings such as indigotine, ponceau Red 4 and titanium
dioxide – the most potent food xenoestrogens examined in this study
- were approximately 106 times less effective that E2 at activating the
human ER in the Yeast cell. The most xenoestrogen between paraben
used like food additive is butylparaben. In 2003, butylparaben was
cleared by the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives
(JECFA) for use as a flavoring agent “at very low levels” (not specified)
[19]. Butylparaben is used as a food additive in Japan and as an additive
to beer to retard microbial growth. Recently, a call for data regarding
suggested limits for the use of butylparaben as a food additive [20].
120
BP
PP
80
EP
% of E2 response
100
MP
E2
titanium dioxide
indigotine
60
40
20
0
1E-14
1E-12
1E-10
1E-08
0,000001
0,0001
0,01
1
Table 2 also demonstrates that food colorings are generally less
potent activators of the human ER than parabens compounds.
concentration (M)
Figure 2: Response of the yeast estrogen screen to a range of parabens
of varying alkyl group size (Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben
and Butylparaben), some food dyes (titanium dioxide and indigotine) and
17β-estradiol (E2), dose response curves were normalized to maximum E2
response.
We have analyzed if 4 OH-TAM (a classical ER antagonist)
can inhibit the estrogenic activity induced by studied compounds.
Inhibition of the induction of (ERE) 2-pLacZ reporter can confirm that
studied compounds induce an estrogenic effect in yeast cells. Figure
3 demonstrates that (ERE) 2-pLacZ reporter gene induced activity
using E2 as well as with benzylparaben, butylparaben, propylparaben
ethylparaben, indigotine and titanium dioxide, were inhibited by 4 OHTAM.
E2 10 nM
Methyl Parabem
10 µM
Ethyl Parabem
+ 4 0 H - TA M
Propyl Parabem
Our assays consist on an engineered yeast strain that harbors
two foreign genetic elements: a vertebrate receptor, human Estrogen
Receptor (hER), in our case and a reporter gene. Expression of reporter
gene, LacZ, is dependent on the occurrence of estrogens. The final
product concentration is easy to quantify, the beta-galactosidase
activity. The mechanism of YES is shown in the Figure 4. This is a
simplified version of the mechanisms used by natural estrogens to
operate in vertebrates. The fundamental similarity of the transcriptional
machinery in all eukaryotes ensures that it is similar also on yeast. In
a strict sense, the YES assay detects only agonists of the ER, which are,
substances that bind to ER and elicit transcriptional response in this
simplified system. In conclusion some food dyes like titanium dioxide
Butyl Parabem
Ponceau R4
titanium dioxyde
1 mM
indigotine
Quinoline yellow
Azorubine
0
20
40
60
80
100
120
Estrogenic activity (%)
Figure 3: Effect of 4-OH-TAM on estrogenic activity of selected food additives.
The selected concentrations are closed to EC50 values, 10 nM for E2, 10 µM
for parabens and 1mM for studied dyes. Average ± standard deviation (n=3).
ERE
Promotor
LacZ
Estrogen receptor
Estrogen
Activated receptor
β galactosidase
ERE Estrogen responsive element
LacZ Reportrt gene
hER
nucleus
hER Human Estrogen receptor
Medium
Cytoplasma
Yeast cell
Figure 4: Mechanism of Yeast Estrogen Screen (YES assay).
Methyl Paraben (MP) Ethyl Paraben (EP) Propyl Paraben (PP) Butyl Paraben (BP) 17-β-Estradiol E2 Titanium Dioxyde Indigotine
48 +/- 18 mg.L-1
(3.08*10-4 M)
7.8 +/- 2 mg.L-1
(4.73*10-5 M)
1.32 mg.L-1 +/- 80µg.L- 504 +/- 15 µg.L-1
1
(7.21*10-6 M)
(2.59*10-6 M)
103 +/- 22ng.L-1)
(3.77*10-10 M)
500 +/- 2mg.L-1)
(6.5*10-3 M)
Ponceau 4R
471 +/- 15mg.L-1) 403 +/- 8 mg.L-1)
(1.8*10-3 M)
(2.4*10-3 M)
Table 2: EC50 of 17-β-Estradiol and food additives compounds in distilled water samples obtained in YES test.
(EC50 values, defined as the concentration where transcriptional response reaches 50% of its value at saturating concentration of ligand, were calculated from doseresponse assays, using 8 concentrations for parabens and food dyes and 10 concentrations for 17β-estradiol).
J Ecosys Ecograph
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Volume 3 • Issue 3 • 1000128
Citation: Bazin I, Hassine AIH, Mnif W, Gonzalez C (2013) YES as a Tool for Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives Compounds: E
104, E 122, E 124, E 132 and E 171. J Ecosys Ecograph 3: 128. doi:10.4172/2157-7625.1000128
Page 4 of 5
and indigotine have weak estrogenic effect in yeast cell. Their activities
are close to those of methylparaben.
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Volume 3 • Issue 3 • 1000128
3.
Activité oestrogénique de colorants textiles dans le Yeast Estrogen Screen (YES)
Les matières colorantes se caractérisent par leur capacité à absorber les rayonnements
lumineux dans le spectre visible (380 à 750 nm). Bon nombre de ces colorants ont des cycles
aromatiques. Ils ont des effets mutagènes/tératogènes et leurs sous-produits de dégradation,
amines pour les composés azoïques, peuvent être cancérigènes. Or, ces polluants peuvent
potentiellement se retrouver dans les eaux résiduaires en sortie de station d’épuration et
perturber l’équilibre du système biologique.
L’objectif de cette partie est d’identifier si certains colorants textiles couramment
utilisés en industrie peuvent être des pseudo-oestrogènes, c’est-à-dire qu’ils peuvent induire
une réponse oestrogénique ou anti-oestrogénique dans le YES (Yeast Estrogen Screen). Ces
travaux ont été publiés dans Ecotoxicology and Environmental Safety Volume 85, 1
November 2012, Pages 131–136.
Les colorants sont élaborer pour résister à de nombreux agents extérieurs tels que la
lumière, la chaleur, les acides. Certains colorants, leurs métabolites et les effluents industriels
de teinture sont reconnus toxiques, cancérigènes ou mutagènes (Moawad et al., 2003;
Schneider et al., 2004; Umbuzeiro et al., 2004), mais les procédés de traitement biologique
conventionnels sont incapables de les éliminer de manière satisfaisante (Hutton et al., 1996).
Les procédés de traitement avancés montrent une meilleure efficacité pour l'élimination de la
couleur ou de la DCO des eaux usées (Mansour et al., 2011). Cependant, la mutagénicité de
certains colorants augmentent par chloration et ozonation (Shiozawa et al., 1998; Kunz et al.,
2002).
Au cours de cette étude nous avons testé l’activité oestrogénique et anti-oestrogénique
de 23 colorants utilisés dans l’industrie textile en utilisant le Yeast Estrogen Screen (YES). Il
apparait que ces colorants n’induisent pas ou peu une activité oestrogénique. En effet, parmi
les 23 colorants étudiés, trois ont une activité oestrogénique le «yellow flavina CXL», le
solvent «yellow 56» et le «reactive dye RE 3BS» et cette activité est très faible. Le «yellow
flavina CXL» est plus de 100 000 moins oestrogénique que le 17 β-oestradiol.
La capacité de ces composés à inhiber l’activité oestrogénique dans le YES a été
étudiée et cette activité a été comparée à celle produite par l’antagoniste de référence le 4hydroxytamoxifène (4-OH-TAM). Nous avons ainsi pu déterminer que les colorants antioestrogéniques sont majoritairement rouges et bleu, principalement, l’«eversol navy blue
110
FBN», le bleu «HFRL», le «direct red 89 BNL» et le «benzopurpurine 4B». Le colorant ayant
une activité antagoniste la plus élevée est le bleu «HFRL». L’activité inhibitrice reste moins
élevée que celle du 4-OH-TAM (850 fois moins élevée). Une concentration de 15 mg/l de ce
composé induit une réduction de la moitié de l’activité oestrogénique. Cette concentration est
en deçà des concentrations de colorants retrouvés dans l’environnement qui peuvent avoisiner
400 mg/l (O’Neill at al. 1999). Par la suite, la capacité de ces xéno-estrogènes antagonistes à
entrer en compétition avec le 17 β-oestradiol pour le récepteur aux oestrogènes humains a été
testée dans le YES. Cette étude montre que le «benzopurpurine 4B», le bleu «HFRL » et
l’«everzol Navy Blue FBN», sont capables d’entrer en compétition avec l’E2 (10-8 M). On a
ainsi pu déterminer de nouveaux ligands antagonistes pour le récepteur des oestrogènes.
Afin de déterminer la présence des colorants textiles, dans des effluents réels, nous
avons effectué une analyse spectrale par déconvolution du spectre-UV visible. Cette analyse
montre que l’effluent contient essentiellement des colorants bleu : le bleu «DERF», le «direct
bleu 71», l’«eversol Navu Blue FBN» et le «Grey GGL», dont certains présentent une activité
anti-oestrogénique dans le YES. Le test YES a alors été appliqué à l’effluent. Les résultats
obtenus montrent que cet effluent textile induit un faible potentiel oestrogénique, et a une
activité inhibitrice importante, de l’ordre de 60%.
Les résultats de ces travaux sur les effets endocriniens de colorants textiles viennent en
complément de celles déjà publiées sur la toxicité de colorants. Elles soulignent le fait que
certains colorants, principalement des colorants bleus et rouges, peuvent perturber la fonction
endocrinienne in vitro. En ce qui concerne l'environnement, certains de ces colorants peuvent
être retrouvés à des concentrations susceptibles d’affecter la qualité de vie des populations
aquatiques naturelles. Les effluents textiles présentent ainsi un danger potentiel pour
l’environnement qui exige une meilleure surveillance sur la présence des colorants utilisés par
l'industrie et les méthodes de traitement. Il est donc particulièrement important de traiter
efficacement les effluents industriels contenant des colorants azoïques avant qu'ils ne soient
rejetés dans l’environnement. Il est, aussi, intéressant de noter que certains des colorants que
nous avons caractérisés, ont une activité anti-oestrogènique.
111
Ecotoxicology and Environmental Safety 85 (2012) 131–136
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Ecotoxicology and Environmental Safety
journal homepage: www.elsevier.com/locate/ecoenv
Estrogenic and anti-estrogenic activity of 23 commercial textile dyes
Ingrid Bazin a,n, Aziza Ibn Hadj Hassine a, Yosra Haj Hamouda b, Wissem Mnif b, Ahgleb Bartegi c,
Miguel Lopez-Ferber a, Michel De Waard d,e, Catherine Gonzalez a
a
Ecole des Mines d’Ale s, LGEI center, 6 avenue de Clavie re, 30319 Ale s Cedex, France.
