20120425 TC Isabelle Kerekes

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20120425 TC Isabelle Kerekes
Influence des traitements
cosmétiques sur la concentration
de l’éthylglucuronide dans les
cheveux
Projet Travail de candidature
Kerekes Isabelle
Je, soussignée Kerekes Isabelle, certifie par la présente que ce travail a été réalisé par mes
propres moyens, sans aide illicit et que tout emploi de littérature est dûment signalé.
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Projet Travail de candidature
Kerekes Isabelle
Kerekes Isabelle
Professeure candidate en chimie
au Lycée Technique Mathias Adam
Influence des traitements
cosmétiques sur la
concentration de
l’éthylglucuronide dans les
cheveux
Pétange 2012
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Projet Travail de candidature
Kerekes Isabelle
RÉSUMÉ
Introduction : L’éthylglucuronide (EtG), un métabolite de l’éthanol, est un marqueur
pertinent de la consommation chronique et répétée d’alcool lorsqu’il est analysé dans les
cheveux. Un seuil de 7 pg/mg de cheveux permettant la différentiation entre abstinents ou
buveurs peu fréquents et buveurs occasionnels, ainsi qu’un seuil de 30 pg/mg à partir duquel
une consommation excessive et répétée d’alcool peut être attribuée. Une première étude a mis
en évidence une baisse de 78% de la concentration de l’EtG suite à une décoloration,
démontrant l’importance du traitement cosmétique pour l’interprétation correcte des résultats
d’EtG. Récemment, une autre étude a montré une disparition complète suite à la décoloration
des cheveux. Il n’est cependant pas clair de nos jours si le mécanisme induisant cette
disparition provient d’une dégradation chimique de l’EtG ou bien d’un relargage de ce
métabolite de la matrice capillaire endommagée.
But : Cette étude aura ainsi pour objectif d’analyser l’influence de la décoloration, mais aussi
de la permanente et de la coloration temporaire sur la stabilité de l’EtG dans les cheveux. De
plus, la réactivité entre l’EtG et les produits chimiques de base des produits cosmétiques, tels
que l’eau oxygénée et le thioglycolate d’ammonium, sera étudiée.
Méthodes : Les échantillons de cheveux sont traités in vitro avec les divers produits
cosmétiques suivant la notice d’utilisation. L’EtG est déterminé par CG/SM en mode
ionisation chimique négative en présence d’EtG-D5, le standard interne, après avoir était
purifié par extraction sur phase solide à l’aide de colonnes Oasis MAX et dérivatisé avec
l’anhydride heptafluorobutyrique.
Résultats : Aucun changement notable du taux d’EtG n’a été démontré suite à une coloration
temporaire. Une baisse de 71% de l’EtG a été constatée suite à la décoloration et de 91% suite
à un traitement de permanente. Les tests, lors desquels l’EtG a été mis en présence de
peroxyde d’hydrogène d’une part et de thioglycolate d’ammonium d’autre part, révèlent une
baisse allant jusqu’à 80% pour l’eau oxygénée seule et jusqu’à 100% pour le thioglycolate.
Conclusion : La décoloration et la permanente sont donc deux traitements cosmétiques
agressifs envers l’EtG et les résultats indiquent que la diminution du taux d’EtG serait due
plutôt à une dégradation chimique alors qu’à un relargage lors du traitement. Les résultats de
cette étude démontrent l’importance de la prise en compte de la décoloration et de la
permanente pour une interprétation correcte des résultats de ce marqueur éthylique.
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TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ .................................................................................................................................... 4
I. INTRODUCTION ................................................................................................................ 11
I.1. État du phénomène de la consommation d’alcool dans le monde ................................. 11
I.1.1. En général ............................................................................................................... 11
I.1.2. Au Luxembourg ...................................................................................................... 11
I.1.3. Combattre la consommation abusive d’alcool et l’alcoolisme ............................... 12
I.2. Dépistage de l’alcool en toxicologie ............................................................................. 13
I.2.1. Les matrices biologiques alternatives ..................................................................... 14
I.2.2. Avantage du dépistage des drogues et autres constituants dans les cheveux ......... 17
I.2.3. Mécanisme d’incorporation des drogues dans les cheveux .................................... 19
I.3. Les marqueurs de l’alcool .............................................................................................. 20
I.3.1 L’éthylglucuronide ................................................................................................... 21
I.4. Impact des traitements cosmétiques sur les cheveux ..................................................... 23
I.4.1. Décoloration ............................................................................................................ 24
I.4.2. Permanente .............................................................................................................. 25
I.4.3. Coloration temporaire ............................................................................................. 26
I.5. Influence des traitements cosmétiques sur la concentration de l’éthylglucuronide dans
les cheveux .................................................................................................................... 28
I.5.1. Objectif du travail ................................................................................................... 29
II. MATÉRIEL ET MÉTHODES À METTRE EN ŒUVRE .................................................. 31
II.1. Prélèvement des cheveux.............................................................................................. 31
II.2. Traitement cosmétique des cheveux ............................................................................. 32
II.2.1. Décoloration .......................................................................................................... 32
II.2.2. Permanente ............................................................................................................ 32
II.2.3. Coloration temporaire ............................................................................................ 32
II.3. Tests in vitro sans cheveux .......................................................................................... 33
II.3.1. Tests avec l’eau oxygénée ..................................................................................... 33
II.3.2. Tests avec le thioglycolate d’ammonium .............................................................. 33
II.4. Méthode d’extraction .................................................................................................... 34
II.4.1. Décontamination et traitement des cheveux .......................................................... 34
II.4.2. Purification de l’EtG sur phase solide ................................................................... 34
II.4.3. Dérivation .............................................................................................................. 34
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II.5. Méthode d’analyse par CG/SM-ICN ............................................................................ 35
II.5.1. La spectrométrie de masse à ionisation négative.................................................. 36
II.5.2. Droite de calibration et paramètres de validation .................................................. 36
III. RÉSULTATS ET DISCUSSION ....................................................................................... 39
III.1. Validation de la méthode............................................................................................. 39
III.2. Détermination de l’EtG dans les cheveux ................................................................... 39
III.2.1. Décoloration des cheveux .................................................................................... 39
III.2.2. Permanente des cheveux ...................................................................................... 42
III.2.3. Coloration temporaire des cheveux ...................................................................... 43
III.3. Tests in vitro sur la dégradation de l’EtG ................................................................... 45
III.3.1. Tests avec l’eau oxygénée .................................................................................... 45
III.3.2. Tests avec le thioglycolate d’ammonium ............................................................. 46
IV. CONCLUSION .................................................................................................................. 47
V. BIBLIOGRAPHIE .............................................................................................................. 49
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INDEX DES FIGURES ET DES TABLES
Figures :
Figure 1 :
Substances toxicologiques dans le sang de 210 conducteurs
p.14
Figure 2 :
Patch collecteur de sueur
p.15
Figure 3 :
Utilisation du QED Saliva Alcohol Test
p.15
Figure 4 :
Coupe transversale de la peau de la tête - structure d’un cheveu
p.16
Figure 5:
Coupe d’un cheveu
p.16
Figure 6 :
Cycle de croissance d’un cheveu
p.17
Figure 7 :
Schématisation des voies d’incorporation de substances dans les cheveux p.19
Figure 8 :
L’éthylglucuronide
p.21
Figure 9 :
Réaction chimique de la synthèse de l’EtG
p.21
Figure 10 :
Les liaisons de cohésion de la kératine
p.23
Figure 11 :
Représentation du cheveu naturel et du cheveu décoloré
p.24
Figure 12 :
Les étapes du traitement de la permanente
p.25
Figure 13 :
Formation du thiolate d’ammonium
p.25
Figure 14 :
Formation des ponts disulfures entre deux cystéines
p.25
Figure 15 :
Principaux colorants dans les colorants temporaires
p.27
Figure 16 :
Prélèvement d’un échantillon de cheveux
p.31
Figure 17 :
L’éthylglucuronide deutéré – standard interne
p.34
Figure 18 :
Schéma de l’acétylation de l’EtG
p.35
Figure 19 :
Histogrammes de l’EtG avant et après la décoloration
p.41
Figure 20 :
Spectres de l’EtG – buveur excessif avant et après décoloration
p.41
Figure 21 :
Histogrammes de l’EtG avant et après la permanente
p.43
Figure 22 :
Histogrammes de l’EtG avant et après la coloration temporaire
p.44
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Tables :
Table 1 :
Taux de mortalité standard (par 100000) dû à des maladies chroniques
et aigues et à des dommages graves – 11 premiers pays d’Europe
p.12
Table 2 :
Dose de la consommation d'alcool par habitant en litres d'alcool pur
p.12
Table 3 :
Fenêtres de détection des matrices
p.18
Table 4 :
Données des échantillons de cheveux traités par le produit de décoloration p.40
Table 5 :
Données des échantillons de cheveux traités par le produit de permanente p.42
Table 6 :
Données des échantillons de cheveux traités par la coloration temporaire
8
p.44
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ABRÉVIATIONS
CDT
Transferrine Déficiente en Carbohydrates
CG
Chromatographie en phase Gazeuse
CL
Chromatographie en phase Liquide
CV
Coefficient de Variation
DGS
Direction Générale de la Santé
EtG
EthylGlucuronide
EtG-d5
EthylGlucuronide Deutéré 5 fois
EtS
EthylSulfate
F
Femme
FAEE
Fatty Acids Ethyl Esters (éthyles esters d’acides gras)
γ-GT
γ-GlutamylTranspeptidase
H
Homme
HFBA
Anhydride HeptaFluoroButyrique
IC
Ionisation Chimique
ICN
Ionisation Chimique Négative
IE
Impacte Electronique
LLOQ
Limite de Quantification (Lowest Limit Of Quantification)
LOD
Limite de Détection
m
mètre
mg
milligramme
min
minute
mL
millilitre
mm
millimètre
L
microlitre
m
micromètre
ng
nanogramme
NPDA
NitroPhénylènDiAmines
PEth
PhosphatidylEthanol
pg
picogrammes
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QED
Quod Erat Demonstrandum (ce qu'il fallait démontrer)
SIM
Selected Ion Monitoring
SM
Spectrométrie de Masse
SPE
Solid Phase Extraction (Extraction en Phase Solide)
Tpm
Tours par minute
UDP
Uridine DiPhosphate
VGM
Volume Globulaire Moyen
WHO
World Health Organization
°C
degrès Celsius
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I. INTRODUCTION
I.1. État du phénomène de la consommation d’alcool dans le monde
I.1.1. En général
Dans de nombreux pays du monde, la consommation de boissons alcoolisées est un acte
courant lors de réunions amicales ou mondaines. Néanmoins, la consommation d'alcool n'en
risque pas moins d'entraîner des conséquences néfastes. L’alcool fait partie des drogues
légales les plus consommées à travers le monde. Le World Health Organization Global Status
Report on Alcohol de 2004 (W.H.O., 2004) estimait le nombre de personnes du monde entier
consommant de l’alcool à 2 billions et 76,3 millions d’entre elles présentaient des abus de
consommation d’alcool. D’après un nouveau rapport publié en février 2011 par l’Organisation
mondiale de la Santé (W.H.O., 2010), l’usage nocif d’alcool entraîne 2,5 millions de décès
chaque année, ainsi que des maladies et des traumatismes en grand nombre et affecte de plus
en plus les jeunes générations. Près de 4% des décès sont liés à des maladies reliées à l’abus
d’alcool, un tiers des 2,5 millions de morts est dû à des blessures non intentionnelles sous
l’influence d’alcool, telles que des accidents de la route. 320 000 jeunes âgés de 15 à 29 ans
meurent tous les ans de causes liées à l’alcool, ce qui représente 9% de la mortalité totale dans
ce groupe d’âge. Selon le rapport à la Commission européenne Anderson, P. et Baumberg, B.
sur « L’Alcool en Europe : Une approche en santé publique » de l’Institute of Alcohol Studies
(2006), presque tous les élèves âgés de 15 à 16 ans (90 %) ont bu de l'alcool à un moment de
leur vie, débutant en moyenne à l’âge de 12 ans et demi avec, en moyenne, une première
ivresse à 14 ans. Plus d’un jeune sur 8 (c'est-à-dire 13 % de cette classe d’âge) a été ivre au
moins 20 fois dans sa vie et plus d'un sur 6 de ces buveurs (18 %) a recherché l’ivresse, au
moins 3 fois dans le dernier mois. Dans la plupart des pays, on a observé une augmentation du
comportement de recherche d’ivresse pour les garçons entre les années 1995-1999 et 2003 et
dans la presque totalité des pays, cette évolution fut observée également pour les filles.
