THÈSE Aziza IBN HADJ HASSINE EVALUATION DE L`ACTIVITE
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THÈSE Aziza IBN HADJ HASSINE EVALUATION DE L`ACTIVITE
NNT : 2014 EMSE 0740 THÈSE présentée par Aziza IBN HADJ HASSINE pour obtenir le grade de Docteur de l’École Nationale Supérieure des Mines de Saint-Étienne Spécialité : Sciences et Génie de l’Environnement EVALUATION DE L’ACTIVITE OESTROGENIQUE DE CONTAMINANTS ET DEVELOPPEMENT D’UN BIO-RECEPTEUR D’AFFINITE POUR LA DETECTION D’UNE XENO-HORMONE soutenue à Alès, le 23 avril 2014 Membres du jury Président : Rapporteurs : Examinateur(s) : Directeur(s) de thèse : Loïc BLUM Professeur, Directeur de l'ICBMS, Université de Lyon I Jean-Louis MARTY Professeur, Université de Perpignan Via Domitia, Serge CHIRON Directeur de recherche, Université de Montpellier II Catherine GONZALEZ Professeur, Ecole des mines d’Alès Ingrid BAZIN Chargé de recherche, Ecole des mines d’Alès Jacques BOURGOIS Professeur Emérite, Ecole des Mines de SaintEtienne Remerciements Je tiens à remercier le Professeur Catherine Gonzalez, mon directeur de thèse, de m’avoir accueilli au sein de son équipe pour mon stage de master 2 et ensuite pour ma thèse. Vous avez été toujours présente lors des moments clefs de cette thèse. Merci de votre confiance et votre soutien tant sur le plan professionnel que personnel. Je tiens à exprimer ma sincère reconnaissance au Dr Ingrid Bazin, Chargé de recherche à l’Ecole des mines d’Alès, qui a également joué un rôle important pendant mon master et durant toute ma thèse. Je tiens à lui exprimer ma profonde gratitude pour sa disponibilité de chaque instant, pour son aide précieuse et ses conseils avisés durant les expérimentations et la rédaction de ce manuscrit. Merci Ingrid ! Je tiens à remercier également le Professeur Miguel Lopez-Ferber, Directeur du LGEI de l’Ecole des mines d’Alès, de m’avoir permis d’effectuer ma thèse au sein de son laboratoire. J’exprime mes sincères remerciements au Professeur Loïc Blum, Directeur de l'ICBMS, Université de Lyon I et au Professeur Jean-Louis Marty, Laboratoire IMAGES EA, Université de Perpignan Via Domitia, pour avoir accepté d’être rapporteurs de ce manuscrit et d’apporter un éclairage pertinent sur ce travail de recherche. Je souhaite également adresser mes remerciements à Mr Serge Chiron, Directeur de recherche, Laboratoire HSM, Université Montpellier II et à Mr Jacques Bourgois, Professeur Emérite, Centre SPIN-Département GSE, Ecole Nationale Supérieure des Mines de Saint Etienne, pour accepter de juger ce manuscrit et participer au jury de ma soutenance. Je remercie tout naturellement mes collègues de l’équipe EcoDiag qui m’ont aidé tout au long de cette thèse et sans qui ce travail ne serait pas ce qu’il est. Je remercie particulièrement Sylvie, Roro, Christine et Mumu. Je remercie également tous les autres collaborateurs avec qui j’ai pu travailler durant ma thèse ainsi que les membres du LGEI que je n’ai pu citer ici. A Andrey. Tu as été un super collègue et ami tout au long de ce travail de thèse. Chaque jour j’ai pu compter sur ton aide précieuse. Au moment où j’écris ces remerciements, je me remémore tous les moments qu’on a pu passer ensemble depuis l’été 2011. Je te souhaite plein de bonheur et de réussite pour la suite. A Andrey (toujours le même !), Romain, Imtiaz, Rita et Nibal que j’ai appris à connaître et à apprécier durant ces 3 années de thèse. Merci pour votre aide et votre soutien dans les moments de doute. Le travail au sein du laboratoire m’a permis de faire votre rencontre et je n’oublierai pas les bons moments que nous avons passé ensemble. A bientôt ! A mon Papou. Cette thèse c’est aussi la tienne. Depuis le début chaque jour, chaque instant tu as été là pour me soutenir. Tu as été là quand le doute s’installait et tu as toujours eu ton oreille attentive pour m’écouter te raconter les derniers résultats du jour. Je n’aurai jamais assez de ces quelques lignes dans ce manuscrit pour te remercier pour ton amour. Je crois savoir que tu es content que tout cela s’achève enfin. Table des matières Liste des figures....................................................................................................................................... iv Liste des Tableaux ....................................................................................................................................v Liste d’abréviations ................................................................................................................................. vi Introduction ......................................................................................................................................... 1 Chapitre I : Synthèse bibliographique ................................................................................................ 2 I. Contrôle de la qualité de l’eau et des rejets : micropolluants à activité endocrinienne et législation européenne............................................................................................................................................... 6 Mécanismes de la perturbation endocrinienne .............................................................................. 12 II. A. Fonctionnement du système hormonal ...................................................................................... 12 B. Récepteurs stéroïdiens sexuels .................................................................................................. 14 1) Organisation structurelle ....................................................................................................... 14 2) Récepteur aux oestrogènes : ER ............................................................................................ 16 3) Mécanismes d’action du récepteur aux oestrogènes.............................................................. 16 Définition des perturbateurs endocriniens : un débat d’actualité .............................................. 18 III. A. Mécanismes de la perturbation endocrinienne .......................................................................... 19 B. Xéno-hormones et récepteur aux oestrogènes ........................................................................... 21 C. Cas particulier : les xéno-estrogènes et le récepteur à la dioxine .............................................. 25 D. Action à faible dose et en mélange de perturbateurs endocriniens............................................ 29 Perturbateurs endocriniens : substances d’origines multiples ................................................... 31 IV. Hormones .................................................................................................................................. 32 A. 1) Hormones naturelles .............................................................................................................. 32 2) Hormones synthétiques ......................................................................................................... 33 Xéno-hormones d’origine naturelle ........................................................................................... 33 B. 1) Phyto-oestrogènes ................................................................................................................. 33 2) Myco-oestrogènes ................................................................................................................. 33 Xéno-hormones d’origine anthropique...................................................................................... 34 C. 1) Xéno-hormones d’origines industrielles................................................................................ 34 2) Produits de consommation courante et d’hygiène corporelle, les parabènes ........................ 37 V. Evaluation des altérations des écosystèmes en lien avec la présence des perturbateurs endocriniens........................................................................................................................................... 39 A. Effet sur les invertébrés ............................................................................................................. 39 B. Poissons/Amphibiens ................................................................................................................ 40 C. Effet sur les mammifères ........................................................................................................... 42 i Observations chez l’Homme ..................................................................................................... 43 D. VI. Perturbateurs endocriniens dans les effluents et les milieux aquatiques ............................... 44 A. Présences des parabènes ............................................................................................................ 45 B. Présence des mycotoxines ......................................................................................................... 46 C. Autres perturbateurs endocriniens ............................................................................................. 47 VII. Détection des perturbations endocriniennes et des xéno-hormones. ......................................... 48 Détection de la perturbation endocrinienne de contaminants et d’effluents.............................. 48 A. 1) Bioessais pour détecter la perturbation endocrinienne .......................................................... 48 a) Méthodes in vivo ................................................................................................................... 48 b) Méthodes in vitro................................................................................................................... 49 b.1. Tests de liaison au récepteur................................................................................................... 49 b.2 Tests de prolifération cellulaire. .............................................................................................. 49 b.3 Dosage de l’activité oestrogèno-mimétique; le Yeast Estrogen Screen (YES) et autres tests utilisant le gène rapporteur. ........................................................................................................... 50 2) Immunoessais pour détecter la perturbation endocrinienne .................................................. 52 Détection des xéno-hormones avérées ...................................................................................... 55 B. 1) Méthodes physico-chimiques ................................................................................................ 55 2) Bioessais, méthodes immunochimiques ................................................................................ 56 3) Détection de la perturbation oestrogénique dans l’environnement et les eaux usées via le Yeast Estrogen Screen (YES) ........................................................................................................ 58 Biocapteurs pour le suivi des PE dans l’environnement ........................................................... 61 C. 1) Définition............................................................................................................................... 61 2) Bio-récepteurs d’affinité........................................................................................................ 63 3) Bio-récepteurs métaboliques et cellulaires ............................................................................ 65 4) Application des biocapteurs pour le contrôle environnemental ............................................ 65 Chapitre II : Résultats et discussions ..................................................................................................... 69 I. Observation et détection des effets biologiques des xéno-oestrogènes ......................................... 70 A. Observation des effets biologiques sur les écosystèmes côtiers tunisiens : étude des déformations squelettiques chez Aphanius faciatus. ......................................................................... 71 B. Détermination de l’activité oestrogénique d’échantillons réels et de contaminants par le Yeast Estrogen Screen (YES) ...................................................................................................................... 84 1. Activité oestrogénique d’effluents de stations d’épuration du Sahel tunisien et présence de parabènes ............................................................................................................... 84 2. Activité oestrogéniques de colorants alimentaires dans le Yeast Estrogen Screen (YES) .......................................................................................................................................... 102 ii 3. II. Activité oestrogénique de colorants textiles dans le Yeast Estrogen Screen (YES) 110 Développement d’un nouveau bio-récepteur d’affinité pour la détection des xéno-oestrogènes 118 Conclusion générale et perspectives.................................................................................................... 126 Références bibliographiques ............................................................................................................... 131 iii Liste des figures Figure 1 : Système endocrinien chez l’homme ...................................................................................... 12 Figure 2 : Organisation structurelle des récepteurs stéroïdiens .......................................................... 15 Figure 3: Différentes voies de signalisation cellulaire du récepteur ER et de l’oestradiol. . ............... 17 Figure 4 : Modes d’action des perturbateurs endocriniens .................................................................. 20 Figure 5 : Activation illégitime du récepteur des oestrogènes ............................................................. 21 Figure 6 : Voies de signalisation des oestrogènes médiées par les récepteurs membranaires et nucléaires. ............................................................................................................................................. 25 Figure 7: Structure et mécanismes moléculaires du récepteur nucléaire AhR. .................................... 26 Figure 8 : Intéraction de la signalisation du récepteur AhR ................................................................ 27 Figure 9:Activation illégitime de la voie de signalisation du ER (récepteur des oestrogènes) par le récepteur de la dioxine activé AhR. ....................................................................................................... 28 Figure 10: Interaction de la signalisation des dioxines avec les oestrogénes. ..................................... 29 Figure 11 : Quelques exemples de xéno-hormones ............................................................................... 35 Figure 12 : Déformation de la colonne vertébrale chez des médakas âgés de 10 semaines................. 42 Figure 13 : Substances à action endocrinienne dans les eaux résiduaires d’une station d’épuration allemande .............................................................................................................................................. 47 Figure 14 : Principe du YES (Yeast Estrogen Screen) .......................................................................... 51 Figure 15 : Schéma présentant les 3 principes utilisés pour la technique ELISA ................................ 54 Figure 16 : Schéma du principe de fonctionnement d'un biocapteur .................................................... 61 Figure 17 : Représentation des différents types de bio-récepteurs ....................................................... 62 Figure 18 : Localisation géographique des sites d’échantillonnage .................................................... 72 Figure 19 : Niveau de pollution en métaux et en HAP au niveau des quatre sites étudiés. .................. 73 iv Liste des Tableaux Tableau 1 : Substances prioritaires de la DCE et leurs effets endocrinniens. ........................................ 9 Tableau 2 : Relation entre les hormones endocrines et les réponses correspondantes ....................... 13 Tableau 3 : Récepteurs des hormones stéroïdes ................................................................................... 15 Tableau 4 : Cibles des perturbateurs endocriniens ............................................................................. 20 Tableau 5 : Structures des trois catégories de ligands du récepteur aux oestrogènes humains. .......... 22 Tableau 6 : Classes de perturbateurs endocriniens. Archives des maladies professionnelles et de l’environnement .................................................................................................................................... 32 Tableau 7 : Sources de perturbateurs endocriniens entrant dans les eaux environnementales ........... 45 Tableau 8 : Comparaison des limites de détection, des valeurs de EC50 et des durées des essais pour les différents tests in vitro. ..................................................................................................................... 52 Tableau 9 : Techniques d'analyse utilisées pour la quantification des différentes classes de perturbateurs endocriniens dans l'environnement aquatique ............................................................... 55 Tableau 10 : Exemples de kits commerciaux. ....................................................................................... 57 Tableau 11 : Niveaux des EEQ trouvés dans différentes matrices environnementales analysées dans de nombreux pays en utilisant le test in vitro YES ..................................................................................... 60 Tableau 12 : Biocapteurs électrochimiques pour l'analyse environnementale. ................................... 63 Tableau 13 : Biocapteurs électrochimiques pour l'analyse environnementale. ................................... 66 Tableau 14 : Liste des polluants organiques analysés par les systèmes RIANA ou AWACSS .............. 68 Tableau 15 : Activité oestrogénique exprimée en équivalent oestradiol (EEQ) ................................... 87 Tableau 16 : Activité oestrogénique relative des cinq colorants alimentaires (1g/l). ......................... 103 v Liste d’abréviations Abs : anticorps AChE : Acétylcholinestérase Ags : antigènes AhR : récepteur de la dioxine et des hydrocarbures aromatiques AMPc : adénosine mono phosphate cyclique PAL : phosphatase alcaline AP : Alkylphénols APCI : Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique APE : Alkylphénols Polyéthoxylates AR : récepteurs des androgènes Arnt : Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator BaP : Benzo(a)pyrène BChE : Butyrylcholinesterase bHLH-PAS : Basic Helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim BLYES : Bioluminescent Yeast Assay BPA : bisphénol A BuP : butyl parabène BzP : benzyl parabène CEVAM : Centre européen pour la validation de méthodes alternatives CFC : chlorofluocarbones CIRC : Centre international de recherche sur le cancer CMR : Cancerigène, Mutagène, Reprotoxique CPRG : chlorophénol rouge-beta-D-galactopyranoside DAD : détection à barrette de diodes DBD : DNA Binding Domain DCE : Directive Cadre sur l’eau DDD : dichlorodiphényldichloroéthane 4,4’-DDE : 4,4'- Dichlorodiphényldichloroéthane DDT : 4,4'-(2,2,2-trichloroethane-1,1-diyl)bis(chlorobenzene) DES : diéthylstilbestrol DHEA : déhydroépiandrostérone DHT : dihydrotestostérone DON : déoxynivalénol DRE : éléments de réponse à la dioxine E1 : oestrone E102 : tartazine E127 : érytrosine B E2 : oestradiol E3 : oestriol E310 : propyl gallate EAP : éthoxylates d’alkylphénol EDSTAC : Agence de protection de l’environnement des USA EE2 : éthinylestradiol EEQ : Equivalent Estradiol EFSA : Autorité européenne de sécurité des aliments EGF : epidermal growth factor vi ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ENP : éthoxylates de nonylphénol EOP : éthoxylates d’octylphénol ER α, β et γ : récepteur aux oestrogènes α, β et γ ER-CALUX : Chemical-Activated LUciferase gene eXpression ceU bioassay system ERE : élément de réponse aux oestrogènes ESI : Ionisation Electrospray EtP : éthyl parabène FI-lA : Flow-injection immunoassay GC : chromatographie en phase gazeuse GFP : green fluorescent protein GR : récepteurs glucocorticoïdes HAP : hydrocarbures polyaromariques hER : récepteur humain des estrogène HRE : Hormone Receptor Element HRMS : spectrométrie de masse haute résolution IC : chromatographie ionique IGF-1 : insulin-like growth factor ITP : Inositol triphosphate IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry LBD : Ligand Binding Domain LC : chromatographie en phase liquide LH : hormone lutéinisante LOD : limite de détection LOQ : limite de quantification LYES : Lyticase assisted Yeast Estrogen Screen MAP kinase : Mitogen-activated protein kinase MeP : méthyl parabène MIP : Polymères à Empreinte Moléculaire MPA : medroxyprogesterone acetate MS : spectrométrie de masse MS/MS : spectrométrie de masse en tandem NLS : localisation nucléaire NP : nonylphénol NQE : normes de qualité environnementale OMS : Organisation Mondiale de la Santé OTA : ochratoxine A PAE : Esters de l’acide phtalique PBDE : Ethers diphényles polybromés PCB : polychlorobiphényles PCDD : Dibenzo-p dioxines polychlorées PCDF : Dibenzofuranes polychlorés PE : perturbateur endocrinien POP : polluants organiques persistants PPSP : produits pharmaceutiques et de soins personnels PR : récepteurs de la progestérone PrP : propyl parabène REACH : Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals vii RIA : Radioimmunoasay RNs : récepteurs nucléaires stéroïdiens RXR : récepteur X des rétinoïdes SERM : Selective Estrogen Receptor Modulator SPR : Surface plasmon résonance STEP : Station d'épuration des eaux usées T : testostérone TBBA :Tetrabromobisphénol A TBT : tributylétain ThR : récepteur de l'hormone de la thyroïde TIRF : Total internal reflection fluorescence microscope UV : ultra-violet Vg : vitellogénine XRE : éléments de réponse aux xénobiotiques YES : Yeast Estrogen Screen viii 1 Introduction Depuis plusieurs années, les préoccupations concernant les effets de la pollution, générée par les activités anthropiques, sur la santé humaine et animale s’immiscent de plus en plus au cœur des débats politiques et scientifiques. En particulier, la prise de conscience des autorités sanitaires, des gouvernements et du grand public, concernant la présence de substances environnementales susceptibles de perturber le système endocrinien n’a cessé de progresser depuis le début des années 1990. D’origine naturelle ou synthétique, les perturbateurs endocriniens (PE) peuvent altérer le fonctionnement du système hormonal des animaux et des Hommes. Ces substances pourraient donc induire des effets néfastes sur la santé d’un organisme, de sa descendance, ou d’une population, et constituer un danger sanitaire qui est encore aujourd’hui mal évalué. Même si les effets néfastes des PE sur la santé ne sont que soupçonnés, des programmes de recherche et des groupes de travail ont été mis en place afin d’évaluer l’étendue des problèmes relatifs aux PE, en vue de développer des stratégies de prévention et d’intervention. Ainsi, l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé) a chargé l’IPCS (International Programm on Chemical Safety) de préparer un rapport décrivant l’évaluation globale de la littérature scientifique sur les PE. L’US-EPA (Agence de Protection Américaine de l’Environnement) et l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economiques) ont également établi des programmes ayant comme objectifs : (i) d’accroître l’échange d’informations et la coordination des activités de recherche relatifs aux PE; (ii) d’élaborer et de réviser les lignes directrices pour les essais visant à détecter les PE; (iii) de développer des tests de criblage robustes, reproductibles et pertinents, capables de détecter les composés ayant une activité œstrogénique, anti-œstrogénique, androgénique ou antiandrogénique; (iv) et d’harmoniser les méthodes de caractérisation des dangers et des risques. De ces travaux sont issues les premières recommandations ("Guidelines") 407 de l’OCDE datant de 1995 qui portent sur l’étude des effets des diverses substances chimiques sur un modèle animal (rongeur). Cependant, ces tests ne sont toujours pas homologués pour détecter les effets des PE du fait de leur complexité d’actions (courbes dose-réponse spécifiques, impact des mélanges). De ce fait, surveiller les risques liés aux substances chimiques, en particulier les polluants qui provoquent des perturbations endocriniennes, est un des enjeux importants de la 1 mise en œuvre des réglementations. En témoigne le récent rapport de l'office parlementaire du sénat qui affirme que « Dans tous les cas, l'adoption de tests reconnus est un point fondamental. Il permettra de faire évoluer la législation européenne en la matière et de prendre pleinement en compte l'enjeu des perturbateurs endocriniens pour la santé et l'environnement par les agences compétentes. » (http://www.senat.fr/rap/r10-765/r1076519.html). Il est également recommandé de poursuivre la démarche d’investigation sur les effets des xéno-hormones à moyen et long terme. Aujourd'hui, le sujet des perturbateurs endocriniens reste largement focalisé sur les problèmes de reproduction, notamment chez certaines espèces de poissons, et les problèmes liés à certains cancers chez l’homme. Classiquement, un perturbateur endocrinien est « une substance exogène qui interfère avec la synthèse, la sécrétion, la libération, le transport, le métabolisme, la fixation, l’action ou l’élimination des hormones naturelles du corps responsables de l’homéostasie, de la reproduction et du développement ». Ces substances chimiques d'origine naturelle ou artificielle étrangères à l'organisme, pouvant interférer avec l’organisme, sont dits xéno-hormones. Parmi ces dernières, se retrouvent les xéno-estrogènes qui miment l’effet de l’oestradiol et qui peuvent se lier aux récepteurs cellulaires de la même façon que les oestrogènes. Ces xéno-estrogènes, de nature très variée, peuvent être d’origine naturelle (phyto-oestrogène, myco-estrogène) et d’origine anthropique (pesticides, produits d’origine industrielle, produits pharmaceutiques et de soin corporels,…). Ces substances ont des effets oestrogéniques démontrés via des tests in vitro et in vivo. Les tests in vitro sont basés sur des cellules de mammifères, des levures génétiquement transformées répondant spécifiquement à une perturbation oestrogénique. Les tests in vitro les plus utilisés sont l’E-screen (cellule MCF7 exprimant le récepteur alpha aux oestrogénes) et le Yeast Estrogen Screen (levure Saccharomyces cerevisiae transfectée avec le gène codant pour le récepteur humain aux œstrogènes). Cependant, un problème majeur, dans l'utilisation de ces tests in vitro pour analyser les échantillons environnementaux, est la présence de composés inhibiteurs/cytotoxiques. Ces échantillons sont, en effet, souvent contaminés par des substances autres que les xéno-estrogènes qui peuvent interférer avec la croissance et la viabilité des cellules animales. En revanche cette cytotoxicité est moindre pour les levures, ce qui leur confère une meilleure fiabilité pour le dosage de l’activité oestrogéno-mimétique des échantillons environnementaux (eaux usées, eaux de surface). 2 Concernant le dosage de l’activité oestrogénique par des tests in vivo, les modèles vivants utilisés sont principalement des rongeurs (poids des organes génitaux) et des poissons (taux de production de la protéine vitellogénine, biomarqueur de l’activité oestrogénique). Les essais in vivo présentent l’avantage de mesurer l’impact réel de la perturbation (effet additif, synergique, inhibiteur etc..) sur des organismes vivants. Ils permettent d’intégrer le métabolisme et donc d’étudier la dégradation d’un produit actif ou la transformation d’un produit inactif en produit actif. Deux types de tests in vivo existent pour mesurer une activité oestrogénique ou androgénique : le test utérotrophique chez la souris ou la rate et le test de Hershberger chez le rat. Concernant la préservation de la qualité des milieux aquatiques, la DCE (2000) a fixé un certain nombre de polluants (substances prioritaires) à surveiller en précisant des normes de qualité environnementales en fonction des masses d’eau. Cependant, la DCE ne prend pas en compte la mesure des effets potentiels des substances (notamment l’effet oestrogénique) même si ces substances sont classées CMR (Cancérogènes, Mutagènes et toxiques pour la Reproduction) et PBT (Persistantes, Bio-accumulables et Toxiques). La détection de ces substances prioritaires s’effectue classiquement par des méthodes d’analyse physico-chimique de laboratoire qui répondent aux exigences des seuils de qualité environnementale mais ne sont pas compatibles avec des systèmes de gestion et d’alerte sur site. Par contre, dans une optique d’anticipation de pollutions accidentelles ou de dégradation du milieu aquatique, des systèmes tels que les biocapteurs sont tout à fait pertinents et peuvent apporter des informations complémentaires aux mesures réalisées en laboratoire. Ces dernières années, les recherches portent sur le développement de biocapteurs pour l’analyse de polluants dans des matrices environnementales (triazines, isoproturon, DDT et ses dérivés, bisphénol A, nonylphénol,…). Ces biocapteurs associent un biorécepteur, espèce biologique permettant la reconnaissance sélective de la molécule cible, et un transducteur permettant de détecter et/ou de quantifier les substances dans les eaux (eaux potables, eaux de surface notamment). Dans ce contexte, ce travail de thèse aborde plusieurs approches permettant d’évaluer la perturbation oestrogénique (observation in vivo et mesure in vitro avec le YES) et de détecter des xéno-estrogènes spécifiquement (biorécepteur affine). Cette thèse s’articule autour de 3 volets d’étude : 3 ① Un premier volet porte sur l’investigation des effets des xéno-hormones sur les écosystèmes en identifiant, tout d’abord, l’impact des perturbateurs oestrogéniques sur les malformations squelettiques observées chez une espèce de poisson autochtone (aphanius faciatus) du Golfe de Gabes (Tunisie). Parallèlement, les principaux polluants chimiques (métaux, HAP) liés potentiellement à cette perturbation ont été recherchés afin de corréler leur présence aux activités anthropiques (urbaines, agricoles et industrielles) présentes sur le site étudié. ② Un deuxième volet se focalise sur la quantification par HPLC de parabènes, xénooestrogènes connus, soupçonnés de provoquer certains cancers, et sur l’évaluation de leurs effets en utilisant le Yeast Estrogen Screen (YES). Le YES permet d’évaluer l’activité oestrogénique des matrices complexes comme les effluents de station d’épuration. La distribution des parabènes entre différents compartiments/fractions (eau, boues, MES) et l’activité oestrogénique au niveau de stations d'épuration tunisiennes ont été analysées en combinant des évaluations chimiques et biologiques. Dans l’optique de mettre en évidence les effets oestrogéniques de substances d’origines industrielles, d’autres composés (colorants textiles et alimentaires) ont été testés en utilisant le YES. En effet, ces colorants sont susceptibles d’être présents dans des effluents industriels et peuvent impacter le milieu récepteur, notamment pour les pays où l’industrie textile est fortement développée (Pays du Maghreb, Inde,…). ③ Enfin, la dernière partie du manuscrit est consacrée à la mise au point d’un outil bio-analytique de substance spécifique. Cette partie est novatrice car elle porte sur le développement d’un bio-récepteur de nature peptidique pour détecter des myco-oestrogènes, comme l’ochratoxine A. Cette mycotoxine étant difficilement immunogène, il n’existe que de rare anticorps spécifiquement dirigés contre cette molécule. Les (bio)récepteurs alternatifs développés jusqu’à présent sont des aptamères ADN et des MIP (polymère à empreinte moléculaire) qui ont une affinité pour la mycotoxine. Ce manuscrit est classiquement structuré et comprend : - Un premier chapitre présentant une synthèse bibliographique qui décrit les mécanismes de la perturbation endocrinienne, les perturbateurs endocriniens (xéno-hormones d’origine naturelle et anthropique), l’état de l’art sur les altérations des écosystèmes dues aux 4 PE et les différentes méthodes de détection des effets et des xéno-hormones (effets oestrogéniques, biocapteurs). Un focus sur les parabènes, les mycotoxines et les colorants permet d’établir un constat sur leur présence dans les eaux. - Un second chapitre basé sur 5 publications ouvre sur une discussion à partir des principaux résultats concernant la mesure des effets oestrogéniques in vivo et in vitro et le développement d’un biorécepteur affine pour l’ochratoxine A. Par conséquent, la partie « matériel et méthodes » est incluse dans chacun des articles. - Une conclusion met en valeur les résultats majeurs et aborde les perspectives de ce travail de thèse. 5 1 Chapitre I : Synthèse bibliographique 2 5 I. Contrôle de la qualité de l’eau et des rejets : micropolluants à activité endocrinienne et législation européenne. Il est généralement admis qu’un polluant est «un altéragène (c'est-à-dire un composé étranger aux cycles vitaux des organismes ou xénobiotiques) biologique, physique ou chimique, qui au-delà d'un certain seuil, et parfois dans certaines conditions (potentialisation), développe des impacts négatifs sur tout ou partie d'un écosystème ou de l'Environnement en général» (AFNOR). On parlera de micropolluants lorsque ces substances sont retrouvées à des concentrations de l’ordre du microgramme par litre, pouvant diffuser au sein de différents compartiments des écosystèmes et impacter les organismes vivants même à de faibles teneurs. Les polluants chimiques peuvent se diviser en 2 groupes : - Les polluants organiques comme les pesticides (organochlorés tel que le DDT), les polychlorobiphényles (PCB), les hydrocarbures polyaromatiques (HAP), les dioxines et furannes, les chlorofluocarbones (CFC) et les phtalates. - Les polluants inorganiques comme les métaux. Les plus fréquemment rencontrés dans l’environnement sont le cadmium, l’arsenic, le cuivre, le plomb etc… Les micropolluants présents dans l’eau correspondent à une multitude de composés dont les effets sur les organismes vivants peuvent être toxiques à de très faibles concentrations (inférieures ou de l’ordre du microgramme par litre). La contamination des eaux de surface par ces polluants est due essentiellement à des rejets directs (égouts non raccordés à un système d’épuration, par exemple), à un dysfonctionnement des stations d’épuration, à des rejets industriels ou au ruissellement de l’eau sur des surfaces contaminées. Les eaux souterraines sont, quant à elles, potentiellement contaminées suite à l’infiltration des micropolluants dans le sol et le sous-sol. On distingue les apports ponctuels où les sources de pollution sont clairement identifiées (rejets industriels, pollution accidentelle, rejets des eaux usées domestiques), des sources diffuses liées principalement aux activités agricoles, touristiques et aux retombées atmosphériques. Les effets des micropolluants sur les écosystèmes aquatiques sont très variables, car ils ne dépendent pas uniquement du niveau de concentration dans l’eau, mais également d’autres caractéristiques, comme par exemple, le mode de pénétration dans les organismes, leurs actions sur des systèmes physiologiques etc… 6 Pour protéger les ressources (eau de surface ou eau souterraine), des actions ont été engagées au travers de la loi sur l’eau du 3 Janvier 1992 (LOI n° 92-3 du 3 janvier 1992 sur l'eau, JORF n°3 du 4 janvier 1992 page 187 http://www.legifrance.gouv.fr) puis plus récemment, la Directive Cadre sur l’eau (DCE) a été élargie à l’échelle européenne un cadre réglementaire pour assurer la préservation des écosystèmes aquatiques et le maintien de la qualité des eaux (2000/60/CE du 23 octobre 2000). Ces différentes actions ciblant au départ une réduction des flux de polluants organiques ont été étendues à la réduction des rejets de substances toxiques et à la limitation d’émission des micropolluants comme les pesticides ou des macropolluants tels que le phosphore ou l’azote jusqu’à aboutir à la DCE établissant un cadre pour atteindre un bon état des eaux en 2015. Ce cadre vise également une réduction progressive des rejets et des émissions de substances prioritaires jusqu’à une suppression de ces substances d’ici 2021. Cette directive établit des normes de qualité environnementale (NQE) et limite la concentration de trente-trois substances et de huit autres polluants dans les eaux de surface (tableau 1). Cette liste comprend onze substances dangereuses prioritaires, qui sont toxiques, persistantes et qui s’accumulent dans les tissus animaux et végétaux. Ces substances présentent un risque à long terme, il s’agit plus particulièrement des métaux lourds, des pesticides et des hydrocarbures. Cependant, la DCE ne prend pas encore en compte l’effet de ces substances prioritaires sur les écosystèmes et les humains notamment la perturbation endocrinienne. En effet, la perturbation endocrinienne correspond à l’altération de la fonction endocrine par un agent exogène qui interfère avec la production, le métabolisme, le transport, la libération, la liaison, l’action ou l’élimination des ligands naturels responsables du maintien de l’homéostasie et de la régulation du développement de l’organisme. Or, comme présenté tableau 1, certaines substances prioritaires, déjà soumises à des interdictions ou prises en compte dans des réglementations européennes via la législation sur les pesticides, via la Directive Cadre et via la législation REACH (en référence à leur caractère CMR : Cancerigène, Mutagène, Reprotoxique), ont potentiellement des effets sur le système endocrinien. De ce fait, dans le cadre de la «Stratégie communautaire concernant les perturbateurs endocriniens», la Commission Européenne a constitué une liste de 60 substances prioritaires parmi plus de 550 suspectées de perturber le système endocrinien. De la même façon, 21 substances sur les 33 notifiées par la DCE ont été identifiées comme perturbateurs endocriniens potentiels (tableau 1). Mais la question de l’évaluation de l’impact des polluants ayant des effets perturbateurs endocriniens dans l’environnement est soulevée 7 dans le cadre des réglementations récentes. En effet, lors de la Conférence environnementale de 2012, le gouvernement français s’est engagé à élaborer une stratégie nationale sur les perturbateurs endocriniens et le Parlement Européen « envisage la mise en œuvre d’une nouvelle législation au plus tard en Juin 2015 afin de réexaminer de manière approfondie les règles actuelles relatives aux perturbateurs endocriniens » (Résolution du Parlement européen du 14 mars 2013 sur la protection de la santé publique contre les perturbateurs endocriniens (2012/2066(INI)), http://www.europarl.europa.eu ). Des études complémentaires sont actuellement en cours pour permettre à la Commission d’étudier la prise en compte de ces composés dans les futures règlementations. 8 Tableau 1 : Substances prioritaires de la DCE et leurs effets endocrinniens. N°UE (1) N°UE DCE (2) Nom de la substance Effet perturbateur endocrinien Référence Alachlore N°CAS (Chermical Abstracts Service) 15972-60-8 1 Liaison compétitive aux récepteurs d'oestrogènes et de la progestérone. Interactions avec le récepteur cellulaire pregnane X, interférant avec la production des enzymes responsables du métabolisme des hormones stéroïdes Mikamo et al., 2003 Cocco et al., 2002 3 2 Anthracène 120-12-7 Liaison avec le récepteur des oestrogènes Schneider et al., 1976 Pasqualini et al., 1990 131 3 Atrazine 1912-24-9 L'inhibition des androgènes avec un faible effet oestrogénique. Perturbation du contrôle hypothalamique au niveau d'hormones et de la prolactine. Induction de l'activité de l'aromatase Dommages au niveau des glandes surrénales dommages et réduction du métabolisme des stéroïdes. Cocco et al., 2002 Cooper et al., 2000 Hayes et al., 2003 7 4 Benzène 71-43-2 5 Pentabromodiphényéther 32534-81-9 Altérations du fonctionnement du système thyroïdien Petrović et al., 2001 6 Cadmium et ses composés 7440-43-9 Le cadmium est un puissant oestrogène et androgène in vivo et in vitro, il interagit directement avec les récepteurs des oestrogènes et des androgènes Takiguchi et al., 2005 7 C 10-13-chloroalcanes 85535-84-8 8 9 Chlorfenviraphos Chlorpyrifos 470-90-6 2921-88-2 Faible effet oestrogénique Activité antagoniste aux androgènes. Vinggaard et al., 1999 Kang et al., 2004 10 11 101-06-2 75-09-2 _ I 17-81-7 Induction des niveaux sériques de la testostérone Ge et al., 2007 13 1,2-dichluroéthane Dichlorométhane Di(2-éthylhexyl)phtalate (DEHP). Diuron 330-54-1 Activité inhibitrice des androgènes Thibaut et al., 2004 14 Endosulfan 115-29-7 Liaison compétitive aux récepteurs d'androgènes, activité oestrogénique, stimulation de la production du récepteur des oestrogènes, inhibition de l'activité de l'aromatase Andersen et al., 2002 Lemaire et al., 2004 35 Fluoranthène 206-44-0 Agoniste du récepteur des oestrogènes Plíšková et al., 2005 Vondráček et al., 2002 83 16 Hexachlorobenzène 118-74-1 Altération du récepteur des oestrogènes et du Src/HER1 Peña et al., 2012 84 17 Hexachlorobutadiene 87-68-3 Néphrotoxique Green et al., 2003 85 18 Hexachlorocyclohexane 008-73-1 Réduction du cycle œstral et des concentrations de progestérone. Augmentation des concentrations sériques d'insuline et d'oestradiol, diminution des concentrations de thyroxine. Liaison compétitive aux récepteurs aux androgènes, oestrogènes et progestérone. Rawlings et al., 1998 Beard et al., 1999 12 59 62 76 9 N°UE (1) 92 N°UE DCE (2) 19 Isoproturon N°CAS (Chermical Abstracts Service) 34123-59-6 Activation du récepteur cellulaire Pregnane X Lemaire et al., 2006 20 21 Plomb et ses composés Mercure et ses composés Naphthalène 7439-92,-1 7439-97-6 91-20-3 Interfère avec la spermatogenèse et influence les niveaux des hormones reproductives physiologiques Iavicoli et al., 2009 Iavicoli et al., 2009 23 Nickel et ses composés 7440-02-0 Erα agoniste Darbre, 2006 Nonylphénols 25154-52-3 Activation du récepteur cellulaire Pregnane X Masuyama et al., 2000 Octylphénol Pentachlorobenzène Pentachlorophénol 1806-26-4 608-93-5 87-86-5 Xéno-oestrogène Inhibe la production des hormones thyroïdes Faible activité estrogénique et anti-androgénique Oehlmann et al., 2000 Cocco et al., 2002 Cocco et al., 2002 Benzo(a)pyrène 50-32-S Changements dans l'expression des gènes stéroïdogènes des testicules chez les rats à divers stades de développement Liang et al., 2012 Benzo(b)fluoranthène 205-99-2 AhR agoniste Kummer et al., 2001 Benzo(g,h,i)pérylène Indéno(1,2,3-cd)pyrène 207-08-9 191-24-2 193-39-5 Simazine Composés du tributylétain Trichlorobenzènes (tous les isomeres) Trichlorométhane 121-34-9 M-73-3 Induction de l'activité de l'aromatase et augmentation de la production des oestrogènes Inhibe de façon compétitive la conversion des androgènes en oestrogènes. Inhibe la production de certains androgènes Sanderson et al., 2000 Thibaut et al., 2004 Trifluraline 1582-09-8 Interagit avec le récepteur cellulaire de pregnane X, interférant avec la production d'enzymes responsables du métabolisme des hormones stéroïdes. Eriko et al., 2003 96 24 101 106 25 26 27 29 30 117 118 31 23 32 124 33 46 1 1 2 71 3 77 4 130 5 Nom de la substance Effet perturbateur endocrinien Référence 1200248-1 47.66-3 DDT total Sans objet p-p’-DDT 50-29-3 Aldrine 309-00-2 Dieldrine 60-57-1 Endrine 72-20-8 Isodrine 465-73-6 Imite l'action des oestrogènes, antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en inhibant la transcription génétique qu'ils induisent. Favorise la prolifération des cellules sensibles aux androgènes. Imite les actions des oestrogènes indirectement en stimulant la production de leurs récepteurs Antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en inhibant la transcription génétique qu'ils induisent Antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en inhibant la transcription génétique qu'ils induisent Imite les actions des oestrogènes indirectement en stimulant la production de leurs récepteurs Antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en inhibant la transcription génétique qu'ils induisent 10 McKinlay et al., 2008 Lemaire et al., 2004 Lemaire et al., 2004 Lemaire et al., 2004 N°UE (1) N°UE DCE (2) 13 111 6 7 121 8 Nom de la substance Tétrachlorure de carbone Tétrachloroéthylène Trichloréthylène N°CAS (Chermical Abstracts Service) 56-23-5 Effet perturbateur endocrinien Référence Perturbateur endocrinien non listé INERIS 127-18-4 79-01-6 (1) N° UE : nombre mentionné correspondant au classement par ordre alphabétique issu de la communication de la Commission européenne au Conseil du 22 juin 1982. (2) N ° UE DCE : nombre mentionné corresponantd au classement issu de l'annexe X de la DCE 11 Pour mieux comprendre les enjeux qui résident dans l’établissement de critères scientifiques permettant d’identifier les substances dites « perturbateur endocrinien » en vue de leur éventuelle interdiction, il convient d’expliquer succinctement le fonctionnement du système hormonal. II. Mécanismes de la perturbation endocrinienne A. Fonctionnement du système hormonal Les animaux pluricellulaires possèdent deux mécanismes de coordination des activités des tissus et des organes : la communication nerveuse et la communication hormonale. La première sert à coordonner les mouvements grâce à la propagation de signaux électriques entre cellules nerveuses, la seconde, par un transfert de signaux chimiques, permet de réguler l'activité d'un ou plusieurs organes ou organismes en modifiant le comportement et les interactions. Figure 1 : Système endocrinien chez l’homme Ces substances chimiques « médiatrices » dites hormones sont sécrétées par les glandes endocrines et sont transportées par le système de circulation générale (le sang) pour exercer une action spécifique sur des cellules cibles. Les glandes endocrines (figure 1), telles que la thyroïde, les gonades, l’hypophyse, les surrénales, le pancréas endocrine, sécrètent des hormones comme la thyroxine, l’oestrogène et la testostérone, l’adrénaline, l’insuline. Ces substances sont des messagers chimiques qui, en se liant à des récepteurs avec une grande affinité, vont induire des réactions spécifiques et réguler la croissance, le métabolisme, le 12 comportement et le développement, incluant le développement sexuel et la reproduction. Le tableau 2 présente les différentes fonctions nécessitant des hormones pour développer des actions vitales pour l'organisme. Tableau 2 : Relation entre les hormones endocrines et les réponses correspondantes (Ministère de l’Ecologie et du Développement Durable, Décembre 2003) Fonctions Reproduction Hormones Androgènes, oestrogènes, progestérone, hormones hypophysaires (LH, FSH, prolactine). Croissance et développement Hormones de croissance, hormones thyroïdiennes, insuline, glucocorticoïde, androgènes, oestrogènes, progestérone. Vasopressine aldostérone, hormone parathyroïdienne progestérone. Maintien de l'environnement interne Disponibilité énergétique Insuline, glucagon, hormones thyroïdiennes. Réponses Production de gamètes, facteurs de croissance, lactation, gestation. Instauration des caractéristiques secondaires et du comportement sexuel. Large action sur la croissance. Contrôle du volume et de la pression. Contrôle de la balance des électrolytes. Contrôle des os, des muscles et de la graisse. Régulation du métabolisme. Les organes effecteurs, organes cibles de l’activité hormonale, possèdent, au niveau de leur cellule, des molécules fixant l’hormone (récepteurs spécifiques de l’hormone). Les cellules possèdent différents récepteurs et peuvent donc reconnaître plusieurs types d’hormone. Ces récepteurs peuvent être présents sur la membrane d'une cellule (récepteurs membranaires). C'est le cas des récepteurs d'hormones peptidiques qui sont souvent des protéines transmembranaires de type récepteurs couplés aux protéines G, récepteurs sensoriels ou récepteurs ionotropes. Ces récepteurs peuvent produire trois types de réponse cellulaire : a- une réponse électrophysiologique correspondant aux récepteurs canaux-ioniques, b- une réponse métabolique responsable de modifications post-traductionnelles des protéines, c- une réponse transcriptionnelle activant ou inhibant l'expression de certains gènes. 13 Généralement ces types de réponse se traduisent par la production d'un ou plusieurs intermédiaires intracellulaires dits messagers secondaires comme l’adénosine monophosphate cyclique ou AMP cyclique (AMPc) ou par l’intermédiaire de cascades de phosphorylations. Les récepteurs peuvent être des récepteurs nucléaires intervenant dans la modulation de la transcription des gènes impliqués dans la prolifération, la différenciation cellulaire, le développement, l’homéostasie et le métabolisme (Gronemeyer et al 2004). Ce sont des protéines solubles activées par la liaison de la molécule informative. Ils sont normalement localisés dans le noyau. Mais il existe des exceptions comme pour les récepteurs stéroïdiens (récepteurs des glucocorticoïdes, des oestrogènes ou des androgènes) qui sont situés dans le cytosol en absence de ligand et la liaison de ce dernier induit la translocation du récepteur dans le noyau. B. Récepteurs stéroïdiens sexuels 1) Organisation structurelle Les stéroïdes participent au développement des vertébrés et à l’accomplissement de plusieurs fonctions physiologiques. Les récepteurs des hormones stéroïdiennes sont des récepteurs nucléaires et sont constitués de trois sections formant les principales régions du récepteur thyroïdien comme illustré figure 2 (Bain et al., 2007) : - La région N-terminal (A-B) comprend 20 acides aminés pour le récepteur de la vitamine D et 600 acides aminés pour celui des minéralo-corticoïdes. Cette région contient un activateur de la transcription AF1 (Activation Function) agissant de façon constitutive indépendamment du ligand. - La région C, domaine de liaison à l’ADN, dit le DBD (DNA Binding Domain), comprend 8 cystéines en position stable qui permettent la formation de deux structures en « doigts de zinc ». Ce domaine est essentiel à l'activation de la transcription. La fixation du ligand entraîne un changement dans la configuration du récepteur permettant la liaison à une séquence HRE (Hormone Receptor Element) sur le gène cible. La spécificité de liaison du récepteur à son HRE est déterminée par le premier domaine protéique en « doigt de zinc ». Le second domaine en « doigt de zinc » permet la dimérisation du récepteur. - La région D, située entre le domaine de liaison à l’ADN et la région E, correspond au domaine de fixation de l'hormone, et permet le contrôle du transit du récepteur à partir du 14 cytoplasme où il est synthétisé, vers le noyau. Cette région est également un site de rotation permettant des modifications spatiales. - La région E/F, domaine de liaison à l'hormone, le LBD (Ligand Binding Domain) est située à l'extrémité carbonylée du récepteur. Cette région permet, outre la liaison à l'hormone, la dimérisation des récepteurs et l'activation de la transcription par une zone fonctionnelle appelée AF2. C'est aussi l'endroit de liaison aux protéines chaperonnes. Contrairement à AF1, l'activité de l’AF2 dépend totalement de la fixation de l'hormone au récepteur (Drummond 2006). Figure 2 : Organisation structurelle des récepteurs stéroïdiens Les récepteurs stéroïdiens sont divisés en trois groupes (tableau 3) en fonction des hormones qui se lient comme les oestrogènes, la progestérone, la testostérone, les glucocorticoïdes et les minéralo-corticoïdes. Tableau 3 : Récepteurs des hormones stéroïdes Sous Famille : Récepteur des hormones stéroïdes 1- Récepteur des oestrogènes-α (ERα; NR3A1) Groupe A : Récepteur des oestrogènes (hormone sexuelle : oestrogènes) 2- Récepteur des oestrogènes-β (ERβ; NR3A2) Groupe B : récepteur liés aux récepteurs des oestrogènes Groupe C : Récepteurs des 3-ketostéroïdes 1- Récepteur liés aux récepteurs des oestrogènes-α (ERRα; NR3B1) 2- Récepteur liés aux récepteurs des oestrogènes-β (ERRβ; NR3B2) 3- Récepteur liés aux récepteurs des oestrogènes-γ (ERRγ; NR3B3) 1- Récepteur des glucocorticoïdes (GR; NR3C1) (Cortisol) 2- Récepteur des minéralocorticoïdes (MR; NR3C2) (Aldostérone) 3- Récepteur de la progestérone (PR; NR3C3) (hormone sexuelle : Progestérone) 4- Récepteur des androgènes (AR; NR3C4) (hormone sexuelle : Testostérone 15 2) Récepteur aux oestrogènes : ER Le récepteur aux oestrogènes (ER) est un membre de la famille des récepteurs nucléaires dont la fonction, médiée par l’oestradiol, est l’activation de la transcription de gènes impliqués notamment dans la croissance, la différenciation cellulaire et les fonctions reproductrices. Il existe trois formes de récepteur aux oestrogènes : ERα, ERβ et ERγ (ou ERβa). Les isotypes α et β sont retrouvés chez toutes les espèces alors que l’isotype γ n’a été identifié que chez certaines espèces de poissons (Hawkins et al., 2000; Ma et al., 2000; Menuet et al., 2002). Afin d’assurer sa fonction de facteur de transcription, le récepteur aux oestrogènes, une fois traduit dans le cytoplasme, doit se diriger vers le noyau. Celui-ci met en jeu les importines (transporteurs) présentes au sein des pores nucléaires qui reconnaissent les signaux de localisation nucléaire (NLS : Nuclear Localization Signal) portés par le récepteur. Jusqu’au début des années 1980, le modèle classique d’action des récepteurs aux hormones stéroïdiennes proposait que les récepteurs étaient exclusivement cytoplasmiques en l’absence de ligand et n’étaient dirigés vers le noyau qu’en présence de celui-ci (Jensen et al., 1968). Il est clair aujourd’hui que l’isotype α du récepteur aux oestrogènes est nucléaire et cette localisation est indépendante de la présence de l’hormone (Stenoien et al., 2000 a et b). 3) Mécanismes d’action du récepteur aux oestrogènes Les récepteurs aux oestrogènes peuvent agir selon deux mécanismes différents. Le premier permet de réguler la transcription des gènes cibles par le biais de la fixation du récepteur intracellulaire à son élément de réponse aux oestrogènes (ERE) au sein du promoteur de gènes cibles ou par des interactions protéine-protéine; ce mécanisme est communément appelé mécanisme génomique. Il existe 3 voies de signalisation génomique (figure 3) : 1- La voie classique ou ERE-dépendant (voie1), 2- La voie ERE-indépendante (voies 2 et 3), 3- La voie ligand-indépendante (voie 4). Comme présenté figure 3, pour la signalisation classique (voie 1), le récepteur ER liganté à l’oestradiol (E2) se lie sous forme dimérique à une séquence spécifique dite ERE. Dès lors, des coactivateurs sont recrutés ainsi que la machinerie transcriptionnelle et le tout aboutit alors à l’activation de la transcription du gène cible. Concernant les voies ERE- 16 indépendantes (voies 2 et 3, figure 3), le complexe ER-E2 peut induire la transcription des gènes cibles en se liant directement à des protéines spécifiques Sp1 ou AP-1 (formé des protéines c-Fos et c-Jun) liées respectivement à des domaines nucléotidiques riches en glutamine ou TRE (TPA (12-Otetradecanoylphorbol 13-acetate) Response Element) (Krishnan et al., 2010). La troisième voie de signalisation génomique est ligand-indépendant (voie 4, figure 3). Cette activation est produite principalement par des facteurs de croissance comme l’EGF (Epidermal Growth Factor) et l’IGF-1 (Insulin-like Growth Factor). Ceux-ci phosphorylent le récepteur des oestrogènes au résidu de sérine 118 par l’intermédiaire de la MAP kinase. Le récepteur interagit avec le coactivateur p68 RNA hélicase et active la transcription du gène en interagissant avec l’ERE (Flint et al., 2002; Moore et Faller 2013; Koterba et Rowan 2006; Kallen et al., 2004). Le second mécanisme est non-génomique. Les stéroïdes, agissant par l’intermédiaire de récepteurs membranaires, entraînent une cascade de réactions dont des phosphorylations et modulent des fonctions physiologiques rapides telles que la régulation du flux calcique. 4 Figure 3: Différentes voies de signalisation cellulaire du récepteur ER et de l’oestradiol. Il existe trois voies de signalisation génomique: Voie 1 : La voie classique ou ERE-dépendant, Voies 2 et 3 : voies ERE-indépendante, Voie 4 : voie ligand-indépendante. Il y a une voie de signalisation non-génomique (Le Grand, thèse de doctorat 2009). 17 III. Définition des perturbateurs endocriniens : un débat d’actualité Ce terme est apparu dans la littérature scientifique depuis 1993 (Colborn et al., 1993). Pourtant la définition des «perturbateurs endocriniens» ou PE n’est toujours pas arrêtée et fait encore débat (Sénat français, juillet 2011). Une première définition a été proposée par Kavlock et al., (Kavlock et al., 1996 ) : «Un perturbateur endocrinien est une substance exogène qui interfère avec la synthèse, la sécrétion, la libération, le transport, le métabolisme, la fixation, l’action ou l’élimination des hormones naturelles du corps responsables de l’homéostasie, de la reproduction et du développement». Un perturbateur endocrinien (PE) est défini en 1998 par l’Agence de protection de l’environnement des USA (EDSTAC, 1998) comme un agent exogène (substance chimique d’origine naturelle ou artificielle) ou un mélange de substances exogènes qui agissent sur le système endocrinien et qui ont des effets néfastes au niveau d’un organisme intact, de sa progéniture et/ou des (sous)-populations. Au cours du congrès européen sur les perturbateurs endocriniens (European Commission, 1997), une autre définition a été proposée : «un perturbateur endocrinien est une substance exogène qui provoque des effets néfastes sur un organisme sain ou sa progéniture dus à une modification des fonctions endocrines». Quoi qu’il en soit, identifier un perturbateur endocrinien revient donc à identifier une molécule pouvant être reliée à une activité hormonale; si elle se lie au récepteur ou si elle modifie l’action de certaines hormones, elle peut être considérée comme un perturbateur endocrinien. Mais pour certaines substances, ayant une activité plus ou moins importante sur le système endocrinien, l’EFSA (Autorité européenne de sécurité des aliments) a proposé de distinguer deux groupes de molécules : celles qui produisent des effets délétères et celles qui suscitent une réponse de l’organisme non problématique ou encore qui produisent des effets adaptatifs (Sénat français, 12 juillet 2011). Cette définition revient à adopter celle établie par l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé) en 2002 qui définit les perturbateurs endocriniens comme étant des «substances chimiques d'origine naturelle ou artificielle étrangères à l'organisme qui peuvent interférer avec le fonctionnement du système endocrinien et induire ainsi des effets délétères sur cet organisme ou sur ses descendants» (Sénat français, 12 juillet 2011). De ce fait, une xéno-hormone (ou speudo-hormone) n’est pas une hormone véritable, mais est une substance naturelle ou synthétique qui se comporte comme une hormone. Les 18 xéno-estrogènes sont des substances qui «miment» l’oestradiol, hormone naturelle, et qui peuvent se lier aux récepteurs cellulaires de la même façon que les oestrogènes. A. Mécanismes de la perturbation endocrinienne De nombreuses molécules de l’environnement ont la capacité de modifier le fonctionnement du système endocrinien. Étant donnée la diversité des fonctions physiologiques impliquant le système endocrinien, les mécanismes par lesquels ces substances peuvent perturber le système endocrinien sont complexes. En effet, les perturbateurs endocriniens (PE) peuvent agir sur le système endocrinien en interférant à plusieurs niveaux : synthèse, stockage et libération des hormones, transport, métabolisme, ou encore liaison avec les récepteurs nucléaires constituant les cibles naturelles des hormones. Les perturbateurs endocriniens peuvent interférer avec le fonctionnement du système hormonal de différentes façons (figure 4) : a. Ils peuvent imiter l’action d’une hormone naturelle. Ils se fixent alors sur le récepteur cellulaire et entraînent une réponse normale : effet agoniste. b. Ils peuvent se lier au récepteur hormonal et empêcher l’émission d’un signal. Ils entravent alors l’action des hormones : effet antagoniste. Le plus souvent, ces mécanismes d’action des PE résultent d’une combinaison des deux mécanismes agoniste et antagoniste. Les autres modes d'action des PE peuvent être de perturber la synthèse, le transport, le métabolisme et la sécrétion des hormones, altérant ainsi les concentrations des hormones naturelles dans l'organisme. 