Laboratory of Biochemistry, Institute of Biotechnology, Monastir, Tunisia
c
Department of Biology, Faculty of Sciences, King Faisal University, P.O. Box 1759 31982, Al Hassa, Saudi Arabia
d
Inserm U836, Grenoble Institut of Neurosciences, Site Santé de la Tronche, 38042 Grenoble, Cedex 09, France
e
Université Joseph Fourier, Grenoble, France
b
a r t i c l e i n f o
abstract
Article history:
Received 28 March 2012
Received in revised form
30 July 2012
Accepted 2 August 2012
Available online 1 September 2012
The presence of dyes in wastewater effluent of textile industry is well documented. In contrast, the
endocrine disrupting effects of these dyes and wastewater effluent have been poorly investigated.
Herein, we studied twenty-three commercial dyes, usually used in the textile industry, and extracts of
blue jean textile wastewater samples were evaluated for their agonistic and antagonistic estrogen
activity. Total estrogenic and anti-estrogenic activities were measured using the Yeast Estrogen Screen
bioassay (YES) that evaluates estrogen receptor binding-dependent transcriptional and translational
activities. The estrogenic potencies of the dyes and wastewater samples were evaluated by doseresponse curves and compared to the dose-response curve of 17b-estradiol (E2), the reference
compound. The dose-dependent anti-estrogenic activities of the dyes and wastewater samples were
normalized to the known antagonistic effect of 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) on the induction of the lac
Z reporter gene by E2. About half azo textile dyes have anti-estrogenic activity with the most active
being Blue HFRL. Most azo dyes however have no or weak estrogenic activity. E2/dye or E2/waste water
ER competitive binding assays show activity of Blue HFRL, benzopurpurine 4B, Everzol Navy Blue FBN,
direct red 89 BNL 200% and waste water samples indicating a mechanism of action common to E2. Our
results indicate that several textile dyes are potential endocrine disrupting agents. The presence of
some of these dyes in textile industry wastewater may thus impact the aquatic ecosystem.
& 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords:
Textile dyes
Estrogenic activity
Anti-estrogenic activity
Industrial textile effluent
1. Introduction
Dyes are widely used in most industries such as those manufacturing papers, plastics, food, cosmetics, textiles or leathers.
These dyes are useful to color the final products. Dyes are
classified depending on their colors, their chemical structures
and/or their origin (natural or synthetic). Natural dyes most
frequently originate from plants (such as riboflavin or b-carotene).
Determination of the chemical structures of natural dyes and the
accomplishment of their synthesis allow the gradual replacement
of these natural dyes by their synthetic counterparts. Approximately 10,000 commercial dyes are used in the coloring industry.
More than 10% of dyestuff used during the coloring processes does
not bind to the fibers and therefore these excess dyes are released
into the environment producing serious environmental pollution
(Pearce et al., 2003; Rajeswari et al., 2011). The presence of these
dyes in wastewater and subsequently in water resources, even at
n
Corresponding author. Fax: þ33 466782701.
E-mail address: [email protected] (I. Bazin).
0147-6513/$ - see front matter & 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ecoenv.2012.08.003
very low concentrations, is easy to observe visually as the result of
textile industry activities. They may increase effluent toxicity and
lead to environmental damage (Robinson et al., 2002). In addition,
many synthetic dyes are poorly biodegradable. In some dyehouse
effluents, dye concentration can reach up to 400 mg/l (O’Neill
et al., 1999). A specific study has even demonstrated that these
concentrations can exceed 600 mg/L in Nigeria (Yusuff and
Sonibare, 2004). Their presence in water reduces light penetration
and has a negative impact on photosynthesis. Moreover, the
dyeing process itself generally also contributes to the water body
contamination by chromium, zinc and copper which are all toxic
to aquatic plants and fish below 1.0 mg/L (Eremektar et al., 2007;
Sharma et al., 2007; Verma, 2008). The research on textile wastewater toxicity, which has been carried out so far, shows how the
action of toxic dyes occurs at different levels of the food chain,
from food supply (i.e. algae and plants) to consumers (i.e.
crustaceans and fishes) (Manu and Chaudhari, 2003; Robinson
et al., 2002; Sharma et al., 2007; Soni et al., 2006; Tigini et al.,
2011). Most research effort has been devoted towards elucidating
or improving the degradation mechanisms of textile dyes with the
hope to reduce their toxicity levels (Phugare et al., 2011a, 2011b).
132
I. Bazin et al. / Ecotoxicology and Environmental Safety 85 (2012) 131–136
Table 1
Textile dyes analyzed in this study.
Compound
CAS #
Family
Formula
Benzopurpurine 4B (Red 4 B)
Direct black VSF AZO-FREE (Direct Black 22)
Yellow 4 G (Solvent yellow 19)
Direct blue 71 (Blue BRR)
Brown RL
Red Alpacide 3BL
Brown GV
Orange 7GL
Direct black PMSF
Everzol navy blue FBNa
Blue HFRLb
Direct red 89 BNL 200%
Blue DERFb
Everzol yellow EDa
Reactive dyes red 3BS (Red 195)
Everzol blue EDa
Yellow flavina CXLb
Everzol navy ED
Solvent yellow 56
Yellow 3GFb
Everzol red EDa
Grey GGLb
Blue ED 250
992-59-6
6473-13-8
10343-55-2
4399-55-7
12238-94-7
12238-49-2
azo
azo
azo
azo
azo
azo
12222-37-6
azo
azo
azo
C34H26N6Na2O6S2
C44H32N13Na3O11S3
C16H11CrN4O8S
C40H23N7Na4O13S4
C15H14O5
C18H10N2O2Cl2
C31H21N7O6Na2S
C42H28N7Na4O15S4
C37H25N5Na2O6S2
C37H29ClN10O22S7Na6
93912-64-2
azo
Confidential data
93050-79-4
2580-78-1
azo
anthraquinone
17095-24-8
2481-94-9
azo
azo
C31H19ClN7O19S6
C22H18N2O11S3Na2
_
C26H25N5O19S6Na4
C16H19N3
C30H26N4Na2O8S2
Confidential data
89157-03-9
azo
C31H24ClN7O19S6Na5
a
Dyes and informations obtained by Everlight Chemical SA.
Reactive azo dye (copper complex, 70% pure for Blue HFRL) kindly provided by a textile industry unfortunately there is no available
information on its structure (Baêta et al. 2011).
b
Environmental regulations in most countries (i.e. EU directive
91/271) have prioritized in wastewater dye decontamination in
order to minimize environmental damage (Robinson et al., 2001).
Although the Environmental Protection Agency (EPA) has emitted
new practice guidelines for environmental management, the
presence of pollution dyes remains a serious environmental issue
specifically for small textile industries in various countries (e.g.
China, India, Taiwan) where working conditions and low economic
status does not allow an efficient wastewater treatment before
disposal into water sources (Mathur et al., 2005; Gregory, 2007;
You and Teng, 2009). Since the mid nineties, the links between
dyes, environmental impact and cancer emergence have been the
subject of considerable interest both from researchers and from
the general public. However, the causal relationship between dyes
and certain types of cancer is difficult to establish. Several studies
have been conducted on the toxicity, mutagenicity and genotoxicity of textile dyes (Bakshi and Sharma, 2003; Ben Mansour et al.,
2007; Dogan et al., 2005; Durnev et al., 1995; Mathur and
Bhatnagar, 2007; Schneider et al., 2004). In the case of azo dyes,
the increase in bladder cancer incidence, observed among textile
industry workers, has been linked to prolonged exposure to these
dyes. A report of experts from the ‘‘Cosmetic Ingredient Review
Committee’’ confirmed that some anthraquinone dyes, like the
disperse Blue 7 dye, used in the cosmetic industry as hair colorant
and in textile, induce genotoxicity in bacteria (Cosmetic Ingredient
Review Expert Panel, 2007). Since then, research on these dyes
confirmed their carcinogenic effects for humans and animals
(Tsuda et al., 2001). This toxic effect has been linked to their
presence in the environment (Dogan et al., 2005; Chou et al., 2007;
Tigini et al., 2011). From an environmental point of view, toxicity,
genotoxicity and mutagenicity of industrial effluents have been
demonstrated (Alves de Lima et al., 2007; Grinevicius et al., 2009;
Tigini et al., 2011). However, these effects have generally not been
linked to the presence of dyes. Chou and collaborators associated
the dioxin-like activity of some dyeing wastewater with the
presence of specific anthraquinone dyes (Chou et al., 2006,
2007). In the same studies, these authors demonstrated that
disperse blue 56 can bind the aryl hydrocarbon receptor (AhR),
which is involved in many physiological functions such as cell
regulation and reproduction. Two Brazilian studies have identified
that the mutagenic activity of the Cristais River, a drinking water
source of Sa~ o Paulo, is caused by the presence of three blue dyes;
C.I. Disperse Blue 37 contributing to 55% of this effect (De Araga~ o
Umbuzeiro et al., 2005).
Up to now, the estrogenic activity of dyes has seldom been
studied. Rare studies mainly report the effects of food colors, such
as tartazine (E102) and erythrosin B (E127). Both compounds
affect chromosome structure and increase Estrogen Receptor (ER)
site-specific DNA binding to Estrogen Response Element (ERE) in
HTB 133 cells (Roychoudhury and Giri, 1989) and in the E-screen
test (Datta and Lundin-Schiller, 2008). The present manuscript
investigates both the estrogenic and anti-estrogen activities of
twenty three pure commercial textile dyes using the Yeast
Estrogen Screen (YES). This in vitro assay has been developed
for the detection of endocrine disrupting compounds (EDCs). In
order to indentify estrogen and anti-estrogen activity of textile
dyes, the YES assay has been used to probe two different modes of
action. First, a reporter gene assay measures the impact of dye
binding on ER on its ability to promote binding-dependent
transcriptional and translational activity. Second, an ER competitive binding assay measures how a dye competes with 17bestradiol (E2)-dependent ER activation. In addition, the endocrine
activity (estrogenic and anti-estrogenic activity) has been
assessed on a textile effluent coming from a blue jean manufacturing Tunisian industry in an attempt to correlate the endocrine
activity observed for commercial compounds and that obtained
for dyeing wastewater.
2. Materials and methods
2.1. Selected dyes
All the dyes selected (23) in this study are used in the textile industry
(Tables 1 and 2). Only, 17 on 23 dyes have a known or communicated structure.
The structure of the 6 other dyes were confidential and not available in the
chemical abstracts service. However, the safety and chemical information
I. Bazin et al. / Ecotoxicology and Environmental Safety 85 (2012) 131–136
Table 2
Relative estrogen agonistic and antagonistic activities of industrial dyes. Estrogenic activity of textile dyes (1 g/L). The anti-estrogenic activity of textile dyes has
been determinate at 1 g/L and expressed in 4-OHT%. The half maximal effective
concentration (AC50) was calculated based on the sigmoidal dose–effect curve of
4-OHT.
