THµSE - thèse

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THµSE - thèse

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Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier)
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Bonnet Agnès
le
16 décembre 2013
5JUSF
Etude de l’expression des gènes au cours des stades précoces de la
folliculogenèse ovarienne chez les mammifères de rente (brebis)
²DPMF EPDUPSBMF et discipline ou spécialité ED BSB : Génétique moléculaire
6OJUÏEFSFDIFSDIF
UMR 444 Génétique Cellulaire INRA
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EFʾÒTF
Mr Mulsant Philippe
Mme Mandon-Pépin Béatrice
Jury :
Mme Binart Nadine (Directeur de recherche, INSERM, Le Kremlin-Bicêtre)
M. Bobe Julien (Directeur de recherche, INRA, Rennes)
M. Bujan Louis (Professeur des universités, praticien hospitalier, Hôpital Paule de Viguier)
M. Gougeon Alain (Directeur de recherche, INSERM, Lyon)
M. Lecerf Frédéric (Maître de conférence, Agrocampus Ouest, Rennes)
Remerciements
Je dédie ce travail
A Michel,
A nos 3 enfants
Christophe, Sébastien et Julien,
A mes parents,
A Jean- Luc
Merci ….
En tout premier lieu, je tiens à remercier Madame Nadine Binart et Monsieur Julien Bobe pour
avoir accepté d’être les rapporteurs de ce travail. Merci de l’attention que vous avez porté à
cette thèse. Je tiens à vous exprimer ma respectueuse considération et ma sincère gratitude.
Je tiens aussi à remercier les membres du jury : Monsieur Jean Parinaud, Monsieur Louis
Bujan, Monsieur Alain Gougeon, Monsieur Frédéric Lecerf pour avoir accepté de juger ce
travail. Merci de l’intérêt que vous avez porté à cette thèse.
Je tiens enfin à remercier Monsieur Philippe Mulsant et Madame Béatrice Mandon-Pépin pour
avoir accepté d’être mes directeurs de thèse. Je vous suis particulièrement reconnaissante pour
votre disponibilité, votre encadrement, vos conseils et pour l’intérêt que vous avez porté à mon
travail tout au long de ma thèse. Aucune phrase ne sera assez forte pour vous dire merci.
Cette thèse est pour moi l’aboutissement d’un travail qui a pu être mené à bien grâce à
l’interaction et au soutien de nombreuses personnes.
« Il y a des milliers de vies dans une seule vie.» Swami Parjnanpad
Ce fut également une période d’un grand enrichissement humain et scientifique. Merci à tous
ceux qui m’ont encouragée, soutenue dans les moments difficiles et conseillée tout au long de
ce parcours.
Je remercie tous les membres passés et présents de l’équipe de génétique des ovins et des
caprins pour leur confiance, leurs discussions et leurs conseils.
De nombreuses personnes ont contribué régulièrement à faire avancer ce travail, que ce soit à
l’occasion de réunions, de séminaires, de relectures et corrections d’articles ou de discussions,
et je les remercie de l’intérêt qu’elles ont porté à mon sujet et des conseils avisés qu’elles m’ont
prodiguées. Je remercie en particulier Laurence Liaubet, Magali San Cristobal, Thomas Faraut,
Alain Vignal et Jérome Gouzy.
Ma thèse m’a aussi permis de me former à différentes techniques, et j’ai eu la chance de
bénéficier de l’expertise et des « petits trucs » de différentes plateformes (GetPlaGe (Olivier
Bouchez), Plateforme de Microgénomique expressionnelle ICE (Claudia Bevilacqua),
SIGENAE (Cédric Cabau)) et de l’appui de personnes très compétentes (Katia, Yves, Alain J).
Merci également à Francis, Florent et Julien que j’ai embarqué dans la grande aventure de la
microdissection à capture laser. Merci pour leur disponibilité, leur bonne humeur et les bons
moments passés ensemble.
Enfin cette thèse signe une fin de cursus universitaire qui a commencé il y a plus de trente ans :
« Jamais nous ne devrions suivre le chemin d’un autre, car c’est sa voie, pas la
nôtre. … Une fois que tu l’as trouvé, ne t’en écarte jamais. Ta voie est ce qui te
convient, mais elle ne convient pas à un autre. » Swami Viveknanda
Mon chemin a été long et il a fallu beaucoup de motivations et de batailles contre « la
normalité » pour garder le cap. Merci à l’INRA de m’avoir laissée cette opportunité. Merci à
tous ceux qui m’ont fait confiance, m’ont encouragé et guidé le long de ce chemin (Francois G,
Francois H, Philippe, Béatrice, Laurence, Magali, Thomas, Alain, Mireille,…). Merci pour
leurs conseils de rédaction et de présentation « raconter une histoire » « message à faire
passer » Plus facile à dire qu’à faire ! Merci pour les discussions « déjeuner » toujours très
enrichissantes d’un point de vue personnel et scientifique. Un grand merci enfin, à Stéphane
Fabre pour ses conseils lors de la rédaction et à Caroline Molette et Annie Robic qui ont pris un
peu de leur temps pour relire ce manuscrit.
Et tant pis pour ceux qui n’ont pas compris mes choix ! En route pour de nouvelles aventures
avec la TGU !
J’ai une pensée particulière pour ma famille qui a toujours été présente et m’a soutenue dans
mes projets un peu fous quelquefois et les moments difficiles.
A mes parents merci tout simplement pour l’éducation qu’ils m’ont donnée.
« Quand on ne sait pas où l’on va, que l’on sache d’où on vient » (tradition orale)
A tous mes amis ; merci pour leur réconfort, pour les sorties balades, randonnées et
gastronomiques qui m’ont, chacun à leur manière, changer les idées ! , Merci d’être là !
Un dernier merci pour tous ceux que j’ai oublié.
Michel cette thèse je te la dédie
A la mémoire de Jean-Luc, si tu avais pu tourner ces pages…
INTRODUCTION
Chez les mammifères, la réserve en cellules germinales (constituée de follicules primordiaux)
est acquise au cours de la vie fœtale ou néonatale et constitue un stock disponible tout au long
de la vie reproductive. Cette réserve va cependant s’épuiser au cours de la vie.
En santé humaine, la compréhension des dysfonctionnements ovariens est un enjeu important.
Par exemple, la défaillance ovarienne précoce est une pathologie responsable d’aménorrhées
primitives ou secondaires qui touche 1% des femmes de moins de 40 ans.
En agronomie, la maîtrise de la fonction de reproduction des animaux d’élevage joue un rôle
central dans la gestion des exploitations, pour la production mais également dans l'optique du
bien être animal (ex : limitation des tailles de portée extrêmes chez les brebis).
Les différentes étapes de la mise en place de la réserve en cellules germinales et de la
folliculogenèse basale sont contrôlées par l’expression spécifique de certains gènes ovocytaires
et dépendent d’un dialogue moléculaire très étroit entre les cellules somatiques et les cellules
germinales. Les acteurs et les mécanismes qui sous tendent ces différentes étapes sont encore
mal connus. Leurs bons déroulements conditionnent la durée reproductive et la fertilité des
femelles. Ce sont donc des étapes cruciales pour la fonction ovarienne.
L’équipe Génomique Des Ovins et des Caprins du Laboratoire de Génétique Cellulaire
s’intéresse à la variabilité du taux d’ovulation chez la brebis et a déjà identifié des mutations
naturelles dans trois gènes de l’espèce ovine de race Lacaune : FecB (concernant le gène
BMPR1B), FecL (gène inconnu) et FecX (gène BMP15) qui bloquent la folliculogenèse basale
au stade du follicule primaire. Parmi les mammifères mono-ovulants (homme, bovin, caprin,
ovin…), l’espèce ovine représente un bon modèle expérimental puisque la folliculogenèse est
relativement bien décrite dans cette espèce (morphologie, chronologie). Il existe quelques
modèles génétiques (mutation naturelle BMP15…) et les caractéristiques de la folliculogenèse
sont proches de celle de l’espèce humaine.
Le projet scientifique de cette thèse est de :
1- Mettre en place une méthode d'analyse des stades précoces de la folliculogenèse chez la
brebis par analyse du transcriptome.
2- Décrire l’expression des gènes dans les 2 types cellulaires (oocyte et cellules de la
granulosa) au cours des différents stades de la folliculogenèse basale chez la brebis.
Cette étude devrait nous permettre d’identifier des gènes potentiellement impliqués dans
le dialogue moléculaire existant entre les deux types cellulaires ainsi que des gènes à
expression spécifique susceptibles de jouer un rôle important dans cet événement
physiologique.
3- Décrire l’expression des gènes impliqués dans le développement folliculaire et mettre
en évidence des processus moléculaires clés et des « biomarqueurs » de la croissance
folliculaire basale. Cette étude devrait permettre de décrire précisément la
folliculogenèse basale dans l’espèce ovine et de pouvoir la comparer à celles des
espèces poly-ovulantes (souris). Les « biomarqueurs » identifiés sont susceptibles de
jouer un rôle important. En effet, la finalité à long terme est de pouvoir les utiliser
comme standard in vivo, notamment pour contrôler la survie et le développement des
follicules en culture in vitro ou après cryopréservation du cortex ovarien par
transposition à l'espèce humaine. En effet, il est aujourd’hui possible de préserver la
fertilité de jeunes patientes atteintes de cancer grâce à la cryoconservation de leur tissu
ovarien avant traitement, puis à greffer ce tissu une fois la patiente guérie et adulte.
La thématique de notre projet de recherche relève des aspects moléculaires de la
folliculogenèse basale (période néonatale). Ce manuscrit présente d’abord en introduction,
l’état de l’art en trois points: après un rappel général sur l’ovogenèse et la folliculogenèse, nous
aborderons les aspects morphologiques, physiologiques et cellulaires de l’ovogenèse et la
folliculogenèse basale et enfin, nous nous attacherons ensuite à en décrire les aspects
moléculaires.
Les résultats seront ensuite exposés. Après la mise au point des méthodes d’analyse, nous
analyserons l’expression des gènes dans les compartiments folliculaires puis au cours de la
folliculogenèse basale.
Enfin, nous discuterons de certains résultats obtenus concernant notamment le dialogue
moléculaire et la régulation de la croissance folliculaire basale.
En conclusion de ce manuscrit, de nouvelles pistes de recherche seront définies.
Table des matières
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
1
CHAPITRE I : INTRODUCTION A L’OVOGENESE ET A LA FOLLICULOGENESE
4
CHAPITRE II : ASPECTS MORPHOLOGIQUES, PHYSIOLOGIQUES ET CELLULAIRES
6
1. Ovogenèse fœtale : de la formatrion des crêtes génitales à la formation des follicules ovariens
6
2. Le développement folliculaire
13
3. L’atrésie ovocytaire et folliculaire
19
CHAPITRE III ASPECTS MOLECULAIRES
21
1. Description générale des mécanismes
21
2. Ovogenèse foetale
25
3. Folliculogenèse basale
35
49
MATERIEL ET METHODES
52
MICRODISSECTION A CAPTURE LASER (LCM)
54
ANALYSE DU TRANSCRIPTOME
55
1. Support microarray
55
2. RNA-seq
55
VALIDATION PAR PCR EN TEMPS REEL
57
INTERPRETATION BIOLOGIQUE VALIDATION
58
RESULTATS
60
PREAMBULE
63
CHAPITRE I. METHODES D’ANALYSE DES STADES PRECOCES DE LA FOLLICULOGENESE
BASALE CHEZ LA BREBIS
65
1. Résultats
66
2. Conclusion
69
3. Article 1
69
4. Annexes de l’article 1
70
CHAPITREII.DESCRIPTIONDESTRANSCRIPTOMESDANSCHACUNDESDEUX
COMPARTIMENTSOVARIENS:SPECIFICITESFONCTIONNELLESETDIALOGUE
MOLECULAIRE
71
1. Résultats
72
2. Conclusion
78
3. Article 2
78
79
CHAPITREIII.PROFILD’EXPRESSIONSPATIOTEMPORELDELAFOLLICULOGENESE
BASALE:PREDICTIONDESPROCESSUSBIOLOGIQUESETSESREGULATIONS
80
1. Résultats
81
2. Conclusion
87
2. Article 3
89
90
DISCUSSIONGENERALE
91
METHODOLOGIES
93
CARACTERISTIQUESDESTRANSCRIPTOMES
96
ETUDEDESCOMPARTIMENTS
99
1. Les fonctions
99
2 .Les mécanismes
99
3. Les communications cellulaires
102
4. Les spécificités de compartiments
104
LEDEVELOPPEMENTFOLLICULAIREPRECOCE
106
1. Les fonctions
106
2. Mécanismes mis en place au cours du développement folliculaire
106
3. Régulation de la croissance
107
4. Les spécificités de stades
111
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
113
CONCLUSIONS METHODOLOGIQUES
114
CONCLUSIONS BIOLOGIQUES
114
PERSPECTIVES
115
LISTE DES PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS
117
ARTICLES
118
COMMUNICATIONS ORALES
118
POSTERS
118
REFERENCES
120
ABBREVIATIONS
125
Index des figures
Figure 1. Représentation schématique de l’évolution des follicules dans l’ovaire humain.
4
Figure 2. Schéma chronologique de l’ovogenèse et la folliculogenèse chez la brebis et la
souris.
4
Figure 3. Schéma chronologique de l’ovogenèse et la folliculogenèse chez différents
mammifères.
5
Figure 4. Evénements chronologiques de la différenciation ovarienne chez les ruminants
(brebis) et les rongeurs (souris).
8
Figure 5. Formation des cordons ovigères (souris).
8
Figure 6. Les étapes de la méiose.
9
Figure 7. Les principales étapes de la méiose I.
9
Figure 8. Etapes de la formation des follicules primordiaux.
11
Figure 9. Chronologie des principales étapes de la période fœtale chez l’homme et la souris :
de la migration des CGP à la formation des follicules primordiaux.
12
Figure 10. La folliculogenèse.
13
Figure 11. Progression du diamètre folliculaire au cours du développement dans différentes
espèces.
14
Figure 12. Croissance de l’ovocyte et multiplication des cellules de granulosa pendant la
15
Figure 13. Différents stades de follicules de la croissance folliculaire, ainsi que leurs limites
de taille et leur classification chez l’homme.
17
Figure 14. Pourcentage de follicules entrant en atrésie pendant la croissance folliculaire.
19
Figure 15. Gaspillage ovocytaire au cours de l’ovogenèse.
19
Figure 16. Principales étapes de la folliculogenèse et de la maturation de l’ovocyte.
20
Figure 17. Voie de signalisation canonique WNT/β caténine.
21
Figure 18. Illustration de la voie de signalisation PI3K.
21
Figure 19. Composants majeurs de la signalisation des principaux membres de la famille
TGFβ et combinaisons possibles entre facteurs et récepteurs.
24
Figure 20.Voie de signalisation des TGFβ et sa régulation.
24
Figure 21. Rôle de Foxl2 dans l’ovaire.
25
Figure22. Spécialisation des cellules somatiques en cellules germinales.
26
Figure23. Cascade des événements conduisant à la formation des gonades.
26
Figure 24. La différenciation sexuelle chez les souris.
27
Figure 25. Voies de signalisation (putative) impliquées dans l’organogenèse ovarienne de
souris.
28
Figure 26. Régulation de la méiose par l’acide rétinoïque.
29
Figure 27. Représentation des facteurs impliqués dans la formation des CGP, des cordons
ovigères et des follicules primordiaux.
34
Figure 28. Rôle potentiel de la signalisation intra-ovocytaire de PI3K.
35
Figure 29. Facteurs impliqués dans le maintien et la survie des follicules primordiaux.
36
Figure 30. Expression de KITL et KIT au cours de la folliculogenèse chez la souris.
36
Figure 31. Différents facteurs impliqués dans l’activation, l’inhibition ou la survie des
follicules primordiaux.
41
Figure 31. Contact intercellulaire entre ovocyte et cellules de granulosa.
46
Figure32. Dialogue moléculaire. Erreur ! Signet non défini.
48
Figure 33. Biogenèse et régulation par les micro-ARN chez les mammifères.
49
Figure 34. Régulation du développement folliculaire basal.
51
Figure 35. Plan d’expérience.
55
Figure 36. Synthèse du nombre de séquences obtenues par échantillon.
72
Figure 37. Pertinence des jeux de données.
94
Figure 38. Réseau des gènes impliqués dans la régulation de l’atrésie ovocytaire.
99
Figure 39. Bilan des connaissances sur le dialogue moléculaire.
104
Figure 40. Chronologie des modifications cellulaires potentielles mises en place pendant la
croissance folliculaire basale.
107
Figure 41. Régulateurs potentiels impliqués dans la croissance folliculaire basale.
108
Figure 42. Facteurs de transcription potentiels impliqués dans la croissance folliculaire
basale.
108
Figure 43. Gènes montrant des différences d’expression les plus significatives.
112
Index des tableaux
Tableau 1. Chronologie de l’ovogenèse fœtale chez les mammifères.
6
Tableau 2. Comparaison de la durée du développement folliculaire entre espèces.
13
Tableau 3. Diamètres folliculaires (en mm) aux principales étapes du développement
folliculaires chez différents mammifères.
17
Tableau 4. Effet de l’invalidation de gènes intervenant dans la mise en place de la gonade
chez la souris.
27
Tableau 5. Régulateurs de la mort programmée qui affectent la survie ovocytaires et la
formation des follicules.
30
Tableau 6. Facteurs de transcription impliqués dans la formation des follicules.
31
Tableau 7. Facteurs de croissance et de signalisation impliqués dans l’assemblage des
follicules.
32
Tableau 8. Expression des principaux composants de la voie de signalisation des TGFβ en
fonction des espèces, des stades de développement et du compartiment folliculaire.
42
Tableau 9. Résumé des effets des hormones et facteurs de croissance sur la croissance
folliculaire.
48
Tableau 10. Rôle des miRNA identifiés pendant la croissance basale.
49
Tableau 11: Liste des publications ayant utilisé la technologie LCM pour étudier la
folliculogenèse basale de différentes espèces.
65
Tableau 12. Bilan des résultats obtenus avec les deux techniques d’assemblage.