I.1.2. Au Luxembourg
En 1997, le Luxembourg, en dépit de sa petite taille, a atteint la seconde place des pays
d’Europe avec le plus de morts reliés aux accidents de la route (Table 1) et se trouve
également à la seconde place de 185 pays avec une consommation d’alcool par personne de
17.54 L pou l’année 2001 (Table 2). Le Luxembourg, autant que la France et l’Allemagne, est
très concerné par les problèmes d’abus d’alcool en Europe centrale avec une estimation
11
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d’environ 3% de la population âgé de plus de 15 ans comme étant des buveurs excessifs en
1994.
Table 2. Consommation d'alcool totale
par personne (+ 15 ans) par an, en litres
d'alcool pur
Table 1. Pourcentage de décès de la route
(par 100 000)
% de mortalité relié au
trafic
Grèce
18,88%
Luxembourg
17,36%
Espagne
13,98%
France
13,06%
Italie
11,76%
Croatie
11,27%
Irlande
10,14%
Autriche
9,84%
Danemark
9,57%
République Tchèque
8,65%
Allemagne
8,05%
(W.H.O., 2004)
Pays
Pays
Total
Hongrie
Danemark
Espagne
Lituanie
Slovaquie
Portugal
Autriche
Croatie
Allemagne
Bermudes
Réunion
France
République de Moldavie
Irlande
République Tchèque
Luxembourg
Uganda
(W.H.O., 2004)
11,92
11,93
12,25
12,32
12,41
12,49
12,58
12,66
12,89
12,92
13,39
13,54
13,88
14,45
16,21
17,45
19,47
L’étude sur la mortalité chez les enfants, adolescents et jeunes adultes au Luxembourg de
1968-1997 indique que 55% des décès par accidents des jeunes de 15 à 24 ans sont dus à des
accidents de voitures. En considérant que la vitesse et l'alcool au volant sont à l'origine de
plus de la moitié des accidents mortels, le Ministère de la Santé déclare que l’alcool est la
deuxième cause de mortalité évitable au Luxembourg (Ministère de la Santé, 2009).
En 2010, le rapport annuel « L’état du phénomène de la drogue au Grand-Duché de
Luxembourg» indique que 6 à 9% des jeunes âgées de 13 ans affirment boire de l’alcool au
moins chaque semaine, alors que le pourcentage se situe entre 19 et 30% pour les adolescents
âgés de 15 ans (RELIS, 2010).
I.1.3. Combattre la consommation abusive d’alcool et l’alcoolisme
L’alcool fait ainsi partie des drogues légales les plus consommées mondialement et sa
consommation chronique est cause de plus de 60 types de maladies. La consommation
d’alcool par personne étant la plus élevée en Europe, le taux de maladies et de blessures dues
à l’alcool varie entre 8 et 10% (Eurobaromètre, 2007).
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L’abus d’alcool mène dans de nombreux cas à de graves conséquences sur le plan social,
telles que la violence, la criminalité, les problèmes familiaux et l’exclusion sociale. Entre cinq
et neuf millions d’enfants vivent dans des familles souffrant de problèmes d’alcool. Par
ailleurs, l’alcool joue un rôle dans un meurtre sur quatre et un suicide sur six, révèle la
commission européenne en juin 2007 (D.G.S., 2007).
Malgré ces constatations, sa consommation continue à être tolérée au sein de la société de
la plupart des pays et devient depuis quelques années de plus en plus tendance surtout auprès
des adolescents, ce qui mène à de nombreux cas d’abus d’alcool.
Une stratégie mondiale afin de réduire l’usage nocif de l’alcool a été approuvée par
l’organisation mondiale de la santé en mai 2010 (W.H.O., 2010) et envisage un éventail de
mesures visant à réduire cette consommation abusive d’alcool. Il ne suffira pas de réduire le
nombre de points de vente et d’augmenter les limites d’âge légales pour acheter de l’alcool,
ainsi que d’appliquer des mesures efficaces contre l’alcool au volant. Il faudra également
préconiser le dépistage et des interventions brèves en milieu médicalisé pour modifier les
modes de consommation dangereux et traiter les troubles liés à l’alcool. Depuis que
l’alcoolisme tend à devenir l’une des dépendances les plus fréquentes, il a finalement prouvé
son intérêt en médecine clinique et légale.
I.2. Dépistage de l’alcool en toxicologie
Le sang et les urines ont longtemps été la base des analyses biologiques, le sang étant
l’unique prélèvement permettant de relier un comportement modifié à la consommation d’une
substance au moment même de la situation. Les urines permettent de rechercher d’éventuels
métabolites et d’obtenir des résultats jusqu’à 72h après consommation pour la plupart des
substances. En 2002, une étude sur la consommation d’alcool et d’autres drogues a été menée
au Luxembourg sur 210 automobilistes lors des contrôles d’alcoolémies sur une population
ciblée (Appenzeler et al., 2005) et a indiqué un problème d’abus d’alcool au volant. La figure
1 indique les substances toxicologiques retrouvées auprès des conducteurs et cette étude mène
à la conclusion que 88% des 210 conducteurs étaient sous l’influence d’alcool. Lors de cette
étude
96,8%
des
buveurs
dépassaient
la
limite
légale
de
0,8 g/l. La quantification du CDT (Transferrine déficiente en carbohydrate), une protéine de
transport du fer dont le taux devient plus élevé lors de l’abus répété de la consommation
alcoolique, a permis de mettre en évidence que 29,5% des conducteurs étaient également des
buveurs abusifs chroniques.
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Figure 1 : Substances toxicologiques dans le sang de 210 conducteurs
I.2.1. Les matrices biologiques alternatives
L’utilisation de matrices biologiques alternatives telles que la sueur, la salive ou les
cheveux, permet d’établir une fenêtre de détection complémentaire par rapport aux matrices
classiques (sang et urines), mais apporte encore d’autres avantages. En effet, ces matrices
moins invasives et faciles à prélever, même à maintes reprises, permettent de mettre en
évidence la substance mère, mais également des métabolites et donnent ainsi des informations
sur l’élimination de la substance. Dans les cheveux, les substances montrent une grande
stabilité et il est plus difficile, voir impossible de les adultérer contrairement à l’urine. De
plus, la collecte de ces matrices ne présente pas de risques infectieux.
a) La sueur
Plusieurs millions de glandes sudoripares sont réparties sur toute la surface du corps
humain. Leur rôle est la régulation de la température corporelle et l’hydratation de la peau. La
quantité de sueur produite par jour dépend de la température ambiante, de la température
corporelle et du degré d’humidité environnemental et varie ainsi entre 0.4 et 1.5 litres par
jour, mais peut atteindre jusqu’à 3 litres lors d’efforts intenses.
De nos jours, un patch collecteur développé par les laboratoires PharmChem est disponible
permettant de prélever la sueur (Figure 2). (Kintz, 1998)
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Figure 2 : Patch collecteur de sueur
Le patch peut être porté de 1 à 10 jours pendant lesquels les xénobiotiques dans la sueur
vont se fixer sur la membrane absorbante et se concentrer. Ensuite, les substances recherchées
seront extraites de ces membranes et analysées.
b) La salive
Dans la cavité buccale, des glandes salivaires produisent un liquide translucide connu
sous le nom de salive. La production de salive est de l’ordre de 1 à 1.5 litres par jour. La
salive peut être collectée par mâchage d’un morceau de coton dans la bouche ou bien par un
système prêts à l’emploi, constitué par une enveloppe membranaire en polymère contenant
des substances glucidiques favorisant la sécrétion de salive.
Pour ce qui est du dosage de l’alcool dans la salive, il existe un procédé fait d’une tige en
plastique terminée par un coton à introduire dans la bouche, le QED Saliva Alcohol Test
(Figure 3). (Kintz, 1998)
Figure 3 : Utilisation du QED Saliva Alcohol Test
c) Les cheveux
Le cheveu est formé dans le follicule pileux, localisé 3 à 5 mm au-dessous de la peau, et
renferme 65-95% de protéines, 1 à 9% de lipides, 0.1 à5% de pigments (mélanine) et des
traces de minéraux, polysaccharides et d’eau (Kronstrand et al., 2007). La composition exacte
varie considérablement suivant le type, le sexe, le mode de nutrition, l’environnement et la
couleur des cheveux. La Figure 4 représente une coupe transversale de la peau de la tête
humaine.
15
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Figure 4 : Coupe transversale de la peau – Structure d’un cheveu
La papille dermique, en contacte avec le bulbe pileux, est entouré par un système
capillaire qui fournit le matériel métabolique nécessaire aux cheveux en croissance. Le
système vasculaire et les glandes sudoripares forment un environnement complexe autour du
cheveu et participent à l’incorporation de diverses substances dans le poil. Le diamètre d’un
cheveu humain varie entre 15 et 120 μm en fonction de son type et de l’endroit de
prélèvement (Harkey, 1993). Le cheveu n’est pas une fibre homogène, mais se compose de
cellules kératinisées, qui forment selon l’assemblage trois structures concentriques (Figure 5).
La cuticule externe, abondamment kératinisée, contenant des cellules se recouvrant comme
des écailles afin de protéger les fibres intérieures. Le cortex contenant les fibres de protéine
kératinisées et renfermant les pigments, principalement la mélanine synthétisée à partir de la
tyrosine dans les mélanosomes, situés à la base du cheveu. Trois formes distinctes de
mélanine existent (jaunes, brun et noir) et s’assemblent en proportions inégales déterminant
ainsi une large variété de couleurs de cheveux du blond au noir. Le déficit de la production de
la mélanine entraîne la formation de poils gris ou blancs.
Figure 5 : Coupe d’un cheveu
16
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Finalement, le médulle (moelle), l’axe central du cheveu, formé par de grosses cellules
kératinisées séparées par des espaces remplis d’air (Musshoff et al., 2004).