Compounds
Test estrogen
screen agonist
activity (E2%)
Test estrogen
screen antagonist
activity
(4-OHT percent)
Test estrogen
screen
antagonist AC50
(g/l)
E2 (10E 9M)
OTH
Benzopurpurine
4B (Red 4 B)
Direct black VSF
AZO-FREE
(Direct black 22)
Yellow 4 G
(Solvent yellow
19)
Direct blue 71
(Blue BRR)
*Brown RL
Red alpacide 3BL
*Brown GV
*Orange 7GL
*Direct black PMSF
Everzol navy blue
FBN
Blue HFRL
Direct red 89 BNL
200%
Blue DERF
*Everzol yellow ED
Reactive dyes red
3BS (Red 195)
Everzol blue ED
Yellow flavina CXL
Everzol navy ED
Solvent yellow 56
Yellow 3GF
Everzol red ED
*Grey GGL
Blue ED 250
100
–
0
–
100
100
–
2 10 5
0.17
0
20
41
0
13
41
0
22
41
0
0
0
0
0
0
–
44
–
–
–
94
–
41
–
–
–
0.065
0
0
100
100
0.017
0.029
0
0
22
10
–
0
41
–
0
0
36
0
11
0
0
0
0
35
0
32
0
0
30
–
0
41
0
41
0
0
41
–
0
certificate of analysis usually indicates the nature of the dye (azoic or
anthraquinone-type chemical structure). For each dye, a stock solution (10 g/L)
was prepared by dissolving in distilled water, followed by filtration through
Whatmann no. 5 filter paper. All these dyes appeared perfectly soluble in water at
this concentration as assessed by the absence of precipitate. For each dye, the
endocrine activity was assessed at four concentrations in the range of 1 10 5 g/L
to 1 g/L. The natural fluorescence of the dyes and their interference on the
fluorescence emitted by yeast was determined beforehand in order to avoid
spurious signals generated by the YES test in our experimental conditions. The
fluorescence of each dye has been measured in the absence of yeast cells and
subtracted from the data obtained for estrogenic tests. The quenching potential of
the dyes was also assessed on the yeast fluorescence emission during the
antiestrogenic test as follows. The fluorescence of yeast cell has been measured
after 6 h of incubation of the reference compound E2 (from Sigma-Aldrich, St
Quentin-Fallavier, France). Then, each dye was added to the medium at various
concentrations and the fluorescence quenching was measured immediately.
Compounds inducing more than 10% of fluorescence quenching were not investigated further for anti-estrogenic activity (noted by an asterisk in Table 2). The
cytotoxicity of each dye was evaluated by measuring yeast growth at an O.D. of
600 nm.
2.2. Wastewater sampling and extraction
Wastewater samples (1 L) were collected from the textile effluent of an
industrial blue jeans factory in Tunisia. Raw water samples were centrifuged
(2000 g, 15 min) to eliminate solids in suspension. Supernatants were then
extracted by solid-phase extraction as described by Pillon et al. (2005). Briefly,
aqueous samples were concentrated on reverse-phase C18 (5 g, 20 mL) cartridges
133
(Sigma-Aldrich, St Quentin-Fallavier, France) preconditioned with methanol.
Compounds elution from the column was triggered using methanol followed by
hexane. Eluates were dried at 37 1C in a rotary evaporator and residues were taken
up in 2 mL methanol (concentration factor: 500).
2.3. Yeast estrogen screen assay (YES)
2.3.1. Assay of estrogenic and anti-estrogenic activity
Both agonist and antagonist activities of chemical dyes were examined using
the Yeast strain BY4741 (Euroscarf, Frankfurt, Germany). This recombinant yeast
strain carries the b-galactosidase reporter gene under the control of the ERE and
contains the human ER cloned into the constitutive yeast expression vector pAAH5
(Garcı́a-Reyero et al., 2001). The test measures b-galactosidase activity (fluorescence at 460 nm and excitation at 355 nm) with a fluorimeter (Fluoroskan Twinkle
LB 970, BERTHOLD Technologies) after 6 h of exposure to the compounds to
evaluate. Tests were performed in 96-well plates. To determine the estrogen
agonist activity of dyes and effluent samples, E2 was used as a positive control and
distillated water was used as a negative control. Four dye concentrations were
tested in the range of 1 10 5 g/L to 1 g/L. For the effluent samples, a series of
dilutions (1 to 1000 of concentrated extract) were tested for their estrogenic
activity. To determine the estrogen antagonist activity of the dyes, 4-OHT was
used as a positive control and E2 (1 nM) was used as a negative control. In the
antagonist test, the ability of the dye to compete with E2 for binding to ER and/or
inhibit the receptor functions was evaluated. The tested dyes or 4-OHT, the
positive control, were combined with 1 nM E2 before the start of the assay. All
experiments were performed in triplicate. For estrogen agonist activity, the half
maximal effective concentration (EC50) was calculated based on the sigmoidal
dose–effect curve of E2. For estrogen antagonist activity, the half-maximal
effective concentration (AC50) was calculated based on the sigmoidal dose–
effect curve of 4-OHT.
2.3.2. Competitive binding assay
Competition between dyes and/or sample effluent and E2 was measured at
various concentrations of E2. Textile dye concentration used is 0.01 g/L and the
textile dyeing effluent sample at a dilution factor 5 of the concentrated extract.
Thus any decrease of b-galactosidase activity after 6 h of exposure indicates that
the dye induces a decrease in E2 binding.
2.4. UV/visible spectrum deconvolution
The absorbency spectrum of a water sample can be decomposed into a few
numbers of spectra (reference spectra). The shape of the UV spectrum can be
considered as a linear combination of defined spectra (REF1,.., REFp) related to
potential compounds present in studied water sample (Thomas et al., 1996).
Sw ¼ Sai REFi 7 r, where Sw is the final spectra, ai and r are the coefficient of the
ith reference spectra and the admitted error, respectively. The Secomam company
(Ale s, France) has developed the UVPro software based on advanced UV spectral
deconvolution (UVPro, 2000) which allows creating dedicated models and determination of reference spectra from a set of studied wastewater UV spectra.
The UVPro software has been applied to the textile effluent of an industrial
blue jeans factory of Tunisia. The reference spectra used for the deconvolution are
obtained from the 23 selected textiles dyes (Table 1). Using the deconvolution
model, it is possible to assess the contribution of studied dyes in the wastewater
spectrum.
3. Results/discussion
3.1. Estrogenicity/anti-estrogenicity studies of individual dyes
YES allows a fast determination of both endocrine agonist and
antagonist actions. The relative estrogenicity of each dye has been
estimated using YES by comparison to the estrogenicity of E2 as
reference compound. Typical dose–response curves for E2 have
been established (data not shown). In the present study, we have
essentially analyzed azo dyes. These dyes are extensively used for
dyeing cotton in textile industries. By using YES assay in the
present work, we have analyzed the degree of interference of
textile dyes with the endocrine system considering both the
potential agonist and antagonist actions. A great variability
between dyes is observed. The YES assay data illustrate a dosedependent estrogen agonist activity from 1 10 5 g/L to 1 g/L for
three dyes (Yellow Flavina CXL, Reactive dye red 3BS and Solvent
yellow 56) (Fig. 1). All these dyes have weak estrogenic effects
134
I. Bazin et al. / Ecotoxicology and Environmental Safety 85 (2012) 131–136
Fig. 1. Induction of estrogenic activities of some textile dyes. Average 7standard
deviation (n ¼3).
since the maximum activity is obtained at 1 g/L. In addition, the
estrogenic effect of the dyes did not saturate precluding the
determination of the EC50 value, contrary to the positive control
E2 (EC50 value at 1 ng/L) (Fig. 1). Higher dye concentrations were
not investigated, since water body dye concentration in the
environment never exceeds 1 g/l. Table 2 also summarizes the
fact that the twenty other dyes had no estrogenic effect by
themselves. These results indicate that these dyes are not
xenoestrogens that should highly impact the environment, as
compared to E2 or other known xenoestrogens (e.g. bisphenol A,
parabeny) (Routledge et al., 1998).
In addition, some textile dyes have an anti-estrogenic activity.
The anti-estrogenic reference compound 4-OHT was used to
demonstrate efficient anti-estrogenic activity when incubated in
the presence of 1 nM E2. The AC50 value of 4-OHT was 0.5 mM or
0.02 mg/L (Table 2). Similar experiments were conducted with the
dyes. Only some dyes have been tested (Fig. 2), the other ones,
marked by an asterisks, could not been tested because they
quenched the b-galactosidase fluorescence. At a concentration
of 1 g/L, antagonistic activities of these dyes vary from 100% to
10% inhibition according to their color (Table 2 and Fig. 2A). Blue
and red dyes show the highest inhibition potential. Everzol navy
blue FBN, blue HFRL, Direct Red 89 BNL 200% and Benzopurpurine
4B (Red 4B) are the most potent inhibitors tested. Their inhibitory
effects remain however inferior to that of 4-OHT. At 1 g/L, these
dyes are the only ones that induce a complete inhibition of the
reporter gene in yeast cells. Among these four dyes, Blue HFRL is
the strongest antagonist; its anti-estrogenic potency being
approximately 850-fold less than that of 4-OHT. A reduction of
50% of b-galactosidase activity is observed for concentrations as
low as 15 mg/L. These concentration values are thus considerably
lower than the total color level found in the environment
(400 mg/L). The antagonist effect of three other dyes (Benzopurpurine 4B (Red 4B), Everzol Navy Blue FBN, and Direct Red 89
BNL) were, respectively, 8500-, 3250-, and 1450-fold less than
that of 4-OHT. In contrast, all other dyes were either weak ER
inhibitors or non-ER inhibitors. For instance, Everzol Blue ED, Red
alpacide 3BL, Direct Blue 71, Blue ED 250, Direct Black VSF and
Blue DERF were weak ER inhibitors. The anti-estrogenic activity
for Blue DERF and Direct Blue 71 at 1 g/l, are 10% and 22%,
respectively. Among these dyes, most are of the azo class with
sulfonated aniline (Benzopurpurine 4B, Direct Red 89 BNL 200%)
and one is an anthraquinone dye, Everzol Blue ED. The Direct
Black VSF AZO-FREE, Blue ED 250, both being polyazo dyes,
Fig. 2. Anti-estrogenic activity of textile (A) dyes as measured by the yeast
estrogen screen (B). Competitive binding essay of 3 textile dyes (0.01 g/l) against
various concentrations of E2. Average 7 standard deviation (n¼3).