72
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
1
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2
2.6L’inductiondelaméiose
2.7Lespointsdecontrôleméiotiques
a.Lamortcellulaireprogrammée
b.Lesfacteursdetranscription
c.Lesfacteursdecroissanceetlesvoiesdesignalisation
d.Leshormones
28
29
30
30
31
32
3.Folliculogenèsebasale
3.1Maintienouactivationdelaréservefolliculaire
a.LavoiedesignalisationPI3K
b.Lemaintiendelaréservefolliculaire
c.Activationdelaréservefolliculaire
3.2Lacroissancefolliculaire
a.Ledialoguemoléculaire
b.Lesinteractionsphysiques
c.Lessignauxautocrines
d.Lerôledeshormonesetdesfacteursdecroissance
e.Lesmicro~ARN
35
35
35
37
39
41
42
46
47
47
49
4.L’atrésieovocytaireetfolliculaire
49
4.1L’atrésieovocytaire
4.2L’atrésiefolliculaire
49
49
3
Figure 1. Représentation schématique de l’évolution des follicules dans l’ovaire humain.
Source (Thibault et Levasseur 2001)
Etapes de la folliculogenèse (réserve, follicules 1 à pré ovulatoire, atrésie) et lutéogenèse (corps jaune en
développement ou régression)
Figure 2. Schéma chronologique de l’ovogenèse et la folliculogenèse chez la brebis et la
souris. Source (Racki and Richter 2006)
Chapitre I : Introduction à l’ovogenèse et à la folliculogenèse
Chapitre I : Introduction à l’ovogenèse et à la
folliculogenèse
L’ovaire constitue l’élément principal de la fonction de reproduction chez la femelle (Figure 1)
et présente une double fonction :
- La production des ovocytes : c’est le lieu de stockage et de maturation des cellules germinales
femelles qui entourées des cellules de la granulosa forment les follicules. Ceux-ci libèrent à
chaque cycle au moins un ovocyte fécondable.
- La sécrétion hormonale qui joue un rôle clé dans le système endocrinien de la femelle en
synthétisant et secrétant les hormones stéroïdes (œstrogènes, progestérone et androgènes) et
peptidiques (inhibines…) indispensables à la fonction de reproduction.
Aux niveaux anatomique et physiologique, l’ovaire constitue un compartiment composé de
deux structures :
- La medulla, lieu d’arrivée et de départ des nerfs, des vaisseaux sanguins et lymphatiques.
- Le cortex périphérique, lieu de maturation des cellules germinales.
L’ovaire est un organe en perpétuelle évolution où, dès la puberté, tous les stades de la
folliculogenèse et de la lutéogenèse peuvent être observés (Figure 1).
Dans l’ovaire, deux processus indissociables, l’ovogenèse et la folliculogenèse, déterminent
donc le nombre et la qualité des ovocytes produits. La production de gamètes femelles ou
ovogenèse commence au stade fœtal chez les mammifères mais progresse de manière
discontinue. Les ovocytes se bloquent une première fois en prophase de première division
(ovocytes I) dans une structure spécialisée de l’ovaire : le follicule primordial. Les ovocytes
reprennent ensuite leur croissance à partir de la puberté en lien étroit avec la croissance du
follicule ou folliculogenèse. Ce processus biologique continu démarre par la croissance du
follicule primordial et se termine à l’ovulation (Figure 2). Enfin, après la décharge ovulante
cyclique de LH (hormone lutéinisante), l’ovocyte (ou les ovocytes) se bloque(nt) à nouveau en
métaphase de deuxième division jusqu’à la fécondation (ovocyte II). La régulation de ces deux
processus est liée à de nombreux facteurs endocrines ou paracrines et à des interactions
multiples entre types cellulaires et entre gènes. L’efficacité reproductive des mammifères va
dépendre de la taille du stock de follicules primordiaux produits pendant la vie fœtale et du bon
déroulement de la folliculogenèse pendant toute la vie reproductive de la femelle.
4
Figure 3. Schéma chronologique de l’ovogenèse et la folliculogenèse chez différents
mammifères.
Source (Monniaux et al. 2009)
JPC : jour post conception.
Chapitre I : Introduction à l’ovogenèse et à la folliculogenèse
On distingue trois étapes successives jusqu’à l’ovulation :
- l’ovogénèse fœtale (de la mise en place de l'ovaire fœtal à la formation du stock de follicules
primordiaux),
- la folliculogenèse basale ou précoce (indépendante des hormones gonadotropes, ~135 j chez
la brebis),
- la folliculogenèse antrale ou tardive (dépendante des hormones gonadotropes, ~44 j chez la
brebis).
Si l’ovogenèse est initiée chez tous les mammifères au cours de la vie fœtale, des différences
importantes dans la mise en place de l'ovaire existent entre les espèces et en particulier
avec les rongeurs qui représentent une entité bien distincte. Ces différences concernent
l’organisation structurale de l’ovaire, l’activité stéroïdogène fœtale, l’initiation de la méiose
(espèces à méiose immédiate ou retardée) et les régulations géniques dans ces étapes. On
observe aussi ensuite des différences dans la chronologie des étapes de la folliculogenèse. Par
exemple, la formation des follicules s’effectue pendant la vie fœtale chez l’homme, les
ruminants et les porcins et en période néonatale chez la souris et le lapin. La durée totale du
développement folliculaire varie aussi d’une vingtaine de jours chez les rongeurs à plusieurs
mois chez les mammifères de grande taille (Figure 3).
Enfin, on distingue les espèces qui produisent un ovocyte par cycle (espèces mono-ovulantes :
ovine, bovine, équine, humaine) des espèces qui produisent plusieurs ovocytes par cycle
(espèces poly-ovulantes : porcine, canine, rongeurs).
Le rôle des gènes nécessaires à l'élaboration de toutes ces étapes a été caractérisé
principalement chez la souris par des études génétiques (invalidation de gènes). Les données
bibliographiques proviennent essentiellement des rongeurs et peu de données sont disponibles
chez les autres espèces. Cependant dans la suite de ce document, les différences connues entre
les espèces seront mentionnées.
5
Stade embryonnaire
Formation des CGP
Formation des crêtes
génitales
Migration : début/fin
méiose
souris
6.25-7.5 jpc
(jour post
coïtum)
9-10 jpc
porc
21 jpc
bovin
homme
caprin
ovin
35-55 jpc
24 jpc
28-32 jpc
4-6 semaines
25 jpc
23-24 jpc
9-13.5 dpc
13.5-15.5 jpc
18-24 jpc
30-64
A partir de A partir de
42 jpc
70 jpc
4-7 semaines
11-12eme semaine
jusqu’au 2 eme
trimestre
30-32
De 55 à
90 jpc
23
De 52 à
120jpc
Formation des
follicules
2 jours
postnataux
68-70 jpc
90 jpc
80
A partir
de 75 jpc
Durée de gestation
19-21 jours
112-115
jours
(Liu et al.
(Takagi et
2010)
al. 1997;
(Pepling 2006) Parma et
al. 1999;
Pailhoux
et al.
2001)
9 mois
Environ 16
semaines pc– 6
mois post natal
9 mois
150 jours
145 jours
(Pailhoux
et al.
2002)
(McNatty
et al.
1995)
(Baillet et
al. 2011)
Références
(Lavoir et
al. 1994)
(Aerts and
Bols 2010)
(Turnpenny et al.
2006)
(De Felici 2013)
(Stoop et al. 2005;
Oktem and Oktay
2008) (Oktem and
Oktay 2008)
Tableau 1. Chronologie de l’ovogenèse fœtale chez les mammifères.
Chapitre II : Aspects morphologiques, physiologiques et cellulaires
Ovogenèse fœtale : De la formation des crêtes génitales à la formation des follicules ovariens.
Chapitre II : spects orphologi ues
ph siologi ues et cellulaires
1.
vogenèse fœtale
e la formation des cr tes génitales la formation
des follicules ovariens.
L’évolution des cellules de la lignée germinale comporte trois phases : une phase de
multiplication, une phase d’accroissement de la taille et une phase de maturation qui sont
régulées par de nombreux facteurs intra et extra ovariens.
Les événements chronologiques du développement ovarien sont bien connus chez les
mammifères et on distingue trois étapes clé :
- la phase de multiplication des cellules germinales et la différenciation ovarienne. Les
cellules germinales primordiales (CGP) deviennent des ovogonies,
- l'initiation de la méiose fœtale, caractéristique d'un développement femelle.
ovogonies deviennent des ovoc tes
es
(primaires) qui restent bloqués en première phase de
méiose la prophase
- la méiose est suivie par la formation des follicules qui se déroule soit pendant la vie
fœtale, soit en période néonatale : un ovocyte I s'entoure de quelques cellules somatiques (prégranulosa) pour former des follicules primordiaux. Ces follicules primordiaux comportant un
ovocyte I constituent le stock de cellules germinales pour la vie reproductive de la femelle.
La chronologie de cette période est différente entre les espèces et pour plus de clarté dans la
suite du manuscrit, est résumée dans le Tableau 1.
1.1 Lesgonadesindifférenciées
Chez les mammifères, les gonades se forment dans la crête génitale. C'est un renflement
longitudinal provoqué par la prolifération de l'épithélium cœlomique et l’épaississement du
mésenchyme sous-jacent situé sur la face médio ventrale du mésonéphros (rein embryonnaire
transitoire). Les progéniteurs de la lignée germinale dérivent des cellules de l'épiblaste (couche
supérieure du disque embryonnaire).
La migration des CGP s’effectue de manière passive grâce aux mouvements morphogéniques
de l’intestin primitif caudal en formation (Hara et al. 2009) puis de manière active en réponse à
des signaux directionnels émis par les cellules somatiques. Les CGP commencent aussi à se
6
multiplier par mitose. Le début de la migration s’accompagne de changements morphologiques
et biochimiques tels que les extensions cytoplasmiques et la polarisation (Anderson et al.
2000).
A leur arrivée dans les crêtes génitales (9 jpc (jour post coïtum) chez la souris et vers 23-24 jpc
chez la brebis), les CGP perdent leur mobilité et deviennent des ovogonies. Elles se multiplient
par mitoses successives rapides et établissent des contacts avec les cellules épithéliales.
Après la colonisation par les cellules germinales, les ébauches gonadiques mâle et femelle ont
un aspect identique, c'est pourquoi on nomme aussi cet état, l'ébauche gonadique indifférenciée
ou bipotentielle. Au terme du développement des crêtes génitales en gonade embryonnaire, on
distingue deux types cellulaires en complément des ovogonies : les cellules de soutien qui
donneront les cellules de Sertoli ou de granulosa et les cellules stéroïdogènes qui donneront les
cellules de Leydig ou de la thèque. La zone corticale (cortex) de la gonade embryonnaire se
différenciera en ovaire et la zone médullaire (medulla) en testicule.
1.2 Différenciationprécocedel'ovaire
Chez les mammifères, le sexe est déterminé génétiquement à la fécondation en fonction du
spermatozoïde apporté, qui peut être porteur ou non du chromosome Y (XX pour la femelle et
XY pour le mâle). La colonisation des crêtes génitales par les CGP est une 1ere étape
nécessaire à la formation de gonades fonctionnelles. Une 2eme étape consiste à l'expression de
différents gènes qui va induire la différenciation des crêtes génitales en ovaire ou en testicule.
Cependant, un seul gène Sry (sex determining region Y), présent sur le chromosome Y est
nécessaire et suffisant pour induire la différenciation sexuelle vers un testicule et donc la voie
mâle, chez les mammifères terriens (marsupiaux et placentaires). Ce n’est qu’à la suite de cette
différenciation sexuelle des gonades que les ovogonies s’orienteront vers la voie mâle ou
femelle grâce à l'expression d'autres gènes spécifiques de chaque sexe.
La différenciation précoce et le maintien de la gonade femelle qui suit est également cruciale
puisque le stroma ovarien reste relativement labile avec la possibilité de rebasculer vers un état
testiculaire (vu chez la souris (Schlessinger et al. 2010)). L’altération de l’expression de gènes
actifs à cette période de développement a des répercussions sur la fonction de reproduction des
animaux à l’âge adulte comme l’infertilité ou l’inversion sexuelle.
Dès les premières étapes de la différenciation gonadique, la gonade va aussi produire des
hormones stéroïdes : androgènes chez le mâle et œstrogènes chez la femelle (32 jpc chez la
7
Figure . vénements chronologiques
de la différenciation ovarienne chez les
ruminants brebis et les rongeurs
souris .
Source (Baillet and Mandon-Pepin 2012)
Les ovaires se structurent en deux parties à la
formation des cordons ovigères : le cortex et la
medulla.
Cette organisation ovarienne est observée avant
l’entrée en méiose chez les ruminants (A) et
après la méiose chez les rongeurs (B). La
synthèse d’œstrogènes commence pendant la vie
fœtale chez les ruminants et à la naissance chez
les rongeurs.
Figure . Formation des cordons ovigères souris .
Source (Pepling 2006)
A leur arrivée dans les crêtes génitales les ovogonies se multiplient et restent relier entre elles pour former des
cordons ovigères (Germline cyst).
brebis). Les œstrogènes jouent un rôle important dans la différenciation ovarienne de nombreux
vertébrés (poissons, reptiles, oiseaux, ruminants) car ils sont capables soit d’induire des
inversions sexuelles femelles chez les mâles (comme chez les poissons (Vizziano-Cantonnet et
al. 2008) ou s’ils sont inhibés d’entraîner des phénotypes mâles chez les femelles (Baillet et al.
2011). Chez les mammifères il existe des différences entre espèces pour la production des
œstrogènes pendant la vie fœtale. Chez les ruminants, comme la vache, la brebis et la chèvre,
les gonades secrètent un pic d’œstrogènes au moment de la formation des cordons ovigères puis
ce taux diminue avant l’entrée en méiose. Par contre la souris ne produit pas d’hormones
stéroïdiennes pendant la vie fœtale (référence dans(Baillet and Mandon-Pepin 2012)) (Figure
4).
Dans la même période, au cours de la multiplication des ovogonies, la cytokinèse incomplète des
mitoses va relier les ovogonies entre elles par des ponts cytoplasmiques et créer des cystes
d’ovogonies. Chaque cyste s’entoure de cellules épithéliales provenant du cortex ovarien
(cellules pré-granulosa) puis d’une membrane basale. Le tissu interstitiel sépare chaque cyste
pour former des structures tubulaires que l’on appelle des cordons ovigères (Figure 5) (Juengel
et al. 2002; Pepling 2006; Magre 2011).
Au démarrage de la méiose, la structure de la gonade femelle fœtale n’est pas identique dans
toutes les espèces. Chez les ruminants (chèvre, brebis, vache) mais aussi chez la truie et la
lapine, les CGP migrent à la périphérie de la gonade et forment les cordons ovigères. La gonade
s’organise alors en deux zones (cortex ; medulla). Ce changement morphologique est associé à
la production d’œstrogènes. Par contre, chez les rongeurs, les CGP colonisent toute la gonade,
et l’architecture de l’ovaire n’apparaît que quelques jours avant la naissance et ne se fixe
qu’après la naissance (Ottolenghi et al. 2007) (Figure 4).
1.3 Laméiose
a
Initiation de la
iose
Dans l'ovaire, à 13,5 jpc chez la souris et 55 jpc chez la brebis, les ovogonies stoppent leur
réplication d'ADN pour entrer en méiose. L'initiation de la méiose aussi précocement est
caractéristique de la voie femelle, dans le testicule l’entrée en méiose ne se produit qu’après la
naissance et par vagues continues.
On observe une différence dans la vitesse d’initiation de la méiose en fonction des espèces
(Figure 4). Les ovogonies des souris démarrent la méiose rapidement après la différenciation
8
Figure . es étapes de la méiose.
Figure . es principales étapes de la méiose . Source
a lo s i and Cande
Une seule paire de chromosomes est montrée et le chromosome homologue a une couleur différente. Les nodules
de recombinaison sont représentés par des points de différentes grosseurs. Les principaux événements de la
prophase I comprennent la formation des cassures double brins, leur réparation, l’appariement des chromosomes
homologues, les synapses et la formation des crossing-overs,. Les interactions entre chromosomes homologues
pendant la prophase I amènent à la formation de paires homologues ou bivalents et à des échanges réciproques de
régions chromosomiques, conséquence des crossing overs. Les chromosomes homologues se séparent en
anaphase.
sexuelle (le jour suivant chez la souris). Par contre, chez d'autres espèces de mammifères
(comme la femme, les ruminants, le lapin) qui produisent des œstrogènes précocement au cours
de la différenciation ovarienne, la méiose survient plus tardivement au sein des cordons
ovigères. De plus, la méiose s’initie de manière synchronisée chez les rongeurs et asynchrone
chez l’homme, les ruminants et le lapin. Chez toutes les espèces, la dénomination des cellules
germinales change : les ovogonies deviennent les ovoc tes primaires ou ovocytes I.
a
iose
La méiose est un mécanisme de division cellulaire particulier à la lignée germinale destinée à
donner naissance à des gamètes haploïdes. Elle correspond à la succession de deux divisions
cellulaires qui suivent une phase unique de réplication d'ADN et qui conduisent à la formation
de quatre cellules haploïdes (n) pour une cellule diploïde (2n) (Figure 6).
Elle assure la transmission de l'information génétique d'une génération à la suivante et le
brassage de l'information génétique qui aboutit à la diversité génétique de l'espèce. La première
division méiotique est réductionnelle. Elle permet la réduction du nombre de chromosomes et
le brassage de l'information génétique. La deuxième division méiotique est équationnelle. Elle
ressemble à une mitose mais elle n'est pas précédée d'une synthèse d'ADN et survient sur des
chromosomes en un seul exemplaire. Ces deux divisions sont asymétriques et vont produire
deux cellules filles de taille différente.
La méiose est précédée d’une phase unique de synthèse d’ADN de longue durée appelée stade
préleptotène. Chaque division méiotique passe ensuite par 4 étapes identiques à celle de la
mitose : prophase, métaphase, anaphase et télophase (Figure 7).