19 Figure 4 : Modes d’action des perturbateurs endocriniens ; Pol II pour ARN Polymérase II En conséquence, la classification des perturbateurs endocriniens a été effectuée en fonction de leur activité connue ou soupçonnée par rapport aux récepteurs hormonaux, et des mécanismes de perturbation car leurs cibles sont multiples comme l’indique le tableau 4. Il est, en effet, difficile voire impossible de classer les PE en fonction de leur structure chimique. Tableau 4 : Cibles des perturbateurs endocriniens (sénat francais, rapport 12 Juillet 2011) 20 B. Xéno-hormones et récepteur aux oestrogènes a. Interaction directe avec les récepteurs hormonaux nucléaires : Action génomique des perturbateurs endocriniens Le mécanisme d’action génomique le plus connu est la liaison du perturbateur endocrinien aux récepteurs nucléaires stéroïdiens (RNs) tel un imposteur (xéno-hormone), modifiant l’expression des gènes comme facteurs de transcription. Après fixation des xéno-hormones, les RNs exercent leurs activités génomiques en tant que facteurs de transcription qui reconnaissent des séquences ADN spécifiques, au niveau de promoteurs de leurs gènes cibles, en activant (effet agoniste) ou en inhibant (effet antagoniste) illégitimement l’expression des gènes. Parmi ces récepteurs stéroïdiens la majeure partie des PE décrits sont les molécules ayant des effets oestrogéniques et sont capables de mimer l’effet biologique du 17 β œstradiol et de cibler les récepteurs aux oestrogènes (ER) (Wilson et al., 2007; Le et al., 2003). Les xéno-oestrogènes peuvent aussi illégitimement activer le récepteur nucléaire des oestrogènes. Ils agissent comme l’oestradiol, par une voie classique qui suppose la dimérisation du récepteur alpha (ERα) ou du récepteur béta (ERβ), les deux isoformes du récepteur aux oestrogènes. Ce dimère reconnait les éléments de réponse localisés sur les promoteurs de gènes cibles (figure 5) et induit leur transcription. Figure 5 : Activation illégitime du récepteur des oestrogènes (d’après Massaad et Barouki, 1999) (RE : récepteur des oestrogènes; ERE : Elément de réponse aux oestrogènes) 21 Les xéno-hormones peuvent être agonistes, antagonistes ou agoniste/antagoniste. En réalité, leur mécanisme d‘action est mieux compris s’il est comparé à celui d’agents pharmacologiques appelés SERM (Selective Estrogen Receptor Modulator) comme le 4hydroxythamoxifène ou encore l’éthinyloestradiol présentés tableau 5. D’autres molécules sont des antagonistes pures comme L’ICI 182.780 et l’ICI 164.384 (Wakeling et al., 1991; Zhu et al., 2008), ou présentent les deux modes d’action pour le récepteur aux oestrogènes comme le 4-hydroxythamoxifène. Tableau 5 : Structures des trois catégories de ligands du récepteur aux oestrogènes humains. Agonistes purs naturels 17β-Estradiol synthétiques Ethynylestradiol Agonistes/Antagonistes mixtes Diethylstilbestrol 4Hydroxytamoxiféne Raloxiféne Antagonistes purs ICI 182.780 ICI 164.384 22 La grande majorité des xéno-oestrogènes sont des molécules agonistes et ils ont une meilleure affinité pour le récepteur alpha comme le nonyphénol et ses différents isomères (Arukwe et al., 2002; Gabriel et al., 2008), le cadmium (Nesatyy et al., 2006) et certains colorants alimentaires (Axon et al., 2012) . Certaines molécules ont une meilleure affinité pour le récepteur béta (ERβ). C’est le cas de phyto-oestrogènes comme la génistéine (chez les mammifères), la biochanine A ou la daidzéine, et la benzophénone. Dans une majorité des cas, les xéno-estrogènes ont une affinité pour les deux récepteurs alpha et béta comme le bisphénol A (Kuiper et al., 1998), les parabènes, les écrans UV (Gomez et al., 2005), le diéthylstilbestrol (DES) (exerçant une fonction agoniste et ayant une affinité importante vis-à-vis des deux isotypes du récepteur aux oestrogènes) ou le glyphosate (Thongprakaisang et al., 2013). Enfin, certaines molécules ont une activité agoniste sur le récepteur alpha (ERα) et antagoniste sur le récepteur béta (ERβ). C’est le cas de pesticides comme le méthoxychlore ou le chlordécone (Le Maire et al., 2010). Ceci illustre le fait que de nombreuses molécules potentiellement retrouvées dans l’environnement peuvent avoir des effets complexes sur le système hormonal. Mais les mécanismes des perturbateurs endocriniens ne se limitent pas à celui-ci. Ils peuvent également cibler le récepteur de l'hormone de la thyroïde (ThR) (Jagnytsch et al., 2006), des récepteurs glucocorticoïdes (GR) (Neel et al., 2013), des récepteurs de la progestérone (PR) (Scippo et al., 2004), le récepteur de la dioxine et des hydrocarbures aromatiques (AhR) (Jeuken et al., 2003). Ces molécules peuvent aussi cibler le récepteur des androgènes (AR) (récepteur des hormones sexuelles mâles comme la testostérone et son métabolite, la dihydrotestostérone). Ce récepteur est principalement exprimé dans le testicule, il est présent dans la prostate, les glandes surrénales, les reins, le cerveau et l’hypophyse. Le rôle du récepteur AR dans les organes mâles est très similaire à celui des récepteurs ER dans les organes femelles. Les plus puissants agonistes connus sont la testostérone et son métabolite, le DHT (dihydrotestostérone) qui se lient plus fortement aux récepteurs aux androgènes et l’acétate de médroxyprogestérone (MPA) (Okamoto et al., 2012; BiancoMiotto 2014). b. Action non génomique des perturbateurs endocrin iens Au-delà de la voie de signalisation classique passant par l’activité nucléaire du récepteur, les perturbateurs endocriniens provoquent des effets moins classiques, par l’intermédiaire de certaines voies de signalisation membranaires (notamment calcium 23 dépendant) suite à l’activation d’un récepteur membranaire. Plusieurs travaux ont permis d’identifier notamment des récepteurs aux stéroïdes localisés dans la membrane cytoplasmique qui sont identiques aux récepteurs nucléaires car ils sont reconnus par les mêmes anticorps (Powell et al., 2001). Les travaux décrits dans la littérature ont montré que, les stéroïdes ou des xéno-hormones, sont capables d’induire une action non génomique via un second messager après leur fixation sur les récepteurs membranaires ou sur leurs isoformes (Falkenstein et al., 2000). En effet, de nombreuses études ont été réalisées sur l’activité non génomique des xéno-oestrogènes notamment pour expliquer leur rôle dans des disfonctionnements physiologiques, métaboliques et dans des déficits fonctionnels à court terme et à long terme au niveau de la cellule et des tissus (tératogenèse et cancer) (Watson et al., 2007; Watson et al., 2013, Hisamoto et al., 2001 ). Il a été montré, par exemple, que l’œstradiol (E2) peut se lier au récepteur ERα membranaire (identique au récepteur ERα nucléaire) et induire une cascade de protéines kinase qui aboutit à la division cellulaire (Falkenstein et al., 2000; Bulayeva et al 2004; Watson et al., 2005). Il est aussi impliqué dans l’activation de la production d’AMPc et d’IP3 (inositol triphosphate) dans certains tissus (Grove et Korach, 1987; Ignar-Trowbridge et al., 1991; Aronica et al., 1994; McEwen et Alves, 1999). Certains xéno-estrogènes comme le diéthylstilbestrol, le coumestrol, le bisphénol A, ou le nonylphénol, induisent des réponses non génomiques par des voies très diverses qui peuvent, par exemple, conduire à l’activation des voies des MAP kinases (Watson et al., 2007; Watson et al 2010). Un schéma simplifié des voies de signalisation contrôlées par le récepteur des oestrogènes membranaire et cytoplasmique est présenté figure 6. Ces activités non génomiques sont extrêmement rapides, elles se déroulent dans les minutes qui suivent l’activation du récepteur membranaire et ne sont pas affectées par les inhibiteurs de la transcription ou de la synthèse protéique tels que l’actinomycine D ou le cycloheximide (Jagla, 2007). Cependant ces activités restent ligands dépendantes, étant donné que l’administration d’un ligand antagoniste permet leur inhibition. De telles activités ont été, entre autres, décrites pour le AR (Baron et al., 2004) et le PR (Boonyaratanakornkit et al., 2001 ). Ces effets peuvent d'ailleurs avoir des conséquences sur la régulation de gènes. 24 Figure 6 : Voies de signalisation des oestrogènes médiées par les récepteurs membranaires et nucléaires. Les voies classiques (I et II) dépendent de l’interaction directe de l’oestrogène avec ER. Les voies non-classiques (III et IV) dépendent l’interaction avec un récepteur non-stéroïdien (III) ou avec un ER (IV) membranaire (Lorenzo et al., 2003) De la même manière, l’interférence des xéno-hormones dans le métabolisme des hormones peut avoir des effets qui s’additionnent à ceux engendrés par leur activité agoniste ou antagoniste. L’activité de presque toutes les enzymes impliquées dans la stéroïdogenèse peut être modifiée par les xéno-hormones (Whitehead et Rice., 2006). Ce qui altère la concentration des hormones naturelles dans l’organisme et induit un dysfonctionnement du système hormonal. C. Cas particulier : les xéno-estrogènes et le récepteur à la dioxine Le récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) est un facteur de transcription activé par la fixation de ligands. Le récepteur AhR semble intervenir dans le développement des invertébrés. Par exemple, chez Drosophila melanogaster, l’homologue du récepteur AhR intervient dans le développement des segments et des antennes (Emmons et al., 1999) et son ADN complémentaire, connu depuis 1992, révèle des domaines de forte homologie avec les protéines Per (Period) et Sim (Single-Minded) de Drosophila melanogaster. Il fait partie de la famille dite bHLH-PAS (basic Helix-Loop-Helix/Per-AhR-Sim) (Hankinson 1995; Swanson et Bradfield, 1993), distincte des récepteurs nucléaires à laquelle appartient le récepteur aux 25 oestrogènes. Ce motif «PAS» (PER-AhR-SIM), caractérise les membres d’une nouvelle super-famille de protéines incluant Arnt (AhR nuclear translocator), partenaire d’hétérodimérisation de AhR. Parmi les ligands qui se fixent sur l’AhR, citons les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comme le benzopyrène, les polychlorobiphényles (PCB) et les dioxines. Un certain nombre de phyto-oestrogènes sont des antagonistes du récepteur AhR tels que la génistéine ou le resvératrol. Ce récepteur reconnaît plus de 250 ligands dont 75 dioxines, mais le ligand naturel reste inconnu malgré quelques molécules candidates (Denison et Nagy, 2003). Le rôle du récepteur à la dioxine est particulier car il peut interagir avec le récepteur ER et peut soit l’activer ou soit l’inhiber, ce qui explique la confusion du statut anti ou pro- oestrogénique de la dioxine. Le récepteur AhR se caractérise par un domaine N-terminal complexe appelé «bHLHPAS» (basic Helix-Loop-Helix/Per-AhR-Sim), responsable de la liaison à l’ADN, de l’hétérodimérisation et de la liaison du ligand (figure 7A). Ce domaine définit une famille de transactivateurs qui comprend, outre le récepteur AhR, son partenaire d’hétérodimérisation nucléaire ARNT (Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator) (Rowlands et Gustafsson, 1997). L’hétérodimère AhR-Arnt identifie des séquences «XRE» (Xenobiotic Responsive Element). La partie C-terminale du récepteur AhR contient des régions trans-activatrices et une fonction de répression de la transcription. AhR présente une rare aptitude aux interactions avec d’autres protéines telles que les chaperonnes (HSP90), B A Figure 7: Structure et mécanismes moléculaires du récepteur nucléaire AhR. (A) : illustration de l’architecture de domaine et des ligands apparentés pour ces récepteurs. bHLH : hélice-boucle-hélice de base; PAS : Per-ARNT -Sim domaine; AD : domaine d'activation; AF : fonction d'activation. (B) mécanismes de régulation des gènes médiés par AhR. ERE, un élément de réponse aux oestrogènes (inspiré de Ohtake et al., 2009). 26 Le fonctionnement de l’AhR est semblable à celui de certains récepteurs stéroïdiens (figure 7B) (Ohtake et al., 2007, 2008). Il se localise dans le cytoplasme et une fois lié à un ligand, le complexe recrute une protéine de translocation appelée translocateur nucléaire du récepteur des hydrocarbures aromatiques (ARNT). Le complexe ligand-AhR-Arnt agit comme facteur de transcription sur l'élément de réponse aux xénobiotiques (XRE : xenobiotic response element) sur le promoteur du gène concerné, comme c'est le cas pour le gène codant pour le CYP1Al. Cette fixation au XRE va permettre de recruter l'ARN polymérase favorisant la transcription des gènes cibles, dont beaucoup codent pour des enzymes de détoxication, en ARNm. Ainsi le taux de transcription est favorisé par la fixation de facteurs de transcription. Parmi les gènes dits AhR-dépendants figurent ceux codant pour un grand nombre d'enzymes de biotransformation (évitant toute accumulation de métabolites intermédiares potentiellement toxiques pour la cellule) incluant: - des enzymes de phase I telles que le CYP 1 A 1, CYP 1 A2, CYP 1 B 1 et CYP2s 1, - des enzymes de phase II telles que la NAD(P)H-Nqo 1 (nicotinamide adénine dinucléotide phosphate-quinone oxidoréductase), la GSTA 1 (glutathion-Stransferase A 1) et l'UGT1 A6 (UDP-glucuronosyltransférase) (Rivera et al., 2002) (figure 8). La fixation de ligands comme les dioxines provoque également l’activation de gènes de la prolifération, de la régulation du cycle cellulaire et de l’inflammation. Figure 8 : Intéraction de la signalisation du récepteur AhR avec A, la modulation de la synthèse d’enzyme de biotransformation et du métabolisme (enzyme de phase I et de phase II) et avec B, l’élimination du récepteur ER par le protéasome (inspiré de Matthews et Gustafsson, 2006) 27 Outre les effets géniques du récepteur AhR, plusieurs travaux ont montré que ce récepteur pouvait exercer ses effets en activant des cascades de signalisation différentes. Ainsi, plusieurs kinases semblent être la cible de ce récepteur, comme la p38 kinase et la JNK (c-Juhn N-terminal Kinase) (Weiss et al., 2005; Diry et al., 2006). Il existe un mode d’activation non conventionnel du récepteur AhR qui, en absence d’hormone, induit tout de même des gènes oestrogéno dépendants. Les mécanismes d’action qui induisent cet effet, ont été, notamment, démontrés par Ohtake et al., 2003. Ce dernier peut former un hétérodimère avec le récepteur ERα et ainsi agir comme co-régulateur pour stimuler la transcription contrôlée normalement par le récepteur ERα (figure 9). Figure 9:Activation illégitime de la voie de signalisation du ER (récepteur des oestrogènes) par le récepteur de la dioxine activé AhR. En l’absence d’oestrogène, la voie de signalisation du ER peut être activée par des interactions entre le récepteur ER et le récepteur de la dioxine activé (d’après Massaad et Barouki, 1999) En effet, plusieurs études in vivo et in vitro ont confirmé un lien entre l’activité du récepteur ERα et celle du récepteur AhR. Par exemple, en transférant le gène codant pour le récepteur ERα à des cellules ne pouvant pas exprimer ce récepteur et ne pouvant pas répondre à la dioxine, Thomson et al., ont montré que ces cellules étaient de nouveau capables de répondre à la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine en déclenchant une réponse oestrogénique. De même, des agonistes du récepteur AhR peuvent l’être également pour le récepteur ERα, on parle alors de xéno-oestrogènes bivalents. De même, il est désormais admis que le récepteur à la dioxine AhR possède des voies de signalisation et d’activation qui se croisent avec celles 28 du récepteur aux oestrogènes ERα et également avec celles du récepteur aux androgènes (AR) (figure 10). Figure 10: Interaction de la signalisation des dioxines avec les oestrogénes. Interaction des voies signalisation du récepteur AhR et du récepteur ERα via une association directe entre AhR et ERα. Les ligands du récepteur AhR induisent une association de AhR avec Erα. Ce nouveau complexe agit comme une unité fonctionnelle pour réguler la transcription (inspiré de Matthews et Gustafsson , 2006). Il a été également montré que le récepteur AhR exerce à l’égard du récepteur ER une activité «ubiquitine E3 ligase» et oriente le récepteur ER vers le protéasome favorisant ainsi sa dégradation (Ohtake et al., 2007; Matthews et Gustafsson, 2006). Il résulte de ces derniers travaux que les dioxines perturbent considérablement les régulations hormonales oestrogéniques : en présence d’hormone, ces polluants exercent un rôle antagoniste, alors qu’en absence d’hormone, ils sont capables d’induire transitoirement des gènes hormonodépendants (figure 10). D. Action à faible dose et en mélange de perturbateurs endocriniens Compte tenu de la particularité des PE à produire leurs effets via des mécanismes de signalisation physiologique, leurs cibles sont difficiles à évaluer et la perturbation du système endocrinien peut, dans certains cas, apparaître à des concentrations bien plus faibles que celles qui alarment habituellement les toxicologues. Tout comme les hormones naturelles, les PE 29 présentent des relations non linéaires entre la concentration de la molécule et le nombre de récepteurs liés, ainsi qu'entre le nombre de récepteurs liés et l'effet biologique maximal (Vandenberg et al., 2012). Les effets de faibles concentrations ont été très souvent pris en compte notamment pour le bisphénol A (vom Saal et al., 2007). De nombreuses études ont démontré que comme les hormones, les PE peuvent avoir des effets à de faibles doses (dose physiologique) et ces effets ne sont plus présents ou différents à des doses élevées (pouvant être considérées comme toxiques) (Wetherill et al., 2007; Piccart et al., 2003). Si on commence à mieux appréhender les effets de ces composés lorsqu'un organisme est exposé à une seule de ces molécules, on connait beaucoup moins bien l'effet de ces composés lorsqu'ils sont présents en mélange. Or, les contaminations par les PE étant pratiquement toujours multiples, il apparaît pertinent de pouvoir évaluer les effets des mélanges. La compréhension de ces effets est rendue complexe car un même PE peut avoir plusieurs mécanismes d’action tels que des effets oestrogéniques dans certains systèmes et anti-androgéniques dans d’autres (Viñas, et al., 2013). De plus, différentes études ont déjà montré que même si chacun des composés est présent à une concentration inférieure à celle où il induit un effet, le mélange de ces composés à ces mêmes concentrations peut néanmoins causer un effet (Silva et al., 2002; Rajapakse et al., 2002). Des études ont donc évalué les effets d’addition (Bazin et al., 2010), de synergie (Laetz et al., 2009) ou d’antagonisme (Tanida et al., 2009) entre molécules. Ces effets sont d’autant plus importants pour les perturbateurs endocriniens que certains induisent des effets agonistes (éthinyloestradiol, nonylphénol), antagoniste (tamoxifène) et peuvent avoir des mécanismes d’action différents (liaison aux récepteurs, modification du métabolisme) (voir partie II A Mécanismes de la perturbation endocrinienne) (Monosson et al., 2005; Cizmas et al., 2004). De même, il a été démontré que des mélanges multi-composants d'oestradiol et d'autres xéno-oestrogènes induisent la synthèse d’une protéine spécifique, la vitellogénine chez le poisson. Cette protéine est un biomarqueur de la perturbation endocrinienne. En comparant le taux d’induction par les contaminants pris isolément et deux à deux, on peut prédire l’effet dû au mélange (Brian et al., 2005). Ce système de prédiction basé sur des effets cocktails, utilisant des bioessais in vitro, a permis d’évaluer les effets de mélange de nombreux perturbateurs endocriniens (Bazin et al 2010). La prévisibilité des effets de la combinaison de plusieurs molécules a été démontrée avec des systèmes encore plus complexes que celui de l’induction de la vitellogénine chez les poissons. Dans un modèle de toxicité pour le développement du rat, il a été montré que les 30 combinaisons d'antagonistes des récepteurs aux androgènes vont agir de manière additive et ainsi induire des changements physiologiques chez l’animal lors de sa vie fœtale, caractéristiques de la perturbation de l'action des androgènes (Hass et al., 2007). Des observations similaires ont été faites avec des combinaisons d’anti-androgènes qui agissent par le biais de mécanismes différents (Christiansen et al., 2009; Rider 2008). Des études avec des perturbateurs thyroïdiens ont également montré des effets additifs à faibles doses (Crofton et al., 2005). Compte tenu des propriétés des PE, par rapport aux divers scenarii d’exposition des populations, la recherche se focalise actuellement sur les mélanges de substances à doses environnementales (de l’ordre du microgramme ou du nanogramme par littre). IV. Perturbateurs endocriniens : substances d’origines multiples Les différentes activités humaines génèrent une diversité de substances et des quantités toujours croissantes d’agents physiques, chimiques ou biologiques ayant un pouvoir contaminant et des risques potentiels sur la santé humaine, animale et/ou végétale. Parmi les effets négatifs pouvant être développés par ces contaminants, la perturbation endocrinienne est, à l’heure actuelle, un des impacts sur l’écosystème qui est de plus en plus étudié. Cependant, il faut noter que les substances, ayant des effets potentiellement perturbateurs sur le système endocrinien, peuvent avoir deux origines : naturelle et anthropique (tableau 6). 31 Tableau 6 : Classes de perturbateurs endocriniens. Archives des maladies professionnelles et de l’environnement 2008, L. Multigner, P. Kadhel Différentes classes de substances à action endocrine Hormones stéroïdes naturelles Produits pharmaceutiques Produits dentaires Produits vétérinaires Produits de combustion Oestrone, 17α-oestradiol, oestriol (hormones sexuelles) DES (Distilbène), 17 α-éthynil-oestradiol (contraceptif), kétokonazole (traitement du pityriasis, pommade), tamoxifène (traitement de certains cancers du sein)…. Bisphénol A DES, trenbolones (augmentent la masse musculaire)… Dioxines, furanes, HAP (hydrocarbure aromatique polycyclique)… Produits à usage industriel ou domestique Phtalates, bisphénol A, styrène (polystyrène), Polybromodiphényl éthers (PBDE), polychlorobiphényls, organoétains Alkylphénols, parabènes (conservateurs dans les produits de beauté), Arsenic, cadmium… Produits phytosanitaires Phytooestrogènes Mycotoxines Organochlorés (DDT, chlordécone…), vinchlozoline (retirée en avril 2007), linuron (herbicide), atrazine, simazine, linuron… Isoflavones (soja, trèfle)… Zéaralénone, ochratoxine A… A. Hormones 1) Hormones naturelles Les hormones stéroïdes représentent une large classe de molécules lipophiles. Elles agissent principalement sur des sites variables pour la régulation de nombreuses fonctions physiologiques. C’est pour cela quelles sont essentielles pour une physiologie normale. Il existe deux principales classes d’hormones : les androgènes comme le déhydroépiandrostérone (DHEA), la dihydrotestostérone (DHT) ou la testostérone (T) et les oestrogènes comme l’œstrone (E1), l’œstradiol (E2) et l’oestriol (E3). Ces hormones sont importantes dans la différentiation sexuelle, la reproduction ainsi que pour le maintien d’une santé optimale chez l’adulte. L’activation ou l’inhibition inappropriée des récepteurs stéroïdes par ces hormones est l’un des modèles les plus utilisés pour l’étude de la perturbation, plus particulièrement, l’interférence avec la signalisation des récepteurs des oestrogènes. Plusieurs études ont rapporté la prévalence des oestrogènes naturels dans les effluents de station d’épuration (Pillon et al., 2005, Johnson et al., 2005, Khanal et al., 2006, Limpiyakorn et al., 2011). Ces auteurs ont mis en évidence le rôle néfaste de ces substances, comme étant une 32 source de composés pouvant entrainer, du fait de leur présence «anormale» dans l’environnement, des perturbations endocriniennes sur les écosystèmes naturels. 2) Hormones synthétiques Les oestrogènes synthétiques sont utilisés comme contraceptifs (éthinyloestradiol (EE2), mestranol), dans le traitement des pathologies reproductives (clomifen) ou le cancer (tamoxifen, raloxifen). Ces produits pharmaceutiques agissent par compétition avec les hormones endogènes, par blocage ou en activant certaines voies métaboliques, ou encore en remplacement des oestrogènes endogènes. B. Xéno-hormones d’origine naturelle 1) Phyto-oestrogènes Les phyto-oestrogènes, composés dérivant des plantes, possèdent des structures chimiques similaires aux oestrogènes. Ce sont des perturbateurs endocriniens non stéroïdes et sont retrouvés dans de nombreux aliments comme le soja. Dans la littérature, l’aptitude de ces composés à se lier aux récepteurs des oestrogènes est de plus en plus rapportée. En effet, ces composés induisent des réponses oestrogéniques dans les essais in vitro (Stopper et al., 2005), chez certains mammifères (Hopert et al., 1998; Burton et Wells, 2002) ainsi que des effets délétères sur la faune naturelle (Colborn et al., 1993; Dusza et al., 2006; Jefferson et al, 2007; Rochester et Millam, 2009). D’autres phyto-composés comme les coumestranes (principalement le coumestrol), et des isflavonones présentent une activité anti-oestrogénique dans les cellules MCF-7 (Han et al., 2002). 2) Myco-oestrogènes Certaines mycotoxines produites par les champignons, en particulier fusarium (Kuiper-Goodman, 1987) telles que la zéaralénone, la déoxynivalénol (DON), ou encore la toxine T-2, sont des substances pouvant avoir une activité endocrinienne (Ndossi et al., 2012) et qui sont retrouvées à de fortes concentrations dans les produits alimentaires comme les céréales (maïs, orge) et l’huile végétale. Elles sont capables de se lier, avec une bonne affinité, aux récepteurs des oestrogènes (ERα et ERβ) (Balaguer et al., 2001). De récentes études ont également montré l’impact de l’ochratoxine A sur le système endocrinien (Frizzell 2013a et b). Jusqu’alors, cette mycotoxine produite par les genres Aspargillus et Penicillium était connue pour avoir des effets sur la reproduction (Gharbi et al., 1993), sur la spermatogenèse 33 (Biro et al., 2003), sur le système immunitaire et également des effets cancérogènes (classée groupe 2B par le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC)). De ce fait, le Comité scientifique de l'alimentation humaine de la Commission européenne a estimé, dans son avis du 17 septembre 1998, qu'il serait prudent de réduire autant que possible l'exposition à l'ochratoxine A. Ainsi, la concentration doit se situer près de la valeur inférieure des doses journalières tolérables comprises entre 1,2 à 14 ng/kg p.c./jour (poids corporel/jour). La teneur maximale de cette mycotoxine dans les vins pour une commercialisation en Europe est de 2 µg/l. Le Canada et les Etats Unis refusent l'importation des vins présentant plus de 1 μg/l d'ochratoxine A. Cette mycotoxine peut également avoir un impact sur la sécrétion des certaines hormones comme la testostérone (Shashi, et al., 2011), et sur l’hormone lutéinisante (LH) (Hassan et al., 2010). L’ochratoxine A semble avoir une action sur le système endocrinien via les voies non génomiques (Frizzell et al., 2013a et b). C. Xéno-hormones d’origine anthropique Outre les phyto-oestrogènes et les myco-oestrogènes, les xéno-hormones font référence à des milliers de produits et appartiennent à diverses familles de produits chimiques : les organochlorés, les dioxines; les alkylphénols …. On les retrouve dans les formulations, les solvants, les produits issus du pétrole etc… Ils regroupent des produits de l’industrie chimique (phtalates, bisphénol A, métaux lourds, etc.), des produits phytosanitaires utilisés en agriculture (herbicides, fongicides, insecticides, etc.) et des produits de consommation courante (cosmétiques, conservateurs, produits alimentaires etc…). 1) Xéno-hormones d’origines industrielles a) Produits chimiques Les substances synthétiques sont conçues pour une utilisation industrielle en tant que solvants, surfactants ou lubrifiants (ex. nonylphénol ou polychlorobiphényle/PCB), et sont retrouvés dans les plastiques (ex. bisphénol A). D’autres sont utilisées comme pesticides (ex. méthoxychlore, dichlorodiphényltrichloroéthane/DDT, lindane), fongicides (ex. vinclozoline, bénomyl), substances médicamenteuses (ex. flutamide), et produits de consommation courante (ex., cosmétiques, produits d’entretien). Les composés organochlorés sont utilisés comme solvants, pesticides dont les insecticides et les fongicides ou encore comme réfrigérants ou molécules intermédiaires de synthèse en chimie et pharmacie. Les plus connus sont les pesticides (DDT, aldrine, chlordécone, dieldrine, chlordane, heptachlore, endrine, 34 mirex, chlorobiphényle (BPC), toxaphène, lindane, etc.), les polychlorobiphényles (PCB) et les dioxines qui pour certains ne sont plus utilisés à ce jour (Convention de Stockholm) et d’autres sont interdits en France et en Europe. Quelques structures de ces xéno-hormones sont illustrées (figure 11). En raison de leur caractère lipophile, les organochlorés sont réputés persistants et se concentrent dans les tissus adipeux. Certains d’entre eux perturbent ainsi le système endocrinien. Ces composés font partie des composés organiques persistants (POPs) qui possèdent des temps de demi-vies pouvant atteindre plusieurs décades. Figure 11 : Quelques exemples de xéno-hormonesd’après le site Internet de la National Library of Medicine 2007 Le mode d’action, de ces molécules, comme perturbateur endocrinien est très varié. Par exemple, les effets oestrogéniques des PCB peuvent se produire suite aux interactions directes avec le récepteur aux oestrogènes (ER) (Fielden et al., 1997; Ma et al., 2000). Le DDT, insecticide longtemps utilisé, est un des perturbateurs endocriniens les plus étudiés (Yang et al., 2006). Son métabolite le 4,4'-Dichlorodiphényldichloroéthane (4,4’-DDE) est un composé anti-androgénique reconnu (Kelce et al 1995). Les hydrocarbures aromatiques polycycliques regroupent plusieurs composés, le plus connu étant le Benzo(a)pyrène (BaP). Leur principal mécanisme de toxicité est induit via l’activation du récepteur à la dioxine (récepteur AhR) pouvant indirectement produire des effets endocriniens (Ma et al., 2000). 35 Les détergents du type éthoxylates d’alkylphénol (EAP) et éthoxylates d’octylphénol (EOP) sont utilisés par l’industrie métallurgique pour dégraisser les surfaces métalliques. Les éthoxylates de nonylphénol (ENP) se retrouvent, quant à eux, dans des produits d’entretien domestique. Après leur utilisation, ces composés biodégradés en station d’épuration engendrent la formation de produits bio-réfractaires comme le nonylphénol (NP) qui est persistant et toxique. Il a été démontré que le nonylphénol et ses dérivés sont des composés induisant une activité oestrogénique en se fixant notamment sur le récepteur ERα (Guenther et al., 2002; Preuss et al., 2006; Bechi et al., 2006; Gabriel et al., 2008). Le NP et ses dérivés sont connus pour s’accumuler dans les espèces aquatiques et entraîner la féminisation des poissons bien qu’il soit 10 000 fois moins oestrogénique de l’oestradiol (Jobling et Sumpter 1995). Les constituants du plastique comme le bisphénol A et les phtalates peuvent engendrer respectivement des effets oestrogéniques et anti-androgéniques par la liaison au récepteur des oestrogènes et au récepteur des androgènes (vom Saal et al., 2005). Le bisphénol A peut également fixer le récepteur AhR (Bonefeld-Jorgensen et al., 2007, ), et le récepteur des hormones thyroïdiennes (ThR) (Zoeller et al., 2005). Les phatlates interfèrent également avec les voies des androgènes et des oestrogènes. La perturbation des activités androgéniques a été montrée par le développement sexuel anormal des rats exposés aux contaminants et son impact sur la fertilité des hommes (Dalsenter et al., 2006; Latini et al., 2006). De plus, des expériences in vitro ont montré le potentiel anti-androgénique de ces xéno-hormones (Lee et al., 2007). Certains métaux comme le plomb, le cadmium, l’arsenic, le mercure, le zinc ou le nickel, peuvent induire des perturbations endocriniennes chez l’animal (Iavicoli et al., 2009; Bogdan et al., 2011). A des concentrations non cytotoxiques (comprises entre 2 et 225 µg/l) l’arsenic inhibe l’effet de l’oestradiol dans les cellules MCF7. De même, le mercure encore employé en technique dentaire peut avoir une action de perturbation qui induirait un dérèglement de plusieurs glandes, des ovaires et des testicules provoquant des troubles de l’immunité, des troubles de la reproduction et un accroissement des cancers du sein (Tan et al., 2009; Wirth et al., 2010). A des concentrations de l’ordre du nanogramme par millilitre, le cadmium interfère avec la synthèse des oestrogènes, des androgènes et de la progestérone (Massanyiet al., 2000; Takiguchi et Yoshihara, 2006). 36 b) Colorants Les colorants sont impliqués dans un grand éventail de domaines : industrie textile, imprimerie, industrie pharmaceutique, cosmétique et agro-alimentaire. L’industrie des colorants constitue aujourd’hui un secteur important de la chimie : la production mondiale est estimée à plus de 800.000 tonnes par an dont 140.000 tonnes s’échappent dans les effluents au cours des différentes étapes d’application et de confection (Cooper, 1995; Zollinger, 1987). Parmi les nombreuses familles de colorants synthétiques, les colorants azoïques sont les plus largement utilisés (60 à 70 %). Ces colorants possèdent une ou plusieurs liaisons azoïques (R1-N=-R2) en association avec un ou plusieurs groupements aromatiques, ce qui les rend très stables et relativement peu biodégradables. De nombreuses études ont montré, d’autre part, des effets toxiques et/ou carcinogènes des colorants azoïques (Mathur et Bhatnagar 2007; Schneider et al., 2004). Dans le cas des colorants azoïques, l'augmentation de l'incidence du cancer de la vessie, observée chez les travailleurs de l'industrie textile, a été liée à une exposition prolongée à ces colorants. Un rapport d'experts du « Comité Cosmetic Ingredient Review » a confirmé que certains colorants d'anthraquinone, comme le Disperse Blue 7, utilisé dans l'industrie cosmétique comme colorant pour cheveux et dans l’industrie textile, induisent de la génotoxicité chez les bactéries (Final report on the safety assessment of disperse blue 7, 2007). De même il a été montré que des rejets d’industrie de peinture avaient une activité dioxine like (AhR) et cette activité a été corrélée à la présence de colorants spécifiques (Chouet al., 2007). D’un point de vue environnemental, les activités oestrogéniques n’ont pas été décrites pour les colorants textiles. Les impacts sur le système endocrinien, que pourraient avoir ces composés, ont été observés pour le résorcinol, un antiseptique utilisé pour produire des colorants comme le bleu de résorcine, le vert de résorcine, utilisés pour le tannage ou le textile (Lam et al., 2013). En revanche, des études ont décrit des effets oestrogéniques dues à la présence de colorants alimentaires. La tartazine (E102) ou l’érythrosine (E127) affectent la réponse du récepteur aux oestrogènes (ER) en se fixant sur l’élément de reconnaissance oestrogénique (ERE) dans les cellules HTB 133 (cellules hepitéliales de glande mammaire). Ces résultats sont confirmés par le bioessais Escreen (Roychoudhury et Giri 1989; Lundin-Schiller 2008). 2) Produits de consommation courante et d’hygiène corporelle, les parabènes Parmi les produits de soin corporel et d’hygiène (PPSP pour produits pharmaceutiques et de soins personnels), on retrouve des produits pharmaceutiques, des antibiotiques et des produits de soins personnels (comme les parfums synthétiques à base de musc) mais aussi 37 certains conservateurs comme les parabènes. Les médicaments excrétés par les humains et les stéroïdes déjectés par les animaux d’élevage représentent d’autres sources de perturbateurs endocriniens retrouvés dans l’eau. Des études récentes ont montré que le paracétamol et les anti inflammatoires perturbent le système endocrinien (Vanderford et al., 2003 et 2006, Westerhoff et al., 2005; Albert et al., 2013). Certains analgésiques ont des effets antiandrogéniques chez le fœtus du rat et chez l’homme (Mazaud-Guittot et al., 2013; Kristensen et al., 2011). Les parabènes sont des esters de l’acide parahydroxybenzoïque ou encore des parahydroxybenzoate d'alkyles dont le groupement alkyle, peut être un radical méthyl, éthyl, propyl, butyl, isobutyl ou benzyl. En général, les parabènes sont des composées stables qui résistent à l’hydrolyse en solution acide (Soni et al., 2005; Eriksson et al., 2009). La concentration en parabène admise dans les cosmétiques peut atteindre 1 % (Tavares et al., 2009). Cependant la Directive Européenne 76/768/EC autorise une concentration maximale dans les produits cosmétiques de 0,4 % pour un seul ester et 0,8 % (en masse) pour un mélange d’esters. En raison de leurs propriétés antibactérienne et antifongique, les parabènes sont employés comme conservateurs, en particulier dans les produits cosmétiques et certaines spécialités pharmaceutiques (Jonkers et al., 2009; Elder, 1984). Une enquête, récente, réalisée en Espagne sur 215 produits cosmétiques a montré que les parabènes sont utilisés dans 99 % des crèmes et des lotions, et 77 % des démaquillants (Tavares et al., 2009). Ils peuvent également être présents dans les dentifrices (Benijts et al., 2004). Dès 1998, des études in vitro, s’intéressant aux mécanismes d’action de ces composés, ont mis en évidence la capacité des parabènes à se lier au récepteur oestrogénique. Cette activité oestrogénique serait fonction de la longueur des chaînes alkyles (méthyl, éthyl, propyl, butyl) (Routledge et al., 1998; Bazin et al., 2010). Des essais réalisés sur des cellules MCF‐7 (lignée de cellules tumorales mammaires), ont démontré l’effet oestrogénique additif entre les parabènes et le 17β‐ oestradiol (Van Meeuwen et al., 2008). Une activité anti-androgénique a également été observée in vitro avec les méthyl, propyl et butyl parabènes. En effet, à partir d’une concentration de 10 μM, ils sont capables d’inhiber l’activité transcriptionnelle induite par la testostérone respectivement de 40 %, 33 %, et 19 % (Chen et al., 2007). Enfin, les parabènes pourraient exercer une activité «indirecte» de perturbation sur le système endocrinien par 38 l’inhibition des sulfotransférases, enzymes nécessaires à la régulation de l’action des oestrogènes in vivo. V. Evaluation des altérations des écosystèmes en lien avec la présence des perturbateurs endocriniens Les évidences sont nombreuses en matière d’écotoxicologie et d’impact sur la faune principalement aquatique. En effet, de nombreuses études ont montré un lien entre la présence de polluants, induisant des effets du système endocrinien (notamment des effets sur la régulation des hormones stéroïdiennes), et des anomalies survenues sur la reproduction et le développement de certaines populations comme observé chez les alligators, les gastéropodes ou certains poissons (Toppari et al., 1996). A. Effet sur les invertébrés La recherche sur les systèmes endocriniens invertébrés a été principalement axée sur la reproduction des mollusques aquatiques, les insectes et les crustacés. La modification du sexratio et la production de vitellogénine, précurseur protéique des réserves énergétiques de l'oeuf chez de nombreuses espèces animales en réponse à des oestrogènes endogènes, peuvent être induits chez les crustacés et les mollusques placés dans les exutoires d’eaux usées (Gagné, et al., 2001; 2003; Pampaninet al., 2005; Matozzo et Marin, 2008; 2007) transformant ainsi la dynamique de la population. Une autre perturbation endocrinienne, très connue, est le pseudo-hermaphrodisme ou imposex. Celui-ci se traduit par le développement de caractères sexuels mâles chez les femelles tel que le développement d'organes génitaux mâles (pénis et canal déférent par exemple). Ce phénomène apparait surtout chez les populations de gastéropodes marins. Ce phénomène a été largement observé en Asie du sud-est (Ellis et Pattisina, 1990), en Alaska (Short et al., 1989), au Royaume Uni (Bryan et al., 1986) et aux Etats-Unis (Smith, 1981). La cause majeure du pseudo-hermaphrodisme est l’exposition à des organo-étains, en particulier le tributylétain (TBT) (biocide organométallique massivement utilisé des années 1960 à 2000 comme antifouling pour les bateaux). Ces substances sont connues pour être très toxiques pour les mollusques, même à des teneurs extrêmement faibles et sont rencontrées dans les eaux côtières. Les premiers travaux ont montré que cette anomalie était due à l’inhibition de l’aromatase conduisant à des concentrations plasmatiques accrues en testostérone (Heidrich et al., 2001). De récents travaux ont déduit que ce phénomène était 39 sans doute dû à l’induction de la voie des récepteur X de rétinoïdes (RXR) (Lima et al., 2011), ce qui implique que les effets sur la différentiation sexuelle sont donc indirects. B. Poissons/Amphibiens Les travaux pionniers de Sumpter (Purdom et al., 1994; Jobling, et Sumpter 1995), sur la truite arc en ciel (Oncorhynchus mykiss), démontrant les effets des perturbateurs endocriniens sur la féminisation des poissons, ont été un élément déclencheur pour montrer l’urgence et l’intérêt d’étudier l’impact de ces composés sur les écosystèmes aquatiques. Les amphibiens et les poissons (truite arc-en-ciel notamment) sont utilisés comme indicateurs de facteurs de stress environnementaux du fait de leur développement larvaire (en phase aqueuse) qui expose en permanence l'embryon aux composés potentiellement présents dans l'eau de surface. En effet, les œufs n’ont pas de coquille de protection (Henry et al., 2000). La sensibilité des amphibiens aux perturbateurs endocriniens peut être déterminée à l’aide d’organismes modèles tel que le xénope (Xenopus laevis). L’effet de ces perturbateurs sur la biologie de la reproduction, le système thyroïdien et le développement neural (Urbatzkaa et al., 2007; Cevasco et al., 2008) a été observé chez cet organisme. Les oestrogènes conduisent à la féminisation, les anti-oestrogènes neutralisent la différenciation sexuelle, les androgènes provoquent une masculinisation, tandis que les anti-androgènes ont des effets féminisants. (Kloas et Lutz, 2006). Les effets des perturbateurs endocriniens sur les paramètres de la reproduction chez les poissons sont bien documentés à la fois sur le terrain et au laboratoire. Le premier exemple documenté d’une perturbation sexuelle généralisée dans une population de poissons remonte à 1998 (Jobling et al., 1998). Un des indicateurs le plus analysé est la féminisation des poissons. Une forte incidence d'intersexualité et une augmentation significative des concentrations de vitellogénine (Vg) dans le plasma ont alors été observées chez des gardons (Rutilus rutilus) mâles capturés en aval de huit stations d’épuration au Royaume-Uni. Plus tard, des analyses chimiques ont révélé la présence d’oestrogènes naturels et synthétiques ainsi que des alkylphénols et du bisphénol A dans ces effluents (Jobling et al., 2004). Ces chercheurs ont lié la présence de gonades intersexuées chez Rutilus rutilus avec des modifications dans la maturation sexuelle et une diminution de la production de gamètes et de la fertilité (Jobling et al 2002 a; 2002 b). Les travaux similaires de Munkittrick et al. (Munkittrick et al., 1991) ont montré que l’exposition des poissons «white sucker» (Castostomis commersoni) du Lac Supérieur (Etats-Unis) à des effluents d’usines de pâtes à papier réduisait la taille des gonades 40 et la capacité de reproduction. De même, une étude de Hashimoto et al. (2000) montre qu’au Japon, 15 % des flets sauvages (Pleuronectes yokohamae) mâles capturés dans la baie de Tokyo, recevant une grande quantité d’effluents industriels et domestiques, avaient des ovocytes dans leurs testicules (Hashimoto et al., 2000). Des études menées en laboratoire montrent que l'éthinyloestradiol peut être utilisé pour améliorer la production d'œufs chez les poissons femelles, et induit une démasculinisation des mâles. Les oestrogènes naturels, oestradiol et oestrone ont des effets similaires, l'oestradiol étant le plus puissant (Arcand-Hoy et Benson, 1998; Gordon et al., 2004). D’autres études ont démontré des effets néfastes chez le mosquito fish dus à des composés tels que l’éthinyloestradiol, le tamoxifen, ou le méthyldihydrotestostérone. Sur les populations de poissons, on observe une diminution de la masculinisation et du taux de spermatozoïdes (Larsson et Forlin 2002; Toft et Guillette 2005; Cheshenko et al., 2008), l’apparition des phénomènes d'intersexualité (Vigano et al., 2001; Van Aerle et al., 2001), et un impact sur la croissance et la différenciation sexuelle chez le poisson chat (Sridevi et al., 2013). Le développement embryonnaire des poissons peut également être altéré par la présence de perturbateurs endocriniens. Les malformations squelettiques sont les plus spectaculaires dans la mesure où le squelette constitue la charpente de l’animal. Elles ont été décrites surtout chez les espèces d’élevage, mais elles sont également bien connues dans la nature (Dawson, 1964). Elles affectent les différentes parties du squelette, mais les plus répandues sont celles du rachis : lordose et scoliose (Madsen et Dalsgaard, 1999). Ces malformations résultent soit d’anomalies du développement et affectent alors la morphologie générale (tératologie) et/ou la croissance, soit de facteurs écophysiologiques variés : carences alimentaires (Rao et Raghuramulu, 1995), perturbations hormonales (Antunes et Da Cunha, 2002; Dulcic, 2003). Ainsi, suite à l’exposition, en laboratoire, d’œufs de médaka japonais (Oryzias latipes) à des extraits de sédiments contaminés par des polluants organiques, les embryons peuvent présenter une déformation marquée de la colonne vertébrale absente chez les individus témoins (figure 12) (Cachot et al., 2007 ; Kessabi et al., 2012). Des observations similaires ont été mentionnées pour d’autres espèces en présence de composés comme la dioxine, les HAP, les PCB (Cachot et al., 2005; 2006; Yamauchi et al., 2006; Gagnon and Rawson, 2009; Kessabi et al., 2012). 41 Figure 12 : Déformation de la colonne vertébrale chez des médakas âgés de 10 semaines. A : Médaka japonnais-Oryzias latipes; B : individu normal; C : individu présentant une lordose sévère (cachot et al., 2005) C. Effet sur les mammifères Les mammifères marins sont particulièrement vulnérables aux effets des perturbateurs endocriniens persistants. Comme les humains, ils ont une durée de vie longue et occupent des niveaux trophiques supérieurs. En outre, ils ont de grandes réserves de graisse qui agissent comme des puits pour les composés lipophiles qui sont ensuite libérés en quantité pendant la grossesse, l'allaitement et les périodes de famine. Des niveaux élevés de PCB et d'autres POP (polluants organiques persistants) ont souvent été enregistrés, parfois à des niveaux connus pour provoquer des anomalies de la reproduction. Les Pinnipèdes, comme les otaries, ont reçu plus d'attention que les cétacés et en raison de leur taille. Dans les populations sauvages des anomalies de la reproduction ont été signalées dans les zones polluées par ces substances et, dans certains cas, ces anomalies sont en corrélation avec le niveau de contaminants présents dans le corps. C’est le cas d’une étude faite dans la mer de Wadden (Jensen et al., 1979) qui a recensé une diminution du taux de reproduction des phoques dans cette zone et qui a été corrélée à une pollution par les PCB provenant du Rhin. Les taux élevés de troubles de la reproduction, l’augmentation de l'expression de CYP1A1 (due à une activation du récepteur AhR), et de kystes ovariens, indiquant une ovulation anormale, ont été observés dans les populations de cétacés se nourrissant dans les zones contaminées (Fossi et al., 2013; 2006). Concernant les mammifères terrestres, un lien, entre les polluants et la perturbation de la fonction endocrinienne, a été donné comme une explication possible de la diminution de populations et des anomalies de la reproduction de plusieurs espèces en particulier les panthères et les loutres (Roos et al., 2001; Elmeros et al., 2006). En 1995, la population de panthères de Floride ne comptait plus que 30 à 46 individus dont certains présentaient des 42 anomalies au niveau des systèmes reproducteur et immunitaire (Facemire et al., 1995). Les anomalies de la reproduction se caractérisaient par des spermatozoïdes anormaux, une faible concentration spermatique et des cas de cryptorchidie. Bien que la consanguinité soit une cause possible de ces anomalies, l'exposition à des xéno-estrogènes peut également induire des effets chez ces panthères. En effet, de fortes doses de mercure, de sélénium et de plusieurs organochlorés ont été détectées dans les tissus d'une panthère morte. De plus, les ratons laveurs, la principale proie de ces panthères, accumulent de fortes quantités de pesticides organochlorés via leur alimentation. Néanmoins, une relation causale entre ces perturbateurs endocriniens et les anomalies de la reproduction n'a pu être établie. D. Observations chez l’Homme Chez l’homme, les observations ont permis de mettre en évidence qu’une exposition fœtale ou périnatale aux perturbateurs endocriniens peut entraîner une différentiation sexuelle et des malformations urogénitales suivies d’une diminution des capacités de reproduction à l’âge adulte (Anway et al., 2005). Parallèlement plusieurs symptômes, regroupés sous le terme de « Syndrome de Dysgénésie Testiculaire » (Bay et al., 2006), témoignent d’une altération des fonctions du système reproducteur chez l’homme depuis une vingtaine d’années comme des malformations génitales, une baisse de qualité du sperme et une augmentation des cancers des testicules et de la prostate (Sharpe et Skakkebaek , 1993; Storgaard et al., 2006). Chez la femme, des études épidémiologiques mettent en avant une tendance à la puberté précoce, des irrégularités menstruelles, une fertilité altérée (Massart et al., 2003), une augmentation d’enfants prématurés, de cancers du sein et des organes génitaux (Coumoul, et Barouki, 2002; Hilakivi-Clarke, 2006). L’exemple le plus connu est celui de l’utilisation du diéthylstilbestrol chez les femmes enceintes entre les années 1938 et 1971 pour prévenir l’arrêt spontané des grossesses. Suite à l’exposition in utero, la descendance a été sujette à un nombre anormalement élevé de cancers du vagin et à une légère augmentation des risques du cancer du sein, alors que les garçons ont été sujets à des anomalies dans le développement du système reproducteur et à une augmentation des risques du cancer de la prostate et des testicules (Schrager et Potter, 2004). 43 L’origine des troubles du système de reproduction n’est pas clairement établie à ce jour mais il est possible que ces symptômes soient les conséquences d’une exposition multiple et sur le long terme aux perturbateurs endocriniens. VI. Perturbateurs endocriniens dans les effluents et les milieux aquatiques Les effluents de station d’épuration représentent la source la plus importante d’insertion de PE dans le milieu récepteur. La grande majorité des perturbateurs endocriniens utilisés en milieu urbain ou domestique se retrouve dans les eaux usées. En effet, ces composés sont principalement d’origine domestique (hormones naturelles ou de synthèse, lessives, cosmétiques..) et industrielle. Les rejets convergent vers les stations de traitement où certains perturbateurs endocriniens sont très mal éliminés dans les STEP classiques. Ils se déversent donc dans le milieu aquatique via les effluents. Cette voie de rejet est celle des hormones de synthèse et de produits de cosmétique comme les parabènes. Les herbicides, utilisés en agriculture, sont généralement entraînés par lessivage et se déversent directement dans le milieu naturel (sources diffuses) (tableau 7). Les principaux perturbateurs endocriniens déversés de cette façon sont les oestrogènes issus de l’élevage, les produits phytosanitaires et les résidus s’infiltrant dans le sous-sol des sites contaminés (cas des colorants industriels par exemple). De ce fait, de nombreuses études ont démonté que la perturbation endocrinienne de certains effluents, aussi bien en Europe que dans d’autres pays n’était pas négligeable (Dagnino et al., 2010). Cette activité biologique exprimée en Equivalent oestradiol (EEQ) est mesurée par différent tests in vivo et in vitro (voir section VII) (Cargouet et al., 2007; Nelson et al., 2007) et montrent que, dans certaines stations d’épuration, cette activitée peut varier de 10 ng/l à 130 ng/l EEQ (selon les études et les tests utilisés) au niveau des eaux arrivant dans la STEP (Murk et al., 2002). Cette activité passe en deça la vingtaine de nanograme par litre (activité allant de 16ng/l à 0,03 ng/l EEQ) à la sortie des stations d’épuration. Dans les eaux de surface, l’activité oestrogénique atteind 1,5 ng/l EEQ (Pillon et al., 2005). 44 Tableau 7 : Sources de perturbateurs endocriniens entrant dans les eaux environnementales (Birkett et Lester, 2003) Source Eaux usées domestiques Eaux usées industrielles Décharge industrielle Peinture pour bateaux Écoulement agricole (récoltes) Écoulement agricole (animaux) Ruissellement urbain Lixiviats de décharge publique Déposition par l'air Eaux naturelles Eau réceptrice Substances susceptibles d'être présentes Eau de surface Eau souterraine Eau souterraine (alimentation) Eau de surface, Eau souterraine Eau de surface, Eau souterraine Agents de surface, HAP, PCB, PBDE, pesticides, PAE, BPA Dioxines, PBDE, TBBA, PAE, PCB, HAP, pesticides, BPA Eau de surface TBT Eau de surface, Eau souterraine Eau de surface, Eau souterraine Eau de surface, Eau souterraine Pesticides, AP, APE PBDE, HAP Eau souterraine HAP, PBDE, TBBA, BPA, PAE Eau de surface, Eau souterraine Eau de surface, Eau souterraine HAP, PCB, PCDD, PCDF, PBDE, TBBA, pesticides HAP, oestrogènes stéroïdes (phyto-estrogènes) Oestrogènes stéroïdes, Agents de surface, PAE, BPA Oestrogènes stéroïdes Pesticides, HAP A. Présences des parabènes Bien que les stations d’épuration permettent un abattement de ces composés (Lee et al., 2005), le méthyl, l’éthyl, le propyl et le butyl parabènes ont été détectés dans des effluents à des concentrations de l’ordre du ng/l (Paxeus, 1996; Lee et al., 2005; Canosa et al., 2006). En entrée de station d’épuration, le composé majoritaire, largement retrouvé, est le méthylparabène car il est le plus utilisé comme conservateur aussi bien dans les produits cosmétiques que dans l’alimentation (Geara-Matta , 2013). Ses concentrations peuvent atteindre le milligramme par litre dans certains pays européens comme le Danemark (Andersen et al., 2007), le Royaume-Uni (Kasprzyk‐Hordern et al., 2008) ou encore l’Espagne (González‐Mariño I et al., 2009). Les autres parabènes sont également retrouvés et le moins présent est le benzyl parabène du fait de son interdiction (Canosa et al., 2006). En sortie de station d’épuration, en raison d’un abattement important de ces composés lors du traitement secondaire (Eriksson et al., 2009), ils sont retrouvés à des concentrations plus 45 faibles. Certaines études mentionnent des concentrations très faibles de l’ordre du nanogramme par litre voir en dessous des limites de détection (Lee et al., 2005; Canosa et al., 2006; Pedrouzo et al., 2009) et d’autres montrent, au contraire, une présence plus importante de ces composés. En effet, il a été retrouvé des concentrations pouvant atteindre, par exemple en Suisse, 423 ng/l pour le méthylparabène et 16 ng/l pour le benzyl parabène (Jonkers et al., 2009a et b). De ce fait, ces composés peuvent être présents dans les eaux de surface (Brausch et al., 2010). Ils ont été détectés par exemple en Espagne (González‐Mariño et al., 2009), en Belgique (Benijts et al., 2004) et aux Etats Unis (Renz et al., 2013). Ces concentrations peuvent atteindre 147 ng/l d’éthylparabène dans les rivières indiennes (Ramaswamy et al., 2010). B. Présence des mycotoxines Les mycotoxines sont des métabolites secondaires produits par plusieurs variétés de champignons du genre Fusarium, Aspargillus et Penicilium, qui se développent surtout dans les denrées périssables. Bien que la plupart des études se soient intéressées à leur présence dans l’alimentation, quelques-unes les ont identifiées dans l’eau. Des études ont montré la présence de mycotoxines dont certaines sont connues pour leur activité oestrogénique comme la zéaralénone ou la déoxynivalénol (DON) (Hartmann et al., 2007). Gromadzka et al., en 2009. La zéaralénone est, en effet, présente dans les milieux aquatiques à des concentrations pouvant atteindre 43,7 ng/l dans certaines rivières polonaises (Gromadzka et al., 2009). La présence de mycotoxine est expliquée par le développement de la fusariose (genre Fusarium) dans les cultures. Le drainage par les pluies entraine la toxine dans le milieu naturel (Hartmann et al., 2008). Le genre Fusarium produit également des mycotoxines appartenant à la famille des trichothécènes comme la déoxynivalénol. Les concentrations de ce composé naturel peut atteindre 20 ng/l dans les rivières du canton de Zurich en Allemagne (Bucheli et al., 2008). Des études faites sur trois stations d’épuration suisses ont montré que la DON est omniprésente dans les effluents à des concentrations allant de 32 à 118 ng/l (Wettstein et al., 2010). Concernant l’ochratoxine A produite par le genre Penicillium, sa présence est prédominante dans les rejets vinicoles (Nogueira et al., 2007) et dans le sol (Mortensen et al., 2003). D’autres mycotoxines comme les aflatoxines, sont retrouvées en mélange avec les fumonisines ou trichothécènes dans l’environnement (Hoerger et al., 2009). 