Everzo Yellow ED and Red ED (for which no structures can be
disclosed) induce inhibition of b-galactosidase expression by E2
with AC504 1 g/L.
Competition between the textile dyes and E2 was also measured by varying the concentration of E2 and maintaining a
constant dye concentration (0.01 g/L, a concentration that does
not fully inhibit E2 effect, Fig. 2A). Benzopurpurine 4B, Blue HFRL
and Everzol Navy Blue FBN can compete with E2 for binding to ER
(Fig. 2B). These dyes induces a slight inhibition of E2 estrogenic
activity when E2 is used at concentrations equal or lower than
1.10 8 M. No effect is observed for higher concentrations of E2.
For example, this activity decreased from 200,000 RLU without
dye to 100,000 RLU in presence of the Blue HFRL at 10 8 M E2.
This study also shows that the Red Alpacide 3BL induces a 44%
inhibition of estrogenic activity and the metal-complexed azo dye
yellow 4G induces a 13% inhibition (Table 2). The competitive
binding assay in the YES assay showed that these dyes can bind
specifically to ER in order to induce these antagonist effects.
3.2. Estrogenicity/anti-estrogenicity studies of textile effluent
The textile effluent sample analyzed presents a weak estrogenic effect at the maximum concentration tested (5-fold
dilution). At higher concentrations of the sample, the sample
compounds reduce cell viability (data not show) precluding the
use of the sample for the estrogenic assay. For the dilution range
(5- to 10,000-fold), results from the YES bioassay indicate that
the industrial textile effluent presents a low (below 15%) but
I. Bazin et al. / Ecotoxicology and Environmental Safety 85 (2012) 131–136
135
Fig. 4. UV/visible deconvolution of textile effluent spectrum.
(You and Teng, 2009). Nevertheless, without a complete characterization of the nature of the dyes being released in the local
environment of this factory, the ant-estrogenic effect of the
effluent sample cannot be unequivocally be attributed to these
blue dyes. Since this effluent is essentially blue, and that some
blue dyes are among those presenting the highest anti-estrogenic
effect, suspicion remains however high that this Tunisian factory
releases harmful components in the environment. In addition, it is
worth noting that the most active dyes have anti-estrogenic AC50
values (between 15 mg/L and 70 mg/L) that are well below the
dye concentration that can be detected in some water bodies
(400 mg/L). If these same dyes are indeed present in the environment, they would present a real anti-estrogenic activity to local
water consumers.
4. Conclusions
Fig. 3. Estrogenic (A) and anti-estrogenic (B) activity of textile effluent,
(C) competitive binding assay of textile effluent (dilution factor 5-fold) against
various concentrations of E2. Average 7standard deviation (n¼ 3).
significant estrogenic activity (Fig. 3A). Also, the effluent sample
inhibits 60% of estrogenic activity (Fig. 3B). In competition
experiments, in which E2 concentration is varied and a single
dilution dose of the effluent sample is used (5-fold dilution), the
anti-estrogenic effect is observable until 10 5 M of E2 (Fig. 3C).
The competition effect of the sample is most significant at
10 8 M.
The composition of the effluent sample in dyes has not been
fully determined. Spectral analyses indicate that most of its
components are blue dyes. Indeed, UV/visible deconvolution of
the spectrum of a blue jeans manufacturer’s effluent of Tunisia
indicates that the sample contains mainly Blue DERF, Direct Blue
71, Everzol navy Blue FBN, and Grey GGL dye according to the
spectrum of each individual dye (Fig. 4). The deconvolution of the
sample spectrum did not predict the presence of other dyes.
Interestingly, our studies have demonstrated that at least three of
these dyes presented anti-estrogenic activity with the YES assay.
Most blue and navy blue dyes are derived from the Reactive Black
5 azo dye, which is classified Xn (harmful). It is also suspected to
be mutagenic and to be associated to bladder cancer development
Our results on the endocrine effects of textile dyes come in
complement of those already published on the carcinogenic and
mutagenic effects of dyes. They point to the fact that some
dyes, mainly blue and red dyes, may be endocrine disruptor
compounds. These observations raise two issues. Concerning
environmental pollution, some of these dyes may be present at
concentrations high enough that they may indeed affect life
quality by promoting tumor generation. Textile sewage is therefore a potential health hazard that should require a better
communication on the dyes used by the industry and its method
of disposal. In that respect, it appears as particularly important to
efficiently treat industrial effluent containing azo dyes before
they get discharged into the environment. The second issue
concerns the pharmacological effect of these textile dyes. Besides
4-OHT, few compounds have anti-estrogenic activity. It is therefore of interest to note that some of the dyes that we characterized have similar anti-estrogenic activity, suggesting that they
may be lead compounds for the development of new 4-OHT like
anti-estrogenic compounds.
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II. Développement d’un nouveau bio-récepteur d’affinité pour la
détection des xéno-oestrogènes
Les connaissances acquises sur les mécanismes de la perturbation endocrinienne a
permis de mettre au point des tests de bio analyse in vitro de la perturbation endocrinienne. La
caractérisation, l’identification et la quantification des substances à l’origine de l’effet reste
cependant indispensable pour atteindre les objectifs de bon état écologique des masses d’eau.
L’analyse régulière de la qualité des masses d’eau fait appel à toute une panoplie d’outils de
diagnostic, d’évaluation et de mesure. Ces méthodes principalement physico-chimiques sont
automatisées et permettent de mesurer un grand nombre de substances chimiques connues et
d’échantillons (ces analyses se font en laboratoire). Elles représentent la grande majorité des
techniques d’analyse utilisées à ce jour. Il existe également des méthodes biologiques
permettant aussi de détecter spécifiquement une substance. Elles regroupent l’immunochimie, les bioessais, les biocapteurs. La plus répandue est la technique ELISA (Alarcon et
al., 2006). Cette technique nécessite le développement d’anticorps spécifiquement dirigés
contre les molécules cibles. L’anticorps reste le bio-récepteur (ou Elément de Reconnaissance
Biologique dit ERB) affine le plus utilisé. Le contrôle des contaminants de plus en plus
important crée une forte demande pour des méthodes d'analyse qui permettent leur détection
rapide et sensible à des concentrations correspondant aux limites réglementaires établies.
Dans ce cadre, la détection de mycotoxines est une préoccupation de plus en plus importante.
En effet, les mycotoxines de structures chimiques diverses et de propriétés physiques
différentes peuvent induire un large éventail d'effets biologiques sur les mammifères :
génotoxique, tératogène, mutagène, ou encore oestrogénique (Storari et al., 2012).
L'ochratoxine A, examinée par le Centre international de recherche sur le cancer, a été
reconnue comme potentiellement cancérogène (groupe 2B) pour l'homme et plus récemment
comme perturbateur endocrinien (Frizzell et al., 2013a et b). C’est pourquoi il est nécessaire
de surveiller le taux de contamination par cette toxine dans les aliments et les boissons
sachant que la dose maximale autorisée dans l'UE est actuellement de 2,0 µg/l en ochratoxine
A (European Commission, 2005). Les anticorps sont produits lorsque le système immunitaire
est au contact de molécules étrangères de poids moléculaire important (supérieur à l 000
daltons). En revanche concernant les molécules de poids moléculaire inférieur à 400 Da, les
réactions immunitaires sont induites par un couplage de la molécule d’intérêt (dite haptène) à
une molécule porteuse (dite «carrier» comme la BSA par exemple). De ce, fait la sélection
d’anticorps sélectifs uniquement contre l’haptène (molécule de «petite taille») est hasardeuse.
118
Par exemple, il existe des anticorps dirigés contre les HAP qui a été fabriqué en utilisant le
Benzo[a]pyrenebutyric acid (B[a]PBA) pour générer un anticorps (Scharnweber et al. 2001)
ou en le liant à une molécule porteuse (Spier et al. 2009). Les anticorps dirigés contre
certaines molécules naturelles oestrogèniques comme certaines mycotoxines sont rares. Le
remplacement de biomolécules naturelles avec les récepteurs artificiels ou biomimétiques est
devenu un axe de la recherche prometteur au cours des dernières années (Tothill et al., 2011).
Ces molécules présentent l’avantage d’être robustes et faciles à produire et peuvent être
modifiées aisément pour faciliter l'immobilisation. La reconnaissance moléculaire par des
peptides est connue pour un grand nombre de mécanismes, tels que la transduction de signal,
la croissance cellulaire et la défense immunitaire, et est basée sur plusieurs interactions non
covalentes (Tothill et al., 2013). Les récepteurs peptidiques présentent de nombreux avantages
par rapport aux anticorps car les peptides spécifiques peuvent être obtenus pour pratiquement
n'importe quelle cible et sont faciles à produire. Par conséquent, la conception et la synthèse
chimique de peptides pouvant se lier à la mycotoxine cible avec une affinité est un axe de
recherche novateur. Nous décrivons dans ce travail, la mise au point de bio-récepteurs
synthétiques de nature oligopeptidique affines pour l’ochratoxine A (OTA). En conséquence,
un certain nombre de peptides (dépôt de brevet européen n° 12305269,8, 2012) provenant de
protéines à activité redox spécifiques (par exemple l’oxydoréductase) ont été choisis et
produits par synthèse chimique. La capacité de ces peptides à se lier à l'ochratoxine A a été
évaluée par HPLC. Les résultats obtenus ont montré que le peptide NFO4 contenant 12 acides
aminés est celui qui a la plus grande affinité pour l’ochratoxine A. L'identification d'un tel
peptide permet d'analyser la présence de ce myco-oestrogène dans une matrice très complexe
où il est souvent présent, le vin rouge. Ce peptide est donc utilisé pour développer un dosage
immuno-enzymatique à base de peptide (test ELISA à base de peptide). La détection a pu être
réalisée pour une gamme allant de 1,25 à 10 µg/l d’OTA. Les limites de détection (LOD)
déterminées pour l’OTA dans le PBS et le vin rouge sont respectivement de 1,25 µg/l et 2
µg/l.
Le test ELISA a montré que le peptide NFO4 peut distinguer une contamination de 2
µg/l de l'OTA dans le vin rouge (sans préconcentration). En revanche cet oligopeptide
reconnait également l’ochratoxine B qui ne se distingue de l’ochratoxine A que par l’absence
d’un groupement chlore. Le test ELISA montre qu’il y a 21% de réactivité croisée.
En conclusion, cette étude préliminaire met en évidence la possibilité d'utiliser de
petits peptides dans des systèmes de biocapteurs (par exemple par détection électrochimique).
119
Des modifications de la séquence peptidique du NFO4 peuvent être requises dans le but de
diminuer d’avantage la réactivité croisée observée avec l’OTB. Dans tous les cas, ces données
préliminaires montrent qu’il est possible de développer d’autres bio-récepteurs d’affinité autre
que les anticorps et les aptamers ADN ou ARN pour détecter des contaminants dans des
matrices complexes.