La croissance moyenne des cheveux varie entre 0.84 à 1.41 cm par mois (Hartwig et al.,
2003). Le follicule passe par des cycles de croissance répétés, qui consistent en trois étapes
(Figure 6) et commencent tout d’abord par une phase anagène, une phase active au cours de
laquelle le cheveu se forme et pousse (Pragst et al., 1998; Kronstrand et al., 2007; Pötsch et
al., 2004). Cette phase s’étend de quelques semaines jusqu’à quelques années en fonction de
la région du cheveux/poil (Table 3.). Les cheveux de la tête y passent 2 à 6 ans, alors que les
poils du corps n’y passent en moyenne que quelques mois à maximum 2 ans. Ensuite, la
racine du cheveu s’atrophie dans la phase de repos, surnommée phase catagène. Finalement,
lors de la dernière étape, la phase télogène, le cheveu cesse de pousser et reste dans la peau
pendant quelques mois, le temps qu’un nouveau cheveu se forme et le pousse hors de la peau.
Figure 6 : Cycle de croissance d’un cheveu
En outre, comme les follicules pileux s’atrophient de plus en plus avec l’âge, le
remplacement des cheveux tombés n’est plus souvent effectué, ce qui a comme résultat la
calvitie. Ce phénomène est plus marqué chez l’homme que chez la femme.
I.2.2. Avantage du dépistage des drogues et autres constituants dans les cheveux
Depuis les dernières décennies, la recherche de substances dans les matrices biologiques
alternatives, telles que la sueur, la salive, le lait maternel et surtout les cheveux, s’est
considérablement développée. Les cheveux diffèrent des autres matrices par leur avantage
d’avoir une plus grande fenêtre de détection (Table 3), qui permet de suivre une
consommation chronique des substances. Après incorporation dans le cheveu, une substance y
demeure jusqu'à ce que le cheveu tombe. Il a ainsi été possible d’identifier de la cocaïne et ses
métabolites dans les cheveux de momies chiliennes et péruviennes vieilles de plus de 3000
ans (Cartmell et al., 1991; Springfield et al., 1993).
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L’intérêt majeur des analyses de substances dans les cheveux réside dans le fait que cette
matrice biologique permet de suivre une consommation chronique de drogues et de
médicaments pendant un intervalle de temps très long, qui n’est pas couvert par les analyses
habituelles.
Table 3. Comparaison des fenêtres de détection des substances dans les différentes matrices
biologiques
Echantillon
biologique
Sérum
Urine
Salive
Sueur
Cheveux
Durée de détection des Informations
drogues
3 h à 24 h
Evaluation de la
toxicité, dosage des
drogues et
médicaments
6 h – 2j
Dépistage des
drogues et des
médicaments
1 h à 24 h
Concentration
proche de celle du
plasma
Quelques jours (dépend Dépistage
de la durée du port du
patch)
1 mois(dépendant de la Consommation
longueur des cheveux) chronique
Remarques
Le sang doit être rapidement prélevé,
homogénéisé et refroidi, puis
transféré immédiatement au
laboratoire
Min 20 ml, conserver à 4°C jusqu’à
1-2 jours, puis au congélateur
Utilisation de salivette
Utilisation de patch
Facilement stockable et transportable
Les analyses de sang et de salive ne permettent de suivre une consommation que pendant
quelques heures, alors que l’urine et la sueur présentent des fenêtres de détection de quelques
jours. En revanche, puisque les cheveux poussent en moyenne entre 0.8 et 1.4 cm/mois,
chaque cm est en moyenne le témoin mensuel de l’exposition aux substances et ainsi l’analyse
des cheveux permet de dresser un calendrier rétrospectif de la consommation d’un individu.
La consommation peut être suivie jusqu’à plusieurs mois, voire même des années, le seul
facteur restrictif étant la longueur du cheveu disponible. En outre l’analyse segmentaire des
cheveux est devenue aujourd’hui un outil indispensable quand il s’agit de dresser le profil
d’un individu dépendant aux drogues, à l’alcool et aux médicaments. Un des inconvénients
est que les quantités des substances présentes sont généralement assez faibles, ce qui nécessite
des techniques d’analyse très spécifiques et sensibles. De même, la prise unique de stupéfiants
ou médicaments est difficile à détecter dans les cheveux. Par ailleurs, les résultats quantitatifs
qui en découlent doivent être considérés avec beaucoup de précaution vu que la croissance du
cheveu n’est pas continue et que des phénomènes de migration à l’intérieur du poil ne peuvent
pas être exclus.
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I.2.3. Mécanisme d’incorporation des drogues dans les cheveux
L’incorporation de substances dans les cheveux est très complexe. Nombreuses études ont
été menées afin d’étudier le mécanisme d’incorporation des drogues dans les cheveux. Le
délai d’apparition d’une substance, défini entre l’administration orale ou parentérale et son
apparition dans les cheveux, est variable. Trois modèles ont été envisagés: la diffusion passive
ou active du sang vers les cellules en croissance du bulbe pileux, la diffusion externe à partir
des sécrétions sudorales ou sébacées, ou une contamination passive due aux vapeurs ou
poudres dans l’air ambiant (Pötsch et al., 2004). Une vue schématique des voies
d’incorporation de substances est représentée dans la Figure 7.
Figure 7 : Schématisation des voies d’incorporation de substance
Lors de la formation du cheveu, les cellules en contact avec le sang piégeraient donc les
substances qui sont directement séquestrées dans la moelle du cheveu où elles ne pourront
plus être enlevées sans dénaturation des protéines. L’incorporation des substances dépend
fortement de la lipophilicité et du pH (Nakahara et al., 1994), ainsi que de l’affinité pour la
mélanine, ainsi les substances lipophiles et basiques sont incorporées plus facilement, que
celles qui sont hydrophiles et acides. Les substances mères sont détectées à des concentrations
plus élevées que leurs métabolites. La troisième voie qui est uniquement produite in vivo par
métabolisation de la substance. Les sécrétions des glandes sudoripares parviennent jusqu’à
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l’intérieur du cortex où de fortes interactions permettent aux protéines de lier les diverses
molécules.
Finalement, la fixation des substances dans les cheveux peut aussi s’effectuer par le biais
de l’environnement atmosphérique. Néanmoins, la contamination par voie passive entraîne
une interaction moins forte avec la matrice, ce qui permet d’éliminer une grande partie des
substances par des procédés de décontamination adéquats. Ainsi, des lavages à l’aide de
solutions aqueuses et/ou de solvants organiques pendant des temps d’incubation et des
températures différentes devraient permettre d’éliminer largement la contamination passive
(Schaffer et al., 2005).
I.3. Les marqueurs de l’alcool
L’éthanol n’étant détectable que pendant une période très courte dans le corps humain
puisqu’il est métabolisé. La recherche s’est ainsi focalisée à l’identification de métabolites ou
marqueurs biologiques afin de diagnostiquer la consommation excessive et chronique
d’alcool.. Ces analyses sont utiles dans des cas où l’abus d’alcool peut être dangereux, tels
que la conduite, la grossesse, le lieu de travail, en cas d’adoption ou garde d’enfant et encore
dans des situations de violence intrafamiliale ou procédure de divorce.
Les marqueurs biologiques traditionnels d’une surconsommation d’alcool sont : la
transferrine déficiente en carbohydrates (CDT), la γ-glutamyltransférase (γ-GT), le volume
globulaire moyen (VGM). Néanmoins, ceux-ci peuvent être influencés par des médicaments
ou des maladies et dépendent fortement de l’âge et du sexe du sujet. C’est pour cette raison,
que de nos jours, de plus en plus de marqueurs directs de l’éthanol sont utilisés ; ils ont
l’avantage d’être plus spécifiques et peuvent être détectés avec une plus grande sensibilité,
leur fenêtre de détection étant bien plus large. Dans le sang on peut ainsi détecter le
phosphatidyléthanol (PEth), dans le sérum et l’urine l’éthylsulfate (EtS) et l’éthylglucuronide
(EtG) et finalement dans les cheveux, l’éthylglucuronide et les éthylesters d’acides gras
(FAEE). Les deux derniers marqueurs directs de l’éthanol, l’EtG et les FAEEs, semblent donc
idéals pour le suivi précis de la consommation d’alcool sur une longue durée, car ils sont
détectables dans les cheveux. Des études de comparaison des deux marqueurs montrent que
les FAEEs autant que l’EtG sont adéquats, mais que l’analyse des deux marqueurs combinés
permet d’avoir des résultats plus pertinents (Yegles et al., 2004 ; Pragst et Yegles, 2008). Il
s’avère que les FAEEs peuvent fournir de faux positifs (Hartwig et al., 2003) , lorsque les
cheveux étaient traités avec des lotions capillaires à base d’éthanol, ce qui n’est pas le cas
pour l’EtG (Martins F. et al, 2011).
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I.3.1 L’éthylglucuronide
L’éthylglucuronide (EtG) (Figure 8), un métabolite de phase II de l’éthanol, qui a donc
l’avantage d’être un métabolite direct, donc plus spécifique et qui n’est formé que in vivo
notamment dans le foie, a prouvé être un marqueur prometteur (Dahl et al., 2002).
Figure 8 : L’éthylglucuronide
Chez l’humain, l’éthanol est essentiellement métabolisé par oxydation dans le foie (9095%) et aussi en faibles quantité dans les reins, poumons et la peau. La réaction de
conjugaison de l’éthanol avec l’acide glucuronique, activé par l’uridine-5’-diphosphate
(UDP), est catalysée par l’UDP-glucuronosyl-transférase et forme l’éthylglucuronide (Figure
9), qui ne représente que 0.02 à 0.06% de l’élimination totale de l’éthanol (Dahl et al., 2002;
Goll et al., 2002). L’EtG est une substance non-volatile et soluble dans l’eau, qui ne se lie que
faiblement aux cheveux kératinisés à cause de ses propriétés hydrophiles et de son acidité et
n’est donc retrouvé que dans l’ordre du picogramme par milligramme de cheveu dans les
analyses de cheveux.
Figure 9 : Réaction chimique de la synthèse de l’EtG à partir de l’éthanol
L’EtG a été isolé pour la première fois en 1952 par Kamil et al. dans l’urine de lapins et
plus tard par Jaakonmaki et al. dans l’urine d’humains (1967).
Après une consommation d’alcool, l’EtG peut être détecté jusqu’à 18 heures dans le sang
et jusqu’à 80 heures dans les urines. Les analyses d’EtG dans le sang et les urines sont de nos
jours appliquées de façon routinière pour déterminer une consommation d’alcool récente.
La première découverte d’EtG dans les cheveux a été faite par Sachs en 1993 (Sachs,
1993) et un an après par Aderjan et al. (Aderjan et al., 1995) et Skopp et al. (Skopp et al.,
1995). Grâce à sa détermination dans les cheveux, il s’est avéré un marqueur pertinent de la
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consommation chronique et répétée d’alcool. En accord avec la Society of Hair Testing
(Society, 2004), l'hypothèse d'une croissance de cheveux de 1cm/mois est employée pour
comparer l’historique de la consommation d'alcool à la concentration d'EtG dans les différents
segments de cheveux.