46 C. Autres perturbateurs endocriniens De nombreux autres composés sont retrouvés dans l’environnement dont certains agissent sur le système endocrinien. C’est le cas des hormones naturelles (oestradiol et ses dérivés). Par exemple, une étude faite sur les eaux résiduaires aux environs de Paris a montré que les concentrations de ces hormones sont très variables. Les concentrations vont de 51 à 0,6 ng/l en entrée de station d’épuration pour l’oestradiol. Certaines hormones naturelles et synthétiques de type oestrogène telles que l’oestrone, le 17-α-oestradiol et le 17-αéthinyloestradiol subsistent encore dans les effluents. En effet, cette même étude montre qu’en sortie de station, les concentrations de ces composés varient de 19 à 1,2 ng/l (Cargouet et al., 2001). Or, ces hormones sont actives à faibles concentrations, quelques ng/l, qui sont susceptibles d’induire des effets sur l’écosystème aquatique. Des alkylphénols, le bisphénol A, des phtalates et HAP ont été retrouvés en sortie de station d’épuration et dans les eaux de surface (Céspedes et al., 2008; Voutsa et al., 2006 Sun et al., 2013). Comme ces composés sont largement utilisés dans l’industrie, l’agriculture et dans les activités domestiques (détergents), ils peuvent être retrouvés dans l’environnement à un niveau de concentration supérieur à celui des hormones (μg/l). La figure 13 montre les composés potentiellement retrouvés dans l’environnement ainsi que leurs concentrations (Wintgens et Melin, 2001). Figure 13 : Substances à action endocrinienne dans les eaux résiduaires d’une station d’épuration allemande (Wintgens et Melin, 2001). 47 VII. Détection des perturbations endocriniennes et des xéno-hormones. Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées pour détecter la perturbation endocrinienne et pour identifier les molécules responsables de ces effets. Des tests in vivo et in vitro sont disponibles et permettent d’évaluer les effets (notamment les effets oestrogéniques et anti oestrogéniques). Cependant, lorsqu’il s’agit d’identifier et de quantifier plus précisément une substance dans une matrice donnée, les analyses physico-chimiques sont plus adaptées. A. Détection de la perturbation endocrinienne de contaminants et d’effluents 1) Bioessais pour détecter la perturbation endocrinienne a) Méthodes in vivo Les essais in vivo présentent l’avantage de mesurer l’impact réel de la perturbation (effet additif, synergique, inhibiteur etc..) sur des organismes vivants (Campbell et al., 2006). Ces tests ont principalement recourt à l’utilisation de poissons comme la truite arc-en ciel (dont l’induction de la vitellogénine est un biomarqueur très utilisé pour déterminer l’activité oestrogénique), de rongeurs, d’algues, de plantes (Sumpter et Jobling 1995; Garcia- Reyero et al., 2004). Les méthodes, pour les essais in vivo, sont bien définies et utilisées depuis plusieurs décennies. Elles permettent d’intégrer de multiples mécanismes d’action et d’évaluer les effets sur le système endocrinien globalement. Par exemple chez les rongeurs, c’est l’expression de gènes endogènes ou des changements de phénotypes qui permettent d’indiquer l’effet. Deux types de tests réglementaires existent pour mesurer une activité oestrogénique ou androgénique. Le test utérotrophique chez la souris ou le rat consiste à mesurer l’augmentation du poids de l’utérus après 3-7 jours de traitement par de l’oestradiol ou le produit dont l’activité oestrogénique est à tester. Le test de Hershberger, chez le rat, consiste à mesurer l’augmentation du poids d’organes comme le gland pénien, les vésicules séminales ou la prostate ventrale après 10 jours de traitement par un produit dont l’activité androgénique est à tester (Vandenberg et al., 2007). D’autres tests, pas encore validés par le CEVAM (Centre européen pour la validation de méthodes alternatives) utilisant la technique de gène rapporteur in vivo, ont été développés ces dernières années. Ces tests utilisent des animaux transgéniques (zébrafish, xénope ou 48 souris) dont le gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein) est sous le contrôle d’un promoteur activable par les oestrogènes ou les androgènes. De tels modèles existent pour les récepteurs ER chez le zébrafish (AromataseB-GFP et ERE-Luciférase) (Legler et al., 2002a; Tong et al., 2009). Comme tous les modèles in vivo, ils présentent l’avantage d’intégrer le métabolisme et donc d’étudier la dégradation d’un produit actif ou la transformation d’un produit inactif en produit actif. b) Méthodes in vitro La caractérisation du potentiel «perturbateur endocrinien» de diverses substances chimiques et de divers effluents a été réalisée grâce à des tests in vitro. Concernant la perturbation oestrogénique, ces essais peuvent être classés en trois catégories : la mesure de l’affinité d’un produit chimique à se lier au récepteur humain des oestrogènes (hER), la prolifération de cellules «E-Screen-Assay», l’expression du gène rapporteur «YES-Assay». b.1. Tests de liaison au récepteur. Les tests de liaison à un récepteur particulier sont utilisés pour détecter des molécules capables d’interagir directement avec un récepteur endocrinien, comme les récepteurs α et β des oestrogènes ou le récepteur des androgènes. Ces tests permettent de mesurer l’affinité de liaison du récepteur pour les ligands testés. Ils sont basés sur l’étude de la compétition entre la molécule testée non radiomarquée et un ligand standard radiomarqué pour le récepteur (Leush et al., 2006; Snyder et al., 2003). Le défaut principal de ces tests est qu’ils ne fournissent aucune information sur l’activité hormonale du composé testé. Ils ne permettent pas, en effet, de faire la différence entre une activité agoniste ou antagoniste par exemple (Farré et al., 2005). Il est donc impératif d’utiliser un autre test fonctionnel in vitro pour la déterminer. b.2 Tests de prolifération cellulaire. Le test E-Screen est l’exemple le plus connu pour ce type de tests. Il est basé sur la propriété que les cellules du cancer du sein MCF-7 sont capables de proliférer en présence d’une molécule oestrogénique dans le milieu de culture (Soto et al., 1995). Ce test a permis de déterminer l’oestrogénicité d’effluents de STEP et d’eaux de surface. Ce test est l’un des plus sensibles pour analyser l’oestrogénicité des molécules et permet de distinguer une activité agoniste ou non. Ainsi, une molécule est considérée comme un antagoniste pur lorsque (i) elle n’affecte pas le nombre de cellules en absence d’oestrogène, (ii) elle bloque les effets prolifératifs de l’oestradiol, et (iii) ce blocage est réversible en augmentant la dose 49 d’oestradiol tout en gardant constante la concentration de l’antagoniste (Sonnenschein and Soto, 1998). Ce test est utilisé pour détecter l’activité oestrogénique d’effluent et sa sensibilité peu atteindre le nanogramme par litre (Bicchi et al., 2010; Kuch et al., 2010.) Néanmoins, du fait de la sensibilité du test aux conditions de culture (sous-clones cellulaires différents, lots de sérum), la variabilité des résultats en laboratoire est relativement importante (Eertmans et al., 2003). Des tests de prolifération cellulaire ont également été développés pour détecter les molécules ayant une activité androgénique ou anti-androgénique. Ces tests «A-Screen» utilisent les cellules de carcinome de la prostate d’origine humaine LNCaP-TAC, dont la prolifération est dépendante de la présence d’un androgène dans le milieu de culture (Sonnenshein et Soto, 1998). b.3 Dosage de l’activité oestrogèno-mimétique; le Yeast Estrogen Screen (YES) et autres tests utilisant le gène rapporteur. Ces tests se basent sur le modèle simple des cellules (cellules de mammifère ou levure), qui expriment un gène sous le contrôle de promoteurs définis, répondant à des substances spécifiques, et qui produisent ainsi un signal facilement quantifiable (Balaguer et al., 1996). Les cellules sont transfectées de façon transitoire ou stable avec un plasmide vecteur portant les séquences ADN d’un élément de réponse à une hormone (Hormone Response Element ou HRE) couplées à un gène rapporteur comme celui de la β-galactosidase ou de la luciférase. Par exemple, le «YES-assay», utilisant des cellules de levure (Fawell et al., 2001; Garcia-Reyero et al., 2001; Kirk et al., 2002; Hugget et al., 2003; Aerni et al., 2004; Gibson et al., 2005; Vermeirssen et al., 2006) est souvent utilisé en raison de sa manipulation simple. Ce test est basé sur la souche recombinante de la levure saccharomyces cerevisiae, qui contient, dans son génome, un gène codant pour le récepteur humain aux oestrogènes (hER). Elle contient également un plasmide portant l’élément de réponse aux oestrogènes (ERE) contrôlant lui-même l’expression du gène rapporteur lac-Z qui code pour la β-galactosidase (Routledge et Sumpter, 1996) (figure 14). 50 Figure 14 : Principe du YES (Yeast Estrogen Screen) Ainsi en présence d’oestrogènes, la β-galactosidase est synthétisée. Elle métabolise un substrat spécifique présent dans le milieu de culture comme le CPRG (chlorophénol rougebeta-D-galactopyranoside), conduisant à une coloration rouge due à la libération de chlorophénol ou comme le 4-méthylumbellriferyl-β-D-galactopyranoside (MuGal) conduisant à une florescence à 460 nm (Boever et al., 2001). L’intensité de la coloration ou de la fluorescence est un indicateur de l’oestrogénicité de la molécule ou de l’effluent testé. Des versions modifiées appelées «Lyticase assisted Yeast Estrogen Screen» (LYES) (Schultiset Metzger, 2004) et le «Bioluminescent Yeast Assay» (BLYES) (Sanseverino et al., 2010) ont été également développées. D'autres essais utilisent des cellules humaines du cancer du sein. Elles contiennent déjà le récepteur humain aux oestrogènes, et elles sont transfectées, dans certains cas, avec la luciférase dans le test ER-CALUX (Chemical-Activated LUciferase gene eXpression ceU bioassay system) (Murk et al., 2002; Van der Linden et al., 2008), dans le test T47D-KBluc ( exprimant les récepteurs alpha et beta aux oestrogènes), (Wilson et al 2004) ou dans le test MELN (Cellule MCF-7 exprimant le récepteur alpha aux oestrogènes) (Cargouët et al., 2004; Pillon et al., 2005; Cargouët et al., 2006). Ces essais montrent un grand intérêt pour la détermination rapide de l'oestrogénicité des composés naturels et artificiels et d’effluents. 51 Tableau 8 : Comparaison des limites de détection, des valeurs de EC50 et des durées des essais pour les différents tests in vitro. Test in vitro Cellule Limite de détection ng/l EC50 Reference (ng E2/l) Durée de l’essai (jours) ER-CALUX T47D 0,1 1,6 3 Murk et al., 2002 ;Vethaak et al., 2002 YES Levure 2,7 27 2 Murk et al., 2002 <1 4 Hugget et al., 2003 3 3 Kirk et al., 2002 2 5 Arijs et al., 2002; Folmar et al., 2002 57 2 Folmar et al., 2002 60 3 Beresford et al., 2000 1,3-2,2 6 Körner et al., 1998, 1999, 2000 0,3-2,7 6 Körner et al., 2001 1 8 Gutendorf et Westendorf, 2001 E-Screen MCF-7 0,27 Parmi les deux tests les plus utilisés, le test YES a montré une sensibilité environ dix fois plus faible que l’ER-CALUX, et selon les tests utilisés les sensibilités peuvent variées (tableau 8) (Leusch et al., 2010. Murk et al 2002). La limite de détection du test l’ER-CALUX est de 0,1 ng/l. Pour mieux appréhender l’effet des effluents où les substances se retrouvent en mélange, les équipes de recherche proposent donc un ensemble de tests où plusieurs effets hormonaux sont analysés, par exemple l’activité oestrogénique et l’activité androgénique (Grover et al., 2011). 2) Immunoessais pour détecter la perturbation endocrinienne Ces bioessais, appelés immunoessais, se basent sur les propriétés de liaison entre anticorps (Abs) et antigènes (Ags). Les technologies immunochimiques les plus représentatives pour les analyses environnementales regroupent différents systèmes : 52 «enzyme-linked immunosorbent assay» (ELISA), «Radioimmunoasay» (RIA) (Snyder et al., 2003), «Flow-injection immunoassay» (FIlA), «Immunoaffinity column » (Farré et al., 2005). Le test ELISA offre plusieurs avantages par rapport aux autres immunoessais. Il est, en effet, basé sur une technique immuno-enzymatique de détection permettant de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée, le plus souvent, produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps. De plus, il est robuste, fournissant des mesures rapides, et demande peu de qualification pour son utilisation (Auriol M., Thèse de doctorat 2007). Ainsi, cette méthode est très répandue pour les analyses environnementales (Gascon et al., 1997; Goda et al., 2000; Valentini et al., 2002; Schneider et al., 2004). Les principales enzymes utilisées sont la peroxydase de raifort (HRP), la phosphatase alcaline (AP) et la β-galactosidase. Les désavantages de cette méthode concernent les effets de matrice et les réactions croisées (Farré et al., 2005). Le principe de la mesure repose sur la reconnaissance structurelle de la molécule cible. Le système immuno-enzymatique est décliné en différents principes (figure 15) : Dosages avec réactif limitant : méthodes par compétition ou méthodes indirectes (figure 15 A) : l'antigène à doser entre en compétition avec l'antigène marqué pour la liaison à l'anticorps; la totalité des sites anticorps disponibles est liée. On mesure la fraction liée qui diminue exponentiellement avec la concentration en Ag à doser. On peut procéder en phase liquide homogène ou en phase solide hétérogène; dans ce dernier cas, la séparation des fractions libre et liée est facilitée. Cette méthode s'applique à tous les antigènes quelle que soit leur taille, y compris les haptènes. Dosage d'un antigène par méthode sandwich (ELISA sandwich) (figure 15 B) : l'antigène doit posséder deux épitopes différents; il est pris en "sandwich" entre deux anticorps. Il est ensuite révélé par un anticorps marqué. On mesure la fraction liée qui augmente avec la concentration en antigène à doser (linéairement pour de faibles concentrations). 53 Figure 15 : Schéma présentant les 3 principes utilisés pour la technique ELISA : (A) méthodes par compétition, (B) Dosage d'un antigène par méthode sandwich (Lafont, 2005) Les premières méthodes ELISA proposées pour détecter la perturbation endocrinienne ont été développées pour la vitellogénine, biomarqueur de la perturbation oestrogénique exprimée chez le poisson (indiquant une exposition à des oestrogènes mimétiques). Pour cela, un anticorps monoclonal a été développé afin de mettre au point le test ELISA (Tyler et al., 2002). Dans ce test, la xéno-hormone n’est pas directement mesurée mais c’est l’effet engendré par le/les perturbateurs qui est détecté (Nilsen et al., 2004; Meucci et al., 2005; Eidem et al., 2006; Verderame et al., 2011.) De même, ces tests ELISA développés, pour détecter de très faibles concentrations de vitellogénine (6 µg/l) chez certains poissons comme le Cyprinus carpio, permettent de déterminer l’effet «perturbateur endocrinien» notamment oestrogénique et anti-oestrogéniques de composés chimiques pour lesquels ces effets n’avaient pas encore été déterminés (Ebrahimi et al., 2007; 2005). Les méthodes de «screening» des perturbateurs endocriniens incluent des tests réalisés in vivo et in vitro. In vivo, les perturbateurs endocriniens sont capables d’interférer à différents niveaux des mécanismes complexes de régulation du système endocrinien. Ces tests permettent ainsi d’observer les effets engendrés par une molécule testée en prenant en compte l’ensemble de ces interactions. Mais ils ne permettent pas d’identifier et de quantifier les xéno-hormones à des concentrations de l’ordre du nanogramme par litre. 54 B. Détection des xéno-hormones avérées 1) Méthodes physico-chimiques Parmi toutes les techniques analytiques, la chromatographie en phase gazeuse (GC) et la chromatographie en phase liquide (LC) couplées à la spectrométrie de masse (MS) ou en tandem (MS/MS) sont aujourd’hui les moyens les plus adaptés pour l’analyse des perturbateurs endocriniens (Stanczyk et Clark, 2010). Les limites de détection relevées tableau 9 en témoignent. Tableau 9 : Techniques d'analyse utilisées pour la quantification des différentes classes de perturbateurs endocriniens dans l'environnement aquatique Classe de polluants Hormones stéroïdes Alkylphénols Phtalates Bisphénol A Type d'échantillon Séparation Détection LD (ng/l) Référence Entrée station/ Sortie station Sortie station Sortie station LC MS/MS Stavrakakis et al., 2003 GC LC IC-MS DAD MS (ESI) de 0,1 à 0,3 112 2-500 Entrée station/Sortie station Sortie station LC 0,08-0,9 Baronti et al., 2000 LC MS/MS (ESI) MS/MS 5-10 Lagana et al, 2004 Sortie station Entrée station/ Sortie station Entre station/Sortie station Sortie station Sortie station GC LC MS/MS MS/MS 1 0,2-0,5 Kelly, 2000 Johnson et al., 2000 LC MS/MS de 0,5 à 10 Stavrakakis et al., 2008 LC LC APCI-MS APCI/ESI 500 20-100 Castillo et al.. 2000 Petrovic et al., 2003 Sortie station LC 500 20-100 Ahel et al, 2000 Petrovic et al., 2003 Entrée station/ Sortie station Entre station/Sortie station Entrée station/ Sortie station Entre station/ Sortie station LC LC UV APCI/ESI MS APCI-MS UV MS-APCI 0,06-0,1 500 11 0,06-0,1 Castllo et al, Ahel et al, 2000 Stavrakakis et al., 2008 Castllo et al, GC GC LC GC MS MS/MS n. p. 11 Lee et Peart, 2000 Stavrakakis et al., 2008 Entre station/ Sortie station LC MS/MS n. p. Lee et Peart, 2000 LD = Limite de détection 55 Xiao et al., 2001 De Alda et Barcelo, 2001 Le couplage chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse (LC/MS) permet d’analyser des composés non volatils, ou des composés thermiquement instables qui ne pourraient pas être analysés par GS/MS ou seulement après une première étape de dérivation chimique. De plus, la conception des interfaces d’ionisation (ESI Ionisation Electrospray et APCI Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique) ont permis d’améliorer les limites analytiques. Concernant les oestrogènes naturels et synthétiques, leur détermination dans les eaux usées est une tâche difficile à cause de la complexité de la matrice et leur analyse en GC-MS et GC-MS/MS est difficile. La LC-MS et la LC-MS/MS sont des technologies applicables à un large éventail de matrices et ne requiert pas de dérivation préalable. 2) Bioessais, méthodes immunochimiques Dans la section VII.A, les méthodes in vitro ont été présentées comme des outils analysant la perturbation du système endocrinien. Cependant, certaines méthodes in vitro peuvent identifier des xéno-hormones. Bien que le dosage immuno-isotopique ou RIA (Radioimmunoessay), méthode en phase liquide utilisant un anticorps secondaire radioactif, soit efficace pour déterminer la présence d’oestradiol et de stéroïdes (Xing et al., 1983; Riffle et al., 2013), la technique ELISA est une technique valable pour détecter et doser plusieurs polluants environnementaux connus pour perturber les systèmes endocriniens. Ainsi la technique ELISA a été développée pour détecter de façon spécifique le bisphénol A (Verderame et al., 2011; Lu et al., 2012) avec une limite de détection variant de 0,1 à 0,05 µg/l selon l’anticorps utilisé. Plus récemment, des tests ELISA multiplex ont été developpés (Marquette et al., 2012), pour la détection et le dosage simultané de plusieurs produits chimiques, dont certains sont des perturbateurs endocriniens, comme par exemple le 2,4Dichlorophenoxyacetic (Desmet et al., 2013). Les applications biologiques se sont développées sur des échantillons type plasma, urine, par exemple, et se sont étendues aux applications environnementales, d’abord axées sur des échantillons d’eau plus ou moins complexes (eaux de surface, eaux souterraines, effluents de station d’épuration). Il est désormais possible de trouver de nombreux kits commerciaux pour détecter des substances chimiques pouvant perturber le système endocrinien (comme les PCB) ou des kits plus globaux détectant les oestrogènes. Selon les modèles, il est possible de 56 doser soit réellement un des oestrogènes (oestradiol, oestrone, éthynilestradiol), soit des analogues structuraux des oestrogènes. De même des tests ELISA ont été développés pour détecter l’oestradiol (Chiu et al., 2011; Handelsman et al., 2013) avec une limite de détection de 1nM (Xin et al., 2009; 2008). Les techniques utilisant la chimiluminescence permettent de détecter l’E2 à des concentrations pouvant atteindre 1,48 ng/l (Xin et al., 2010). Le tableau 10 donne une liste non exhaustive de kits actuellement disponibles. Il présente des kit qui diffèrent au niveau des molécules ou familles de molécules ciblées, du type de matrice environnementale et de la gamme de concentrations. Tableau 10 : Exemples de kits commerciaux. Les NQE (définitives ou en proposition, http://www.ineris.fr/substances/fr/page/9) sont données à titre indicatif. Paramètre Méthode Matrice Gamme de calibration NQE Acétochlore et autres acétanilides Particules magnétiques Eau, sol 0,10 à 2,5 µg/l 0,3 pg/l (alachlor) 0,3 µg/l (alachlor) Alachlore Particules magnétiques Sol, eau 0,05 à 5,0 µg/l Aldicarbe Particules magnétiques Eau 0,25 à 100µg/l Alkyphénols éthoxylés Microplaques Eau, effluent 20 à 1000 µg/l Alkylphénols Microplaques Eau, effluent 5 à 500 µg/l Alkylphénols Ethoxylates Particules magnétiques Eau 20 à 1000 µg/l Microplaques Eau 20 à 1000 µg/l Atrazine et triazines Particules magnétiques Sol, eau 0,04 à 5,0 µg/l Microplaques Eau 0,02 à 1,5 µg/l Microplaques Eau, sédiment, sol, 0,03 à 3 µg/l Composés benzéniques Mesure «total BTEX» Particules magnétiques Eau, sol 0,9 à 30 mg/l (sol) 0,02 à 3,0 mg/l (eau) Bisphénol A Particules Effluent 5 à 500 µg/l Particules magnétiques Eau 0,05 à 10,0 µg/l Carbendazime/Bénomyl Particules magnétiques Eau 0,10 à 5,0 µg/l Carbaryl Particules magnétiques Eau 0,25 à 5,00 µg/l Carbofuran Particules magnétiques Eau 0,25 à 5,00 µg/l Chlorpyrifos Particules magnétiques Eau 0,22 à 3,0 µg/l 0,3 µg/l (alkylphénols) 16 µg/l (atrazine) 0,01 à 0.07 mg/l 0,03 µg/l DDT/DDE/DDD Particules magnétiques Eau, sol 1,25 à 75,0 µg/l Diuron et phénylurée Particules magnétiques Eau, sol 0,03 à 3,0 µg/l 0,2 µg/l 2,4-D Particules magnétiques Eau Sol 0,7 à 50 µg/l 0,15 à 7,5 mg/l 0,3 µg/l Oestrogènes totaux Particules/Microplaques Eau 0,1 à 3,0 µg/l Isoproturon Particules/ Microplaques Eau 0,05 à 0,5 µg/l LAS surfactant alkylés Particules magnétiques Eaux, effluent 20 à 1000 µg/l Méthomyl Particules magnétiques Eau 0,45 à 15,0 µg/l 57 0,3 µg/l Paramètre Méthode Matrice Gamme de calibration NQE Métalochlor Particules magnétiques Eau, sol 0,05 à 5,0 µg/l 0,3µg/l (alachlor) PCB Particules magnétiques Sol 20, 50, 100, 500mg/l Eau Sol 10 µg/l2000 mg/l 2-2000 mg/l Eau Sol 0.5 à 10µg/l 0,5 à 10 mg/l HAP Pentachlorophénol Particules magnétiques Particules magnétiques Eau Sol HAP totaux 0,02 à 2,4 µg/l 1 à 1000 mg/l Eau Sol Equivalent phénanthrène 0,93 à 66,5 µg/l 0,2 à 5,0 mg/l Eau Sol Equivalent benzo[a]pyrène 0,04 à 10,0 µg/l 10 à 500 µg/l Eau Sol 5 à 500 µg/l 0,5 à 50 mg/l Eau Sol 0,06 à 10 µg/l 0,1 à 10,0 mg/l 0,4 µg/l 3) Détection de la perturbation oestrogénique dans l’environnement et les eaux usées via le Yeast Estrogen Screen (YES) Bien que le test YES s’avère moins sensible que les tests utilisant les cellules de mammifère comme l’ER-CALUX, dans le cas de cours d’eau recevant des flux importants d’eaux usées, ce test semble être une solution adaptée pour déterminer la teneur en oestrogènes (Nelson et al., 2007). En effet, un problème majeur, dans l'utilisation de tests in vitro pour analyser les échantillons environnementaux, est la présence de composés inhibiteurs/cytotoxiques. Ces échantillons sont souvent contaminés par des substances autres que les xéno-oestrogènes et peuvent interférer avec la croissance et la viabilité des cellules animales. En revanche, cette cytotoxicité est moindre pour les levures. Finalement le choix du système cellule de mammifère/levure va dépendre de la balance entre la limite de détection à atteindre (c’est-à-dire la sensibilité du test) et le rapport coût/facilité de mise en œuvre. De plus, le système «levure» a un certain nombre d'avantages par rapport à d'autres systèmes. En effet, il ne présente pas de récepteurs d'hormones stéroïdiennes endogènes. Par conséquent, ce 58 système manque d’interactions complexes entre l'ER et d'autres récepteurs (Routledge et Sumpter, 1996). En outre, étant donné que l'ER est transfecté dans la cellule, il n'y a aucune préoccupation concernant l'effet des récepteurs mutants ou variants, qui sont connus pour être présents dans des lignées de cellules contenant leur récepteur comme les cellules MCF-7 (Pfeffer et al., 1996). Un inconvénient du bioessais à base de levure est la présence d'une paroi cellulaire et des mécanismes de transport actifs qui peuvent être différents de ceux trouvés dans les cellules de mammifères et qui sont susceptibles d'affecter l'activité de certains composés testés (Legler et al., 2002b). Dans les échantillons d'eau, peuvent se retrouver en mélange des substances oestrogéniques de faible puissance (comme les alkylphénols) pouvant être présents en grande quantité et des composés ayant une activité oestrogénique très élevée (comme les oestrogènes synthétiques ou naturels) présents à l’état de trace. Le comportement additif de l'activité oestrogénique des substances individuelles dans un mélange a été démontré et constitue la base pour évaluer quantitativement la teneur totale de l'activité oestrogénique dans un échantillon via l'utilisation de dosages in vitro. Ainsi, l’oestrogénicité totale d’un échantillon est comparée à l’amplitude de réponse provoquée par l’hormone naturelle E2. De ce fait, pour pouvoir calculer une activité oestrogénique totale en fonction de la réponse des tests, les résultats obtenus sont comparés à la concentration du 17-β oestradiol (hormone naturelle) qui produirait le même effet biologique en utilisant le bioessais. On définit alors un indice exprimé en équivalent 17-ß-oestradiol (EEQ) correspondant au potentiel oestrogénique. Lorsque cet effet est évalué pour un composé ou un mélange de composés, il faut alors définir ce facteur d'équivalence en 17-ß-oestradiol (FFA ou EEF selon les données de la littérature) : où Ci est la concentration de l'espèce i. Les potentiels oestrogéniques de certains composés ont été ainsi déterminés et ils sont spécifiques à chaque bioessai utilisé (Nguyen 2011). L'utilisation de l'essai in vitro YES a démontré une activité oestrogénique des eaux usées et des eaux de surface dans de nombreux pays. En effet, de nombreuses études ont donc été faites avec le YES sur des matrices complexes comme les eaux de station d’épuration de façon à déterminer les concentrations en xéno-oestrogènes présents. Ce bioessais a été utilisé 59 en entrée et en sortie de stations d’épuration (Xm et al., 2008; Tilton et al., 2002). Par exemple, dans une enquête nationale néerlandaise (Vethaak et al., 2002), le test YES a été appliqué pour mesurer l'activité oestrogénique d’échantillons d'eaux usées et d’eaux de surface. Dans presque la moitié des échantillons d'eau de surface, la réponse de l'essai YES était inférieure à la limite de détection. L'activité oestrogénique des eaux de surface de la Meuse est, en moyenne, de 0,04 ng/l EEQ (moyenne obtenue sur trois saisons échantillonnage). La plupart des effluents des STEP ont également montré une activité oestrogénique en-dessous de la limite de détection. En général, l'activité oestrogénique est intensément réduite (de 88 à 99,9% d'élimination) par un traitement des eaux usées. Cependant, il est apparu que l'activité oestrogénique dans les effluents était plus élevée que dans les eaux réceptrices (Vethaak et al., 2002). Une étude menée, en Belgique, sur des rivières et des effluents des eaux usées de STEP municipales a montré que l’activité oestrogénique de l'eau de surface était plus importante par rapport à celle de l'effluent (Witters et al., 2001). Sur 16 échantillons analysés, les activités oestrogéniques varient de 2 à 85 ng/l EEQ et plus de 7 échantillons ont des valeurs dépassant 10 ng/l EEQ (Witters et al., 2001). De même, Thomas et al., (2001) ont utilisé le test YES pour évaluer l’activité oestrogénique d’eaux usées et de surface (estuaire au Royaume-Uni) et ont trouvé un maximum de 24 ng/l EEQ (Thomas et al., 2001). Des études similaires ont été faites aux Etats-Unis (Huggett et al., 2003), en France, ou encore au Japon (Tashiro et al., 2003). Le tableau 11 résume les données de la littérature concernant l’utilisation du YES dans des matrices environnementales. Tableau 11 : Niveaux des EEQ trouvés dans différentes matrices environnementales analysées dans de nombreux pays en utilisant le test in vitro YES. (Onda et al., 2002; Arijs et al., 2002) Matrice Affluents d'eaux usées Effluents d'eaux usées EEQ 35-72 (ng/l) 0,1 to 150 (pM) < LD (4,46 ng/l) 0,1-15 (ng/l) 21-147 (ng/l) 4-35 (ng/l) < LD (81,4 ng/l) Eau de surface <24 (ng/l) 10 (ng/l) < LD (23,5 ng/l) < LD : inférieur à la limite de détection Pays Japon Chine Belgique Etats Unis Etats Unis Japon Belgique Angleterre Japon Afrique du sud 60 Référence Onda et al., 2002 Li et al., 2008 Witters et al., 2001 Huggett et al., 2003 Tilton et al., 2002 Onda et al ., 2002 Witters et al., 2001 Thomas et al., 2001 Tashiro et al., 2003 Arijs et al., 2002 C. Biocapteurs pour le suivi des PE dans l’environnement Dans un contexte de contrôle et de surveillance de la qualité des ressources en eau, la détection de substances cibles, pouvant engendrer des effets sur le système hormonal, nécessite de développer des biocapteurs compatibles avec une mesure sur site et plus spécifiquement intégrés dans un système d’alerte en ligne répondant aux préoccupations des gestionnaires et traiteurs d’eau. 1) Définition Un biocapteur est un système analytique qui convertit une réponse biologique en un signal physique mesurable (Blum et Coulet, 1991). Il associe un bio-récepteur, espèce biologique permettant la reconnaissance sélective de la molécule cible, et un transducteur permettant de détecter et/ou de quantifier les biomolécules dans les aliments, les matrices environnementales ou dans les liquides biologiques (figure 16). Selon l’IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), un biocapteur doit être petit et compact, avoir un signal réversible, donner des concentrations fiables et établir une connexion réelle entre le matériel biologique et le transducteur. Figure 16 : Schéma du principe de fonctionnement d'un biocapteur d’après Minh, 1991 Les biocapteurs peuvent être classés suivant différents critères Par type de bio-récepteur : enzymes, anticorps, cellules entières… Par mode de transduction : optique, électrochimique, thermique ou massique. Par type d'interaction entre le bio-récepteur et la substance cible : affinité, biocatalyse, hybridation. 61 Le choix du bio-récepteur dépend de l’analyte recherché. Au fil des années, différents bio-récepteurs ont été développés. Les plus communs sont les enzymes, les anticorps, les acides nucléiques (ADN, ARN) et les récepteurs de molécules biologiquement actives (hormones, toxines, facteurs de croissance). Il est également possible de concevoir des biocapteurs à base de cellules entières (Rodriguez-Mozaz et al., 2004) (figure 17). Figure 17 : Représentation des différents types de bio-récepteurs (Montrose, A. thèse de doctorat 2013) Le type de transducteur est choisi en fonction des modifications biochimiques et/ou physico-chimiques se produisant au niveau du bio-récepteur. Le transducteur convertit ces changements en signaux électriques mesurables qui sont amplifiés et traités par des circuits électroniques. Les plus utilisés reposent sur l’optique, la calorimétrie, la piézoélectricité et l’électrochimie. L’objectif du développement d’un biocapteur est d’aboutir à un dispositif de taille réduite (portatif) permettant de détecter, d’alerter, voire de doser directement un polluant, de façon rapide, de préférence sans nécessiter l’ajout d’autres réactifs ou de prétraitement de l’échantillon (Dejous, 2005). Concernant les PE, deux classes de biocapteurs sont pris en compte : les biocapteurs qui mesurent les effets perturbateurs du système endocrinien, et les biocapteurs qui répondent à la présence d'une substance spécifique (ou groupe de substances) fondés sur la reconnaissance spécifique d'une biomolécule. Les bio-récepteurs les plus utilisés pour développer ces biocapteurs sont des bio-récepteurs d’affinité (anticorps, acide nucléique ou récepteur membranaire) ou des bio-récepteurs métaboliques. Le tableau 12 résume les applications possibles des biocapteurs dans l’environnement pour détecter les perturbateurs endocriniens. 62 Tableau 12 : Biocapteurs électrochimiques pour l'analyse environnementale, d’après Farré et al 2009 Analyte Atrazine Isoproturon Type et base Test d'inhibition avec détection optique Dosage indirect avec détection TIRF Triazines Test d'inhibition avec détection SPR Surface inhibition test avec détection de changement de l'indice réfraction Immunodosages compétitifs avec détection par fluorescence Immunodosage compétitif avec détection SPR Immunocapteur optique basé sur la fluorescence Immunocapteur optique basé sur la fluorescence Pesticides DDT et dérivés Hormones Bisphénol A Alkylphenols et leurs éthoxylates Nonylphénol Surfactants Immunocapteur SPR Immunocapteur utilisant la transduction électrochimique Immunocapteur utilisant la transduction électrochimique Biocapteur ampérométrique à cellules entières en utilisant Pseudomonas et Achromobacter Sensibilité 1–10 μg/L 0.01– 0.14 μg/L 0.16 μg/L 15 μg/ml Ref. Skladal, 1999 Mallat et al., 2001 Harris et al., 1999 Bier et al., 1994 Tschmelak et al., 2005 15 ng/L Mauriz et al., 2007 Sub-ng/L Tschmelak, et al., 2006 Rodriguez-Mozaz et al., 2004 Marchesini, et al., 2005 μg/L Rose et al., 2002 10 μg/L Evtugyn et al., 2006 25 mg/l Taranova et al., 2002 2) Bio-récepteurs d’affinité Dans cette classe de bio-récepteurs, se retrouvent principalement les anticorps, les récepteurs membranaires et les acides nucléiques. Ils forment un complexe, le plus souvent réversible, avec l’analyte et présentent l’avantage d’avoir une grande sélectivité et une forte affinité pour son ligand. Les biocapteurs utilisant des anticorps, ou immunoglobines et leurs dérivés sont appelés immunocapteurs. Ils reposent sur la reconnaissance moléculaire spécifique des anticorps avec les antigènes correspondants. De tels biocapteurs ont été développés pour détecter les perturbateurs endocriniens et leurs effets. En effet, le développement d’immunocapteurs optiques et électrochimiques permettent de détecter des PE comme le bisphénol A (Gerardo et al., 2005; Rodriguez-Mozaz et al., 2007) à des concentrations pouvant atteindre 0,4 µg/l. En utilisant la technologie SPR (Surface Plasmon Resonance), la limite de détection peut atteindre 0,14 µg/l de bisphénol A dans les effluents de stations d’épuration, ce qui est comparable aux résultats obtenus par le test ELISA ou par HPLC (Hegnerová et al., 2010). Cette technologie permet également de 63 détecter le benzo-a-pyrène, l’atrazine et le nonylphénol à des concentrations de 0,07 µg/l, 0,16 µg/l et 0,26 µg/l respectivement. Le temps d’analyse est de 45 min (Dostálek et al., 2007). D’autres substances chimiques comme certains pesticides, des alkylphénols sont analysés en utilisant des immunocapteurs. L’oestradiol peut également être détecté dans des échantillons d’urine et des échantillons d’eau (Ojeda et al., 2012; Butler et al., 2006). De récents travaux ont permis d'optimiser la détection de cette hormone naturelle couplée à la détection du diéthylstilbestrol dans des gammes de concentrations allant de 0,095 ng/l à 100 µg/l (Zhang et al., 2014). De même, la détection des effets de produits chimiques ou d’effluents peut être réalisée en utilisant des biocapteurs d’affinité. Des anticorps monoclonaux anti vitellogénine de carpe ont été développés (An et al., 2007) pour permettre le développement de biocapteurs électrochimiques, optiques ou piézoélectriques (Darain et al., 2004; Bulukin et al., 2007; Kim et al., 2008a). La détection de cette protéine dans le plasma des poissons est un indicateur d’exposition environnementale aux oestrogènes. Des biocapteurs d’effet oestrogénique exploitent les capacités de ces substances à se fixer sur le récepteur aux oestrogènes immobilisé à la surface d’un transducteur. Le récepteur aux oestrogènes est alors un bio-recepteur constituant un élément du biocapteur. Le récepteur oestrogénique d’origine humaine est le plus souvent utilisé (Murata et al., 2003). Différents modes de transduction comme la fluorescence (McLachlan et al., 2011), la SPR, la voltamétrie cyclique (Murata et al., 2001; Zheng et al., 2013) ont été proposés. Des systèmes portables utilisant la technologie SPR ont été développés (Soelberg et al., 2005). Un biocapteur comportant des nanotubes de carbone fonctionnalisé avec le récepteur oestrogénique humain (ERα) utilisant un transistor à effet de champ comme transducteur a été proposé. Le temps de réponse est extrêmement rapide (2 min). Le développement d’aptamères ADN ou ARN et le développement des MIP (Polymères à Empreinte Moléculaire) ont permis de remplacer les anticorps comme biorécepteur d’affinité et de détecter des molécules de petites tailles (<400 Da dites hapten). Ces molécules ont été développées pour plusieurs composés ayant des activités oestrogéniques comme le bisphénol A (Jo et al., 2011; Ragavan et al., 2013.), l’oestradiol (Yildirim et al., 2012) ou encore certains myco-estrogènes comme l’ochratoxine A (Rhouati et al., 2013; Hayat et al., 2013). Les MIP ont l’avantage d’être moins affectés par la matrice de l'échantillon. En revanche leur affinité pour le ligand est inférieure à celle des anticorps. 64 3) Bio-récepteurs métaboliques et cellulaires Les bio-récepteurs catalytiques ou métaboliques sont souvent choisis pour leur capacité de reconnaissance et leur forte activité à de faibles concentrations. A la différence des bio-récepteurs d’affinité, la réponse du biocapteur métabolique est basée sur une réaction catalysée par des macromolécules. Concernant les perturbateurs endocriniens, les biorécepteurs enzymatiques ont été utilisés afin de développer des biocapteurs sensibles pour la détection du bisphénol A ou de certains pesticides. Pour les premiers, la tyrosinase cible les composés phénoliques (Portaccio et al., 2010; Wu et al., 2012; Dempsey et al., 2004.). L'acétylcholinestérase ou AChE est une hydrolase dont l’activité est inhibée en présence de certains insecticides organophosphorés et carbamates. Ces propriétés ont largement été utilisées pour développer des biocapteurs (Dhull et al., 2013; Zejli et al., 2008; Andreescu et Marty, 2006; Bucur et al., 2006; Ganesana et al., 2011). Les biocapteurs à enzymes permettent d’atteindre un seuil de détection satisfaisant mais posent des problèmes de stabilité dans le temps. Les biocapteurs cellulaires ou microbiens utilisent des microorganismes vivants comme élément de reconnaissance pour mesurer les changements physiologiques causés par un stimulus interne ou externe. Plusieurs types de microorganismes ont été utilisés, des bactéries, des levures, des algues, pour détecter la perturbation endocrinienne ou des composés classés comme perturbateurs endocriniens (Taranova et al., 2002; Védrine et al., 2003). Ces biocapteurs cellulaires peuvent mesurer l’activité métabolique (consommation d’O2, production de CO2 etc..) et leur état rend compte d’une toxicité oestrogénique (Van Ginkel et al., 2010). En revanche, leur réponse est moins rapide que celle d'un biocapteur enzymatique. Certains bio-récepteurs sont des microorganismes génétiquement modifiés qui ont été développés pour mesurer un contaminant spécifique. Par exemple, biocapteur basé sur une souche de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiés qui, en présence d'un composé oestrogénique produit la luciférase de luciole et a été appliquée pour la détection d’une myco-estrogène, la zéaralénone (Välimaa et al., 2010). 4) Application des biocapteurs pour le contrôle environnemental L'application de nouveaux biocapteurs à des échantillons environnementaux est l’étape finale du développement du système de détection. Les échantillons les plus souvent analysés sont les eaux de surfaces, les eaux potables et les eaux souterraines. Les applications dans les matrices réelles sont primordiales pour déterminer leur effet sur la réaction biologique. Cette 65 dernière peut être affectée par le pH, la force ionique de la matrice ou l’apport d’autres substances naturelles comme le carbone organique dissous qui peut, par exemple, interférer avec les interactions antigène-anticorps (Wanekaya et al., 2008). De nombreux biocapteurs enzymatiques ont été appliqués à l’analyse de contaminants dans des échantillons environnementaux. Le plus souvent, l’élément de transduction associé est électrochimique (détection ampérométrique ou potentiométrique). Le principal avantage de ce mode de transduction est son faible coût, une bonne reproductibilité et la possibilité d’utiliser des électrodes jetables. L'instrumentation est également facilement disponible, peu coûteuse et compacte, ce qui permet d'effectuer des mesures sur site. Les limites des mesures ampérométriques sont dues aux interférences potentielles de composés électro-actifs présents dans l'échantillon lorsque l'on travaille à des potentiels élevés. L'utilisation de médiateurs d'oxydoréduction permet de limiter ces problèmes d'interférences. De ce fait de nombreuses applications ont été développées dans le domaine de l’environnement (tableau 13). Par exemple, l’équipe de Kim et al., a optimisé une électrode à tyrosinase pour mesurer des pesticides dans des échantillons d’eau (Kim et al., 2008b). Tableau 13 : Biocapteurs électrochimiques pour l'analyse environnementale. D’après Farré et al 2009 Analyte/Effet Biocapteur : type et base Matrice AChE, BChE. détection Potentiométrique Tyrosinase immobilisée sur différents supports de carbone avec une détection ampérométrique Immunocapteur potentiométrique Echantillons synthétiques Eau potable et eau de surface Eau Electrodes de diamant dopée au bore et avec une tyrosinase modifiée, détection ampérométrique ADN ampérométrique Eau 10−6 M pour le bisphénol A Eau Babkina et al., 2005 Organophosphate s Mono-Nanotube de Carbone Biocapteur avec cellules entières détection ampérométrique Eau Parathion Activité enzymatique parathion hydrolase avec une détection ampérométrique Biocapteur ampérométrique basé Eau de rivière 4,0 × 10−11, 1,0 × 10−10, 1,0 × 10−9, 5,0 × 10−9 M pour le Cu(II), Pb(II), Cd(II), Fe(III), respectivement concentration du phosphate dans les systèmes marins est de 0,04 mg/l 10 µg/l Phenanthrene Fahnrich Carbamates Bisphénol A Bisphénol A Bisphénol A, 17-βestradiol Métaux lourds Hydrocarbures 66 Eau Limite de Détection 1,5 × 10−5– 2,5 × 10−3 M 0,02 μM 0.6 ng/ml Ref. Ivanov et al., 2000 Mita et al., 2007 Piao et al., 2008 Notsu et al., 2002 Liu et al., 2007 Sacks et al., 2000 Analyte/Effet aromatiques polycycliques Surfactants Biocapteur : type et base Matrice sur des électrodes sérigraphiées Biocapteur ampérométrique bactérien Eau Limite de Détection LOD de 2 µg/l 0,25 mg/l Ref. et al., 2003 Taranova et al., 2004 Par la suite, des travaux ont été entrepris pour automatiser ces systèmes. Quelques outils ont été développés, par exemple le système RIANA est un immunocapteur optique qui détermine la concentration de pesticides et de perturbateurs endocriniens. Il a été utilisé dans différentes matrices environnementales comme les eaux de rivière, les eaux des surfaces, les aqueducs. Le système AWACSS est une amélioration du système RIANA qui permet de détecter 32 composés simultanément par réaction immunologique (Rodriguez-Mozaz et al., 2009) . Ces deux systèmes automatiques de détection, fruits de travaux de recherche au niveau européen, ont été appliqués à l’analyse de pesticides présents dans des échantillons réels, de certaines substances prioritaires (DCE) et de perturbateurs endocriniens. Le tableau 14 présente les polluants analysés, les limites de détection ainsi que les matrices étudiées. 67 Tableau 14 : Liste des polluants organiques analysés par les systèmes RIANA ou AWACSS, soit seul, soit en multi-analytes d'Après Rodriguez-Mozaz et al., 2008. Analytes LOD (ng/l]) Matrice aqueuse Référence Paraquat 10 Eau Milli-Q et rivière Mallat et al., 2001 Isoproturon 10 Eau Milli-Q et rivière Mallat et al., 2001 Triazines 60-200 Eau de rivière Mallat et al., 1999 Propanil 0,6 Eau Milli-Q Bisphénol A 14 Station hydraulique Progestérone 0,37 Eau Milli-Q, eau potable et rivière Tschmelak et al., 2004 Rodriguez-Mozaz et al., 2005 Tschmelak et al., 2004 Testostérone 0,2 Eau de surface Estrone 0.2 1 Eau Milli-Q Tschmelak et al., 2006 Hua et al., 2005 Sulphonamides 2.7-6.6 Eau potable, eau de surface et souterraine Tschmelak et al., 2004 Eau Milli-Q Barzen et al., 2002 Détermination multi-analytes Atrazine 30 Simazine Isoproturon 30 110 Alachlore 70 2,4-D 70 PCP 4 230 Isoproturon 50 Atrazine 160 Estrone 80 Bisphénol A 5 Atrazine 2 Eau Milli-Q et eau de surface Estrone 19 Eau souterraine Isoproturon I6 Rodriguez-Mozaz et al., 2004; 2006 2,4-D : 2,4-dichlorophénoxyacétique, PCP : Pentachlorophénol 68 Tschmelak et al., 2004 Chapitre II : Résultats et discussions 69 I. Observation et détection des effets biologiques des xéno-oestrogènes Pour protéger quantitativement et qualitativement les masses d’eau ainsi que les habitats des espèces qu’elle abrite, il est nécessaire d’utiliser des outils permettant d’établir un diagnostic sur leur état chimique et biologique. La surveillance de la qualité de l’eau et de surcroît de la qualité de l’environnement peut se faire suivant deux approches : (i) la détection des polluants et leur quantification; (ii) l’évaluation des effets des polluants sur les organismes vivants, soit à l’échelle des individus, soit à l’échelle des populations et des communautés (Adams, 2002). La première approche, renseigne sur la nature du polluant et sa concentration, mais ne renseigne pas sur l’impact qu’il peut avoir sur un organisme. La seconde approche permet l’évaluation des perturbations environnementales et anthropiques sur les organismes et sur les écosystèmes à plus ou moyen long terme. Ces organismes, choisis selon le temps de réponse aux perturbations ou selon leur représentativité du milieu, sont des bio-indicateurs de l’état de l’environnement et donc de la qualité des eaux. Le choix des indicateurs dépend donc de la problématique abordée. Les indicateurs qui ont un temps de réponse court (heures, jours), comme les bioessais in vitro (Microtox, Daphtoxkit), ont certes une signification écologique faible mais permettent d’identifier des effets de contaminants pris individuellement ou en mélange et ainsi détecter des signaux précoces de la perturbation environnementale. Combinés à la détection et à la quantification des polluants, ces outils renseignent sur l’état de l’environnement sur une période donnée. Le premier aspect abordé ici est l’utilisation d’indicateurs, ayant un temps réponse relativement lent (mois, années), dont la signification écologique est forte et permet une bonne évaluation des effets à long terme d’une perturbation. Dans ce cadre, les poissons ou les amphibiens sont très régulièrement utilisés comme bio-indicateurs pour la détection d’une perturbation anthropique. Ils ont été durant longtemps (et le sont encore) ceux qui indiquent la présence de perturbateurs endocriniens en raison de la grande similitude de leur système hormonal avec celui de l’homme (Casanova-Nakayamaet al., 2011). Les études portent, le plus souvent, sur l’étude de la production de la vitellogénine (protéine permettant la production du jaune des œufs chez les poissons femelles) (Petrovicet al., 2002). La production de cette protéine, en présence d’un contaminant chimique peut être activée chez les sujets mâles. Parmi ces « imposteurs endocriniens », on retrouve des produits chimiques comme le nonylphénol, le bisphénol A, les PCB, certains pesticides utilisés en agriculture, certains métaux lourds, certains produits de soin comme les parabènes, les muscs mais aussi des effluents particuliers comme des effluents de papetières. Les effluents contenant ces 70 contaminants peuvent donc avoir un réel impact sur la qualité de l’environnement et notamment sur la qualité des environnements côtiers (estuaires). Or, ces zones particulières sont des habitats de choix pour certaines espèces de poissons. Dans un premier temps, nous avons étudié l’impact des rejets de certaines industries déversés dans le golfe de Gabès, sur les malformations squelettiques d’une variété de poisson fortement présent dans ces zones, l’Aphanius fasciatus. Dans un second temps, les travaux mettront en évidence la pertinence de l’utilisation de bioessais in vitro comme le Yeast Estrogen Screen (YES) pour détecter ces « imposteurs hormonaux » dans les eaux environnementales et pour déterminer le potentiel oestrogénique de composés industriels. Ces composés sont des composés naturels ou des substances synthétiques provenant de produits de consommation courante ou d’activités industrielles et présentent un effet endocrinien involontaire. C’est en transitant via les stations d’épuration que ces contaminants gagnent les cours d’eau où ils produisent des effets perturbateurs visibles et inquiétants impactant l’intersexualité des poissons. Or, l’efficacité d’une station d’épuration (STEP) et le contrôle de la qualité des rejets est évaluée sur la base de paramètres physico-chimiques et non sur les effets résiduels engendrés par les contaminants. Parmi ces effets résiduels, l’effet oestrogénique est l’un des plus recherchés. Le bioessais YES est donc utilisé pour détecter ces effets résiduels spécifiquement au niveau des stations d’épuration ou dans des cours d’eau fragilisés par les apports d’effluent industriels et de STEP. Ce bioessais est également un outil intéressant pour identifier les nouveaux polluants dits pseudooestrogènes (ou xéno-oestrogènes). A. Observation des effets biologiques sur les écosystèmes côtiers tunisiens : étude des déformations squelettiques chez Aphanius faciatus. Au cours de ces dernières décennies de nombreux travaux scientifiques tentent de montrer l’effet des contaminants environnementaux sur le système de reproduction et de développement des organismes aquatiques notamment. Cette première partie est consacrée à l’analyse de certains perturbateurs endocriniens oestrogéniques communément retrouvés dans l’environnement côtier du golfe de Gabès recevant des rejets industriels et urbains contenant des métaux lourds (Cu, Zn et Cd), des HAP, des oestrogènes (E1, E2, E3 et EE2), pour expliquer la fréquence élevée des déformations squelettiques observées chez une espèce de poisson Aphanius fasciatus collectée dans cette région. 71 L’étude est limitée autour du Golfe de Gabès sur quatre sites (figure 18). Le site S1 dit côte de Luza est le site de référence. Les trois autres sites se différencient par les types de rejets qu’ils reçoivent. Le site S2 est la côte limitrophe de Sfax et est sujet à de fortes pollutions industrielles (usines de traitement du phosphate et industries chimiques). La côte de Kniss (site S3) et l’Oued Hamdoun (S4) sont soumis à une pollution due à l’activité agricole des villages avoisinants, aux activités de la zone industrielle de Monastir, aux activités aquacoles et aux activités urbaines. L’étude est menée sur une période qui s’étend de 2007 à 2010. Les résultats de ces travaux ont été publiés dans Chemosphere, Volume 90, Issue 11, Mars 2013, Pages 2683–2689. Figure 18 : Localisation géographique des sites d’échantillonnage La présence de contaminants dans les milieux aquatiques se traduit souvent par diverses manifestations sur les espèces autochtones au niveau morphologiques, histopathologiques et cellulaire…Certaines de ces manifestations peuvent être utilisées comme biomarqueurs d'exposition. L’évaluation des malformations squelettiques est l'une des méthodes les plus simples pour étudier les effets de la contamination sur les poissons en raison de la facilité de reconnaissance par rapport aux autres types de biomarqueurs (Sun et al., 2009). Dans cette étude, une évaluation des anomalies squelettiques a été faite chez des individus prélevés dans les quatre zones. Les résultats obtenus montrent que le pourcentage de déformations dans la population d’Aphanius fasciatus, analysée sur le site de référence S1, avoisine 5%, ce qui est cohérent avec les résultats de la littérature (Sassi et al., 2010). Les sites S3 et S4, qui reçoivent des rejets urbains et industriels présentent moins de 5% de déformations. En revanche, la fréquence des malformations est 8 fois plus élevée pour le site pollué S2 que pour le site témoin S1. En effet, le pourcentage de déformations avoisine 18% 72 pour le site S2 entre 2007 et 2010 et peut atteindre 30% lors de la période de reproduction des poissons. Afin d’identifier les causes possibles des déformations retrouvées dans le site S2, nous avons analysé l’occurrence des polluants qui pourraient être produits par une activité industrielle comme les métaux, les HAP et certains oestrogènes naturels et synthétiques. Les résultats montrent que la côte industrielle de Sfax (site S2) est la plus polluée. Elle présente une forte teneur en métaux en comparaison aux autres sites. Par exemple, ce site contient 67 µg/l de zinc dans l’eau, et une teneur en HAP non négligeable (0,1 à 2 µg/g dans les sédiments). La teneur en cadmium est vingt fois plus élevée que les autres sites (figure 19). De plus, les malformations observées sont corrélées avec la présence de taux élevés de cadmium pour le site S2. Des travaux précédents ont montré qu’une contamination en cadmium pouvait induire des déformations chez le poisson zèbre (Cheng et al., 2000). Figure 19 : Niveau de pollution en métaux et en HAP au niveau des quatre sites étudiés. Les résultats obtenus par HPLC montrent, pour tous les sites, la présence d’oestrogènes. Les principaux composés retrouvés sont l’oestrone, l’oestriol et le 17βoestradiol. Les activités oestrogéniques mesurées ne montrent pas de différence entre les sites. L’activité oestrogénique ne permet donc pas d’expliquer la fréquence des déformations observées. En revanche, l’ensemble de ces résultats montre une corrélation entre la présence de contaminants (HAP et éléments trace) en mélange dans l’environnement et les déformations squelettiques observées chez Aphanius fasciatus. 73 Une étude précédente (Kessabi et al., 2010) met en évidence des dosages d’ARNm codant pour le cytochrome P4501A (CYP1A) dans les poissons normaux et anormaux prélevés dans le site S2. Les dosages montrent que le taux d’ARNm CYP1A est 10 fois plus important dans les organismes anormaux. De plus, ce taux d’ARNm chez les organismes normaux prélevés dans le site S2 est comparable à celui retrouvé chez les organismes normaux prélevés dans la zone témoin S1. En revanche le taux d’ARNm codant pour la vitellogénine est le même pour les organismes normaux et anormaux quel que soit le site de prélèvement. Or, il a été montré que le récepteur à la dioxine (AhR) intervient dans l’activation de certains gènes comme celui de CYP1A (voir chapitre 1, IIB). Des travaux ont démontré que cette expression peut être induite par des hydrocarbures aromatiques et récemment par le cadmium (Kluxen et al., 2012) et qu’il y a une relation entre la signalisation du récepteur des oestrogènes et celui de la dioxine like AhR (Matthews et Gustafsson, 2006; Swedenborg et Pongratz, 2010). Ces résultats semblent conforter nos travaux qui montrent un effet combiné des métaux lourds (principalement le cadmium) et des HAP et qui induirait une fréquence élevée de malformations squelettiques chez Aphanius fasciatus. En revanche les causes précises de cette déformation ne sont pas élucidées, cette co-exposition induit une modification des enzymes de biotransformation et indirectement a des effets sur la croissance osseuse de ces espèces. Ce travail est une approche préliminaire pour caractériser les impacts morphologiques chez Aphanius fasciatus dus à des contaminants transportés par des rejets industriels dans le Glofe de Gabès. 74 Chemosphere 90 (2013) 2683–2689 Contents lists available at SciVerse ScienceDirect Chemosphere journal homepage: www.elsevier.com/locate/chemosphere Possible chemical causes of skeletal deformities in natural populations of Aphanius fasciatus collected from the Tunisian coast Kaouthar Kessabi a,⇑, Ali Annabi a, Aziza Ibn Hadj Hassine b, Ingrid Bazin b, Wissem Mnif c, Khaled Said a, Imed Messaoudi a a b c LR11ES41: Génétique, Biodiversité et Valorisation des Bioressources, Institut de Biotechnologie, Université de Monastir, Monastir 5000, Tunisia Ecole des Mines d’Ales, Centre LGEI, 6 av. de Clavieres, 30319 Ales Cedex, France Laboratoire de Biochimie, Unité de Recherche 02/UR/09-01, Institut Supérieur de Biotechnologie, de Monastir, Université de Monastir, 5000 Monastir, Tunisia h i g h l i g h t s " Patterns of skeletal deformities were detected in natural population of Aphanius fasciatus. " The high incidence of spinal deformities was observed in the most polluted site. " The most polluted site is contaminated mainly by heavy metals and organic compounds. " Relation between the observed deformities and chemical pollution was suggested. a r t i c l e i n f o Article history: Received 9 March 2012 Received in revised form 8 November 2012 Accepted 24 November 2012 Available online 20 December 2012 Keywords: Aphanius fasciatus Skeletal deformities Endocrine disruption Organic pollution Metallic pollution Tunisian coasts a b s t r a c t This study attempt to quantify and identify skeletal deformities in natural populations of Aphanius fasciatus collected from the Tunisian coast and tends to found a possible relationship between these anomalies and several types of pollutants presents in the environment. Fish were collected from one reference area (S1: coast of Luza) and three polluted areas (S2: industrialized coast of Sfax, S3: coast of Khniss and S4: Hamdoun’Oued). Various patterns of skeletal deformities were diagnosed using double staining technics, and the levels of heavy metals (Cd, Cu and Zn), various polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and estrogenic compounds were determined in water and sediment from different sites. Spatio-temporal variation of the spinal deformities frequencies in A. fasciatus show that high incidence of spinal anomalies has been recorded in population collected from S2 in comparison to three other ones. Morphological results indicated that skeletal deformities of adult A. fasciatus were grouped into 13 categories that described abnormalities on spines, vertebrae, arcs and mandibles. A total of 1025 abnormalities were quantified. The results of chemical analysis showed that the levels of heavy metals and PAHs were significantly higher in S2 than in S1, S3 and S4. High level of estrogenic activity was observed only in S4. A possible correlation between environmental exposures to a mixture of pollutants in coastal waters in S2 and spinal deformities in A. fasciatus was suggested. Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved. 1. Introduction Spinal deformities have been reported in natural fish populations as well as in farmed fish (Aunsmo et al., 2008; Ayed et al., 2008; Kessabi et al., 2009; Bardon et al., 2009; Messaoudi et al., 2009a; Sun et al., 2009). However, skeletal malformations in farmed fish are very common and are a major problem in aquaculture (Koumoundourous et al., 2001a,b). Whereas, the observation of spinal deformities in wild specimens of teleost fish is relatively rare (Dahlberg, 1970; Da Chuna and Antunes, 1999). ⇑ Corresponding author. Tel.: +216 73465405; fax: +216 73465404. E-mail address: [email protected] (K. Kessabi). 0045-6535/$ - see front matter Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.chemosphere.2012.11.047 While, skeletal malformations in aquaculture appear to be related to a complex interaction of genetic, procedural and infectious/immunological factors (Lall and Lewis-McCrea, 2007; Aunsmo et al., 2008, 2009; Bardon et al., 2009), the presence of deformities in natural populations are most likely related to pollution (Lemly, 2002; Kessabi et al., 2009; Messaoudi et al., 2009a). Indeed, it has been suggested that spinal deformities in natural populations of fish serve as a biomarkers of environmental pollution (De La Cruz-Aguero and Perezgomez-Alvarez, 2001; Antunes and Lopes Da Cunha, 2002; Xuan Yang, 2004). It is well known that a wide variety of chemicals can cause skeletal deformities through such mechanisms by altering the development and bone formation. These include heavy metals such 2684 K. Kessabi et al. / Chemosphere 90 (2013) 2683–2689 as lead (Pb) (Bengtsson and Larsson, 1986), cadmium (Cd), many organophosphorus pesticides, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs), toxaphene (Cheng et al., 2000; Teraoka et al., 2002) and natural estrogenic compounds such as ethinylestradiol (EE2) (Boudreau et al., 2004) and 17 beta-œstradiol (E2) (Urushitani et al., 2002). The Mediterranean killifish, Aphanius fasciatus (Valenciennes, 1821) is a small cyprinodont fish inhabiting brackish waters in coastal habitats of the central and eastern Mediterranean Sea. It tolerates a wide range of physico-chemical parameters, such as temperature (5–39 °C) and salinity (0–180 g L 1). We have recently described, in natural populations of this species collected from the Gulf of Gabes in Tunisia, a complex spinal deformities consisting of a consecutive repetition of scoliosis, lordosis, and kyphosis from the head to the caudal fin. Deformed fish were eight times more frequent in the industrialized coast of Sfax than in the coast of Luza which is unaffected by human activities, possibly indicating a relationship between pollution levels and spinal deformities (Messaoudi et al., 2009b). However, a direct relationship between observed spinal deformities and pollution was not determined in this species. Therefore, this study attempt to quantify and identify skeletal deformities in A. fasciatus populations which is naturally exposed to several types of pollutants. For this purpose fish were collected from three polluted localities: S2, S3 and S4, and from a reference site S1. In addition, heavy metals (Cd, Cu and Zn), PAHs, estrogenic activities and estrogenic compounds were also determined in water and sediment of these sites in order to establish a relationship between these pollutants and the high incidence of spinal deformities detected in A. fasciatus. important industrial activities, mainly crude phosphate treatments and chemical industries, was chosen as a most polluted site. This site is contaminated with heavy metals, essentially Cd. The S1, located 50 km north of S2 apparently unaffected by human activities, was used as reference sample site (Barhoumi et al., 2009; Messaoudi et al., 2009b). Pollution in S3 caused by human activities is related to the proximity of the industries in Monastir South, aquaculture activities, the penetration of the water weir South Bay loaded Khniss of pollutants from the village and neighboring areas of culture, and, particularly through the wadi and the activity of washing the wool. The discharge of hot water by Power station via S4 used for overflow sewage, contributes to a sizeable rise in water temperature, this temperature can reach 36 °C. It also contributes to environmental enrichment in nutrients especially ammonium which is an indicator of urban pollution. 2. Material and methods 2.2.1. Skeletal deformities analysis The double staining method was used to evaluate anomalies observed in specimens. Normal fish and fish showing a morphological deformity were fixed in buffered 10% formalin and stained using the ‘‘Alcian Blue-Alizarin Red’’ double staining method (Park and Kim, 1984). Alcian Blue 8 GX (Sigma) was used to stain cartilage in blue followed by Alizarin RedS (Sigma) to stain calcified 2.1. Study sites and sampling 2.1.1. Sites characterization Sampling sites were selected in the Tunisian coast (Fig. 1), three polluted sites and a reference one. The S2, surrounded by 2.1.2. Sample collection Fish were caught with a hand nets. Caught fish were counted and the percentage of deformed fish was calculated from 2007 to 2010. 75 normal specimens (mean total length 3.14 ± 0.36 cm; mean total weight 0.54 ± 0.17 g) and 77 deformed specimens (mean total length 2.79 ± 0.34 cm; mean total weight 0.45 ± 0.15 g) were collected for the morphological study. Water samples were collected from all localities at a depth of 0.5 m in clean bottles from the different areas. The upper 5 cm of sediments were also collected. Sampling bottles were previously cleaned by soaking with 10% nitric acid (HNO3) and rinsed with ultrapure water. 2.2. Analytical procedures Fig. 1. Location of the sampling sites. S1: coast of Luza: S2: industrial coast of Sfax; S3: Khniss; S4: Hamdoun’Oued. 2685 K. Kessabi et al. / Chemosphere 90 (2013) 2683–2689 structures in red. The combination of KOH and peroxide treatment tends to increase the transparency of soft tissues and allow clear observation of skeletal structure. at 0.4 ml min 220 nm. 1 . A UV detector was used to detect estrogens at 2.3. Statistical analysis 2.2.2. Metal analysis Water samples were stabilized at pH 2 with 1 M nitric acid prior to direct determination of total metal concentrations. Sediment samples were oven-dried for 48 h at 100 °C and 100 mg of each sample was mineralized at 250 °C with a set of acids composed of 1 ml of nitric acid, 2 ml of fluorhydric acid and 0.5 ml of perchloric acid and then adjusted to 10 ml with deionised water. Samples were analyzed to determine Cd, Cu and Zn concentrations using a graphite furnace AAS technique (ZEEnit 700). Samples were analyzed in triplicate. The variation coefficient was usually less than 10%. Metal concentrations are reported as lg g 1 of dry weight for sediments and as lg L 1 for water samples. 2.2.3. PAHs (polycyclic aromatic hydrocarbons) determination The assays performed were carried out according to the protocol of CEAEQ (www.ceaeq.gouv.qc.ca). PAHs levels in sediment were determined by gas chromatography coupled with mass spectrometry. The following compounds were analyzed: acenaphthylene, acenaphthene, naphthalene, phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, benzo(a) anthracene, chrysene, benzo(b) fluoranthene, benzo (e, a)pyrene, benzo(g, h, i) perylene, and dibenzo [a, h] anthracene. Data are reported as lg of PAHs/ g dry weight. 2.2.4. YES assay Both agonist and antagonist activities of chemical dyes were examined using the Yeast strain BY4741 (García-Reyero et al., 2001). This recombinant yeast strain carries the b-galactosidase reporter gene under the control of the estrogen responsive element ERE. The test consisted on the measurement of the b-galactosidase activity (fluorescence at 460 nm after excitation at 355 nm; Fluoroskan, Twinkle LB 970, BERTHOLD Technologies) after 6 h of exposure to the solutions to be analyzed. Within each experiment, an internal control was set up for the reference estrogen, 17b-estradiol on one plate. The upper part of each plate was filled with the solvent control (methanol), nine concentrations of E2 (1.0 10 12, 1.0 10 11, 1.0 10 10, 1.0 10 9, 1.0 10 8, 1.0 10 7, 1.0 10 6, 1.0 10 5 and 1.0 10 4 M). For the effluent samples, dilution series (1–1000) of concentrated extract were prepared in distillated water. Each test for effluent samples was evaluated at least three times by independent experiments. Agonist activities of effluent samples were measured as % of maximal fluorescence intensity produced by 17b-estradiol. 2.2.5. Estrogens detection The derived estrogens were separated on a waters 2695 HPLC machine, coupled with UV detector DAD996. The injection of 40 ll of samples was performed at 25 °C. The column was a C18 Ascentis C18, 5 cm 4.6 mm I.D., 5 lm; the mobile phase was a mixture of water: acetonitrile (55:45); and the flow rate was set For the skeletal deformities, results were reported as percentage of fish affected and comparisons were performed with chi-square test. For metal concentrations, data are given as means ± SE, and differences were assessed by one-way ANOVA followed by protected least significant difference Fisher’s test. Values were considered statistically significant when p < 0.01. 3. Results 3.1. Incidence of spinal deformities in A. fasciatus Spinal deformities were visible on the fish body immediately upon catching. The results of spatial distribution among different sites show that the percentage of deformed fish was significantly higher (p < 0.0001) in S2 from 2007 to 2010 compared to the three other sites (Table 1). 3.2. Skeletal anomalies: description and frequencies Skeletal anomalies of adult A. fasciatus were grouped into 13 categories that described abnormalities on spines, vertebrae arcs and mandibles. A total of 1025 anomalies were observed: 460 in the vertebrae, 478 in the spines, 73 in the arcs and 14 in mandibles. The number of anomalies recorded in normal fish was 31 (3.02%) and 994 in deformed fish (96.97%). The most common abnormalities described are shown in Fig. 2. The frequencies of fish affected with different skeletal anomalies are reported in Table 2. 3.3. Chemical analysis The water physico-chemical parameters of sampling sites are summarized in Table 3. Our results showed that the industrialized coast of Sfax (S2) appeared as the most polluted site. In fact, PAHs and heavy metals, especially Cd and Cu, were predominant in S2 compared to the three other sites (S1, S3 and S4). Physico-chemical parameters such as pH, conductivity and dissolved O2 are similar in all studied sites, while the highest temperature was recorded in the Hamdoun river (S4). Results presented in Fig. 3 showed that spatial variations of incidence of spinal deformities in A. fasciatus populations and CdLire phonétique that spinal deformities that contents in water and sediment of studied sites were very similar. 3.4. Estrogenic activities Our results show that the high level of estrogenic activity was observed only in S4 (60.5% in water and 99.65% of relative Table 1 Spatio-temporal distribution of spinal deformities (percentages) in A. fasciatus populations from studied sites. Year 2007 Sites T D % 2008 T D % 2009 T D % T D % S1 S2 S3 S4 341 263 225 220 9 46 4 5 2.63 17.49* 1.77 2.27 477 518 250 268 20 80 7 3 4.19 15.44* 2.8 1.12 440 394 263 228 13 72 5 4 2.95 18.27* 1.9 1.75 500 500 219 264 20 71 3 5 4 14.2* 1.36 1.89 T: Total number of fish examined. D: Number of deformed fish. S1: Luza; S2: industrialized coast of Sfax; S3: Khniss and S4: Hamdoun river. * p < 0.0001: Significance from samples of the three other sites throughout the year. 2010 2686 K. Kessabi et al. / Chemosphere 90 (2013) 2683–2689 Fig. 2. Examples of skeletal anomalies in A. fasciatus. (a): Normal specimen, (b): deformed specimen, (c): normal vertebral column profile, (d): the black arrow points to absence of spine, the white arrow points to fused spines. (e): The black arrow points to bifurcated spine, the white arrow points to broken spine. (f): The black arrow points to short spine, the white arrows point to detachment of spines. (g): Abnormal shape of three consecutive spines, (h): fused vertebrae, (i): hypertrophied vertebrae, (j): the black arrow points to atrophied vertebrae, the white arrows point to a Hypertrophied arcs, (k): detached arcs and (l): prognathe. Table 2 Number (N) and frequencies (F) of normal and deformed A. fasciatus affected with different skeletal anomalies. Normal (n = 75) Deformed (n = 77) N F N F Anomalies of spines Fused spines Bifurcation Detachment Broken spines Absence of spines Short spines Abnormal shape 3 6 8 0 0 0 0 0.63 8 10.66 0 0 0 0 46 77 77 39 20 19 49 59.74* 100* 100* 50.64* 25.97* 24.67* 63.63* Anomalies of vertebrae Fused vertebrae Atrophy Hypertrophy 4 3 2 5.33 4 2.66 77 50 65 100* 64.93* 84.41* Anomalies of arcs Arc detachment Arc hypertrophy Prognathe 0 0 0 0 0 0 27 15 14 35.06 19.48 18.18 n: Number of specimens examined p < 0.0001: Significance from normal fish. * estrogenic activity in suspended mater). A light difference was observed between S1, S2 and S3 (Table 4). The results related to the estrogenic compounds, detected by HPLC analysis in water and suspended mater (SM) of different areas of study; indicate the presence of estrone in water and 17b-estradiol and estriol in SM collected from S4 (Table 4). 4. Discussion The aim of this study was to diagnose skeletal deformities and found a possible relationship between these deformities and several types of pollutants present in the environment. Skeletal deformities, one of the most serious pathological effects in fishes, are well known for many fish species from different areas of the world (Tutman et al., 2000; Ayed et al., 2008; Sun et al., 2009). Assessing morphological deformities represent one of the most straight forward methods to study the effects of contamination on fish because of the ease of recognition and examination when compared with other types of biomarkers. In our previous study, we have showed that CYP1A mRNA levels in deformed A. fasciatus collected from the industrial coast of Sfax (S2) were 10 times higher than the normal ones, suggesting a link between the extent of deformity of impacted fish and their exposure to CYP1A-inducing pollutants (dioxins, dioxin-like PCBs, PAHs) in the environment (Kessabi et al., 2010). In the present study, population from the industrialized coast of Sfax (S2) was found to have higher frequency of abnormal fishes as compared to A. fasciatus from the other sites. PAHs and heavy metals have been found in water and sediments of S2 with high levels as compared to other sites, suggesting a combined effect of these pollutants leading to different types of skeletal deformities observed in A. fasciatus. This ecological situation is closely connected with the promoted industrial development and intense human activities. This region differs greatly in many environmental aspects and observed population differences in malformation frequency might be explained by influence of environmental pollution. In fact, the pollution in this coast is due essentially to the presence of continuous discharge of pollutants from local industrial activities (Hamza-Chaffai and Pellerin, 2003) and from the phosphogypsum. Several reports have also indicated high metal concentrations in soft tissues of Reditapes decussatus (Hamza-Chaffai and Pellerin, 2003; Smaoui-Damak et al., 2003) and in the fish Scorpaena porcus (Hamza-Chaffai et al., 1995) from this coast. The present study showed that spatial variations of incidence of spinal deformities in A. fasciatus populations and CdLire phonétique that spinal deformities that contents in water and sediment of studied sites were very similar. An increase in spinal deformities rate induced by exposures of fish to Cd were reported by many 2687 K. Kessabi et al. / Chemosphere 90 (2013) 2683–2689 Table 3 Sites description. Parameter S1 S2 S3 S4 8.5 20.3 54.5 8.4 8.4 21.4 54.6 8.5 8.5 24 56 8.5 8.4 29.6 56.3 8.4 0.03 ± 0.01 3.06 ± 1.54 12.28 ± 1.47 0.62 ± 0.02* 15.29 ± 3.39* 67,25 ± 7.96* 0.02 ± 0.004 2.73 ± 0.79 12.85 ± 1.5 0.03 ± 0.01 2.43 ± 0.49 11.62 ± 1.78 Heavy metals sediment (lg g 1 dry weight) Cd Cu Zn 0.05 ± 0.01 3.05 ± 1.19 32.00 ± 9.57 1.78 ± 0.15* 36.84 ± 2.44* 143.66 ± 31.08* 0.04 ± 0.01 11.98 ± 2.06 20.35 ± 1.86 0.05 ± 0.01 4.74 ± 1.21 18.38 ± 3.00 PAHs sediment (lg g 1 dry weight) Acenaphtylene Acenaphtene Naphthalene Phenanthrene Anthracene Fluoranthene Pyrene Benzo(a)anthracene Chrysene Benzo(b)fluoranthene Benzo(e)pyrene Benzo(a)pyrene Benzo(g,h,i)perylene Dibenzo[a,h]anthracene <DL <DL <DL <DL <DL 0.05 0.05 0.06 <DL <DL <DL <DL <DL <DL <DL <DL 0.12 0.1 <DL 0.29 0.28 0.23 0.25 0.17 0.09 0.2 0.26 <DL <DL <DL 0.07 0.09 <DL 0.21 0.22 0.13 0.09 0.11 0.07 0.17 0.18 <DL <DL <DL 0.06 0.05 <DL 0.18 0.25 0.2 0.15 0.22 0.09 0.23 0.22 <DL R PAHs 0.16 1.99 1.34 1.65 pH Temperature (°C) Conductivity (mS cm O2 (ppm) Heavy metals Water (lg L Cd Cu Zn 1 1 ) ) PAHs: total concentration of PAHs presents in each site; <DL: inferior to limit of detection; S1: Luza; S2: industrialized coast of Sfax; S3: Khniss and S4: Hamdoun river. * p < 0.0001 (Significance from samples of S1, S3 and S4). Table 4 Estrogenic activities (%) and estrogenic compounds detected in water (W) and suspended mater (SM) of studied sites. Sites S1 S2 S3 S4 Estrogenic activity (%) Estrogenic compounds W SM W SM 17.18 22.46 20.39 60.5 6.85 5.16 6.68 99.65 E2 <LD or NF <LD or NF E1 E2, E1, E2, E2, EE2 E3 EE2 E3 NF: compound not found. <LD: inferior to limit of detection. (E1: estrone; E2: 17b-estradiol; E3: estriol; EE2: ethynilestradiol). S1: Luza; S2: industrialized coast of Sfax; S3: Khniss and S4: Hamdoun river. Fig. 3. Cd levels and distribution of spinal deformities frequencies in A. fasciatus collected from studied sites. authors (Bervoets and Blust, 2003; Sassi et al., 2010). Myoxocephalus quadricornis exposed for 1 year to an artificial heavy metalcontaining effluent displayed spinal curvature and increased frequency of vertebral deformities (Bengtsson and Larsson, 1986). A causal relationship between high environmental levels of heavy metals, especially Cd, and skeletal anomalies in fish has been suggested by Bengtsson et al. (1985). Buhringer et al. (1990) found highest Cd levels in the bones in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss suffering from deformities compared to healthy individuals. Most of the evidence on Cd influence on induction of spinal deformities in fish is from laboratory studies. Resorption of Ca from the bone to compensate for disturbed Ca homeostasis, under Cd influence, is suggested as the main mechanism behind the observed deformities in these studies (Bengtsson and Larsson, 1986; Bervoets and Blust, 2003; Sassi et al., 2010). Cheng et al. (2000) showed that the frequency of malformations in zebrafish embryos increased with Cd concentration in culture media and demonstrated a reduced myotome formation in Cd-induced spinal deformity. These authors suggested that fish embryonic malformations induced by Cd might be mediated through ectopic expression of developmental regulatory genes. PAHs comprise a large class of widespread environmental contaminants produced by both natural and anthropogenic sources. Due to their persistence and accumulation in soils and sediments, these compounds are now widely dispersed in the biosphere, notably in sediments of estuaries and coastal marine 2688 K. Kessabi et al. / Chemosphere 90 (2013) 2683–2689 areas throughout the world. It was frequently reported that spinal deformities can be experimentally induced in fish upon exposure to different organic and inorganic substances, including metals, metalloids and organic substances like PAHs, organochlorine compounds OC and dioxins (Yamauchi et al., 2006; Cachot et al., 2007; Miller et al., 2007; Holth et al., 2008; Gagnon and Rawson, 2009). Given their high estrogenic potency and their high prevalence in the aquatic environment, the natural estrogens such as E1 (estrone), E2 (17 beta-estradiol), E3 (estriol) and the synthetic estrogens, are of particular concern in the risk assessment of endocrine disrupting compounds for wildlife (Kramer et al., 1998; Bjerselius et al., 2001; Van den Belt et al., 2001, 2002). Estrogens are potent chemicals of which the estrogenic effects can be observed in laboratory studies at 1 ng L 1 (Routeledge et al., 1998). In addition, length of the exposure period influenced the incidence of morphological abnormalities as abnormalities worsened as exposure progressed. This temporally cumulative effect was also observed in response to EE2 treatment, in which a 60-d exposure of Fundulus heteroclitus produced abnormalities at lower concentrations than a 25-d exposure (Boudreau et al., 2004). Although S3 and S4 are polluted and show high values of PAHs, and S4 shows an estrogenic activity up to 100%, the percentage of spinal deformities is low compared to S2. This confirms that estrogenic compounds or PAHs alone are not able to give a high rate of malformations in A. fasciatus. The causes of the occurrence of spinal deformities in natural populations of fish are complicated and, to a large extent, unknown. They may be a response to a number of biotic factors and abiotic factors which are not related to pollution. Nevertheless, the observed association of the relatively high prevalence of spinal deformity in A. fasciatus and the important accumulation of heavy metals and PAHs in the industrialized coast of Sfax, seems to be very interesting and suggest that these mixture of chemical pollutants may represent a potential risk to induce spinal deformities in natural population of A. fasciatus. However, clear and confirmed association of skeletal abnormalities in A. fasciatus from the industrialized coast of Sfax with contaminants still requires additional research. References Antunes, M., Lopes Da Cunha, P., 2002. Skeletal anomalies in Gobius niger (Gobiidae) from Sado Estuary, Portugal. Cybium 26, 179–184. Aunsmo, A., Guttvik, A., Midtlyng, P.J., Larssen, R.B., Evensen, O., Skjerve, E., 2008. Association of spinal deformity and vaccine-induced abdominal lesions in harvest-sized Atlantic salmon, Salmo salar L. J. Fish. Dis. 31, 515–524. Aunsmo, A., Ovretveit, S., Breck, O., Valle, P.S., Larssen, R.B., Sandberg, M., 2009. Modelling sources of variation and risk factors for spinal deformity in farmed Atlantic salmon using hierarchical- and cross-classified multilevel models. Prev. Vet. Med. 90, 137–145. Ayed, N., Faure, E., Quignard, J.P., Maamouri, F., Trabelsi, M., 2008. Incidence of kyphosis deformities in natural population of Atherina lagunae (Trabelsi et al., 2002) from the Tunis North Lake, Tunisia. Mar. Biol. 153, 319–325. Bardon, A., Vandeputte, M., Dupont-Nivet, M., Chavanne, H., Haffray, P., Vergnet, A., Chatain, B., 2009. What is the heritable component of spinal deformities in the European sea bass (Dicentrarchus labrax). Aquaculture 294, 194–201. Barhoumi, S., Messaoudi, I., Deli, T., Saïd, K., Kerkeni, A., 2009. Cadmium bioaccumulation in three benthic fish species, Salaria basilisca, Zosterisessor ophiocephalus and Solea vulgaris collected from the Gulf of Gabes in Tunisia. J. Environ. Sci. 21, 980–984. Bengtsson, B.E., Larsson, A., 1986. Vertebral deformities and physiological effects in fourhorn sculpin (Myoxocephalus quadricornis) after long term exposure to a simulated heavy metal-containing effluent. Aquat. Toxicol. 9, 215–229. Bengtsson, A., Bengtsson, B.E., Lithner, G., 1985. Vertebral defects in fourhorn sculpin, Myoxocephalus quadricornis L., exposed to heavy metal pollution in the Gulf of Bothnia. J. Fish. Biol. 33, 517–529. Bervoets, L., Blust, R., 2003. Metal concentrations in water, sediment and gudgeon (Gobio gobio) from a pollution gradient: relationship with fish condition factor. Environ. Pollut. 126, 9–19. Bjerselius, R., Lundstedt-Enkel, K., Olseén, H., Mayer, I., Dimberg, K., 2001. Male goldfish reproductive behaviour and physiology are severely affected by exogenous exposure to 17b-estradiol. Aquat. Toxicol. 53, 139–152. Boudreau, M., Courtenay, S.C., MacLatchy, D.L., Bérubé, C.H., Parrott, J.L., Van der Kraak, G.J., 2004. Utility of morphological abnormalities during early-life development of the estuarine mummichog, Fundulus heteroclitus, as an indicator of estrogenic and antiestrogenic endocrine disruption. Environ. Toxicol. Chem. 23, 415–425. Buhringer, H., Sperling, K., Wunder, W., 1990. Spinal shortening (osteosclerosis) in spawners of the rainbow trout. Arch. Fisch. Wiss. 40, 205–228. Cachot, J., Law, M., Pottier, D., Peluhet, L., Norris, M., Budzinski, H., Winn, R., 2007. Characterization of toxic effects of sediment-associated organic pollutants using the lambda transgenic medaka. Environ. Sci. Technol. 41, 7830–7836. Cheng, S.H., Wai, A.W.K., So, C.H., Wu, R.S.S., 2000. Cellular and molecular basis of cadmium-induced deformities in zebrafish embryos. Environ. Toxicol. Chem. 19, 3024–3031. Da Chuna, P.L., Antunes, M.M., 1999. Occurrence of vertebral deformities in Gobiidae (Pisces) from the Tagus estuary. Aquat. Ecol. 33, 281–285. Dahlberg, D.M., 1970. Frequencies of abnormalities in Georgia estuarine fishes. Trans. Am. Fish. Soc. 99, 95–97. De La Cruz-Aguero, J., Perezgomez-Alvarez, L., 2001. Lordosis in topsmelt Atherinops affinis (Ayers, 1860) (Teleostei: Atherinopsidae). Rev. Biol. Mar. Oceanog. 36 (1), 109–110. Gagnon, M.M., Rawson, C.A., 2009. Diuron increases spinal deformity in earlylifestage pink snapper Pagrus auratus. Mar. Pollut. Bull. 58, 1083–1085. García-Reyero, N., Grau, E., Castillo, M., López de Alda, M.J., Barceló, D., Piña, B., 2001. Monitoring of endocrine disruptors in surface waters by the yeast recombinant assay. Environ. Toxicol. Chem. 20, 1152–1158. Hamza-Chaffai, A., Pellerin, J.J.C., 2003. Health assessment of a marine bivalves Ruditapes decussatus from the Gulf of Gabès (Tunisia). Environ. Int. 28, 609– 617. Hamza-Chaffai, A., Cossin, R.P., Amiard-Triquet, C., El-Abed, A., 1995. Physicochemical forms of storage of metals (Cd–Cu and Zn) and metallothionein-like proteins in gills and liver of marine fish from the Tunisian coast: ecotoxicological consequences. Comp. Biochem. Physiol. 102, 329–341. Holth, T.F., Nourizadeh-Lillabadi, R., Blaesbjerg, M., Grung, M., Holbech, H., Petersen, G.I., Alestrom, P., Hylland, K., 2008. Differential gene expression and biomarkers in zebrafish (Danio rerio) following exposure to produced water components. Aquat. Toxicol. 90, 277–291. Kessabi, K., Kerkeni, A., Said, K., Messaoudi, I., 2009. Involvement of Cd bioaccumulation in spinal deformities occurrence in natural populations of Mediterranean Killifish. Biol. Trace Elem. Res. 128, 72–81. Kessabi, K., Navarro, A., Casado, M., Said, K., Messaoudi, I., Pina, B., 2010. Evaluation of environmental impact on natural populations of the Mediterranean killifish Aphanius fasciatus by quantitative RNA biomarkers. Mar. Environ. Res. 70, 327– 333. Koumoundourous, G., Divanach, P., Anezaki, L., Kentouri, M., 2001a. Temperatureinduced ontogenetic plasticity in sea bass (Dicentrachus labrax). Mar. Biol. 139, 817–830. Koumoundourous, G., Divanach, P., Kentouri, M., 2001b. The effect of rearing conditions on development of saddleback syndrome and caudal fin deformities in Dentex dentex L. Aquaculture 200, 285–304. Kramer, V.J., Miles-Richardson, S., Pierens, S.L., Giesy, J.P., 1998. Reproductive impairment and induction of alkaline-labile phosphate, a biomarker of estrogen exposure, in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to waterborne 17b-estradiol. Aquat. Toxicol. 40, 335–360. Lall, S.P., Lewis-McCrea, L.M., 2007. Role of nutrients in skeletal metabolism and pathology in fish, an overview. Aquaculture 267, 3–19. Lemly, A.D., 2002. Symptoms and implications of selenium toxicity in fish: the Belews Lake case example. Aquat. Toxicol. 57, 39–49. Messaoudi, I., Deli, T., Kessabi, K., Barhoumi, S., Kerkeni, A., Said, K., 2009a. Association of spinal deformities with heavy metal bioaccumulation in natural populations of grass goby, Zosterisessor ophiocephalus Pallas, 1811 from the Gulf of Gabes (Tunisia). Environ. Monit. Assess. 156, 551–560. Messaoudi, I., Kessabi, K., Kacem, A., Said, K., 2009b. Incidence of spinal deformities in natural populations of Aphanius fasciatus Nardo, 1827 from the Gulf of Gabes, Tunisia. Afr. J. Ecol. 47, 360–366. Miller, L.L., Wang, F., Palace, V.P., Hontela, A., 2007. Effects of acute and subchronic exposures to waterborne selenite on the physiological stress response and oxidative stress indicators in juvenile rainbow trout. Aquat. Toxicol. 83, 263– 271. Park, E.H., Kim, D.S., 1984. A procedure for staining cartilage and bone of whole vertebrate larvae while rendering all other tissues transparent. Stain Technol. 59, 269–272. Routeledge, E.J., Parker, J., Odum, J., Ashby, J., Sumpter, J.P., 1998. Some alkyl hydroxy benzoate preservatives (parabens) are estrogenic. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153, 12–19. Sassi, A., Annabi, A., Kessabi, K., Kerkeni, A., Saïd, K., Messaoudi, I., 2010. Influence of high temperature on cadmium-induced skeletal deformities in juvenile mosquitofish (Gambusia affinis). Fish Physiol. Biochem., 9307–9309. Smaoui-Damak, W., Hamza-Chaffai, A., Berthet, B., Amiard, J.C., 2003. Preliminary study of the clam Ruditapes decussatus exposed in situ to metal contamination and originating from the gulf of Gabès, Tunisia. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 71, 961–970. Sun, P.L., Hawkins, W.E., Overstreet, R.M., Brown-Peterson, N.J., 2009. Morphological deformities as biomarkers in fish from contaminated rivers in Taiwan. Int. J. Environ. Res. 6, 2307–2331. Teraoka, H., Dong, W., Ogawa, S., Tsukiyama, S., Okuhara, Y., Niiyama, M., Ueno, N., Peterson, R.E., Hiraga, T., 2002. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-pdioxin toxicity in the zebrafish embryo: altered regional blood flow and impaired lower jaw development. Toxicol. Sci. 65, 192–199. K. Kessabi et al. / Chemosphere 90 (2013) 2683–2689 Tutman, P., Glamuzina, B., Skaramuca, B., Kozul, V., Glavic, N., Lucic, D., 2000. Incidence of spinal deformities in natural populations of sandsmelt, Atherina boyeri (Risso, 1810) in the Neretva river estuary, middle Adriatic. Fish. Res. 45, 61–64. Urushitani, H., Shimizu, A., Katus, Y., Iguchi, T., 2002. Early estrogen exposure induces abnormal development of Fundulus heteroclitus. J. Exp. Zool. 293, 693– 702. Van den Belt, K., Verheyen, R., Witters, H., 2001. Reproductive effects of ethynylestradiol and 4t-octylphenol on the zebrafish. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 41, 458–467. 2689 Van den Belt, K., Wester, P.W., Van der Ven, L.T.M., Verheyen, R., Witters, H., 2002. Effects of ethynylestradiol on the reproductive physiology in zebrafish (Danio rerio): time dependency and reversibility. Environ. Toxicol. Chem. 21, 767–775. Xuan Yang, M.S., 2004. Use of fish biomarkers to assess the contaminant exposure and effects in Lake Erie tributaries, Thèse doctorat. The Graduate School of the Ohio State University, 150 p. Yamauchi, M., Kim, E.Y., Iwata, H., Shima, Y., Tanabe, S., 2006. Toxic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) in developing red seabream (Pagrus major) embryo: an association of morphological deformities with AHR1, AHR2 and CYP1A expressions. Aquat. Toxicol. 80, 166–179. B. Détermination de l’activité oestrogénique d’échantillons réels et de contaminants par le Yeast Estrogen Screen (YES) Parmi l’infinie variété des interactions avec un système biologique que peuvent avoir les composés chimiques, l’attention s’est focalisée sur les composés susceptibles d’interférer avec les réponses du système endocrinien via des récepteurs hormonaux. En particulier, un système a été retenu, le récepteur aux oestrogènes étudié grâce à des systèmes de levures recombinantes YES (Yeast Estrogen Screen). Dans cet essai, des cellules de levure Saccharomyces cerevisiae ont été transfectées de manière stable avec le gène codant pour le récepteur aux oestrogènes humain et un plasmide contenant la séquence ERE et le gène rapporteur lac-Z codant pour l'enzyme β-galactosidase. L'activation du récepteur hER, par liaison d'un ligand, provoque l'expression de gène lacZ, qui produit la β-galactosidase. Cette enzyme est sécrétée dans le milieu de culture où elle métabolise le substrat chromogène, le Mugal (4-méthylumbellriferyl-β-D-galactopyranoside), qui produit alors un composé qui fluorescence à 460 nm après une excitation à 355 nm. L’intensité de cette fluorescence est proportionnelle à l’activité oestrogénique d’un échantillon d’eau ou au potentiel oestrogénique d’un composé chimique. Le 17 β-oestradiol (E2) est utilisé comme composé de référence. Une série de dilutions de E2 est dosée parallèlement aux échantillons. L'activité oestrogènique de chaque échantillon est ensuite comparée à celle de E2. Pour déterminer si les composés étudiés possèdent une activité anti-oestrogénique, du 17 β oestradiol (10-9 M) est ajouté au milieu. L'aptitude des composés ou de l’échantillon à inhiber la synthèse de la β-galactosidase induite par l’E2 est alors déterminée (Routledge et al., 1997; Sohoni et Sumpter 1998) 1. Activité oestrogénique d’effluents de stations d’épuration du Sahel tunisien et présence de parabènes Les molécules à activité oestrogénique sont parmi les principaux perturbateurs endocriniens transférés vers les milieux naturels via les eaux usées. Ils sont susceptibles de provoquer, à des concentrations de l’ordre du ng/l, des altérations de la croissance, du comportement et de la reproduction. Une des sources majeures de ces molécules sont les êtres humains et les animaux qui les excrètent naturellement via leurs urines. Il existe également des xéno-oestrogènes utilisés comme conservateurs dans l’alimentation ou dans les produits de soins corporels comme les parabènes. Le propyl et le butyl-parabène sont des 84 conservateurs employés dans les produits de soin personnel ou comme additifs alimentaires. Le propylparabène a des propriétés oestrogéniques et anti-androgèniques et il diminue la production de spermatozoïdes chez les rats mâles. Le butylparabène présente une plus forte activité oestrogénique et il a aussi des effets sur les hormones thyroïdiennes; il affecte la mobilité des spermatozoïdes et leur nombre ainsi que le métabolisme des graisses. Toutes ces molécules se retrouvent donc dans les eaux usées urbaines. L’objectif de ce travail de recherche est d’étudier le devenir de ces xéno-estrogènes, les parabènes, lors du traitement des eaux usées par les stations d’épuration. La distribution des parabènes (eau, boues, MES) et l’activité oestrogénique au niveau de stations d'épuration ont été analysées en combinant des évaluations chimiques et biologiques. La zone d’étude est située sur le littoral tunisien. Ces travaux ont été publiés dans European Journal of Water Quality en 2011 (vol 42 p 91-103). Dans cette étude, l’activité oestrogénique des échantillons est exprimée en pourcent par rapport à l’activité oestrogénique produite par une concentration de 10-9 M de 17 βoestradiol (E2). Ici l’EC50 est la concentration pour laquelle la réponse transcriptionnelle du YES atteint 50% de sa valeur par rapport à des concentrations saturantes de 17 β-oestradiol. L’EC50 est exprimée en équivalent oestradiol. A l’issu de cette étude, il apparait que l’activité oestrogénique mesurée sur les eaux d’entrée et de sortie, des trois stations, est relativement comparable. Elle est comprise entre 20 et 30% de l’activité de l’oestradiol E2 (10-9 M) en entrée et 40 et 60% en sortie selon les stations. La comparaison de la concentration effective (EC50) de ces échantillons avec celle de la substance de référence (17 β-oestradiol) montre que la charge équivalente en oestradiol avoisine 10-9 M. Concernant les échantillons de boues, l’activité oestrogénique est plus importante avec des EC50 pouvant atteindre 10-8M. Les matières en suspension ont une activité oestrogénique plus faible. Pour les trois stations d’épuration les concentrations en parabènes ont été mesurées par HPLC pour les phases dissoutes, les matières en suspension et les boues. Les cinq parabènes analysés sont le méthyl parabène (MeP), l’éthyl parabène (EtP), le propyl parabène (PrP), le butyl parabène (BuP) et le benzyl parabène (BzP). La concentration des parabènes dans les eaux résiduaires varie de 0,2 à 566 µg/l avec comme parabène majoritaire le méthylparabéne (MeP). La concentration en MeP est très élevée dans la station A. Pour les autres stations, la 85 concentration de ce dernier est autour de 3µg/l. La station A reçoit des effluents provenant de l’industrie textile. Des échantillons de cet effluent ont été analysés et il apparait que la concentration en MeP atteint 400µg/l, ce qui peut expliquer, du moins en partie, les concentrations relevées au niveau de cette station. Le méthylparabéne est retrouvé dans cette station au niveau des matières en suspensions analysées en sortie. Parallèlement, le méthylparabéne, l’éthylparabéne, le propylparabéne, le benzylparabéne et le buthylparabéne ont été mesurés sur les fractions solides (boues et matières en suspension). Les concentrations mesurées sont beaucoup plus élevées que celles retrouvées dans la littérature, jusqu’à 3500 µg/g de matière sèche pour l’éthylparabéne dans les boues activées II. L’ensemble de ces résultats montre que l’abattement le plus important des parabènes a lieu au niveau des bassins de traitement biologique (bassin d’activation I et II). En effet, les concentrations dans les eaux traitées, à l’exception du méthylparabéne dans la station A, ne dépassent pas 4µg/l. Par contre, l’activité oestrogénique en sortie de STEP est autour de 60%. Dans notre cas, les parabènes n’expliquent pas la majeure partie de l’activité oestrogénique détectée en entrée et en sortie de STEP, la présence d’autres xéno-estrogènes et/ou de leurs produits de dégradation n’est pas à exclure. Des résultats complémentaires ont montrés que les parabènes, bien que très présents dans les différents compartiments étudiés ne pouvaient pas expliquer la totalité de l’oestrogénicité évaluée par le Yeast Estrogene Screen. Les équivalents œstradiols (EEQ) ont été calculés pour chaque concentration de parabène, déterminée en HPLC, et ces EEQ ont été sommés pour obtenir un équivalent œstradiol calculé (EEQ calculé parabènes) selon la formule suivante : où Ci est la concentration du parabène i, et FFAi est le potentiel oestrogénique du parabène i établi avec le Yeast Estrogen Screen (Nguyen 2011). Cette activité oestrogénique, exprimée en équivalent oestradiol (EEQ calculé parabènes), est comparée à l’activité oestrogénique totale évaluée par le YES (EEQ mesuré YES). Les résultats présentés tableau 15 montrent que l’activité oestrogénique due à la présence des parabènes représente moins de 10% de l’activité oestrogénique totale évaluée par le YES. Dans le cas des boues épaissies, leur activité représente un peu plus de 20% de 86 l’activité totale. Les parabènes, ne sont donc pas les principaux perturbateurs oestrogéniques présents dans ces effluents et d’autres composés non analysés (car non recherchés) contribuent à cette activité oestrogénique évaluée par le bioessais. Tableau 15 : Activité oestrogénique exprimée en équivalent oestradiol (EEQ) EEQ calculé (M) parabènes EEQ mesuré (M) (bioessais YES) EEQ calculé/EEQ mesuré en % EEQ calculé (M) parabènes EEQ mesuré (M) (bioessais YES) % EEQ parabènes/EEQt EEQ calculé (M) parabènes EEQ mesuré (M) (bioessais YES) % EEQ parabènes/EEQt Entrée Sortie station A Boues de retour 4,7 E-12 7,9 E-13 1,2 E-10 2,0 E-10 1,8 E-09 2,4% Boues activées I Boues épaissies 1,2 E-10 Boues activées II 1,2 E-09 2,0 E-09 9,0 E-09 5,0 E-09 1,0 E-09 0,04% 6,3% 1,3% 24,6% 22,5% Entrée Sortie station B Boues de retour Boues activée Boues épaissies 2,2 E-12 2,0 E-13 1,3 E-10 1,2 E-10 Boues activée II 1,3 E-09 2,5 E-11 1,8 E-09 2,0 E-09 9,6 E-09 5,3 E-09 1,2 E-09 8,88 0,01 6,37 1,20 25,36 19,46 Entrée Sortie Station C Boues de retour Boues activée Boues épaissies 9,6 E-12 2,0 E-13 8,3 E-11 2,6 E-11 Boues activée II nd 3,0 E-10 1,0 E-08 1,3 E-08 2,0 E-08 1,0 E-09 3,21 0,002 0,64 0,13 22,27 2,2 E-10 2,3 E-10 2,2 E-10 Les mesures établies sur la filière eau, démontrent que la biodégradation (traitement biologique) et l’adsorption des parabènes sur la phase particulaire semblent être les processus majoritaires dans l’élimination des parabènes (pas de traitement cible pour les parabènes). Cette hypothèse est renforcée par les taux élevés de parabènes mesurés dans les boues épaissies en fin de traitement. Certains composés ont une affinité pour les boues et pour les matières en suspension, devenant ainsi un réservoir potentiel pour ces composés. En conclusion, cette étude a permis de réaliser un bilan complet sur trois STEP en considérant tous les compartiments, ainsi que l’activité oestrogénique associée. Peu d’études ont effectué ces mesures sur un seul site. Les résultats enrichissent les informations disponibles dans la 87 littérature concernant la présence de parabènes dans la fraction dissoute et la fraction particulaire et l’impact spécifique de chacune des étapes du traitement, qui restaient peu étudiées jusqu’à présent. Ils confirment d’autres résultats obtenus précédemment sur le rôle des parabènes vis-à-vis de l’activité oestrogénique. Les effluents et les boues contiennent des teneurs en oestrogène très élevées. Ceci souligne l’importance d’approfondir les connaissances sur la dynamique et la biodégradation des xéno-estrogènes de manière générale par les boues activées et leur devenir au cours du traitement des boues d’épuration. 88 Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 # ASEES, 2012 DOI: 10.1051/wqual/2012002 Disponible en ligne sur : www.water-quality-journal.org Activité estrogénique et détection des parabènes dans trois stations d’épuration du Sahel tunisien Ibn Hadj Hassine AZIZA1, Bazin INGRID1*, Um KHÉMARY1, Bartegi AGHLEB2 et Catherine GONZALEZ1 École des Mines d’Alès, Laboratoire de Génie de l’Environnement Industriel et des Risques Industriels et Naturels, 6 avenue de Clavières, 30319 Ales Cedex, France 2 Department of Biology, Faculty of Sciences – King Faisal University, P.O. Box 1759, 31982 Al Hassa, Saudi Arabia *Auteur de correspondance : [email protected] 1 (Article reçu le 5 mars 2012 ; accepté le 11 mai 2012) Résumé – La présence dans l’environnement de composés chimiques ayant des propriétés hormono-mimétiques génère des inquiétudes sur leur devenir et leurs effets sur les organismes aquatiques. Parmi leurs nombreux modes d’action, ces substances ont la capacité de se fixer aux récepteurs des hormones stéroïdiennes comme le récepteur des œstrogènes (ER) en mimant l’effet d’hormones naturelles et induisant ainsi une perturbation du fonctionnement normal du système endocrine. Ils sont liés très souvent au changement dans le « sex-ratio » et la réduction du taux de fécondité chez certains vertébrés. Les substances à activité estrogénique peuvent être d’origine naturelle comme l’estradiol ou les phyto- et myco-estrogènes, mais également d’origine synthétique comme l’éthynylestradiol, les alkylphénols (surfactants), certains pesticides ou des résidus de cosmétiques. Suite à leur utilisation, ils se retrouvent dans les filières de traitement des eaux usées. Parmi ces molécules, les parabènes, conservateurs fréquemment utilisés dans les produits cosmétiques, les crèmes, les produits pharmaceutiques, sont introduits dans l’environnement via les rejets urbains. Du fait de leur activité estrogénique, ils font partie des composés chimiques dont le niveau de concentration dans l’environnement est à surveiller. Dans cette étude, trois stations d’épuration ont été sélectionnées afin d’avoir une vision actuelle sur la présence des substances estrogéniques dans les eaux usées et sur leur élimination. Dans un premier temps, l’activité estrogénique, à l’aide de test in vitro (Yeast Estrogen Screen, YES), a été mesurée en entrée, en sortie de station d’épuration, et dans les boues, afin d’évaluer la variabilité de ces Article published by EDP Sciences 92 I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 activités dues à des polluants estrogéniques. La présence de cinq parabènes, les plus utilisés dans l’industrie pharmaceutique et alimentaire (benzylparabène, buthylparabène, ethylparabène, propylparabène and méthylparabène), a été également recherchée au moyen de l’HPLC/DAD. Le test YES a montré que les échantillons de boues ont la plus forte activité estrogénique avec une EC50 (concentration effective médiane) qui varie de 1E−07 M à 1E−09 M EEQ (equivalent estradiol). Cette activité est largement suffisante pour induire des perturbations endocriniennes chez les organismes aquatiques. Par ailleurs, les analyses en HPLC-DAD ont montré la présence des cinq parabènes dans les échantillons prélevés en entrée et en sortie de station. Ces composés sont présents dans l’eau (mg.L−1), les matières en suspension (μg.L−1) et s’accumulent dans les boues (mg.g−1). C’est la première étude qui montre la présence de parabènes dans des effluents tunisiens et la possibilité d’associer cette « pollution » à une activité hormonale dans les trois matrices citées au-dessus, spécialement les boues qui sont souvent utilisées dans certaines activités agricoles. Mots-clés : Station d’épuration, parabènes, YES (yeast estrogen screen), HPLC-DAD Abstract – Estrogenic activity and parabens occurrence in three Tunisian wastewater treatment plants. The occurrence of chemicals in the environment, with hormonal activity, increases concern about their fate and effects on the aquatic organisms. Among their various mechanism of action, these compounds have the ability to bind steroid hormones receptors like the oestrogen receptor (ER) and mimic natural hormone effects: inducing disruption on the endocrine system functioning. They are usually related to sex-ratio disequilibrium and decrease of fertility on some vertebrates fertility. Estrogens can be natural hormone like estradiol, phyto and myco-estrogens, or synthetic such as ethynylestradiol, alkylphenols (surfactant), some pesticides and cosmetics. After use, those compounds are found in the different sector of wastewater treatment plants. Among those molecules, parabens and preservatives usually used on cosmetics, creams, pharmaceutics, are introduced in the environment through urban effluent. Due to their estrogenic activity, levels of those compounds in the environment must be monitored. In this study, three wastewater treatment plants were chosen to have an actual point of view on the occurrence of estrogens on the urban wastewater and their removal. First of all, estrogenic activity of the influent, effluent samples, and sludge were investigated using in vitro test (Yeast Estrogen Screen, YES) to evaluate variability in the estrogenic activity that can be attributed to estrogenic contaminants. The occurrence of five parabens among most used ones in pharmaceutical and food corporations (bénzylparabène, buthylparabène, ethylparabène, propylparabène and méthylparabène), were assessed using HPLC/DAD. Sludge showed the highest estrogenic activity with an EC50 (half maximum effective concentration) between 1E−07 M and 1E −09 M EEQ (estradiol equivalent). This activity is enough to induce endocrine disruption in the aquatic organisms. On the other hand, I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 93 HPLC-DAD analysis showed the presence of the five investigated parabens in the influent and effluent samples. Those compounds were detected in water (mg.L−1), suspended matters (μg.L−1) and accumulates in sludge (mg.g−1). This is the first study reporting the presence of parabens in Tunisian wastewater and the ability to associate this “pollution” to hormonal activity in the three matrices mentioned above, especially the sludge, which is often used in some agricultural activities. Keywords: Wastewater treatment plants, parabens, estrogens, YES (yeast estrogen screen), HPLC-DAD 1. INTRODUCTION De nombreuses études font état de la présence dans l’environnement aquatique de substances toxiques de classes chimiques et d’origines très diverses. Toutefois au regard des 41 substances prioritaires listées dans la Directive Européenne (DCE), l’émergence de nouveaux types de contaminants comme les parabènes pose problème aux scientifiques et gestionnaires de l’environnement pour établir une évaluation réaliste du risque pour l’environnement. Les parabènes sont des alkyle esters de l’acide p-hydroxybenzoïque, ils sont utilisés comme antimicrobiens contre les moisissures et les levures dans de nombreux produits alimentaires, pharmaceutiques et cosmétiques. Les parabènes les plus utilisés sont le méthyl parabène (MeP) suivi par de l’éthyl parabène (EtP), du n-propyle (PpP), du n-butyl (BuP) parabène et du benzyl parabènes (BzP) (Rastogi et al., 1995). L’activité de ces composés est proportionnelle à la longueur de la chaı̂ne alkyle. Certains parabènes sont utilisés à des concentrations inférieures à 1 % dans les produits cosmétiques comme les crèmes, les rouges à lèvres, les lotions pour la peau, les shampooings, etc. Cependant, depuis plusieurs années ces composés sont un sujet médiatique sensible suite à une étude montrant leurs implications dans certains cancers (Darbre, 2006). Plusieurs études ont montré le pouvoir estrogénique des parabènes : le méthyl parabène, l’éthyl parabène, le n-propyle et le n-butyl parabène ont été identifiés comme faiblement estrogéniques par la méthode de dosage des récepteurs d’estrogènes chez le rat. En utilisant la méthode du « Yeast estrogen screen receptor » (YES), leur activité estrogénique est 100 000 à 30 000 fois moins estrogénique que le 17β estradiol (composé de référence) selon la longueur de la chaı̂ne alkyle (Routledge et al., 1998 ; Bazin et al., 2010). Le benzyl parabène présente l’activité la plus importante, activité qui au cours de certains tests s’est révélée être plus élevée que celle induite par le bisphénol A (Honma et al., 2002). Des résultats similaires ont été démontrés par des tests in vitro (Okubo et al., 2001 ; Morohoshi et al., 2005). Le n-butyl parabène a montré une activité estrogénique dans des essais utérotrophiques chez le rat (Routledge et al., 1998). Darbre et al. (2003) a également rapporté une augmentation de la masse utérine chez la rate induite par une exposition au benzyl parabène. En ce qui concerne les essais sur organismes aquatiques, le n-propyle induit chez le male médaka une augmentation du taux de la vitellogénine (VTG) (Inui et al., 2003). Des injections intrapéritonéales d’éthyl parabène, n-propyle et n-butyl parabène chez la truite arc-en ciel induisent une réponse estrogénique équivalente 94 I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 à celle obtenue suite à une injection de 100–300 mg.kg−1 de VTG (Pedersen et al., 2000 ; Alslev et al., 2005). Plusieurs études ont conclu que l’effet de certains parabènes sur le système endocrinien est similaire à celui induit par les estrogènes endogènes et pourraient affecter le développement ou la maturation sexuelle de nombreuses espèces vivantes (Oishi 2001, 2002a, 2002b ; Kang et al., 2002 ; Lemini et al., 2004 ; Tavares et al., 2009). D’un point de vue environnemental, peu d’études ont été menées pour déterminer le niveau de présence et le devenir de ces composés dans les milieux aquatiques. Les parabènes sont potentiellement « relargués » dans le milieu aquatique via les effluents domestiques. Bien que les stations d’épuration permettent un abattement de ces composés (Lee et al., 2005), le méthyl, éthyl, propyl et butyl parabènes ont été détectés dans des effluents à des concentrations de l’ordre du ng.L−1 (Paxeus, 1996 ; Lee et al., 2005 ; Canosa et al., 2006) ainsi qu’au niveau de certains sols et sédiments (Núñez et al., 2008). L’éthyl parabène a été détecté dans les sédiments fluviaux japonais sur deux sites d’échantillonnage à des concentrations de 3,3 mg.kg−1, les quatre autres composés étant à la limite de détection (Japan Ministry of Environment, 2002). L’objectif de ce travail est d’étudier l’effet oestrogénique, grâce à un outil in vitro (biotest YES), d’effluents de trois stations d’épuration (STEP) tunisiennes recevant différentes eaux résiduaires (eaux usées urbaines et touristiques, rejets d’industries, rejets agricoles). Le niveau de concentration des cinq principaux parabènes (benzyl parabène, buthyl parabène, éthyl parabène, propyl parabène et méthyl parabène) a ensuite été déterminé par HPLC-DAD dans ces échantillons. Une comparaison entre ces deux types d’information permet d’évaluer l’implication des parabènes dans la toxicité endocrinienne à laquelle les organismes aquatiques de diverses masses d’eaux (rivières ou eaux côtières) peuvent être soumis. 2. MATÉRIEL ET MÉTHODES 2.1. Sites de prélèvement Les échantillons ont été collectés au niveau de trois stations d’épuration dont deux d’entre elles présentent des capacités de traitements similaires (Tab. I). Le prélèvement a été fait au mois de mars 2010 en entrée et sortie de chaque station (le prélèvement est fait sur 24 h), et de chaque compartiment des boues (un prélèvement ponctuel est fait au niveau des boues activées I et II, et des boues épaissies). Ces trois stations notées A, B et C sont localisées sur le littoral tunisien (fig. 1) et traitent des eaux résiduaires venant de plusieurs origines : – – – Station A : les eaux résiduaires urbaines et industrielles (essentiellement textile), Station B : les eaux résiduaires urbaines, industrielles et touristiques, Station C : les eaux résiduaires urbaines et agricoles. Des échantillons d’eaux et de matières en suspension ont été prélevés en entrées, en sortie. Des échantillons de boues ont été recueillis à différents niveaux de la filière de traitement : boues de retour, boues activées (I et II) et enfin les boues épaissies (sortie de filière). I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 95 Tableau I. Paramètres caractérisant les stations étudiées. Table I. Parameters characterizing studied stations. Type Eau Population Débit (m3.J−1) DBO5 (kg.J−1) DCO (kg.J−1) 148 000 165 000 17 700 13500 15500 1500 3125 3350 600 8440 9040 780 Station A Station B Station C Fig. 1. Localisation géographique des trois stations d’épuration. Fig. 1. Geographical location of the three wastewater treatment plants. 2.2. Préparation des échantillons 2.2.1. Phase dissoute À partir de 1,5 L d’eau en entrée de chaque station, les matières en suspension sont séparées par centrifugation. L’eau est ensuite extraite sur phase solide selon la méthode décrite par Pillon et al. (2005). Cette méthode permet de concentrer les échantillons d’eau sur une colonne de C18 (5 g, 20 mL) en mode inverse. La colonne est préalablement conditionnée avec du méthanol et l’élution est faite avec du méthanol puis avec de l’hexane. L’éluat obtenu est ensuite évaporé à 40 °C et le résidu obtenu est dissous dans 2 mL de méthanol. 2.2.2. Phase particulaire (MES-Matières en Suspension) et boues Les MES et les boues ont été homogénéisées puis lyophilisées. Les MES et les boues sont extraites avec un mélange de solvant dichlorométhane/méthanol (2/1 ; 96 I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 80 mL) sous agitation pendant 15 min. Après centrifugation (2 min à 3500 rpm), le surnagent est filtré sur GF/C puis séché avec du sulfate de sodium anhydre. Les extraits sont ensuite évaporés à l’aide d’un évaporateur rotatif à 40 °C puis repris dans 2 mL de méthanol. Les extraits méthanol sont conservés à −20 °C en attente de l’analyse. 2.3. Test de l’activité estrogénique La Souche de levure recombinante YES (Yeast Estrogen Screen) a été fournie par le Professeur Barceló Damià (Madrid, Espagne) et contient deux plasmides le pVit (contenant dans cet ordre l’élément ERE, le promoteur CYC et le gène rapporteur Bgal) et le pHHE0 (contient l’ADNc pour le récepteur des œstrogènes sous le contrôle du promoteur ADH1) (García-Reyero et al., 2001; Bazin et al., 2010). Le principe du test de l’activité estrogénique se base sur l’expression d’un gène rapporteur LacZ et la mesure de l’activité de ce gène suite à l’activation des récepteurs des estrogènes (activité β-galactosidase). Le test est fait selon le principe décrit par Bazin et al. (2010). Le 17β-estradiol est utilisé comme composé référant. Une analyse par HPLC/ DAD est faite sur les échantillons du Galaizon de façon à connaı̂tre la présence ou non de molécules connues à activité estrogénique Cet échantillon est considéré comme un témoin négatif n’induisant pas de réponse transcriptionnelle chez le Yeast Estrogen Screen. Afin de déterminer l’EC50 du 17β-estradiol (composé de référence), une courbe de réponse a été réalisée pour neuf concentrations (1E−12, 1E−11, 1E−10, 1E−9, 1E −8, 1E−7, 1E−6, 1E−5 et 1E−4 M). De la même façon, une série de différentes dilutions des échantillons allant de 1 fois à 100 fois dilués, permet d’évaluer l’activité estrogénique de ces derniers et d’en déduire leur EC50. Ici l’EC50 est définie comme la concentration où la réponse transcriptionnelle atteint 50 % de sa valeur par rapport à des concentrations saturantes de ligand. Cette EC50 pour les échantillons est exprimée en équivalent œstradiol. 