120
Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246
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Biosensors and Bioelectronics
journal homepage: www.elsevier.com/locate/bios
Peptide binding to ochratoxin A mycotoxin: A new approach in conception of
biosensors
I. Bazin a,n, N. Andreotti b, A. Ibn Hadj Hassine a, M. De Waard c, J.M. Sabatier b, C. Gonzalez a
a
Ecole des Mines d’Ales, 6 avenue de Claviers 30319 Ales cedex, France
INSERM UMR1097, Aix-Marseille Université, Parc scientifique de Luminy, Marseille, France
c
INSERM U836, Grenoble Institut des Neurosciences, Bâtiment Edmond Safra, 38042 Grenoble Cedex 09, France
b
a r t i c l e i n f o
a b s t r a c t
Available online 27 July 2012
Ochratoxin A (OTA) is a widespread and abundant natural carcinogenic mycotoxin produced by several
species of Aspergillus and Penicillium fungi. Due to the ubiquitous presence of these fungi in food and
potential risk for human health, a rapid and sensitive in vitro detection assay is required. Analytical
methods for OTA detection/identification are generally based on liquid–liquid extraction, clean-up
using an immunoaffinity column (IAC), and identification by reversed-phase high pressure liquid
chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD). However, IACs are costly and have a short
lifespan. Therefore, an interesting approach would appear to be the design and chemical synthesis of a
mimotope peptide simulating mycotoxin-specific antibodies. We have developed a promising alternative method that is based on the use of peptides which are able to bind to specific chemical functions
and/or molecular structures. Accordingly, a number of peptides (derived from the structures of major
redox proteins) were selected and produced by chemical solid phase syntheses. The ability of such
peptides to bind to ochratoxin A was evaluated by HPLC. The peptide NF04 (structurally derived from
an oxidoreductase enzyme), which was found to be the sole potently reactive compound among tested
molecules, was further evaluated in a peptide-based enzyme-linked immunosorbent assay (peptidebased ELISA), thus confirming its specific interaction with ochratoxin A.
& 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords:
Peptide binding
Peptide-based assay
Ochratoxin A
Mycotoxin
1. Introduction
Ochratoxin A, also referred to as OTA, is a coumarinic mycotoxin produced by several fungi species from Aspergillus (e.g., A.
ochraceus) and Penicillium (e.g., P. verrucosum) genera under
different environmental conditions (Scott, 1997; Brera et al.,
2008). It is a mycotoxin that has been identified as a contaminant
in grains, cereals, beans, coffee, dried fruits and wine (Zimmerli
and Dick, 1995, Varga and Kozakiewicz, 2006; Blesa et al., 2006).
OTA is known to have nephrotoxic, immunotoxic, teratogenic and
carcinogenic effects (O’Brien and Dietrich, 2005, Pfohl-Leszkowicz
et al., 2002, Smith et al., 1995). Wine contamination by OTA has
been described and largely reviewed by several authors (Varga
and Kozakiewicz, 2006; Blesa et al., 2006). This beverage is widely
consumed and represents a major source of daily OTA intake for
the population (Jorgensen, 2005). Thus, regulatory limits for OTA
exist in many countries, especially in Europe where maximum
limits for OTA in wine, grape juices and grape beverages, have
been fixed at 2 mg l 1 (European Commission Regulation,
n
Corresponding author.
E-mail address: [email protected] (I. Bazin).
0956-5663/$ - see front matter & 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2012.07.031
2005,2010). Nowadays, the most widely used quality control
process relies on an immunoaffinity column (IAC), followed by
reversed-phase high pressure liquid chromatography using fluorescence detection (HPLC-FLD) (Visconti et al., 1999; Aresta et al.,
2006). Because this mycotoxin is largely represented in food,
availability of rapid, reliable and sensitive analytical methods for
the detection of OTA is required to protect consumers’ health.
Despite the fact that the IAC procedure is rather simple, sensitive
and quite reproducible, IACs are unfortunately too costly, together
with short shelf lives. In the last decade, several groups attempted
to develop appropriate alternative assays to improve rapidity and
sensitivity, combined with cost reduction. Such methods rely on
immunoassays, test strips and biosensors. First, a competitive
ELISA kit has been used widely in recent years for the detection of
OTA. ELISAs for ochratoxin content analyses have been reported
in barley (Morgan et al., 1983). The assay sensitivity for detection
of OTA in barley samples was ca. 5 mg kg 1 (Ramakrishna et al.,
1990). Angelini et al., (2008) compared performance of four
extraction procedures and three commercial ELISA kits for OTA
in grapes. Sometimes, IAC are used to concentrate OTA. The
advantage of using IAC after the extraction procedure was the
excellent detection limit, which was between 0.06 and
0.0075 mg l 1. This detection limit depends on the ELISA kit used.
I. Bazin et al. / Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246
Second, the test strip, also called lateral flow device or immunochromatographic strip (ICS) test, is based on a membrane loaded
with immobilized antibodies. They are of simple use and give
faster results (2–15 min). Test strips are semi-quantitative with
different visual limits of detection (LOD) in function of the nature
of sample (Krska and Molinelli, 2009; Shim et al., 2009). Initially,
the LOD was set at ca. 500 mg l 1 of OTA (Cho et al., 2005;
Rusanova et al., 2009), whereas, nowadays, the cutoff level
dropped down to 1 mg l 1, which corresponds to the lower limit
tolerated by the Food and Drugs Administration. Third, with
regard to biosensors, their characteristics depend on the nature
of the bioreceptor and the physical transducer. Antibodies, which
show high selectivity and affinity towards mycotoxins, have been
widely used to set up a variety of immunosensors (e.g. electrochemical, impedimetric or conductimetric immunosensors)
against mycotoxins like OTA (Prieto-Simón et al., 2008; Liu
et al., 2009; Alarcon et al., 2006; Radi et al., 2008,2009).
The well-known favorable molecular recognition characteristics
of an antibody (in terms of affinity and selectivity) are counterbalanced by the unfavorable use of different matrix samples or
experimental conditions of assay (e.g. denaturation of antibodies in
organic solvents). To overcome these drawbacks, several strategies
have been followed such as development of new synthetic systems
that mimic the recognition properties of antibodies. Indeed, many
efforts have been made to substitute OTA antibodies by DNA
aptamers (Cruz-Aguado et al., 2008a,2008b), molecularly
imprinted polymers (MIP) (Ali et al., 2010; Yu and Lai, 2010) and
phage display libraries (Giraudi et al., 2007). The isolation of
oligonucleotide sequences (DNA aptamers) and synthetic receptor(s) (MIP) that recognize this class of target molecules have some
advantages compared to antibodies. They can be generated easily
and are stable at different pH values and/or at high temperatures.
Among these approaches, based on synthetic systems, none of
them reach affinity for OTA that is compatible with the detection
limits fixed in wine by the European Commission (2.0 mg l 1) or
the rest of the world (1.0 mg l 1). The first hexapeptide selected
using phage display libraries exhibits an affinity of ca.
3.4 104 M 1 towards OTA (Giraudi et al., 2007). Although moderate, such a peptide affinity can be potentially increased by some
structure–activity relationship studies. Peptide-based detection
assays in general are commercially available and most frequently
used in the biomedical field rather than environmental sciences
which is of concern in this study. For examples, peptides are used
in various fields, from diagnosis of HIV infection (Alcaro et al.,
2003; Ravanshad et al., 2006; Gerasimov and Lai, 2010) to detection of potential sensitizing compounds (Gerberick et al., 2004).
Apart from the previously described techniques used for OTA
quantification, we describe in this work for the first time a novel
approach based on the identification of new peptides (not based
on phage display analyses) which exhibit significant affinities
towards OTA. HPLC was used as an analytical method to select the
most potent peptide interacting with OTA in a binding assay.
Identification of such a peptide is important and allowed us to
analyze some red wine samples that were previously supplemented with OTA in a peptide-based enzyme-linked immunosorbent
assay (peptide-based ELISA).
241
2.2. Chemicals
OTA was obtained from Sigma-Aldrich (France). A solution was
prepared in methanol at 1 mg ml 1. PEG 8000 (Polyethylene
Glycol) and PVPP were obtained from Promega (France). Luminol
was obtained from Pierce (France).
2.3. Solid-phase peptide synthesis
The peptides (NF01, NF02, NF03, NF04, Chim1, pep01 and
pep02) were produced by chemical synthesis using a peptide
synthesizer (Model 433 A, Applied Biosystems Inc.). The amino
acid sequence of the most reactive peptide, i.e. NFO4, is provided
in Fig. 2B. All peptide sequences are described in European patent
no. 12305269.8 (deposited by Tournoux Biotech on March 5th
2012). Peptide chains were assembled stepwise on 0.25 m mol of
Fmoc-amide resin (1% cross-linked; 0.65 m mol of amino group/g)
using 1 m mol of Na-(9-fluorenyl)methyloxycarbonyl (Fmoc)
L-amino acid derivatives. Side chain-protecting groups for trifunctional residues were: trityl for cysteine, and asparagine; t-butyl
for tyrosine, glutamate and aspartate; 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl for arginine; and t-butyloxycarbonyl
for lysine. Na-amino groups were deprotected by successively
treating with 18 and 20% (v/v) piperidine/N-methylpyrrolidone
for 3 and 8 min, respectively. After three washes with N-methylpyrrolidone, the Fmoc-amino acid derivatives were coupled
(20 min) as their hydroxybenzotriazole active esters in N-methylpyrrolidone (4-fold excess). After peptides were assembled, and
removal of N-terminal Fmoc groups, the peptide resins (ca. 1.5 g)
were treated under stirring for 2.5 h at 25 1C with mixtures of
trifluoroacetic acid/H2O/thioanisole/ethanedithiol (73:11:11:5, v/
v) in the presence of crystalline phenol (2.1 g) in final volumes of
30 ml per gram of peptide resins. The peptide mixtures were
filtered, precipitated and washed twice with cold diethyloxide.
The crude peptides were pelleted by centrifugation (3200 g;
10 min). They were then dissolved in H2O and freeze dried. The
crude peptides were purified to homogeneity by reversed-phase
high pressure liquid chromatography (HPLC) (C18 Aquapore ODS,
20 mm, 250 10 mm; PerkinElmer Life Sciences) by means of a
60 min linear gradient of 0.08% (v/v) trifluoroacetic acid/H2O
(buffer A) with 0 to 40% of 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid/
acetonitrile (buffer B), at a flow rate of 4 ml/min (l ¼230 nm).