C’est la prophase I qui fait la particularité de la méiose, par sa durée, elle occupe 90 % du
temps de la méiose, et par l’importance des événements qui s’y déroulent. C’est en effet au
cours de cette prophase I que se déroulent les deux événements fondamentaux de la méiose :
l’appariement des chromosomes homologues et la recombinaison génétique (Pawlowski and
Cande 2005; Jordan 2006). La prophase est subdivisée en 5 stades transitoires, classés en
fonction de leur configuration chromosomique:
u stade leptotène l’ADN se condense, les chromosomes sont sous forme de filaments
accrochés à la membrane par des bouquets télomériques. Ces bouquets favorisent le
rapprochement des chromosomes et leur appariement. Des cassures double brin se forment et
initient la recombinaison méiotique (Keeney 2008).
u stade z gotène, l’appariement des chromosomes homologues est maintenu. Les complexes
synaptonémaux
apparus
au
leptotène
favorisent
les
processus
de
recombinaisons
9
chromosomiques (Kolas et al. 2004; Kouznetsova et al. 2005).
u stade pach tène des tétrades se forment au sein de ces complexes synaptonémaux et les
crossing-over se forment au niveau des chiasmas.
u stade diplotène les complexes synaptonémaux se dissocient et les chromosomes
homologues se séparent. Ils se condensent mais restent attachés au niveau des points de
recombinaison sous la forme de chiasmas, indispensables pour une bonne ségrégation des
chromosomes. Chez les mammifères, le blocage de la prophase I intervient à ce stade diplotène
chez les femelles et dure de quelques jours (souris) à plusieurs années (femme, ruminants…).
a première division restera bloquée au stade diplotène usqu’au moment de l’ovulation.
Cette diapause correspond au stade dict otène. La première division méiotique reprendra
juste avant l’ovulation suite à la décharge ovulante d’hormone gonadotrope LH (luteinzing
hormone).
A la puberté, les ovoc tes
terminent la prophase
au stade diacinèse. Les chromosomes
homologues se déplacent et l’enveloppe nucléaire disparait.
Dès le démarrage de la méiose, les ovocytes I mettent en place des communications avec les
cellules somatiques proches que l’on appelle des pré-granulosa et qui se différencieront plus
tard en cellules de granulosa (Matzuk and Lamb 2002).
1.4 Formationdesfolliculesprimordiaux
Les follicules primordiaux se forment dans un ovaire structuré (cortex/medulla) lorsque les
ovocytes sont bloqués en prophase I au sein des cordons ovigères. En fonction des espèces,
l’apparition des follicules se situe pendant la période fœtale (femme, chèvre, brebis, vache
…) ou néonatale (souris, lapin...) (Figure 3). Pendant la période fœtale, l’assemblage des
follicules peut être aussi décalé dans le temps en fonction des espèces. Pour la vache et la
femme par exemple qui ont des durées similaires de gestation, les follicules apparaissent vers
80 jours chez la vache et 112-132 jours chez la femme (Nilsson and Skinner 2009). Chez les
rongeurs, on observe également un gradient centrifuge d’entrée en méiose des ovocytes et de
formation des follicules au sein de l’ovaire. Les ovocytes entrent en méiose et les cystes se
fragmentent d’abord dans le cortex interne juste avant la naissance, le processus s’étend ensuite
après la naissance vers l’épithelium de surface (pour revue (Pepling 2012)). Chez la brebis, les
cordons ovigères sont d'abord retrouvés à la frontière médulla/cortex puis s'étendent aussi à tout
le cortex (Juengel et al. 2002).
10
Figure . tapes de la formation des follicules primordiaux.
Source (Guigon and Magre 2006)
A : Les cordons ovigères (OC) composés d’ovocytes (GC) et de cellules de pré-granulosa (PC) sont délimités par
la membrane basale (MB). Les cellules mésenchymateuses (MC) sont situées dans le tissu interstitiel.
B : Au cours de la rupture des cordons ovigères, les ovocytes se réarrangent autour des pré-granulosa et la
membrane basale se désagrège. Un certain nombre d’ovocytes se dirige vers la voie de l’apoptose (en noir).
C : Après la rupture des cordons, les follicules primordiaux se forment constitués d’un seul ovocyte arrêté en
prophase I et entouré de quelques cellules de pré-granulosa aplaties, délimité par une nouvelle membrane basale et
entouré de cellules mésenchymateuses.
Les follicules sont composés d'un ovocyte entouré de cellules somatiques. Ils se forment par
fragmentation des cordons ovigères grâce à la coopération des cellules pré-granulosa, des
cellules parenchymateuses et des ovocytes. Si la présence des ovocytes n’est pas indispensable
pour la formation des cordons ovigères, elle l’est pour la formation des follicules puisqu'en
l’absence d’ovocytes, les structures épithéliales vont progressivement disparaitre et l’ovaire
régresser (Merchant 1975; Mazaud et al. 2002). Chez la brebis, les premiers follicules
primordiaux apparaissent vers 75 jpc. Le nombre de cellules germinales détecté à ce stade est
maximal et atteint 900 000 (McNatty et al. 1995). Un grand nombre d’ovocytes meurent par
apoptose programmée pendant la fragmentation. Une des raisons possibles de cette
dégénérescence est de permettre la fragmentation des gros cystes en plus petites structures
jusqu’à l’obtention d’ovocytes séparés. A la fin de cette période de dégénérescence, seul un
tiers des ovocytes chez la souris survivent et s’entourent des cellules aplaties de pré-granulosa
pour former les follicules (Figure 8) (Guigon and Magre 2006; Pepling 2006). Chez la brebis
entre 75 et 90 jpc, plus de 75% de cellules germinales sont perdues par apoptose (Smith et al.
1993). Au même moment, les cellules de l'épithélium ovarien prolifèrent activement (Sawyer et
al. 2002). Les cellules somatiques jouent aussi un rôle important dans le processus de formation
des follicules. Elles séparent physiquement les ovocytes et sécrètent des facteurs de croissance
et des molécules de signalisation qui agissent sur l’ovocyte.
Chez les mammifères la population de follicules primordiaux créée dans l’ovaire fœtal ou
néonatal constitue un pool fini d’ovoc tes appelé la réserve disponible pendant toute la
durée de vie reproductive des femelles.
11
Figure . Chronologie des principales étapes de la période fœtale chez l’homme et la
souris de la migration des C
la formation des follicules primordiaux.
Source (Sarraj and Drummond 2012)
En résumé (Figure 9)
La phase de multiplication et la formation des follicules chez les mammifères se déroulent
pendant la vie fœtale et néonatale en lien étroit avec la différenciation ovarienne. Des
différences importantes existent entre les espèces de mammifères et en particulier entre les
rongeurs et les autres espèces.
Les gonades se forment sur la face ventrale du mésonephros et sont colonisées par les cellules
germinales primordiales (CGP) d’origine extra embryonnaire. A leur arrivée dans les gonades,
les CGP perdent leur mobilité et deviennent des ovogonies. Elles se localisent en périphérie des
gonades indifférenciées (sauf chez les rongeurs, localisées dans toute la gonade) et
commencent à se multiplier.
La différenciation sexuelle des gonades dépend de la présence des CGP pour la femelle et de
l’expression de différents gènes. L’organisation des ovaires en deux zones (cortex-médulla)
dépendrait ensuite de l’activité stéroïdogène de l’ovaire (espèces à steroïdogenèse active/non
active). Chez les rongeurs, espèce à steroïdogenèse non active, la compartimentation et les
œstrogènes ne sont pas retrouvés. L’architecture de l’ovaire en cortex et médulla ne se fixe
qu’en période périnatale.
Le premier événement caractéristique de la différenciation ovarienne est l’entrée en méiose des
ovogonies qui deviennent des ovocytes I. L’initiation commence à la fin de la phase de
multiplication. La vitesse d’initiation de la méiose varie en fonction des espèces. Les rongeurs
ont une méiose immédiate et synchronisée et la femme, les ruminants ont une méiose retardée
et désynchronisée.
Les ovocytes vont interrompre la prophase I de méiose au stade diplotène et restent bloqués
jusqu’à la reprise de la méiose après la puberté. Ils sont regroupés en cordons ovigères. Les
follicules primordiaux, constitués d’un ovocyte entouré de quelques cellules aplaties de prégranulosa, se forment suite à la fragmentation de ces cordons avec la coopération des cellules
pré-granulosa, des cellules parenchymateuses et des ovocytes.
a population de follicules primordiaux ainsi créée constitue une réserve fixée d’ovoc tes.
12
Figure 1 . a folliculogenèse.
Ce processus est caractérisé par 2 phases : la croissance du follicule (folliculogenèse basale hormono
indépendante) puis la maturation du follicule (folliculogenèse terminale dépendante des hormones hypophysaires
FSH et LH).
spèce
souris rate
hamster
urée totale du
urée de développement
développement folliculaire en des follicules antrum en
1
3
lapine
brebis
1
1
vache
femme
Tableau . Comparaison de la durée du développement folliculaire entre espèces.
Le développement folliculaire
.
e développement folliculaire
La folliculogenèse ou développement folliculaire correspond à la succession des différentes
étapes à partir du moment ou le follicule sort de la réserve folliculaire, jusqu’à sa rupture à
l’ovulation ou son involution (atrésie folliculaire) (Figure 10). Chez les mammifères, c’est un
phénomène continu puisque chaque jour des follicules entrent en croissance et d'autres
dégénèrent. a folliculogenèse se divise
étapes
- l’activation de la croissance folliculaire,
- la début de la croissance folliculaire,
- la sélection du (des) follicule(s) destiné(s) à ovuler,
- la maturation du (des) follicule(s) pré ovulatoire(s).
’activation initiale se produit dès la formation des follicules primordiaux et jusqu’à
épuisement de la réserve folliculaire (ménopause chez la femme).
Les étapes suivantes du développement folliculaire se déroulent en 2 phases distinctes
(diZerega and Hodgen 1981) (Figure 11) en lien étroit avec le développement ovocytaire :
- une croissance basale longue appelée folliculogenèse basale ou précoce indépendante des
hormones hypophysaires (FSH, LH) mais contrôlée par de nombreux facteurs qui agissent de
manière autocrine et paracrine. C’est au cours de cette phase que s’effectue la croissance de
l’ovocyte et le début de la croissance folliculaire.
- suivie d’une croissance terminale rapide appelée folliculogenèse terminale ou tardive qui
se déroule à partir de la puberté (Tableau 2). Elle est strictement dépendante des hormones
gonadotropes FSH et LH. Le follicule évolue en follicule antral. C’est au cours de cette phase
que s’effectue la sélection du ou des follicule(s) destiné(s) à ovuler, la maturation de l’ovocyte
et la différenciation des cellules de la granulosa en cellules stéroïdogènes.
2.1 Réservefolliculaireetactivationinitialedelacroissance
Les follicules primordiaux ont un diamètre compris entre 30 et 50 μm chez la femme (Gougeon
1986), 20 μm chez la brebis (Lundy et al. 1999)), et sont localisés dans le cortex de l’ovaire. Ils
se composent d’un ovocyte d’environ 10-20 μm bloqué au stade diplotène de la prophase de
première division de méiose, entouré de quelques cellules précurseurs de la granulosa en forme
de faucille (pré-granulosa). Ils constituent la réserve folliculaire utilisable tout au long de la vie
reproductive de la femelle. Chez la femme, leur effectif est de 250 000 à 500 000 par ovaire à
13
Figure 11. rogression du diamètre folliculaire au cours du développement dans
différentes espèces.
Source (Griffin et al. 2006)
la naissance (Block 1953; Forabosco et al. 1991).
Un follicule primordial a quatre destins possibles:
i)
rester à l’état quiescent pour une durée plus ou moins longue pouvant aller jusqu’à
la fin de la vie reproductive de la femelle. Cette période varie d’un follicule à
l’autre, et d’une espèce à l’autre (jusqu’à 40 ans pour la femme).
ii)
être activé et commencer sa croissance folliculaire jusqu’à l’ovulation,
iii)
être activé, commencer sa croissance folliculaire mais celle-ci ne se prolonge pas et
le follicule dégénère par atrésie sur les stades de développement plus tardifs, ou
iv)
basculer directement vers l’atrésie (dégénérescence).
La taille et la persistance de la réserve de follicules primordiaux déterminent la durée de la vie
reproductive.
2.2 Lacroissancefolliculaire
Elle se traduit morphologiquement par la croissance de l’ovocyte, la multiplication des cellules
de la granulosa (CG) (50 à 100 millions en fin de maturation chez la femme (Gougeon 1986))
et la formation de l’antrum (cavité liquidienne creusée entre les CG). L’augmentation des
dimensions de cette cavité est essentiellement responsable de l’accroissement de taille du
follicule.
L’ovocyte et le follicule ne se développent pas simultanément. L’ovocyte croît très rapidement
pendant la phase basale alors que l’essentiel de la prolifération et de la différenciation des
cellules de granulosa est stimulée par la FSH (phase terminale) après la croissance de l’ovocyte
(Liu et al. 2006).
Les diamètres folliculaires augmentent progressivement et de manière non linéaire. Chaque
stade du développement est caractérisé par une taille folliculaire définie (Figure 11) (Griffin et
al. 2006). La durée totale du développement folliculaire est spécifique de l’espèce et varie
d’une vingtaine de jours chez les rongeurs, à plusieurs mois chez les mammifères de grande
taille (Tableau 2). La sélection des follicules est aussi différente selon les espèces puisqu'on
distingue les espèces mono-ovulantes et d'autres poly-ovulantes.
a. La folliculogenèse basale : de l’initiation du follicule primordial au
follicule pré-antral (~ 2mm)
L’ovocyte croît rapidement (~ 2 semaines chez la souris) pour atteindre 300 fois son volume
initial (Figure 12). Son diamètre passe de 13 à 80 μm chez la souris, ce qui représente
14
. Croissance basale chez la souris
3
m
m
m
. Croissance basale chez l’homme
Follicule primordial
Follicule primaire
Follicule secondaire
Follicule pré antral
Figure 1 . Croissance de l’ovoc te et multiplication des cellules de granulosa pendant la
Modifié de (Liu et al. 2006; Gougeon 2010)
80% de sa taille définitive (Eppig and O'Brien 1996) (35–120 m chez l’homme et la brebis
(Picton et al. 1998; Lundy et al. 1999)). Les chromosomes se décondensent de façon à assurer
une synthèse d'ARNm et la mise en place de l’embryogenèse. En fin de croissance l’ovocyte
contient 200 fois plus d’ARN qu’une cellule somatique, soit ~ 6 ng, dont 65% d’ARN
ribosomiques. Sur la totalité des ARNm synthétisés durant cette croissance, seulement 15%
sont traduits en protéines (par exemple celles de la zone pellucide), les autres, soit 85%, sont
stockés et ne seront utilisés que plus tard, lors du développement embryonnaire. On les qualifie
de transcrits maternels. Le taux de synthèse protéique augmente de 38 fois entre le début et la
fin de la croissance ovocytaire chez la souris, ce qui dénote une activité métabolique intense
(Schultz et al. 1979; Liu et al. 2006).
La transcription et la traduction sont variables au cours de la croissance de l’ovocyte (Pan et al.
2005). Ces régulations transcriptionnelles (facteurs de transcription, polyadenylation, 3’ et 5’
non codants, dégradation…) et traductionnelles (petits ARN, piRNA…) font intervenir des
mécanismes complexes finement régulés et stades-dépendant qui sont indispensables pour
obtenir un ovocyte de bonne qualité (Sánchez and Smitz 2012). C’est au cours de cette phase
basale que les ovocytes acquièrent la compétence à reprendre la méiose (Monniaux et al. 1997).
Enfin, l’ovocyte secrète des facteurs spécifiques qui contrôlent le développement folliculaire et
sa propre croissance (BMP15; GDF9). Dans le même temps, les cellules de la granulosa
n’auront formé que trois couches de cellules cuboïdales (Liu et al. 2006).
lles mettent en
place des communications bidirectionnelles avec l’ovoc te. En fin de phase pré-antrale, elles
rentrent toutes en prolifération et deviennent volumineuses.
La folliculogenèse basale se déroule indépendamment des hormones hypophysaires mais sa
régulation fait intervenir des facteurs autocrines et paracrines qui seront développés dans le
chapitre suivant.
Follicules primaires
Après activation, les follicules primordiaux (Type 1 classification (Lundy et al. 1999)) se
transforment en follicules primaires (Type 2, environ 46 et 75 μm de diamètre pour la vache et
la brebis (Hulshof et al. 1994; Lundy et al. 1999)) composés d'une couche de cellules
folliculaires cubiques (les cellules de granulosa) qui entoure l'ovocyte. Entre le follicule et la
membrane du stroma ovarien apparait une lame basale, appelée la membrane de Slavjanski, qui
isole le follicule du reste de l'ovaire. Dans l’ovocyte, la synthèse de transcrits est maximale en
début de croissance jusqu’au stade primaire. Les cellules de la granulosa établissent des
onctions communicantes entres elles et l'ovoc te pour permettre le passage de petites
15
molécules dans l'ovocyte. Elles acquièrent les récepteurs de la FSH (Oktay et al. 1997).
Follicules secondaires
Le développement se poursuit avec la prolifération des cellules de granulosa et conduit à la
formation des follicules secondaires (Type 3, > 75 μm chez la souris) constitués de plusieurs
couches de cellules de granulosa (au moins deux couches) (Figure 12). Dans l’ovocyte, la
synthèse de transcrits commence à diminuer (Pan et al. 2005) par rapport au stade de
développement précédent. Une membrane glycoprotéique, nommée zone pellucide, se forme
entre la membrane plasmique de l’ovocyte et les cellules de la granulosa. Elle joue un rôle
important dans le maintien de la structure de l’ovocyte et participera plus tard au
développement et à la fertilisation de l’ovocyte ainsi qu'au développement pré-implantatoire de
l’embryon. Elle est constituée de 3 ou 4 protéines (ZP1-2-3-4) qui sont relativement bien
conservées entre les espèces. Chez la souris, la zone pellucide est composée des protéines ZP1
à ZP3, chez les bovins et les porcins, la ZP1 est absente et chez l’homme les quatre protéines
(ZP1 à 4) sont retrouvées (Goudet et al. 2008). Chez la souris et l’homme, ZP1 se lie à la
matrice fibreuse formée par ZP2 et 3 (Picton et al. 1998). Ces protéines sont détectées au début
de la croissance folliculaire chez la souris et dans l’ooplasme, dès le stade primordial chez
l’homme. La synthèse va ensuite s’amplifier jusqu’à recouvrir complètement l’ovocyte dans les
follicules secondaires de plus de 6 couches de cellules. Une légère production de ZP est
montrée chez l’homme avant la formation des follicules et dans les cellules de la granulosa
(Gook et al. 2008; Törmälä et al. 2008). La zone pellucide forme des onctions qui permettent
le couplage ovoc te cellules de la granulosa. Les prolongements cytoplasmiques issus des
cellules de granulosa traversent la zone pellucide pour assurer l'approvisionnement de
l'ovocyte. Les cellules de la granulosa sont peu vascularisées mais les follicules sont soumis
aux facteurs circulants du sang par de petites artérioles proches de la membrane de Slavjanski
(Gougeon 2010). A la fin de la croissance du follicule secondaire, les cellules du stroma
ovarien qui sont à la périphérie de la membrane de Slavjanski s’alignent pour constituer la
thèque. Les cellules de la thèque acquièrent les récepteurs à la LH.