L’optimisation de la méthode CG/SM-ICN pour une meilleure sensibilité de la
détermination analytique de l’EtG a rendu possible de différencier entre abstinents, buveurs
occasionnels et buveurs excessifs. Yegles et Pragst (Yegles et al., 2005; Pragst et al., 2007)
ont proposé des seuils qui rendent possible la différenciation entre abstinents ou buveurs peu
fréquents et buveurs occasionnels, utilisant un seuil de 7 pg/mg et des concentrations
supérieures à 25 pg/mg permettent d’indiquer une surconsommation d’alcool chronique.
Finalement, la concentration d’EtG, discriminant les buveurs occasionnels des buveurs
excessifs répétés, a été fixée à 30 pg/mg par la Society of Hair Testing (Kintz, 2012).
Ces seuils ne sont valables que pour les cheveux de la tête. En cas d’absence des cheveux
tous les autres poils du corps peuvent être analysés à l’exception des poils pubiens, dû au
risque de contamination par l’EtG urinaire. (Kerekes et al., 2009).
Des études récentes ( Politi et al., 2006; Appenzeller et al., 2007; Kerekes et al., 2009) ont
démontré l’existence d’une relation entre les concentrations d’EtG dans les cheveux de la tête
et la quantité d’alcool consommée. Par ailleurs, aucune différence entre homme et femme n’a
été rapportée de nos jours pour l’EtG, ni de différence entre les couleurs de cheveux, ce qui
indique que l’EtG n’est pas dépendant de la quantité de mélanine présente dans le cheveu.
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I.4. Impact des traitements cosmétiques sur les cheveux
Le cheveu constitué par ses trois couches : la cuticule, le cortex et la moelle, peut être
victime d’un grand nombre de modifications. La cuticule étant une simple barrière
imperméable du cheveu, nombreux produits sont capables de rompre cette protection, tel
l’ammoniaque qui va gonfler les cheveux et ouvrir les écailles de la cuticule afin de permettre
aux autres produits de s’infiltrer au centre du cheveu et effectuer des modifications. Un grand
nombre de liaisons joue un rôle important dans la structure et la couleur de notre chevelure.
Un cheveu à l’état naturel est constitué à 50% de kératine donnant sa forme et sa
résistance, c’est une protéine de structure hélice α. Cette hélice est stabilisée par des ponts
hydrogène et les hélices sont maintenues entre elles par des ponts disulfures, des liaisons
ioniques (ponts salins) et des forces de Van der Waals (Figure 10).
Figure 10 : Les liaisons de cohésion de la kératine
Les liaisons se trouvant entre les chaînes peptidiques ou au sein d’une hélice peuvent être
facilement rompus. Ces différentes forces de cohésion vont être modifiées lors des traitements
cosmétiques capillaires. Par exemple, les ponts hydrogène peuvent tout simplement
disparaître par l’effet de l’eau, lorsqu’on mouille le cheveu, ce qui va lui donner une autre
élasticité et le raidir. Puis, les ponts hydrogènes peuvent être rétablis dans des positions
différentes lors d’un brushing ou d’une mise en pli. Un simple étirement du cheveu, va ainsi
remplacer momentanément la structure en hélice α par une structure en feuillet β et rendre aux
cheveux un aspect lisse (Berrada, 2008).
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I.4.1. Décoloration
La décoloration correspond à un traitement d’oxydation alcaline lors duquel sont utilisées
des lotions contenant d’une part 6 à 12% de peroxyde d’hydrogène en présence
d’ammoniaque (agent alcalin) et d’autre part du persulfate d’ammonium et de potassium. Ces
deux lotions sont mélangées au moment de l’application activant ainsi l’eau oxygénée
possédant un fort pouvoir oxydant. Le milieu alcalin du mélange permet une réactivité régulée
et contrôlée de l’oxydant et les persulfates en solution aqueuse libèrent davantage d’eau
oxygénée selon la réaction suivante :
K+-O3S – O – O – SO3- K+ + 2 H2O  2 K+HSO4- + H2O2
Le peroxyde d’hydrogène va réagir avec les pigments de la mélanine, facilement
oxydables. Des liaisons contenues dans les mélano-protéines, constituant la mélanine donnant
la couleur au cheveu, seront rompues et de nouveau pigments, solubles dans l’eau, seront
formés et éliminés au lavage. L’oxydation n’étant pas sélective, elle va également affecter les
chaînes polypeptidiques du cheveu qui seront endommagées lors de ces traitements et
transforme la surface du cheveu en une surface rêche et trouée (Figure 11), permettant ainsi
plus facilement l’élimination d’analytes lors du lavage d’échantillons capillaires.
Figure 11 : Représentation du cheveu naturel et du cheveu décoloré
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I.4.2. Permanente
La permanente est un procédé de frisage composé de trois étapes selon la figure 12.
Figure 12 : Les étapes du traitement de la permanente
Une première étape, qui consiste à mouiller les cheveux et à les enrouler sur des bigoudis,
afin de décaler le positionnement des chaines polypeptidiques de la kératine. La deuxième
étape est basée sur l’utilisation d’un produit réducteur qui provoque la rupture des ponts
disulfures.
La solution réductrice est à base de sels de l’acide thioglycolique, en général le thioglycolate
d’ammonium, en milieu alcalin. Le thioglycolate d’ammonium est activé en présence d’une
solution d’hydroxyde d’ammonium formant ainsi le thiolate d’ammonium selon la figure 13.
Figure 13 : Formation du thiolate d’ammonium à partir du thioglycolate d’ammonium
La liaison par pont disulfure est une liaison formée à partir de deux cystéines, acide
aminé de la kératine, en associant les groupements –SH pour donner la cystine avec la liaison
–S-S- selon la Figure 14.
Figure 14 : Formation des ponts disulfures entre deux cystéines
Cette deuxième étape de la permanente génère ainsi la réaction en sens inverse, afin de
rompre les ponts disulfures, selon la réaction d’oxydo-réduction suivante :
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Oxydation :
2 RS-
Réduction :
K-S-S-K
Bilan :
2 RS- +
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
R-S-S-R
+ 2 e-

2 KS-
K-S-S-K

R-S-S-R
+
2 e-
+
2 KS-
thiolate d’ammonium kératine oxydée
kératine réduite
Finalement, la troisième étape consiste à fixer la forme imposée par les bigoudis au
cheveu. Ceci se fera par reconstitution de ponts disulfures par oxydations des cystéines avec
une lotion oxydante, contenant du peroxyde d’hydrogène à faible concentration.
Oxydation :
2 KS-
Réduction :
H2O2
Bilan :
2 KS- +

K-S-S-K
+ 2 e-

2 OH-
H2O2 
K-S-S-K
kératine réduite
+
+
2 e-
2 OH-
kératine oxydée
Les ions alcalins (OH-) sont neutralisés par l’acidité de la solution de fixation (pH = 4),
contenant l’acide phosphorique.
I.4.3. Coloration temporaire
La coloration des cheveux peut varier selon la persistance de couleur recherchée. Il existe
en effet trois types de coloration : la coloration permanente, la coloration semi-permanente et
la coloration temporaire. Les deux premières sont des colorations oxydantes qui reposent sur
un principe de combinaison de deux composants, qui créent le colorant après adsorption dans
le cheveu. On obtient un produit colorant peu soluble, fortement adsorbé et très peu sensible à
l'élution. L'avantage décisif est une bonne uniformité de la couleur et une durée plus longue.
La phase d'oxydation se fait en présence d'eau oxygénée en milieu légèrement basique
(pH = 9), ce qui repose sur un phénomène de décoloration.
La coloration temporaire se fait à l’aide de mousses ou de crèmes colorantes. Ce sont des
colorants directs qui se déposent sur la surface de la cuticule, recouvrant ainsi les écailles. Ils
ne pénètrent pas dans le cheveu, mais restent à la périphérie du cortex, et ne modifient pas la
mélanine naturelle du cheveu. Ces colorants ont une durée de 4 à 6 shampooings et colorent
dans le même ton, soit légèrement plus foncé.
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Figure 15 : Principaux colorants dans les colorants temporaires
Cette petite nuance de ton est en général due à un mélange de nitrophénylèndiamines
(NPDA), des nitroaminophénols ou des colorants azoïques, solubles dans des solvants comme
le cyclohexanol, tels que représentés sur la figure 15.
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I.5. Influence des traitements cosmétiques sur la concentration de
l’éthylglucuronide dans les cheveux
Comme l’apparence physique prend une position de plus en plus importante dans notre
société, de nombreuses femmes, ainsi que d’hommes ont davantage recours à des produits
cosmétiques. Le blanchissement des cheveux étant inévitable avec l’âge et l’aspect des
cheveux influant énormément sur l’aspect physique, on retrouve de plus en plus de personnes
amenées à colorer ou à déteindre leurs cheveux.
Diverses études ont déjà mis en évidence l’influence des traitements cosmétiques sur la
concentration de drogues et médicaments dans les cheveux. Ainsi la concentration en cocaïne,
amphétamines, opiacés et THC connaissent une baisse considérable après décoloration des
cheveux allant de 60 à 90%, mais néanmoins les échantillons ne deviennent pas forcément
négatifs (Martins F. et al., 2008, Yegles, 2005, Yegles et al., 2000).
L’éthylglucuronide et les FAAEs sont devenus des marqueurs de référence pour le
dépistage de la consommation chronique d’alcool. Il reste toutefois plusieurs questions à
élucider concernant particulièrement l’influence sur la teneur de ces marqueurs dans les
cheveux lors de divers traitement cosmétiques.
Une recherche récente a été menée afin d’étudier l’effet de lotions capillaires, contenant
un volume de 44% d’éthanol, sur l’éthylglucuronide. Les résultats indiquent que ces produits
cosmétiques n’ont aucun effet sur la concentration de l’EtG (Martins F. et al., 2011),
contrairement aux FAEEs (Hartwig et al., 2003 ). En effet, la teneur en FAEEs est fortement
augmentée suite à un traitement cosmétique avec des produits contenant de l’alcool à l’origine
donc des résultats faussement positifs.
Lors de cette étude, les différences de concentrations ont été étudiées non seulement pour
les concentrations de FAEE extraites des cheveux, mais également celles éliminées en surface
des cheveux lors des lavages. Les résultats des lavages ont démontré que les cheveux traités
avaient moins de FAEE en surface. Cependant, la concentration interne des FAEEs, sur les
quelques cas étudiés, ne variait que de 5% lors d’une permanente et de 8% lors d’une
décoloration, ce qui n’est pas suffisant pour douter de l’utilisation des FAEEs comme
marqueurs de l’alcool dans les cheveux. Néanmoins, quelques produits cosmétiques contenant
de l’alcool peuvent donner une concentration de FAEE plus élevée, ce qui pourrait amener à
des faux positifs
Une baisse unique de 78% de la concentration de l’EtG suite à une décoloration a été
mise en évidence démontrant l’importance du traitement cosmétique pour l’interprétation
correcte des résultats d’EtG (Yegles, 2005). Récemment, une étude indique que la
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décoloration du cheveu rendait l’EtG indétectable dans des échantillons positifs (Morini et al.,
2010). Ces deux études présentent donc des résultats non cohérents. Il est néanmoins à noter
que différentes méthodes d’extractions et de détection ont été utilisées pouvant être à l’origine
de ces résultats non cohérents. Par ailleurs, Morini et al. été confronté à des problèmes
d’interférences de matrice avec sa méthode de routine par CL/MS/MS à l’origine de
suppressions d’ions. C’est pour cette raison qu’il a été amené à adapter la méthode en utilisant
des colonnes SPE pour l’extraction. Le mécanisme responsable de cette baisse n’est pas
encore élucidé et deux hypothèses peuvent être proposées : une dégradation chimique de
l’EtG par le peroxyde d’hydrogène ou bien une élimination physique à partir de la kératine
endommagée.