2.4. Chromatographie liquide haute performance /détecteur DAD (HPLC/DAD) Méthyl parabène (MeP), éthyl parabène (EtP), n-propyl parabène (PrP), n-butyl parabène (BuP), benzyl parabène (BzP), proviennent de Sigma-Aldrich (France). Les solutions mères de chaque parabène et les solutions contenant les cinq parabènes en mélange sont préparées dans du méthanol. Elles sont ensuite diluées dans une solution eau/méthanol (60:40) pour obtenir les concentrations filles (100, 200, 300, 400 et 500 μg). Une analyse par HPLC/DAD est faite sur les échantillons du Galaizon de façon à connaı̂tre la présence ou non de molécules connues à activité estrogénique. L’analyse des parabènes dans les différents échantillons recueillis a été réalisée par HPLC en phase inverse. L’appareil utilisé est une HPLC-DAD (Waters 2695) couplée à un détecteur de DAD (Waters 996). Une colonne « Luna PFP C18 » (15 cm × 4,6 mm ID) est utilisée avec une phase mobile eau/acétonitrile (60:40), un débit de I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 97 Tableau II. Limite de détection et de quantification déterminées dans le solvant d’extraction. Table II. Limit of detection and quantification determined in the extraction solvent. Composé Methylparaben Ethylparaben Propylparaben Butylparaben Benzylparaben \br LQ (μg.L−1) LD (μg.L−1) 1,6 2 2,7 3,2 1,7 1 1 1 1 1 1 mL/min. La séparation et les analyses ont été effectuées à température ambiante. La détection parabènes a été réalisée à 257 nm. Les performances de la méthode d’analyse ont été évaluées en étudiant, la linéarité, la répétabilité, la spécificité (eaux de rivière et effluents de STEP). Les limites de détections et de quantification analytique sont déterminées dans le solvant d’extraction (tab. II). Les limites de détection et de quantification pour les échantillons (phase dissoute, MES, boues) sont calculées en tenant compte des facteurs de concentration lors de l’extraction. 3. RÉSULTATS ET DISCUSSION 3.1. Détermination de l’activité estrogénique des eaux usées par le Yeast Estrogen Screen De nombreuses études publiées ont montré la faisabilité de l’utilisation des modèles in vitro comme le biotest YES (Yeast Estrogen Screen) pour la détection d’activité estrogénique due à des polluants organiques au sein de mélanges environnementaux complexes tels que des extraits d’effluents ou de sédiments. Ce test est basé sur des levures génétiquement modifiées répondant aux contaminants oestrogéniques. En présence d’oestrogènes, les échantillons à tester entraînent l’expression de la β-galactosidase. Son activité est mesurée par fluorescence à 460 nm après excitation à 355 nm. En pratique, différentes dilutions des extraits à analyser sont testées pour leur capacité à induire une réponse in vitro. Après avoir vérifié que les échantillons de rivière (eau du Galaizon d’Alès) «qui n’ont pas de molécules connues à activité estrogénique » n’induisent pas de réponse transcriptionnelle, les résultats obtenus par le Yeast Estrogen Screen montrent que tous les sites de prélèvement étudiés ont une activité estrogénique (tab. III). Lorsque les échantillons ne sont pas dilués, leur activité estrogénique varie de 2,5 % à 85 %. Le niveau d’œstrogénicité varie selon les stations mais également selon l’échantillon. Les matières en suspension (MES) quel que soit le site de prelèvement ont une activité estrogénique faible. Cette activité varie de 2,5 % à 8 % pour des échantillons non dilués. De ce fait, la comparaison de la concentration effective (EC50) de ces échantillons avec celle de la substance de référence (e.g. le 17β œstradiol) montre que la charge équivalente en estradiol avoisine 10−11 M pour la phase particulaire 98 I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 Tableau III. Activité estrogénique des échantillons exprimée en pourcent par rapport à l’activité du 17β estradiol (10−9 M). Table III. Sample estrogenic activity expressed as percent relative to the activity of 17 β estradiol (10−9M). Phase dissoute Station A Station B Station C MES Boues Entrée Sortie Entrée Sortie De retour Activée 26 19,5 32 39 39 61 8 6 2,5 6 5 6 51 56 85 72 76,5 83,5 Activée II 62 69 ND Épaissies 43,6 48 54 Tableau IV. EC50 des échantillons étudiés. Table IV. EC50 of studied samples. Phase dissoute Station A Station B Station C MES Boues Entrée Sortie Entrée Sortie Boues de retour 2E−10 2,5E−11 3E−10 1,8E−09 1,8E−09 1E−08 1,5E−11 1,5E−11 5E−10 1E−11 5E−12 1E−11 2E−09 2E−09 1E−08 Boues activee I Boues activee II Boues epaissies 9E−09 9,6E−09 3E−08 5E−09 5,3E−09 ND 1E−09 1,2E−09 2,1E−09 (tab. IV). Les échantillons de boues ont la plus forte activité, entre 43 % et 85 % selon les échantillons et leurs EC50 peuvent atteindre 9 10−8 M équivalent œstradiol (tab. IV). Concernant la phase dissoute, l’activité estrogénique est importante et varie en entrée de station de 19,5 % à 32 % et en sortie de 39 % à 61 % selon les stations (tab. III). Les EC50 des échantillons est de l’ordre de 10−9 et 10−8 M équivalent œstradiol (tab. IV). Cette expérience montre que la contamination globale en composés estrogéniques des effluents reste importante en sortie de station. Pour les trois stations sélectionnées, l’activité oestrogénique, provenant des eaux résiduaires urbaines, touristique et industrielles (station A et B), est moins élevée que celle des eaux résiduaires urbaines combinées aux eaux résiduaires agricoles (Station C). 3.2. Détermination de la concentration de parabenes dans les eaux usées par HPLC-DAD Pour les 3 stations, les niveaux de contamination par les parabènes ont été mesurés dans les différentes matrices (phase dissoute, MES, boues). Les résultats obtenus ont été interprétés en tenant compte de l’effet de matrice des différents échantillons. Les cinq parabènes ont été identifiés dans les échantillons d’eau à l’entrée de chaque station. La concentration moyenne de la phase dissoute est de l’ordre du μg.L−1, de l’ordre du μg.g−1 dans les MES (tab. V). Dans les boues, ces I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 99 Tableau V. Concentrations mesurées des cinq parabènes dans les phases dissoutes (μg.L−1) et particulaires (μg.g−1). Table V. Measured concentrations of five parabens in the dissolved phase (μg.L−1) and particulate (μg.g−1). Station A Phase dissoute MES Methyl Ethyl Propyl Buthyl Benzyl Methyl Ethyl Propyl Buthyl Benzyl Station B Station C Entrée Sortie Entrée Sortie Entrée Sortie 560 2,5 0,3 0,4 4 74 <LD <LQ <LD <LD 443 <LD 0,1 0,1 0,2 268 64 101 <LD <LD 3 1 1,6 1,3 1,5 <LQ 21 13,7 0 19 <LQ <LD 0,04 <LD 0,2 <LD <LD <LD <LD <LD 1 2 2,7 16,3 2 <LD <LD <LD 413 <LD 3,4 <LD <LD <LD 0,04 <LD 13 <LD <LD <LD Tableau VI. Concentrations mesurées des cinq parabènes dans les boues (μg.g−1). Table VI. Measured concentrations of five parabens in sludge (μg.g−1). Station A Station B Station C Boues de retour Boues activée Boues activée II Boues épaissies Boues de retour Boues activée Boues activée II Boues épaissies Boues de retour Boues activée Boues épaissies Methyl Ethyl Buthyl Benzyl 117 79 112 185 121 88 113 189 112 <LQ 106 495 237 3503 954 595 237 2043 1080 137 170 505 253 246 2366 451 253 236 2445 464 168 50 464 <LD 2 87,8 <LQ <LD 2,3 198,8 <LD 2,9 <LQ <LQ concentrations sont de l’ordre de la centaine de μg.g−1 pouvant aller au-delà du mg.g−1 selon les prélèvements (tab. VI). Le méthyl parabène est le plus fréquemment détecté dans les échantillons en entrée et en sortie des stations, sa concentration passe de 560 μg.L−1 à 442 μg.L−1 pour la station A. Pour les autres stations, sa concentration avoisine 3 μg.L−1 en entrée et ce composé n’est plus quantifiable en sortie. La station reçoit des effluents provenant d’une industrie textile. Des échantillons de cet effluent ont été analysés et ont révélé une forte concentration de méthyl parabène, de l’ordre de 400 μg.L−1 (résultats non présentés). La présence de méthyl parabène dans les eaux de la station A est corrélée à la présence de ce même composé dans l’effluent industriel qui alimente la station en partie. Concernant l’EtP, le BtP, le PrP et le BzP en entrée comme en sortie, le niveau de contamination suit une répartition similaire 100 I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 pour trois stations. Ces concentrations sont comprises entre 1 et 2,5 μg.L−1 en entrée et ne sont plus quantifiables en sortie pour l’EtP. Le Prp, le BuP et le BzP sont en général détectés en entrée et en sortie avec des concentrations de 1 μg.L−1 en sortie de station. Le butyl est fortement présent en entrée de la station C (eaux résiduaires urbaine et agricoles) avec des concentrations atteignant 16 μg.L−1. Dans la station C, il y a un seul bassin d’activation contrairement aux deux autres stations où le butyl parabène s’adsorbe fortement. Au niveau du bassin d’activation II, plus de 2000 μg. g−1 de BuP sont accumulés dans les boues des stations A et B. La présence de ces bassin d’activation semble influer sur la présence de ce composé dans les boues épaissies, les MES et la phase dissoute (notamment en entrée de station) (tab. V). Ces résultats sont en accord avec la littérature, et montrent que les composés les plus fréquemment retrouvés sont le MeP, l’EtP, le PrP et le BuP du fait de leur grande utilisation dans les produits cosmétiques (Lee et al., 2005 ; Jonkers et al., 2009 ; Kasprzyk-Hordern et al., 2009 ; González-Mariño et al., 2011). Les concentrations de ces composés peuvent atteindre 12,6 μg.L−1 dans la phase dissoute d’eau usées collectées en entrée de station (Andersen et al., 2007). Récemment, une étude menée dans les émissaires franciliens montre des concentrations de MeP atteignant des concentrations de 21 μg.L−1 (Geara-Matta et al., 2011). Au niveau des MES, les résultats sont moins homogènes entre les trois stations. Le MeP est retrouvé à de fortes concentrations en entrée (75 μg.g−1) et en sortie (268 μg.g−1) de la station A comme déjà observé dans la phase dissoute des effluents. De plus, de façon surprenante, l’EtP est présent en sortie de cette station alors que le composé est difficilement détecté en entrée. Au niveau des deux autres stations, l’EtP, le PrP et le BzP sont détectés en entrée de la staion B et ne sont plus retrouvés en sortie. Au niveau de la station C, le BtP est très fortement concentré dans les MES en entrée (413 μg.g−1). Concernant les échantillons de boue, les cinq composés sont détectés et quantifiés. Les composés les plus concentrés sont l’EtP suivi du BuP et du MeP à des concentrations allant respectivement de 136 μg.g−1 à 3500 μg.g−1 et de 50 μg.g−1 à 2500 μg. g−1 et 79 μg.g−1 à 189 μg.g−1 (tab. VI). Le BzP se concentre dans les boues activées du type II et n’est pas quantifié dans les autres échantillons. Le propyl n’est détecté dans aucun échantillon. La particularité de la station A (récupération d’un effluent industriel fortement chargé en méthyl parabène) conserve une concentration non négligeable de se composés dans les trois niveaux des échantillons (phase dissoute, MES et boues). Les parabènes sont des composés lipophiles avec un coefficient de partage octanol/eau qui augmente avec la chaı̂ne carbonée (LogKow 1.66 pour le methyl parabène ; 3.24 pour le butyl parabène) ce qui permet leur adsorption dans les boues (tab. VI). 4. CONCLUSION Cette étude est la première étude réalisée en Tunisie pour la quantification simultanée de cinq parabènes dans la phase dissoute, les matières en suspension et les boues de stations d’épuration. Nos résultats montrent que l’activité estrogénique détectée par le test in vitro peut expliquer seulement en partie la présence de ces composés dans les eaux et principalement dans les boues qui servent ensuite à l’épandage en champs. En effet, les résultats obtenus par le test in vitro Yeast Estrogen Screen, spécifique d’un mode d’action (substance ayant la capacité de se fixer sur les récepteurs aux œstrogènes en mimant l’effet d’hormones naturelles), I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 101 sont dépendants des autres substances perturbatrices présentes dans des échantillons complexes comme des effluents de stations d’épuration. Contrairement aux résultats obtenus en HPLC/DAD (qui donne des concentrations de composés dans les échantillons), la forte concentration de parabènes n’est pas toujours corrélée avec l’activité transcriptionnelle du test in vitro. D’autres composés peuvent inhiber l’activité transcriptionnelle ou d’autres composés non recherchés en HPLC/DAD peuvent augmenter cette activité. En effet en entrée de la station A, l’activité du test YES est plus faible que l’activité estrogénique théorique représentée par la présence des parabènes détectés en HPLC/DAD. Les résultats montrent également que l’activité agricole impacte de façon plus importante que l’activité touristique et urbaine sur l’activité estrogénique dans la phase dissoute. Les prélèvements effectués en entrée et en sortie des stations ayant été faits le même jour, la variation de l’activité estrogénique et des parabènes journalière ne peut être interprété. Cependant, il semble que ces stations n’aient pas la capacité d’élimer totalement et de façon régulière l’activité estrogénique de certains parabènes comme le méthyl et le benzylparabène. Certains de ces composés ont une affinité pour les boues et pour les matières en suspension telle que ces derniers deviennent un réservoir environnemental pour ces composés notamment si les boues sont épandues aux champs. L’ensemble de ces résultats montrent que le niveau de concentration dans l’environnement des parabènes est à surveiller. En effet, l’activité en tant que perturbateur endocrinien des parabènes a été décrite pour la première fois par Routledge et al. (1998) in vivo et in vitro. Dans le milieu aquatique, certaines études ont prouvé que l’exposition à certains parabènes à de faibles concentrations (μg.L−1) induit une réponse vitellogénique chez la truite arc-en-ciel juvénile (Alslev et al., 2005). Leur EC50 étant comprise entre 5 et 30 mg.L−1 pour Daphnia magna, le méthyl- (MeP), l’éthyl- (EtP) et le propylparabène (PrP) sont considérés comme modérément toxiques tandis que le butyl- (BuP) et le benzyl- (BzP) sont classés parmi les substances très toxiques (1 < EC50 < 10 mg.L−1). Par comparaison avec d’autres composés tels que le bisphénol A (EC50 = 10 mg.L−1) et les phtalates (4 < EC50 < 103 mg.L−1 pour Daphnia magna), le suivi des parabènes dans l’environnement interpelle. REFERENCES Alslev B., Korsgaard B. and Bjerregaard P., 2005. Estrogenicity of butylparaben in rainbow trout Oncorhynchus mykiss exposed via food and water. Aquat. Toxicol., 72, 295. Andersen H.R., Lundsbye M., Wedel H.V., Eriksson E. and Ledin A., 2007. Estrogenic personal care products in a greywater reuse system. Water Sci. Technol., 56, 45. Bazin I., Gadal A., Touraud E. and Roig B., 2010. Hydroxy benzoate preservatives (parabens) in the environment: data for environmental toxicity assessment. Environ. Pol., 16, 245. Canosa P., Rodríguez I., Rubí E., Bollaín M.H. and Cela R., 2006. Optimisation of a solidphase microextraction method for the determination of parabens in water samples at the low ng per litre level. J. Chromatogr. A, 1124, 3. Darbre P.D., 2006. Environmental oestrogens, cosmetics and breast cancer. Best. Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., 20, 121. Darbre P.D., Byford J.R., Shaw L.E., Hall S., Coldham N.G., Pope G.S. and Sauer M.J., 2003. Oestrogenic activity of benzylparaben. J. Appl. Toxicol., 23, 43. Directive 2001/41/CE du Parlement européen et du Conseil, Document 301L0041(01) Journal officiel n° L 194 du 18/07/2001 p. 0036 – 0037. 102 I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 García-Reyero N., Grau E., Castillo M., López de Alda M.J., Barceló D. and Piña B., 2001. Monitoring of endocrine disruptors in surface waters by the yeast recombinant assay. J. Environ. Toxicol. Chem., 20, 1152–1158. Geara-Matta D., Lorgeoux C., Rocher V., Chebbo G. et Moilleron R., 2011. Contamination des eaux usées par les perturbateurs endocriniens : protocole d’analyse et résultats pour le tricolsen, le triclorocarban et les parabénes. TSM, 10, 17. González-Mariño I., Quintana J.B., Rodríguez I. and Cela, R., 2011. Simultaneous determination of parabens, triclosan and triclocarban in water by liquid chromatography/electrospray ionisation tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom., 23, 1756. Guillette L.J., Gross Jr. T.S., Masson G.R., Matter J.M., Percival H.F. and Woodward, A.R., 1994. Developmental abnormalities of the gonad and abnormal sex hormone concentrations in juvenile alligators from contaminated and control lakes in Florida. Environ. Health Perspect., 102, 680. Honma S., Suzuki A., Buchanan D.L., Katsu Y., Watanabe H. and Iguchi T., 2002. Low dose effect of in utero exposure to bisphenol A and diethylstilbestrol on female mouse reproduction. Reprod. Toxicol., 16, 117. Inui M., Adachi T., Takenaka S., Inui H., Nakazawa M., Ueda M., Watanabe H., Mori C., Iguchi T. and Miyatake K., 2003. Effect of UV screens and preservatives on vitellogenin and choriogenin production in male medaka (Oryzias latipes). Toxicology, 194, 43. Japan Ministry of Environment, 2002. Chimical substances and environment, fiscal year 2001. http://www.env.go.jp/chemi/kurohon/http2001/index.html (in Japanese). Jobling S., Nolan M., Tyler C.R., Brighty G. and Sumpter J.P., 1998. Widespread sexual disruption in wild fish. Environ. Sci. Technol., 32, 2498. Jonkers N., Kohler H.-P.E., Dammshäuser A. and Giger W., 2009. Mass flows of endocrine disruptors in the Glatt River during varying weather conditions. Environ. Pollut., 157, 714. Kang K.S., Cho S.D. and Lee Y.S., 2002. Additive estrogenic activities of the binary mixtures of four estrogenic chemicals in recombinant yeast expressing human estrogen receptor. J. Vet. Sci., 3, 1. Kasprzyk-Hordern B., Dinsdale R.M. and Guwy A.J., 2009. The removal of pharmaceuticals, personal care products, endocrine disruptors and illicit drugs during wastewater treatment and its impact on the quality of receiving waters. Water Res., 43, 363. Lee H.B., Peart T.E. and Svoboda M.L., 2005. Determination of endocrine-disrupting phenols, acidic pharmaceuticals, and personal-care products in sewage by solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1094, 122. Lemini C., Hernández A., Jaimez R., Franco Y., Avila M.E. and Castell A., 2004. Morphometric analysis of mice uteri treated with the preservatives methyl, ethyl, propyl, and butylparaben. Toxical. Ind. Health, 20, 123. Morohoshi K., Yamamoto H., Kamata R., Shiraishi F., Koda T. and Morita M., 2005. Estrogenic activity of 37 components of commercial sunscreen lotions evaluated by in vitro assays. Toxicol. In Vitro, 19, 457. Núñez L., Tadeo J.L., García-Valcárcel A.I. and Turiel E., 2008. Determination of parabens in environmental solid samples by ultrasonic-assisted extraction and liquid chromatography with triple quadrupole mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1214, 178. Oishi S., 2001. Effects of butylparaben on the male reproductive system in rats. Toxicol. Ind. Health, 17, 31. Oishi S., 2002a. Effects of butyl paraben on the male reproductive system in mice. Arch. Toxicol., 76, 423. Oishi S., 2002b. Effects of propyl paraben on the male reproductive system. Food Chim. Toxicol., 40, 1807. I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103 103 Okubo T., Yokoyama Y., Kano K. and Kano I., 2001. ER-dependent estrogenic activity of parabens assessed by proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and expression of ERalpha and PR. Food Chim. Toxicol., 39, 1225. Paxeus N., 1996. Organic polluants in the effluents of large wastewater treatment plants in Sweden. Water Res., 30, 1115. Pedersen K.L., Pedersen S.N., Christiansen L.B., Korsgaard B. and Bjerregaard P., 2000. The preservatives ethyl-, propyl- and butylparaben are oestrogenic in an in vivo fish assay. Pharmacol. Toxicol., 86, 110. Pillon A., Boussioux A.M., Escande A., Aı̈t-Aı̈ssa S., Gomez E., Fenet H., Ruff M., Moras D., Vignon F., Duchesne M.J., Casellas C., Nicolas J.C. and Balaguer P., 2005. Binding of estrogenic compounds to recombinant estrogen receptor alpha: Application to environmental analysis. Environmental Health Perspectives, 113, 278. Rastogi S.C., Schouten A., Kruuf N.D. and Weijland J.W., 1995. Contents of methyl-, ethyl-, butyl- and benzylparaben in cosmetic products. Contact Dermatitis, 32, 28. Routledge E.J., Parker J., Odum J., Ashby J. and Sumpter J.P., 1998. Some alkyl hydroxy benzoate preservatives (parabens) are estrogenic. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 12. Sumpter J.P., 1995. Feminized response in fish to environmental estrogens. Toxicol. Lett., 82, 737. Sumpter J.P. and Jobling S., 1995. Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environ. Health Perspect., 103, 173. Tavares R.S., Martins F.C., Oliveira P.J., Ramalho-Santos J. and Peixoto F.P., 2009. Parabens in male infertility-is there a mitochondrial connection? Reprod. Toxicol, 27, 1. 2. Activité oestrogéniques de colorants alimentaires dans le Yeast Estrogen Screen (YES) Nous sommes exposés tous les jours à de nombreuses substances de synthèse issues de l’industrie chimique par le biais de nombreuses sources dont notre alimentation. Certains additifs et colorants retrouvés dans les denrées alimentaires ont la capacité de perturber notre système hormonal. Comme nous l’avons vu dans l’article précédent, certains parabènes comme le propyl et le butyl parabène sont des conservateurs et des additifs utilisés dans les aliments qui ont la capacité de mimer l’oestrogène naturel. Par exemple, le propyl gallate (E310) utilisé comme anti-oxydant est un xéno-estrogène (Amadasi et al., 200). Parmi ces xéno-estrogènes se retrouvent également certains colorants comme la tartazine (E102), l’érytrosine B (E127) ou encore le Sudan (rouge de Sudan) qui n’est plus autorisé dans l’Union Européenne depuis 1995. Ce volet de recherche a pour but de tester l’aptitude de cinq colorants alimentaires, à induire une réponse oestrogénique en utilisant le YES (Yeast Estrogen Screen) et de comparer cette activité à celle de cinq parabènes couramment utilisés (méthyl parabène (MeP), éthyl parabène (EtP), propyl parabène (PrP), butyl parabène (BuP), benzyl parabène (BzP)). Et dont l’activité oestrogénique est connue. Ces travaux ont été publiés dans Journal of Ecosystem & Ecography Volume 3 : 128. 2013, Pages 1-5. Dans cette étude nous avons testé, pour la première fois, l’induction de l’activité oestrogénique de colorants alimentaires avec le YES. En effet, le YES a été développé pour l’identification et la caractérisation de composés capables de se lier au récepteur des oestrogènes (Roultdge et al., 1996). La spécificité de ce test au composé oestrogénique est expliquée par le nature du récepteur aux oestrogènes où le site de liaison est plus flexible (Bistan et al., 2012). De ce fait, le récepteur des oestrogènes devient une cible plus vulnérable à un large éventail de composés qui possèdent des analogies structurales avec le 17 βoestradiol, comme les oestrogènes synthétiques, le bisphénol A, le nonylphénol et les phytooestrogènes. Parmi les colorants testés, seuls deux composés ont la capacité d’induire une activité oestrogénique avec le YES, l’E171 (Dioxyde de titane) et l’E132 (l’indigotine). Le tableau 16 présente les activités oestrogéniques de différents colorants. L’E171 a une activité oestrogénique de 33% à une concentration de 1g/l. Cette activité oestrogénique est faible en comparaison de celle induite par les 17β-oestradiol et les parabènes. En effet, ce colorant est 106 fois moins oestrogénique que le 17 β-oestradiol, 102 Tableau 16 : Activité oestrogénique relative des cinq colorants alimentaires (1g/l). Composés E2 E122 E104 E132 E 124 E171 Activité oestrogénique agoniste (E2 %) 100 (10-9M) 0 0 10 0.93 33 L’inhibition par 4-OH-TAM de l’activité oestrogénique induite par le colorant dans le YES démontre que ce composé est un xéno-oestrogène comme les parabènes. Le 4-OH-TAM inhibe l’induction du ERE. 103 Bazin et al., J Ecosys Ecograph 2013, 3:3 http://dx.doi.org/10.4172/2157-7625.1000128 Ecosystem & Ecography Research Article Research Article Open OpenAccess Access YES as a Tool for Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives Compounds: E 104, E 122, E 124, E 132 and E 171 Ingrid Bazin1*, Aziza Ibn Hadj Hassine1, Wissem Mnif2 and Catherine Gonzalez1 1 2 Ecole des Mines d’Alès, LGEI center, 6 avenue de Clavière 30319 Alès Cedex, France Laboratory of Biochemistry, Institute of Biotechnology, Monastir, Tunisia Abstract The toxicity (mutagenic and carcinogenic effects) of food dyes (used like food additive) has been well documented. However the endocrine disrupting effects of these dyes have been poorly investigated. We studied five commercial food dyes for their agonistic estrogen activity and do a comparison with estrogenic activity of some paraben (other food additives compounds). Total estrogenic activities were measured using the Yeast Estrogen Screen bioassay (YES). The estrogenic potency of the food dyes was measured by dose-response curves and compared to a doseresponse curve of 17-β-estradiol (E2), (reference compound). Estrogen EC50 values have been calculated using standard linear regression methods. Among these compounds, three food dyes, indigotine (E 132), the monoazo dye Ponceau 4R (E 124) and the inorganic dye titanium dioxide (E 171), revealed weak estrogenic activity. Negative results were obtained for Quinoline Yellow (E 104). Keywords: Food dyes; Paraben; Food additives; Estrogenic activity Introduction Food additives are artificial ingredients added to foods, medications and cosmetics in order to enhance flavour, colour, and texture. They facilitate the preparation and prevent spoiling. The most common food additives are: Aspartame Monosodium Glutamate (MSG), Sodium Nitrate, parabens and dyes like tartrazine (Yellow Dye #5). Although many of these individual additives are included in small amounts individual average consumption is estimated at about 5 pounds of synthetic additives in total each year. If we include sugar data - as it’s the most used additive by the food industry - then that number increases to 135 pounds a year. Between them we can find food dyes (like tartrazine the most widely used) and parabens (methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben and isobutylparaben). The most common health issue that occurs from the intake of food additives is the worsening of asthmatic symptoms and development of allergies. But safety of some of them is well known. For example, the safety of parabens has been debated overlooked to male and female breast, testicular cancer and fertility, they are able to mimic estrogens [1-5]. Except quinolone, food colors are relatively weak mutagen and certified as safe additives despite reports that some people have allergic reactions towards them [6]. However, studies have revealed toxic effects of many colorants [7]. All these compounds are classified as xenoestrogens. Xenoestrogens are exogenous chemicals able to modulate endogenous estrogen activity through, for example, structural similarities leads to receptors interactions or estrogen metabolizing enzymes. A common mode of action is with xenoestrogens shows an affinity for Estrogen Receptors (ER) and subsequently causes endocrine disruption through this interaction [8]. Other chemicals may bind to other receptors related to ERs and modulate their functioning [9]. The Estrogen Receptor (ER) is the key factor that elicits estrogenic response in vertebrates. Several structural trends have been identified to be potential ligands for the ER. Various additives like parabens have been proven to be endocrine disruptor compounds using either in vivo or in vitro assay [10]. Recombinant Yeast Assays (RYA) (or Yeast Estrogen Screen) based on use of estrogen receptors of vertebrates are convenient functional assays to evaluate the potential endocrine disruption of a substance [11]. But few studies have focused on the J Ecosys Ecograph ISSN:2157-7625 JEE, an open access journal estrogenic activity of food dyes. Studies concern mainly food colors such as tartazine (E 102), sudan I and erythrosine B (E 127) which have effects on the chromosomal structure and can increase Estrogen Receptor (ER) site-specific DNA binding effect to Estrogen Response Element (ERE) in HTB 133 cells [12,13] and in the E-screen test [14]. Axon et al. [15] helped to identify several modulator of the human ER among food additives such as tartazine and sunset yellow. In the current work, we sought to detect the presence of xenobiotic ER agonists between various food additives using the Yeast Estrogen Screen (YES). Materials and Methods Selected compounds Selected compounds methylparaben (MP), ethylparaben (EP), n-propylparaben (PP), n-butylparaben (BP), and 17-β-estradiol (E2) were purchased from Sigma-Aldrich (Table 1). All stock solutions were prepared in methanol and serially diluted in distilled water to obtain the targeted concentrations. For each paraben the endocrine activity was assessed at various concentrations in the range of 10-9 to 10-3 M. The methanol concentration in the exposure solutions, including controls was 0.01% (v/v) in the tested solutions, which is a non-effective dose as estimated in preliminary tests. A selection of currently used dyes was chosen for this study. These dyes were selected on the basis of their potential use food industries (http://www.omicsonline.org/2155-6199/2155-6199-1-110. php#Table1) For each dye, a stock solution (0.1 M) was prepared by dissolving *Corresponding author: Ingrid Bazin, Ecole des Mines d’Alès, LGEI center, 6 avenue de Clavière 30319 Alès Cedex, France, E-mail: [email protected] Received May 27, 2013; Accepted June 25, 2013; Published June 27, 2013 Citation: Bazin I, Hassine AIH, Mnif W, Gonzalez C (2013) YES as a Tool for Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives Compounds: E 104, E 122, E 124, E 132 and E 171. J Ecosys Ecograph 3: 128. doi:10.4172/2157-7625.1000128 Copyright: © 2013 Bazin I, et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Volume 3 • Issue 3 • 1000128 Citation: Bazin I, Hassine AIH, Mnif W, Gonzalez C (2013) YES as a Tool for Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives Compounds: E 104, E 122, E 124, E 132 and E 171. J Ecosys Ecograph 3: 128. doi:10.4172/2157-7625.1000128 Page 2 of 5 Code foodstuf CAS # Class Formula E 218 99-76-3 ------ C8H8O3 ethylparaben E 214 120-47-8 ------ C9H10O3 propylparaben E 216 94-13-3 ------ C10H12O3 butylparaben ------ 94-26-8 ------ C11H12O3 Azorubine, E122 3567-69-9 monoazo C20H12N2O7S2Na2 Quinoline Yellow E104 8004-92-0 quinophtalone C18H9NO8S2Na2 indigotine E132 860-22-0 indigoid C16 H8N2O8S2Na2 Ponceau 4R E 124 2611-036-2 monoazo C20H11N2O10S3Na3 Titanium Dioxyde E171 13463-67-7 inorganic TiO2 Table 1: compounds analyzed in this study. in distilled water, followed by filtration through Whatmann No. 5 filter paper. All these dyes appeared perfectly soluble in water at this concentration as assessed by the absence of precipitate. For each dye, the endocrine activity was assessed at four concentrations in the range of 1×10−6 M to 1×10-2 M. The natural fluorescence of the dyes and their interference on the fluorescence emitted by yeast was determined beforehand in order to avoid spurious signals generated by the YES test in our experimental conditions. The fluorescence of each dye has been measured in the absence of yeast cells and subtracted from the data obtained for estrogenic tests. The cytotoxicity of each dye was evaluated by measuring yeast growth at an O.D. of 600 nm. Yeast estrogen screen assay (YES) Yeast strain BY4741 (MATa ura3D0 leu2D0 his3D1 met15D0) was obtained from Euroscarf, Frankfurt, Germany. Expression plasmid pH5HE0 contains the human estrogen cloned into the constitutive yeast expression vector pAAH5 [11]. Plasmid pVITB2x encompasses the reporter gene beta-galactosidase from Escherichia coli fused to the yeast CYC1 promoter and under the control of the pseudopalindromic Estrogen Responsive Element ERE2 from Xenopus laevis vitellogenin B1 gene (50-AGTCACTGTGACC-30 , two copies) [11]. The test measures β-galactosidase activity with 4-methylumbelliferone β-Dgalactopyranoside (fluorescence at 460 nm and excitation at 355 nm) with a fluorimeter (Fluoroskan Twinkle LB 970, BERTHOLD Technologies) after 6 h of exposure to the compounds. Tests were performed in 96-well plates. To determine the estrogen agonistic activity of studied compounds, E2 was used as a positive control and distillated water was used as a negative control. Stock solutions of MP, EP, PP BP (10-2 M), 17 β -estradiol (10-3 M), and dyes (0.1 M) are prepared in methanol and serially diluted in distilled water. The transformed yeast strain were grown overnight at 30°C in a non-selective medium (YPD: 5 g/L yeast extract, 10 g/L peptone, 20 g/L glucose, all from Sigma-Aldrich, France). The following day, 15 µl of saturated culture is added to 15 ml of selective media (SD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, DIFCO, Basel, Switzerland; 20 g/L glucose, supplemented with 0.1 g/L of prototrofic markers as required). The final culture was diluted in selective media and adjusted to an optical density (DO) between 0.1-0.2 at 600 nm. 45 µl aliquots were transferred into a 96-well polypropylene microtiter plate. 5 µl aliquots of each sample were then dispensed into wells in quadruplicate. This experimentation was carried out 3 times in order to obtain representative statistical data. After 6h incubation, 50 µl of YPER (Pierce, Rockford, IL, USA) were added to each well and incubated at 30°C for 30 min. 50 µl of buffer Z ( 60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, pH 7.0 plus 0.5% 2-mercaptoethanol (Fluka), 1% Triton X-100 (Sigma), 4-methylubelliferyl β-DJ Ecosys Ecograph ISSN:2157-7625 JEE, an open access journal Galactoside (Sigma)) were added to the cell lysat then incubated at room temperature for 30 min after a centrifugation at 1000 rpm for 1 min. The fluorescence was mesured at 460 nm (excitation at 355 nm and emission at 460 nm). Confirmation of human ER activation by xenobiotics was made with 4 Hydroxytamoxifen (4-OH-TAM). 0.5 µM of 4-OH-TAM was added to yeast cell prior to addition of potential ER activator. 4 OH-TAM competitively binds to estrogen receptors on tumor cells and other tissue targets, producing a nuclear complex that decreases DNA synthesis and inhibits estrogen effects. After 6h exposure to binary mixture, β-D-galactosidase activity was determined. Calculation of EC50 values: EC50 values, defined as the concentration where transcriptional response reaches 50% of its value at saturating concentration of ligand, were calculated from dose-response assays, using 5 or 7 concentrations for parabens, 5 concentrations of dyes and 8 concentrations for 17-β-estradiol. Results and Discussion Natural and artificial azo dyes and parabens are widely used as coloring agents for food ingredients, drugs and cosmetics. These toxicological effects can vary from carcinogenicity and mutagenicity to genotoxicity. Many azo dyes are genotoxic in short-term tests and carcinogenic in laboratory animals [7]. The genotoxicity of these dyes are controversial, it were classified as genotoxic in one review [7] but not in another [16]. To our knowledge, food additives such as ponceau 4R, azorubine, titanium dioxyde or indigotine have not been examined and/or reported to be estrogenic chemicals. Accordingly, we investigated their potency of action in the yeast/(ERE) 2-pLacZ reporter gene assay. Figure 1 illustrates a typical dose–response for E2 on relative reporter gene expression in yeast cells transfected with (ERE) 2-pLacZ. In our experimental conditions the EC50 is 3.77*10-10 M (22 ng/L). These data were used to calculate EC50% values for a range of compounds. Table 2 and Figure 2 demonstrate that some formulation compounds of cosmetics such as paraben esters, are human ER agonists [17], in our assay. A correlation between the length of the paraben ester chain and the estrogenicity has been also pointed out [17,18]. In addition the cosmetic and food additives titanium dioxide and indigotine were also shown to be ER_ agonists (Figure 2). They induce a concentrationdependent response in yeast cell. As shown in Figure 2, the estrogenic potency of food dyes is very weak compared to that of E2 or some parabens. As previously reported [15], the food dye quinolone yellow 120 100 80 Relative activity (%) compound methylparaben 60 40 20 0 1E-13 1E-12 1E-11 1E-10 1E-09 1E-08 1E-07 1E-06 1E-05 1E-04 1E-03 E2 concentration (M) Figure 1: Dose-response curve for 17β estradiol (E2) in distilled water . Average ± standard deviation (n=3). Volume 3 • Issue 3 • 1000128 Citation: Bazin I, Hassine AIH, Mnif W, Gonzalez C (2013) YES as a Tool for Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives Compounds: E 104, E 122, E 124, E 132 and E 171. J Ecosys Ecograph 3: 128. doi:10.4172/2157-7625.1000128 Page 3 of 5 was not shown to be an ER agonist (Figure 2). Table 2 demonstrates that food colorings such as indigotine, ponceau Red 4 and titanium dioxide – the most potent food xenoestrogens examined in this study - were approximately 106 times less effective that E2 at activating the human ER in the Yeast cell. The most xenoestrogen between paraben used like food additive is butylparaben. In 2003, butylparaben was cleared by the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) for use as a flavoring agent “at very low levels” (not specified) [19]. Butylparaben is used as a food additive in Japan and as an additive to beer to retard microbial growth. Recently, a call for data regarding suggested limits for the use of butylparaben as a food additive [20]. 120 BP PP 80 EP % of E2 response 100 MP E2 titanium dioxide indigotine 60 40 20 0 1E-14 1E-12 1E-10 1E-08 0,000001 0,0001 0,01 1 Table 2 also demonstrates that food colorings are generally less potent activators of the human ER than parabens compounds. concentration (M) Figure 2: Response of the yeast estrogen screen to a range of parabens of varying alkyl group size (Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben and Butylparaben), some food dyes (titanium dioxide and indigotine) and 17β-estradiol (E2), dose response curves were normalized to maximum E2 response. We have analyzed if 4 OH-TAM (a classical ER antagonist) can inhibit the estrogenic activity induced by studied compounds. Inhibition of the induction of (ERE) 2-pLacZ reporter can confirm that studied compounds induce an estrogenic effect in yeast cells. Figure 3 demonstrates that (ERE) 2-pLacZ reporter gene induced activity using E2 as well as with benzylparaben, butylparaben, propylparaben ethylparaben, indigotine and titanium dioxide, were inhibited by 4 OHTAM. E2 10 nM Methyl Parabem 10 µM Ethyl Parabem + 4 0 H - TA M Propyl Parabem Our assays consist on an engineered yeast strain that harbors two foreign genetic elements: a vertebrate receptor, human Estrogen Receptor (hER), in our case and a reporter gene. Expression of reporter gene, LacZ, is dependent on the occurrence of estrogens. The final product concentration is easy to quantify, the beta-galactosidase activity. The mechanism of YES is shown in the Figure 4. This is a simplified version of the mechanisms used by natural estrogens to operate in vertebrates. The fundamental similarity of the transcriptional machinery in all eukaryotes ensures that it is similar also on yeast. In a strict sense, the YES assay detects only agonists of the ER, which are, substances that bind to ER and elicit transcriptional response in this simplified system. In conclusion some food dyes like titanium dioxide Butyl Parabem Ponceau R4 titanium dioxyde 1 mM indigotine Quinoline yellow Azorubine 0 20 40 60 80 100 120 Estrogenic activity (%) Figure 3: Effect of 4-OH-TAM on estrogenic activity of selected food additives. The selected concentrations are closed to EC50 values, 10 nM for E2, 10 µM for parabens and 1mM for studied dyes. Average ± standard deviation (n=3). ERE Promotor LacZ Estrogen receptor Estrogen Activated receptor β galactosidase ERE Estrogen responsive element LacZ Reportrt gene hER nucleus hER Human Estrogen receptor Medium Cytoplasma Yeast cell Figure 4: Mechanism of Yeast Estrogen Screen (YES assay). Methyl Paraben (MP) Ethyl Paraben (EP) Propyl Paraben (PP) Butyl Paraben (BP) 17-β-Estradiol E2 Titanium Dioxyde Indigotine 48 +/- 18 mg.L-1 (3.08*10-4 M) 7.8 +/- 2 mg.L-1 (4.73*10-5 M) 1.32 mg.L-1 +/- 80µg.L- 504 +/- 15 µg.L-1 1 (7.21*10-6 M) (2.59*10-6 M) 103 +/- 22ng.L-1) (3.77*10-10 M) 500 +/- 2mg.L-1) (6.5*10-3 M) Ponceau 4R 471 +/- 15mg.L-1) 403 +/- 8 mg.L-1) (1.8*10-3 M) (2.4*10-3 M) Table 2: EC50 of 17-β-Estradiol and food additives compounds in distilled water samples obtained in YES test. (EC50 values, defined as the concentration where transcriptional response reaches 50% of its value at saturating concentration of ligand, were calculated from doseresponse assays, using 8 concentrations for parabens and food dyes and 10 concentrations for 17β-estradiol). J Ecosys Ecograph ISSN:2157-7625 JEE, an open access journal Volume 3 • Issue 3 • 1000128 Citation: Bazin I, Hassine AIH, Mnif W, Gonzalez C (2013) YES as a Tool for Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives Compounds: E 104, E 122, E 124, E 132 and E 171. J Ecosys Ecograph 3: 128. doi:10.4172/2157-7625.1000128 Page 4 of 5 and indigotine have weak estrogenic effect in yeast cell. Their activities are close to those of methylparaben. References 1. Oishi S (2002) Effects of propyl paraben on the male reproductive system. Food Chem Toxicol 40: 1807-1813. 11.Gaido W, Leonard LS, Lovell S, Gould JC, Babai D, et al. (1997) Evaluation of chemicals with endocrine modulating activity in a yeast-based steroid hormone receptor gene transcription assay. Toxicol Appl Pharmacol 143:205-212. 12.García-Reyero N, Grau E, Castillo M, López de Alda MJ, Barceló D, et al. (2001) Monitoring of endocrine disruptors in surface waters by the yeast recombinant assay. J Environ Toxicol Chem 20: 1152-1158. 2. Soni MG, Carabin IG, Burdock GA (2005) Safety assessment of esters of p-hydroxybenzoic acid (parabens). Food Chem Toxicol 43: 985-1015. 13.Dees C, Askari M, Garrety S, Gehrs K, Henley D, et al. (1997) Estrogenic and DNA-damaging activity of Red No. 3 in human breast cancer cells. Environ Health Perspect 105: 625-632. 3. Darbre PD, Aljarrah A, Miler WR, Coldham NG, Sauer MJ, et al. (2004) Concentrations of parabens in human breast tumours. J Appl Toxicol 24: 5-13. 14.Roychoudhury A, Giri AK (1989) Effects of certain food dyes on chromosomes of Allium cepa. Mutat Res 223: 313-319. 4. Witorsch RJ, Thomas JA (2010) Personal care products and endocrine disruption: A critical review of the literature. Crit Rev Toxicol 40:1-30. 15.Datta P, Lundin-Schiller S (2008) Estrogenicity of the synthetic food colorants tartrazine, erythrosin B, and sudan I in an estrogen-responsive human breast cancer cell line. Journal of the Tennessee Academy of Science 83. 5. Bazin I, Gadal A, Touraud E, Roig B (2010) Hydroxy benzoate preservatives (parabens) in the environment: data for environmental toxicity assessment. Environ. Pol 16: 245-257. 6. Björkner B, Niklasson B (1983) Contact allergic reaction to D & C yellow no.11 and quinoline yellow. Contact Dermatitis 9: 263-268. 7. Combes RD, Haveland-Smith RB (1982) A review of the genotoxicity of food, drug, and cosmetic colours and other azo, triphenylmethane, and xanthene dyes. Mutat Res 98: 101-248. 8. McKenna NJ, O’Malley BW (2002) Combinatorial control of gene expression by nuclear receptors and coregulators. Cell 108: 465-474. 9. Huang P, Chandra V, Rastinejad F (2010) Structural overview of the nuclear receptor 10.superfamily: insights into physiology and therapeutics. Annu Rev Physiol 72: 247-272. J Ecosys Ecograph ISSN:2157-7625 JEE, an open access journal 16.Axon A, May FE, Gaughan LE, Williams FM, Blain PG, et al. (2012) Tartrazine and sunset yellow are xenoestrogens in a new screening assay to identify modulators of human oestrogen receptor transcriptional activity. Toxicology 298: 40-51. 17.Chung KT, Cerniglia CE (1992) Mutagenicity of azo dyes: Structure-activity relationships. Mutat Res 277: 201-220. 18.Routledge EJ, Parker J, Odum J, Ashby J, Sumpter JP (1998) Some alkyl hydroxy benzoate preservatives (parabens) are estrogenic. Toxicol Appl Pharmacol 153: 12-19. 19.Lemini C, Jaimez R, Avila ME, Franco Y, Larrea F, et al. (2003) In vivo and in vitro estrogen bioactivities of alkyl parabens. Toxicol Ind Health 19: 69-79. 20.JECFA (2003) Approval for parabens at low concentrations in food. Joint FAO/ WHO expert committee on food additives. 21.JECFA (2004) Call for data on butylparaben. Joint FAO/WHO expert committee on food additives. Volume 3 • Issue 3 • 1000128 Citation: Bazin I, Hassine AIH, Mnif W, Gonzalez C (2013) YES as a Tool for Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives Compounds: E 104, E 122, E 124, E 132 and E 171. J Ecosys Ecograph 3: 128. doi:10.4172/2157-7625.1000128 Page 5 of 5 Submit your next manuscript and get advantages of OMICS Group submissions Unique features: • • • User friendly/feasible website-translation of your paper to 50 world’s leading languages Audio Version of published paper Digital articles to share and explore Special features: Citation: Bazin I, Hassine AIH, Mnif W, Gonzalez C (2013) YES as a Tool for Detecting Estrogenic Activity of Some Food Additives Compounds: E 104, E 122, E 124, E 132 and E 171. J Ecosys Ecograph 3: 128. doi:10.4172/21577625.1000128 J Ecosys Ecograph ISSN:2157-7625 JEE, an open access journal • • • • • • • • 250 Open Access Journals 20,000 editorial team 21 days rapid review process Quality and quick editorial, review and publication processing Indexing at PubMed (partial), Scopus, EBSCO, Index Copernicus and Google Scholar etc Sharing Option: Social Networking Enabled Authors, Reviewers and Editors rewarded with online Scientific Credits Better discount for your subsequent articles Submit your manuscript at: http://www.omicsonline.org/submission Volume 3 • Issue 3 • 1000128 3. Activité oestrogénique de colorants textiles dans le Yeast Estrogen Screen (YES) Les matières colorantes se caractérisent par leur capacité à absorber les rayonnements lumineux dans le spectre visible (380 à 750 nm). Bon nombre de ces colorants ont des cycles aromatiques. Ils ont des effets mutagènes/tératogènes et leurs sous-produits de dégradation, amines pour les composés azoïques, peuvent être cancérigènes. Or, ces polluants peuvent potentiellement se retrouver dans les eaux résiduaires en sortie de station d’épuration et perturber l’équilibre du système biologique. L’objectif de cette partie est d’identifier si certains colorants textiles couramment utilisés en industrie peuvent être des pseudo-oestrogènes, c’est-à-dire qu’ils peuvent induire une réponse oestrogénique ou anti-oestrogénique dans le YES (Yeast Estrogen Screen). Ces travaux ont été publiés dans Ecotoxicology and Environmental Safety Volume 85, 1 November 2012, Pages 131–136. Les colorants sont élaborer pour résister à de nombreux agents extérieurs tels que la lumière, la chaleur, les acides. Certains colorants, leurs métabolites et les effluents industriels de teinture sont reconnus toxiques, cancérigènes ou mutagènes (Moawad et al., 2003; Schneider et al., 2004; Umbuzeiro et al., 2004), mais les procédés de traitement biologique conventionnels sont incapables de les éliminer de manière satisfaisante (Hutton et al., 1996). Les procédés de traitement avancés montrent une meilleure efficacité pour l'élimination de la couleur ou de la DCO des eaux usées (Mansour et al., 2011). Cependant, la mutagénicité de certains colorants augmentent par chloration et ozonation (Shiozawa et al., 1998; Kunz et al., 2002). Au cours de cette étude nous avons testé l’activité oestrogénique et anti-oestrogénique de 23 colorants utilisés dans l’industrie textile en utilisant le Yeast Estrogen Screen (YES). Il apparait que ces colorants n’induisent pas ou peu une activité oestrogénique. En effet, parmi les 23 colorants étudiés, trois ont une activité oestrogénique le «yellow flavina CXL», le solvent «yellow 56» et le «reactive dye RE 3BS» et cette activité est très faible. Le «yellow flavina CXL» est plus de 100 000 moins oestrogénique que le 17 β-oestradiol. La capacité de ces composés à inhiber l’activité oestrogénique dans le YES a été étudiée et cette activité a été comparée à celle produite par l’antagoniste de référence le 4hydroxytamoxifène (4-OH-TAM). Nous avons ainsi pu déterminer que les colorants antioestrogéniques sont majoritairement rouges et bleu, principalement, l’«eversol navy blue 110 FBN», le bleu «HFRL», le «direct red 89 BNL» et le «benzopurpurine 4B». Le colorant ayant une activité antagoniste la plus élevée est le bleu «HFRL». L’activité inhibitrice reste moins élevée que celle du 4-OH-TAM (850 fois moins élevée). Une concentration de 15 mg/l de ce composé induit une réduction de la moitié de l’activité oestrogénique. Cette concentration est en deçà des concentrations de colorants retrouvés dans l’environnement qui peuvent avoisiner 400 mg/l (O’Neill at al. 1999). Par la suite, la capacité de ces xéno-estrogènes antagonistes à entrer en compétition avec le 17 β-oestradiol pour le récepteur aux oestrogènes humains a été testée dans le YES. Cette étude montre que le «benzopurpurine 4B», le bleu «HFRL » et l’«everzol Navy Blue FBN», sont capables d’entrer en compétition avec l’E2 (10-8 M). On a ainsi pu déterminer de nouveaux ligands antagonistes pour le récepteur des oestrogènes. Afin de déterminer la présence des colorants textiles, dans des effluents réels, nous avons effectué une analyse spectrale par déconvolution du spectre-UV visible. Cette analyse montre que l’effluent contient essentiellement des colorants bleu : le bleu «DERF», le «direct bleu 71», l’«eversol Navu Blue FBN» et le «Grey GGL», dont certains présentent une activité anti-oestrogénique dans le YES. Le test YES a alors été appliqué à l’effluent. Les résultats obtenus montrent que cet effluent textile induit un faible potentiel oestrogénique, et a une activité inhibitrice importante, de l’ordre de 60%. Les résultats de ces travaux sur les effets endocriniens de colorants textiles viennent en complément de celles déjà publiées sur la toxicité de colorants. Elles soulignent le fait que certains colorants, principalement des colorants bleus et rouges, peuvent perturber la fonction endocrinienne in vitro. En ce qui concerne l'environnement, certains de ces colorants peuvent être retrouvés à des concentrations susceptibles d’affecter la qualité de vie des populations aquatiques naturelles. Les effluents textiles présentent ainsi un danger potentiel pour l’environnement qui exige une meilleure surveillance sur la présence des colorants utilisés par l'industrie et les méthodes de traitement. Il est donc particulièrement important de traiter efficacement les effluents industriels contenant des colorants azoïques avant qu'ils ne soient rejetés dans l’environnement. Il est, aussi, intéressant de noter que certains des colorants que nous avons caractérisés, ont une activité anti-oestrogènique. 111 Ecotoxicology and Environmental Safety 85 (2012) 131–136 Contents lists available at SciVerse ScienceDirect Ecotoxicology and Environmental Safety journal homepage: www.elsevier.com/locate/ecoenv Estrogenic and anti-estrogenic activity of 23 commercial textile dyes Ingrid Bazin a,n, Aziza Ibn Hadj Hassine a, Yosra Haj Hamouda b, Wissem Mnif b, Ahgleb Bartegi c, Miguel Lopez-Ferber a, Michel De Waard d,e, Catherine Gonzalez a a Ecole des Mines d’Ale s, LGEI center, 6 avenue de Clavie re, 30319 Ale s Cedex, France. Laboratory of Biochemistry, Institute of Biotechnology, Monastir, Tunisia c Department of Biology, Faculty of Sciences, King Faisal University, P.O. Box 1759 31982, Al Hassa, Saudi Arabia d Inserm U836, Grenoble Institut of Neurosciences, Site Santé de la Tronche, 38042 Grenoble, Cedex 09, France e Université Joseph Fourier, Grenoble, France b a r t i c l e i n f o abstract Article history: Received 28 March 2012 Received in revised form 30 July 2012 Accepted 2 August 2012 Available online 1 September 2012 The presence of dyes in wastewater effluent of textile industry is well documented. In contrast, the endocrine disrupting effects of these dyes and wastewater effluent have been poorly investigated. Herein, we studied twenty-three commercial dyes, usually used in the textile industry, and extracts of blue jean textile wastewater samples were evaluated for their agonistic and antagonistic estrogen activity. Total estrogenic and anti-estrogenic activities were measured using the Yeast Estrogen Screen bioassay (YES) that evaluates estrogen receptor binding-dependent transcriptional and translational activities. The estrogenic potencies of the dyes and wastewater samples were evaluated by doseresponse curves and compared to the dose-response curve of 17b-estradiol (E2), the reference compound. The dose-dependent anti-estrogenic activities of the dyes and wastewater samples were normalized to the known antagonistic effect of 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) on the induction of the lac Z reporter gene by E2. About half azo textile dyes have anti-estrogenic activity with the most active being Blue HFRL. Most azo dyes however have no or weak estrogenic activity. E2/dye or E2/waste water ER competitive binding assays show activity of Blue HFRL, benzopurpurine 4B, Everzol Navy Blue FBN, direct red 89 BNL 200% and waste water samples indicating a mechanism of action common to E2. Our results indicate that several textile dyes are potential endocrine disrupting agents. The presence of some of these dyes in textile industry wastewater may thus impact the aquatic ecosystem. & 2012 Elsevier Inc. All rights reserved. Keywords: Textile dyes Estrogenic activity Anti-estrogenic activity Industrial textile effluent 1. Introduction Dyes are widely used in most industries such as those manufacturing papers, plastics, food, cosmetics, textiles or leathers. These dyes are useful to color the final products. Dyes are classified depending on their colors, their chemical structures and/or their origin (natural or synthetic). Natural dyes most frequently originate from plants (such as riboflavin or b-carotene). Determination of the chemical structures of natural dyes and the accomplishment of their synthesis allow the gradual replacement of these natural dyes by their synthetic counterparts. Approximately 10,000 commercial dyes are used in the coloring industry. More than 10% of dyestuff used during the coloring processes does not bind to the fibers and therefore these excess dyes are released into the environment producing serious environmental pollution (Pearce et al., 2003; Rajeswari et al., 2011). The presence of these dyes in wastewater and subsequently in water resources, even at n Corresponding author. Fax: þ33 466782701. E-mail address: [email protected] (I. Bazin). 0147-6513/$ - see front matter & 2012 Elsevier Inc. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.ecoenv.2012.08.003 very low concentrations, is easy to observe visually as the result of textile industry activities. They may increase effluent toxicity and lead to environmental damage (Robinson et al., 2002). In addition, many synthetic dyes are poorly biodegradable. In some dyehouse effluents, dye concentration can reach up to 400 mg/l (O’Neill et al., 1999). A specific study has even demonstrated that these concentrations can exceed 600 mg/L in Nigeria (Yusuff and Sonibare, 2004). Their presence in water reduces light penetration and has a negative impact on photosynthesis. Moreover, the dyeing process itself generally also contributes to the water body contamination by chromium, zinc and copper which are all toxic to aquatic plants and fish below 1.0 mg/L (Eremektar et al., 2007; Sharma et al., 2007; Verma, 2008). The research on textile wastewater toxicity, which has been carried out so far, shows how the action of toxic dyes occurs at different levels of the food chain, from food supply (i.e. algae and plants) to consumers (i.e. crustaceans and fishes) (Manu and Chaudhari, 2003; Robinson et al., 2002; Sharma et al., 2007; Soni et al., 2006; Tigini et al., 2011). Most research effort has been devoted towards elucidating or improving the degradation mechanisms of textile dyes with the hope to reduce their toxicity levels (Phugare et al., 2011a, 2011b). 