LABO – 3. MICROSCOPIE À FLUORESCENCE

101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies - ESP
Culture cellulaire et virologie
LABO – 3. MICROSCOPIE À FLUORESCENCE
DIAPHRAGME DE CHAMP
DIAPHRAGME-IRIS
OCULAIRES
CAMÉRA
PLAQUE DE CONTRASTE
LAMPE HALOGÈNE
PLATINE
SÉLECTION
OPTIQUE
Bino ou Photo
OBTURATEUR
TIGE DES FILTRES
INTERRUPTEUR
VIS MICROMÉTRIQUE
RHÉOSTAT
VIS MACROMÉTRIQUE
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1) PRÉPARATION AU MICROSCOPE INVERSÉ ORDINAIRE
1.
2.
3.
Identifier un puits d’intérêt (sans couvercle) : confluence 70-90%, avec des cellules individuelles visibles.
Avec une micropipette de 1000 µl, vidanger en aspirant au bord du puits sélectionné.
Ajouter 100 µl de solution «DAPI». Très visqueuse, couper l’extrémité de l’embout, aspirer et rejeter lentement. Réutilisable; svp récupérer à la fin.
2) INSTALLATION AU MICROSCOPE À FLUORESCENCE
1.
Obturateur (pastille orange) 1 enfoncé (bloque l’éclairage halogène)
2.
Interrupteur 2 à «ON»
3.
Rhéostat 3 à intensité moyenne
4.
Diaphragme de champ 4 remonté
5.
Diaphragme-iris 5 en position médiane («A»)
6.
Plaque de contraste 6 tirée vers l’extrême droite (pour petits objectifs)
7.
Objectif 4X 7 sélectionné (anneau rouge)
8.
Vis macrométrique 8 ; faire monter l’objectif au plus haut
9.
Placer la plaque sur la platine 9 , puits aligné sur le faisceau lumineux
4
6
12
5
10. Tige des filtres 10 tirée en position médiane (lumière verte)
11. Sélection optique 11 à «BINO» (image vers oculaires, non la caméra)
12. Via les oculaires, 12 focus avec les vis macro 8 et micrométrique 13
13. Ajuster l’éclairage au besoin (diaphragme-iris 5 et rhéostat 3 )
14. Objectif 10X (anneau jaune)
o Focus / vis macro et micrométrique
o Ajuster l’éclairage / diaphragme-iris et rhéostat
15. Objectif 40X (anneau bleu)
9
11
7
1
10
8
o Enfoncer la plaque de contraste 6 (pour objectif 40X)
o Focus / vis micrométrique seulement
o Ajuster l’éclairage / diaphragme-iris (vers «O») et rhéostat
o Identifier une zone à photographier.
Interrupteur à OFF jusqu’à ce que la caméra soit en place (prof).
13
3
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3) PRISE DE PHOTO
A) Prévisualisation en noir et blanc. (Interrupteur à ON et Sélection optique à «PHOTO».
1.
2.
3.
4.
5.
Clic sur «Preview» 1 (ouvre une fenêtre de visionnement)
Clic sur «Auto Set» 2. Clic sur «close» dans la nouvelle boîte.
Clic dans la case «Binning» 3a et choisir 4x4 3b (augmente la vitesse acquisition d’image)
Au besoin, modifier la grandeur de la fenêtre de visionnement avec «Pvw Zoom» 4
Ajuster l’image (focus et éclairage) et choisir une région d’intérêt. Interrupteur à OFF.
5
1
2
A) 1ère Photo : noyaux en bleu.
1. Tige des filtres en position externe (pour une lumière bleue).
2. Éclairage halogène en tirant sur l’obturateur (pastille ORANGE)
3. Prévisualisation en noir et blanc.
 Clic sur «Preview» 1 puis sur «Auto Set» 2
4. Focus. Au besoin, déplacer le puits pour choisir de beaux noyaux. Puis ne plus bouger pour les photos!
5. Ajuster l’intensité du bleu dans la boîte «White Balance»
6. Clic sur «snap» 5 pour la photo.
Rapidement, fermer l’obturateur.
C) 2e Photo : actine en rouge.
1. Tige des filtres en position interne (pour une lumière rouge).
2. Éclairage halogène en tirant sur l’obturateur (pastille ORANGE)
3. Prévisualisation en noir et blanc.
 Clic sur «Preview» 1 puis sur «Auto Set» 2
4. Focus.
5. Ajuster l’intensité du rouge dans la boîte «White Balance»
6. Clic sur «snap» 5 pour la photo. Fermer l’obturateur.
3a
3b
D) Enregistrer les photos en format JPG sur une clé USB.
o
o
POUR TERMINER
Récupérer la solution DAPI : transférer avec une micropipette de 100 µl dans le contenant approprié.
Placer la plaque multi-puits dans un contenant à décontamination (ou au frigo pour autre utilisation)
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4) SUPERPOSITION DES PHOTOS
1) Ouvrir la photo «Actine» avec le logiciel Adobe Photoshop Elements 4.0 ou 10.0.
2)
 Locaux d’informatique: D-214, D-325, L-215-221-222-313
Dans le menu Accentuation, choisir «Régler l’éclairage» puis «Niveaux».
1. Cliquer sur le compte-gouttes noir
2. Déplacer votre curseur vers un coin sombre de l’image (le curseur devient un compte-goutte au-dessus de l’image) et cliquer à cet endroit.
Le fond de la photo s’assombrit. Si la modification vous satisfait, Cliquez sur OK.
3) Dans le menu Accentuation, choisir «Régler l’éclairage» puis «Luminosité/Contraste».
1. Ajuster le contraste (et l’intensité s’il y a lieu) en déplaçant le curseur vers la gauche ou la droite.
2. Cliquer sur OK.
4) Dans le menu «Fichier», choisir «Ouvrir» puis sélectionner la photo «Noyaux».
1. Procéder aux deux mêmes réglages d’accentuation que pour la photo «Actine».
2. Dans le menu «Sélection», choisir «Tout sélectionner». La photo est alors entourée de tirets de sélection.
3. Dans le menu «Édition», choisir «copier».
5) Sélectionner la photo «Actine» en cliquant sur son image au bas de la fenêtre.
1. Dans le menu «Édition», choisir «coller». L’image apparaît alors cachée par la photo «Noyau».
2. Dans la section des calques, choisir «superposition» dans le menu déroulant (lequel affiche «normal» par défaut)
Si la plaque multi-puits n’a pas bougé entre les deux prises de photo, la superposition devrait être parfaite. Sinon, sélectionner l’outil
«déplacement», au haut de la barre d’outils verticale à gauche de l’écran, et déplacer la photo «Noyaux» jusqu’à superposition parfaite!
6) Enregistrer les photos superposées en format .jpg (le format par défaut du logiciel est .psd).
À remettre : un document Word via Colnet incluant :
o No de l’équipe et noms des membres de l’équipe.
o Titre : Infection d’astrocytes murins (lignée DBT) par le virus MHV-A59
o Photo superposée noyaux-actine
o Identier : syncytium(s), cellules normales, noyau(x), actine
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