Concernant l’effet de la décoloration, une étude in vitro a déjà été effectuée par Morini et
al en utilisant du peroxyde. Lors de ces tests in vitro, la baisse d’EtG n’était que de 50%.
Comme lors de la comparaison de l’EtG des cheveux décolorés et non décolorés, il a observé
une baisse de 100% , il a conclu que la baisse est due essentiellement à un relargage physique
de l’EtG du cheveu abîmé lors du traitement.
Il est donc important de connaître l’influence de tels produits, utilisés quotidiennement
par les gens, afin de pouvoir affirmer avec certitude les résultats obtenus.
I.5.1. Objectif du travail
La présente étude aura ainsi pour objectif d’étudier plus en profondeur l’influence des
traitements cosmétiques sur la stabilité de l’EtG. Les traitements cosmétiques choisis pour
cette étude sont : la décoloration, la permanente et la coloration temporaire. Le travail sur la
décoloration devrait également permettre d’apporter des éléments de réponse sur les résultats
non cohérents des études de Yegles et al (2005) et Morini et al (2010).
Des tests in vitro menés sur l’EtG en présence des produits chimiques de base des
traitements cosmétiques, tels que l’eau oxygénée et le thioglycolate d’ammonium, apporteront
d’éventuelles informations sur la réactivité de l’EtG et ainsi sur la dégradation de ce
marqueur.
Les résultats obtenus lors de cette recherche permettront de mieux interpréter les résultats
obtenus lors des analyses sur l’EtG dans les cheveux. De plus, ils détermineront si la méthode
utilisée peut être déterminative ou dans d’autres cas permettre de mieux adapter les méthodes
d’analyse. D’autre part, cela permettra de mieux évaluer les faux-négatifs obtenus
éventuellement.
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II. MATÉRIEL ET MÉTHODES À METTRE EN ŒUVRE
Pour pouvoir étudier la stabilité de l’EtG dans les cheveux lorsque ceux-ci sont soumis à
des traitements cosmétiques, tels que la coloration, la décoloration ou la permanente, des
échantillons de cheveux de personnes volontaires ou de sujet d’autopsie dont les habitudes de
consommation d’alcool ont été régulières, ce qui signifie en d’autres termes qu’elles
consomment régulièrement les mêmes quantités de l’alcool, ont été collectés. Ces échantillons
sont soumis in vitro aux différentes conditions expérimentales avant d’être analysés par après
et comparés à ceux qui n’ont pas été soumis aux épreuves précédentes.
Pour cette étude, il était important de travailler essentiellement avec des échantillons de
cheveux positifs. Pour 35 sujets sur 40 aucune information n’était connue sur les habitudes de
consommation d’alcool à part le rapport d’autopsie indiquant un taux très élevé d’alcool dans
le sang. Pour les 5 autres cas, où une dose d’alcool par jour était connue.
En ce qui concerne le dosage de l’EtG, il sera d’abord extrait des divers échantillons de
cheveux et finalement dosé par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie
de masse à ionisation chimique négative selon une méthode mise au point à la division de
Toxicologie du Laboratoire National de la Santé (Kerekes et al., 2008, Martins F. et al.,
2011).
II.1. Prélèvement des cheveux
Le prélèvement de cheveux se fait au niveau du vertex postérieur. Une mèche de cheveux
de la taille d’un crayon est tout d’abord solidement fixée à l’aide d’une cordelette à 1 cm à la
base du crâne. L’échantillon est prélevé le plus près du cuir chevelu à l’aide d’une paire de
ciseaux (Figure 16). Le fil permet d’indiquer l’extrémité de la racine. Les cheveux sont
finalement conservés à température ambiante dans un tube sec, dans une enveloppe ou bien
entre deux feuilles d’aluminium.
Figure 16 : Prélèvement d’un échantillon de cheveux
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II.2. Traitement cosmétique des cheveux
Les échantillons de cheveux prélevés sont divisés en deux parts égales, de manière à ce
que chaque part contienne des cheveux allant de la partie coupée près de la racine à la pointe.
Les cheveux ont été coupés en segments de 3 cm à maximum 6 cm, selon leur abondance et
taille. Une part sera analysée pour obtenir le taux d’éthylglucuronide non traité, alors que
l’autre part sera traité par un des trois traitements cosmétiques choisis pour l’étude.
Ces échantillons seront soumis in vitro aux conditions expérimentales prévu par le traitement
selon la notice d’utilisation fournie, puis analysés afin de comparer le taux d’EtG aux cheveux
non traités.
II.2.1. Décoloration
La décoloration des cheveux a été faite à l’aide du produit « Schwarzkopf Blonde Intensive
Blond Strong » constitué d’une part d’une crème à blondir à base d’eau, alcool, parfum,
sodium laureth sulfate et silicate de sodium, d’autre part d’une poudre activatrice à base de
sulfate et de persulfate de potassium et puis d’une émulsion révélatrice à base d’eau
oxygénée. Ce produit ne contient pas d’ammoniaque, le mélange étant néanmoins basique
(pH=8.8).
La préparation du produit se fait en mélangeant la poudre activatrice et la crème à blondir
avec l’émulsion révélatrice. Le mélange est appliqué directement sur le cheveu sec et agira
pendant 45 minutes. Ensuite, le produit est rincé et le cheveu lavé afin d’être analysé.
II.2.2. Permanente
Le traitement cosmétique pour la permanente a été fait avec le produit « Poly Lock Intensiv
de Schwarzkopf Permanente forte ». Il contient une lotion à permanenter à base de
thioglycolate d’ammonium et d’hydroxyde d’ammonium. La lotion à permanenter (pH=8) est
appliquée sur les cheveux mouillés, enroulés et agit pendant 25 minutes. Ensuite, le produit
est rincé et une lotion de fixation (pH=4), à base de peroxyde d’hydrogène et d’acide
phosphorique, est appliquée pendant 15 minutes. Finalement, la lotion est rincée et le cheveu
lavé afin d’être analysé.
II.2.3. Coloration temporaire
Le produit « L’Oréal Paris Si Naturelle Châtain » a été utilisé pour la coloration
temporaire. Ce produit contient de l’eau et une série de colorants, tels que : HC blue N°2
[2,2'-((4-((2-Hydroxyethyl)amino)-3-nitrophenyl)imino)bis(ethanol)], HC Yellow N°7 [1-(4’-
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Aminophenylazo)-2-methyl-4-(bis-2-hydroxyethyl)aminobenzene], HC red N°7 [1-Amino-2nitro-4-(ß-hydroxyethyl)-aminobenzene]
et
HC
violet
N°
1
[1-Amino-2-nitro-4-(ß-
hydroxyethyl)-aminobenzene], ainsi que le 4-amino-3-nitrophenol.
Ce produit est appliqué directement sur le cheveu et le temps de pose est de 30 minutes,
après lequel les cheveux sont rincés et lavés.
II.3. Tests in vitro sans cheveux
II. 3.1 Tests avec l’eau oxygénée
Afin de tester la réactivité entre l’EtG et le peroxyde d’hydrogène, une dose de 1000 et
de 2000 pg d’EtG a été incubée avec 100 µl d’eau oxygénée 30% et 100 µl d’eau distillée
pendant 45 minutes. Le test a également été répété pour les concentrations de H2O2 suivantes :
3,75%, 7,50%, 22,5% et 30%. Ce test a été fait à deux reprises et une fois en présence de 10
mg de cheveux négatifs en EtG. Ensuite, l’eau oxygénée est décomposée à l’aide de charbon
actif en eau et dioxygène, puis le mélange est évaporé sous flux d’azote à 100°C pour
accélérer la décomposition.
Par la suite, 2000 pg d’EtG-D5 ont été ajoutés avec 2 ml d’eau et les échantillons ont été
purifiés sur colonnes SPE et dérivatisés avec HFBA afin d’être analysés par CG/SM-ICN.
II.3.2. Tests avec le thioglycolate d’ammonium
Le traitement de la permanente repose en premier lieu sur l’utilisation d’un produit à base
de thioglycolate d’ammonium, sel de l’acide thioglycolique. Ensuite, un deuxième produit à
base de peroxyde d’hydrogène en faible concentration (2%) est utilisé pour fixer la nouvelle
structure du cheveu. Cependant, la dose de peroxyde est si faible qu’elle ne décolore pas les
cheveux, donc probablement la concentration est trop faible pour interagir avec l’EtG dans la
matrice. Les tests in vitro effectués ont ainsi été menés en faisant interagir l’EtG avec le
thioglycolate d’ammonium en présence d’ammoniaque. Une dose de 1000 pg, respectivement
2000 pg, d’EtG a été incubée avec 1 ml de thioglycolate d’ammonium (5%) à pH = 8. Dans
ces conditions se forme le thiolate d’ammonium, connu pour la réduction des ponts disulfures.
L’EtG sera mis en contact pendant 30 minutes, le mélange est ensuite évaporé et le
standard interne est ajouté. Finalement, les échantillons seront purifiés sur colonnes SPE et
dérivatisés avec HFBA afin d’être analysés par CG/SM-ICN.
33
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II.4. Méthode d’extraction
II.4.1. Décontamination et traitement des cheveux
Les échantillons ont été lavés avec 100 mL d’eau puis 100 mL d’acétone à deux reprises,
afin d’éliminer les restes de produits de beauté. Puis, ils ont été séchés et coupés en petits
segments de quelques millimètres à l’aide de ciseaux. Par la suite, ils ont été pulvérisés dans
un broyeur à billes (Retsch, Haan Germany) et 20-30 mg ont été prélevés et additionnés de 2
mL d’eau déminéralisée. Afin d’extraire l’éthylglucuronide des cheveux, les échantillons sont
soumis à 2h d’incubation dans un bain à ultrasons (Elma Transsonic Tl-H-15). Finalement, 2
ng de EtG-D5, l’éthylglucuronide deutéré utilisé en tant que standard interne, sont introduits,
puis les échantillons sont centrifugés (10 min à 5000 tpm, Sigma 4-15 Germany).
Figure 17 : L’éthylglucuronide deutéré – standard interne
II.4.2. Purification de l’EtG sur phase solide
Pour la purification par extraction en phase solide (SPE), le surnageant est déposé sur des
cartouches Oasis MAX 3cc (60 mg) (Waters), conditionnées avec 2 mL de méthanol et 2 mL
d’eau. L’EtG est élué par lavage avec 1 mL d’eau/ammoniaque (5%), puis 2 mL de méthanol.
Les colonnes sont séchées sous vide pendant 5 min. Puis l’EtG est élué avec 2 mL d’acide
formique (2%) dans le méthanol et évaporé sous flux d’azote dans un block chauffant à 37 °C.