The purity and identity of each peptide were assessed by:
(i) analytical C18 reversed-phase HPLC (C18 Lichrospher 5 mm,
4 200 mm; Merck) using a 60 min linear gradient of buffer A
with 0–60% of buffer B, at a flow rate of 1 ml/min; and (ii)
molecular mass determination by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) spectrometry (Voyager DE-RP, Perceptive Biosystems Inc.).
2. Material and methods
2.1. Materials
Na-fluorenyl-9-methyloxycarbonyl
(Fmoc)-L-amino
acids,
Fmoc-amide rink resin, and reagents used for peptide synthesis
were obtained from Iris Biotech (Germany). Solvents were analytical grade products from Carlo-Erba (France).
NFO4 primary structure
VYMNR KYYKC CK-NH2
1
5
10
12
Fig. 1. (A) Chemical structure of Ochratoxin A mycotoxin. (B) Amino acid
sequence of NFO4. Single letter code.
242
I. Bazin et al. / Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246
332-
NFO4
20015010050-
300Absorbance (mV)
250-
25020015010050-
9
18 27
36 45
Retention time (min)
54 60
18 27
36 45
Retention time (min)
NFO1
200150100-
20015010050-
509
18 27
36 45
Retention time (min)
54 60
18 27
36 45
Retention time (min)
Chim1
54 60
OTA
300-
NFO2
250-
100-
335-
Absorbance (mV)
Absorbance (mV)
250-
NFO4
150-
9
300-
300-
200-
54 60
OTA
348-
250-
50-
NFO4
9
OTA
343-
OTA
338-
300Absorbance (mV)
Absorbance (mV)
300-
Absorbance (mV)
Hydroquino
ne
329-
25020015010050-
9
18 27
36 45
Retention time (min)
54 60
9
18 27
36 45
Retention time (min)
54 60
Fig. 2. HPLC-based peptide-based binding assays. (A) Representative HPLC profiles of three reaction media corresponding to NF04 incubation with lactic acid as negative
control (left panel), hydroquinone as positive control (center panel) and OTA (right panel). Lactic acid is not detected on the HPLC profile because of lack of absorption at
230 nm. Complexes between NF04 and compounds are not detected on HPLC profiles. (B) Representative HPLC profiles of three peptides incubated with OTA: NFO1 (left),
NFO2 (middle), and Chim1 (right). Peak peptide depletions according to control without OTA (not shown) are 7% (NFO1), 35% (NFO2) and 10% (Chim1).
2.4. HPLC-based peptide binding assays
Eighty microlitres of a peptide (NF01, NF02, NF03, NF04,
Chim1, pep01 or pep02) at a concentration of 1.25 mM in 0.1 M
Tris–HCl buffer, pH 8.3, were tested with 10 ml of OTA solution at
0.1 M in acetonitrile, supplemented with 70 ml of 0.1 M Tris–HCl
buffer (pH 8.3) and 40 ml acetonitrile. The mixture of peptide and
OTA was incubated for 4 h in the dark, at a temperature of 30 1C.
The reaction medium (200 ml) was then analyzed by C18 reversedphase HPLC (C18 Aquapore ODS, 20 mm, 250 10 mm; PerkinElmer Life Sciences) by means of a 40 min linear gradient of 0.08%
(v/v) trifluoroacetic acid/H2O (buffer A) with 0 to 60% of 0.1% (v/v)
trifluoroacetic acid/acetonitrile (buffer B), at a flow rate of 1 ml/
min (l ¼230 nm). Peptide reactivity with OTA was finally
assessed by comparing the peak areas corresponding to free
peptide (unreactive peptide) between the test sample of peptide/OTA, and a reference sample of peptide alone (without OTA).
It is worth mentioning that results obtained with the reference
samples (peptides alone) are similar to those obtained with
peptides incubated with irrelevant, unreactive products (data
not shown). The identity of free peptides and peptide/OTA
complexes was verified by MALDI-TOF mass spectrometry. Binding assays were performed in triplicate.
2.5. Peptide-based competitive enzyme-linked immunosorbent
assay (peptide-based competitive ELISA)
Polystyrene white microtiter plate wells (Maxisorb LumiNunc,
Thermoscientific, USA), coated with the synthetic peptide NFO4 at
an optimized concentration of 5 mg/100 ml in carbonate buffer
(15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 0.2 g/L NaN3, pH 9.6) were
incubated at 37 1C for 3 h. Non-specific binding sites of the
peptide-coated wells were blocked with 5% nonfat dry milk in
PBS containing 0.1% Triton X-100 (milk buffer) at room temperature (RT) for 3 h before performing the test. Fifty ml of OTA-HRP
(horseradish peroxidase) were added in each well combined with
50 ml of phosphate buffer saline or red wine sample supplemented with unlabeled OTA. The reaction was left for 30 min at RT.
After washing unbound OTA, 40 ml of luminol (Pierce, France)
substrate was added in each well. After 5 min of enzymatic
reaction, light emission signals (lmax ¼425 nm) were analyzed
using an automated microplate luminescence reader (Berthold,
France). Light intensity was expressed in Relative Luminescent
Unit (RLU). The result obtained is inversely proportional to the
concentration of unlabeled OTA. During each test, nonspecific
binding (negative control) was determined by using an incubation
mixture (OTA-HRP) in which the peptide NFO4 was replaced by
100 mL of carbonate buffer. All the samples were tested in
triplicate and the mean of the peak light emission was taken as
the final light signal value.
2.6. Calculation methods
In order to evaluate the peptide-based competitive assay, a
calibration curve was set up by using solutions containing welldefined concentrations of OTA. In that direct competitive peptidebased ELISA, results are expressed in B/Bo dose logarithmic
function. B and Bo represent the enzyme-bound activity measured in the presence or absence of competitor, respectively. The
standard curve was traced by plotting standard concentrations on
I. Bazin et al. / Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246
x-axis (logarithmic scale) and percentage of maximal binding
(express in % of B/B0) on y-axis (B/Bo¼f(log[OTA])). The binding
values are obtained by dividing the light intensity of each testing
well B (the luminescence measured when OTA–HRP and unlabeled OTA are in competition with NFO4 peptide) by the light
Table 1a
HPLC-based peptide binding assays. Percentages of peak area depletion are noted.
‘100’ corresponds to 100% binding of peptide to indicated chemical compound. ‘0’
corresponds to a lack of interaction between peptide and organic compound.
243
intensity of the positive control well B0 (maximum luminescence
obtained with OTA-HRP). This method allows the comparison of
results between assays performed on different plates or different
days. While the absolute light emission may differ from plate to
plate or day to day, the percentage of B/B0 values should be
reasonably consistent from one plate to the next. All measurements were made in triplicate. The minimum detectable concentration (MDC) was taken as the concentration of competitor
(unlabeled OTA) inducing a significant decrease in B0. The effect
of complex matrix was established by testing a red wine sample.
Peptides/chemical compounds
NFO1
NFO2
NFO3
NFO4
Chim1
2.7. Specificity measurements
Hydroquinone
Phtalic anhydride
Diphenylcyclopropenone
Cinnamic aldehyde
Phenylacetaldehyde
Lactic acid
Okadaic acid
Naphtalene
100
95
0
55
80
0
0
0
90
100
98
35
20
0
0
0
100
100
100
100
35
0
0
0
100
100
99
100
100
0
0
0
80
85
85
90
55
0
0
0
The specificity of the peptide immunoassay described previously was controlled by testing its capacity to detect or not
ochratoxin B (OTB), another mycotoxin structurally related to
OTA. Results are expressed as percentage of cross-reactivity,
defined as the ratio (%) of the concentration of OTA and OTB
compounds at 50% B/B0. Cross-reactivity measurement was carried out in triplicates.
Table 1b
Chemical structures of organic compounds studied in HPLC-based peptide binding assays.
Name
MW
Hydroquinone
110.11
Belchik and Xun (2011)
Phtalic anhydride
148.10
Quartier et al. (2006)
Diphenylcyclopropenone
206.25
Ryan et al. (2000)
Cinnamic aldehyde
132.16
Cocchiara et al. (2005)
Phenylacetaldehyde
120.15
Chen et al. (2011)
90.08
Shen et al. (2012)
Lactic acid
Chemical structure
Ref.
Okadaic acid
805.00
Franchini et al. (2010)
Naphtalene
128.17
Girschikofsky et al. (2012)
244
I. Bazin et al. / Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246
In order to study matrix-associated effects, a study with red
wine was carried out. A sample of 10 ml of wine supplemented
(or not) with OTA (1.25–15 mg l 1) has been diluted with 10 mL
of PEG8000 1% - NaHCO3 5% solution. This mixture has been
incubated for 30 min at RT on a rocker. Afterwards, it was
centrifuged at 8000 rpm for 15 min. The whole sample is filtered
before analysis with the peptide-based enzyme-linked immunosorbent assay.
Using NFO4, the threshold of OTA detection was found to be in
the same concentration range as the one requested by the
European commission regulation (2 mg l 1 OTA). Although the
potency of OTA detection by NFO4 is actually moderate, one can
anticipate that optimizing both NFO4 structure (in a structureactivity relationship study) and the experimental conditions of
binding assay could improve sensitivity of peptide-based detection, and yield to the desired mycotoxin detection range in wine.
Overall, experimental data obtained strongly suggest that, basically, a peptide-based detection assay of OTA might be a promising approach.
3. Results and discussion
3.2. Peptide-based competitive enzyme-linked immunosorbent
assay
2.8. Preparation of matrix samples for peptide EIA: wine
pretreatment
3.1. Rationale of the study
The mycotoxin OTA from Aspergillus (e.g., A. ochraceus) and
Penicillium (e.g., P. verrucosum) genera is a complex organic
compound that contains several functional groups, including
carbonyl (ester: R1COOR2, and amide: R1CONHR2R3) and phenol
(i.e f-OH) moieties (Fig. 1A). We designed and chemically
produce a number of peptides (European patent deposit no.
12305269.8, 2012) derived from specific regions of redox proteins
(e.g. oxidoreductase) and ABC transporters that potently react-in
an HPLC-based binding assay-with more or less complex molecules containing such functional group(s), i.e carbonyl and/or
phenol (Table 1a and b). The carbonyl group (i.e. C¼O) is shared
by several types of organic compounds and comprises ketone,
aldehyde, ester, amide, carboxylic acid, acid anhydride, enone and
acyl halide. We evaluated whether or not these selected peptides
would interact with OTA. As shown in Table 2, three peptides
(NFO2, NFO3 and NFO4), with related molecular structures (up to
83% sequence identity) derived from human NADH–FMN oxidoreductase significantly interacted with the mycotoxin. The experimental molecular masses, as determined by MALDI-TOF mass
spectrometry, were (M þH) þ : 1793.17 Da (NFO2), 1722.15 Da
(NFO3) and 1598.99 Da (NFO4), consistent with their calculated
molecular structures. Among reactive peptides, NFO4 was the
most potent compound, with 70% binding to OTA in our experimental conditions of binding assay. NFO4 amino acid sequence is
provided in Fig. 1B. Fig. 2A shows binding assays with representative HPLC profiles of three reaction media corresponding to
NF04 incubated for 4 h at 30 1C with lactic acid as negative
control (left panel), hydroquinone as positive control (center
panel) and OTA (right panel). Interaction of NFO4 with hydroquinone or OTA is highlighted by the disappearance (hydroquinone) or decrease (OTA) of peak area corresponding to freeunbound NFO4. HPLC profiles showing binding of other peptides
to OTA are also shown for comparison (Fig. 2B). For example,
NFO1 and Chim1 showed binding inferior to 10%, while NFO2
showed binding at 35%.