Follicules pré antraux
La thèque se différencie ensuite en 2 parties : la thèque interne et externe. La thèque interne est
vascularisée et contient les cellules stéroïdogènes qui expriment les enzymes permettant la
synthèse des progestagènes et androgènes ainsi que les récepteurs de la LH. Elle commence à
synthétiser des androgènes et de nombreux facteurs de croissance capables de stimuler la
prolifération des cellules de granulosa. La thèque externe correspond à un tissu conjonctif
16
Acquisition des
Follicule
Follicule à
Début de la folliculogenèse
primordial
antrum
terminale
Rate
0,03 à 0,05
0,2
0,2
0,5
0,5 à 0,8
Brebis
0,03 à 0,05
0,2
2
3 à 3,5
6à7
Truie
0,03 à 0,05
0.2
1
5
7 à 11
Vache
0,03 à 0,05
0,2
3à4
9
10 à 20
Jument
0,03 à 0,05
0,2
10
15
45
Femme
0,03 à 0,05
0,2
3à5
10 à 12
20
Espèces
récepteurs de LH sur la
Ovulation
granulosa
Tableau 3. Diamètres folliculaires (en mm) aux principales étapes du développement folliculaires
chez différents mammifères.
Figure 13. Différents stades de follicules de la croissance folliculaire, ainsi que leurs limites de
taille et leur classification chez l’homme.
Modifié de (Gougeon 2011)
Les temps de passage des follicules dans chaque classe montrent qu’environ 90 jours sont nécessaires pour qu’un grand
follicule primaire atteigne le stade pré-antral et que 70 jours seront nécessaires à ce dernier pour qu’il atteigne une taille
d’environ 2 mm.
fibreux. Au cours de cette période, les récepteurs à la FSH augmentent progressivement dans
les cellules de la granulosa, la taille du follicule augmente par multiplication intense des
cellules de la granulosa et des espaces intercellulaires se constituent. A ce stade, les follicules
mesurent en moyenne 200 μm quelle que soit l’espèce (Type 4) (Monniaux et al. 2009).
Follicules petit antrum
Les follicules pré-antraux se transforment ensuite en follicules tertiaires (Type 5). Des petites
cavités remplies de liquide folliculaire, à la composition proche du sérum sanguin, apparaissent
et vont fusionner pour former une cavité dans la granulosa que l’on nomme antrum. L’essentiel
de la croissance ovocytaire est réalisé. Le diamètre de l’ovocyte est passé de 40 μm pour le
follicule primaire à 100 μm dans le follicule à petit antrum chez l’homme. Sa croissance sera
ensuite plus lente pour atteindre sa taille finale de 140 μm. En fin de croissance basale,
l’ovocyte acquiert la compétence à reprendre la méiose et son activité transcriptionnelle se
ralentit jusqu’à devenir indétectable (Pan et al. 2005). L’acquisition de cette compétence
correspond à une taille de follicules déterminée qui varie en fonction des espèces. Le
cytoplasme de l’ovocyte se réorganise en fonction des nouvelles protéines synthétisées et des
organelles. Le nombre de mitochondries et de ribosomes augmente. Les organelles se
vacuolisent et migrent vers la périphérie pour former les granules corticaux. L’ooplasme
accumule les vésicules de stockage de glycogène, lipides et protéines et le transport de
molécules au travers de la membrane s’amplifie (Picton et al. 1998). Les cellules de la
granulosa qui entourent l’ovocyte constituent alors le cumulus oophorus. Le follicule devient
capable de fabriquer des œstrogènes car il possède les deux types cellulaires (granulosa et
thèque) nécessaires à leur synthèse et acquiert la capacité à être stimulé par les gonadotrophines
(Drummond 2006). Les follicules continuent à croître jusqu’à atteindre une taille déterminée
pour devenir un follicule sélectionnable. Cette taille varie de 200 μm chez les rongeurs à 2-5
mm chez l’homme (Tableau 3).
Le temps nécessaire à un follicule primordial pour atteindre le stade pré-antral varie de 4 à 5
mois (brebis, femme, Tableau 2). Ensuite, 70 jours supplémentaires seront nécessaires pour
arriver à la taille de 2 mm chez la femme (Gougeon 2010). Les tailles des différents stades
folliculaires au cours de la folliculogenèse basale ainsi que la durée de croissance sont
mentionnées Figure 13.
17
b. A la puberté : la phase terminale
La folliculogenèse terminale correspond à la maturation de l’ovocyte et la différenciation des
cellules de la granulosa. Elle est strictement dépendante des hormones gonadotrophes
hypophysaires FSH et LH, elles-mêmes contrôlées par la neurohormone de l'hypothalamus : la
GnRH (luteinizing-releasing hormone), régulateur de l’activité ovarienne. Au sein de chaque
follicule, des régulations de nature paracrine (entre thèque et granulosa et entre granulosa et
ovocyte) et autocrine modulent la sensibilité des follicules aux gonadotropines.
Cette phase terminale se déroule par vagues folliculaires et se décompose en 3 périodes :
recrutement, sélection et dominance.
En début de phase folliculaire, un groupe de follicules sélectionnables (3 à 11 chez la femme),
c'est-à-dire qui ont atteint le diamètre requis (entre 2 et 5 mm chez l’homme (Gougeon 1996),
2 mm chez la brebis et la vache (Webb et al. 2003) et dont les cellules de granulosa sont
réceptives à FSH, va être recruté. La FSH stimule alors la prolifération des cellules de
granulosa et induit un développement rapide du follicule qui devient un follicule antral. Le
recrutement est suivi d’une diminution de concentration de FSH circulante en réponse au
rétrocontrôle excercé par l’oestradiol et l’inhibine secrétés par les cellules de granulosa sur
l’axe hypothalamo-hypophysaire.
Une hiérarchie fonctionnelle s’établit progressivement entre les follicules aboutissant à la
sélection du ou des follicule(s) destiné(s) à l'ovulation. Les follicules les plus développés sont
toujours stimulés par la FSH. Le nombre de cellules de granulosa augmentant, le nombre de
récepteurs à la FSH s'accroît conjointement et le niveau circulant de FSH diminue
progressivement. Ces follicules deviennent dominants. Ces mécanismes permettent de réguler
le nombre d’ovulations qui est spécifique d’une espèce et d’une race.
Au terme de la croissance folliculaire et sous l’effet de la décharge ovulante de LH, les
mécanismes de l’ovulation s’enclenchent. Les cellules de la granulosa perdent leur capacité à se
multiplier.
La maturation ovocytaire correspond à la reprise de la méiose dans la cellule germinale
femelle et aboutit à la formation de l’ovocyte II. Elle ne dure que quelques heures chez la
femme (36h).
Cette phase terminale ne sera pas détaillée dans ce manuscrit puisque nous nous limitons à la
thématique de notre projet de recherche (folliculogenèse basale).
18
Figure 1 . ourcentage de follicules entrant en atrésie pendant la croissance folliculaire.
Source (Gougeon 1996)
Figure 1 .
aspillage ovoc taire au cours de l’ovogenèse.
L’atrésie ovocytaire et folliculaire
3.
’atrésie ovoc taire et folliculaire
La perte d’ovocytes concerne tous les stades de l’ovogenèse selon deux phénomènes
prépondérants. La perte la plus importante des cellules germinales s’effectue au cours de la
période fœtale jusqu’au follicule primordial quiescent et implique des mécanismes d’apoptose
(destruction programmée et contrôlée). Après la naissance et pendant la phase de croissance
folliculaire, l’élimination des ovocytes implique des mécanismes d’atrésie folliculaire.
3.1 L’atrésieovocytaire
Une première vague d’apoptose ovocytaire concerne une grosse proportion des CGP et
s’effectue, chez la souris, quand les ovogonies cessent de se multiplier et initient la méiose.
Une deuxième vague coïncide avec la rupture des niches d’ovogonies et est nécessaire pour
l’assemblage des follicules primordiaux. Les ovocytes apoptotiques ont alors un noyau et un
cytoplasme condensés avec l’ADN fragmenté. Différentes hypothèses peuvent expliquer la
raison de cette apoptose ovocytaire : (i) ovocytes de faible qualité (une perte de l’intégrité de
l’ADN, manque d’énergie), (ii) l’auto sacrifice nécessaire pour casser les ponts cytoplasmiques
entre ovogonies et former les follicules primordiaux, (iii) mort cellulaire pour servir de cellule
nourricière en transférant les organites aux ovocytes survivants grâce aux jonctions
communicantes comme chez la drosophile, (iv) ou autre (manque de facteurs de croissance ou
de support somatique… (pour revue (Aitken et al. 2011)).
3.2 L’atrésiefolliculaire
La plupart des follicules n’atteignent pas l’ovulation et vont se diriger vers un mécanisme de
dégénérescence appelé atrésie folliculaire, puisque seul(s) le (les) follicule(s) dominant(s) est
(sont) sélectionné(s) pour l’ovulation. L’atrésie folliculaire concerne 99% des follicules en
croissance (Figure 14). Ainsi chez la femme, sur les 6-7 millions d’ovocytes présents au 5ème
mois de grossesse, seuls 400-500 sont destinés à ovuler après la puberté (Figure 15).
Morphologiquement, l’atrésie est reconnaissable par des anomalies morphologiques dans
l’ovocyte (condensations nucléaire et cytoplasmique…) et l’apparition de grains de pycnose
dans les cellules de la granulosa (Hussein 2005).
19
Figure 1 . rincipales étapes de la folliculogenèse et de la maturation de l’ovoc te.
Développement et atrésie folliculaire
La folliculogenèse débute lorsque le follicule primordial quitte la réserve ovarienne, et se
termine à l’ovulation par la libération d’un ou plusieurs ovocytes par cycle, en fonction des
espèces. Folliculogenèse et ovogenèse sont indissociables. Le dialogue entre les différents
types cellulaires est un élément déterminant qui contribue à la régulation du développement
folliculaire et ainsi à une production de gamètes femelles de qualité. Le follicule apporte à
l’ovocyte qu’il renferme, l’environnement nécessaire à sa croissance et sa maturation.
L’ovocyte sécrète des facteurs spécifiques qui contrôlent le développement folliculaire ainsi
que sa propre croissance.
Ce processus se divise en deux phases
la folliculogenèse basale. Après l’activation des follicules primordiaux, la croissance de
l’ovocyte est rapide et quasiment achevée à la fin de cette période. L’ovocyte augmente son
activité transcriptionnelle et traductionnelle pour permettre sa croissance, la formation de la
zone pellucide et le stockage des ARNs et protéines nécessaires à la mise en place de
l’embryogenèse. L’activité transcriptionnelle est maximale en début de croissance puis diminue
pour devenir indétectable en fin de croissance ovocytaire. Les cellules de la granulosa entrent
en prolifération. La thèque se forme. D’étroites communications se mettent en place entre les
types cellulaires. Un couplage ovocyte-cellules de granulosa s’effectue grâce à la formation de
jonctions dans la zone pellucide et à des prolongements cytoplasmiques issus des cellules de
granulosa. De la même manière, la synthèse d’œstrogènes est effectuée par les cellules de
granulosa à partir des androgènes produits par la thèque interne. C’est au cours de cette phase
que les ovocytes acquièrent la compétence à reprendre la méiose.
- la folliculogenèse terminale qui se déroule à l’âge adulte et sous contrôle endocrinien
hypothalamo-hypophysaire (GnRH, FSH et LH) et ovarien (hormones stéroïdes et peptidiques).
C’est au cours de cette phase que s’effectue, de manière cyclique sous l’effet de la FSH, la
sélection du (des) follicule(s) destiné(s) à ovuler, la maturation de l’ovocyte et la
différenciation des cellules de la granulosa. La maturation finale du (des) follicule(s) est
contrôlée par la LH et s’achève avec le déclenchement d’une ou plusieurs ovulations, dont le
nombre est spécifique de chaque espèce de mammifères et de chaque race.
Par ailleurs, tout le long de la folliculogenèse, l’ovaire est le siège d’un énorme gaspillage de
cellules germinales provoqué par l’atrésie folliculaire. Ce gaspillage permet de maintenir par
cycle un nombre constant d’ovulations dans chaque espèce.
20
Figure 1 . oie de signalisation canonique
T caténine.
Source (Tevosian and Manuylov 2008)
A) Voie de signalisation non activée en l’absence de ligands
B) Voie de signalisation activée
C) Voie de signalisation inhibée
Figure 1 . llustration de la voie de signalisation
Source (Zheng et al. 2012)
En rouge les molécules de signalisation inhibitrice
En vert les molécules de signalisation activatrice.
3 .
Chapitre III Aspects moléculaires
Description générale des mécanismes
Les processus de l’ovogenèse et de la folliculogenèse sont contrôlés par de nombreux facteurs
et dépendent d’interactions CGP-cellules somatiques. Certaines voies de signalisation et gènes
jouent en particulier un rôle pivot dans ces processus.
Nous ferons donc dans un premier temps une description générale de ces mécanismes. Par
convention, nous écrirons les gènes en italiques. Les gènes des rongeurs seront en minuscules
et les gènes des autres espèces en majuscules. Les protéines seront en majuscules.
1. Description générale des mécanismes
WNT (Wingless-Type MMTV Integration Site Family) est une grande famille de
glycoprotéines principalement connues pour son rôle au cours du développement
embryonnaire. Elle régule pour de nombreux types cellulaires différents processus tels que la
différenciation, la détermination de la destinée, la mobilité et l’apoptose (pour revue (Boyer et
al. 2010). La signalisation WNT est relayée par 3 voies différentes de transduction connues : la
voie canonique WNT/ȕ caténine (CTNNB1) et non canoniques : la voie WNT/ Ca ++ et la voie
de polarité planaire des cellules. La voie de transduction WNT/ȕ caténine est la mieux
caractérisée dans l’ovaire (Figure 17). Elle est activée par la liaison de WNT sur un récepteur
de la famille Frizzed (FZD) et un corécepteur LRP (LDL-receptor-related protein). Le signal
est ensuite transmis par Disheveled (DSH) qui libère CTNNB1 du complexe APC
(adenomatous polyposis coli)/AXIN/ GSK3ȕ (glycogen synthase kinase 3beta) et permet sa
translocation dans le noyau ou il régule les gènes. La voie de transduction WNT/ȕ caténine est
modulée par différentes protéines: les protéines SFRP4 (Secreted frizzled-related protein 4) et
WIF1 (WNT Inhibitory Factor 1) qui se lient à WNT pour empêcher son interaction avec les
récepteurs FZD, DKK (dickkopf) qui se lie au corécepteur LRP, les RSPO (R-spondin) qui
inhibent l’activité PDK et GSK3ȕ (qui phosphoryle CTNNB1).
Cette voie de signalisation est composée de kinases, phosphatases et facteurs de transcription
(Figure 18). Les protéines PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) sont divisées en trois classes
majeures (classe I, II et III) sur la base de leur structure et de la spécificité de leurs substrats.
Elles se présentent sous la forme d’hétérodimères constitués d’une sous unité régulatrice et une
21
sous unité catalytique. La classe I des PI3K est divisée en deux sous familles dépendantes des
récepteurs auxquels elles se couplent. La classe IA est activée par les récepteurs RTK sous
l’effet de facteurs de croissance et cytokines (insuline, IGF1 (insulin like growth factor 1),
PDGF (platelet derived growth factor), EGF (epidermal growth factor), KITL (kit-ligand
appelé aussi Stem cell factor), VEGF (vascular endothelial growth factor)…). La classe IB est
activée par des récepteurs couplés à des protéines G (GPCR : G-Protein Coupled Receptor).
Une fois activée par les récepteurs, la sous unité régulatrice de PI3K transforme PIP2
(phosphoinositol 4,5 bis phosphate) en PIP3 (phosphoinositol 3, 4, 5 triphosphate). PIP3 agit
ensuite comme second messager et à son tour recrute des kinases à domaines PH comme PDK1
(pyruvate dehydrogenase kinase, isoenzyme 1) (Figure 18). PDK1 à son tour active d’autres
kinases comme AKT (thymoma viral proto-oncogene) et S6K1 (ou RPS6KB1 : ribosomal
protein S6 kinase, polypeptide 1). Une fois activée, AKT peut réguler différentes fonctions par
phosphorylation des protéines: BCL2 (B cell leukemia/lymphoma 2) (apoptose et survie),
FOXO3A (Forkhead o3a) (apoptose et arrêt de la prolifération), P27KIP1 (cyclin-dependent
kinase inhibitor 1B) (blocage du cycle cellulaire), GSK3 (glycogen synthase kinase 3 beta)
(augmentation de la synthèse de glycogène), TSC (Tuberculous sclerosis complex) (énergie
cellulaire, facteurs de croissance) et S6K1 (synthèse des ribosomes et traduction des protéines
dans l’ovocyte via l’activation de RPS6 (ribosomal protein S6)).
PTEN (Phosphatase and Tensin homolog) est capable de reverser le passage PIP2/PIP3 et
fonctionne ainsi comme un régulateur négatif de l’action de PI3K classe I (Adhikari and Liu
2009).
P27KIP1 est un membre de la famille des CIP/KIP, inhibitrices des kinases cyclinesdépendantes (CDK) et donc du cycle et de la croissance cellulaire
Les protéines TSC1 et 2 sont les produits de deux gènes distincts suppresseurs de tumeurs. Les
protéines forment un hétérodimère pour réguler négativement l’activité du complexe mTORC1
(mamalian target of rapamycin). TSC2 possède un domaine régulateur correspondant à une
protéine activatrice de GTPase (GAP) et TSC1 stabilise le complexe et protège TSC2 de
l’ubiquitination et la dégradation (Reddy et al. 2008)
FOXO3a fait partie des facteurs de transcription forkhead de la famille FOXO caractérisée par
la présence de sites de phosphorylation AKT. Il est régulé par PI3K et PTEN. Après sa
phosphorylation par AKT, la protéine FOXO3 est transloquée dans le cytoplasme et perd son
activité (Adhikari and Liu 2009).