II.4.3. Dérivation
Pour être correctement analysés en chromatographie en phase gazeuse, les analytes requièrent
deux conditions : ils doivent être volatilisables et thermiquement stables. Afin d’accomplir
ces conditions, les produits sont alors modifiés chimiquement ; on parle de la dérivation. Une
dérivation est une réaction chimique, consistant à greffer par une réaction d’acylation des
groupements donnés sur les atomes d’oxygène ou d’azote de la substance à analyser.
Dans ce cas, le résidu est dérivatisé avec 100 µL d’anhydride heptafluorobutyrique (HFBA)
(Figure 18) pendant 30 min à 60 °C. Le mélange est évaporé sous azote, puis reconstitué dans
50 µL d’acétate d’éthyle.
34
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Figure 18 : Schéma de l’acétylation de l’EtG donnant la molécule recherchée sur le spectre SM
Ce type de modification chimique présente de nombreux avantages en CG-SM, tel
qu’une augmentation de la volatilité des substances polaires en chromatographie gazeuse et
une diminution sur la phase stationnaire des phénomènes d’adsorption des fonctions polaires,
tels que les amines, alcools, acides, ce qui conduit à une meilleure symétrie des pics.
II.5. Méthode d’analyse par CG/SM-ICN
Les analyses de l’éthylglucuronide ont été réalisées à l’aide d’un chromatographe à gaz
7890A (Agilent) équipé d’un détecteur de masse sélective 5975C (Agilent) et un injecteur
7993 (Agilent). Trois µl de chaque échantillon sont injectés dans une colonne capillaire HP5MS (5% phényle méthyle siloxane) (longueur 30 m x diamètre 0.25 mm x épaisseur du film
0.25 µm) de J&W Scientific (Agilent Technologies). Le gaz vecteur est l’hélium qui débite
avec un flux constant de 1ml/min. La température de l’injecteur est de 250°C et celle du
détecteur est de 280°C. Le four est maintenu initialement à 100°C pendant 2 minutes avant
d’être chauffé à 170°C à un taux de 10°C/min, puis à une température finale de 310°C à
40°C/min. Le temps d’exécution total est de 14.50 min. Le détecteur opère en mode ICN
(Ionisation Chimique Négative) et les données sont acquises en mode SIM (Selected Ion
Monitoring). Les ions précurseurs observés sont : m/z 397, 596 pour EtG et m/z 601 pour EtGD5. Le gaz ionisant est le méthane. Les données sont enregistrées par l’ordinateur grâce au
programme Chemstation Version D.04.00 de Hewlett-Packard.
35
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II.5.1. La spectrométrie de masse à ionisation négative
La fragmentation obtenue est fortement dépendante de la technique utilisée en
spectrométrie de masse. Deux techniques existent et diffèrent par leur source, l’ionisation
chimique et l’impact électronique. Le mode ionisation chimique (IC) a été utilisé et se traduit
par un transfert indirect de l’énergie permettant d’obtenir une fragmentation moins importante
et plus douce que dans la méthode par impact électronique (IE). Grâce à cette faible
fragmentation on devrait obtenir des spectres où le pic moléculaire est facile à déterminer.
Pour la détection, le mode d’ionisation chimique négative (ICN) est le plus adapté et efficace.
Il consiste à ioniser en premier lieu le gaz réactant (CH4) par collision avec des électrons
primaires. Ces ions primaires en présence d’électrons thermiques (CH4+ + 2étherm.), d’énergie
plus basse que les électrons du filament, vont par la suite produire des ions négatifs (M-∙) par
collision avec la molécule à analyser (M). Ceci est connu sous le nom de capture électronique
et c’est ce qui rend l’ICN aussi sensible. La sensibilité des analyses ICN est souvent 10 fois
supérieure à celle des analyses IE à cause de l’absence de l’ionisation des molécules non
électronégatives. En général, l’ionisation chimique négative est utilisée dans des cas
d’analyses de molécules électronégatives contenant des groupements tels que F ou NO2. Ainsi
les échantillons sont dérivatisés avec de l’anhydride heptafluorobutyrique (HFBA), ce qui
permet d’augmenter la sensibilité de détection grâce à la présence des atomes de fluor.
II.5.2. Droite de calibration et paramètres de validation
L’établissement d’une droite de calibration se fait à l’aide des talons internes. Cette droite
de calibration donne le rapport des concentrations entre le standard interne, EtG-D5, et la
substance à doser, l’EtG, et s’écrit de la manière suivante :
Concentration du pic du composé à doser
Surface du composé à doser
-------------------------------------------------- = a x -----------------------------------Concentration du pic du standard interne
Surface du standard interne
Avec a = la pente de la droite
Les paramètres de validation d’une méthode sont les suivants :
la limite de détection, LOD, qui équivaut à une hauteur de signal 3 fois supérieure à la
hauteur du bruit de fond ;
la limite de quantification, LLOQ, qui équivaut à une hauteur de signal 10 fois
supérieure à la hauteur du bruit de fond.
36
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le rendement d’extraction calculé en réalisant deux extractions. La première extraction
consistant à extraire la substance à doser ainsi que le standard interne ajoutés au
milieu. La deuxième manipulation consistant à extraire seulement le milieu
biologique, le standard interne et la substance à doser étant rajoutés après l’extraction.
Le calcul du rendement d’extraction se fait en prenant le rapport des concentrations
des deux manipulations.
répétabilité intrajour (10 extraits analysés chacun une fois en une journée)
répétabilité interjour (6 extraits analysés une fois 5 jours de suite). Les résultats de
répétabilité sont exprimés par le biais du coefficient de variation (CV) :
CV = (écart-type/moyenne)x100
Les mesures sont estimées répétables si le coefficient de variation est inférieur à 15%.
la justesse des mesures représentant la variation des mesures intrajour et interjour par
rapport à une valeur cible exprimée en pourcentages.
37
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38
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III. RÉSULTATS ET DISCUSSION
III.1. Validation de la méthode
Le domaine de linéarité de la droite de calibration était de 0,4 à 120 pg/mg de cheveux et
le coefficient de détermination (r2) était de 0,99. La valeur moyenne de la LOD était de 0,12
pg/mg et la valeur de la LLOQ était de 0,40 pg/mg. Le rendement d’extraction est de 78,9 %.
En utilisant une concentration d’EtG de 40 pg/mg, les précisions intrajour et interjour étaient
respectivement de 1,40% et 1,65% et les coefficients de variation intrajour et interjour étaient
respectivement de 5,77% et 1,45%. Les mesures ont ainsi été estimées répétables puisque tous
les paramètres étaient bien inférieurs à 15%.
III.2. Détermination de l’EtG dans les cheveux
III.2.1. Décoloration des cheveux
Les échantillons de cheveux non-traités utilisés pour l’étude de la décoloration comptent
3 sujets négatifs ([EtG] < 7 pg/mg), 6 sujets positifs étant buveurs occasionnels (7 pg/mg <
[EtG] < 30 pg/mg) et 14 sujets positifs buveurs excessifs ([EtG] > 30 pg/mg). Les résultats
sont reportés dans la cinquième colonne de la table 4.
Suite à la décoloration (Table 4), les échantillons ont tous subi une baisse de
concentration en EtG. Seuls 5 des 20 sujets positifs avant traitement deviennent négatifs
([ETG] < 7 pg/mg de cheveux) suite au traitement, en considérant que le sujet numéro 20 était
déjà juste à la limite, tous les autres cas sont restés positifs (en pourpre). Ces résultats
confirment l’étude de Yegles et al (2005) et sont en contradiction avec l’étude de Morini et al
(2010) qui montrait une non-détection de l’EtG suite à un traitement de décoloration. Une des
raisons de ceci pourrait être la méthode d’analyse utilisée : la CG/SM-ICN semble ainsi moins
sensible aux interférences chromatographiques suite à la décoloration des cheveux que la
CL/SM/SM utilisée dans l’étude de Morini, responsable ainsi de faux négatifs. En effet, la
CL/MS/MS est connue pour être sensible aux interférences de matrices à l’origine d’un
phénomène de suppression d’ions. C’est pour cette raison que la méthode CG/SM-ICN
semble être la méthode de choix pour une analyse de l’EtG capillaire notamment après
décoloration.
39
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Table 4. Données des échantillons de cheveux traités par le produit de décoloration
ECHANTILLON SEXE
COULEUR
1
2
3
H
H
F
brun
blond
blond foncé
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
reste positif > 7
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
F
F
H
F
H
F
brun foncé
gris brun
brun foncé
brun foncé
brun
brun gris
gris
blond
brun
blond foncé
gris
brun
brun
blond-foncé
brun-roux
brun
noir
blond
brun gris
brun
DECOLORATION
[ETG]
LONGUEUR
Sans
traitement
5 cm
417.5
5 cm
165.7
3 cm
164.3
[ETG]
Après
traitement
117.2
6.7
26.8
163.4
44.8
73
149.4
98.7
94.8
82.2
74.0
68.6
65.2
59.3
39.2
37.7
27.1
25.6
20.8
10.6
10.0
7.0
6.8
6.7
4.7
14.3
9.3
9.2
12.1
20.1
0.8
31.5
27.0
20.2
8.5
8.5
0.9
8.8
3.9
7.9
4.4
0.9
2.8
1.4
90
91
90
85
73
99
52
54
48
78
69
96
58
63
21
37
87
58
70
2 cm
5 cm
6 cm
5 cm
6 cm
3 cm
3 cm
6 cm
1 cm
6 cm
3 cm
3 cm
3 cm
6 cm
4 cm
5 cm
3 cm
3 cm
3 cm
5 cm
Baisse (%)
72
96
84
La baisse de concentration de l’EtG varie entre 21% à 99% avec une moyenne de 71% et
une médiane de 73%, ce qui est bien visible sur le graphique de la figure 19, représentant les
23 échantillons du taux d’EtG le plus élevé au plus faible avant décoloration (bleu), puis après
décoloration (rouge).
Finalement, la baisse de concentration n’est pas en fonction de la teneur en EtG
initialement présente, ce qui est visible par exemple pour les sujets 2 à 4. Le type de cheveux
semble jouer un rôle non négligeable. Celui-ci peut varier non seulement dans la couleur et
ainsi la facilité de décoloration, réduisant le temps de pose, mais aussi dans l’épaisseur du
cheveux et sa porosité. Tous ces facteurs vont influencer l’absorption du produit décolorant et
l’interaction au sein du cheveu.
40
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Concentration EtG en pg/mg de cheveux
Concentration en EtG avant et après décoloration
450.0
Échantillons
avant
traitement
400.0
350.0
300.0
250.0
Échantillons
après
traitement
décolorant
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Échantillons
Figure 19: Histogrammes de l’EtG avant et après la décoloration
Pic 596
[EtG] = 98.7 pg/ mg de cheveu
Pic 596
[EtG] = 9.3 pg/ mg de cheveu
Figure 20 : Spectres de l’EtG – buveur excessif avant et après décoloration
41
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La figure 20 représente un exemple de spectre de masse avec les pics des ions : m/z 397
(rouge), 596 (noir) pour l’EtG et m/z 601 (bleu) pour l’EtG-D5, avant et après décoloration.