Table 2
Peptide binding assay. Percentages of peak area depletion are noted. ‘100’
corresponds to 100% binding of peptide to organic compound. ‘0’ corresponds to
a lack of interaction.
Peptides/chemical compounds
NFO1
NFO2
NFO3
NFO4
Chim1
OTA
Hydroquinone**
Lactic acid*
7
100
0
35
90
5
40
100
4
70
100
7
10
80
1
nn
n
Positive control.
Negative control.
Competitive ELISAs are most commonly used to measure
various molecules including lipids, hormones, and small peptides
if they are present in high enough concentrations. In this study,
this type of assay is based on the competition between the
analyte of interest, OTA, and an enzyme horseradish peroxidaseconjugated version of the same analyte (referred to as the tracer,
OTA–HRP) for a limited number of specific peptide NFO4 binding
sites (Fig. 3). The concentration of OTA–HRP is held constant in all
wells while the concentration of OTA varies from well-to-well
(0 mg l 1, 1.25 mg l 1, 2 mg l 1, 2.5 mg l 1, 5 mg l 1, 10 mg l 1 and
15 mg l 1). As a result, the amount of tracer that can bind to the
peptide NFO4 will be inversely proportional to the amount of
analyte in the well–the presence of more analyte means less
tracer will be able to bind to the specific peptide.
The standard curves obtained for peptide-based competitive
ELISA in PBS are shown (Fig. 4A). The exponential curve fit for the
standard OTA in PBS gives a clear graphical representation of how
the competition proceeds. Inhibition starts at 1.25 mg l 1 and
reaches a maximum at 10 mg l 1. Inhibition is complete which is
expected since the tracer is also OTA-based. Half-inhibition occurs
at a value of 3.2 mg l 1, which should grossly correspond to the Kd
value of NFO4 for OTA. We consider that with this test the LOD for
OTA is at 1.25 mg l 1 and that differences in OTA concentration
can be discriminated between 1.25 and 10 mg l 1. Cross-reactivity
measurement of the peptide test was carried out using OTB
(Fig. 4A). The OTB concentration inducing 50% of the maximum
Peptide NFO4 anti-OTA
OTA
Other compounds (interferences)
OTA-HRP
Developer (substrate)
Fig. 3. Principle of competitive immunoassay with conjugated OTA. (A) The plate
is coated with the peptide NFO4. (B) The peptide is then placed in contact with the
sample. If the sample contains the specific OTA, the toxin links to the specific
peptide and the detection element conjugated with the toxin (usually HRP).
(C) The amount of HRP-conjugated toxin that can be fixed is inversely correlated
with the amounts of toxin present in the sample. (D) The non-fixed compounds
are rinsed away before adding a developing product.
I. Bazin et al. / Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246
100
Red wine OTA
luminescence (RLU)
80
B/B0 (%)
245
60
40
PBS OTA
20
PBS OTB
0
1
10
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
Control
Mycotoxin concentration (µg l-1)
0
2
10
OTA concentration (µg l-1)
Fig. 4. (A) Peptide-based competitive ELISA calibration curve. The x-axis represents the calibrator concentration of mycotoxin (OTA or OTB). B and B0 represent the bound
enzyme activity measured in the presence or absence of competitor, respectively. Data are average7 standard deviation, and were fitted by decreasing exponential
functions y¼y0 þa.e bx. Y0 values were o 10 for OTA (wine and PBS) and 430 for OTB. (B) Peptide-based competitive ELISA with OTA in wine. The negative control is the
luminescence emitted with OTA–HRP without NFO4 peptide. Data are the mean of n ¼3 7standard deviation.
possible decrease of the light signal was 8.5 mg l 1, indicating that
the affinity of NFO4 for OTB is ca. 3-fold lower than for OTA. In
addition, free OTB was a worse competitor than OTA for decreasing OTA–HRP signal. Maximal decrease reached 69% instead of
100% for concentrations above 15 mg l 1. At 10 mg l 1, OTA
depleted the signal by 89%, whereas OTB reduced it by 47%
clearly indicating that OTA detection was better than OTB with
this system. Next, we evaluated whether our system could detect
OTA from red wine samples. The same range of OTA concentrations was added to red wine samples. The resulting competition
curve was compared to that established with pure OTA or OTB in
PBS (Fig. 4A). Wine OTA could nicely be detected by the system,
with a slight reduction in efficacy which can easily be explained
by the enhanced number of non specific compounds co-present in
wine samples. Half-inhibition occurred at 5.8 mg l 1 and as for
OTA in PBS the inhibition was complete. The LOD for OTA in wine
was 2 mg l 1 (Fig. 4B), which is only slightly higher than OTA in
PBS. These results suggested that the NFO4 peptide can be used
for detection of OTA in red wine matrices.
4. Conclusions
The European Union (EU) has defined regulatory limits for
OTA, i.e., 10 mg l 1 in dried vine fruits and instant coffee, 5 mg l 1
in cereals and roasted coffee and 2 mg l 1 in wine. Here we
present a new strategy for detection of this important mycotoxin
in various matrices like red wine. We have selected small
peptides (12 amino acids) allowing specific recognition of OTA.
The peptide named NFO4 was selected in HPLC for its higher
affinity for OTA. We have validated this result by a peptide-based
competitive ELISA in phosphatase buffer saline and in red wine
samples. The peptide-based competitive ELISA showed that NFO4
can discriminate a contamination of 2 mg l 1 of OTA in red wine
(without preconcentration of the sample on immunoaffinity
column). This preliminary study highlights the possibility of using
small peptides in biosensor systems (e.g. by electrochemical
detection). Modifications of NFO4 peptide sequence may be
required in order to further decrease the observed cross-reactivity
with OTB which is potentially related to the phenol moiety of
OTB. Such a structure-activity relationship study may increase the
LOD to the lower value of 1 mg l 1 which is the world limit for
OTA in red wine. In any case, these preliminary data are quite
encouraging and strongly suggest that further work on NFO4 will
allow the development of a more sensitive system, either by
peptide modification or by OTA preconcentration by an affinity
column.
Acknowledgment
Fernando Rubio (Abraxis Kit, Warminster, PA, USA) is thanked for
OTB-HRP production.
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Conclusion générale et perspectives
Bien que les premières recommandations de l’OCDE, sur la prise en compte des effets
des substances chimiques sur des organismes complexes, remontent aux années 90,
l’évaluation de leur impact sur le système hormonal reste d’actualité dans la mesure où
aucune réglementation spécifique relative aux perturbateurs endocriniens (PE) n’existe à ce
jour. Même si les activités hormonales de certains composés sont connues, leur mode d’action
est complexe (effet de faible dose, effet de mélange, action sur différentes voies
physiologiques) et de fait, il est difficile de standardiser des tests pouvant soutenir une
réglementation. Les PE peuvent agir sur le système endocrinien en interférant à plusieurs
niveaux (transport, métabolisme, libération d’hormones,…) et perturber les sécrétions
hormonales des glandes endocrines telles que la thyroïde, les surrénales, le pancréas
endocrine,… En effet, ces substances peuvent avoir des activités œstrogéniques et antiœstrogéniques, androgéniques et anti-androgéniques ou encore des activités thyroïdiennes. De
ce fait, il n’existe pas de test unique recouvrant l’ensemble de ces perturbations hormonales,
mais différents tests sont disponibles pour mesurer soit une perturbation oestrogénique (Escreen, ER-Calux, YES,…) soit une perturbation androgénique (YAS).
Ainsi, dans le cadre de cette thèse, des tests in vivo et in vitro ont été utilisés pour
détecter des perturbations endocriniennes. Pour l’ensemble des cas d’étude, le test YES a été
appliqué pour déterminer l’activité oestrogénique et anti-oestrogénique d‘effluents ou de
substances chimiques.
A partir d’un terrain d’étude situé en Tunisie (Golfe de Gabes), ce travail de thèse s’est
intéressé tout d’abord à l’impact des PE sur les écosystèmes aquatiques recevant des effluents
de STEP provenant de différentes activités anthropiques.
Le constat est que l’activité industrielle (traitement de phosphates et industrie
chimique) est l’une des principales causes des déformations squelettiques observées sur les
poissons Aphanius faciatus. Par contre, les organismes soumis aux rejets d’origine urbaine
présentent un taux de déformations plus faible. Les analyses des métaux, des HAP et des
œstrogènes naturels (œstradiol et produits de dégradation) et synthétiques (éthynilestradiol)
mettent en évidence la présence de Cd et de HAP à des teneurs non négligeables. Des études
antérieures ont montré que les poissons déformés présentent une surexpression de l’ARNm
126
codant pour le cytochrome P450 1A (CYP 1A). La transcription de ce gène est modulée par
des xéno-hormones pouvant se lier au récepteur à la dioxine (AhR) comme les PCB ou les
HAP. Ces résultats mettent en évidence que l’exposition combinée du cadmium et des HAP
peut altérer l’activité des enzymes de biotransformation du métabolisme comme le CYP1A.
De plus, il n’est pas à exclure que le Cd en présence de ligands d’AhR comme les HAP,
puisse interagir avec la voie de signalisation de récepteur aux œstrogènes via la voie AhR. En
revanche, une relation avec une perturbation oestrogénique spécifiquement liée au Cd est
moins évidente, dans ce cas précis, car le principal biomarqueur (taux de vitellogénine) est
identique chez tous les individus qu’ils présentent une déformation ou pas.
Cette étude a été complétée par l’évaluation de l’effet oestrogénique des eaux usées
susceptibles de contenir des parabènes en utilisant le Yeast Estrogen Screen (YES). L’activité
oestrogénique a été mesurée sur la phase dissoute, les MES et les boues pour différentes
étapes de traitement de la STEP. L’activité oestrogénique la plus importante est observée au
niveau des boues avec une EC50 pouvant atteindre 10-8 EEQ (M). Par ailleurs, la
quantification des parabènes par HPLC a été effectuée sur les phases dissoutes et MES (entrée
et sortie de STEP) ainsi que sur les boues. Les valeurs obtenues montrent que ces composés
ne sont plus présents en sortie à l’exception du méthyl parabène. La concentration de ce
composé est, en effet, importante dans les eaux d’entrée de STEP et donc son élimination ne
semble pas complète. Par contre l’éthyl et le butyl parabène sont accumulés
préférentiellement dans les boues.