132 I. Bazin et al. / Ecotoxicology and Environmental Safety 85 (2012) 131–136 Table 1 Textile dyes analyzed in this study. Compound CAS # Family Formula Benzopurpurine 4B (Red 4 B) Direct black VSF AZO-FREE (Direct Black 22) Yellow 4 G (Solvent yellow 19) Direct blue 71 (Blue BRR) Brown RL Red Alpacide 3BL Brown GV Orange 7GL Direct black PMSF Everzol navy blue FBNa Blue HFRLb Direct red 89 BNL 200% Blue DERFb Everzol yellow EDa Reactive dyes red 3BS (Red 195) Everzol blue EDa Yellow flavina CXLb Everzol navy ED Solvent yellow 56 Yellow 3GFb Everzol red EDa Grey GGLb Blue ED 250 992-59-6 6473-13-8 10343-55-2 4399-55-7 12238-94-7 12238-49-2 azo azo azo azo azo azo 12222-37-6 azo azo azo C34H26N6Na2O6S2 C44H32N13Na3O11S3 C16H11CrN4O8S C40H23N7Na4O13S4 C15H14O5 C18H10N2O2Cl2 C31H21N7O6Na2S C42H28N7Na4O15S4 C37H25N5Na2O6S2 C37H29ClN10O22S7Na6 93912-64-2 azo Confidential data 93050-79-4 2580-78-1 azo anthraquinone 17095-24-8 2481-94-9 azo azo C31H19ClN7O19S6 C22H18N2O11S3Na2 _ C26H25N5O19S6Na4 C16H19N3 C30H26N4Na2O8S2 Confidential data 89157-03-9 azo C31H24ClN7O19S6Na5 a Dyes and informations obtained by Everlight Chemical SA. Reactive azo dye (copper complex, 70% pure for Blue HFRL) kindly provided by a textile industry unfortunately there is no available information on its structure (Baêta et al. 2011). b Environmental regulations in most countries (i.e. EU directive 91/271) have prioritized in wastewater dye decontamination in order to minimize environmental damage (Robinson et al., 2001). Although the Environmental Protection Agency (EPA) has emitted new practice guidelines for environmental management, the presence of pollution dyes remains a serious environmental issue specifically for small textile industries in various countries (e.g. China, India, Taiwan) where working conditions and low economic status does not allow an efficient wastewater treatment before disposal into water sources (Mathur et al., 2005; Gregory, 2007; You and Teng, 2009). Since the mid nineties, the links between dyes, environmental impact and cancer emergence have been the subject of considerable interest both from researchers and from the general public. However, the causal relationship between dyes and certain types of cancer is difficult to establish. Several studies have been conducted on the toxicity, mutagenicity and genotoxicity of textile dyes (Bakshi and Sharma, 2003; Ben Mansour et al., 2007; Dogan et al., 2005; Durnev et al., 1995; Mathur and Bhatnagar, 2007; Schneider et al., 2004). In the case of azo dyes, the increase in bladder cancer incidence, observed among textile industry workers, has been linked to prolonged exposure to these dyes. A report of experts from the ‘‘Cosmetic Ingredient Review Committee’’ confirmed that some anthraquinone dyes, like the disperse Blue 7 dye, used in the cosmetic industry as hair colorant and in textile, induce genotoxicity in bacteria (Cosmetic Ingredient Review Expert Panel, 2007). Since then, research on these dyes confirmed their carcinogenic effects for humans and animals (Tsuda et al., 2001). This toxic effect has been linked to their presence in the environment (Dogan et al., 2005; Chou et al., 2007; Tigini et al., 2011). From an environmental point of view, toxicity, genotoxicity and mutagenicity of industrial effluents have been demonstrated (Alves de Lima et al., 2007; Grinevicius et al., 2009; Tigini et al., 2011). However, these effects have generally not been linked to the presence of dyes. Chou and collaborators associated the dioxin-like activity of some dyeing wastewater with the presence of specific anthraquinone dyes (Chou et al., 2006, 2007). In the same studies, these authors demonstrated that disperse blue 56 can bind the aryl hydrocarbon receptor (AhR), which is involved in many physiological functions such as cell regulation and reproduction. Two Brazilian studies have identified that the mutagenic activity of the Cristais River, a drinking water source of Sa~ o Paulo, is caused by the presence of three blue dyes; C.I. Disperse Blue 37 contributing to 55% of this effect (De Araga~ o Umbuzeiro et al., 2005). Up to now, the estrogenic activity of dyes has seldom been studied. Rare studies mainly report the effects of food colors, such as tartazine (E102) and erythrosin B (E127). Both compounds affect chromosome structure and increase Estrogen Receptor (ER) site-specific DNA binding to Estrogen Response Element (ERE) in HTB 133 cells (Roychoudhury and Giri, 1989) and in the E-screen test (Datta and Lundin-Schiller, 2008). The present manuscript investigates both the estrogenic and anti-estrogen activities of twenty three pure commercial textile dyes using the Yeast Estrogen Screen (YES). This in vitro assay has been developed for the detection of endocrine disrupting compounds (EDCs). In order to indentify estrogen and anti-estrogen activity of textile dyes, the YES assay has been used to probe two different modes of action. First, a reporter gene assay measures the impact of dye binding on ER on its ability to promote binding-dependent transcriptional and translational activity. Second, an ER competitive binding assay measures how a dye competes with 17bestradiol (E2)-dependent ER activation. In addition, the endocrine activity (estrogenic and anti-estrogenic activity) has been assessed on a textile effluent coming from a blue jean manufacturing Tunisian industry in an attempt to correlate the endocrine activity observed for commercial compounds and that obtained for dyeing wastewater. 2. Materials and methods 2.1. Selected dyes All the dyes selected (23) in this study are used in the textile industry (Tables 1 and 2). Only, 17 on 23 dyes have a known or communicated structure. The structure of the 6 other dyes were confidential and not available in the chemical abstracts service. However, the safety and chemical information I. Bazin et al. / Ecotoxicology and Environmental Safety 85 (2012) 131–136 Table 2 Relative estrogen agonistic and antagonistic activities of industrial dyes. Estrogenic activity of textile dyes (1 g/L). The anti-estrogenic activity of textile dyes has been determinate at 1 g/L and expressed in 4-OHT%. The half maximal effective concentration (AC50) was calculated based on the sigmoidal dose–effect curve of 4-OHT. Compounds Test estrogen screen agonist activity (E2%) Test estrogen screen antagonist activity (4-OHT percent) Test estrogen screen antagonist AC50 (g/l) E2 (10E 9M) OTH Benzopurpurine 4B (Red 4 B) Direct black VSF AZO-FREE (Direct black 22) Yellow 4 G (Solvent yellow 19) Direct blue 71 (Blue BRR) *Brown RL Red alpacide 3BL *Brown GV *Orange 7GL *Direct black PMSF Everzol navy blue FBN Blue HFRL Direct red 89 BNL 200% Blue DERF *Everzol yellow ED Reactive dyes red 3BS (Red 195) Everzol blue ED Yellow flavina CXL Everzol navy ED Solvent yellow 56 Yellow 3GF Everzol red ED *Grey GGL Blue ED 250 100 – 0 – 100 100 – 2 10 5 0.17 0 20 41 0 13 41 0 22 41 0 0 0 0 0 0 – 44 – – – 94 – 41 – – – 0.065 0 0 100 100 0.017 0.029 0 0 22 10 – 0 41 – 0 0 36 0 11 0 0 0 0 35 0 32 0 0 30 – 0 41 0 41 0 0 41 – 0 certificate of analysis usually indicates the nature of the dye (azoic or anthraquinone-type chemical structure). For each dye, a stock solution (10 g/L) was prepared by dissolving in distilled water, followed by filtration through Whatmann no. 5 filter paper. All these dyes appeared perfectly soluble in water at this concentration as assessed by the absence of precipitate. For each dye, the endocrine activity was assessed at four concentrations in the range of 1 10 5 g/L to 1 g/L. The natural fluorescence of the dyes and their interference on the fluorescence emitted by yeast was determined beforehand in order to avoid spurious signals generated by the YES test in our experimental conditions. The fluorescence of each dye has been measured in the absence of yeast cells and subtracted from the data obtained for estrogenic tests. The quenching potential of the dyes was also assessed on the yeast fluorescence emission during the antiestrogenic test as follows. The fluorescence of yeast cell has been measured after 6 h of incubation of the reference compound E2 (from Sigma-Aldrich, St Quentin-Fallavier, France). Then, each dye was added to the medium at various concentrations and the fluorescence quenching was measured immediately. Compounds inducing more than 10% of fluorescence quenching were not investigated further for anti-estrogenic activity (noted by an asterisk in Table 2). The cytotoxicity of each dye was evaluated by measuring yeast growth at an O.D. of 600 nm. 2.2. Wastewater sampling and extraction Wastewater samples (1 L) were collected from the textile effluent of an industrial blue jeans factory in Tunisia. Raw water samples were centrifuged (2000 g, 15 min) to eliminate solids in suspension. Supernatants were then extracted by solid-phase extraction as described by Pillon et al. (2005). Briefly, aqueous samples were concentrated on reverse-phase C18 (5 g, 20 mL) cartridges 133 (Sigma-Aldrich, St Quentin-Fallavier, France) preconditioned with methanol. Compounds elution from the column was triggered using methanol followed by hexane. Eluates were dried at 37 1C in a rotary evaporator and residues were taken up in 2 mL methanol (concentration factor: 500). 2.3. Yeast estrogen screen assay (YES) 2.3.1. Assay of estrogenic and anti-estrogenic activity Both agonist and antagonist activities of chemical dyes were examined using the Yeast strain BY4741 (Euroscarf, Frankfurt, Germany). This recombinant yeast strain carries the b-galactosidase reporter gene under the control of the ERE and contains the human ER cloned into the constitutive yeast expression vector pAAH5 (Garcı́a-Reyero et al., 2001). The test measures b-galactosidase activity (fluorescence at 460 nm and excitation at 355 nm) with a fluorimeter (Fluoroskan Twinkle LB 970, BERTHOLD Technologies) after 6 h of exposure to the compounds to evaluate. Tests were performed in 96-well plates. To determine the estrogen agonist activity of dyes and effluent samples, E2 was used as a positive control and distillated water was used as a negative control. Four dye concentrations were tested in the range of 1 10 5 g/L to 1 g/L. For the effluent samples, a series of dilutions (1 to 1000 of concentrated extract) were tested for their estrogenic activity. To determine the estrogen antagonist activity of the dyes, 4-OHT was used as a positive control and E2 (1 nM) was used as a negative control. In the antagonist test, the ability of the dye to compete with E2 for binding to ER and/or inhibit the receptor functions was evaluated. The tested dyes or 4-OHT, the positive control, were combined with 1 nM E2 before the start of the assay. All experiments were performed in triplicate. For estrogen agonist activity, the half maximal effective concentration (EC50) was calculated based on the sigmoidal dose–effect curve of E2. For estrogen antagonist activity, the half-maximal effective concentration (AC50) was calculated based on the sigmoidal dose– effect curve of 4-OHT. 2.3.2. Competitive binding assay Competition between dyes and/or sample effluent and E2 was measured at various concentrations of E2. Textile dye concentration used is 0.01 g/L and the textile dyeing effluent sample at a dilution factor 5 of the concentrated extract. Thus any decrease of b-galactosidase activity after 6 h of exposure indicates that the dye induces a decrease in E2 binding. 2.4. UV/visible spectrum deconvolution The absorbency spectrum of a water sample can be decomposed into a few numbers of spectra (reference spectra). The shape of the UV spectrum can be considered as a linear combination of defined spectra (REF1,.., REFp) related to potential compounds present in studied water sample (Thomas et al., 1996). Sw ¼ Sai REFi 7 r, where Sw is the final spectra, ai and r are the coefficient of the ith reference spectra and the admitted error, respectively. The Secomam company (Ale s, France) has developed the UVPro software based on advanced UV spectral deconvolution (UVPro, 2000) which allows creating dedicated models and determination of reference spectra from a set of studied wastewater UV spectra. The UVPro software has been applied to the textile effluent of an industrial blue jeans factory of Tunisia. The reference spectra used for the deconvolution are obtained from the 23 selected textiles dyes (Table 1). Using the deconvolution model, it is possible to assess the contribution of studied dyes in the wastewater spectrum. 3. Results/discussion 3.1. Estrogenicity/anti-estrogenicity studies of individual dyes YES allows a fast determination of both endocrine agonist and antagonist actions. The relative estrogenicity of each dye has been estimated using YES by comparison to the estrogenicity of E2 as reference compound. Typical dose–response curves for E2 have been established (data not shown). In the present study, we have essentially analyzed azo dyes. These dyes are extensively used for dyeing cotton in textile industries. By using YES assay in the present work, we have analyzed the degree of interference of textile dyes with the endocrine system considering both the potential agonist and antagonist actions. A great variability between dyes is observed. The YES assay data illustrate a dosedependent estrogen agonist activity from 1 10 5 g/L to 1 g/L for three dyes (Yellow Flavina CXL, Reactive dye red 3BS and Solvent yellow 56) (Fig. 1). All these dyes have weak estrogenic effects 134 I. Bazin et al. / Ecotoxicology and Environmental Safety 85 (2012) 131–136 Fig. 1. Induction of estrogenic activities of some textile dyes. Average 7standard deviation (n ¼3). since the maximum activity is obtained at 1 g/L. In addition, the estrogenic effect of the dyes did not saturate precluding the determination of the EC50 value, contrary to the positive control E2 (EC50 value at 1 ng/L) (Fig. 1). Higher dye concentrations were not investigated, since water body dye concentration in the environment never exceeds 1 g/l. Table 2 also summarizes the fact that the twenty other dyes had no estrogenic effect by themselves. These results indicate that these dyes are not xenoestrogens that should highly impact the environment, as compared to E2 or other known xenoestrogens (e.g. bisphenol A, parabeny) (Routledge et al., 1998). In addition, some textile dyes have an anti-estrogenic activity. The anti-estrogenic reference compound 4-OHT was used to demonstrate efficient anti-estrogenic activity when incubated in the presence of 1 nM E2. The AC50 value of 4-OHT was 0.5 mM or 0.02 mg/L (Table 2). Similar experiments were conducted with the dyes. Only some dyes have been tested (Fig. 2), the other ones, marked by an asterisks, could not been tested because they quenched the b-galactosidase fluorescence. At a concentration of 1 g/L, antagonistic activities of these dyes vary from 100% to 10% inhibition according to their color (Table 2 and Fig. 2A). Blue and red dyes show the highest inhibition potential. Everzol navy blue FBN, blue HFRL, Direct Red 89 BNL 200% and Benzopurpurine 4B (Red 4B) are the most potent inhibitors tested. Their inhibitory effects remain however inferior to that of 4-OHT. At 1 g/L, these dyes are the only ones that induce a complete inhibition of the reporter gene in yeast cells. Among these four dyes, Blue HFRL is the strongest antagonist; its anti-estrogenic potency being approximately 850-fold less than that of 4-OHT. A reduction of 50% of b-galactosidase activity is observed for concentrations as low as 15 mg/L. These concentration values are thus considerably lower than the total color level found in the environment (400 mg/L). The antagonist effect of three other dyes (Benzopurpurine 4B (Red 4B), Everzol Navy Blue FBN, and Direct Red 89 BNL) were, respectively, 8500-, 3250-, and 1450-fold less than that of 4-OHT. In contrast, all other dyes were either weak ER inhibitors or non-ER inhibitors. For instance, Everzol Blue ED, Red alpacide 3BL, Direct Blue 71, Blue ED 250, Direct Black VSF and Blue DERF were weak ER inhibitors. The anti-estrogenic activity for Blue DERF and Direct Blue 71 at 1 g/l, are 10% and 22%, respectively. Among these dyes, most are of the azo class with sulfonated aniline (Benzopurpurine 4B, Direct Red 89 BNL 200%) and one is an anthraquinone dye, Everzol Blue ED. The Direct Black VSF AZO-FREE, Blue ED 250, both being polyazo dyes, Fig. 2. Anti-estrogenic activity of textile (A) dyes as measured by the yeast estrogen screen (B). Competitive binding essay of 3 textile dyes (0.01 g/l) against various concentrations of E2. Average 7 standard deviation (n¼3). Everzo Yellow ED and Red ED (for which no structures can be disclosed) induce inhibition of b-galactosidase expression by E2 with AC504 1 g/L. Competition between the textile dyes and E2 was also measured by varying the concentration of E2 and maintaining a constant dye concentration (0.01 g/L, a concentration that does not fully inhibit E2 effect, Fig. 2A). Benzopurpurine 4B, Blue HFRL and Everzol Navy Blue FBN can compete with E2 for binding to ER (Fig. 2B). These dyes induces a slight inhibition of E2 estrogenic activity when E2 is used at concentrations equal or lower than 1.10 8 M. No effect is observed for higher concentrations of E2. For example, this activity decreased from 200,000 RLU without dye to 100,000 RLU in presence of the Blue HFRL at 10 8 M E2. This study also shows that the Red Alpacide 3BL induces a 44% inhibition of estrogenic activity and the metal-complexed azo dye yellow 4G induces a 13% inhibition (Table 2). The competitive binding assay in the YES assay showed that these dyes can bind specifically to ER in order to induce these antagonist effects. 3.2. Estrogenicity/anti-estrogenicity studies of textile effluent The textile effluent sample analyzed presents a weak estrogenic effect at the maximum concentration tested (5-fold dilution). At higher concentrations of the sample, the sample compounds reduce cell viability (data not show) precluding the use of the sample for the estrogenic assay. For the dilution range (5- to 10,000-fold), results from the YES bioassay indicate that the industrial textile effluent presents a low (below 15%) but I. Bazin et al. / Ecotoxicology and Environmental Safety 85 (2012) 131–136 135 Fig. 4. UV/visible deconvolution of textile effluent spectrum. (You and Teng, 2009). Nevertheless, without a complete characterization of the nature of the dyes being released in the local environment of this factory, the ant-estrogenic effect of the effluent sample cannot be unequivocally be attributed to these blue dyes. Since this effluent is essentially blue, and that some blue dyes are among those presenting the highest anti-estrogenic effect, suspicion remains however high that this Tunisian factory releases harmful components in the environment. In addition, it is worth noting that the most active dyes have anti-estrogenic AC50 values (between 15 mg/L and 70 mg/L) that are well below the dye concentration that can be detected in some water bodies (400 mg/L). If these same dyes are indeed present in the environment, they would present a real anti-estrogenic activity to local water consumers. 4. Conclusions Fig. 3. Estrogenic (A) and anti-estrogenic (B) activity of textile effluent, (C) competitive binding assay of textile effluent (dilution factor 5-fold) against various concentrations of E2. Average 7standard deviation (n¼ 3). significant estrogenic activity (Fig. 3A). Also, the effluent sample inhibits 60% of estrogenic activity (Fig. 3B). In competition experiments, in which E2 concentration is varied and a single dilution dose of the effluent sample is used (5-fold dilution), the anti-estrogenic effect is observable until 10 5 M of E2 (Fig. 3C). The competition effect of the sample is most significant at 10 8 M. The composition of the effluent sample in dyes has not been fully determined. Spectral analyses indicate that most of its components are blue dyes. Indeed, UV/visible deconvolution of the spectrum of a blue jeans manufacturer’s effluent of Tunisia indicates that the sample contains mainly Blue DERF, Direct Blue 71, Everzol navy Blue FBN, and Grey GGL dye according to the spectrum of each individual dye (Fig. 4). The deconvolution of the sample spectrum did not predict the presence of other dyes. Interestingly, our studies have demonstrated that at least three of these dyes presented anti-estrogenic activity with the YES assay. Most blue and navy blue dyes are derived from the Reactive Black 5 azo dye, which is classified Xn (harmful). It is also suspected to be mutagenic and to be associated to bladder cancer development Our results on the endocrine effects of textile dyes come in complement of those already published on the carcinogenic and mutagenic effects of dyes. They point to the fact that some dyes, mainly blue and red dyes, may be endocrine disruptor compounds. These observations raise two issues. Concerning environmental pollution, some of these dyes may be present at concentrations high enough that they may indeed affect life quality by promoting tumor generation. Textile sewage is therefore a potential health hazard that should require a better communication on the dyes used by the industry and its method of disposal. In that respect, it appears as particularly important to efficiently treat industrial effluent containing azo dyes before they get discharged into the environment. The second issue concerns the pharmacological effect of these textile dyes. Besides 4-OHT, few compounds have anti-estrogenic activity. It is therefore of interest to note that some of the dyes that we characterized have similar anti-estrogenic activity, suggesting that they may be lead compounds for the development of new 4-OHT like anti-estrogenic compounds. References Alves de Lima, R.O., Bazo, A.P., Salvadori, D.M., Rech, C.M., de Palma Oliveira, D., de Araga~ o Umbuzeiro, G., 2007. Mutagenic and carcinogenic potential of a textile azo dye processing plant effluent that impacts a drinking water source. Mutat. Res. 626 (1–2), 53–60. 136 I. Bazin et al. / Ecotoxicology and Environmental Safety 85 (2012) 131–136 Baêta, B.E., Aquino, S.F., Silva, S.Q., Rabelo, C.A., 2011. Anaerobic degradation of azo dye Drimaren blue HFRL in UASB reactor in the presence of yeast extract a source of carbon and redox mediator. Biodegradation, http://dx.doi.org/ 10.1007/s10532-011-9499-4. Bakshi, D.K., Sharma, P., 2003. Genotoxicity of textile dyes evaluated with Ames test and rec-assay. J. Environ. Pathol. Toxico.l Oncol. 22 (2), 101–109. Ben Mansour, H., Corroler, D., Barillier, D., Ghedira, K., Chekir, L., Mosrati, R., 2007. Evaluation of genotoxicity and pro-oxidant effect of the azo dyes: acids yellow 17, violet 7 and orange 52, and of their degradation products by Pseudomonas putida mt-2. Food Chem. Toxicol. 45 (9), 1670–1677. Chou, P.H., Matsui, S., Matsuda, T., 2006. Detection and identification of dyes showing AhR-binding affinity in treated sewage effluents. Water Sci. Technol. 53 (11), 35–42. Chou, P.H., Matsui, S., Misaki, K., Matsuda, T., 2007. Isolation and identification of xenobiotic aryl hydrocarbon receptor ligands in dyeing wastewater. Environ. Sci. Technol. 41 (2), 652–657. Cosmetic Ingredient Review Expert Panel, 2007. Final report on the safety assessment of disperse blue 7. Int. J. Toxicol. 26 (Suppl 2), 65–77, http://dx.doi.org/10.1080/ 10915810701351210. Datta, P., Lundin-Schiller, S., 2008. Estrogenicity of the synthetic food colorants tartrazine, erythrosin B, and sudan I in an estrogen-responsive human breast cancer cell line. J. Tenn. Acad. Sci. 83, 4. De Araga~ o Umbuzeiro, G., Freeman, H.S., Warren, S.H., de Oliveira, D.P., Terao, Y., Watanabe, T., Claxton, L.D., 2005. The contribution of azo dyes to the mutagenic activity of the Cristais River. Chemosphere 60 (1), 55–64. Dogan, E.E., Yesilada, E., Ozata, L., Yologlu, S., 2005. Genotoxicity testing of four textile dyes in two crosses of Drosophila using wing somatic mutation and recombination test. Drug Chem. Toxicol. 28 (3), 289–301. Durnev, A.D., Oreshchenko, A.V., Kulakova, A.V., Beresten, N.F., 1995. Analysis of cytogenetic activity of food dyes. Vopr. Med. Khim. 41 (5), 50–53. Eremektar, G., Selcukb, H., Mericc, S., 2007. Investigation of the relation between COD fractions and the toxicity in a textile finishing industry wastewater: effect of preozonation. Desalination 211, 314–320. Garcı́a-Reyero, N., Grau, E., Castillo, M., López de Alda, M.J., Barceló, D., Piña, B., 2001. Monitoring of endocrine disruptors in surface waters by the yeast recombinant assay. J. Environ. Toxicol. Chem. 20 (6), 1152–1158. Gregory, P., 2007. Toxicology of textile dyes. In: Christie, R.M. (Ed.), Environmental Aspects of Textile Dyeing, 3; 2007, pp 44–73, WP chp. Grinevicius, V.M., Geremias, R., Laus, R., Bettega, K.F., Laranjeiras, M.C., Fávere, V.T., Wilhelm Filho, D., Pedrosa, R.C., 2009. Textile effluents induce biomarkers of acute toxicity, oxidative stress, and genotoxicity. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 57 (2), 307–314. Manu, B., Chaudhari, S., 2003. Decolorization of indigo and azo dyes in semicontinuous reactors with long hydraulic retention time. Process Biochem. 38 (8), 1213–1221. Mathur, N., Bhatnagar, P., 2007. Mutagenicity assessment of textile dyes from Sanganer (Rajasthan). J. Environ. Biol. 28 (1), 123–126. Mathur, N., Bhatnagar, P., Bakre, P., 2005. Assessing mutagenicity of textiles dyes from Pali (Rajasthan) using Ames bioassay. Appl. Ecol. Environ. Res. 4 (1), 111–118. O’Neill, C., Freda, R., Hawkes, D.L., Hawkes, N.D., Lourenc- o, H.M., Pinheiro, W.D., 1999. Color in textile effluents – sources, measurement, discharge consents and simulation: a review. J. Chem. Tech. Biotech. 74 (11), 1009–1018. Pearce, C.I., Lloyd, J.R., Guthrie, J.T., 2003. The removal of color from textile wastewater using whole bacterial cells: a review. Dyes Pigm. 58 (3), 179–196. Phugare, S.S., Kalyani, D.C., Patil, A.V., Jadhav, J.P., 2011a. Textile dye degradation by bacterial consortium and subsequent toxicological analysis of dye and dye metabolites using cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress studies. J. Hazard. Mater. 186 (1), 713–723. Phugare, S.S., Kalyani, D.C., Surwase, S.N., Jadhav, J.P., 2011b. Ecofriendly degradation, decolorization and detoxification of textile effluent by a developed bacterial consortium. Ecotoxicol. Environ. Saf. 74 (5), 1288–1296. Pillon, A., Servant, N., Vignon, F., Balaguer, P., Nicolas, J.C., 2005. In vivo bioluminescence imaging to evaluate estrogenic activities of endocrine disrupters. Anal. Biochem. 340 (2), 295–302. Rajeswari, K., Subashkumar, R., Vijayaraman, K., 2011. Biodegradation of mixed textile dyes by bacterial strains isolated from dyewaste effluent. Res. J. Environ. Toxicol. 5, 97–107. Robinson, T., Chandran, B., Nigam, P., 2001. Studies on the decolourisation of an artificial textile-effluent by white-rot fungi in N-rich and N-limited media. Appl. Microbiol. Biotechnol. 57 (5-6), 810–813. Robinson, T., Chandran, B., Nigam, P., 2002. Removal of dyes from a synthetic textile dye effluent by biosorption on apple pomace and wheat straw. Water Res. 36 (11), 2824–2830. Routledge, E.J., Parker, J., Odum, J., Ashby, J., Sumpter, J.P., 1998. Some alkyl hydroxy benzoate preservatives (parabens) are estrogenic. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153, 12–19. Roychoudhury, A., Giri, A.K., 1989. Effects of certain food dyes on chromosomes of Allium cepa. Mutat. Res. 223 (3), 313–319. Schneider, K., Hafner, C., Jäger, I., 2004. Mutagenicity of textile dye products. J. Appl. Toxicol. 24 (2), 83–91. Sharma, K.P., Sharma, S., Sharma, S., Singh, P.K., Kumar, S., Grover, R., Sharma, P.K., 2007. A comparative study on characterization of textile wastewaters (untreated and treated) toxicity by chemical and biological tests. Chemosphere 69, 48–54. Soni, P., Sharma, S., Sharma, S., Kumar, S., Sharma, K.P., 2006. A comparative study on the toxic effects of textile dye wastewaters (untreated and treated) on mortality and RBC of a freshwater fish Gambusia affinis (Baird and Gerard). J. Environ. Biol. 27 (4), 623–628. Tigini, V., Giansanti, P., Mangiavillano, A., Pannocchia, A., Varese, G.C., 2011. Evaluation of toxicity, genotoxicity and environmental risk of simulated textile and tannery wastewaters with a battery of biotests. Ecotoxicol. Environ. Saf. 74 (4), 866–873. Thomas, O., Theraulaz, F., Agnel, C., Suryani, S., 1996. Advanced UV examination of wastewater. Environ. Technol. 17 (5), 251–261. Tsuda, S., Murakami, M., Matsusaka, N., Kano, K., Taniguchi, K., Sasaki, Y.F., 2001. DNA damage induced by red food dyes orally administered to pregnant and male mice. Toxicol. Sci. 61 (1), 92–99. UVPro, 2000. Procédés et dispositifs pour la manipulation, l’archivage, la caractérisation, l’analyse d’un échantillon liquide. Patent 00402038-4. Verma, Y., 2008. Acute toxicity assessment of textile dyes and textile and dyes industrial effluents using Daphnia magna bioassay. Toxicol. Ind. Health 24, 491–500. You, S.J., Teng, J.Y., 2009. Performance and dye-degrading bacteria isolation of a hybrid membrane process. J. Hazard. Mater. 172 (1), 172–179. Yusuff, R.O., Sonibare, J.A., 2004. Characterization of textile industries effluents in Kaduna Nigeria and pollution implications. Global Nest: Int. J. 3 (6), 212–221. II. Développement d’un nouveau bio-récepteur d’affinité pour la détection des xéno-oestrogènes Les connaissances acquises sur les mécanismes de la perturbation endocrinienne a permis de mettre au point des tests de bio analyse in vitro de la perturbation endocrinienne. La caractérisation, l’identification et la quantification des substances à l’origine de l’effet reste cependant indispensable pour atteindre les objectifs de bon état écologique des masses d’eau. L’analyse régulière de la qualité des masses d’eau fait appel à toute une panoplie d’outils de diagnostic, d’évaluation et de mesure. Ces méthodes principalement physico-chimiques sont automatisées et permettent de mesurer un grand nombre de substances chimiques connues et d’échantillons (ces analyses se font en laboratoire). Elles représentent la grande majorité des techniques d’analyse utilisées à ce jour. Il existe également des méthodes biologiques permettant aussi de détecter spécifiquement une substance. Elles regroupent l’immunochimie, les bioessais, les biocapteurs. La plus répandue est la technique ELISA (Alarcon et al., 2006). Cette technique nécessite le développement d’anticorps spécifiquement dirigés contre les molécules cibles. L’anticorps reste le bio-récepteur (ou Elément de Reconnaissance Biologique dit ERB) affine le plus utilisé. Le contrôle des contaminants de plus en plus important crée une forte demande pour des méthodes d'analyse qui permettent leur détection rapide et sensible à des concentrations correspondant aux limites réglementaires établies. Dans ce cadre, la détection de mycotoxines est une préoccupation de plus en plus importante. En effet, les mycotoxines de structures chimiques diverses et de propriétés physiques différentes peuvent induire un large éventail d'effets biologiques sur les mammifères : génotoxique, tératogène, mutagène, ou encore oestrogénique (Storari et al., 2012). L'ochratoxine A, examinée par le Centre international de recherche sur le cancer, a été reconnue comme potentiellement cancérogène (groupe 2B) pour l'homme et plus récemment comme perturbateur endocrinien (Frizzell et al., 2013a et b). C’est pourquoi il est nécessaire de surveiller le taux de contamination par cette toxine dans les aliments et les boissons sachant que la dose maximale autorisée dans l'UE est actuellement de 2,0 µg/l en ochratoxine A (European Commission, 2005). Les anticorps sont produits lorsque le système immunitaire est au contact de molécules étrangères de poids moléculaire important (supérieur à l 000 daltons). En revanche concernant les molécules de poids moléculaire inférieur à 400 Da, les réactions immunitaires sont induites par un couplage de la molécule d’intérêt (dite haptène) à une molécule porteuse (dite «carrier» comme la BSA par exemple). De ce, fait la sélection d’anticorps sélectifs uniquement contre l’haptène (molécule de «petite taille») est hasardeuse. 118 Par exemple, il existe des anticorps dirigés contre les HAP qui a été fabriqué en utilisant le Benzo[a]pyrenebutyric acid (B[a]PBA) pour générer un anticorps (Scharnweber et al. 2001) ou en le liant à une molécule porteuse (Spier et al. 2009). Les anticorps dirigés contre certaines molécules naturelles oestrogèniques comme certaines mycotoxines sont rares. Le remplacement de biomolécules naturelles avec les récepteurs artificiels ou biomimétiques est devenu un axe de la recherche prometteur au cours des dernières années (Tothill et al., 2011). Ces molécules présentent l’avantage d’être robustes et faciles à produire et peuvent être modifiées aisément pour faciliter l'immobilisation. La reconnaissance moléculaire par des peptides est connue pour un grand nombre de mécanismes, tels que la transduction de signal, la croissance cellulaire et la défense immunitaire, et est basée sur plusieurs interactions non covalentes (Tothill et al., 2013). Les récepteurs peptidiques présentent de nombreux avantages par rapport aux anticorps car les peptides spécifiques peuvent être obtenus pour pratiquement n'importe quelle cible et sont faciles à produire. Par conséquent, la conception et la synthèse chimique de peptides pouvant se lier à la mycotoxine cible avec une affinité est un axe de recherche novateur. Nous décrivons dans ce travail, la mise au point de bio-récepteurs synthétiques de nature oligopeptidique affines pour l’ochratoxine A (OTA). En conséquence, un certain nombre de peptides (dépôt de brevet européen n° 12305269,8, 2012) provenant de protéines à activité redox spécifiques (par exemple l’oxydoréductase) ont été choisis et produits par synthèse chimique. La capacité de ces peptides à se lier à l'ochratoxine A a été évaluée par HPLC. Les résultats obtenus ont montré que le peptide NFO4 contenant 12 acides aminés est celui qui a la plus grande affinité pour l’ochratoxine A. L'identification d'un tel peptide permet d'analyser la présence de ce myco-oestrogène dans une matrice très complexe où il est souvent présent, le vin rouge. Ce peptide est donc utilisé pour développer un dosage immuno-enzymatique à base de peptide (test ELISA à base de peptide). La détection a pu être réalisée pour une gamme allant de 1,25 à 10 µg/l d’OTA. Les limites de détection (LOD) déterminées pour l’OTA dans le PBS et le vin rouge sont respectivement de 1,25 µg/l et 2 µg/l. Le test ELISA a montré que le peptide NFO4 peut distinguer une contamination de 2 µg/l de l'OTA dans le vin rouge (sans préconcentration). En revanche cet oligopeptide reconnait également l’ochratoxine B qui ne se distingue de l’ochratoxine A que par l’absence d’un groupement chlore. Le test ELISA montre qu’il y a 21% de réactivité croisée. En conclusion, cette étude préliminaire met en évidence la possibilité d'utiliser de petits peptides dans des systèmes de biocapteurs (par exemple par détection électrochimique). 119 Des modifications de la séquence peptidique du NFO4 peuvent être requises dans le but de diminuer d’avantage la réactivité croisée observée avec l’OTB. Dans tous les cas, ces données préliminaires montrent qu’il est possible de développer d’autres bio-récepteurs d’affinité autre que les anticorps et les aptamers ADN ou ARN pour détecter des contaminants dans des matrices complexes. 120 Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246 Contents lists available at SciVerse ScienceDirect Biosensors and Bioelectronics journal homepage: www.elsevier.com/locate/bios Peptide binding to ochratoxin A mycotoxin: A new approach in conception of biosensors I. Bazin a,n, N. Andreotti b, A. Ibn Hadj Hassine a, M. De Waard c, J.M. Sabatier b, C. Gonzalez a a Ecole des Mines d’Ales, 6 avenue de Claviers 30319 Ales cedex, France INSERM UMR1097, Aix-Marseille Université, Parc scientifique de Luminy, Marseille, France c INSERM U836, Grenoble Institut des Neurosciences, Bâtiment Edmond Safra, 38042 Grenoble Cedex 09, France b a r t i c l e i n f o a b s t r a c t Available online 27 July 2012 Ochratoxin A (OTA) is a widespread and abundant natural carcinogenic mycotoxin produced by several species of Aspergillus and Penicillium fungi. Due to the ubiquitous presence of these fungi in food and potential risk for human health, a rapid and sensitive in vitro detection assay is required. Analytical methods for OTA detection/identification are generally based on liquid–liquid extraction, clean-up using an immunoaffinity column (IAC), and identification by reversed-phase high pressure liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD). However, IACs are costly and have a short lifespan. Therefore, an interesting approach would appear to be the design and chemical synthesis of a mimotope peptide simulating mycotoxin-specific antibodies. We have developed a promising alternative method that is based on the use of peptides which are able to bind to specific chemical functions and/or molecular structures. Accordingly, a number of peptides (derived from the structures of major redox proteins) were selected and produced by chemical solid phase syntheses. The ability of such peptides to bind to ochratoxin A was evaluated by HPLC. The peptide NF04 (structurally derived from an oxidoreductase enzyme), which was found to be the sole potently reactive compound among tested molecules, was further evaluated in a peptide-based enzyme-linked immunosorbent assay (peptidebased ELISA), thus confirming its specific interaction with ochratoxin A. & 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. Keywords: Peptide binding Peptide-based assay Ochratoxin A Mycotoxin 1. Introduction Ochratoxin A, also referred to as OTA, is a coumarinic mycotoxin produced by several fungi species from Aspergillus (e.g., A. ochraceus) and Penicillium (e.g., P. verrucosum) genera under different environmental conditions (Scott, 1997; Brera et al., 2008). It is a mycotoxin that has been identified as a contaminant in grains, cereals, beans, coffee, dried fruits and wine (Zimmerli and Dick, 1995, Varga and Kozakiewicz, 2006; Blesa et al., 2006). OTA is known to have nephrotoxic, immunotoxic, teratogenic and carcinogenic effects (O’Brien and Dietrich, 2005, Pfohl-Leszkowicz et al., 2002, Smith et al., 1995). Wine contamination by OTA has been described and largely reviewed by several authors (Varga and Kozakiewicz, 2006; Blesa et al., 2006). This beverage is widely consumed and represents a major source of daily OTA intake for the population (Jorgensen, 2005). Thus, regulatory limits for OTA exist in many countries, especially in Europe where maximum limits for OTA in wine, grape juices and grape beverages, have been fixed at 2 mg l 1 (European Commission Regulation, n Corresponding author. E-mail address: [email protected] (I. Bazin). 0956-5663/$ - see front matter & 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2012.07.031 2005,2010). Nowadays, the most widely used quality control process relies on an immunoaffinity column (IAC), followed by reversed-phase high pressure liquid chromatography using fluorescence detection (HPLC-FLD) (Visconti et al., 1999; Aresta et al., 2006). Because this mycotoxin is largely represented in food, availability of rapid, reliable and sensitive analytical methods for the detection of OTA is required to protect consumers’ health. Despite the fact that the IAC procedure is rather simple, sensitive and quite reproducible, IACs are unfortunately too costly, together with short shelf lives. In the last decade, several groups attempted to develop appropriate alternative assays to improve rapidity and sensitivity, combined with cost reduction. Such methods rely on immunoassays, test strips and biosensors. First, a competitive ELISA kit has been used widely in recent years for the detection of OTA. ELISAs for ochratoxin content analyses have been reported in barley (Morgan et al., 1983). The assay sensitivity for detection of OTA in barley samples was ca. 5 mg kg 1 (Ramakrishna et al., 1990). Angelini et al., (2008) compared performance of four extraction procedures and three commercial ELISA kits for OTA in grapes. Sometimes, IAC are used to concentrate OTA. The advantage of using IAC after the extraction procedure was the excellent detection limit, which was between 0.06 and 0.0075 mg l 1. This detection limit depends on the ELISA kit used. I. Bazin et al. / Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246 Second, the test strip, also called lateral flow device or immunochromatographic strip (ICS) test, is based on a membrane loaded with immobilized antibodies. They are of simple use and give faster results (2–15 min). Test strips are semi-quantitative with different visual limits of detection (LOD) in function of the nature of sample (Krska and Molinelli, 2009; Shim et al., 2009). Initially, the LOD was set at ca. 500 mg l 1 of OTA (Cho et al., 2005; Rusanova et al., 2009), whereas, nowadays, the cutoff level dropped down to 1 mg l 1, which corresponds to the lower limit tolerated by the Food and Drugs Administration. Third, with regard to biosensors, their characteristics depend on the nature of the bioreceptor and the physical transducer. Antibodies, which show high selectivity and affinity towards mycotoxins, have been widely used to set up a variety of immunosensors (e.g. electrochemical, impedimetric or conductimetric immunosensors) against mycotoxins like OTA (Prieto-Simón et al., 2008; Liu et al., 2009; Alarcon et al., 2006; Radi et al., 2008,2009). The well-known favorable molecular recognition characteristics of an antibody (in terms of affinity and selectivity) are counterbalanced by the unfavorable use of different matrix samples or experimental conditions of assay (e.g. denaturation of antibodies in organic solvents). To overcome these drawbacks, several strategies have been followed such as development of new synthetic systems that mimic the recognition properties of antibodies. Indeed, many efforts have been made to substitute OTA antibodies by DNA aptamers (Cruz-Aguado et al., 2008a,2008b), molecularly imprinted polymers (MIP) (Ali et al., 2010; Yu and Lai, 2010) and phage display libraries (Giraudi et al., 2007). The isolation of oligonucleotide sequences (DNA aptamers) and synthetic receptor(s) (MIP) that recognize this class of target molecules have some advantages compared to antibodies. They can be generated easily and are stable at different pH values and/or at high temperatures. Among these approaches, based on synthetic systems, none of them reach affinity for OTA that is compatible with the detection limits fixed in wine by the European Commission (2.0 mg l 1) or the rest of the world (1.0 mg l 1). The first hexapeptide selected using phage display libraries exhibits an affinity of ca. 3.4 104 M 1 towards OTA (Giraudi et al., 2007). Although moderate, such a peptide affinity can be potentially increased by some structure–activity relationship studies. Peptide-based detection assays in general are commercially available and most frequently used in the biomedical field rather than environmental sciences which is of concern in this study. For examples, peptides are used in various fields, from diagnosis of HIV infection (Alcaro et al., 2003; Ravanshad et al., 2006; Gerasimov and Lai, 2010) to detection of potential sensitizing compounds (Gerberick et al., 2004). Apart from the previously described techniques used for OTA quantification, we describe in this work for the first time a novel approach based on the identification of new peptides (not based on phage display analyses) which exhibit significant affinities towards OTA. HPLC was used as an analytical method to select the most potent peptide interacting with OTA in a binding assay. Identification of such a peptide is important and allowed us to analyze some red wine samples that were previously supplemented with OTA in a peptide-based enzyme-linked immunosorbent assay (peptide-based ELISA). 241 2.2. Chemicals OTA was obtained from Sigma-Aldrich (France). A solution was prepared in methanol at 1 mg ml 1. PEG 8000 (Polyethylene Glycol) and PVPP were obtained from Promega (France). Luminol was obtained from Pierce (France). 2.3. Solid-phase peptide synthesis The peptides (NF01, NF02, NF03, NF04, Chim1, pep01 and pep02) were produced by chemical synthesis using a peptide synthesizer (Model 433 A, Applied Biosystems Inc.). The amino acid sequence of the most reactive peptide, i.e. NFO4, is provided in Fig. 2B. All peptide sequences are described in European patent no. 12305269.8 (deposited by Tournoux Biotech on March 5th 2012). Peptide chains were assembled stepwise on 0.25 m mol of Fmoc-amide resin (1% cross-linked; 0.65 m mol of amino group/g) using 1 m mol of Na-(9-fluorenyl)methyloxycarbonyl (Fmoc) L-amino acid derivatives. Side chain-protecting groups for trifunctional residues were: trityl for cysteine, and asparagine; t-butyl for tyrosine, glutamate and aspartate; 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl for arginine; and t-butyloxycarbonyl for lysine. Na-amino groups were deprotected by successively treating with 18 and 20% (v/v) piperidine/N-methylpyrrolidone for 3 and 8 min, respectively. After three washes with N-methylpyrrolidone, the Fmoc-amino acid derivatives were coupled (20 min) as their hydroxybenzotriazole active esters in N-methylpyrrolidone (4-fold excess). After peptides were assembled, and removal of N-terminal Fmoc groups, the peptide resins (ca. 1.5 g) were treated under stirring for 2.5 h at 25 1C with mixtures of trifluoroacetic acid/H2O/thioanisole/ethanedithiol (73:11:11:5, v/ v) in the presence of crystalline phenol (2.1 g) in final volumes of 30 ml per gram of peptide resins. The peptide mixtures were filtered, precipitated and washed twice with cold diethyloxide. The crude peptides were pelleted by centrifugation (3200 g; 10 min). They were then dissolved in H2O and freeze dried. The crude peptides were purified to homogeneity by reversed-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) (C18 Aquapore ODS, 20 mm, 250 10 mm; PerkinElmer Life Sciences) by means of a 60 min linear gradient of 0.08% (v/v) trifluoroacetic acid/H2O (buffer A) with 0 to 40% of 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid/ acetonitrile (buffer B), at a flow rate of 4 ml/min (l ¼230 nm). The purity and identity of each peptide were assessed by: (i) analytical C18 reversed-phase HPLC (C18 Lichrospher 5 mm, 4 200 mm; Merck) using a 60 min linear gradient of buffer A with 0–60% of buffer B, at a flow rate of 1 ml/min; and (ii) molecular mass determination by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) spectrometry (Voyager DE-RP, Perceptive Biosystems Inc.). 2. Material and methods 2.1. Materials Na-fluorenyl-9-methyloxycarbonyl (Fmoc)-L-amino acids, Fmoc-amide rink resin, and reagents used for peptide synthesis were obtained from Iris Biotech (Germany). Solvents were analytical grade products from Carlo-Erba (France). NFO4 primary structure VYMNR KYYKC CK-NH2 1 5 10 12 Fig. 1. (A) Chemical structure of Ochratoxin A mycotoxin. (B) Amino acid sequence of NFO4. Single letter code. 242 I. Bazin et al. / Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246 332- NFO4 20015010050- 300Absorbance (mV) 250- 25020015010050- 9 18 27 36 45 Retention time (min) 54 60 18 27 36 45 Retention time (min) NFO1 200150100- 20015010050- 509 18 27 36 45 Retention time (min) 54 60 18 27 36 45 Retention time (min) Chim1 54 60 OTA 300- NFO2 250- 100- 335- Absorbance (mV) Absorbance (mV) 250- NFO4 150- 9 300- 300- 200- 54 60 OTA 348- 250- 50- NFO4 9 OTA 343- OTA 338- 300Absorbance (mV) Absorbance (mV) 300- Absorbance (mV) Hydroquino ne 329- 25020015010050- 9 18 27 36 45 Retention time (min) 54 60 9 18 27 36 45 Retention time (min) 54 60 Fig. 2. HPLC-based peptide-based binding assays. (A) Representative HPLC profiles of three reaction media corresponding to NF04 incubation with lactic acid as negative control (left panel), hydroquinone as positive control (center panel) and OTA (right panel). Lactic acid is not detected on the HPLC profile because of lack of absorption at 230 nm. Complexes between NF04 and compounds are not detected on HPLC profiles. (B) Representative HPLC profiles of three peptides incubated with OTA: NFO1 (left), NFO2 (middle), and Chim1 (right). Peak peptide depletions according to control without OTA (not shown) are 7% (NFO1), 35% (NFO2) and 10% (Chim1). 2.4. HPLC-based peptide binding assays Eighty microlitres of a peptide (NF01, NF02, NF03, NF04, Chim1, pep01 or pep02) at a concentration of 1.25 mM in 0.1 M Tris–HCl buffer, pH 8.3, were tested with 10 ml of OTA solution at 0.1 M in acetonitrile, supplemented with 70 ml of 0.1 M Tris–HCl buffer (pH 8.3) and 40 ml acetonitrile. The mixture of peptide and OTA was incubated for 4 h in the dark, at a temperature of 30 1C. The reaction medium (200 ml) was then analyzed by C18 reversedphase HPLC (C18 Aquapore ODS, 20 mm, 250 10 mm; PerkinElmer Life Sciences) by means of a 40 min linear gradient of 0.08% (v/v) trifluoroacetic acid/H2O (buffer A) with 0 to 60% of 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid/acetonitrile (buffer B), at a flow rate of 1 ml/ min (l ¼230 nm). Peptide reactivity with OTA was finally assessed by comparing the peak areas corresponding to free peptide (unreactive peptide) between the test sample of peptide/OTA, and a reference sample of peptide alone (without OTA). It is worth mentioning that results obtained with the reference samples (peptides alone) are similar to those obtained with peptides incubated with irrelevant, unreactive products (data not shown). The identity of free peptides and peptide/OTA complexes was verified by MALDI-TOF mass spectrometry. Binding assays were performed in triplicate. 2.5. Peptide-based competitive enzyme-linked immunosorbent assay (peptide-based competitive ELISA) Polystyrene white microtiter plate wells (Maxisorb LumiNunc, Thermoscientific, USA), coated with the synthetic peptide NFO4 at an optimized concentration of 5 mg/100 ml in carbonate buffer (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 0.2 g/L NaN3, pH 9.6) were incubated at 37 1C for 3 h. Non-specific binding sites of the peptide-coated wells were blocked with 5% nonfat dry milk in PBS containing 0.1% Triton X-100 (milk buffer) at room temperature (RT) for 3 h before performing the test. Fifty ml of OTA-HRP (horseradish peroxidase) were added in each well combined with 50 ml of phosphate buffer saline or red wine sample supplemented with unlabeled OTA. The reaction was left for 30 min at RT. After washing unbound OTA, 40 ml of luminol (Pierce, France) substrate was added in each well. After 5 min of enzymatic reaction, light emission signals (lmax ¼425 nm) were analyzed using an automated microplate luminescence reader (Berthold, France). Light intensity was expressed in Relative Luminescent Unit (RLU). The result obtained is inversely proportional to the concentration of unlabeled OTA. During each test, nonspecific binding (negative control) was determined by using an incubation mixture (OTA-HRP) in which the peptide NFO4 was replaced by 100 mL of carbonate buffer. All the samples were tested in triplicate and the mean of the peak light emission was taken as the final light signal value. 2.6. Calculation methods In order to evaluate the peptide-based competitive assay, a calibration curve was set up by using solutions containing welldefined concentrations of OTA. In that direct competitive peptidebased ELISA, results are expressed in B/Bo dose logarithmic function. B and Bo represent the enzyme-bound activity measured in the presence or absence of competitor, respectively. The standard curve was traced by plotting standard concentrations on I. Bazin et al. / Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246 x-axis (logarithmic scale) and percentage of maximal binding (express in % of B/B0) on y-axis (B/Bo¼f(log[OTA])). The binding values are obtained by dividing the light intensity of each testing well B (the luminescence measured when OTA–HRP and unlabeled OTA are in competition with NFO4 peptide) by the light Table 1a HPLC-based peptide binding assays. Percentages of peak area depletion are noted. ‘100’ corresponds to 100% binding of peptide to indicated chemical compound. ‘0’ corresponds to a lack of interaction between peptide and organic compound. 243 intensity of the positive control well B0 (maximum luminescence obtained with OTA-HRP). This method allows the comparison of results between assays performed on different plates or different days. While the absolute light emission may differ from plate to plate or day to day, the percentage of B/B0 values should be reasonably consistent from one plate to the next. All measurements were made in triplicate. The minimum detectable concentration (MDC) was taken as the concentration of competitor (unlabeled OTA) inducing a significant decrease in B0. The effect of complex matrix was established by testing a red wine sample. Peptides/chemical compounds NFO1 NFO2 NFO3 NFO4 Chim1 2.7. Specificity measurements Hydroquinone Phtalic anhydride Diphenylcyclopropenone Cinnamic aldehyde Phenylacetaldehyde Lactic acid Okadaic acid Naphtalene 100 95 0 55 80 0 0 0 90 100 98 35 20 0 0 0 100 100 100 100 35 0 0 0 100 100 99 100 100 0 0 0 80 85 85 90 55 0 0 0 The specificity of the peptide immunoassay described previously was controlled by testing its capacity to detect or not ochratoxin B (OTB), another mycotoxin structurally related to OTA. Results are expressed as percentage of cross-reactivity, defined as the ratio (%) of the concentration of OTA and OTB compounds at 50% B/B0. Cross-reactivity measurement was carried out in triplicates. Table 1b Chemical structures of organic compounds studied in HPLC-based peptide binding assays. Name MW Hydroquinone 110.11 Belchik and Xun (2011) Phtalic anhydride 148.10 Quartier et al. (2006) Diphenylcyclopropenone 206.25 Ryan et al. (2000) Cinnamic aldehyde 132.16 Cocchiara et al. (2005) Phenylacetaldehyde 120.15 Chen et al. (2011) 90.08 Shen et al. (2012) Lactic acid Chemical structure Ref. Okadaic acid 805.00 Franchini et al. (2010) Naphtalene 128.17 Girschikofsky et al. (2012) 244 I. Bazin et al. / Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246 In order to study matrix-associated effects, a study with red wine was carried out. A sample of 10 ml of wine supplemented (or not) with OTA (1.25–15 mg l 1) has been diluted with 10 mL of PEG8000 1% - NaHCO3 5% solution. This mixture has been incubated for 30 min at RT on a rocker. Afterwards, it was centrifuged at 8000 rpm for 15 min. The whole sample is filtered before analysis with the peptide-based enzyme-linked immunosorbent assay. Using NFO4, the threshold of OTA detection was found to be in the same concentration range as the one requested by the European commission regulation (2 mg l 1 OTA). Although the potency of OTA detection by NFO4 is actually moderate, one can anticipate that optimizing both NFO4 structure (in a structureactivity relationship study) and the experimental conditions of binding assay could improve sensitivity of peptide-based detection, and yield to the desired mycotoxin detection range in wine. Overall, experimental data obtained strongly suggest that, basically, a peptide-based detection assay of OTA might be a promising approach. 3. Results and discussion 3.2. Peptide-based competitive enzyme-linked immunosorbent assay 2.8. Preparation of matrix samples for peptide EIA: wine pretreatment 3.1. Rationale of the study The mycotoxin OTA from Aspergillus (e.g., A. ochraceus) and Penicillium (e.g., P. verrucosum) genera is a complex organic compound that contains several functional groups, including carbonyl (ester: R1COOR2, and amide: R1CONHR2R3) and phenol (i.e f-OH) moieties (Fig. 1A). We designed and chemically produce a number of peptides (European patent deposit no. 12305269.8, 2012) derived from specific regions of redox proteins (e.g. oxidoreductase) and ABC transporters that potently react-in an HPLC-based binding assay-with more or less complex molecules containing such functional group(s), i.e carbonyl and/or phenol (Table 1a and b). The carbonyl group (i.e. C¼O) is shared by several types of organic compounds and comprises ketone, aldehyde, ester, amide, carboxylic acid, acid anhydride, enone and acyl halide. We evaluated whether or not these selected peptides would interact with OTA. As shown in Table 2, three peptides (NFO2, NFO3 and NFO4), with related molecular structures (up to 83% sequence identity) derived from human NADH–FMN oxidoreductase significantly interacted with the mycotoxin. The experimental molecular masses, as determined by MALDI-TOF mass spectrometry, were (M þH) þ : 1793.17 Da (NFO2), 1722.15 Da (NFO3) and 1598.99 Da (NFO4), consistent with their calculated molecular structures. Among reactive peptides, NFO4 was the most potent compound, with 70% binding to OTA in our experimental conditions of binding assay. NFO4 amino acid sequence is provided in Fig. 1B. Fig. 2A shows binding assays with representative HPLC profiles of three reaction media corresponding to NF04 incubated for 4 h at 30 1C with lactic acid as negative control (left panel), hydroquinone as positive control (center panel) and OTA (right panel). Interaction of NFO4 with hydroquinone or OTA is highlighted by the disappearance (hydroquinone) or decrease (OTA) of peak area corresponding to freeunbound NFO4. HPLC profiles showing binding of other peptides to OTA are also shown for comparison (Fig. 2B). For example, NFO1 and Chim1 showed binding inferior to 10%, while NFO2 showed binding at 35%. Table 2 Peptide binding assay. Percentages of peak area depletion are noted. ‘100’ corresponds to 100% binding of peptide to organic compound. ‘0’ corresponds to a lack of interaction. Peptides/chemical compounds NFO1 NFO2 NFO3 NFO4 Chim1 OTA Hydroquinone** Lactic acid* 7 100 0 35 90 5 40 100 4 70 100 7 10 80 1 nn n Positive control. Negative control. Competitive ELISAs are most commonly used to measure various molecules including lipids, hormones, and small peptides if they are present in high enough concentrations. In this study, this type of assay is based on the competition between the analyte of interest, OTA, and an enzyme horseradish peroxidaseconjugated version of the same analyte (referred to as the tracer, OTA–HRP) for a limited number of specific peptide NFO4 binding sites (Fig. 3). The concentration of OTA–HRP is held constant in all wells while the concentration of OTA varies from well-to-well (0 mg l 1, 1.25 mg l 1, 2 mg l 1, 2.5 mg l 1, 5 mg l 1, 10 mg l 1 and 15 mg l 1). As a result, the amount of tracer that can bind to the peptide NFO4 will be inversely proportional to the amount of analyte in the well–the presence of more analyte means less tracer will be able to bind to the specific peptide. The standard curves obtained for peptide-based competitive ELISA in PBS are shown (Fig. 4A). The exponential curve fit for the standard OTA in PBS gives a clear graphical representation of how the competition proceeds. Inhibition starts at 1.25 mg l 1 and reaches a maximum at 10 mg l 1. Inhibition is complete which is expected since the tracer is also OTA-based. Half-inhibition occurs at a value of 3.2 mg l 1, which should grossly correspond to the Kd value of NFO4 for OTA. We consider that with this test the LOD for OTA is at 1.25 mg l 1 and that differences in OTA concentration can be discriminated between 1.25 and 10 mg l 1. Cross-reactivity measurement of the peptide test was carried out using OTB (Fig. 4A). The OTB concentration inducing 50% of the maximum Peptide NFO4 anti-OTA OTA Other compounds (interferences) OTA-HRP Developer (substrate) Fig. 3. Principle of competitive immunoassay with conjugated OTA. (A) The plate is coated with the peptide NFO4. (B) The peptide is then placed in contact with the sample. If the sample contains the specific OTA, the toxin links to the specific peptide and the detection element conjugated with the toxin (usually HRP). (C) The amount of HRP-conjugated toxin that can be fixed is inversely correlated with the amounts of toxin present in the sample. (D) The non-fixed compounds are rinsed away before adding a developing product. I. Bazin et al. / Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246 100 Red wine OTA luminescence (RLU) 80 B/B0 (%) 245 60 40 PBS OTA 20 PBS OTB 0 1 10 200000 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 Control Mycotoxin concentration (µg l-1) 0 2 10 OTA concentration (µg l-1) Fig. 4. (A) Peptide-based competitive ELISA calibration curve. The x-axis represents the calibrator concentration of mycotoxin (OTA or OTB). B and B0 represent the bound enzyme activity measured in the presence or absence of competitor, respectively. Data are average7 standard deviation, and were fitted by decreasing exponential functions y¼y0 þa.e bx. Y0 values were o 10 for OTA (wine and PBS) and 430 for OTB. (B) Peptide-based competitive ELISA with OTA in wine. The negative control is the luminescence emitted with OTA–HRP without NFO4 peptide. Data are the mean of n ¼3 7standard deviation. possible decrease of the light signal was 8.5 mg l 1, indicating that the affinity of NFO4 for OTB is ca. 3-fold lower than for OTA. In addition, free OTB was a worse competitor than OTA for decreasing OTA–HRP signal. Maximal decrease reached 69% instead of 100% for concentrations above 15 mg l 1. At 10 mg l 1, OTA depleted the signal by 89%, whereas OTB reduced it by 47% clearly indicating that OTA detection was better than OTB with this system. Next, we evaluated whether our system could detect OTA from red wine samples. The same range of OTA concentrations was added to red wine samples. The resulting competition curve was compared to that established with pure OTA or OTB in PBS (Fig. 4A). Wine OTA could nicely be detected by the system, with a slight reduction in efficacy which can easily be explained by the enhanced number of non specific compounds co-present in wine samples. Half-inhibition occurred at 5.8 mg l 1 and as for OTA in PBS the inhibition was complete. The LOD for OTA in wine was 2 mg l 1 (Fig. 4B), which is only slightly higher than OTA in PBS. These results suggested that the NFO4 peptide can be used for detection of OTA in red wine matrices. 