22
Une activité optimale de PI3K dans l’ovaire est cruciale pour maintenir le développement et
la physiologie de l’ovaire ((Zheng et al. 2012).
1.3 SystèmeKITL/KIT
KITL intervient à plusieurs niveaux au cours de l’ovogenèse et de la folliculogenèse ovarienne
(migration, prolifération et survie des CPG, activation des follicules primordiaux, croissance
ovocytaire, arrêt de méiose, prolifération des cellules de granulosa, stéroïdogenèse …) et joue
un rôle fondamental dans la fertilité des rongeurs. Chez l’homme des mutations dans ce gène
sont montrées responsables de différentes maladies dont certains cancers mais sont, à ce jour,
sans effet sur la fertilité (Hutt et al. 2006). Les profils d’expression spatio temporelle de KITL
et de son récepteur KIT (ou c-kit ; v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene
homolog) ont été déterminés dans différentes espèces comme les primates (Gougeon and Busso
2000), la femme (Stoop et al. 2005), la brebis (Tisdall et al. 1997; Tisdall et al. 1999) et les
rongeurs (Manova et al. 1990; Doneda et al. 2002). De manière générale, les CGP, les ovocytes
et la thèque expriment KIT et les cellules de granulosa expriment KITL L’activation majeure du
récepteur KIT est celle de la voie de signalisation PI3K/AKT (Thomas and Vanderhyden
2006).
1.4 LavoiedesignalisationduTGF.
La super famille du TGF (transforming growth factor, beta) est composée d’une trentaine de
membres regroupés en 4 familles principales: TGF, activines et inhibines (INH), GDF
(growth differentiation factor) et BMP (bone morphogenetic protein) et comprend d’autres
membres comme l’AMH (anti-Mullerian hormone). Leur forme active est constituée d’homo
ou hétérodimères (BMP-2/BMP-7 ou BMP-2/BMP-6 par exemple) qui agissent au niveau
ovarien sur la différenciation et la prolifération (Drummond 2005). Les membres de la famille
TGF se fixent sur un récepteur membranaire à activité de type serine/thréonine kinase et qui
est composé de deux sous unités. Après fixation du dimère sur la sous unité de type II, la sous
unité de type I est recrutée et les résidus serines et thréonines du domaine GS sont
phosphorylés. La transduction du signal des récepteurs jusqu’au noyau est ensuite assurée
principalement par phosphorylation des SMAD (mothers against decapentaplegic, Drosophila,
homolog O).
On distingue trois groupes fonctionnels différents de SMAD:
- les SMAD associés au récepteur ou R-SMAD, qui sont spécifiques d’un ligand,
- les co-SMAD, médiateurs communs pour tous les membres de la famille (SMAD 4),
23
Figure 1 . Composants ma eurs de la signalisation des principaux membres de la famille
T F et combinaisons possibles entre facteurs et récepteurs.
Source (Feng and Derynck 2005)
Figure
. oie de signalisation des T F et sa régulation.
Modifié de (Itman et al. 2006)
- et les SMAD inhibiteurs ou I- SMAD (ex : SMAD 7).
La Figure 19 présente les composants majeurs de la signalisation ainsi que les interactions entre
facteurs et récepteurs pour des principaux membres de la famille TGF. La régulation de la
voie de signalisation du TGF s’effectue à plusieurs niveaux. Au niveau extracellulaire, les
TGF sécrétés sont modulés par des molécules antagonistes comme NOG (noggin), CHRD
(chordin), FST (follistatine) et les protéines DAN (differential screening selected gene
abberative in neuroblastoma ) (GREM1 et 2 : gremlin homolog, cysteine knot superfamily;
Xenopus laevis)) (Myers et al. 2011). Au niveau membranaire, l’activité des récepteurs BMP
peut être modulée par le pseudo-récepteur BAMBI (BMP and Activin membrane bound
inhibitor) tronqué du domaine kinase qui fixe les ligands mais est incapable de transmettre un
signal. L’immunophiline FKBP-12 (FK506 binding protein 1a) est aussi décrite comme étant
un inhibiteur commun aux récepteurs de type I. Au niveau intracellulaire, des facteurs comme
les I-SMAD (SMAD6 et 7) et SMURF (SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1) inhibent
la voie de signalisation respectivement par compétition avec les R-SMAD ou par dégradation
des R-SMAD par ubiquitination. Les facteurs RNF111 (ou ARKADIA: ring finger 111, E3
Ubiquitin-Protein Ligase) et SARA (ou ZFYVE9 : zinc finger, FYVE domain containing 9)
favorisent cette voie TGF par ubiquitination des I-smad ou en interagissant avec les récepteurs
et les SMAD (Feng and Derynck 2005; Miyazono and Koinuma 2011). La Figure 20
schématise le processus général de cette voie de signalisation.
En particulier, l’AMH et son récepteur, l’AMHR type II (AMHR2), sont exprimés dans les
cellules de granulosa des follicules en croissance (à partir du follicule primaire). La cinétique
d’expression d’AMH est similaire dans les espèces humaine, ovine et chez les rongeurs. Son
expression est maximale des follicules secondaires aux follicules à petit antrum puis elle
diminue progressivement pour disparaitre en développement terminal (Baarends et al. 1995).
1.5 LavoiedesignalisationFGF
La famille du FGF (fibroblast growth factor) est une famille de gènes composée de 22 peptides,
connue pour son implication dans la fonction ovarienne. Différents membres de cette famille
sont impliqués dans le développement folliculaire et l’ovulation (FGF-1, -2, -5, -7, -8, -9,- 11)
pour revue ((Chaves et al. 2012)). Les FGF se fixent sur des récepteurs FGFR à forte ou faible
affinité. Parmi les 5 récepteurs à forte affinité (FGFR1-5), quatre sont des récepteurs à tyrosine
kinase. Après fixation sur ces récepteurs, les FGF peuvent activer deux voies de signalisation :
Ras-MAPK (ou HRas1 : Harvey rat sarcoma virus oncogene 1- mitogen-activated protein
kinase 1), PI3K-AKT, ainsi que diverses protéines de signalisation comme la phospholipase
24
Figure 21. Rôle de FOXL2 dans l’ovaire.
Modifié de (Pisarska et al. 2011; Caburet et al. 2012)
FOXL2 fonctionne en dimères et requiert des modifications post transcriptionnelles pour être activé. Il forme aussi
"#$&* <
nscription des gènes
varie en fonction du stade de développement ovarien.
Ovogenèse fœtale
cȯ, STAT (signal transducer and activator of transcription), GAB1 (growth factor receptor
bound protein 2-associated protein 1) (Eswarakumar et al. 2005).
1.6 FOXL2
La protéine FOXL2 (FORKHEAD box L 2) agit comme un facteur de transcription classique
en régulant l’activité promotrice des gènes par liaison sur l’ADN. Dans l’ovaire, le gène foxl2
est détectable dès la différenciation sexuelle des gonades dans les cellules somatiques puis est
principalement exprimé dans les cellules pré-granulosa des follicules primordiaux. Son
expression diminue ensuite dans les follicules pré-antraux de souris. Foxl2 est également
exprimé à l’âge adulte. La séquence de ce gène et son expression dans l’ovaire sont très
conservées entre vertébrés (Baron et al. 2005). FOXL2 intervient dans la régulation de
différentes voies métaboliques telles que celles du cholestérol, des stéroïdes, l’apoptose, la
détoxification des espèces réactives oxygénées (ROS : Reactive Oxygen Species) et la
prolifération cellulaire. La fonction de FOXL2 est enfin modulée par des modifications posttranscriptionnelles qui activent (SUMOylations et phosphorylations) ou réduisent (acétylation :
sirtuine 1 déacétylase NAD-dependante (Sirt1)) son activité (Pisarska et al. 2011) (Figure 21).
La protéine FOXL2 est capable par exemple de stimuler les kinases 4 ou 6 (CDK4, CDK6) et
de contrôler la phase de progression G1-S du cycle cellulaire des cellules de la granulosa. Ceci
s’accompagne d’une protection accrue contre le stress oxydatif (augmentation de la réparation
de l’ADN) (Benayoun et al. 2011). FOXL2 peut aussi moduler l’activité d’autres facteurs de
transcription (ESR1, SMAD3, DP103 (DEAD box-containing)…) sans se fixer à l’ADN
(Caburet et al. 2012) et réguler de manière indirecte les différentes voies de signalisation. Il se
lie, par exemple, avec la protéine DEAD box- containing (DP103) et leur co-expression
favorise l’apoptose in vitro (pour revue :(Caburet et al. 2012)). La réponse apoptotique induite
par FOXL2 semble aussi dépendre de la caspase 8, BID (BH3 interacting domain death
agonist) et BAK (BCL2-antagonist/killer 1) (Baillet et al. 2011).
2. Ovogenèse fœtale
2.1 Formation des cellules germinales primordiales
BMP4, BMP8B (d’origine ectodermique) et BMP2 (d’origine endodermique) sont
indispensables à la formation des CGP (Lawson et al. 1999; Ying et al. 2000; Ying and Zhao
2001). Le rôle des facteurs de transcription a également été démontré par des invalidations
partielles ou totales de ces gènes chez la souris. Ainsi des gènes tels que prdm1 (PR Domain-
25
Figure22. Spécialisation des cellules somatiques en cellules germinales.
Source (Bowles and Koopman 2010)
Les facteurs extrinsèques BMP4, BMP8B et BMP2 agissent sur l’épiblaste pour définir une région permettant la
formation des précurseurs des CGP. WNT3 agit sur les cellules de l’épiblaste pour les rendre aptes à répondre aux
BMP. Le facteur intrinsèque LIN28 est nécessaire pour l’expression de prdm1 qui, avec PRDM14, semble inhiber
l’expression des gènes somatiques et favoriser la ré-acquisition de la pluripotence. Enfin les modifications
chromatiniennes spécifiques des CGP apparaissent et l’expression des gènes spécifiques des CGP est induite.
Figure23. Cascade des événements conduisant à la formation des gonades.
Source (Baillet et al. 2011)
Plusieurs gènes sont nécessaires à la formation des crêtes génitales puis des gonades indifférenciées. La
différenciation des cellules somatiques des gonades va être initiée sous l’action de gènes à expression sexespécifique pour aboutir au développement de gonades mâles ou femelle.
Ovogenèse fœtale
Containing Protein 1 ou Blimp1), prdm14, répresseurs de transcription, sont essentiels pour la
spécialisation des cellules somatiques en CGP (Vincent et al. 2005; Kurimoto et al. 2008) et
leurs migrations. Même si le rôle précis de ces deux gènes est mal connu, ils seraient impliqués
dans la répression de l’expression des gènes d’origine somatique au profit de ceux des CGP.
Des marqueurs de pluripotence comme OCT4/NANOG (POU class 5 homeobox 1/nanog
homeobox) sont exprimés dans les CGP et essentiels pour leur survie (Kehler et al. 2004;
Yamaguchi et al. 2009). Enfin d’autres facteurs comme NANOS3 (nanos homolog 3,
Drosophila) and DND1 (dead end homolog 1, zebrafish) protègeraient également les CGP de
l’apoptose chez la souris (Tsuda et al. 2003; Youngren et al. 2005) (Figure 22).
2.2 Formation des crêtes génitales
Plusieurs gènes, codant pour des facteurs de transcription, tels que lhx9 (LIM Homeobox gene
9), lim1 (LIM Homeobox gene 1) et emx2 (Empty Spiracles, Drosophila, 2, Homeobox of 2)
(Shawlot and Behringer 1995; Miyamoto et al. 1997; Birk et al. 2000) jouent un rôle crucial
dans la formation des crêtes génitales. D’autres facteurs comme WT1 (Wilms tumor 1) et SF1
(splicing factor 1) sont indispensables pour le maintien et le développement des gonades
(Figure 23) (Kreidberg et al. 1993; Sadovsky et al. 1995). L’invalidation de ces gènes conduit à
l’absence (agénésie) ou la dégénérescence des gonades (Tableau 4). Enfin, les facteurs CBX2
(M33 : Chromobox homolog 2, Drosophila, polycom class), le facteur de transcription 21
(Tcf21/POD1) et les protéines SMOCS 1 et 2 (SPARC-related Modular Calcium-Binding 1 et
2) participent aussi au maintien et à un développement normal des gonades (Katoh-Fukui et al.
1998; Cui et al. 2004; Pazin and Albrecht 2009).
2.3 Migration des CGP
La migration et la multiplication des CGP sont contrôlées par de nombreux facteurs et
dépendent d’interactions CGP-cellules somatiques. Parmi les facteurs impliqués, le facteur
KITL exprimé par les cellules somatiques présentes le long des voies de migration et son
récepteur KIT, exprimé par les CGP jouent un rôle de chimio-attractant dans le processus de
migration. D’autres couples chimio-attractant comme SDF1-CXCR4 (ou CXCL12 chemokine
(C-X-C motif) ligand 12/chemokine (C-X-C motif) receptor 4) et WNT5A-ROR2 (receptor
tyrosine kinase-like orphan receptor 2) ont également été mis en évidence (Molyneaux et al.
2003; Laird et al. 2011). Des facteurs comme FGF2 (fibroblast growth factor 2, basic) et FGF4
interviennent respectivement dans la mobilité et le nombre des CGP (Takeuchi et al. 2005).
BMP4 et BMP2 sont capables d’augmenter le nombre de CGP en culture chez la souris
26
Nom du gène
Type de protéine
Effet de l'invalidation chez la souris
Références
lhx9
Facteur de
transcription
Absence de formation des crêtes
génitales
Birk et al. (2000)
lim1
Facteur de
transcription
Absence de formation des crêtes
génitales
Shawlot et al. (1995)
emx2
Facteur de
transcription
Absence de formation des gonades
indifférenciées
Miyamoto et al.
(1997)
wt1
Facteur de
transcription
Dégénérescence des crêtes génitales
néoformées
Kreidberg et al.
(1993)
sf1
Facteur de
transcription
Dégénérescence des crêtes génitales
néoformées
Luo et al. (1994)
Sadovsky et al.
(1995)
m33
Facteur de
transcription
Retard de la formation des gonades
indifférenciées
Katoh-Fukui et al.
(1998)
pod1
Facteur de
transcription
Hypoplasie des gonades indifférenciées
Cui et al. (2004)
smoc1
Protéine de la
matrice
extracellulaire
Défaut de différenciation et absence du
maintien des gonades indifférenciées
Pazin et al. (2009)
Tableau 4. Effet de l’invalidation de gènes intervenant dans la mise en place de la gonade
chez la souris. Source (Baillet et al. 2011)
Figure 24. La différenciation sexuelle chez les souris.
Source (Schlessinger et al. 2010)
Sry exprimé dans les cellules somatiques à partir du 10.5eme jour fœtal induit l’activation de Sox9 suivie par
l’expression d’une cascade de marqueurs spécifiques mâles qui permettent le développement vers une voie
testiculaire. Chez la femelle qui ne possède pas le gène sry, des gènes ovariens comme foxl2 et rspo1 vont
commencer à s’exprimer. FOXL2 en particulier réprime l’expression de sox9 et en combinaison avec d’autres
facteurs ovariens dirige le développement de la gonade femelle. Si FOXL2 est inactivé, sox9 est exprimé dans la
gonade XX et aboutit à une inversion sexuelle.
La flèche bleue indique des interactions antagonistes
Ovogenèse fœtale
(Pesce et al. 2002; Puglisi et al. 2004; Ross et al. 2007) et l’invalidation du gène bmp7 chez la
souris provoque une diminution du nombre des CGP (Ross et al. 2007). Les CGP ne migrent
pas indépendamment mais grâce à des réseaux cytoplasmiques qui lient les CGP entre elles.
Pendant cette migration, les protéines E-cadherine et B1-integrine sont présentes dans les
jonctions adhérentes des CGP et nécessaires pour les interactions CGP-CGP (Bendel-Stenzel et
al. 2000) et leur migration (Anderson et al. 1999).
2.4 La différenciation sexuelle
Un seul gène sry (sex determining region Y), est donc nécessaire et suffisant pour déterminer la
différenciation vers un testicule et donc la voie mâle (Figure 24). En l’absence de sry, les crêtes
génitales XX se développent en ovaires (Koopman et al. 1991). L'expression par transgénèse du
gène sry chez des souris XX induit un développement testiculaire (Koopman et al. 1991). SRY
active le gène sox9 (SRY (sex determining region Y)-box 9) (Sekido 2008) qui va induire la
différenciation des cellules de Sertoli (Chaboissier 2004) et entraîner l’expression de gènes tels
que l'amh.
2.5 Différenciation précoce de l'ovaire
La différenciation et le maintien des gonades femelles requièrent l’expression spécifique de
gènes somatiques femelles (foxl2, rspo1, wnt4 …) (Figure 25). Les gènes rspo1 (R-spondin-1)
et wnt4 sont initialement exprimés dans les cellules somatiques des gonades des deux sexes
mais deviennent spécifiques de l’ovaire après la différenciation sexuelle et sont indispensables
pour la différenciation des cellules somatiques ovariennes. La perte de fonction de ces deux
gènes entraîne une masculinisation partielle des gonades XX chez les souris avec une
vascularisation testiculaire, l’apparition de cellules androgéniques, la perte des cellules
germinales femelles et une apparence testiculaire à la naissance (Chassot et al. 2008). Ces
gènes vont activer la signalisatio = î ner la dégradation de SOX9
(Chassot et al. 2008). (Figure 25).
Le maintien de la gonade femelle nécessite l’expression du facteur de transcription foxl2, et
pour la gonade mâle l’expression du gène sox9. Chez la chèvre, la perte d’expression du gène
FOXL2, liée à la délétion du locus PIS, conduit à la masculinisation des gonades XX dû, entre
autre, à la surexpression du gène SOX9 et de l’AMH. Le premier événement moléculaire
observé est une diminution drastique de l'expression du gène de l'aromatase (CYP19A1 :
Cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1), enzyme clé de la synthèse
d’œstradiol (Pailhoux 2002). Il a aussi été montré que le facteur de transcription FOXL2
27
Figure 25. Voies de signalisation (putative) impliquées dans l’organogenèse ovarienne de
souris.