Par ailleurs, la Tunisie ayant des activités textiles importantes, le YES a été utilisé
pour déterminer les effets oestrogéniques et anti-oestrogéniques de colorants textiles. Les
données de la littérature indiquent que les PE sont généralement des agonistes (effet
oestrogénique), or les résultats obtenus pour ces colorants textiles ont montré une activité
antagoniste (effet anti-oestrogénique). Cette activité anti-oestrogénique est plus classiquement
observée pour les agents pharmacologiques appelés SERM (Selective Estrogen Receptor
Modulator) comme le tamoxifen. Les effluents textiles étudiés présentes également une
activité anti-oestrogénique.
Pour compléter l’étude des colorants, l’effet oestrogénique a été mesuré via le YES sur
des colorants alimentaires. Leur effet oestrogénique a été comparé à celui des parabènes et les
résultats montrent qu’ils présentent une faible activité.
127
Bien que la présence des xéno-hormones dans les effluents de STEP étudiés soit
avérée, la concentration mesurée et l’effet oestrogénique observé via le YES ne sont pas
directement corrélables. En effet, l’activité oestrogénique des parabènes, recalculée en EEQ
(équivalent oestradiol) à partir de la concentration réellement mesurée par HPLC, est
nettement inférieure à celle observée pour l’échantillon via le YES.
En conclusion, le YES semble adapté à l’étude d’effluents de STEP. En effet, les
résultats de cette étude ont mis en évidence des effets oestrogéniques et anti-oestrogéniques
sur des effluents réels. Son principal avantage réside dans sa simplicité d’utilisation qui le
rend plus compatible avec des contrôles en routine. Cependant, en matière de gestion des
effluents et pour une prise de décision adéquate, il est nécessaire de définir un objectif de
qualité au vu de l’activité oestrogenique (définie en équivalent oestradiol, EEQ). Ainsi, le
centre Suisse d’écotoxicologie appliqué (Eawag-EPFL) de Lausanne propose une
classification de la qualité des eaux basée sur le niveau d’oestrogénicité évaluée par le YES.
Cependant la validation de ce biotest, en vue d’une normalisation ISO, est encore à l’étude.
Comme pour les tests de toxicité globale, il sera difficile de corréler l’activité oestrogénique
mesurée avec les analyses chimiques des substances potentiellement actives. Par ailleurs, le
déploiement d’une série de tests spécifiques à une perturbation hormonales (androgénique,
oestrogénique,
thyroïdienne)
permettrait
de
mieux
identifier
les
xéno-hormones
potentiellement présentes.
Les tests in vitro permettent d’évaluer l’activité oestrogénique d’un échantillon.
Cependant, lorsqu’il s’agit d’identifier et de quantifier précisément une xéno-hormone, les
analyses chimiques sont généralement utilisées. Il existe également des méthodes biologiques
permettant de détecter spécifiquement une substance. Ces méthodes sont les bioessais, les
biocapteurs. Parmi les bioessais, la technique de l’ELISA est la plus utilisée. Cette technique
nécessite le développement d’anticorps spécifiquement dirigés contre les molécules cibles.
L’anticorps reste le biorécepteur (ou Elément de Reconnaissance Biologique dit ERB) affine
le plus utilisé. Comme il est parfois difficile d’obtenir des anticorps contre les molécules de
petites tailles, des solutions alternatives ont été développées.
Ainsi, un des objectifs de cette thèse était de proposer un biorécepteur de nature
peptidique pour détecter des myco-oestrogènes, notamment l’ochratoxine A qui est une
mycotoxine difficilement immunogène. Les récepteurs peptidiques présentent de nombreux
avantages par rapport aux anticorps car les peptides spécifiques peuvent être obtenus pour
128
pratiquement n'importe quelle cible. Ils sont, par ailleurs, robustes, faciles à produire et
peuvent être modifiées aisément pour faciliter l'immobilisation.
Par conséquent, la conception et la synthèse chimique de peptides pouvant se lier à la
mycotoxine cible avec une affinité est un axe de recherche novateur. Les résultats obtenus ont
permis de sélectionné un peptide contenant 12 acides aminés (NFO4) présentant la plus
grande affinité pour l’ochratoxine A. Ce peptide a été utilisé pour développer un dosage
immuno-enzymatique à base de peptide (test ELISA à base de peptide). La détection a été
réalisée pour une gamme allant de 1,25 à 10 µg/l d’OTA. Les limites de détection (LOD)
déterminées pour l’OTA, dans le PBS et le vin rouge, sont respectivement de 1,25 µg/l et 2
µg/l.
Dans la continuité de cette étude, le peptide NFO4 ayant différentes conformations
tridimensionnelles potentielles, il sera important d’étudier son affinité pour la cible en
fonction de son immobilisation sur un support. Ainsi, un accrochage spécifique (N-terminal
ou C-terminal) pourra induire des affinités différentes vis-à-vis de la cible (OTA). La nature
du support utilisé, la modification de surface du support et l’immobilisation des biorécepteurs
disponibles sont des étapes clés dans le développement de méthodes biologiques de détection
directes de polluants. Le protocole le plus utilisé pour l’immobilisation des ERB est
l’adsorption. Cependant, la technique d'adsorption repose sur des interactions électrostatiques
et hydrophobes non spécifiques pour immobiliser des biorécepteurs. Selon les conditions du
milieu, une désorption peut se produire en raison de la nature réversible de l'attachement non
covalente. En variante, la liaison covalente de biomolécules (comme les protéines) sur des
surfaces solides est de plus en plus étudiée pour augmenter la stabilité de la biomolécule, et la
disponibilité des sites de reconnaissance avec le polluant cible. Donc en perspective de ce
travail de recherche, la détermination des conditions d’immobilisation des peptides permettant
de conserver leur activité biologique (donc leur reconnaissance spécifique) sur un support
adéquat (biopolymère ou membrane de nitrocellulose) sera effectuée. L’objectif est de
proposer un système de détection de petites molécules non immunogènes autres que l’OTA en
utilisant un biorécepteur peptidique.
129
130
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École Nationale Supérieure des Mines
de Saint-Étienne
NNT : 2014 EMSE 0740
Aziza IBN HADJ HASSINE
EVALUATION
OF
CONTAMINANT’S
ESTROGENIC
ACTIVITY
AND
DEVELOPMENT OF A BIO-RECEPTOR FOR THE DETECTION OF A XENOHORMONE.
Speciality : Sciences et génie de l’environnement
Keywords : Bio-detection, sewage treatment plants, Yeast Estrogen Screen, Paraben, food
and textile dyes, Peptide, Ochratoxin A
Abstract :
For several years, environmental exogenous agents called endocrine disruptors (ED),
are thought to interfere with reproduction and development functions in many organisms. For
the Protection of the Environment and human health, the Water Framework Directive
establishes environmental quality standards (EQS) and limits the ranges of thirty-three
substances and eight other pollutants in surface waters. Nevertheless, it does not yet take into
account the effect of these priority substances on ecosystems and humans including endocrine
disruption. More than endocrine disruptors specificity (dose response curve, mixtures effect
etc...) make the identification process more complex. This thesis focuses on the study of
hormonal effects, the most commonly encountered, estrogen disruption using the yeast
estrogen screen (YES) as diagnostic tool. This study focuses particularly on the north of
Tunisia, where the impact of ED on development of Aphanius fasciatus. Some xenoestrogens such as cadmium and PAH products generated by local industry are partly involved
on observed skeletal deformities. In parallel, some xeno-estrogens (including parabens) are
detected in the waters of sewage treatment plants. Other chemicals such as textile and food
dyes also have endocrine activities. Under the supervision of water quality, it is necessary to
develop rapid tests to detect endocrine disrupter and supplement chemical analysis. Some
active substances on the endocrine system is poorly immunogenic, the research axis
developed in this thesis focuses on a peptide affinity for detecting a fungi toxin, the
ochratoxin A.
École Nationale Supérieure des Mines
de Saint-Étienne
NNT : 2014 EMSE 0740
Aziza IBN HADJ HASSINE
EVALUATION
DE
L’ACTIVITE
OESTROGENIQUE
DE
CONTAMINANTS ET DEVELOPPEMENT D’UN BIO-RECEPTEUR
D’AFFINITE POUR LA DETECTION D’UNE XENO-HORMONE.
Spécialité: Sciences et génie de l’environnement
Mots clefs : Bio-détection, Effluents de station d’épuration, Yeast Estrogen Screen,
Parabènes, Colorants textiles et alimentaires, Peptide, Ochratoxine A
Résumé :
Depuis plusieurs années, des agents exogènes environnementaux appelés perturbateurs
endocriniens (PE), sont soupçonnés d’interférer avec les fonctions essentielles de
reproduction et de développement chez de nombreux organismes vivants. Pour la protection
de l’Environnement et de l’Homme, la Directive Cadre sur l’Eau établit des normes de
qualité environnementale (NQE) et limite la concentration de trente-trois substances et de
huit autres polluants dans les eaux de surface. En revanche, elle ne prend pas encore en
compte l’effet de ces substances prioritaires sur les écosystèmes et les humains notamment la
perturbation endocrinienne. De plus les spécificités des perturbateurs endocriniens (courbe
dose réponse, effets de mélanges etc..) rendent le processus d'identification de ces molécules
complexe. Cette thèse est axée sur l’étude d’un des effets hormonaux, les plus couramment
rencontrés, la perturbation oestrogénique en utilisant comme outils de diagnostic le Yeast
Estrogen Screen (YES). Cette étude porte plus particulièrement sur le nord de la Tunisie où
l’impact de certains PE sur le développement de poissons Aphanius fasciatus a été mis en
évidence. Certains xéno-estrogènes comme le cadmium et les HAP, produits générés par
l’industrie locale, sont en partie mis en cause dans les malformations observées. En parallèle,
certains xéno-estrogènes (parabènes notamment) sont retrouvés dans les eaux de stations
d’épuration. D’autres produits chimiques comme les colorants textiles et alimentaires ont
également des activités endocriniennes. Dans le cadre de la surveillance de la qualité des
eaux, il est nécessaire de développer des tests rapides de détection de ces perturbateurs venant
complémenter les analyses chimiques. Certaines substances actives sur le système
endocrinien étant peu immunogènes, l’axe de recherche développé, dans le cadre de cette
thèse, porte sur un peptide affine pour détecter une myco-oestrogène, l’ochratoxine A.