III.2.2. Permanente des cheveux
Pour l’étude du traitement de la permanente, des échantillons de cheveux ont été collectés
et comptent 3 sujets négatifs ([EtG] < 7 pg/mg), 8 sujets positifs étant buveurs occasionnels (7
pg/mg < [EtG] < 30 pg/mg) et 12 sujets positifs buveurs excessifs ([EtG] > 30 pg/mg).
Les échantillons des sujets, soumis à la permanente (Table 5), ont tous subi une baisse de
concentration en EtG. Seuls 4 des sujets positifs avant traitement restent positifs après la
permanente, les 19 autres deviennent négatifs après le traitement.
La permanente est donc un traitement bien plus agressif que la décoloration et seul des
sujets excessivement positifs, tels que les sujets 1 à 3, sont encore confirmés comme buveurs
excessifs. Les résultats de l’EtG de personnes ayant des cheveux frisés doivent être interprétés
avec beaucoup de précaution surtout si on n’a pas d’information sur l’origine naturelle ou non
du frisage de cheveux.
Table 5. Données des échantillons de cheveux traités par le produit de permanente
ECHANTILLON
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
reste positif > 7
PERMANENTE
[ETG]
SEX
COULEUR LONGUEUR
Sans
E
traitement
F
roux
6 cm
7165.4
H
gris-noir
3 cm
641.7
H
noir
6 cm
349.4
H
roux
6 cm
148.9
H
brun clair
6 cm
134.0
H
noir
5 cm
103.3
H
brun gris
3 cm
71.8
H
noir
3 cm
51.4
H
brun
6 cm
48.6
H
brun
1 cm
47.9
H
blond fonce
6 cm
46.2
H
gris-blond
6 cm
31.0
F
brun fonce
7 cm
27.7
H
brun
6 cm
17.8
H
blond-fonce
6 cm
17.5
H
brun-gris
4 cm
10.9
F
brun-roux
4 cm
10.9
H
gris
3 cm
10.0
F
gris-noir
6 cm
9.4
H
noir
3 cm
8.0
H
brun fonce
6 cm
6.4
H
brun
6 cm
5.7
H
brun fonce
3 cm
3.7
42
[ETG]
Après
traitement
67.0
53.2
31.5
6.3
3.9
5.9
9.4
5.3
2.4
2.9
4.1
2.1
1.8
0.9
2.1
décelé
décelé
1.4
décelé
0.8
0.5
1.3
0.5
décelé<LLOQ
Baisse (%)
99
92
91
96
97
94
87
90
95
94
91
93
94
95
88
86
90
92
77
87
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La baisse de concentration de l’EtG varie entre 86% à 99% avec une moyenne de 91% et
une médiane de 92%, ce qui est bien visible sur le graphique de la figure 21, représentant les
22 échantillons du second plus élevé au plus faible avant décoloration (bleu), puis après
décoloration (rouge). Les résultats trop élevés du sujet 1 ont été ignorés afin de rendre visible
l’évolution des autres sujets.
Finalement, ici aussi la baisse de concentration n’est pas forcément en fonction de la
quantité initialement présente, ce qui est visible sur la figure 21. Le type de cheveux peut
certes ici aussi jouer un rôle important.
Concentration en EtG avant et après permanente
Concentration EtG en pg/mg de cheveux
700.0
600.0
500.0
Échantillons
avant
traitement
400.0
300.0
Échantillons
après
traitement
permanente
200.0
100.0
0.0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Échantillons
Figure 21 : Histogrammes de l’EtG avant et après la permanente
III.2.3. Coloration temporaire des cheveux
Dans l’étude de la coloration temporaire, les échantillons non-traités se composent de 2
sujets négatifs ([EtG] < 7 pg/mg), 2 sujets positifs étant buveurs occasionnels (7 pg/mg <
[EtG] < 30 pg/mg) et 6 sujets positifs buveurs excessifs ([EtG] > 30 pg/mg).
Les échantillons soumis à la coloration temporaire (Table 6) ont montré des résultats de
concentration en EtG ne variant que légèrement des résultats des cheveux non-traités. En
moyenne, la concentration d’EtG ne varie que d’un pourcent.
43
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Table 6. Données des échantillons de cheveux traités par la coloration temporaire
ECHANTILLON
SEXE COULEUR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
F
H
H
H
H
H
H
H
H
H
roux
roux
brun clair
Noir
Brun
Brun
brun-gris
Gris
brun foncé
brun
LONGUEUR
6 cm
6 cm
6 cm
5 cm
6 cm
1 cm
4 cm
3 cm
2 cm
5 cm
[ETG]
Sans
traitement
9679.8
148.9
135.3
125.7
58.0
47.9
10.2
10.0
6.8
5.1
[ETG]
Après
traitement
10054.3
142.3
151.1
139.6
67.6
54.4
7.7
10.1
6.2
5.5
%
104%
96%
112%
111%
117%
114%
75%
101%
81%
98%
En général, les sujets qui étaient positifs avant le traitement, restent positifs après le
traitement de la coloration temporaire. De même, pour les sujets négatifs, il n’y a eu aucun
changement de classement. La figure 22 indiquant les concentrations en EtG des candidats,
hormis les sujets 1 (résultats trop élevés par rapport aux autres sujets), avant et après
traitement montre que malgré ces faibles variations la concentration en EtG ne varie pas
fortement et que ce traitement cosmétique n’influence guère les résultats.
De plus, il était bien visible lors des lavages que ces colorantes temporaires ne se
trouvent qu’en surface du cheveu, car lors des quatre lavages la coloration a en effet
Concentration EtG en pg/mg de cheveux
pratiquement disparu des cheveux à analyser.
160
Concentration en EtG avant et après traitement par coloration
temporaire
140
Échantillons
avant
traitement
120
100
80
Échantillons
après
traitement
avec mousse
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
Échantillons
7
8
9
10
Figure 19 : Histogrammes de l’EtG avant et après la coloration temporaire
44
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III.3. Tests in vitro sur la dégradation de l’EtG
Etant donné que la décoloration et la permanente sont à l’origine de diminutions
importantes de l’EtG dans les cheveux, il a été intéressant d’étudier la raison de cette baisse.
Dans notre étude, une quantité précise d’éthylglucuronide a été mise en contact avec les
produits chimiques de base contenus dans les divers traitements, puis analysée selon le mode
opératoire classique et la concentration d’EtG a été comparée à la concentration de départ.
La coloration temporaire n’indiquant pas changement pour l’analyse de l’EtG aucun test
in vitro n’a été effectué sur l’EtG.
III.3.1. Tests avec l’eau oxygénée
Les essais ont été effectués une fois en absence de cheveux, puis en présence de cheveux.
En absence de cheveux, une forte baisse de la concentration d’EtG, en moyenne 94% (n= 2) a
été observée. Plusieurs concentrations (3,75%, 7,50%, 15,00%, 22,50% et 30,00%) ont été
utilisées sans pour autant changer sensiblement la diminution de l’EtG.
L’interaction entre l’EtG et le peroxyde d’hydrogène seul se déroule néanmoins à un pH
proche de 6. Les produits utilisés pour la décoloration étant toujours des mélanges en milieu
basique (pH=9), le test a été répété une dernière fois en rajoutant de l’ammoniaque pour
atteindre un pH de 9. Dans ce cas, la baisse d’EtG était entre 40 et 50%, ce qui souligne que
l’ammoniaque est souvent utilisée pour réguler la réactivité du peroxyde d’hydrogène dans ce
genre de produits.
En présence de cheveux, les résultats indiquent une plus faible baisse de la concentration
d’EtG (en moyenne 33% de baisse). Probablement, la masse de cheveux, a absorbé l’eau
oxygénée qui a essentiellement décoloré le cheveu et ainsi, il ne reste pas suffisamment de
peroxyde d’hydrogène pour réagir avec l’EtG. De plus, la baisse reste à peu près constante
même en augmentant la concentration de H2O2.
On peut conclure que cette baisse non totale d’EtG en présence d’eau oxygénée indique
que la diminution de l’EtG dans les cheveux suite à une décoloration est due majoritairement
à une dénaturation chimique par le H2O2 . Néanmoins, le relargage de l’EtG des cheveux plus
ou moins abîmés lors du traitement joue un rôle, même si secondaire.
Ainsi lorsqu’on analyse l’EtG après décoloration, cette substance n’est plus détectable
étant donné que sa structure chimique a été modifiée. Il est fort probable que l’eau oxygénée
oxyde les fonctions « alcool secondaire » de l’EtG en « cétone », ce qui rendrait la
45
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dérivatisation avec HFBA impossible et nécessiterait un procédé entièrement différent. Par
ailleurs, une ouverture du cycle ou un réarrangement dans le cycle ne sont pas à exclure.
Ce travail ne confirme donc pas les résultats de l’étude de Morini et al. (2010) dans
laquelle la baisse d’EtG a été expliquée par un relargage de l’EtG de la matrice capillaire
dénaturée par le produit de décoloration.
III.3.2. Tests avec le thioglycolate d’ammonium
Les résultats des tests in vitro (n = 2) indiquent une disparition totale de l’EtG. Lors de
ces essais on était confronté avec le problème qu’également le standard interne a été affecté
par la présence du thiolate d’ammonium. Contrairement au peroxyde d’hydrogène qui peut
être décomposé par la chaleur et par le charbon actif, il s’est avéré difficile d’éliminer le sel,
thiolate d’ammonium faisant que le standard interne a également réagi avec le thiolate. Le test
a été répété en ajoutant le standard interne après extraction sur colonnes SPE et dans ce cas
l’EtG-D5 a pu être détecté, mais plus aucun EtG, celui-ci ayant donc réagi avec le thiolate.
La raison de la baisse de l’EtG après traitement par un produit de permanente est donc
essentiellement due à une dénaturation chimique de l’EtG.
46
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IV. CONCLUSION
Les traitements cosmétiques peuvent avoir des influences sur la structure des cheveux,
mais également sur la présence de nombreux xénobiotiques dans le cheveu, comme
l’éthylglucuronide. Cette étude montre clairement que la décoloration et la permanente ont un
impact important sur la teneur de l’EtG dans le cheveu, en diminuant d’une façon importante
sa concentration. Les tests in vitro indiquent qu’il y a une dénaturation chimique importante
de l’EtG en présence de peroxyde d’hydrogène, d’une part, et du thiolate d’ammonium,
d’autre part. La baisse d’EtG lors de l’analyse de cheveux décolorés ou permanentés est donc
due essentiellement à une dégradation de l’EtG par ces produits. Néanmoins, le relargage de
l’EtG des cheveux plus ou moins abîmés lors du traitement joue un rôle, même si secondaire,
notamment pour la décoloration.
La coloration temporaire des cheveux, qui n’agit pas au sein du cheveu n’a pas d’impact
sur la teneur de l’EtG dans le cheveu et n’a donc pas besoin d’être considéré lors de
l’interprétation des résultats de l’EtG dans les cheveux.
Les résultats de l’EtG dans les cheveux de sujets ayant procédé à un traitement
cosmétique, tel que la décoloration et la permanente, doivent ainsi être interprétés avec
précaution.