Source (Liu et al. 2010)
Deux facteurs secrétés par les cellules somatiques RSPO1 et WNT4 vont ac
=
dans les gonades XX et induire l’expression de wnt4. WNT4 inhibe alors l’expression de sox9 et une de ces cibles
potentielles cyp26b1. Dans la gonade femelle, en l’absence de CYP26B1, l’acide rétinoïde (RA) n’est pas dégradé
et induit l’expression stra8 et dazl*?également l’expression de fst qui maintien la survie de la
gonade femelle (Yao et al. 2004)*@<Q[
\\[]^^&êche ainsi la formation
de la vascularisation spécifique des testicules.
Ovogenèse fœtale
régulait l'aromatase et contrôlerait donc la production d'œstrogènes dans l'ovaire fœtal
(Pannetier et al. 2006). Cette perte d’expression de FOXL2 démontre donc que les œstrogènes
pourraient intervenir dans la différenciation précoce de l'ovaire chez la chèvre. Dans d’autres
espèces, des mutations perte de fonction dans le gène FOXL2 n’entraînent pas une inversion
sexuelle totale. Elles sont, par exemple, associées à une ménopause précoce chez la femme et
une malformation des paupières (syndrome BPES (Blepharophimosis Ptosis Epicantus inversus
Syndrome)) (Crisponi et al. 2001) ou chez la souris à une insuffisance ovarienne précoce (IOP)
(Uda et al. 2004).
2.6 L’induction de la méiose
Après leur migration dans les gonades, les cellules germinales expriment les facteurs
spécifiques de ces cellules, comme GCNA1 (germ cell nuclear antigen 1), DAZL (deleted in
azoospermia-like) et DDX4 (ou VASA/ MVH; D-E-A-D (aspartate-glutamate-alanineaspartate) box polypeptide), et deviennent alors compétentes pour entrer en méiose (Bowles
and Koopman 2010). GCNA1 est le premier marqueur exprimé par les ovogonies et son rôle
n’est pas connu.
DAZL et DDX4 sont des protéines qui se lient aux ARNs et régulent leur traduction. Seules les
ovogonies qui expriment dazl pourront initier le processus de méiose. Chez la souris,
l’inactivation de ce gène entraîne une infertilité des mâles et des femelles et l’absence
d’expression de gènes impliqués dans l’initiation de la prophase I tel que stra8 (stimulated by
retinoic acid gene 8) (Lin et al. 2008). DAZL régule également la traduction de ddx4, impliqué
à son tour dans la régulation d’autres protéines et des petits ARN (piRNA) (Reynolds et al.
2005; Malone et al. 2009). DAZL agit enfin sur la régulation de la traduction de transcrits
spécifiques de la méiose comme sycp3 (synaptonemal complex protein 3) (Reynolds et al.
2007).
Dans les gonades fœtales XX en culture, il a été montré que l’induction de la méiose est sous
le contrôle de l'expression du gène stra8. Il est nécessaire à la réplication de l’ADN, la
condensation des chromosomes, la cohésion, les synapses et la recombinaison lors de la
méiose. L’acide rétinoïque (RA) peut induire stra8 (Bowles et al., 2006; Koubova et al.,
2006)(Li and Clagett-Dame 2009). C’est un facteur extrinsèque synthétisé par le mésonephros
à partir de la vitamine A (rétinol). Il diffuse ensuite dans l’ovaire. Dans les ovogonies, RA se
lie à des récepteurs nucléaires RAR (retinoic acid receptor) contrôlant ainsi la transcription de
gènes, comme le gène stra8, qui est exclusivement exprimé dans les CGP pré-méiotiques des 2
sexes. La présence spécifique de cyp26b1 (cytochrome P450, family 26, subfamily b,
28
Figure 26. Régulation de la méiose par l’acide rétinoïque.
Source (Spiller et al. 2012)
Le mésonephros collé à l’ovaire ou au testicule exprime les enzymes RALDH2-3 lui permettant de produire de
l’acide retinoïque (RA). RA se diffuse ensuite dans l’ovaire et agit directement sur les CGP. Il se lie au dimère
RAR/RXRs présent sur les sites RAREs du promoteur de stra8 pour induire sa transcription. La méiose s'initie.
RALDH1 faiblement exprimée par les cellules interstitielles et de granulosa peut aussi contribuer à la production
locale de RA. Dans le testicule, les cellules interstitielles et de Sertoli expriment l’enzyme CYP26B1 qui dégrade
RA et réprime ainsi la transcription de Stra8. En complément, FGF9 également produit par les cellules de Sertoli
agit directement sur les cellules germinales testiculaires pour inhiber la méiose.
Ovogenèse fœtale
polypeptide 1) dans les cellules de Sertoli fœtales permet de dégrader RA et ainsi d’empêcher
l’expression de stra8. Il en résulte une absence d'entrée en méiose dans le testicule fœtal
(Spiller et al. 2012) (Figure 26). Chez les femelles, la régulation de la méiose par RA n’est pas
limitée aux rongeurs mais est retrouvée chez l’homme, la poule et les amphibiens (Spiller et al.
2012). Il est à noter que les profils d’expression de certaines enzymes permettant la
production de RA (comme RALDH1 (rétinal-déhydrogénase 1)) sont différents entre la souris
et la femme, ce qui suggère une régulation différente de l'initiation de la méiose par RA
entre ces espèces (Le Bouffant et al. 2010). Une étude récente, de Kumar et ses collaborateurs,
vient atténuer le rôle de RA sur l’induction de la méiose en suggérant que RA n’est pas
indispensable à l’induction de la méiose et que l’enzyme CYP26B1 métaboliserait un substrat
autre que RA capable d’induire l’expression de stra8 (Kumar et al. 2011). Cette étude est déjà
controversée par Griswold et Spiller (Griswold et al. 2012; Spiller et al. 2012).
Récemment, il a aussi été montré que la méiose est contrôlée par des facteurs somatiques
comme RSPO1. Dans les gonades de souris mutantes XX rspo1-/-, la grande majorité des CGP
restent bloquées en début de méiose. RSPO1 stimule l’entrée en méiose entrainant l’expression
de stra8 (stimulée par RA) et réprimant celle de nanos2 (nanos homolog 2, Drosophila)
(Chassot et al. 2011).
Une fois la méiose initiée par STRA8, les marqueurs pré-méiotiques vont s’exprimer dans
l'ovaire fœtal.
2.7 Les points de contrôle méiotiques
A la suite du stade pachytène de première division, toutes les cassures doubles brin doivent être
réparées. Les points de contrôle permettent de repérer les erreurs de réparation et bloquer
l’entrée en métaphase. Cette régulation est effectuée par des protéines Kinase ATM (ataxia
telangiectasia mutated homolog, human) et ATR (ataxia telangiectasia and Rad3 related) qui
agissent en phosphorylant des protéines de la famille des BRCA (Brca1-2 (breast cancer 1-2))
ou JH2AX (H2A histone family, member X ) qui s’accumulent au niveau des régions des
cassures double-brins (Turner et al. 2005). L'ensemble de ces protéines permet à la machinerie
de réparation de fonctionner.
De nombreux mutants de gènes impliqués dans le contrôle méiotique ont été produits chez la
souris. Ils ont permis d’identifier les perturbations qui en découlent. L’étude de ces mutations
montre l’importance de certains gènes (dmc1, spo11 (meiotic protein covalently bound to DSB
homolog, S. cerevisiae), msh4 (mutS homolog 4, E. coli )…) dont l’invalidation chez la souris
entraîne la stérilité chez les mâles et les femelles (Morelli and Cohen 2005).
29
Genes
Protein/function
Atg7
Involved in autophagy
Bax
Bcl2 family of apoptosis
regulators
Bcl2
regulators
Becn1
Involved in autophagy
Casp2
Cysteine protease
Mcl1
regulators
Evidence for role in follicle assembly
Loss of germ cells by PND1
Increased oocyte survival
reduced cyst breakdown
and follicle formation
Mutation results in reduced oocyte numbers,
overexpression results in increased
oocyte numbers
Reduced oocyte numbers at PND1
Increased number of primordial follicles
Expressed in oocytes
during follicle formation
References
Gawriluk et al. (2011)
Perez et al. (1999)
and Greenfeld et al. (2007)
Ratts et al. (1995)
and Flaws et al. (2001)
Gawriluk et al. (2011)
Bergeron et al. (1998)
Hartley et al. (2002)
Tableau 5. Régulateurs de la mort programmée qui affectent la survie ovocytaires et la
formation des follicules.
Ovogenèse fœtale
Le point de contrôle du fuseau méiotique à la reprise de la méiose, au cours de l’anaphase, est
aussi essentiel pour s’assurer d’une ségrégation correcte des chromosomes. Mais ce point ne
sera pas traité dans cette thèse car il relève de la phase de maturation de l’ovocyte (âge adulte).
2.8 Régulation de l’assemblage des follicules primordiaux
Les manipulations génétiques chez la souris ont permis d’identifier un certain nombre de
facteurs impliqués dans la régulation de la formation des follicules primordiaux. Ces facteurs
interviennent à différents niveaux : mort cellulaire, transcription, voies de signalisation.
a.
La mort cellulaire programmée
Comme énoncé dans le chapitre précédent, la mort programmée des ovocytes et la
fragmentation des cordons ovigères semblent liées. Le nombre d’ovocytes dans les cystes est
finement contrôlé par des mécanismes de mort programmée et de détection d’ovocytes en
excès. La mort programmée fait intervenir des mécanismes d’apoptose mais aussi d’autophagie
et de nécrose. Le rôle de certains gènes, régulateurs de la mort programmée, dans l’assemblage
du follicule est listé Tableau 5. En particulier différents membres de la famille de BCL2 qui
régulent l’apoptose sont connus pour être impliqués.
b. Les facteurs de transcription
Le premier facteur ovocytaire identifié pour son rôle dans la formation des follicules est le
facteur de transcription FIGLA (folliculogenesis specific basic helix-loop-helix) qui possède un
domaine bHLH (Helix loop helix). Son invalidation chez la souris empêche l’apparition des
follicules après la naissance entrainant la disparition des ovocytes et une stérilité des femelles.
Par contre, la délétion de figla n'affecte pas la migration des cellules germinales. Le rôle de
FIGLA dans la formation des follicules primordiaux n'est donc pas totalement connu. Des
mutations de ce gène ont aussi été retrouvées chez des femmes présentant une insuffisance
ovarienne précoce (IOP) (Zhao et al. 2008).
Le récepteur aryl hydrocarbon (AHR) est autre facteur de transcription à domaine bHLH
présent dans les cellules de pré-granulosa et les ovocytes. Il régule le nombre de follicules
primordiaux. Les souris mutantes pour ce gène possèdent un nombre plus important de
follicules primordiaux dû à une diminution d’apoptose ovocytaire (Robles et al. 2000). D’autres
facteurs spécifiques des cellules de granulosa comme FOXL2 sont aussi nécessaires à la
formation des follicules primordiaux. Chez les souris mutantes foxl2-/- on observe un défaut
d’organisation des cellules de la granulosa qui ne prolifèrent pas. Les ovocytes restent groupés
30
Genes
Protein/function
Evidence for role in
follicle assembly
Aryl hydrocarbon
Primordial follicle
receptor, basic helixformation is accelerated in
Ahr
loop-helix transcription
mutants
factor
Factor in the germ line
Mutants are defective in
alpha, folliculogenesisfollicle formation and
Figla
specific basic helixexhibit perinatal oocyte
loop-helix
loss
Mutants are defective in
Forkhead box L2,
follicle formation and
winged helix
Foxl2
exhibit perinatal oocyte
transcription factor
loss
siRNA knockdown in rat
Heterogeneous nuclear ovary organ culture caused
Hnrnpk
ribonucleoprotein K
a block in cyst breakdown
and follicle formation
Nobox
Newborn ovary
homeobox-encoding
gene
Mutants have delayed
follicle formation and
oocyte loss
Expressed in
References
Oocytes and
granulosa cells
Benedict et al. (2000)
and Robles et al.
(2000)
Oocytes
Soyal et al. (2000)
Granulosa cells
Schmidt et al. (2004)
and Uda et al. (2004)
Oocytes and
granulosa cells
Wang et al. (2011)
Oocytes
Rajkovic et al. (2004)
Tableau 6. Facteurs de transcription impliqués dans la formation des follicules.
Ovogenèse fœtale
et entourés d’une couche de soutien (Uda et al. 2004). Il n’y a pas fragmentation des cordons
ovigères et les souris sont infertiles. Enfin, la ribonucléoprotéine K (HNRNPK) est impliquée,
grâce à ses interactions ADN/ARN, dans la régulation de la transcription, l’épissage alternatif
et la traduction et peut jouer le rôle de facteur de transcription. Dans l’ovaire de souris, cette
protéine est très exprimée dans le noyau des cellules de granulosa entourant l’ovocyte au
moment de la formation des follicules (dès 1 jpp (jour post partum)). Des ovaires de souris
traités par la stratégie d ARN interférence (pour invalidation du gène) montrent des zones très
déstructurées présentant des paquets d’ovocytes non entourés de cellules de granulosa et des
agrégats de cellules somatiques non associées aux ovocytes. Le nombre de follicules
primordiaux dans ces ovaires est alors diminué (Wang et al. 2011).
Les facteurs qui maintiennent la survie de l’ovocyte comme NOBOX (newborn ovary
homeobox protein) vont aussi agir indirectement sur la formation des follicules (Rajkovic et al.
2004).
L’effet de ces facteurs est résumé Tableau 6.
c. Les facteurs de croissance et les voies de signalisation
Différents facteurs de croissance comme les neurotrophines sont également impliqués dans ce
processus ou du moins dans un maintien approprié du nombre de follicules primordiaux. ngf
(nerve growth factor) est exprimé dans les ovocytes et les cellules de la pré-granulosa juste
avant la formation des follicules. Les mutants homozygotes invalidés pour ngf ou son récepteur
ntrk1 (~trka) (neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 1) possèdent moins de follicules
primordiaux et davantage d’ovocytes sont retrouvés dans des cystes par comparaison aux
animaux normaux (Dissen et al. 2001; Kerr et al. 2009). Le mutant invalidé pour le récepteur
ntrk2 (neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2) qui lie NT4 (neurotrophin 4) et BDNF
(brain derived neurotrophic factor), possède aussi moins d’ovocytes et de follicules
primordiaux (Ojeda et al. 2000).
Différentes voies de signalisation interviennent dans l’assemblage des follicules comme par
Q_@*
ées avec de l’activine A présentent un nombre accru de
follicules primordiaux (Bristol-Gould et al. 2006). A l’inverse les souris qui sur-expriment
l’Inha, un antagonisme de l’activine, présentent plus de MOF (Multiple ovocyte follicles)
(McMullen et al. 2001). L’invalidation de Fst, provoque également un retard de la rupture des
cordons ovigères et de la formation des follicules (Kimura et al. 2011). Le TGFß1 ne semble
pas intervenir directement dans l’assemblage mais il interagit avec le CTGF (connective tissue
31
Protein/function
Evidence for role in follicle
assembly
Expressed in
References
Activin A
TGFB family member
Promotes follicle formation
Oocytes and
granulosa cells
McMullen et al. (2001) and
Bristol-Gould et al. (2006)
Akt1
Serine/threonine kinase,
also known as protein
kinase B (PKB)
Multiple oocyte follicles
Oocytes and
granulosa cells
Brown et al. (2010)
Amh
Anti-Mullerian hormone,
TGFB family member
Genes
Bdnf
Bmp15
Ctgf
Follistatin
Gdf9
Brain-derived
neurotrophic factor,
neurotrophin signaling
Bone morphogenetic
protein 15, TGFB family
member
Connective tissue growth
factor, CCN protein
family member
Activin antagonist, TGFB
family member
Growth differentiation
factor 9, TGFB family
member
Activin antagonist, TGFB
family member
Follicle formation is reduced and
oocyte number increased in
Stromal cells
mutants
Blocking in organ culture results in
Not detected in
a reduction of neonatal oocyte
ovary by RT-PCR
survival
(ND)
Nilsson et al. (2011)
Spears et al. (2003)
Mutants have multiple oocyte
follicles
Oocytes
Yan et al. (2001)
Promotes follicle formation
Oocytes
Schindler et al. (2010)
Reduced fertility, reduced follicle
formation
Oocytes,
granulosa, and
stromal cells
Kimura et al. (2011)
follicles
Oocytes
Yan et al. (2001)
Overexpression causes multiple
oocyte follicles
Inhibition of Notch signaling
reduces follicle formation
ND
McMullen et al. (2001)
Oocytes
Trombly et al. (2008)
ND
Jagged1
Notch ligand
Jagged2
Notch ligand
Lunatic
fringe
Regulator of Notch
signaling
follicles
Granulosa cells
Hahn et al. (2005)
Ngf
Nerve growth factor,
Follicle formation is reduced in
mutants
Oocytes and
granulosa cells
Dissen et al. (2001) and
Abir et al. (2005)
Notch1
Notch receptor
ND
Notch2
Notch receptor
Granulosa cells
NT4
Neurotrophin 4,
ND
Spears et al. (2003)
Oocytes and
somatic cells
Kerr et al. (2009)
Follicle formation and germ cell
number is reduced in mutants
Oocytes
Spears et al. (2003) and
Kerr et al. (2009)
Primordial follicle formation is
accelerated in mutants
Oocytes and
granulosa cells
Rajareddy et al. (2007)
Promotes follicle formation in
hamster
Granulosa cells
Wang & Roy (2004) and
Nandedkar et al. (2007)
Ntrk1
Ntrk2
p27
Scf
NGF receptor,
Receptor for NT4 and
BDNF, neurotrophin
signaling
Cyclin-dependent kinase
inhibitor 1, downstream
of PI3K signaling
Stem cell factor, kit
signaling
Blocking in organ culture results in
a reduction of neonatal oocyte
survival
Follicle formation is reduced in
mutants
Tableau 7. Facteurs de croissance et de signalisation impliqués dans l’assemblage des
follicules. Source (Pepling 2012)
Ovogenèse fœtale
growth factor) qui favorise l’assemblage des follicules chez le rat (pour revue (Pepling 2012)).