4. Conclusions The European Union (EU) has defined regulatory limits for OTA, i.e., 10 mg l 1 in dried vine fruits and instant coffee, 5 mg l 1 in cereals and roasted coffee and 2 mg l 1 in wine. Here we present a new strategy for detection of this important mycotoxin in various matrices like red wine. We have selected small peptides (12 amino acids) allowing specific recognition of OTA. The peptide named NFO4 was selected in HPLC for its higher affinity for OTA. We have validated this result by a peptide-based competitive ELISA in phosphatase buffer saline and in red wine samples. The peptide-based competitive ELISA showed that NFO4 can discriminate a contamination of 2 mg l 1 of OTA in red wine (without preconcentration of the sample on immunoaffinity column). This preliminary study highlights the possibility of using small peptides in biosensor systems (e.g. by electrochemical detection). Modifications of NFO4 peptide sequence may be required in order to further decrease the observed cross-reactivity with OTB which is potentially related to the phenol moiety of OTB. Such a structure-activity relationship study may increase the LOD to the lower value of 1 mg l 1 which is the world limit for OTA in red wine. In any case, these preliminary data are quite encouraging and strongly suggest that further work on NFO4 will allow the development of a more sensitive system, either by peptide modification or by OTA preconcentration by an affinity column. Acknowledgment Fernando Rubio (Abraxis Kit, Warminster, PA, USA) is thanked for OTB-HRP production. References Alarcon, S.H., Palleschi, G., Compagnone, D., Pascale, M., Visconti, A., Barna-Vetró, I., 2006. Talanta 69, 1031–1037. Alcaro, M.C., Peroni, E., Rovero, P., Papini, A.M., 2003. Current Protein and Peptide Science 4, 285–290. Ali, W.H., Derrien, D., Alix, F., Pérollier, C., Lépine, O., Bayoudh, S., Chapuis-Hugon, F., Pichon, V., 2010. Journal of Chromatography A 1217, 6668–6673. Angelini, E., Bazzo, I., Savino, M., Borgo, M., 2008. Journal of Food Protection 71, 2488–2496. Aresta, A., Vatinno, R., Palmisano, F., Zambonin, C.G., 2006. Journal of Chromatography A 1115, 196–201. Belchik, S.M., Xun, L., 2011. Drug Metabolism Reviews 43, 307–316. Blesa, J., Soriano, J.M., Molto, J.C., Manes, J., 2006. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 46, 473–478. Brera, C., De Santis, B., Debegnach, F., Miraglia, M., Yolanda, P., 2008. Mycotoxins in Food Contaminants and Residue Analysis, Comprehensive Analytical Chemistry, vol. 51. Elsevier, Amsterdam, The Netherland, pp. 363–427.. Chen, X.M., Kobayashi, H., Sakai, M., Hirata, H., Asai, T., Ohnishi, T., Baldermann, S., Watanabe, N., 2011. Journal of Plant Physiology 168, 88–95. Cho, Y.J., Lee, D.H., Kim, D.O., Min, W.K., Bong, K.T., Lee, G.G., Seo, J.H., 2005. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 8447–8451. Cocchiara, J., Letizia, C.S., Lalko, J., Lapczynski, A., Api, A.M., 2005. Food and Chemical Toxicology 43, 867–923. Cruz-Aguado, J.A., Penner, G., 2008a. Analytical Chemistry 80, 8853–8855. Cruz-Aguado, J.A., Penner, G., 2008b. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56, 10456–10461. European Commission Regulation. No. 123/2005. European Union, Brussels. European Commission Commission Regulation, 2010. Official Journal of the European Union 35, 7–8. Franchini, A., Malagoli, D., Ottaviani, E., 2010. Marine Drugs 16, 658–677. Gerasimov, J.Y., Lai, R.Y., 2010. Chemical Communications (Camb) 46, 395–397. Gerberick, G.F., Vassallo, J.D., Bailey, R.E., Chaney, J.G., Morrall, S.W., Lepoittevin, J.P., 2004. Toxicological Sciences 81, 332–343. Giraudi, G., Anfossi, L., Baggiani, C., Giovannoli, C., Tozzi, C., 2007. Journal of Chromatography A 1175, 174–180. Girschikofsky, M., Rosenberger, M., Belle, S., Brutschy, M., Waldvogel, S.R., Hellmann, R., 2012. Sensors (Basel) 12 2018–25. Jorgensen, K., 2005. Food Additives and Contaminants 22 (1), 26–30. Krska, R., Molinelli, A., 2009. Analytical and Bioanalytical Chemistry 393, 67–71. Liu, X.-P., Deng, Y.-J., Jin, X.-Y., Chen, L.-G., Juang, J.-H., Shen, G.-L., Yu, R.-Q., 2009. Analytical Biochemistry 389, 63–68. Morgan, M.R., McNerney, R., Chan, H.W., 1983. Journal of the Association of Official Analytical Chemists 66, 1481–1484. O’Brien, E., Dietrich, D.R., 2005. Critical Reviews in Toxicology 35, 33–60. Pfohl-Leszkowicz, A., Petkova-Bocharova, T., Chernozemsky, I.N., Castegnaro, M., 2002. Food Additives and Contaminants 19, 282–302. Prieto-Simón, B., Campa s, M., Marty, J.-L., Noguer, T., 2008. Biosensors and Bioelectronics 23, 995–1002. Quartier, S., Garmyn, M., Becart, S., Goossens, A., 2006. Contact Dermatitis 55, 257–267. Radi, A.-E., Muñoz-Berbel, X., Lates, V., Marty, J.-L., 2008. Biosensors and Bioelectronics 24, 1888–1892. 246 I. Bazin et al. / Biosensors and Bioelectronics 40 (2013) 240–246 Radi, A.-E., Muñoz-Berbel, X., Cortina-Puig, M., Marty, J.-L., 2009. Electrochimica Acta 54, 2180–2184. Ramakrishna, N., Lacey, J., Candlish, A.A., Smith, J.E., Goodbrand, I.A., 1990. Journal of the Association of Official Analytical Chemists 73, 71–76. Ravanshad, M., Sabahi, F., Mahboudi, F., Kazemnejad, A., 2006. Saudi Medical Journal 27, 31–36. Rusanova, T.Y., Beloglazova, N.V., Goryacheva, I.Y., Lobeau, M., van Peteghem, C., de Saeger, S., 2009. Analytica Chimica Acta 653, 97–102. Ryan, C.A., Gerberick, G.F., Cruse, L.W., Basketter, D.A., Lea, L., Blaikie, L., Dearman, R.J., Warbrick, E.V., Kimber, I., 2000. Contact Dermatitis 43, 95–102. Scott, P.M., 1997. Mycotoxins in Grain-Compounds Other than Aflatoxin. In: Miller, J.D., Trenholm, H.L. (Eds.), Eagan Press, Saint Paul, MN, USA, pp. 261. Shen, X., Zhang, G., Zhang, D., 2012. Organic Letters 14, 1744–1747. Shim, W., Dzantiev, B.B., Eremin, S.A., Chung, D., 2009. Journal of Microbiology and Biotechnology 19, 83–92. Smith, J.E., Solomons, G., Lewis, C., Anderson, J.G., 1995. Natural Toxins 3, 187–192. Varga, J., Kozakiewicz, Z., 2006. Trends in Food Science and Technology 17, 72–81. Visconti, A., Pascale, M., Centonze, G., 1999. Journal of Chromatography A 864, 89–101. Yu, J.C.C., Lai, E.P.C., 2010. Toxins 2, 1536–1553. Zimmerli, B., Dick, R., 1995. Journal of Chromatography B 666, 85–99. Conclusion générale et perspectives Bien que les premières recommandations de l’OCDE, sur la prise en compte des effets des substances chimiques sur des organismes complexes, remontent aux années 90, l’évaluation de leur impact sur le système hormonal reste d’actualité dans la mesure où aucune réglementation spécifique relative aux perturbateurs endocriniens (PE) n’existe à ce jour. Même si les activités hormonales de certains composés sont connues, leur mode d’action est complexe (effet de faible dose, effet de mélange, action sur différentes voies physiologiques) et de fait, il est difficile de standardiser des tests pouvant soutenir une réglementation. Les PE peuvent agir sur le système endocrinien en interférant à plusieurs niveaux (transport, métabolisme, libération d’hormones,…) et perturber les sécrétions hormonales des glandes endocrines telles que la thyroïde, les surrénales, le pancréas endocrine,… En effet, ces substances peuvent avoir des activités œstrogéniques et antiœstrogéniques, androgéniques et anti-androgéniques ou encore des activités thyroïdiennes. De ce fait, il n’existe pas de test unique recouvrant l’ensemble de ces perturbations hormonales, mais différents tests sont disponibles pour mesurer soit une perturbation oestrogénique (Escreen, ER-Calux, YES,…) soit une perturbation androgénique (YAS). Ainsi, dans le cadre de cette thèse, des tests in vivo et in vitro ont été utilisés pour détecter des perturbations endocriniennes. Pour l’ensemble des cas d’étude, le test YES a été appliqué pour déterminer l’activité oestrogénique et anti-oestrogénique d‘effluents ou de substances chimiques. A partir d’un terrain d’étude situé en Tunisie (Golfe de Gabes), ce travail de thèse s’est intéressé tout d’abord à l’impact des PE sur les écosystèmes aquatiques recevant des effluents de STEP provenant de différentes activités anthropiques. Le constat est que l’activité industrielle (traitement de phosphates et industrie chimique) est l’une des principales causes des déformations squelettiques observées sur les poissons Aphanius faciatus. Par contre, les organismes soumis aux rejets d’origine urbaine présentent un taux de déformations plus faible. Les analyses des métaux, des HAP et des œstrogènes naturels (œstradiol et produits de dégradation) et synthétiques (éthynilestradiol) mettent en évidence la présence de Cd et de HAP à des teneurs non négligeables. Des études antérieures ont montré que les poissons déformés présentent une surexpression de l’ARNm 126 codant pour le cytochrome P450 1A (CYP 1A). La transcription de ce gène est modulée par des xéno-hormones pouvant se lier au récepteur à la dioxine (AhR) comme les PCB ou les HAP. Ces résultats mettent en évidence que l’exposition combinée du cadmium et des HAP peut altérer l’activité des enzymes de biotransformation du métabolisme comme le CYP1A. De plus, il n’est pas à exclure que le Cd en présence de ligands d’AhR comme les HAP, puisse interagir avec la voie de signalisation de récepteur aux œstrogènes via la voie AhR. En revanche, une relation avec une perturbation oestrogénique spécifiquement liée au Cd est moins évidente, dans ce cas précis, car le principal biomarqueur (taux de vitellogénine) est identique chez tous les individus qu’ils présentent une déformation ou pas. Cette étude a été complétée par l’évaluation de l’effet oestrogénique des eaux usées susceptibles de contenir des parabènes en utilisant le Yeast Estrogen Screen (YES). L’activité oestrogénique a été mesurée sur la phase dissoute, les MES et les boues pour différentes étapes de traitement de la STEP. L’activité oestrogénique la plus importante est observée au niveau des boues avec une EC50 pouvant atteindre 10-8 EEQ (M). Par ailleurs, la quantification des parabènes par HPLC a été effectuée sur les phases dissoutes et MES (entrée et sortie de STEP) ainsi que sur les boues. Les valeurs obtenues montrent que ces composés ne sont plus présents en sortie à l’exception du méthyl parabène. La concentration de ce composé est, en effet, importante dans les eaux d’entrée de STEP et donc son élimination ne semble pas complète. Par contre l’éthyl et le butyl parabène sont accumulés préférentiellement dans les boues. Par ailleurs, la Tunisie ayant des activités textiles importantes, le YES a été utilisé pour déterminer les effets oestrogéniques et anti-oestrogéniques de colorants textiles. Les données de la littérature indiquent que les PE sont généralement des agonistes (effet oestrogénique), or les résultats obtenus pour ces colorants textiles ont montré une activité antagoniste (effet anti-oestrogénique). Cette activité anti-oestrogénique est plus classiquement observée pour les agents pharmacologiques appelés SERM (Selective Estrogen Receptor Modulator) comme le tamoxifen. Les effluents textiles étudiés présentes également une activité anti-oestrogénique. Pour compléter l’étude des colorants, l’effet oestrogénique a été mesuré via le YES sur des colorants alimentaires. Leur effet oestrogénique a été comparé à celui des parabènes et les résultats montrent qu’ils présentent une faible activité. 127 Bien que la présence des xéno-hormones dans les effluents de STEP étudiés soit avérée, la concentration mesurée et l’effet oestrogénique observé via le YES ne sont pas directement corrélables. En effet, l’activité oestrogénique des parabènes, recalculée en EEQ (équivalent oestradiol) à partir de la concentration réellement mesurée par HPLC, est nettement inférieure à celle observée pour l’échantillon via le YES. En conclusion, le YES semble adapté à l’étude d’effluents de STEP. En effet, les résultats de cette étude ont mis en évidence des effets oestrogéniques et anti-oestrogéniques sur des effluents réels. Son principal avantage réside dans sa simplicité d’utilisation qui le rend plus compatible avec des contrôles en routine. Cependant, en matière de gestion des effluents et pour une prise de décision adéquate, il est nécessaire de définir un objectif de qualité au vu de l’activité oestrogenique (définie en équivalent oestradiol, EEQ). Ainsi, le centre Suisse d’écotoxicologie appliqué (Eawag-EPFL) de Lausanne propose une classification de la qualité des eaux basée sur le niveau d’oestrogénicité évaluée par le YES. Cependant la validation de ce biotest, en vue d’une normalisation ISO, est encore à l’étude. Comme pour les tests de toxicité globale, il sera difficile de corréler l’activité oestrogénique mesurée avec les analyses chimiques des substances potentiellement actives. Par ailleurs, le déploiement d’une série de tests spécifiques à une perturbation hormonales (androgénique, oestrogénique, thyroïdienne) permettrait de mieux identifier les xéno-hormones potentiellement présentes. Les tests in vitro permettent d’évaluer l’activité oestrogénique d’un échantillon. Cependant, lorsqu’il s’agit d’identifier et de quantifier précisément une xéno-hormone, les analyses chimiques sont généralement utilisées. Il existe également des méthodes biologiques permettant de détecter spécifiquement une substance. Ces méthodes sont les bioessais, les biocapteurs. Parmi les bioessais, la technique de l’ELISA est la plus utilisée. Cette technique nécessite le développement d’anticorps spécifiquement dirigés contre les molécules cibles. L’anticorps reste le biorécepteur (ou Elément de Reconnaissance Biologique dit ERB) affine le plus utilisé. Comme il est parfois difficile d’obtenir des anticorps contre les molécules de petites tailles, des solutions alternatives ont été développées. Ainsi, un des objectifs de cette thèse était de proposer un biorécepteur de nature peptidique pour détecter des myco-oestrogènes, notamment l’ochratoxine A qui est une mycotoxine difficilement immunogène. Les récepteurs peptidiques présentent de nombreux avantages par rapport aux anticorps car les peptides spécifiques peuvent être obtenus pour 128 pratiquement n'importe quelle cible. Ils sont, par ailleurs, robustes, faciles à produire et peuvent être modifiées aisément pour faciliter l'immobilisation. Par conséquent, la conception et la synthèse chimique de peptides pouvant se lier à la mycotoxine cible avec une affinité est un axe de recherche novateur. Les résultats obtenus ont permis de sélectionné un peptide contenant 12 acides aminés (NFO4) présentant la plus grande affinité pour l’ochratoxine A. Ce peptide a été utilisé pour développer un dosage immuno-enzymatique à base de peptide (test ELISA à base de peptide). La détection a été réalisée pour une gamme allant de 1,25 à 10 µg/l d’OTA. Les limites de détection (LOD) déterminées pour l’OTA, dans le PBS et le vin rouge, sont respectivement de 1,25 µg/l et 2 µg/l. Dans la continuité de cette étude, le peptide NFO4 ayant différentes conformations tridimensionnelles potentielles, il sera important d’étudier son affinité pour la cible en fonction de son immobilisation sur un support. Ainsi, un accrochage spécifique (N-terminal ou C-terminal) pourra induire des affinités différentes vis-à-vis de la cible (OTA). La nature du support utilisé, la modification de surface du support et l’immobilisation des biorécepteurs disponibles sont des étapes clés dans le développement de méthodes biologiques de détection directes de polluants. Le protocole le plus utilisé pour l’immobilisation des ERB est l’adsorption. Cependant, la technique d'adsorption repose sur des interactions électrostatiques et hydrophobes non spécifiques pour immobiliser des biorécepteurs. Selon les conditions du milieu, une désorption peut se produire en raison de la nature réversible de l'attachement non covalente. En variante, la liaison covalente de biomolécules (comme les protéines) sur des surfaces solides est de plus en plus étudiée pour augmenter la stabilité de la biomolécule, et la disponibilité des sites de reconnaissance avec le polluant cible. Donc en perspective de ce travail de recherche, la détermination des conditions d’immobilisation des peptides permettant de conserver leur activité biologique (donc leur reconnaissance spécifique) sur un support adéquat (biopolymère ou membrane de nitrocellulose) sera effectuée. L’objectif est de proposer un système de détection de petites molécules non immunogènes autres que l’OTA en utilisant un biorécepteur peptidique. 129 130 Références bibliographiques Ahel, M., Molnar, E., Ibric, S., & Giger, W. (2000). Estrogenic metabolites of alkylphenol polyethoxylates in secondarysewage effluents and rivers. Water Science & Technology, 42(78), 15-22. Alarcón, S. H., Palleschi, G., Compagnone, D., Pascale, M., Visconti, A., & Barna-Vetró, I. (2006). Monoclonal antibody based electrochemical immunosensor for the determination of ochratoxin A in wheat. Talanta, 69(4), 1031-1037. Albert, O., Desdoits-Lethimonier, C., Lesné, L., Legrand, A., Guillé, F., Bensalah, K., ... & Jégou, B. (2013). Paracetamol, aspirin and indomethacin display endocrine disrupting properties in the adult human testis in vitro. Human Reproduction, 28(7), 1890-1898. Amadasi, A., Mozzarelli, A., Meda, C., Maggi, A., & Cozzini, P. (2008). Identification of xenoestrogens in food additives by an integrated in silico and in vitro approach. Chemical research in toxicology, 22(1), 52-63. Andersen, H. R., Lundsbye, M., Wedel, H. V., Eriksson, E., & Ledin, A. (2007). Estrogenic personal care products in a greywater reuse system. Water Science & Technology, 56(12). Andreescu, S., & Marty, J. L. (2006). Twenty years research in cholinesterase biosensors : from basic research to practical applications. Biomolecular engineering, 23(1), 1-15. Antunes, M., & Da Cunha, L. (2002). Skeletal anomalies in Gobius niger(Gobiidae) from Sado estuary, Portugal. Cybium, 26(3), 179-184. Anway, M. D., Cupp, A. S., Uzumcu, M., & Skinner, M. K. (2005). Epigenetic transgenerational actions of endocrine disruptors and male fertility. Science,308(5727), 1466-1469. Arcand-Hoy, L. D., & Benson, W. H. (1998). Fish reproduction : an ecologically relevant indicator of endocrine disruption. Environmental toxicology and chemistry, 17(1), 49-57. Arijs K, Verslycke T, Vandenbergh GF, Slabbert JL, Janssen CR (2002). Estrogenic activity in South African inland waters assessed by a yeast estrogenic screen. Poster presentation at the SETAC Europe 12th Annual Meeting. 12-16 May 2002, Vienna, Austria. Aronica, S. M., Kraus, W. L., & Katzenellenbogen, B. S. (1994). Estrogen action via the cAMP signaling pathway : stimulation of adenylate cyclase and cAMP-regulated gene transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(18), 8517-8521. Arukwe, A., Kullman, S. W., Berg, K., Goksøyr, A., & Hinton, D. E. (2002). Molecular cloning of rainbow trout Oncorhynchus mykiss eggshell zona radiata protein complementary DNA : mRNA expression in 17β-estradiol-and nonylphenol-treated fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B : Biochemistry and Molecular Biology, 132(2), 315-326. Auriol, M. (2007) thèse de doctorat ; Université du Québec Institut national de la recherche scientifique Centre Eau, Terre et Environnement : Enlèvement des perturbateurs endocriniens (hormones) par oxydation enzymatique, dans les eaux usées. Axon, A., May, F. E., Gaughan, L. E., Williams, F. M., Blain, P. G., & Wright, M. C. (2012). Tartrazine and sunset yellow are xenoestrogens in a new screening assay to identify modulators of human oestrogen receptor transcriptional activity. Toxicology, 298(1), 40-51. Babkina, S. S., & Ulakhovich, N. A. (2005). Complexing of heavy metals with DNA and new bioaffinity method of their determination based on amperometric DNA-based biosensor. Analytical chemistry, 77(17), 5678-5685. Bain, D. L., Heneghan, A. F., Connaghan-Jones, K. D., & Miura, M. T. (2007). Nuclear Balaguer, P., Boussioux, A. M., Demirpence, E., & Nicolas, J. C. (2001). Reporter cell lines are useful tools for monitoring biological activity of nuclear receptor ligands. Luminescence, 16(2), 153-158. 131 Balch, G. C., Mackenzie, C. A., & Metcalfe, C. D. (2004). Alterations to gonadal development and reproductive success in japanese medaka (Oryzias latipes) exposed to 17α‐ ethinylestradiol. Environmental Toxicology and Chemistry, 23(3), 782-791. Banat, I. M., Nigam, P., Singh, D., & Marchant, R. (1996). Microbial decolorization of textiledyecontaining effluents : a review. Bioresource technology, 58(3), 217-227. Baron, S., Manin, M., Beaudoin, C., Leotoing, L., Communal, Y., Veyssiere, G., & Morel, L. (2004). Androgen receptor mediates non-genomic activation of phosphatidylinositol 3-OH kinase in androgen-sensitive epithelial cells. Journal of Biological Chemistry, 279(15), 14579-14586. Baronti, C., Curini, R., D'Ascenzo, G., Di Corcia, A., Gentili, A., & Samperi, R. (2000). Monitoring natural and synthetic estrogens at activated sludge sewage treatment plants and in a receiving river water. Environmental Science & Technology, 34(24), 5059-5066. Barzen, C., Brecht, A., & Gauglitz, G. (2002). Optical multiple-analyte immunosensor for water pollution control. Biosensors and Bioelectronics, 17(4), 289-295. Bay, K., Asklund, C., Skakkebaek, N. E., & Andersson, A. M. (2006). Testicular dysgenesis syndrome : possible role of endocrine disrupters. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism, 20(1), 77-90. Bazin, I., Gadal, A., Touraud, E., & Roig, B. (2010). Hydroxy benzoate preservatives (parabens) in the environment : data for environmental toxicity assessment. In Xenobiotics in the urban water cycle (pp. 245-257). Springer Netherlands. Beard, A. P., & Rawlings, N. C. (1999). Thyroid function and effects on reproduction in ewes exposed to the organochlorine pesticides lindane or pentachlorophenol (PCP) from conception. Journal of Toxicology and Environmental Health Part A, 58(8), 509-530. Bechi, N., Ietta, F., Romagnoli, R., Focardi, S., Corsi, I., Buffi, C., & Paulesu, L. (2006). Estrogen-like response to p-nonylphenol in human first trimester placenta and BeWo choriocarcinoma cells. Toxicological sciences, 93(1), 75-81. Benijts, T., Lambert, W., & De Leenheer, A. (2004). Analysis of multiple endocrine disruptors in environmental waters via wide-spectrum solid-phase extraction and dual-polarity ionization LC-ion trap-MS/MS. Analytical chemistry, 76(3), 704-711. Bianco-Miotto, T., Trotta, A. P., Need, E. F., Lee, A., Ochnik, A. M., Giorgio, L., ... & Buchanan, G. (2014). Molecular and structural basis of androgen receptor responses to dihydrotestosterone, medroxyprogesterone acetate and δ4-tibolone. Molecular and cellular endocrinology, 382(2), 899-908.. Bicchi, C., Schilirò, T., Pignata, C., Fea, E., Cordero, C., Canale, F., & Gilli, G. (2009). Analysis of environmental endocrine disrupting chemicals using the E-screen method and stir bar sorptive extraction in wastewater treatment plant effluents. Science of the total environment, 407(6), 1842-1851. Bier, F. F., Jockers, R., & Schmid, R. D. (1994). Integrated optical immunosensor for s-triazine determination : regeneration, calibration and limitations. Analyst, 119(3), 437-441. Biró, K., Barna-Vetró, I., Pécsi, T., Szabó, E., Winkler, G., Fink-Gremmels, J., & Solti, L. (2003). Evaluation of spermatological parameters in ochratoxin A—Challenged boars. Theriogenology, 60(2), 199-207. Bistan, M., Podgorelec, M., Marinšek Logar, R., & Tišler, T. (2012). Yeast Estrogen Screen Assay as a Tool for Detecting Estrogenic Activity in Water Bodies. Food Technology and Biotechnology, 50(4), 427-433. Blaise, C., Gagné, F., Salazar, M., Salazar, S., Trottier, S., & Hansen, P. (2003). Experimentallyinduced feminisation of freshwater mussels after long-term exposure to a municipal effluent. Fresenius Environmental Bulletin, 12(8), 865-870. 132 Blum L. & Coulet, P. R. (1991) Biosensor Principles and Applications , Eds.Marcel Dekker, New York, 1991 Bonefeld-Jorgensen, E. C., Long, M., Hofmeister, M. V., & Vinggaard, A. M. (2007). Endocrinedisrupting potential of bisphenol A, bisphenol A dimethacrylate, 4-n-nonylphenol, and 4-noctylphenol in vitro : new data and a brief review. Environmental Health Perspectives, 115, 69. Boonyaratanakornkit, V., Scott, M. P., Ribon, V., Sherman, L., Anderson, S. M., Maller, J. L., ... & Edwards, D. P. (2001). Progesterone receptor contains a proline-rich motif that directly interacts with SH3 domains and activates c-Src family tyrosine kinases. Molecular cell, 8(2), 269-280. Brausch, J. M., & Rand, G. M. (2011). A review of personal care products in the aquatic environment : environmental concentrations and toxicity. Chemosphere,82(11), 1518-1532. Brian, J. V., Harris, C. A., Scholze, M., Backhaus, T., Booy, P., Lamoree, M., ... & Sumpter, J. P. (2005). Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals. Environmental health perspectives, 113(6), 721. Bucheli, T. D., Wettstein, F. E., Hartmann, N., Erbs, M., Vogelgsang, S., Forrer, H. R., & Schwarzenbach, R. P. (2008). Fusarium mycotoxins : overlooked aquatic micropollutants?. Journal of agricultural and food chemistry, 56(3), 1029-1034. Bucur, B., Fournier, D., Danet, A., & Marty, J. L. (2006). Biosensors based on highly sensitive acetylcholinesterases for enhanced carbamate insecticides detection. Analytica Chimica Acta, 562(1), 115-121. Bulayeva, N. N., & Watson, C. S. (2004). Xenoestrogen-induced ERK-1 and ERK-2 activation via multiple membrane-initiated signaling pathways.Environmental Health Perspectives, 112(15), 1481. Bulukin, E., Meucci, V., Minunni, M., Pretti, C., Intorre, L., Soldani, G., & Mascini, M. (2007). An optical immunosensor for rapid vitellogenin detection in plasma from carp Cyprinus carpio. Talanta, 72(2), 785-790. Burton, J. L., & Wells, M. (2002). The effect of phytoestrogens on the female genital tract. Journal of clinical pathology, 55(6), 401-407. Butler, D., & Guilbault, G. G. (2006). Disposable amperometric immunosensor for the detection of 17-β estradiol using screen-printed electrodes. Sensors and Actuators B : Chemical, 113(2), 692-699. Cachot J., Winn R., Norris M., Budzinski H., Menach K.L., Law M., Lacroix S., (2005). Thème 3 : Evaluation des effets biologiques résultant d’une exposition chronique à des mélanges d’hydrocarbures aromatiques polycycliques sur un poisson modèle, le medaka japonais, Oryzias latipes. Phase I. contamination par voie directe des embryons de medaka. Seine-Aval 3, p1-19. Cachot, J., Budzinski, H., Le Ménach, K., & Augagneur, S. (2005). Identification of sedimentassociated compounds involved in the genotoxicity of the upper part of the Seine estuary. In 15th Society of Environmental Toxicology and Chemistry (SETAC) Europe Annual Meeting. Cachot, J., Geffard, O., Augagneur, S., Lacroix, S., Le Menach, K., Peluhet, L., ... & Budzinski, H. (2006). Evidence of genotoxicity related to high PAH content of sediments in the upper part of the Seine estuary (Normandy, France). Aquatic toxicology, 79(3), 257-267. Cachot, J., Law, M., Pottier, D., Peluhet, L., Norris, M., Budzinski, H., & Winn, R. (2007). Characterization of toxic effects of sediment-associated organic pollutants using the λ transgenic medaka. Environmental science & technology,41(22), 7830-7836. 133 Canosa, P., Rodríguez, I., Rubí, E., Bollaín, M. H., & Cela, R. (2006). Optimisation of a solid-phase microextraction method for the determination of parabens in water samples at the low ng per litre level. Journal of Chromatography A, 1124(1), 3-10. Cargouet M, Mouatassim A, Karolak S, Perdiz D, Levi T, 2001. Etude de la pollution par les micropolluants a effets modulateurs endocriniens dans les eaux de la région parisienne. Rapport Agence de l’Eau. Cargouët, M., Perdiz, D., & Levi, Y. (2007). Evaluation of the estrogenic potential of river and treated waters in the Paris area (France) using in vivo and in vitro assays. Ecotoxicology and environmental safety, 67(1), 149-156. Casanova-Nakayama, A., Wenger, M., Burki, R., Eppler, E., Krasnov, A., & Segner, H. (2011). Endocrine disrupting compounds : Can they target the immune system of fish?. Marine pollution bulletin, 63(5), 412-416. Castillo, M., Martínez, E., Ginebreda, A., Tirapu, L., & Barceló, D. (2000). Determination of nonionic surfactants and polar degradation products in influent and effluent water samples and sludges of sewage treatment plants by a generic solid-phase extraction protocol. Analyst, 125(10), 1733-1739. Castillo, M., & Barceló, D. (2001). Characterisation of organic pollutants in textile wastewaters and landfill leachate by using toxicity-based fractionation methods followed by liquid and gas chromatography coupled to mass spectrometric detection. Analytica Chimica Acta, 426(2), 253-264. Céspedes, R., Lacorte, S., Ginebreda, A., & Barceló, D. (2008). Occurrence and fate of alkylphenols and alkylphenol ethoxylates in sewage treatment plants and impact on receiving waters along the Ter River (Catalonia, NE Spain). Environmental Pollution, 153(2), 384-392. Cevasco, A., Urbatzka, R., Bottero, S., Massari, A., Pedemonte, F., Kloas, W., & Mandich, A. (2008). Endocrine disrupting chemicals (EDC) with (anti) estrogenic and (anti) androgenic modes of action affecting reproductive biology of Xenopus laevis : II. Effects on gonad histomorphology. Comparative Biochemistry and Physiology Part C : Toxicology & Pharmacology, 147(2), 241-251. Cheng, S. H., Wai, A. W. K., So, C. H., & Wu, R. S. S. (2000). Cellular and molecular basis of cadmium‐induced deformities in zebrafish embryos. Environmental Toxicology and Chemistry, 19(12), 3024-3031. Cheshenko, K., Pakdel, F., Segner, H., Kah, O., & Eggen, R. I. (2008). Interference of endocrine disrupting chemicals with aromatase CYP19 expression or activity, and consequences for reproduction of teleost fish. General and comparative endocrinology, 155(1), 31-62. Chiu, M. L., Tseng, T. T. C., & Monbouquette, H. G. (2011). A convenient homogeneous enzyme immunoassay for estradiol detection. Biotechnology and Applied Biochemistry, 58(1), 75-82. Chou, P. H., Matsui, S., Misaki, K., & Matsuda, T. (2007). Isolation and identification of xenobiotic aryl hydrocarbon receptor ligands in dyeing wastewater. Environmental science & technology, 41(2), 652-657. Christiansen, S., Scholze, M., Dalgaard, M., Vinggaard, A. M., Axelstad, M., Kortenkamp, A., & Hass, U. (2009). Synergistic disruption of external male sex organ development by a mixture of four antiandrogens. Environmental Health Perspectives, 117(12), 1839. Cizmas, L., McDonald, T. J., Phillips, T. D., Gillespie, A. M., Lingenfelter, R. A., Kubena, L. F., ... & Donnelly, K. C. (2004). Toxicity characterization of complex mixtures using biological and chemical analysis in preparation for assessment of mixture similarity. Environmental science & technology, 38(19), 5127-5133. 134 Cocco, P. (2002). On the rumors about the silent spring : review of the scientific evidence linking occupational and environmental pesticide exposure to endocrine disruption health effects. Cadernos de Saúde pública, 18(2), 379-402. Colborn, T., vom Saal, F. S., & Soto, A. M. (1993). Developmental effects of endocrine-disrupting chemicals in wildlife and humans. Environmental health perspectives, 101(5), 378. Cooper, P. (1995). Colour in dyehouse effluent. Society of dyers and colourists. Cooper, R. L., Stoker, T. E., Tyrey, L., Goldman, J. M., & McElroy, W. K. (2000). Atrazine disrupts the hypothalamic control of pituitary-ovarian function.Toxicological Sciences, 53(2), 297-307. Cosmetic Ingredient Review Expert Panel. (2007). Final report on the safety assessment of disperse Blue 7. International journal of toxicology, 26, 65. Coumoul, X., & Barouki, R. (2002). Génotoxicité des métabolites des œstrogènes et cancers. MS. Médecine sciences, 18(1), 86-90. Crofton, K. M., Craft, E. S., Hedge, J. M., Gennings, C., Simmons, J. E., Carchman, R. A., ... & DeVito, M. J. (2005). Thyroid-hormone–disrupting chemicals : evidence for dose-dependent additivity or synergism. Environmental Health Perspectives, 113(11), 1549. Dagnino, S., Gomez, E., Picot, B., Cavaillès, V., Casellas, C., Balaguer, P., & Fenet, H. (2010). Estrogenic and AhR activities in dissolved phase and suspended solids from wastewater treatment plants. Science of the total environment, 408(12), 2608-2615. Darain, F., Park, D. S., Park, J. S., & Shim, Y. B. (2004). Development of an immunosensor for the detection of vitellogenin using impedance spectroscopy. Biosensors and Bioelectronics, 19(10), 1245-1252. Darbre, P. D. (2006). Metalloestrogens : an emerging class of inorganic xenoestrogens with potential to add to the oestrogenic burden of the human breast. Journal of Applied Toxicology, 26(3), 191-197. Datta, P., & Lundin-Schiller, S. (2008). Estrogenicity of the synthetic food colorants tartrazine, erythrosin b, and sudan i in an estrogen-responsive human breast cancer cell line. Journal of the tennessee academy of science, 83. Dawson, C. E. (1964). A bibliography of anomalies of fishes. Gulf Coast Research Laboratory. Dejous, C., (2005) thèse de doctorat Contribution à l'étude de microcapteurs à ondes acoustiques visant la biodétection rapide sur site. Université Bordeaux 1. p. 126. Desmet, C., Blum, L. J., & Marquette, C. A. (2013). Multiplex microarray ELISA versus classical ELISA, a comparison study of pollutant sensing for environmental analysis. Environmental Science: Processes & Impacts, 15(10), 1876-1882. Dempsey, E., Diamond, D., & Collier, A. (2004). Development of a biosensor for endocrine disrupting compounds based on tyrosinase entrapped within a poly (thionine) film. Biosensors and Bioelectronics, 20(2), 367-377. Dhull, V., Gahlaut, A., Dilbaghi, N., & Hooda, V. (2013). Acetylcholinesterase Biosensors for Electrochemical Detection of Organophosphorus Compounds : A Review. Biochemistry research international, 2013. Diry, M., Tomkiewicz, C., Koehle, C., Coumoul, X., Bock, K. W., Barouki, R., & Transy, C. (2006). Activation of the dioxin/aryl hydrocarbon receptor (AhR) modulates cell plasticity through a JNK-dependent mechanism. Oncogene,25(40), 5570-5574. Dostálek, J., Přibyl, J., Homola, J., & Skládal, P. (2007). Multichannel SPR biosensor for detection of endocrine-disrupting compounds. Analytical and bioanalytical chemistry, 389(6), 1841-1847. Drummond, A. E. (2006). The role of steroids in follicular growth. Reprod Biol Endocrinol, 4(16), 450. 135 Dulčić, J., Pallaoro, A., Cetinić, P., Kraljević, M., Soldo, A., & Jardas, I. (2003). Age, growth and mortality of picarel, Spicara smaris L. (Pisces : Centracanthidae), from the eastern Adriatic (Croatian coast). Journal of Applied Ichthyology, 19(1), 10-14. Dusza, L., Ciereszko, R., Skarzyński, D. J., Nogowski, L., Opałka, M., Kamińska, B., ... & Szkudelska, K. (2005). Mechanism of phytoestrogens action in reproductive processes of mammals and birds. Reproductive biology,6, 151-174. Ebrahimi, M. (2005). Vitellogenin assay by enzyme-linked immunosorbant assay as a biomarker of endocrine disruptor chemicals pollution. Indian Journal of Occupational and Environmental Medicine, 9(2), 65. Ebrahimi, M. (2007). Vitellogenin assay by enzyme-linked immunosorbant assay as a biomarker of endocrine disruptor chemicals pollution. Pakistan Journal of Biological Sciences, 10(18). EDSTAC, 1998. Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee Final Report. Federal Register Notice, vol. 63(248), pp. 71541–1568. URL:ttp://www.epa.gov/scipoly/oscpendo/history/finalrpt.htm〉. Eidem, J. K., Kleivdal, H., Kroll, K., Denslow, N., van Aerle, R., Tyler, C., ... & Goksøyr, A. (2006). Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow Pimephales promelas vitellogenin. Aquatic toxicology, 78(2), 202-206. Elbekai, R. H., & El-Kadi, A. O. (2004). Modulation of aryl hydrocarbon receptor-regulated gene expression by arsenite, cadmium, and chromium.Toxicology, 202(3), 249-269.. Elbekai, R. H., & El-Kadi, A. O. (2007). Transcriptional activation and posttranscriptional modification of Cyp1a1 by arsenite, cadmium, and chromium. Toxicology letters, 172(3), 106119. Elmeros, M., Hammershoj, M., Madsen, A., & Sogaard, B. (2006). Recovery of the otter Lutra lutra in Denmark monitored by field surveys and collection of carcasses. Hystrix, the Italian Journal of Mammalogy, 17(1). Emmons, R. B., Duncan, D., Estes, P. A., Kiefel, P., Mosher, J. T., Sonnenfeld, M., ... & Crews, S. T. (1999). The spineless-aristapedia and tango bHLH-PAS proteins interact to control antennal and tarsal development in Drosophila. Development, 126(17), 3937-3945. Eriko Mikamo, E., Harada, S., Nishikawa, J. I., & Nishihara, T. (2003). Endocrine disruptors induce cytochrome P450 by affecting transcriptional regulation via pregnane X receptor. Toxicology and applied pharmacology, 193(1), 66-72.. Eriksson, E., Andersen, H. R., Madsen, T. S., & Ledin, A. (2009). Greywater pollution variability and loadings. Ecological Engineering, 35(5), 661-669. Etgen, A. M., & Pfaff, D. W. (Eds.). (2010). Molecular mechanisms of hormone actions on behavior. Academic press. Etique, N., Flament, S., Lecomte, J., & Grillier-Vuissoz, I. (2007). Ethanol-induced ligandindependent activation of ER alpha mediated by cyclic AMP/PKA signaling pathway : An in vitro study on MCF-7 breast cancer cells. International journal of oncology, 31(6), 1509. European Commission. European workshop on the impact of endocrine disrupters on human health and wildlife : report of the proceedings. Brussels : European Commission; 1997. (EUR 17549) European Commission, 2005. Commission Regulation No. 123/2005 of 26 January 2005 amending Regulation 466/2001 as regards ochratoxin A. Official Journal of the European Union L25, 3 Evtugyn, G. A., Eremin, S. A., Shaljamova, R. P., Ismagilova, A. R., & Budnikov, H. C. (2006). Amperometric immunosensor for nonylphenol determination based on peroxidase indicating reaction. Biosensors and Bioelectronics, 22(1), 56-62. Facemire, C. F., Gross, T. S., & Guillette Jr, L. J. (1995). Reproductive impairment in the Florida panther : nature or nurture? Environmental Health Perspectives, 103(Suppl 4), 79. 136 Fähnrich, K. A., Pravda, M., & Guilbault, G. G. (2003). Disposable amperometric immunosensor for the detection of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) using screen-printed electrodes. Biosensors and Bioelectronics, 18(1), 73-82. Falkenstein, E., Tillmann, H. C., Christ, M., Feuring, M., & Wehling, M. (2000). Multiple actions of steroid hormones-a focus on rapid, nongenomic effects. Pharmacological reviews, 52(4), 513556. Farré, M., Brix, R., & Barceló, D. (2005). Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 24(6), 532-545. Fielden, M. R., Chen, I., Chittim, B., Safe, S. H., & Zacharewski, T. R. (1997). Examination of the estrogenicity of 2, 4, 6, 2', 6'-pentachlorobiphenyl (PCB 104), its hydroxylated metabolite 2, 4, 6, 2', 6'-pentachloro-4-biphenylol (HO-PCB 104), and a further chlorinated derivative, 2, 4, 6, 2', 4', 6'-hexachlorobiphenyl (PCB 155). Environmental health perspectives, 105(11), 1238. Fini, J. B., Le Mével, S., Turque, N., Palmier, K., Zalko, D., Cravedi, J. P., & Demeneix, B. A. (2007). An in vivo multiwell-based fluorescent screen for monitoring vertebrate thyroid hormone disruption. Environmental science & technology, 41(16), 5908-5914. Flint, A. P. F., Sheldrick, E. L., & Fisher, P. A. (2002). Ligand-independent activation of steroid receptors. Domestic animal endocrinology, 23(1), 13-24. Folmar LC, Hemmer MJ, Denslow ND, Kroll K, Chen J, Cheek A, Richman H, Meredith H, Grau EG (2002). A comparison of the estrogenic potencies of estradiol, ethynylestradiol, diethylstilbestrol, nonylphenol and methoxychlor in vivo and in vitro. Aquatic Toxicology 60, 101-110. Fossi, M. C., Marsili, L., Casini, S., & Bucalossi, D. (2006). Development of new-tools to investigate toxicological hazard due to endocrine disruptor organochlorines and emerging contaminants in Mediterranean cetaceans. Marine environmental research, 62, S200-S204. Fossi, M. C., Casini, S., Maltese, S., Panti, C., Spinsanti, G., & Marsili, L. (2013). An “ex vivo” model to evaluate toxicological responses to mixtures of contaminants in cetaceans : Integumentum biopsy slices. Environmental toxicology. Frizzell, C., Ndossi, D., Kalayou, S., Eriksen, G. S., Verhaegen, S., Sørlie, M., ... & Connolly, L. (2013a). An in vitro investigation of endocrine disrupting effects of the mycotoxin alternariol. Toxicology and applied pharmacology, 271(1), 64-71. Frizzell, C., Verhaegen, S., Ropstad, E., Elliott, C. T., & Connolly, L. (2013b). Endocrine disrupting effects of ochratoxin A at the level of nuclear receptor activation and steroidogenesis. Toxicology letters, 217(3), 243-250. Gabriel, F. L., Routledge, E. J., Heidlberger, A., Rentsch, D., Guenther, K., Giger, W., ... & Kohler, H. P. E. (2008). Isomer-specific degradation and endocrine disrupting activity of nonylphenols. Environmental science & technology, 42(17), 6399-6408. Gagné, F., Blaise, C., Salazar, M., Salazar, S., & Hansen, P. D. (2001). Evaluation of estrogenic effects of municipal effluents to the freshwater mussel Elliptio complanata . Comparative Biochemistry and Physiology Part C : Toxicology & Pharmacology, 128(2), 213-225. Gagnon, M. M., & Rawson, C. A. (2009). Diuron increases spinal deformity in early-life-stage pink snapper Pagrus auratus . Marine pollution bulletin,58(7), 1083-1085. Ganesana, M., Istarnboulie, G., Marty, J. L., Noguer, T., & Andreescu, S. (2011). Site-specific immobilization of a (His) 6-tagged acetylcholinesterase on nickel nanoparticles for highly sensitive toxicity biosensors. Biosensors and Bioelectronics, 30(1), 43-48. García‐Reyero, N., Grau, E., Castillo, M., Alda, D., López, M. J., Barceló, D., & Piña, B. (2001). Monitoring of endocrine disruptors in surface waters by the yeast recombinant assay. Environmental Toxicology and Chemistry, 20(6), 1152-1158. 137 Gascon J., Oubirra A. et Barcelo D. (1997). Detection of endocrinedisrupting pesticides by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) : application to atrazine. Trends Anal. Chem., 16 : 554562. Ge, R. S., Chen, G. R., Dong, Q., Akingbemi, B., Sottas, C. M., Santos, M., ... & Hardy, M. P. (2007). Biphasic effects of postnatal exposure to diethylhexylphthalate on the timing of puberty in male rats. Journal of andrology, 28(4), 513-520. Georgescu, B., Georgescu, C., Dărăban, S., Bouaru, A., & Paşcalău, S. (2011). Heavy metals acting as endocrine disrupters. Scientific Papers Animal Science and Biotechnologies, 44(2), 89-93. Gharbi, A., Trillon, O., Betbeder, A. M., Counord, J., Gauret, M. F., Pfohl-Leszkowicz, A., ... & Creppy, E. E. (1993). Some effects of ochratoxin A, a mycotoxin contaminating feeds and food, on rat testis. Toxicology, 83(1), 9-18. Goda Y., Kobayashi A., Fukuda K., Fujimoto S., Ike M. et Fujita M. (2000) Development of the ELISAs for detection of hormonedisrupting chemicals. Water Sci. Tehnol., 42(7-8) : 81-88. Gomez, E., Pillon, A., Fenet, H., Rosain, D., Duchesne, M. J., Nicolas, J. C., ... & Casellas, C. (2005). Estrogenic activity of cosmetic components in reporter cell lines : parabens, UV screens, and musks. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, 68(4), 239-251. González‐Mariño, I., Quintana, J. B., Rodríguez, I., & Cela, R. (2009). Simultaneous determination of parabens, triclosan and triclocarban in water by liquid chromatography/electrospray ionisation tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 23(12), 1756-1766. Gordon, J. D., Chu, A. C., Chu, M. D., Denison, M. S., & Clark, G. C. (2004). Detection of Estrogen Receptor Endocrine Disruptor Potency of Commonly Used Oranochlorine Pesticides Using The LUMI-CELL Bioassay. Organohalogen Compounds, 66, 169-174. Green, T., Lee, R., Farrar, D., & Hill, J. (2003). Assessing the health risks following environmental exposure to hexachlorobutadiene. Toxicology letters, 138(1), 63-73. Gromadzka, K., Waśkiewicz, A., Goliński, P., & Świetlik, J. (2009). Occurrence of estrogenic mycotoxin–zearalenone in aqueous environmental samples with various NOM content. Water research, 43(4), 1051-1059. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. Å., & Laudet, V. (2004). Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery,3(11), 950-964. Grove, R. I., & Korach, K. S. (1987). Estrogen stimulation of phosphatidylinositol metabolism in mouse uterine tissue. Endocrinology, 121(3), 1083-1088. Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., & Zhou, J. L. (2011). Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade. Chemosphere, 84(10), 15121520. Guenther, K., Heinke, V., Thiele, B., Kleist, E., Prast, H., & Raecker, T. (2002). Endocrine disrupting nonylphenols are ubiquitous in food. Environmental science & technology, 36(8), 1676-1680. Gutendorf, B., & Westendorf, J. (2001). Comparison of an array of in vitro assays for the assessment of the estrogenic potential of natural and synthetic estrogens, phytoestrogens and xenoestrogens. Toxicology, 166(1), 79-89. Han, D. H., Denison, M. S., Tachibana, H., & Yamada, K. (2002). Relationship between estrogen receptor-binding and estrogenic activities of environmental estrogens and suppression by flavonoids. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 66(7), 1479-1487. Handelsman, D. J., Newman, J. D., Jimenez, M., McLachlan, R., Sartorius, G., & Jones, G. R. (2013). Performance of Direct Estradiol Immunoassays with Human Male Serum Samples. Clinical chemistry, clinchem-2013. Hankinson, O. (1995). The aryl hydrocarbon receptor complex. Annual review of pharmacology and toxicology, 35(1), 307-340. 138 Harris, R. D., Luff, B. J., Wilkinson, J. S., Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G., & Abuknesha, R. A. (1999). Integrated optical surface plasmon resonance immunoprobe for simazine detection. Biosensors and Bioelectronics, 14(4), 377-386. Hartmann, N., Erbs, M., Wettstein, F. E., Schwarzenbach, R. P., & Bucheli, T. D. (2007). Quantification of estrogenic mycotoxins at the ng/L level in aqueous environmental samples using deuterated internal standards. Journal of chromatography A, 1138(1), 132-140. Hartmann, N., Erbs, M., Forrer, H. R., Vogelgsang, S., Wettstein, F. E., Schwarzenbach, R. P., & Bucheli, T. D. (2008). Occurrence of zearalenone on Fusarium graminearum infected wheat and maize fields in crop organs, soil, and drainage water. Environmental science & technology, 42(15), 5455-5460. Hashimoto, S., Bessho, H., Hara, A., Nakamura, M., Iguchi, T., & Fujita, K. (2000). Elevated serum vitellogenin levels and gonadal abnormalities in wild male flounder Pleuronectes yokohamae from Tokyo Bay, Japan. Marine Environmental Research, 49(1), 37-53. Hass, U., Scholze, M., Christiansen, S., Dalgaard, M., Vinggaard, A. M., Axelstad, M., ... & Kortenkamp, A. (2007). Combined exposure to anti-androgens exacerbates disruption of sexual differentiation in the rat. Environmental health perspectives, 115, 122. Hassan, A. A., Rashid, M. A., & Koratum, K. M. (2010). Effect of aflatoxin B1, zearalenone and ochratoxin A on some hormones related to fertility in male rats. Life Science Journal, 7(3), 6472. Hawkins, M. B., Thornton, J. W., Crews, D., Skipper, J. K., Dotte, A., & Thomas, P. (2000). Identification of a third distinct estrogen receptor and reclassification of estrogen receptors in teleosts. Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(20), 10751-10756. Hayat, A., Sassolas, A., Marty, J. L., & Radi, A. E. (2013). Highly sensitive ochratoxin A impedimetric aptasensor based on the immobilization of azido-aptamer onto electrografted binary film via click chemistry. Talanta, 103, 14-19. Hayes, T., Haston, K., Tsui, M., Hoang, A., Haeffele, C., & Vonk, A. (2003). Atrazine-induced hermaphroditism at 0.1 ppb in American leopard frogs (Rana pipiens) : laboratory and field evidence. Environmental Health Perspectives,111(4), 568. Hegnerová, K., Piliarik, M., Šteinbachová, M., Flegelová, Z., Černohorská, H., & Homola, J. (2010). Detection of bisphenol A using a novel surface plasmon resonance biosensor. Analytical and bioanalytical chemistry, 398(5), 1963-1966. Hilakivi-Clarke, L., & de Assis, S. (2006). Fetal origins of breast cancer. Trends in Endocrinology & Metabolism, 17(9), 340-348. Hisamoto, K., Ohmichi, M., Kanda, Y., Adachi, K., Nishio, Y., Hayakawa, J., ... & Murata, Y. (2001). Induction of endothelial nitric-oxide synthase phosphorylation by the raloxifene analog LY117018 is differentially mediated by Akt and extracellular signal-regulated protein kinase in vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry, 276(50), 47642-47649. Hoa, N. T. (2011). Monitoring of Endocrine Disruptors in Surface Waters of the Mekong Delta in Vietnam. Hoerger, C. C., Schenzel, J., Strobel, B. W., & Bucheli, T. D. (2009). Analysis of selected phytotoxins and mycotoxins in environmental samples. Analytical and bioanalytical chemistry, 395(5), 1261-1289. Hopert, A. C., Beyer, A., Frank, K., Strunck, E., Wünsche, W., & Vollmer, G. (1998). Characterization of estrogenicity of phytoestrogens in an endometrial-derived experimental model. Environmental health perspectives, 106(9), 581. Hu, L. S., Fong, C. C., Zou, L., Wong, W. L., Wong, K. Y., Wu, R. S., & Yang, M. (2014). Label-free detection of endocrine disrupting chemicals by integrating a competitive binding assay with a piezoelectric ceramic resonator. Biosensors and Bioelectronics, 53, 406-413. 139 Hua, P., Hole, J., Wilkinson, J., Proll, G., Tschmelak, J., Gauglitz, G., ... & Kraemmer, P. (2005). Integrated optical fluorescence multisensor for water pollution. Optics Express, 13(4), 11241130. Huggett, D. B., Foran, C. M., Brooks, B. W., Weston, J., Peterson, B., Marsh, K. E., ... & Schlenk, D. (2003). Comparison of in vitro and in vivo bioassays for estrogenicity in effluent from North American municipal wastewater facilities. Toxicological Sciences, 72(1), 77-83. Hutton, D. G., Meidl, J. A., & O'brien, G. J. (1996). The PACT System for Wastewater Treatment (p. 215). John Wiley and Sons : New York. Iavicoli, I., Fontana, L., & Bergamaschi, A. (2009). The effects of metals as endocrine disruptors. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B, 12(3), 206-223. Ignar-Trowbridge, D. M., Hughes, A. R., Putney JR, J. W., MClachlan, J. A., & Korach, K. S. (1991). Diethylstilbestrol stimulates persistent phosphatidylinositol lipid turnover by an estrogen receptor-mediated mechanism in immature mouse uterus. Endocrinology, 129(5), 2423-2430. Ivanov, A. N., Evtugyn, G. A., Gyurcsanyi, R. E., Toth, K., & Budnikov, H. C. (2000). Comparative investigation of electrochemical cholinesterase biosensors for pesticide determination. Analytica Chimica Acta, 404(1), 55-65. Jagla, M., Fève, M., Kessler, P., Lapouge, G., Erdmann, E., Serra, S., ... & Céraline, J. (2007). A splicing variant of the androgen receptor detected in a metastatic prostate cancer exhibits exclusively cytoplasmic actions. Endocrinology, 148(9), 4334-4343. Jagnytsch, O., Opitz, R., Lutz, I., & Kloas, W. (2006). Effects of tetrabromobisphenol A on larval development and thyroid hormone-regulated biomarkers of the amphibian Xenopus laevis . Environmental research, 101(3), 340-348. Jefferson, W. N., Padilla-Banks, E., & Newbold, R. R. (2007). Disruption of the female reproductive system by the phytoestrogen genistein. Reproductive Toxicology, 23(3), 308-316. Jensen, E. V., Suzuki, T., Kawashima, T., Stumpf, W. E., Jungblut, P. W., & DeSombre, E. R. (1968). A two-step mechanism for the interaction of estradiol with rat uterus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 59(2), 632. Jensen, S., Jansson, B., & Olsson, M. (1979). Number and identity of anthropogenic substances known to be present in Baltic seals and their possible effects on reproduction. Annals of the New York Academy of Sciences, 320(1), 436-448. Jeuken, A., Keser, B. J., Khan, E., Brouwer, A., Koeman, J., & Denison, M. S. (2003). Activation of the Ah receptor by extracts of dietary herbal supplements, vegetables, and fruits. Journal of agricultural and food chemistry, 51(18), 5478-5487. Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., & Sumpter, J. P. (1998). Widespread sexual disruption in wild fish. Environmental science & technology,32(17), 2498-2506. Jobling, S., Beresford, N., Nolan, M., Rodgers-Gray, T., Brighty, G. C., Sumpter, J. P., & Tyler, C. R. (2002a). Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biology of reproduction, 66(2), 272-281. Jobling, S., Coey, S., Whitmore, J. G., Kime, D. E., Van Look, K. J. W., McAllister, B. G., ... & Sumpter, J. P. (2002b). Wild intersex roach (Rutilus rutilus) have reduced fertility. Biology of reproduction, 67(2), 515-524. Jobling, S., Casey, D., Rodgers-Gray, T., Oehlmann, J., Schulte-Oehlmann, U., Pawlowski, S., ... & Tyler, C. R. (2003). Comparative responses of molluscs and fish to environmental estrogens and an estrogenic effluent. Aquatic Toxicology, 65(2), 205-220. Johnson, A. C., Belfroid, A., & Di Corcia, A. (2000). Estimating steroid oestrogen inputs into activated sludge treatment works and observations on their removal from the effluent. Science of the Total Environment, 256(2), 163-173. 140 Johnson, A. C., Aerni, H. R., Gerritsen, A., Gibert, M., Giger, W., Hylland, K., ... & Wettstein, F. E. (2005). Comparing steroid estrogen, and nonylphenol content across a range of European sewage plants with different treatment and management practices. Water research, 39(1), 4758. Jonkers, N., Kohler, H. P. E., Dammshäuser, A., & Giger, W. (2009). Mass flows of endocrine disruptors in the Glatt River during varying weather conditions. Environmental pollution, 157(3), 714-723. Jonkers, N., Sousa, A., Galante-Oliveira, S., Barroso, C. M., Kohler, H. P. E., & Giger, W. (2010). Occurrence and sources of selected phenolic endocrine disruptors in Ria de Aveiro, Portugal. Environmental Science and Pollution Research, 17(4), 834-843. Kallen, J., Schlaeppi, J. M., Bitsch, F., Filipuzzi, I., Schilb, A., Riou, V., ... & Fournier, B. (2004). Evidence for ligand-independent transcriptional activation of the human estrogen-related receptor α (ERRα) crystal structure of ERRα ligand binding domain in complex with peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1α. Journal of Biological Chemistry, 279(47), 49330-49337. Kang, H. G., Jeong, S. H., Cho, J. H., Kim, D. G., Park, J. M., & Cho, M. H. (2004). Chlropyrifosmethyl shows anti-androgenic activity without estrogenic activity in rats. Toxicology, 199(2), 219-230. Kasprzyk-Hordern, B., Dinsdale, R. M., & Guwy, A. J. (2008). The effect of signal suppression and mobile phase composition on the simultaneous analysis of multiple classes of acidic/neutral pharmaceuticals and personal care products in surface water by solid-phase extraction and ultra performance liquid chromatography–negative electrospray tandem mass spectrometry. Talanta, 74(5), 1299-1312. Kasprzyk-Hordern, B., Dinsdale, R. M., & Guwy, A. J. (2009). The removal of pharmaceuticals, personal care products, endocrine disruptors and illicit drugs during wastewater treatment and its impact on the quality of receiving waters. Water research, 43(2), 363-380. Kavlock, R. J., Daston, G. P., DeRosa, C., Fenner-Crisp, P., Gray, L. E., Kaattari, S., ... & Tilson, H. A. (1996). Research needs for the risk assessment of health and environmental effects of endocrine disruptors : a report of the US EPA-sponsored workshop. Environmental health perspectives, 104(Suppl 4), 715. Kelce, W. R., Stone, C. R., Laws, S. C., Gray, L. E., Kemppainen, J. A., & Wilson, E. M. (1995). Persistent DDT metabolite p, p'DDE is a potent androgen receptor antagonist. Nature, 375:581-585. Kelly, C. (2000). Analysis of steroids in environmental water samples using solid-phase extraction and ion-trap gas chromatography–mass spectrometry and gas chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of chromatography A, 872(1), 309-314. Kessabi, K., Annabi, A., Navarro, A., Casado, M., Hwas, Z., Saïd, K., ... & Piña, B. (2012). Structural and molecular analysis of pollution-linked deformities in a natural Aphanius fasciatus (Valenciennes, 1821) population from the Tunisian coast. Journal of Environmental Monitoring, 14(8), 2254-2260. Khanal, S. K., Xie, B., Thompson, M. L., Sung, S., Ong, S. K., & Van Leeuwen, J. (2006). Fate, transport, and biodegradation of natural estrogens in the environment and engineered systems. Environmental science & technology,40(21), 6537-6546. Kim, G. Y., Shim, J., Kang, M. S., & Moon, S. H. (2008a). Optimized coverage of gold nanoparticles at tyrosinase electrode for measurement of a pesticide in various water samples. Journal of hazardous materials, 156(1), 141-147. 141 Kim, N., Kim, D. K., Cho, Y. J., Moon, D. K., & Kim, W. Y. (2008b). Carp vitellogenin detection by an optical waveguide lightmode spectroscopy biosensor. Biosensors and Bioelectronics, 24(3), 391-396. Kirk LA, Tyler CR, Lye C, Sumpter JP (2002). Changes in estrogenic and androgenic activities at different stages of treatment in wastewater treatment works. Environmental Toxicology and Chemistry 21, 972-979. Kloas, W., & Lutz, I. (2006). Amphibians as model to study endocrine disrupters. Journal of Chromatography A, 1130(1), 16-27. Klotz, D. M., Ladlie, B. L., Vonier, P. M., McLachlan, J. A., & Arnold, S. F. (1997). o p′-DDT and its metabolites inhibit progesterone-dependent responses in yeast and human cells. Molecular and cellular endocrinology, 129(1), 63-71. Kluxen, F. M., Höfer, N., Kretzschmar, G., Degen, G. H., & Diel, P. (2012). Cadmium modulates expression of aryl hydrocarbon receptor-associated genes in rat uterus by interaction with the estrogen receptor. Archives of toxicology,86(4), 591-601. Körner W, Hanf V, Schuller W, Bartsch H, Zwirner M, Hagenmaier H (1998). Validation and application of a rapid in vitro assay for assessing the estrogenic potency of halogenated phenolic chemicals. Chemosphere 37,2395-2407. Körner W, Hanf V, Schuller W, Kempter C, Metzger J, Hagenmaier H (1999). Development of a sensitive E-screen assay for quantitative analysis of 53 estrogenic activity in municipal sewage plant effluents. The Science of the Total Environment 225, 33-48. Körner W, Bolz U, Süßmuth W, Hiller G, Schuller W, Hanf V, Hagenmaier H (2000). Input/output balance of estrogenic active compounds in a major municipal sewage plant in Germany. Chemosphere 40, 1131-1142. Körner W, Spengler P, Boltz U, Schuller W, Hanf V, Metzger JW (2001). Körner, W., Spengler, P., Bolz, U., Schuller, W., Hanf, V., & Metzger, J. W. (2001). Substances with estrogenic activity in effluents of sewage treatment plants in southwestern Germany. 