Dans un cas de traitement cosmétique avéré, d’autres poils du corps peuvent être analysés
étant donné que ces poils ne subissent pas, en général, de traitement cosmétique. Même si
pour ces poils aucune indication de temps ne peut être fournie, elles peuvent néanmoins
donner des informations utiles de négativité ou positivité des résultats. Un autre marqueur de
la consommation chronique et abusive de l’alcool, les FAEEs, peut également être analysé en
complémentarité, puisque les produits cosmétiques ne semblent pas affecter ce marqueur.
Il est ainsi d’une importance capitale, de recueillir toutes les informations concernant le
traitement cosmétique du sujet avant l’analyse, de manière à savoir si les cheveux sont
décolorés ou permanentés.
Comme perspective de cette étude, il serait intéressant d’élucider la réaction chimique
entre l’EtG et le peroxyde d’hydrogène, respectivement le thiolate d’ammonium, afin d’en
déduire les nouvelles molécules formées, afin de les dépister dans les cheveux. Ceci permettra
entre autre de pouvoir confirmer que les cheveux ont bien été traités par ces produits
cosmétiques.
47
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48
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V. BIBLIOGRAPHIE
ADERJAN, R. E., BESSERER, K., SACHS, H., SCHMITT, G. G. and SKOPP, G. A. (1995)
Ethyl-glucuronide. A non-volatile ethanol metabolite in human hair. in: V. Spiehler
(Ed.), Proceedings of the 1994 Joint TIAFT/SOFT International Meeting, October 31
to November 4, 1994, in: Tampa/Florida, DABFT, Newport Beach, CA: pp. 39-45
APPENZELLER, B., AGIRMAN, R., NEUBERG, P., YEGLES, M. and WENNIG, R.
(2007) Segmental determination of ethyl glucuronide in hair: A pilot study. Forensic
Science International 173 : pp. 87-92
APPENZELLER, B., SCHNEIDER, S., YEGLES, M., MAUL, A. & WENNIG, R. (2005)
Drugs and chronic alcohol abuse in drivers, Forensic Science International, 155 : pp.
83-90
BERRADA, S. (2008) Les Principaux Produits Capillaires : Composition et Propriétés,
Académie de Montpellier Journées des 17 et 18 Décembre 2008, http://sti.acmontpellier.fr/IMG/pdf/Chimie_des_produits_capillaires.pdf
CARTMELL, L. W., AUFDERHIDE, A. and WEEMS, C. (1991) Cocaine metabolites in
pre-Columbian mummy hair. J. Okla. State Med. Assoc. 84 : pp. 11-12
ANDERSON, P. et BAUMBERG, B., (2006) Commission européenne, Direction générale
Santé et protection des consommateurs : L’Alcool en Europe : Une approche en santé
publique ,
Institute
of
Alcohol
Studies,
Londres
juin
2006
http://ec.europa.eu/health/archive/ph_determinants/life_style/alcohol/documents/alcoh
ol_europe_fr.pdf
DAHL, H., STEPHANSON, N., BECK, O. et HELANDER, A. (2002) Comparison of
urinary excretion characteristics of ethanol and ethyl glucuronide, J Anal Toxicol, 26
: pp. 201-204
DIRECTION
GÉNÉRALE
DE
LA
SANTÉ
ET
DE
LA
PROTECTION
DES
CONSOMMATEURS (2007) Consommation abusive d’alcool, Fiche d’information
de la Commission européenne,
http://ec.europa.eu/health/archive/ph_determinants/life_style/alcohol/documents/alcoh
ol_factsheet_harmful_fr.pdf
EUROBAROMÈTRE, (2007) Attitudes envers l’alcool
http://www.sante.public.lu/publications/rester-bonne-sante/alcooldependances/attitudes-alcool-eurobarometre/attitudes-alcool-eurobarometre.pdf
49
Projet Travail de candidature
Kerekes Isabelle
GOLL, M., SCHMITT, G., GANSSMANN, B. and ADERJAN, R. E. (2002) Excretion
profiles of ethyl glucuronide in human urine after internal dilution. J Anal Toxicol 26
: pp. 262-266
HARKEY, M.R. (1993) Anatomy and physiology of hair. Forensic Science International 63 :
pp. 9-18
HARTWIG, S., AUWÄRTER, V., PRAGST, F. (2003) Effect of hair care and hair cosmetics
on the concentrations of fatty acid ethyl esters in hair as marker of chronically
elevated alcohol consumption, Forensic Science International, 131 : pp. 90-97
JAAKONMAKI, P. I., KNOX, K. L., HORNING, E. C. & HORNING, M. G. (1967) The
characterization by gas-liquid chromatography of ethyl-b-D-glucosiduronic-acid as a
metabolite of ethanol in rat and man. European Journal of Pharmacology, 1 : pp. 63–
70
KAMIL, I. A., SMITH, J. N. & WILLIAMS, R. T. (1952) A new aspect of ethanol
metabolism: isolation of ethyl-glucuronide. Biochemical Journal, 51 : pp. 32–33
KEREKES, I., YEGLES, M., GRIMM, U. & WENNIG, R. (2009) Ethyl Glucuronide
Dtermination: Head Hair versus Non-Head Hair, Alcohol Alcohol., 44 : pp. 62-66
KINTZ, P. (1998) Matrices alternatives et toxicologie médicolégale. In : Kintz P.
(coordinateur), Toxicologie et pharmacologie médicolégale, Elsevier : pp. 685-710
KINTZ, P. (2012) Consensus of the Society of Hair Testing on hair testing for chronic
excessive alcohol consumption . Forensic Science International, 196 : pp. 2
KRONSTRAND, R. and SCOTT, K. (2007) Drug incorporation into hair. in: Analytical and
Practical Aspects of Drug Testing in Hair. P. Kintz (Ed.), Taylor and Francis, Boca
Raton : pp. 1-23
MARTINS, F. L., YEGLES, M., THIEME, D., WENNIG, R., (2008) Influence of bleaching
on the enantiomeric disposition of amphetamine-type stimulants in hair, Forensic
Science International, 176 : pp. 38-41
MARTINS, F. L., BINTZ, T., YEGLES, M., (2011) The influence of ethanol containing
cosmetics on ethyl glucuronide concentration in hair, Forensic Science International,
in Press
MINISTERE DE LA SANTE DE LUXEMBOURG, Alcool et dépendances
(2009)
http://www.sante.public.lu/fr/rester-bonne-sante/alcool-dependances/index.html,
MORINI, L., ZUCCHELLA, A., POLETTINI, A., POLITI, L. and GROPPI, A. (2010) Effect
of bleaching on ethyl glucoronide in hair : An in vitro experiment, Forensic Science
International, 198 : pp. 23-27
50
Projet Travail de candidature
Kerekes Isabelle
MUSSHOFF, F., SACHS, H., THIEME, D., TOURNEUR, D. and MADEA, B. (2004)
Haaranalytik - Eine Einführung. in: Haaranalytik. Technik und Interpretation in
Medizin und Recht. Mussfoff, B. Madea/F., Deutscher Ärzte-Verlag : pp. 3-16
NAKAHARA, Y., TAKAHASHI, K. and KIKURA, R. (1994) Effects of the physicochemical
properties on the incorporation rates of drugs into hair. Second international meeting
clinical and forensic aspect of hair analysis: Genova, Italy, June 6-8, 1994.
RELIS, (Réseau Luxembourgeois d'Information sur les Stupéfiants et les toxicomanies)
(2010) Rapport annuel 2010 : L’état du phénomène de la drogue au Grand-Duché de
Luxembourg, http://www.relis.lu/
POLITI, L., MORINI, L., LEONE, F., POLETTINI, A. (2006) Ethyl glucuronide in hair: is it
a reliable marker of chronic high levels of alcohol consumption? Addiction, 101 :
pp.1408–1412
PÖTSCH, L. and SKOPP, G. (2004) Inkorporation von Fremdsubstanzen in Haare. in:
Haaranalytik. Technik und Interpretation in Medizin und Recht. Mussfoff, B.
Madea/F., Deutscher Ärzte-Verlag : pp. 31-101
PRAGST, F., ROTHE, M., SPIEGEL, K. and SPORKERT, F. (1998) Illegal and therapeutic
drug concentrations in hair segments - A timetable of drug exposure? Forensic
Science Review 10: pp. 82-111
PRAGST, F. et YEGLES, M. (2007) Alcohol markers in hair., In: Analytical and Practical
Aspects of Drug Testing in Hair. P. Kintz (Ed.), Taylor and Francis, Boca Raton.,
2007, pp. 287–323
PRAGST, F. et YEGLES, M. (2008) Determination of fatty acid ethyl esters (FAEE) and
ethyl glucuronide (EtG) in hair: a promising way for retrospective detection of
alcohol abuse during pregnancy? Ther Drug Monit, 30 : pp. 255-63
SACHS, H. (1993) Drogennachweis in Haaren, in: H. Kijewski (Ed.), Proceedings of the
Symposium Das Haar als Spur. Spur der Haare, November 24, 1993. Gottingen,
Schmidt-Römhild, Lübeck: pp. 119–133
SCHAFFER, M., HILL, V. A., & CAIRNS, T. (2005) Hair analysis for cocaine: the
requirement for effective wash procedures and effects of drug concentration and hair
porosity in contamination and decontamination. J. Anal. Toxicol., 29 : pp. 319-326
SKOPP, G., SCHMITT, G., DRÖNNER, P. and ADERJAN, R. (1995) Trinkverhalten und
Haaranalyse, in. T. Daldrup, F. Musshoff (Eds.), Proceedings of the 1995 GTFCh
Symposium, April 20-22, 1995, in: Mosbach/Baden, Verlag Dieter Helm,
Heppenheim : pp. 175-179
51
Projet Travail de candidature
Kerekes Isabelle
SOCIETY OF HAIR TESTING, (2004) Recommendations for hair testing in forensic cases.
Forensic Science International, 145 : pp. 83-84
SPRINGFIELD, A. C., CARTMELL, L. W., AUFDERHIDE, A., BUIKSTRA, J. and HO, J.
(1993) Cocaine and metabolites in the hair of ancient Peruvian coca leaf chewers.
Forensic Science International, 63 : pp. 269-275
WORLD HEALTH ORGANIZATION, (2004) Global Status Report on Alcohol 2004,
http://www.who.int/substance_abuse/publications/global_status_report_2004_overvie
w.pdf
WORLD HEALTH ORGANIZATION, (2010) Global strategy to reduce the harmful use of
alcohol, http://www.who.int/substance_abuse/alcstratenglishfinal.pdf
YEGLES, M. (2005) Pitfalls in hair analysis: cosmetic treatment, Ann Toxicol Anal, 17 : pp.
275-278
YEGLES, M., LABARTHE, A., AUWÄRTER, V., HARTWIG, S., VATER, H., WENNIG,
R., PRAGST, F. (2004) Comparison of ethyl glucuronide and fatty acid ethyl ester
concentrations in hair of alcoholics, social drinkers and teetotallers, Forensic Science
International, 145 : pp. 167–173
YEGLES, M., MARSON, Y., WENNIG, R. (2000) Influence of bleaching on stability of
benzodiapzepines in hair, Forensic Science International, 107 : pp. 87-92
YEGLES, M. et PRAGST, F. (2005) Cut-offs for the detection of alcohol abuse by
measurement of fatty acid ethyl esters and ethyl glucuronide in hair, Ann Toxicol
Anal, 17 : pp. 121
52