Enfin, chez la souris, les composants de la voie de signalisation NOTCH ((neurogenic locus
notch homolog protein) sont aussi exprimés dans les cellules de pré-granulosa et/ou l’ovocyte
(notch2, jag1 (protein jagged-1), hes1 (hairy and enhancer of split 1, Drosophila) et hey2 (HESrelated repressor protein 2)). Les invalidations des gènes impliqués dans cette voie de
signalisation sont souvent létales. Lorsque cette voie de signalisation est inhibée chimiquement
dans des ovaires néonataux de souris en culture in vitro, le nombre de follicules primordiaux
diminue de moitié par rapport à des ovaires cultivés en milieu témoin (Trombly et al. 2009). La
voie NOTCH2 semble donc bien être impliquée dans la formation du stock de follicules
primordiaux.
L’effet de ces gènes est résumé Tableau 7.
d. Les hormones
Des études menées chez les rongeurs soulignent le rôle des hormones stéroïdiennes dans le
maintien des cordons ovigères. Des souris traitées en période périnatale avec des œstrogènes
synthétiques (diethylstilbestrol : DES) présentent des ovaires avec davantage de MOF à cause
d’une mauvaise fragmentation des cordons ovigères (Iguchi et al. 1990). Une exposition
d’œstrogènes maternels pendant la vie fœtale maintien aussi les ovocytes en cystes et leur
diminution à la naissance permettrait la fragmentation des cordons. Les différentes études
menées sur ce sujet suggèrent donc que les œstrogènes inhibent la fragmentation des
cordons ovigères (pour revue (Pepling 2012)). Par contre chez certaines espèces comme le
hamster et le babouin les œstrogènes semblent avoir un effet positif sur la formation des
follicules (Zachos et al. 2002; Wang et al. 2008). Chez ces espèces, si la production
d’œstrogènes est bloquée la formation des follicules est perturbée. Pepling (Pepling 2012) a
émis l'hypothèse que les différences entre espèces pourraient s’expliquer par des différences de
concentration (des fortes concentrations inhiberaient et les faibles concentrations favoriseraient
la formation des follicules) ou bien par des différences dans la voie de signalisation.
La progestérone et l’hormone folliculostimulante (FSH) influencent aussi l’assemblage des
follicules primordiaux. Le traitement néonatal des souris avec de la progestérone augmente le
nombre de MOF (Kezele and Skinner 2003). A ces stades la progestérone peut être apportée
par la circulation maternelle mais deux études chez la vache montrent qu’elle peut être produite
par l’ovaire fœtal (Yang and Fortune 2008; Nilsson and Skinner 2009). L’effet de la
testostérone est associé à sa transformation en œstrogènes et la progestérone diminue
l’assemblage des follicules (Kezele and Skinner 2003). L’hormone FSH est également
32
Ovogenèse fœtale
impliquée dans l’assemblage. Elle est présente dans le sérum des souris et hamsters pendant la
période néonatale et le transcrit du gène du récepteur FSH est détecté dans les ovaires de souris
à cette même période de développement. L’inactivation de FSH par anticorps chez le hamster
provoque une inhibition de la formation des follicules primordiaux. Chez la souris, la FSH
favorise la fragmentation des cordons ovigères sur des cultures d’ovaires mais l’invalidation de
FSH et de son récepteur ne bloque pas la folliculogenèse avant le stade pré-antral (pour revue :
(Pepling 2012)).
Les études menées dans ces différentes espèces suggèrent qu’il existe une régulation
stéroïdienne de l’assemblage des follicules qui est fonction des niveaux d’œstrogènes et
progestérone dans l’ovaire.
33
Figure 27. Représentation des facteurs impliqués dans la formation des CGP, des cordons
ovigères et des follicules primordiaux.
Source (Sánchez and Smitz 2012)
Facteurs produits par les cellules somatiques (en bleu), les cellules de pre-granulosa (en violet), l’ovocyte (en
rouge) et les ovocytes et cellules de ganulosa (en vert).
Ovogenèse fœtale
Les processus de l’ovogenèse sont contrôlés par de nombreux facteurs et dépendent
d’interactions CGP-cellules somatiques.
Plusieurs gènes jouent un rôle crucial dans la formation, le maintien et le développement des
gonades (Lhx9, Sf1, Wt1…). L’invalidation de ces gènes conduit à l’agénésie ou la
dégénérescence des gonades.
La migration des CGP s’effectue de manière passive puis de manière active en réponse à des
signaux directionnels émis par les cellules somatiques (BMP4, BMP7 …). Elle fait en
particulier intervenir des couples chimio-attractant (KIT/KITL…) présents dans les CGP et les
cellules somatiques.
Chez les mammifères, le sexe est déterminé génétiquement à la fécondation selon que le
spermatozoïde est porteur ou non du chromosome Y. La différenciation sexuelle des gonades
dépend du gène sry, présent sur le chromosome Y. En l’absence de sry, les crêtes génitales XX
se développent en ovaires.
Après la différenciation sexuelle, les gonades femelles requièrent l’expression spécifique de
gènes somatiques femelles (foxl2, rspo1, wnt4 …) pour leur différenciation et leur maintien.
Après leur migration dans les gonades, les ovogonies expriment les facteurs spécifiques de ces
cellules (GCNA1, DAZL, DDX4) et deviennent compétentes pour entrer en méiose. STRA8
peut alors, sous le contrôle de l’acide rétinoïque, initier la méiose.
Les follicules primordiaux se forment, enfin, par fragmentation des cordons ovigères grâce à la
coopération des différents types cellulaires. Des facteurs interviennent à différents niveaux pour
réguler cette formation : mort cellulaire (famille BCL2), transcription (FIGLA, AHR,
HNRPK…), voies de signalisation @_@$&* {|} les niveaux d’oestrogènes
semblent aussi réguler l’assemblage des follicules.
.
34
Figure 28. Rôle potentiel de la signalisation intra-ovocytaire de PI3K.
Source (Zheng et al. 2012)
A: Activation optimale : survie des follicules
B : Activation élevée croissance des follicules
C : Répression de l’activité PI3K : mort des ovocytes
Folliculogenèse basale
3. Folliculogenèse basale
Les processus mis en œuvre sont encore mal connus à cause des difficultés d’accès au matériel
biologique. Cependant, une avancée significative a été réalisée ces dernières années dans
l’identification de plusieurs facteurs clés dont les fonctions sont indispensables pour le maintien
et la croissance du follicule, notamment par l’étude de souris mutantes (knock-out, knock-in).
Elles ont également révélé le rôle essentiel du dialogue moléculaire entre les compartiments
dans la folliculogenèse, c'est-à-dire entre ovocytes et cellules somatiques de la granulosa.
Enfin, elles ont confirmé que la folliculogenèse basale était capable de se dérouler en l’absence
de FSH jusqu’au stade pré-antral (Abel et al. 2000).
Il faut cependant noter que les mécanismes moléculaires et cellulaires ne sont pas toujours
conservés entre les espèces.
3.1 Maintien ou activation de la réserve folliculaire
Dans les années 1990, des études menées in vitro dans différentes espèces (bovine, simienne,
souris, humaine) à partir de cultures d'ovaires fœtaux décrivent une activation spontanée des
follicules primordiaux (Wandji et al. 1996; Hovatta et al. 1997; Fortune et al. 1998; O'Brien et
al. 2003). Ces résultats suggèrent que la réserve folliculaire est maintenue in vivo grâce à
l’action permanente de facteurs inhibiteurs et que l’activation des follicules pourrait être
liée à une diminution de ces facteurs ou une augmentation de facteurs stimulants. Depuis,
les modèles génétiques "souris" sont venus étayer cette hypothèse en identifiant différents
facteurs inhibiteurs de l’activation comme FOXL2, AMH. Des données récentes montrent
également le rôle important des voies de signalisations comme PI3K/PTEN.
a. La voie de signalisation PI3K
Dans l’ovaire, le maintien vs l’activation des follicules dépend de la coordination entre cellules
somatiques et ovocytes et semblerait être sous le contrôle des voies de signalisation ovocytaires
coordonnées PI3K/PTEN-AKT-mTORC1-S6K-RPS6 (Figure 18). Les signaux extra
ovocytaires activateurs de PI3K (KITL, l’insuline…) provenant de l’environnement proche du
follicule et les facteurs intra ovocytaires, inhibiteurs de la voie de signalisation PI3K
(PTEN…), régulent finement le niveau optimal d’activation de PI3K. Un niveau de base intra
ovocytaire de PI3K activée est ainsi maintenu et semble être un des garants de la survie des
follicules (Adhikari and Liu 2009; Zheng et al. 2012) (Figure 28).
Une synthèse des facteurs connus pour être impliqués dans le maintien et la survie des
35
Figure 29. Facteurs impliqués dans le maintien et la survie des follicules primordiaux.
Source (Reddy et al. 2010)
1.
Les études faites grâce à l'utilisation de différentes lignées de souris mutantes ont montré l’implication de
ces gènes dans le maintien et la survie des follicules.
2.
En l’absence d’expression de ces gènes, la réserve ovarienne disparait par activation massive ou apoptose.
Figure 30. Expression de kitl et kit au cours de la folliculogenèse chez la souris.
Source (Hutt et al. 2006)
L’ARN et la protéine KITL (ou KL) sont faiblement exprimés dans les cellules de granulosa des follicules
primordiaux. L’expression de kitl augmente dans le follicule primaire puis au cours des stades préantraux. Son
expression diminue ensuite dans les cellules du cumulus oophorus des stades antraux. L’ARN et la protéine de
KIT (ou c-Kit) sont très exprimés au cours de la folliculogenèse basale puis diminuent dans la phase tardive. Les
thèques des follicules préantraux expriment modérément kit.
Expression relative : + faible, ++ modérée, +++ forte
follicules primordiaux est présentée Figure 29.
Les activateurs de PI3K
KITL: Parrott et Skinner ont montré que l’activation des follicules primordiaux est stimulée par
KITL dans des cultures d’ovaires alors que son anticorps bloque complètement l’activation
spontanée des follicules (Parrott and Skinner 1999). Les mécanismes d’action de KITL sont
encore mal connus mais l’activation du récepteur KIT aboutit, via son domaine tyrosine kinase,
à la phosphorylation de protéines impliquées dans la régulation de l’apoptose. Le profil
d’expression des gènes kitl et kit au cours de la folliculogenèse de la souris est présenté Figure
30.
L’invalidation du gène pdk1 (pyruvate dehydrogenase kinase, isoenzyme 1) ou s6k1 dans
l’ovocyte de souris entraîne une perte des follicules primordiaux à la puberté. Cet effet serait lié
à la suppression de la voie de signalisation PDK1-AKT-S6K1-RPS6 (Reddy et al. 2009).
Les inhibiteurs de PI3K
PTEN: L’invalidation de ce gène dans l’ovocyte de la souris, abouti à une activation rapide de
tous les follicules primordiaux (Reddy et al. 2008). L’absence de PTEN, augmente l’activité de
PI3K (Reddy et al. 2008). PTEN n’est, par contre, pas essentiel pour le développement ultérieur
des follicules ovariens (Reddy et al. 2008).
TSC: L’invalidation conditionnelle du gène tsc2 dans l’ovocyte provoque l’activation de toute
la réserve folliculaire, une activité élevée de mTORC1 et une activation de la protéine de
signalisation S6K1(Adhikari et al. 2009).
FOXO3A : Chez la souris, ce gène est exprimé dans le noyau des ovocytes primordiaux
jusqu’au début du stade primaire et son expression diminue ensuite fortement dans les autres
stades de développement (Liu et al. 2007). On observe, chez les souris mutantes foxo3a -/-, une
diminution de la fertilité de manière âge-dépendant aboutissant à une stérilité à l’âge de 15
semaines avec disparition totale des follicules. Dès l’âge de 14 jours, la plupart des follicules
sont en croissance et la réserve folliculaire est épuisée (Castrillon et al. 2003). Chez des souris
transgéniques où foxo3a est exprimé de manière constante dans des follicules primaires, la
croissance de l’ovocyte et le développement folliculaire sont retardés et les souris sont infertiles
(Liu et al. 2007). Ces études montrent que FOXO3A maintient les follicules primordiaux dans
la réserve et que l’inhibition de son activité est un pré-requis à l’activation des follicules.
Foxo3a ne semble pas avoir un autre rôle dans l’ovaire de souris (John et al. 2007). Dans
d’autres espèces comme l’Homme, les mutations détectées dans le gène FOXO3A ne sont pas
36
associées à une IOP (Gallardo et al. 2008). Chez le porc, la protéine est fortement détectée dans
le cytoplasme de l’ovocyte des follicules du stade primordial à secondaire et très faiblement
détectée dans les cellules de granulosa. Il semblerait que la translocation de la protéine du
noyau vers le cytoplasme dépende du stade de développement et de l’espèce (Ding et al. 2010).
CDKN1B (P27, KIP1 : cyclin-dependent kinase inhibitor 1B): Chez la souris, p27 est exprimé
dans le noyau des ovocytes et les cellules de granulosa des stades primordiaux à secondaires.
Dans les follicules plus développés, l’expression de p27 diminue dans l’ovocyte mais subsiste
dans les cellules de granulosa (Rajareddy et al. 2007). Chez les souris mutantes p27 -/-, tous les
follicules primordiaux sont prématurément activés entrainant une IOP à l’âge adulte (Rajareddy
et al. 2007). p27 agirait en inhibant l’activité de CDK1 (Cyclin-dependent kinase 2) et CDK2.
Ces résultats indiquent que l’expression de p27 pendant la phase basale est déterminante pour
réguler négativement l’activation des follicules.
b. Le maintien de la réserve folliculaire
Le maintien et la survie des follicules au sein de la réserve de cellules germinales dépendent de
l’action constante de facteurs de survie provenant de l’environnement proche du follicule. Une
élévation ou une réduction des niveaux de base disponibles pour le follicule peut entraîner une
activation ou une mort immédiate des follicules.
Foxl2
Les souris invalidées pour foxl2 montrent le même phénotype que les patientes atteintes du
syndrome BPES chez la femme. Ces souris femelles ont des ovaires avec une croissance
prématurée de la plupart des follicules. Huit semaines après la naissance, la réserve est épuisée,
les ovocytes ont atteint leur taille définitive et ne sont entourés que de quelques cellules aplaties
de granulosa qui n’ont pas proliféré et ne se sont pas différenciées en granulosa de stade
primaire (Schmidt et al. 2004). Ces follicules dégénèrent ensuite rendant les souris stériles. Ces
résultats montrent que l’expression de foxl2 dans les cellules de pré-granulosa inhibe la
croissance ovocytaire et maintient le follicule à l’état quiescent (Schmidt et al. 2004). Les
mécanismes précis qui interviennent à cette étape ne sont pas connus.
AMH
L’amh et son récepteur, amhr, sont exprimés dans les cellules de granulosa des follicules en
croissance (à partir du follicule primaire). La cinétique d’expression d’AMH est similaire dans
les espèces humaine, ovine et les rongeurs. Son expression est maximale des follicules
secondaires aux follicules à petit antrum puis elle diminue progressivement pour disparaître
37
au cours de leur développement terminal (Baarends et al. 1995). L’AMH semble exercer un
contrôle subtil sur la composition de la population folliculaire. Chez les souris invalidées pour
le gène (amh -/-), le nombre de follicules primordiaux est le même entre souris invalidées amh-/et souris sauvages jusqu’à la puberté (25 jours). A 4 mois (milieu de la période reproductive),
les souris invalidées amh
-/-
présentent moins de follicules primordiaux, un pourcentage plus
élevé de follicules en croissance (pré-antraux) et davantage de petits follicules atrétiques que
les souris sauvages. A 18 mois, la plupart des souris invalidées n’ont plus de follicules
primordiaux. Les souris hétérozygotes amh
+/-
présentent un nombre de follicules
intermédiaires. Ces résultats suggèrent que cette hormone inhibe l’activation des follicules
primordiaux (passage du follicule primordial au primaire) en fonction du nombre de copies du
gène (Durlinger et al. 1999). Son mécanisme d’action concernant l’activation des follicules
primordiaux est encore inconnu car les protéines AMH et AMHR2 ne sont pas détectées dans
les follicules primordiaux de souris. Cependant, l’AMH est capable de diminuer l’expression de
kit (qui lui stimule l’activation des follicules primordiaux) et de facteurs de la famille des BMP
(Nilsson et al. 2007). Il est actuellement proposé que l’AMH est un des meilleurs paramètres
d’estimation de la déplétion du pool des follicules ovariens et peut être le meilleur marqueur
pour diagnostiquer l’IOP (Knauff et al. 2009).
En ce qui concerne les espèces mono-ovulantes, le rôle de l’AMH au cours de la période basale
est plus controversé. Deux études montrent, comme chez les rongeurs, une inhibition de
l’activation de la réserve folliculaire chez la vache et la femme (Gigli et al. 2005; Carlsson et
al. 2006). Deux autres mettent en évidence une activation de la croissance des follicules
primordiaux chez la femme et la brebis (Schmidt et al. 2005; Campbell et al. 2012). Dans ces
dernières études, l’AMH n’affecte pas l’activation des follicules primordiaux mais semble
réguler la vitesse de croissance des follicules pré-antraux, alors que l’expression d’AMH est
maximale. En effet, un blocage de l’activité AMH provoque une diminution de la population
des follicules pré-antraux et petits antraux et augmente le nombre de follicules à antrum
(Campbell et al. 2012).
D’autres facteurs sont également connus pour inhiber le recrutement des follicules comme la
cytokine CXCL12 (ou SDF1) et la somatostatine (SST). De plus, les ARN messagers et les
protéines correspondant au gène sdf1 et son récepteur cxcr4 sont détectés dans les follicules
primordiaux chez la souris (Holt et al. 2006). L’expression de la protéine SDF1- augmente au
cours du développement folliculaire. La SST n’est pas détectée dans l’ovaire de souris mais les
38
récepteurs de la somatostatine SSTR2 et SSTR5 sont détectés au niveau transcrit et
principalement dans les cellules de granulosa au niveau protéique (Gougeon et al. 2010). Un
traitement des ovaires de souris pendant la période néonatale avec un antagoniste de SSTR2
(BIM-23627) ou de SDF1- AMD3100) augmente spontanément le nombre de follicules
activés. Des protéines déjà identifiées dans l’apoptose des ovocytes sont susceptibles
d’intervenir dans le follicule comme BCL2 (Hsu et al. 1996) et (BCL2-associated X protein)
(Perez et al. 1999).
c. Activation de la réserve folliculaire
Les facteurs de transcription
L’expression précoce de certains facteurs de transcription est décisive pour l’activation des
follicules primordiaux. Quatre facteurs de transcription dont l’expression est spécifique des
ovocytes ont été identifiés en utilisant des souris mutantes : nobox, sohlh1 (spermatogenesis
and oogenesis specific basic helix-loop-helix 1) et sohlh2, lhx8 (LIM homeobox protein 8).