2. Biological analysis. Environmental Toxicology and Chemistry, 20(10), 2142-2151. Koterba, K. L., & Rowan, B. G. (2006). Measuring ligand-dependent and ligand-independent interactions between nuclear receptors and associated proteins using Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET2). Nuclear receptor signaling, 4.:e021. doi : 10.1621/nrs.04021 Krishnan, A. V., & Feldman, D. (2010). Molecular pathways mediating the anti-inflammatory effects of calcitriol : implications for prostate cancer chemoprevention and treatment. Endocrinerelated cancer, 17(1), R19-R38. Krishnan, V., Wang, X., & Safe, S. (1994). Estrogen receptor-Sp1 complexes mediate estrogeninduced cathepsin D gene expression in MCF-7 human breast cancer cells. Journal of Biological Chemistry, 269(22), 15912-15917. Kristensen, D. M., Skalkam, M. L., Audouze, K., Lesné, L., Desdoits-Lethimonier, C., Frederiksen, H., ... & Leffers, H. (2011). Many putative endocrine disruptors inhibit prostaglandin synthesis. Environmental health perspectives, 119(4), 534. Kuch, B., Kern, F., Metzger, J. W., & von der Trenck, K. T. (2010). Effect-related monitoring : estrogen-like substances in groundwater. Environmental Science and Pollution Research, 17(2), 250-260. Kuiper, G. G., Lemmen, J. G., Carlsson, B. O., Corton, J. C., Safe, S. H., van der Saag, P. T., ... & Gustafsson, J. A. (1998). Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor β. Endocrinology, 139(10), 4252-4263. Kuiper-Goodman, T., Scott, P. M., & Watanabe, H. (1987). Risk assessment of the mycotoxin zearalenone. Regulatory toxicology and pharmacology, 7(3), 253-306. 142 Kummer, V., Maskova, J., Canderle, J., Zraly, Z., Neca, J., & Machala, M. (2001). Estrogenic effects of silymarin in ovariectomized rats. Veterinarni Medicina-Praha-, 46(1), 17-23. Kunz, A., Mansilla, H., & Duran, N. (2002). A degradation and toxicity study of three textile reactive dyes by ozone. Environmental technology, 23(8), 911-918. Laetz, C. A., Baldwin, D. H., Collier, T. K., Hebert, V., Stark, J. D., & Scholz, N. L. (2009). The synergistic toxicity of pesticide mixtures : implications for risk assessment and the conservation of endangered Pacific salmon. Environmental Health Perspectives, 117(3), 348353. Lafont, R (2005) http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/dosages/D3.html. Laganà, A., Bacaloni, A., De Leva, I., Faberi, A., Fago, G., & Marino, A. (2004). Analytical methodologies for determining the occurrence of endocrine disrupting chemicals in sewage treatment plants and natural waters. Analytica Chimica Acta, 501(1), 79-88. Lam, S. M., Sin, J. C., Abdullah, A. Z., & Mohamed, A. R. (2013). Photocatalytic degradation of resorcinol, an endocrine disrupter, by TiO2 and ZnO suspensions. Environmental technology, 34(9), 1097-1106. Larsson, D. J., & Förlin, L. (2002). Male-biased sex ratios of fish embryos near a pulp mill : temporary recovery after a short-term shutdown. Environmental health perspectives, 110(8), 739. Le Grand, A. thèse de doctorat (2009), Université de Bretagne-Sud ; Etude comparative de récepteurs aux oestrogènes : Aspects moléculaire et cellulaire de la réponse aux oestrogènes et antioestrogènes impliqués dans les causes et thérapies du cancer du sein. Le Maire, A., Bourguet, W., & Balaguer, P. (2010). A structural view of nuclear hormone receptor : endocrine disruptor interactions. Cellular and molecular life sciences, 67(8), 1219-1237. Le, H. T., Schaldach, C. M., Firestone, G. L., & Bjeldanes, L. F. (2003). Plant-derived 3, 3′diindolylmethane is a strong androgen antagonist in human prostate cancer cells. Journal of Biological Chemistry, 278(23), 21136-21145. Lee, H. B., & Peart, T. E. (2000). Determination of bisphenol A in sewage effluent and sludge by solid-phase and supercritical fluid extraction and gas chromatography/mass spectrometry. Journal of AOAC international, 83(2), 290-297. Lee, H. B., Peart, T. E., & Svoboda, M. L. (2005). Determination of endocrine-disrupting phenols, acidic pharmaceuticals, and personal-care products in sewage by solid-phase extraction and gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1094(1), 122-129. Legler, J., Dennekamp, M., Vethaak, A. D., Brouwer, A., Koeman, J. H., Van Der Burg, B., & Murk, A. J. (2002a). Detection of estrogenic activity in sediment-associated compounds using in vitro reporter gene assays. Science of the Total Environment, 293(1), 69-83. Legler, J., Zeinstra, L. M., Schuitemaker, F., Lanser, P. H., Bogerd, J., Brouwer, A., ... & van der Burg, B. (2002b). Comparison of in vivo and in vitro reporter gene assays for short-term screening of estrogenic activity. Environmental science & technology, 36(20), 4410-4415. Lemaire, G., Terouanne, B., Mauvais, P., Michel, S., & Rahmani, R. (2004). Effect of organochlorine pesticides on human androgen receptor activation in vitro. Toxicology and applied pharmacology, 196(2), 235-246. Lemaire, G., Mnif, W., Mauvais, P., Balaguer, P., & Rahmani, R. (2006). Activation of α-and βestrogen receptors by persistent pesticides in reporter cell lines. Life sciences, 79(12), 11601169. Leusch, F. D., Van den Heuvel, M. R., Chapman, H. F., Gooneratne, S. R., Eriksson, A. M., & Tremblay, L. A. (2006). Development of methods for extraction and in vitro quantification of estrogenic and androgenic activity of wastewater samples. Comparative Biochemistry and Physiology Part C : Toxicology & Pharmacology, 143(1), 117-126. 143 Leusch, F. D., De Jager, C., Levi, Y., Lim, R., Puijker, L., Sacher, F., ... & Chapman, H. F. (2010). Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environmental science & technology, 44(10), 3853-3860. Li, X. M., Luo, F. N., LIU, G. X., & Zhu, P. T. (2008). Bioassay of Estrogenic Activity of Effluent and Influent in a Farm Wastewater Treatment Plant Using an in vitro Recombinant Assay with Yeast Cells. Biomedical and Environmental Sciences, 21(5), 381-388. Liang, J., Zhu, H., Li, C., Ding, Y., Zhou, Z., & Wu, Q. (2012). Neonatal exposure to benzo [a] pyrene decreases the levels of serum testosterone and histone H3K14 acetylation of the StAR promoter in the testes of SD rats. Toxicology. Lima, D., Reis-Henriques, M. A., Silva, R., Santos, A. I., Filipe C Castro, L., & Santos, M. M. (2011). Tributyltin-induced imposex in marine gastropods involves tissue-specific modulation of the retinoid X receptor. Aquatic toxicology, 101(1), 221-227. Limpiyakorn, T., Sonthiphand, P., Rongsayamanont, C., & Polprasert, C. (2011). Abundance of amoA genes of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in activated sludge of full-scale wastewater treatment plants.Bioresource technology, 102(4), 3694-3701. Liu, N., Cai, X., Lei, Y., Zhang, Q., Chan‐Park, M. B., Li, C., ... & Mulchandani, A. (2007). Single‐ Walled Carbon Nanotube Based Real‐Time Organophosphate Detector. Electroanalysis, 19(5), 616-619. López de Alda, M. J., & Barceló, D. (2001). Use of solid-phase extraction in various of its modalities for sample preparation in the determination of estrogens and progestogens in sediment and water. Journal of Chromatography A, 938(1), 145-153. Lorenzo, J. (2003). A new hypothesis for how sex steroid hormones regulate bone mass. Journal of Clinical Investigation, 111(11), 1641-1643. Lu, Y., Peterson, J. R., Gooding, J. J., & Lee, N. A. (2012). Development of sensitive direct and indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for monitoring bisphenol-A in canned foods and beverages. Analytical and bioanalytical chemistry, 403(6), 1607-1618. Ma, C. H., Dong, K. W., & Yu, K. L. (2000). cDNA cloning and expression of a novel estrogen receptor β-subtype in goldfish Carassius auratus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression, 1490(1), 145-152. Ma, J. X., Zhang, K. L., Liu, X., Ma, Y. L., Pei, L. N., Zhu, Y. F., ... & Liu, J. (2006). Concurrent expression of aryl hydrocarbon receptor and CYP1A1 but not CYP1A1 MspI polymorphism is correlated with gastric cancers raised in Dalian, China. Cancer letters, 240(2), 253-260.). Madsen, L., & Dalsgaard, I. (1999). Vertebral column deformities in farmed rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, 171(1), 41-48. Mallat, E., Barzen, C., Klotz, A., Brecht, A., Gauglitz, G., & Barcelo, D. (1999). River analyzer for chlorotriazines with a direct optical immunosensor.Environmental science & technology, 33(6), 965-971.Mallat, E., Barzen, C., Abuknesha, R., Gauglitz, G., & Barcelo, D. (2001a). Fast determination of paraquat residues in water by an optical immunosensor and validation using capillary electrophoresis-ultraviolet detection. Analytica chimica acta, 427(2), 165-171. Mallat, E., Barcelo, D., Barzen, C., Gauglitz, G., & Abuknesha, R. (2001c). Immunosensors for pesticide determination in natural waters. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 20(3), 124132. Mallat, E., Barzen, C., Abuknesha, R., Gauglitz, G., & Barcelo, D. (2001b). Part per trillion level determination of isoproturon in certified and estuarine water samples with a direct optical immunosensor. Analytica Chimica Acta, 426(2), 209-216. 144 Mansour, H. B., Boughzala, O., Barillier, D., Chekir-Ghedira, L., & Mosrati, R. (2011). Les colorants textiles sources de contamination de l’eau : criblage de la toxicité et des méthodes de traitement. Revue des sciences de l’eau/Journal of Water Science, 24(3), 209-238. Marchesini, G. R., Meulenberg, E., Haasnoot, W., & Irth, H. (2005). Biosensor immunoassays for the detection of bisphenol A. Analytica chimica acta, 528(1), 37-45. Marquette, C. A., Corgier, B. P., & Blum, L. J. (2012). Recent advances in multiplex immunoassays. Bioanalysis, 4(8), 927-936. Marinella Farré Lina Kantiani, Sandra Pérez, Damià Barceló, Sensors and biosensors in support of EU Directives, TrAC Trends in Analytical Chemistry, Volume 28, Issue 2, February 2009, Pages 170–185 Massaad C, Barouki R. An assay for the detection of xenoestrogens based on a promoter containing overlapping EREs. Environ Health Perspect 1999, 107 : 563-566 Massanyi, P., Uhrin, V., Sirotkin, A. V., Paksy, K., Toman, Z., Forgács, R., & Kovačik, J. (2000). Effects of cadmium on ultrastructure and steroidogenesis in cultured porcine ovarian granulosa cells. Acta Veterinaria Brno, 69(2), 101-None. Massart, F., Becherini, L., Marini, F., Noci, I., Piciocchi, L., Del Monte, F., ... & Brandi, L. (2003). Analysis of estrogen receptor (ERalpha and ERbeta) and progesterone receptor (PR) polymorphisms in uterine leiomyomas. Medical science monitor : international medical journal of experimental and clinical research, 9(1), BR25-30. Masuyama, H., Hiramatsu, Y., Kunitomi, M., Kudo, T., & MacDonald, P. N. (2000). Endocrine disrupting chemicals, phthalic acid and nonylphenol, activate pregnane X receptor-mediated transcription. Molecular Endocrinology, 14(3), 421-428. Mathur, N., & Bhatnagar, P. (2007). Mutagenicity assessment of textile dyes from Sanganer (Rajasthan). Journal of Environmental Biology, 28(1). Matozzo, V., & Marin, M. G. (2007). First evidence of altered vitellogenin-like protein levels in clam Tapes philippinarum and in cockle Cerastoderma glaucum from the Lagoon of Venice. Marine pollution bulletin,55(10), 494-504. Matozzo, V., & Marin, M. G. (2008). Can 17-β estradiol induce vitellogenin-like proteins in the clam Tapes philippinarum Environmental toxicology and pharmacology, 26(1), 38-44. Matthews, J., & Gustafsson, J. A. (2006). Estrogen receptor and aryl hydrocarbon receptor signaling pathways. Nucl Recept Signal, 4, e016. Mauriz, E., Calle, A., Manclús, J. J., Montoya, A., Hildebrandt, A., Barceló, D., & Lechuga, L. M. (2007). Optical immunosensor for fast and sensitive detection of DDT and related compounds in river water samples. Biosensors and Bioelectronics, 22(7), 1410-1418. Mazaud-Guittot, S., Nicolaz, C. N., Desdoits-Lethimonier, C., Coiffec, I., Maamar, M. B., Balaguer, P., ... & Jégou, B. (2013). Paracetamol, Aspirin, and Indomethacin Induce Endocrine Disturbances in the Human Fetal Testis Capable of Interfering With Testicular Descent. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 98(11), E1757-E1767. McEwen, B. S., & Alves, S. E. (1999). Estrogen actions in the central nervous system 1. Endocrine reviews, 20(3), 279-307. McKinlay, R., Plant, J. A., Bell, J. N. B., & Voulvoulis, N. (2008). Endocrine disrupting pesticides : implications for risk assessment. Environment International, 34(2), 168-183. McLachlan, M. J., Katzenellenbogen, J. A., & Zhao, H. (2011). A new fluorescence complementation biosensor for detection of estrogenic compounds. Biotechnology and bioengineering, 108(12), 2794-2803. Menuet, A., Pellegrini, E., Anglade, I., Blaise, O., Laudet, V., Kah, O., & Pakdel, F. (2002). Molecular characterization of three estrogen receptor forms in zebrafish : binding characteristics, 145 transactivation properties, and tissue distributions. Biology of Reproduction, 66(6), 18811892. Meucci, V., & Arukwe, A. (2005). Detection of vitellogenin and zona radiata protein expressions in surface mucus of immature juvenile Atlantic salmon Salmo salar exposed to waterborne nonylphenol. Aquatic Toxicology, 73(1), 1-10. Mikamo, E., Harada, S., Nishikawa, J. I., & Nishihara, T. (2003). Endocrine disruptors induce cytochrome P450 by affecting transcriptional regulation via pregnane X receptor. Toxicology and applied pharmacology, 193(1), 66-72. Mita, D. G., Attanasio, A., Arduini, F., Diano, N., Grano, V., Bencivenga, U., ... & Moscone, D. (2007). Enzymatic determination of BPA by means of tyrosinase immobilized on different carbon carriers. Biosensors and Bioelectronics, 23(1), 60-65. Moawad, H., El–Rahim, W. M. A., & Khalafallah, M. (2003). Evaluation of biotoxicity of textile dyes using two bioassays. Journal of basic microbiology,43(3), 218-229. Monosson, E. (2005). Chemical mixtures : considering the evolution of toxicology and chemical assessment. Environmental health perspectives, 113(4), 383. Montrose, A. thèse de doctorat (2013), Université De Toulouse; Développement d’un immunocapteur impédimétrique pour la détection et la quantification d’une sous- population cellulaire : Application au diagnostic précoce des infections. Moore, R. L., & Faller, D. V. (2013). SIRT1 represses estrogen-signaling, ligand-independent ERαmediated transcription, and cell proliferation in estrogen-responsive breast cells. Journal of Endocrinology, 216(3), 273-285. Mortensen, G. K., Strobel, B. W., & Hansen, H. C. B. (2003). Determination of zearalenone and ochratoxin A in soil. Analytical and bioanalytical chemistry, 376(1), 98-101. Multigner, L., & Kadhel, P. (2008). Perturbateurs endocriniens, concepts et réalité. Archives des Maladies Professionnelles et de l'Environnement, 69(5), 710-717. Munkittrick, K. R., Portt, C. B., Kraak, G. V. D., Smith, I. R., & Rokosh, D. A. (1991). Impact of bleached kraft mill effluent on population characteristics, liver MFO activity, and serum steroid levels of a Lake Superior white sucker (Catostomus commersoni) population. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 48(8), 1371-1380. Murata, M., Nakayama, M., Irie, H., Yakabe, K., Fukuma, K., Katayama, Y., & Maeda, M. (2001). Novel biosensor for the rapid measurement of estrogen based on a ligand-receptor interaction. Analytical sciences, 17(3), 387-390. Murata, M., Gouda, C., Yano, K., Kuroki, S., Suzutani, T., & Katayama, Y. (2003). Piezo electric sensor for endocrine-disrupting chemicals using receptor-co-factor interaction. Anal. Sci, 19(10), 1355-1357. Murk, A. J., Legler, J., Van Lipzig, M. M., Meerman, J. H., Belfroid, A. C., Spenkelink, A., ... & Vethaak, D. (2002). Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environmental Toxicology and Chemistry, 21(1), 16-23. Najwa BEN OUJJI (2012) thèse de doctorat Développement de biocapteurs enzymatiques associés à des polymères à empreinte moléculaire (MIPs) pour la détection sélective et sensible des organophosphorés utilisés en oléiculture universite de Perpignan et d’IBN Zohr d’Agadir p.167) National Library of Medicine. ChemIDplus. 2007. Ndossi, D. G., Frizzell, C., Tremoen, N. H., Fæste, C. K., Verhaegen, S., Dahl, E., ... & Ropstad, E. (2012). An in vitro investigation of endocrine disrupting effects of trichothecenes deoxynivalenol (DON), T-2 and HT-2 toxins. Toxicology letters, 214(3), 268-278. 146 Neel, B. A., Brady, M. J., & Sargis, R. M. (2013). The Endocrine Disrupting Chemical Tolylfluanid Alters Adipocyte Metabolism via Glucocorticoid Receptor Activation. Molecular Endocrinology, 27(3), 394-406. Nelson, J., Bishay, F., Van Roodselaar, A., Ikonomou, M., & Law, F. C. (2007). The use of in vitro bioassays to quantify endocrine disrupting chemicals in municipal wastewater treatment plant effluents. Science of the Total Environment, 374(1), 80-90. Nesatyy, V. J., Ammann, A. A., Rutishauser, B. V., & Suter, M. J. F. (2006). Effect of cadmium on the interaction of 17β-estradiol with the rainbow trout estrogen receptor. Environmental science & technology, 40(4), 1358-1363. Nilsen, B. M., Berg, K., Eidem, J. K., Kristiansen, S. I., Brion, F., Porcher, J. M., & Goksøyr, A. (2004). Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening. Analytical and bioanalytical chemistry, 378(3), 621-633. Nogueira, R., Estevinho, I., Abrunhosa, L., Mendonça, C., Machado, P., Carballa, M., ... & Venâncio, A. (2007). Assessing the degradation of ochratoxin a using a bioassay : the case of contaminated winery wastewater. Water Science & Technology, 56(2). Notsu, H., Tatsuma, T., & Fujishima, A. (2002). Tyrosinase-modified boron-doped diamond electrodes for the determination of phenol derivatives. Journal of Electroanalytical Chemistry, 523(1), 86-92. Oehlmann, J., Schulte-Oehlmann, U., Tillmann, M., & Markert, B. (2000). Effects of endocrine disruptors on prosobranch snails (Mollusca : Gastropoda) in the laboratory. Part I : Bisphenol A and octylphenol as xeno-estrogens. Ecotoxicology, 9(6), 383-397. Ohtake, F., Takeyama, K. I., Matsumoto, T., Kitagawa, H., Yamamoto, Y., Nohara, K., ... & Kato, S. (2003). Modulation of oestrogen receptor signalling by association with the activated dioxin receptor. Nature, 423(6939), 545-550. Ohtake, F., Baba, A., Takada, I., Okada, M., Iwasaki, K., Miki, H., ... & Kato, S. (2007). Dioxin receptor is a ligand-dependent E3 ubiquitin ligase. Nature, 446(7135), 562-566. Ohtake, F., Baba, A., Fujii-Kuriyama, Y., & Kato, S. (2008). Intrinsic AhR function underlies crosstalk of dioxins with sex hormone signalings.Biochemical and biophysical research communications, 370(4), 541-546. Ohtake, F., Fujii-Kuriyama, Y., & Kato, S. (2009). AhR acts as an E3 ubiquitin ligase to modulate steroid receptor functions. Biochemical pharmacology, 77(4), 474-484. Ohtake, F., Fujii-Kuriyama, Y., Kawajiri, K., & Kato, S. (2011). Cross-talk of dioxin and estrogen receptor signals through the ubiquitin system. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 127(1), 102-107. Ojeda, I., López-Montero, J., Moreno-Guzmán, M., Janegitz, B. C., González-Cortés, A., YáñezSedeño, P., & Pingarrón, J. M. (2012). Electrochemical immunosensor for rapid and sensitive determination of estradiol. Analytica chimica acta, 743, 117-124. Okamoto, M., Hojo, Y., Inoue, K., Matsui, T., Kawato, S., McEwen, B. S., & Soya, H. (2012). Mild exercise increases dihydrotestosterone in hippocampus providing evidence for androgenic mediation of neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(32), 13100-13105. Okamoto M, Hojo Y, Inoue K, Matsui T, Kawato S, McEwen BS, Soya H, Mol Cell Endocrinol. 2013 Nov 14;382(2):899-908. doi : 10.1016/j.mce.2013.11.002. Onda, K., Yang, S., Miya, A., & Tanaka, T. (2002). Evaluation of estrogen-like activity on sewage treatment processes using recombinant yeast. Water Science & Technology, 46(11-12), 367373. P.F.P. Henry D. Sparling, G. Linder, C. Bishop (Eds.) (2000), Ecotoxicology of Amphibians and Reptiles, SETAC Press, Pensacola, FL , p. 71 C. 147 Pampanin, D. M., Marangon, I., Volpato, E., Campesan, G., & Nasci, C. (2005). Stress biomarkers and alkali-labile phosphate level in mussels Mytilus galloprovincialis collected in the urban area of Venice (Venice Lagoon, Italy). Environmental Pollution, 136(1), 103-107. Pasqualini, C., Sarrieau, A., Dussaillant, M., Corbani, M., Bojda-Diolez, F., Rostène, W., & Kerdelhué, B. (1990). Estrogen-like effects of 7, 12-dimethylbenz (a) anthracene on the female rat hypothalamo-pituitary axis. Journal of steroid biochemistry, 36(5), 485-491. Pedram, A., Razandi, M., & Levin, E. R. (2006). Nature of functional estrogen receptors at the plasma membrane. Molecular Endocrinology, 20(9), 1996-2009. Pedrouzo, M., Borrull, F., Marcé, R. M., & Pocurull, E. (2009). Ultra-high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry for determining the presence of eleven personal care products in surface and wastewaters. Journal of Chromatography A, 1216(42), 69947000. Peña, D., Pontillo, C., García, M. A., Cocca, C., Alvarez, L., Chiappini, F., ... & Randi, A. (2012). Alterations in c-Src/HER1 and estrogen receptor α signaling pathways in mammary gland and tumors of hexachlorobenzene-treated rats. Toxicology, 293(1), 68-77. Petrović, M., Eljarrat, E., López de Alda, M. J., & Barceló, D. (2001). Analysis and environmental levels of endocrine-disrupting compounds in freshwater sediments. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 20(11), 637-648. Petrovic, M., Solé, M., López De Alda, M. J., & Barceló, D. (2002). Endocrine disruptors in sewage treatment plants, receiving river waters, and sediments : integration of chemical analysis and biological effects on feral carp.Environmental Toxicology and Chemistry, 21(10), 2146-2156. Petrović, M., Gonzalez, S., & Barceló, D. (2003). Analysis and removal of emerging contaminants in wastewater and drinking water. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 22(10), 685-696. Pfeffer, U., Fecarotta, E., Arena, G., Forlani, A., & Vidali, G. (1996). Alternative splicing of the estrogen receptor primary transcript normally occurs in estrogen receptor positive tissues and cell lines. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 56(1), 99-105. Piao, M. H., Noh, H. B., Rahman, M. A., Won, M. S., & Shim, Y. B. (2008). Label‐Free Detection of Bisphenol A Using a Potentiometric Immunosensor.Electroanalysis, 20(1), 30-37. Piccart, M., Parker, L. M., & Pritchard, K. I. (2003). Oestrogen receptor downregulation : an opportunity for extending the window of endocrine therapy in advanced breast cancer. Annals of oncology, 14(7), 1017-1025. Pillon, A., Boussioux, A. M., Escande, A., Aït-Aïssa, S., Gomez, E., Fenet, H., ... & Balaguer, P. (2005). Binding of estrogenic compounds to recombinant estrogen receptor-α : application to environmental analysis. Environmental health perspectives, 113(3), 278. Plíšková, M., Vondráček, J., Vojtěšek, B., Kozubík, A., & Machala, M. (2005). Deregulation of cell proliferation by polycyclic aromatic hydrocarbons in human breast carcinoma MCF-7 cells reflects both genotoxic and nongenotoxic events. Toxicological Sciences, 83(2), 246-256. Portaccio, M., Di Tuoro, D., Arduini, F., Lepore, M., Mita, D. G., Diano, N., ... & Moscone, D. (2010). A thionine-modified carbon paste amperometric biosensor for catechol and bisphenol A determination. Biosensors and Bioelectronics, 25(9), 2003-2008. Powell, C. E., Soto, A. M., & Sonnenschein, C. (2001). Identification and characterization of membrane estrogen receptor from MCF7 estrogen-target cells. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 77(2), 97-108. Preuss, T. G., Gehrhardt, J., Schirmer, K., Coors, A., Rubach, M., Russ, A., ... & Ratte, H. T. (2006). Nonylphenol isomers differ in estrogenic activity. Environmental science & technology, 40(16), 5147-5153. 148 Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Bye, V. V. J., Eno, N. C., Tyler, C. R., & Sumpter, J. P. (1994). Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology, 8(4), 275-285. Ragavan, K. V., Selvakumar, L. S., & Thakur, M. S. (2013). Functionalized aptamers as nanobioprobes for ultrasensitive detection of bisphenol-A. Chemical Communications, 49(53), 5960-5962. Rahman, M. A., Shiddiky, M. J., Park, J. S., & Shim, Y. B. (2007). An impedimetric immunosensor for the label-free detection of bisphenol A. Biosensors and Bioelectronics, 22(11), 2464-2470. Rajapakse, N., Silva, E., & Kortenkamp, A. (2002). Combining xenoestrogens at levels below individual no-observed-effect concentrations dramatically enhances steroid hormone action. Environmental Health Perspectives, 110(9), 917. Ramaswamy, B. R., Shanmugam, G., Velu, G., Rengarajan, B., & Larsson, D. G. (2011). GC–MS analysis and ecotoxicological risk assessment of triclosan, carbamazepine and parabens in Indian rivers. Journal of hazardous materials, 186(2), 1586-1593. Raun Andersen, H., Vinggaard, A. M., Høj Rasmussen, T., Gjermandsen, I. M., & Cecilie BonefeldJørgensen, E. (2002). Effects of currently used pesticides in assays for estrogenicity, androgenicity, and aromatase activity in vitro . Toxicology and applied pharmacology, 179(1), 1-12. Rawlings, N.C.; Cook, S.J.; Waldbillig, D. Effects of the pesticides carbofuran; chlorpyrifos; dimethoate; lindane; triallate; trifluralin; 2;4-D; and pentachlorophenol on the metabolic endocrine and reproductive endocrine system in ewes. J. Toxicol. Environ. Health A 1998, 54, Renz, L., Volz, C., Michanowicz, D., Ferrar, K., Christian, C., Lenzner, D., & El-Hefnawy, T. (2013). A study of parabens and bisphenol A in surface water and fish brain tissue from the Greater Pittsburgh Area. Ecotoxicology, 22(4), 632-641. Rhouati, A., Yang, C., Hayat, A., & Marty, J. L. (2013). Aptamers : a promosing tool for ochratoxin a detection in food analysis. Toxins, 5(11), 1988-2008. Rider, C. V., Furr, J., Wilson, V. S., & Gray, L. E. (2008). A mixture of seven antiandrogens induces reproductive malformations in rats. International journal of andrology, 31(2), 249-262. Riffle, B. W., Henderson, W. M., & Laws, S. C. (2013). Measurement of steroids in rats after exposure to an endocrine disruptor : Mass spectrometry and radioimmunoassay demonstrate similar results. Journal of pharmacological and toxicological methods, 68(3), 314-322. Rivera SP, Saarikoski ST et Hankinson O. 2002. Identification of a novel dio x in inducible cytochrome P450. Mol. Pharmacol. 61, p 255-259 Rochester, J. R., & Millam, J. R. (2009). Phytoestrogens and avian reproduction : Exploring the evolution and function of phytoestrogens and possible role of plant compounds in the breeding ecology of wild birds. Comparative Biochemistry and Physiology Part A : Molecular & Integrative Physiology, 154(3), 279-288. Rodriguez-Mozaz, S., Marco, M. P., de Alda, M. J. L., & Barceló, D. (2004a). Biosensors for environmental monitoring of endocrine disruptors : a review article. Analytical and bioanalytical chemistry, 378(3), 588-598. Rodriguez-Mozaz, S., Reder, S., Lopez de Alda, M., Gauglitz, G., & Barceló, D. (2004b). Simultaneous multi-analyte determination of estrone, isoproturon and atrazine in natural waters by the RIver ANAlyser (RIANA), an optical immunosensor. Biosensors and Bioelectronics, 19(7), 633-640. Rodriguez-Mozaz, S., De Alda, M. L., & Barceló, D. (2005). Analysis of bisphenol A in natural waters by means of an optical immunosensor. Water research, 39(20), 5071-5079. 149 Rodriguez-Mozaz, S., de Alda, M. J. L., & Barceló, D. (2006). Fast and simultaneous monitoring of organic pollutants in a drinking water treatment plant by a multi-analyte biosensor followed by LC–MS validation. Talanta, 69(2), 377-384. Rodriguez-Mozaz, López de Alda , & Damià Barceló (2009) Achievements of the RIANA and AWACSS EU Projects : Immunosensors for the Determination of Pesticides, Endocrine Disrupting Chemicals and Pharmaceuticals, Hdb Env Chem 5J : 33–46 Rogers, J. A., Metz, L., & Yong, V. W. (2013). Review : Endocrine disrupting chemicals and immune responses : A focus on bisphenol-A and its potential mechanisms. Molecular immunology, 53(4), 421-430. Roos, A., Greyerz, E., Olsson, M., & Sandegren, F. (2001). The otter Lutra lutra in Sweden population trends in relation to ΣDDT and total PCB concentrations during 1968-99. Environmental Pollution, 111(3), 457-469. Rose, A., Nistor, C., Emnéus, J., Pfeiffer, D., & Wollenberger, U. (2002). GDH biosensor based offline capillary immunoassay for alkylphenols and their ethoxylates. Biosensors and Bioelectronics, 17(11), 1033-1043. Routledge, E. J., & Sumpter, J. P. (1996). Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry, 15(3), 241-248. Routledge, E. J., & Sumpter, J. P. (1997). Structural features of alkylphenolic chemicals associated with estrogenic activity. Journal of Biological Chemistry, 272(6), 3280-3288. Roychoudhury, A., & Giri, A. K. (1989). Effects of certain food dyes on chromosomes of Allium cepa. Mutation Research/Genetic Toxicology, 223(3), 313-319. Sacks, V., Eshkenazi, I., Neufeld, T., Dosoretz, C., & Rishpon, J. (2000). Immobilized parathion hydrolase : An amperometric sensor for parathion. Analytical chemistry, 72(9), 2055-2058. Sanderson, J. T., Seinen, W., Giesy, J. P., & van den Berg, M. (2000). 2-Chloro-s-triazine herbicides induce aromatase (CYP19) activity in H295R human adrenocortical carcinoma cells : A novel mechanism for estrogenicity?Toxicological Sciences, 54(1), 121-127. Sanseverino, J., Eldridge, M. L., Layton, A. C., Easter, J. P., Yarbrough, J., Schultz, T. W., & Sayler, G. S. (2009). Screening of potentially hormonally active chemicals using bioluminescent yeast bioreporters. Toxicological sciences, 107(1), 122-134. Sargis, R. M., Johnson, D. N., Choudhury, R. A., & Brady, M. J. (2010). Environmental endocrine disruptors promote adipogenesis in the 3t3‐l1 cell line through glucocorticoid receptor activation. Obesity, 18(7), 1283-1288. Sassi, A., Annabi, A., Kessabi, K., Kerkeni, A., Saïd, K., & Messaoudi, I. (2010). Influence of high temperature on cadmium-induced skeletal deformities in juvenile mosquitofish (Gambusia affinis). Fish physiology and biochemistry,36(3), 403-409. Scharnweber, T., Fisher, M., Suchànek, M., Knopp, D., Niessner R. (2001). Monoclonal antibody to polycyclic aromatic hydrocarbons based on a new benzo[a]pyrene immunogen. Fresenius J Anal Chem. Nov;371(5):578-85. Schneider, K., Hafner, C., & Jäger, I. (2004). Mutagenicity of textile dye products. Journal of Applied Toxicology, 24(2), 83-91. Schneider, S. L., Alks, V., Morreal, C. E., Sinha, O. K., & Dao, T. L. (1976). Estrogenic properties of 3, 9-dihydroxybenz [a] anthracene, a potential metabolite of benz [a] anthracene. Journal of the National Cancer Institute,57(6), 1341-1354. Schrager, Sarina., & Potter, B. E. (2004). Diethylstilbestrol exposure. American family physician, 69(10), 2395-2400. 150 Schultis, T., & Metzger, J. W. (2004). Determination of estrogenic activity by LYES-assay (yeast estrogen screen-assay assisted by enzymatic digestion with lyticase). Chemosphere, 57(11), 1649-1655. Scippo, M. L., Argiris, C., Van De Weerdt, C., Muller, M., Willemsen, P., Martial, J., & MaghuinRogister, G. (2004). Recombinant human estrogen, androgen and progesterone receptors for detection of potential endocrine disruptors. Analytical and bioanalytical chemistry, 378(3), 664-669. Scognamiglio, V., Pezzotti, I., Pezzotti, G., Cano, J., Manfredonia, I., Buonasera, K., & Giardi, M. T. (2012). Towards an integrated biosensor array for simultaneous and rapid multi-analysis of endocrine disrupting chemicals. Analytica chimica acta, 751, 161-170. Sénat français, Perturbateurs endocriniens, le temps de la précaution [archive], rapport [archive] de l'opecst ; 12 juillet 2011 ; Communiqué de presse 20 mars 2013, http://www.efsa.europa.eu/fr/press/news/130320.htm Sénat français, 20 mars 2013 (Sénat français, Perturbateurs endocriniens, le temps de la précaution [archive], rapport [archive] de l'opecst; 12 juillet 2011) Sharpe, R. M., & Skakkebaek, N. E. (1993). Are oestrogens involved in falling sperm counts and disorders of the male reproductive tract? The Lancet, 341(8857), 1392-1396. Shashi, N.K. Avinash, G.T. Karan P.S.. Arun, , K. Masarrat, JA. Rajendra D.P. (2011), Experimentally induced toxicity of ochratoxin A and endosulfan in male Wistar rats : a hormonal disorder. Journal of Animal and Veterinary Advances, 10 pp. 1750–1755 Shiozawa, T., Muraoka, K., Nukaya, H., Ohe, T., Sawanishi, H., Oguri, A., ... & Terao, Y. (1998). Chemical synthesis of a novel aromatic amine mutagen isolated from water of the Nishitakase River in Kyoto and a possible route of its formation. Chemical research in toxicology, 11(4), 375-380. Silva, E., Rajapakse, N., & Kortenkamp, A. (2002). Something from “nothing”-eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environmental science & technology, 36(8), 1751-1756. Snyder, S., Vanderford, B., Pearson, R., Quinones, O., & Yoon, Y. (2003). Analytical methods used to measure endocrine disrupting compounds in water. Practice Periodical of Hazardous, Toxic, and Radioactive Waste Management, 7(4), 224-234. Spier C. R., Bromage ES, Harris TM, Unger MA, Kaattari SL. (2009). The development and evaluation of monoclonal antibodies for the detection of polycyclic aromatic hydrocarbons. Anal Biochem, 387(2):287-93 Soelberg, S. D., Chinowsky, T., Geiss, G., Spinelli, C. B., Stevens, R., Near, S., ... & Furlong, C. E. (2005). A portable surface plasmon resonance sensor system for real-time monitoring of small to large analytes. Journal of industrial microbiology and biotechnology, 32(11-12), 669-674. Sohoni, P., & Sumpter, J. P. (1998). Several environmental oestrogens are also anti-androgens. Journal of Endocrinology, 158(3), 327-339. Soto, A. M., Sonnenschein, C., Chung, K. L., Fernandez, M. F., Olea, N., & Serrano, F. O. (1995). The E-SCREEN assay as a tool to identify estrogens : an update on estrogenic environmental pollutants. Environmental health perspectives, 103(Suppl 7), 113. Sridevi, P., Chaitanya, R. K., Prathibha, Y., Balakrishna, S. L., Dutta‐Gupta, A., & Senthilkumaran, B. (2013). Early exposure of 17α‐ethynylestradiol and diethylstilbestrol induces morphological changes and alters ovarian steroidogenic pathway enzyme gene expression in catfish, Clarias gariepinus. Environmental toxicology. Stanczyk, F. Z., & Clarke, N. J. (2010). Advantages and challenges of mass spectrometry assays for steroid hormones. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 121(3), 491495. 151 Stavrakakis, C., Colin, R., Hequet, V., Faur, C., & Le Cloirec, P. (2008). Analysis of endocrine disrupting compounds in wastewater and drinking water treatment plants at the nanogram per litre level. Environmental technology,29(3), 279-286. Stenoien, D. L., Mancini, M. G., Patel, K., Allegretto, E. A., Smith, C. L., & Mancini, M. A. (2000a). Subnuclear trafficking of estrogen receptor-α and steroid receptor coactivator-1. Molecular Endocrinology, 14(4), 518-534. Stenoien, D. L., Simeoni, S., Sharp, Z. D., & Mancini, M. A. (2000b). Subnuclear dynamics and transcription factor function. Journal of Cellular Biochemistry,79(S35), 99-106. Stopper, H., Schmitt, E., & Kobras, K. (2005). Genotoxicity of phytoestrogens.Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis,574(1), 139-155. Storari, M., Dennert, F. G., Bigler, L., Gessler, C., & Broggini, G. A. (2012). Isolation of mycotoxins producing black aspergilli in herbal teas available on the Swiss market. Food Control, 26(1), 157-161. Storgaard, L., Bonde, J. P., & Olsen, J. (2006). Male reproductive disorders in humans and prenatal indicators of estrogen exposure : a review of published epidemiological studies. Reproductive Toxicology, 21(1), 4-15. Sun, P. L., Hawkins, W. E., Overstreet, R. M., & Brown-Peterson, N. J. (2009). Morphological deformities as biomarkers in fish from contaminated rivers in Taiwan. International journal of environmental research and public health, 6(8), 2307-2331. Sun, Y., Huang, H., Sun, Y., Wang, C., Shi, X. L., Hu, H. Y., ... & Fujie, K. (2013). Ecological risk of estrogenic endocrine disrupting chemicals in sewage plant effluent and reclaimed water. Environmental Pollution, 180, 339-344. Sunita Rao, D., & Raghuramulu, N. (1995). Vitamin D and its related parameters in fresh-water wild fishes. Comparative Biochemistry and Physiology Part A : Physiology, 111(2), 191-198. Swan, S. H. (2001). Intrauterine exposure to diethylstilbestrol : long‐term effects in humans. Apmis, 109(S103), S210-S222. Swan, S. H., Main, K. M., Liu, F., Stewart, S. L., Kruse, R. L., Calafat, A. M., ... & Study for Future Families Research Team. (2005). Decrease in anogenital distance among male infants with prenatal phthalate exposure. Environmental health perspectives, 113(8), 1056. Swanson, H. I., & Bradfield, C. A. (1993). The AH-receptor : genetics, structure and function. Pharmacogenetics and Genomics, 3(5), 213-230. Takiguchi, M., & Yoshihara, S. I. (2005). New aspects of cadmium as endocrine disruptor. Environmental sciences : an international journal of environmental physiology and toxicology, 13(2), 107-116. Tanida, T., Warita, K., Ishihara, K., Fukui, S., Mitsuhashi, T., Sugawara, T., ... & Hoshi, N. (2009). Fetal and neonatal exposure to three typical environmental chemicals with different mechanisms of action : mixed exposure to phenol, phthalate, and dioxin cancels the effects of sole exposure on mouse midbrain dopaminergic nuclei. Toxicology letters, 189(1), 40-47. Taranova, L. A., Fesay, A. P., Ivashchenko, G. V., Reshetilov, A. N., Winther-Nielsen, M., & Emnéus, J. (2004). Comamonas testosteroni strain TI as a potential base for a microbial sensor detecting surfactants. Applied Biochemistry and Microbiology, 40(4), 404-408. Taranova, L., Semenchuk, I., Manolov, T., Iliasov, P., & Reshetilov, A. (2002). Bacteria-degraders as the base of an amperometric biosensor for detection of anionic surfactants. Biosensors and Bioelectronics, 17(8), 635-640. Tashiro, Y., Takemura, A., Fujii, H., Takahira, K., & Nakanishi, Y. (2003). Livestock wastes as a source of estrogens and their effects on wildlife of Manko tidal flat, Okinawa. Marine Pollution Bulletin, 47(1), 143-147. 152 Thibaut, R., & Porte, C. (2004). Effects of endocrine disrupters on sex steroid synthesis and metabolism pathways in fish. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 92(5), 485-494. Thomas, K. V., Hurst, M. R., Matthiessen, P., & Waldock, M. J. (2001). Characterization of estrogenic compounds in water samples collected from United Kingdom estuaries. Environmental Toxicology and Chemistry, 20(10), 2165-2170. Thongprakaisang, S., Thiantanawat, A., Rangkadilok, N., Suriyo, T., & Satayavivad, J. (2013). Glyphosate induces human breast cancer cells growth via estrogen receptors. Food and Chemical Toxicology, 59, 129-136. Tilton, F., Benson, W. H., & Schlenk, D. (2002). Evaluation of estrogenic activity from a municipal wastewater treatment plant with predominantly domestic input. Aquatic Toxicology, 61(3), 211-224. Toft, G., & Guillette Jr, L. J. (2005). Decreased sperm count and sexual behavior in mosquitofish exposed to water from a pesticide-contaminated lake. Ecotoxicology and environmental safety, 60(1), 15-20. Tong, S. K., Mouriec, K., Kuo, M. W., Pellegrini, E., Gueguen, M. M., Brion, F., ... & Chung, B. C. (2009). A cyp19a1b‐gfp (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis, 47(2), 67-73. Toppari, J., Larsen, J. C., Christiansen, P., Giwercman, A., Grandjean, P., Guillette Jr, L. J., ... & Skakkebæk, N. E. (1996). Male reproductive health and environmental xenoestrogens. Environmental health perspectives, 104(Suppl 4), 741. Tothill, I. E. (2011). Biosensors and nanomaterials and their application for mycotoxin determination. World Mycotoxin Journal, 4(4), 361-374. Tschmelak, J., Kumpf, M., Proll, G., & Gauglitz, G. (2004a). Biosensor for seven sulphonamides in drinking, ground, and surface water with difficult matrices.Analytical letters, 37(8), 17011718. Tschmelak, J., Proll, G., & Gauglitz, G. (2004b). Sub-nanogram per litre detection of the emerging contaminant progesterone with a fully automated immunosensor based on evanescent field techniques. Analytica chimica acta, 519(2), 143-146. Tschmelak, J., Proll, G., & Gauglitz, G. (2004c). Ultra-sensitive fully automated immunoassay for detection of propanil in aqueous samples : steps of progress toward sub-nanogram per liter detection. Analytical and bioanalytical chemistry,379(7-8), 1004-1012. Tschmelak, J., Proll, G., & Gauglitz, G. (2004d). Verification of performance with the automated direct optical TIRF immunosensor (River Analyser) in single and multi-analyte assays with real water samples. Biosensors and Bioelectronics,20(4), 743-752. Tschmelak, J., Proll, G., Riedt, J., Kaiser, J., Kraemmer, P., Bárzaga, L., ... & Gauglitz, G. (2005). Biosensors for unattended, cost-effective and continuous monitoring of environmental pollution : Automated Water Analyser Computer Supported System (AWACSS) and River Analyser (RIANA). International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 85(12-13), 837-852. Tschmelak, J., Kumpf, M., Käppel, N., Proll, G., & Gauglitz, G. (2006). Total internal reflectance fluorescence (TIRF) biosensor for environmental monitoring of testosterone with commercially available immunochemistry : Antibody characterization, assay development and real sample measurements. Talanta,69(2), 343-350. Tyler, C. R., van Aerle, R., Nilsen, M. V., Blackwell, R., Maddix, S., Nilsen, B. M., ... & Goksøyr, A. (2002). Monoclonal antibody enzyme‐linked immunosorbent assay to quantify vitellogenin for studies on environmental estrogens in the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Environmental toxicology and chemistry, 21(1), 47-54. 153 Umbuzeiro, G. A., Roubicek, D. A., Oliveira, D. P., Murakami, D., Coimbrão, C. A., & Straus, E. L. (2004). Mutagenic activity of sludge samples generated in dyeing processing textile plants. Rev. bras. toxicol, 17(2), 29-36. Urbatzka, R., Bottero, S., Mandich, A., Lutz, I., & Kloas, W. (2007). Endocrine disrupters with (anti) estrogenic and (anti) androgenic modes of action affecting reproductive biology of Xenopus laevis : I. Effects on sex steroid levels and biomarker expression. Comparative Biochemistry and Physiology Part C : Toxicology & Pharmacology, 144(4), 310-318. Urushitani, H., Shimizu, A., Katsu, Y., & Iguchi, T. (2002). Early estrogen exposure induces abnormal development of Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology, 293(7), 693-702. Valentini F., Compagnone D., Gentili A et Palleschi G. (2002) An electrochemical ELISA procedure for the screening of 17β-estradiol in urban waste waters. Analyst, 127(10) : l333-l337. Välimaa AL, Kivistö AT, et al. (2010). A novel biosensor for the detection of zearalenone family mycotoxins in milk. J. Microbiol. Methods 80 (1) : 44-8. van Aerle, R., Nolanusan, M., Jobling, S., Christiansen, L. B., Sumpter, J. P., & Tyler, C. R. (2001). Sexual disruption in a second species of wild cyprinid fish (the gudgeon, Gobio gobio) in United Kingdom freshwaters. Environmental Toxicology and Chemistry, 20(12), 2841-2847. Van der Linden, S. C., Heringa, M. B., Man, H. Y., Sonneveld, E., Puijker, L. M., Brouwer, A., & Van der Burg, B. (2008). Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents and surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environmental science & technology, 42(15), 5814-5820. Van Ginkel, S. W., Hassan, S. H., & Oh, S. E. (2010). Detecting endocrine disrupting compounds in water using sulfur-oxidizing bacteria. Chemosphere,81(2), 294-297. Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Wadia, P. R., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., & Soto, A. M. (2007). Exposure to environmentally relevant doses of the xenoestrogen bisphenol-A alters development of the fetal mouse mammary gland. Endocrinology, 148(1), 116-127. Vandenberg, L. N., Colborn, T., Hayes, T. B., Heindel, J. J., Jacobs Jr, D. R., Lee, D. H., ... & Myers, J. P. (2012). Hormones and endocrine-disrupting chemicals : low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine reviews, 33(3), 378-455. Védrine, C., Fabiano, S., & Tran-Minh, C. (2003). Amperometric tyrosinase based biosensor using an electrogenerated polythiophene film as an entrapment support. Talanta, 59(3), 535-544. Verderame, M., Prisco, M., Andreuccetti, P., Aniello, F., & Limatola, E. (2011). Experimentally nonylphenol-polluted diet induces the expression of silent genes VTG and ERα in the liver of male lizard Podarcis sicula. Environmental Pollution, 159(5), 1101-1107. Vethaak AD, Rijs GBJ, Schrap SM, Ruiter H, Gerritsen A, Lahr GJ, (BelfroidAC, de Boer J, Bulder AS, Kuiper RV, Legler J, Murk AJ, de Voogt P, van der Velde EG, Verhaar HJM. Estrogens and xeno-estrogens in the aquatic environment of The Netherlands : occurrence, potency and biological effects. RIZA Institute for Inland Water Management and Waste Water Treatment, 2002. Vigano, L., Arillo, A., Bottero, S., Massari, A., & Mandich, A. (2001). First observation of intersex cyprinids in the Po River (Italy). Science of the total environment, 269(1), 189-194. Viñas, R., Jeng, Y. J., & Watson, C. S. (2012). Non-genomic effects of xenoestrogen mixtures. International journal of environmental research and public health, 9(8), 2694-2714. Viñas, R., & Watson, C. S. (2013). Mixtures of xenoestrogens disrupt estradiol-induced non-genomic signaling and downstream functions in pituitary cells. Environmental Health, 12(1), 26. Vinggaard, A. M., Breinholt, V., & Larsen, J. C. (1999). Screening of selected pesticides for oestrogen receptor activation in vitro. Food Additives & Contaminants, 16(12), 533-542. 154 Vom Saal, F. S., & Hughes, C. (2005). An extensive new literature concerning low-dose effects of bisphenol A shows the need for a new risk assessment. Environmental health perspectives, 113(8), 926. vom Saal, F. S., Akingbemi, B. T., Belcher, S. M., Birnbaum, L. S., Crain, D. A., Eriksen, M., ... & Zoeller, R. T. (2007). Chapel Hill bisphenol A expert panel consensus statement : integration of mechanisms, effects in animals and potential to impact human health at current levels of exposure. Reproductive toxicology (Elmsford, NY), 24(2), 131. Vondráček, J., Kozubík, A., & Machala, M. (2002). Modulation of estrogen receptor-dependent reporter construct activation and G0/G1–S-phase transition by polycyclic aromatic hydrocarbons in human breast carcinoma MCF-7 cells.Toxicological Sciences, 70(2), 193201. Voutsa, D., Hartmann, P., Schaffner, C., & Giger, W. (2006). Benzotriazoles, alkylphenols and bisphenol A in municipal wastewaters and in the Glatt River, Switzerland. Environmental Science and Pollution Research, 13(5), 333-341. Wakeling, A.E., Dukes, M. et Bowler, J. (1991). A potent specific pure antiestrogen with clinical potential. Cancer Res, 51, 3867-3873. Waldbillig, NC Rawlings SJ Cook D. (1998). Effects of the pesticides carbofuran, chlorpyrifos, dimethoate, lindane, triallate, trifluralin, 2, 4-D, and pentachlorophenol on the metabolic endocrine and reproductive endocrine system in ewes. Journal of Toxicology and Environmental Health Part A, 54(1), 21-36. Wanekaya, A. K., Chen, W., & Mulchandani, A. (2008). Recent biosensing developments in environmental security. Journal of Environmental Monitoring, 10(6), 703-712. Watson, C. S., Bulayeva, N. N., Wozniak, A. L., & Finnerty, C. C. (2005). Signaling from the membrane via membrane estrogen receptor-α : estrogens, xenoestrogens, and phytoestrogens. Steroids, 70(5), 364-371. Watson, C. S., Bulayeva, N. N., Wozniak, A. L., & Alyea, R. A. (2007). Xenoestrogens are potent activators of nongenomic estrogenic responses. Steroids, 72(2), 124-134. Watson, C. S., Jeng, Y. J., & Kochukov, M. Y. (2010). Nongenomic signaling pathways of estrogen toxicity. Toxicological sciences, 115(1), 1-11. Watson, C. S., Jeng, Y. J., & Guptarak, J. (2011). Endocrine disruption via estrogen receptors that participate in nongenomic signaling pathways. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 127(1), 44-50.; Watson, C. S., Hu, G., & Paulucci-Holthauzen, A. A. (2013). Rapid actions of xenoestrogens disrupt normal estrogenic signaling. Steroids. Watson, L. F., Brown, S. J., & Davey, M. A. (2006). Use of periconceptional folic acid supplements in Victoria and New South Wales, Australia. Australian and New Zealand journal of public health, 30(1), 42-49. Weiss, C., Faust, D., Dürk, H., Kolluri, S. K., Pelzer, A., Schneider, S., ... & Göttlicher, M. (2005). TCDD induces c-jun expression via a novel Ah (dioxin) receptor-mediated p38–MAPKdependent pathway. Oncogene, 24(31), 4975-4983. Wetherill, Y. B., Akingbemi, B. T., Kanno, J., McLachlan, J. A., Nadal, A., Sonnenschein, C., ... & Belcher, S. M. (2007). In vitro molecular mechanisms of bisphenol A action. Reproductive Toxicology, 24(2), 178-198. Wettstein, F. E., & Bucheli, T. D. (2010). Poor elimination rates in waste water treatment plants lead to continuous emission of deoxynivalenol into the aquatic environment. Water research, 44(14), 4137-4142. Whitehead, S. A., & Rice, S. (2006). Endocrine-disrupting chemicals as modulators of sex steroid synthesis. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism, 20(1), 45-61. 155 Whitelaw, M., Pongratz, I., Wilhelmsson, A., Gustafsson, J. A., & Poellinger, L. (1993). Liganddependent recruitment of the Arnt coregulator determines DNA recognition by the dioxin receptor. Molecular and cellular biology, 13(4), 2504-2514. Witters, H., Vangenechten, C., & Berckmans, P. (2001). Detection of estrogenic activity in Flemish surface waters using anin vitro recombinant assay with yeast cells. Water Science & Technology, 43(2), 117-123. Wilson, V. S., Bobseine, K., & Gray, L. E. (2004). Development and characterization of a cell line that stably expresses an estrogen-responsive luciferase reporter for the detection of estrogen receptor agonist and antagonists. Toxicological Sciences, 81(1), 69-77. Wilson, V. S., Cardon, M. C., Gray, L. E., & Hartig, P. C. (2007). Competitive binding comparison of endocrine‐disrupting compounds to recombinant androgen receptor from fathead minnow, rainbow trout, and human. Environmental toxicology and chemistry, 26(9), 1793-1802. Wilson, M. E., Westberry, J. M., & Prewitt, A. K. (2008). Dynamic regulation of estrogen receptoralpha gene expression in the brain : a role for promoter methylation? Frontiers in neuroendocrinology, 29(3), 375-385. Wu, L., Deng, D., Jin, J., Lu, X., & Chen, J. (2012). Nanographene-based tyrosinase biosensor for rapid detection of bisphenol A. Biosensors and Bioelectronics, 35(1), 193-199. Xiao, W., & Oefner, P. J. (2001). Denaturing high‐performance liquid chromatography : A review. Human mutation, 17(6), 439-474. Xin, T. B., Wang, X., Jin, H., Liang, S. X., Lin, J. M., & Li, Z. J. (2009). Development of magnetic particle-based chemiluminescence enzyme immunoassay for the detection of 17β-estradiol in environmental water. Applied biochemistry and biotechnology, 158(3), 582-594. Xin, T. B., Chen, H., Lin, Z., Liang, S. X., & Lin, J. M. (2010). A secondary antibody format chemiluminescence immunoassay for the determination of estradiol in human serum. Talanta, 82(4), 1472-1477. Xing, S., Cekan, S. Z., Diczfalusy, U., Falk, O., Gustafsson, S. A., Akerlof, E., & Bjorkhem, I. (1983).Validation of radio immunoassay for estradiol 17 beta by isotope dilution mass spectrometry and by a test of radiochemical purity. Clinica Chimica Acta : 189-202 Xu, Z., Kuang, H., Yan, W., Hao, C., Xing, C., Wu, X., ... & Xu, C. (2012). Facile and rapid magnetic relaxation switch immunosensor for endocrine-disrupting chemicals. Biosensors and Bioelectronics, 32(1), 183-187. Yamauchi, K., & Ishihara, A. (2006). Thyroid system-disrupting chemicals : interference with thyroid hormone binding to plasma proteins and the cellular thyroid hormone signaling pathway. Reviews on environmental health, 21(4), 229-252. Yang, N., Matsuda, M., Kawano, M., & Wakimoto, T. (2006). PCBs and organochlorine pesticides (OCPs) in edible fish and shellfish from China. Chemosphere, 63(8), 1342-1352. Yildirim, N., Long, F., Gao, C., He, M., Shi, H. C., & Gu, A. Z. (2012). Aptamer-based optical biosensor for rapid and sensitive detection of 17β-Estradiol in water samples. Environmental science & technology, 46(6), 3288-3294. Yoshida, M., Nishi, M., Kizaki, Z., Sawada, T. et Kawata, M. (2002). Subcellular and subnuclear distributions of estrogen receptor a in living cells using green fluorescent protein and immunohistochemistry. Acta Histochem Cytochem, 34, 413-422. Zejli, H., Hidalgo-Hidalgo de Cisneros, J. L., Naranjo-Rodriguez, I., Liu, B., Temsamani, K. R., & Marty, J. L. (2008). Alumina sol–gel/sonogel-carbon electrode based on acetylcholinesterase for detection of organophosphorus pesticides. Talanta, 77(1), 217-221. Zheng, Z., Du, Y., Wang, Z., Feng, Q., & Wang, C. (2013). Pt/graphene–CNTs nanocomposite based electrochemical sensors for the determination of endocrine disruptor bisphenol A in thermal printing papers. Analyst, 138(2), 693-701. 156 Zhu, B. T., Han, G. Z., Shim, J. Y., Wen, Y., and Jiang, X. R. (2008). Quantitative structure-activity relationship of various endogenous estrogen metabolites for human estrogen receptor and subtypes : insights into the structural determinants favoring a differential subtype binding, Endocrinology 147, 4132-4150. Zoeller, R. T., Bansal, R., & Parris, C. (2005). Bisphenol-A, an environmental contaminant that acts as a thyroid hormone receptor antagonist in vitro, increases serum thyroxine, and alters RC3/neurogranin expression in the developing rat brain. Endocrinology, 146(2), 607-612. 157 École Nationale Supérieure des Mines de Saint-Étienne NNT : 2014 EMSE 0740 Aziza IBN HADJ HASSINE EVALUATION OF CONTAMINANT’S ESTROGENIC ACTIVITY AND DEVELOPMENT OF A BIO-RECEPTOR FOR THE DETECTION OF A XENOHORMONE. Speciality : Sciences et génie de l’environnement Keywords : Bio-detection, sewage treatment plants, Yeast Estrogen Screen, Paraben, food and textile dyes, Peptide, Ochratoxin A Abstract : For several years, environmental exogenous agents called endocrine disruptors (ED), are thought to interfere with reproduction and development functions in many organisms. For the Protection of the Environment and human health, the Water Framework Directive establishes environmental quality standards (EQS) and limits the ranges of thirty-three substances and eight other pollutants in surface waters. Nevertheless, it does not yet take into account the effect of these priority substances on ecosystems and humans including endocrine disruption. More than endocrine disruptors specificity (dose response curve, mixtures effect etc...) make the identification process more complex. This thesis focuses on the study of hormonal effects, the most commonly encountered, estrogen disruption using the yeast estrogen screen (YES) as diagnostic tool. This study focuses particularly on the north of Tunisia, where the impact of ED on development of Aphanius fasciatus. Some xenoestrogens such as cadmium and PAH products generated by local industry are partly involved on observed skeletal deformities. In parallel, some xeno-estrogens (including parabens) are detected in the waters of sewage treatment plants. Other chemicals such as textile and food dyes also have endocrine activities. Under the supervision of water quality, it is necessary to develop rapid tests to detect endocrine disrupter and supplement chemical analysis. Some active substances on the endocrine system is poorly immunogenic, the research axis developed in this thesis focuses on a peptide affinity for detecting a fungi toxin, the ochratoxin A. École Nationale Supérieure des Mines de Saint-Étienne NNT : 2014 EMSE 0740 Aziza IBN HADJ HASSINE EVALUATION DE L’ACTIVITE OESTROGENIQUE DE CONTAMINANTS ET DEVELOPPEMENT D’UN BIO-RECEPTEUR D’AFFINITE POUR LA DETECTION D’UNE XENO-HORMONE. Spécialité: Sciences et génie de l’environnement Mots clefs : Bio-détection, Effluents de station d’épuration, Yeast Estrogen Screen, Parabènes, Colorants textiles et alimentaires, Peptide, Ochratoxine A Résumé : Depuis plusieurs années, des agents exogènes environnementaux appelés perturbateurs endocriniens (PE), sont soupçonnés d’interférer avec les fonctions essentielles de reproduction et de développement chez de nombreux organismes vivants. Pour la protection de l’Environnement et de l’Homme, la Directive Cadre sur l’Eau établit des normes de qualité environnementale (NQE) et limite la concentration de trente-trois substances et de huit autres polluants dans les eaux de surface. En revanche, elle ne prend pas encore en compte l’effet de ces substances prioritaires sur les écosystèmes et les humains notamment la perturbation endocrinienne. De plus les spécificités des perturbateurs endocriniens (courbe dose réponse, effets de mélanges etc..) rendent le processus d'identification de ces molécules complexe. Cette thèse est axée sur l’étude d’un des effets hormonaux, les plus couramment rencontrés, la perturbation oestrogénique en utilisant comme outils de diagnostic le Yeast Estrogen Screen (YES). Cette étude porte plus particulièrement sur le nord de la Tunisie où l’impact de certains PE sur le développement de poissons Aphanius fasciatus a été mis en évidence. Certains xéno-estrogènes comme le cadmium et les HAP, produits générés par l’industrie locale, sont en partie mis en cause dans les malformations observées. En parallèle, certains xéno-estrogènes (parabènes notamment) sont retrouvés dans les eaux de stations d’épuration. D’autres produits chimiques comme les colorants textiles et alimentaires ont également des activités endocriniennes. Dans le cadre de la surveillance de la qualité des eaux, il est nécessaire de développer des tests rapides de détection de ces perturbateurs venant complémenter les analyses chimiques. Certaines substances actives sur le système endocrinien étant peu immunogènes, l’axe de recherche développé, dans le cadre de cette thèse, porte sur un peptide affine pour détecter une myco-oestrogène, l’ochratoxine A.