Excepté nobox qui est exprimé pendant toute la durée de la folliculogenèse, les trois autres
facteurs de transcription sont exprimés dans les follicules primordiaux et leur expression
diminue ensuite dans les stades primaires et secondaires. L’invalidation de ces gènes entraîne
un blocage au stade primordial sauf pour celle de sohlh2 où de rares follicules primaires se
développent. Leur invalidation provoque la sous expression de différents gènes dont gdf9.
Le gène sohlh1, cible de sohlh2, est exprimé dès l’entrée en méiose des ovocytes et son
invalidation provoque la sous-expression d’un ensemble de gènes comprenant nobox, et lhx8
(Pangas et al. 2006).
Le gène sohlh2 s’exprime dans l’ovocyte avant l’entrée en méiose et son invalidation provoque
la sous-expression d’un certain nombre de gènes impliqués dans la croissance folliculaire
(sohlh1, nobox, figla, and stra8) (Choi et al. 2008).
Les souris invalidées pour le gène lhx8 montrent le même phénotype que pour l’invalidation de
sohlh1 (Pangas et al. 2006).
Enfin, l’absence de NOBOX dans l’ovocyte (exprimé dès les cystes), entraîne également la
sous expression de différents gènes (Rajkovic et al. 2004).
Les facteurs de croissance et cytokines
Différents facteurs produits localement agissent de manière autocrine ou paracrine pour réguler
l’activation des follicules. Ces facteurs comprennent des facteurs de croissance de la famille
39
des TGF (BMP4, BMP7,…), des FGF ( bFGF, KGF (FGF7 : keratinocyte growth factor)), des
PDGF (platelet derived growth factor) mais aussi des cytokines (LIF (leukemia inhibitory
factor)) et des neurotrophines (NT4, NGF, GDNF). Ils peuvent être produits par le stroma
ovarien, les cellules de granulosa ou l’ovocyte.
BMP4 et BMP7 sont par exemple, détectés respectivement dans les cellules du stroma et la
thèque. Ces gènes agissent sur la croissance des follicules primordiaux (Adhikari and Liu 2009)
par l’intermédiaire des SMAD3 et 5. En effet, l’invalidation des gènes smad 3 ou smad 5
entraîne une augmentation du nombre de follicules primordiaux chez la souris (Tomic et al.
2002; Kaivo-oja et al. 2006).
bFGF est localisé dans les ovocytes des stades primordiaux et primaires chez la vache (van
Wezel et al. 1995) et il stimule in vitro l’activation des follicules primordiaux dans des cultures
d’ovaires de rat et de chèvre (Nilsson et al. 2001; Matos et al. 2007). Par contre, le fait
qu’aucune activation n’ait été observée sur des explants de cortex bovin (Derrar et al. 2000)
laisse supposer que cet effet pourrait être espèce-dépendant. Un autre membre de la famille du
FGF, le KGF (ou FGF7) stimule également la transition primordial-primaire chez le rat (Kezele
et al. 2005a).
Les neurotrophines font partie d’une petite famille de protéines comprenant NGF, NT3
(neurotrophin 3), NT4/5 et BNDF. Ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus
de développement neuronal. Elles se fixent sur des récepteurs à tyrosine kinase (TRK ou RPTK
pour receptor protein-tyrosine kinase) et sont présentes dans l’ovaire fœtal et néonatal de souris
et l’ovaire fœtal de la femme (Spears et al. 2003; Dissen et al. 2009). D’une manière générale,
les neurotrophines sont plus exprimées dans les cellules somatiques (cellules de granulosa et
mésenchyme) alors que les récepteurs TRK sont plus exprimés dans l’ovocyte. NT4 est présent
dans l’ovocyte du follicule primordial puis dans les cellules de granulosa des follicules en
croissance (Paredes et al. 2004). TRKB (récepteur de NT4 et BNDF) est aussi présent dans
l’ovocyte. En l’absence de toutes les isoformes de trkb, les follicules ne se développent pas au
delà du stade primaire. Les récepteurs TRKB sont donc nécessaires pour le début de la
croissance folliculaire. Ces récepteurs facilitent le développement de l’ovocyte et agissent sur
les cellules de granulosa par l’intermédiaire des communications bidirectionnelles entre ces
deux compartiments (Paredes et al. 2004; Dissen et al. 2009).
Les hormones
Différentes études in vivo et in vitro montrent que l’œstradiol et la progestérone (maternels
40
Figure 31. Différents facteurs impliqués dans l’activation, l’inhibition ou la survie des
follicules primordiaux.
modifié de (Oktem and Urman 2010)
et/ou ovariens) ont un effet inhibiteur sur la transition primordial-primaire chez le rat (période
néonatale) et les bovins (période fœtale) (Kezele and Skinner 2003; Yang and Fortune 2008).
Par contre, un traitement avec les androgènes augmente significativement le nombre de
follicules primaires probablement par l’intermédiaire de l’activation de la voie de signalisation
IGF1 (Insulin like growth factor) dans l’ovocyte de primates (in vivo dans l’ovaire de singe
Rhésus de 6 à 13 ans) et les bovins (in vitro sur ovaires fœtaux) (Vendola et al. 1999; Fortune
et al. 2011).
Malgré le fait que les follicules se développent pendant la phase basale, la FSH stimule le
développement et la survie des follicules chez la souris adulte (Allan et al. 2006) et favorise la
différenciation des cellules somatiques en cellules de la granulosa chez le hamster (période
fœtale) (Roy and Albee 2000). Par contre la FSH n’affecte pas le développement des follicules
primordiaux dans des cultures de cortex ovariens fœtaux de vache (Oktay et al. 1997). Les
mécanismes qui seraient impliqués dans cette régulation sont inconnus et les cellules de prégranulosa (présentes dans les follicules primordiaux) qu’elles soient de rongeurs, d’ovins, de
bovins ou humains n’expriment pas le récepteur FSH.
En conclusion, ces données bibliographiques montrent la complexité et la redondance des
mécanismes mis en jeu dans l’activation et la survie des follicules primordiaux. Un bilan des
molécules impliquées dans ces mécanismes est présenté Figure 31. La plupart des gènes
identifiés proviennent d’études fonctionnelles obtenues après invalidation de gènes spécifiques
de l’ovocyte (Oktem and Urman 2010; Adhikari and Liu 2009; Zheng et al. 2012). Par contre,
le nombre de facteurs connus qui tiennent un rôle important et qui sont produits par les cellules
de granulosa (comme PDGF par exemple) est, à ce jour, très limité (Monget et al. 2012). Ces
facteurs sont principalement issus de données transcriptomiques sur follicules entiers sans
distinction entre les cellules somatiques et les ovocytes (Park et al. 2005; Yoon et al. 2006).
Après activation, les cellules de pré-granulosa changent de forme, deviennent des cellules de
granulosa cuboïdales et commencent à exprimer l’antigène nucléaire de prolifération (PCNA).
C'est la période de croissance des follicules.
3.2 La croissance folliculaire
La croissance folliculaire basale est régulée par des facteurs intra ovariens. La communication
bidirectionnelle entre ovocyte et cellules somatiques joue un rôle central dans ce processus. Le
dialogue se fait par l’intermédiaire de deux mécanismes, les jonctions communicantes et les
signaux paracrines et juxtacrines impliquant différentes voies de signalisation. L’ovocyte a un
41
Tableau 8. Expression des principaux composants fonction des espèces, des stades de développement et du compartiment folliculaire.
Modifié de (Drummond et al. 2003; Juengel and McNatty 2005; Feary et al. 2007)
rôle actif dans la croissance folliculaire. Il contrôle la prolifération des cellules de la granulosa
et son propre développement. Les cellules de granulosa, elles, sont les premières à fournir
l’environnement physique et chimique nécessaire au développement de l’ovocyte. Les études
concernant le rôle de ces facteurs pendant la période pré-antrale ont été menées le plus souvent
« in vitro » sur culture d’ovaires ou de cortex ovarien ou sur culture de cellules de granulosa de
la phase antrale.
a. Le dialogue moléculaire
Les signaux paracrines : Régulation des fonctions des cellules de granulosa par l’ovocyte
?
[
Q_@*
De nombreux membres de la famille des TGFß sont synthétisés et sécrétés par les cellules de
granulosa, la thèque ou l’ovocyte et de manière stade-dépendant. Globalement, l’ovocyte
exprime BMP6 et GDF9 à partir du follicule primordial, TGFß1 et BMP15 à partir du follicule
primaire. Le tableau 8 présente les données d’expression disponibles pour les composants de la
voie de signalisation des TGFß pour trois espèces : la brebis, la femme et la souris (et
rongeurs). D’une manière générale, les membres de la famille des TGFß interviennent dans
la régulation de la croissance des cellules de granulosa.
Chez la brebis, différentes mutations ayant un effet majeur sur le taux d’ovulation ont été
observées. Elles concernent trois gènes appartenant à cette voie de signalisation (BMPR1B
(bone morphogenetic protein receptor, type 1B), BMP15 et GDF9). BMPR1B est exprimé dans
de nombreux tissus mais GDF9 et BMP15 sont exprimés spécifiquement dans l’ovocyte à partir
du stade primordial et primaire respectivement.
Les brebis porteuses de la mutation FecBB localisée dans le gène BMPR1B sont plus
prolifiques dès l'hétérozygotie. Les follicules ovulatoires sont plus nombreux (reflétant le taux
d’ovulation >5), plus petits et ils montrent une maturité plus précoce. Le développement
folliculaire basal est altéré dès la formation des follicules primordiaux. Pendant cette phase, les
ovocytes de ces brebis mutants présentent des différences par rapport à des animaux sauvages
(Reader et al. 2012) et ont :
- un diamètre plus grand avec davantage de mitochondries, réticulum endoplasmique et
ribosomes,
- une plus grande surface de contact avec les cellules de la granulosa.
Les brebis porteuses des mutations FecX localisées dans le gène BMP15 (six mutations
identifiées qui provoquent une perte de fonction de la protéine) sont stériles à l’état
42
homozygote par blocage de la folliculogenèse au stade primaire (Galloway et al. 2000; Bodin et
al. 2007). L’utilisation de BMP15 recombinante a permis de mettre en évidence le rôle
potentialisateur de cette protéine sur la prolifération des cellules de granulosa chez le rat
(Otsuka et al. 2000), la femme (Di Pasquale et al. 2004) la brebis (McNatty et al. 2005). En
complément, BMP15 stimule l’expression de KITL par les cellules de granulosa et de ce fait,
intervient dans le dialogue ovocyte-granulosa ainsi que sur le développement ovocytaire
(Otsuka and Shimasaki 2002). Ces résultats montrent que chez la brebis la signalisation
BMP est nécessaire à la folliculogenèse. Paradoxalement, la mutation hétérozygote de BMP15
entraîne une augmentation de la prolificité. En effet, une activité réduite de la voie de
signalisation BMP (brebis hétérozygotes) conduit à diminuer la prolifération des cellules de
granulosa et augmenter la sensibilité à FSH. Ceci aboutit à l’ovulation de plusieurs follicules de
plus petites tailles. Chez la femme, 13 mutations dans le gène BMP15 sont associées à une IOP
(Di Pasquale et al. 2004; Di Pasquale et al. 2006; Dixit et al. 2006). Par contre BMP15 a un
rôle moindre chez la souris, puisque son invalidation n’entraîne pas de stérilité mais une
hypofertilité par diminution de la croissance folliculaire (Yan et al. 2001).
Enfin, deux mutations FecG identifiées dans le gène GDF9 ovin présentent le même phénotype
que pour BMP15 (Hanrahan et al. 2004; Nicol et al. 2009) soit une augmentation de la
prolificité pour les brebis hétérozygotes et une stérilité pour les animaux homozygotes. De plus,
les animaux homozygotes pour ces deux mutations montrent des défauts de développement
folliculaire pendant la période basale. Beaucoup de follicules primordiaux sont observés. Les
follicules secondaires ont une morphologie anormale (de deux à quatre couches de cellules de
granulosa) (Nicol et al. 2009). Quelques follicules se développent jusqu’au stade antral mais
comportent des ovocytes atrétiques et des cellules de granulosa désorganisées (Hanrahan et al.
2004). Chez la femme, trois mutations dans le gène GDF9 sont associées à une IOP (Laissue et
al. 2006; Kovanci et al. 2007; Zhao et al. 2007). Chez la souris l’invalidation de GDF9
provoque également l’arrêt de la croissance au stade primaire avec des cellules de granulosa et
un ovocyte de plus grosse taille (Dong et al. 1996). L’injection de GDF-9 chez des rates
immatures provoque l’augmentation du nombre de follicules primaires et à antrum, et diminue
le nombre de follicules primordiaux (Vitt et al. 2000). GFD9 et BMP15 sont donc
indispensables pour le bon déroulement de la folliculogenèse basale.
La famille FGF
Très légèrement exprimé dans les tissus fœtaux, FGF8 est principalement exprimé dans
l’ovocyte, les cellules de granulosa et de thèques des follicules primaires aux follicules
43
secondaires chez la vache (Buratini et al. 2005) alors qu’il est spécifique de l’ovocyte chez le
rat (Valve et al. 1997). Il est capable de stimuler dans cette espèce la voie de signalisation
BMP-SMAD des cellules de granulosa (Miyoshi et al. 2010). Enfin FGF10 est détecté dans les
ovocytes et quelques cellules de granulosa d’ovaires fœtaux humains (Oron et al. 2012) et
stimule la croissance des follicules pré-antraux chez la chèvre (Chaves et al. 2010).
Les signaux paracrines : le contrôle du développement ovocytaire par les cellules de
granulosa
KITL
L’action de la protéine KITL change en fonction du stade de développement et peut être
modulée par les jonctions communicantes (Klinger and De Felici 2002). Elle stimule en
particulier la croissance de l’ovocyte pendant la période pré-antrale et régule l’activité de la
thèque (Kezele et al. 2005b).
La famille TGF.
En complément de son rôle sur la transition primordial primaire, l’AMH joue un rôle plus tardif
(stades pré-antraux avancés) dans le recrutement cyclique des follicules en diminuant la
réceptivité des follicules à la FSH (revue : (Adhikari and Liu 2009)).
L’expression des sous unités A et de l’activine, leurs récepteurs de type 1 et 2 ainsi que la
follistatine (fst) est détectée dans les stades précoce de la folliculogenèse (primaire secondaire). Les activines et fst sont d’abord détectée dans les cellules de granulosa alors que
leurs récepteurs sont exprimés dans tous les compartiments folliculaires. La FST et les
inhibines sont des antagonistes des activines. Les activines stimulent le développement des
follicules pré-antraux chez la brebis (Thomas et al. 2003), la femme (Telfer et al. 2008) et le rat
(Zhao et al. 2001) alors que chez la souris, l’activine A, produite par les follicules secondaires,
inhibe la croissance des follicules primaires (Mizunuma et al. 1999). L’invalidation de l’inha
chez la souris accélère le développement pré-antral. La prolifération des cellules de la
granulosa est accrue (Myers et al. 2009).
FOXL2.
Au stade pré-antral, FOXL2 est aussi capable de stimuler l’expression de l’aromatase
(cyp19a1 : Cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1) (Baron et al. 2005),
nr5a1 (récepteur liver homologue 1) et sf1 (Pisarska et al. 2004). Elle inhibe également la
transcription du gène codant pour la protéine steroidogenesis acute response (star), enzyme qui
catalyse une étape limitante de la steroïdogenèse: la translocation du cholestérol dans la
44
membrane des mitochondries. FOXL2 empêcherait donc l’expression de star dans les follicules
immatures et limiterait la production de stéroïdes.
Ces résultats indiquent donc que FOXL2 contrôlerait la prolifération des cellules de la
granulosa dans les stades précoces (pour revue (Pisarska et al. 2011)).
Les signaux paracrines : le contrôle du développement folliculaire par les cellules de
thèque
Les cellules thécales contribuent aussi développement folliculaire basal par la sécrétion de
testostérone et de nombreux facteurs de croissance (BMP4-7, NGF, FGF7, EGF, TGF)
capables de stimuler la prolifération des cellules de granulosa. Celles-ci en retour régulent
l’activité de la thèque.
BMP4 et BMP7
Elles sont exprimées dans la thèque à partir du stade secondaire. Elles favorisent la croissance
et inhibent l’atrésie folliculaire (Kayamori et al. 2009; Shimizu et al. 2012). Elles interviennent
dans la régulation de la stéroïdogenèse de manière paracrine et autocrine. BMP4 et BMP7
stimulent aussi la production d’œstradiol, d’activine A, d'inhibine et de follistatine chez la
vache (Glister et al. 2004).
FGF1- FGF7
FGF1 est principalement exprimé dans la thèque et se localise à la surface des cellules de
granulosa chez la vache, certainement à cause de sa liaison au récepteur. FGF1 est susceptible
de réguler la stéroïdogenèse et l’apoptose des cellules de granulosa (pour revue (Chaves et al.
2012)). Des études récentes ont mis également en évidence une expression de FGF7 (KGF1) à
partir des follicules primordiaux et jusqu’aux secondaires chez la vache (Buratini et al. 2007) et
la femme (Abir et al. 2009). La protéine FGF7 est aussi présente dans tous les compartiments
folliculaires des stades pré-antraux et du stroma chez la chèvre (Faustino et al. 2011). FGF7
(KGF) est capable de stimuler la prolifération des cellules de granulosa et d’inhiber la
stéroïdogenèse « in vitro » (Parrott and Skinner 1998b), résultat renforcé par la présence du
récepteur dans les cellules de granulosa (Berisha et al. 2004). Une boucle de régulation
(similaire à celle décrite ci-après pour HGF (hepatocyte growth factor)) est également observée
pour FGF7 (Parrott and Skinner 1998b). Ces résultats suggèrent son implication dans la
régulation des stades pré-antraux
HGF
La thèque exprime également le Hepatocyte growth factor (HGF) et les cellules de granulosa
son récepteur c-Met met proto-oncogene ((Parrott and Skinner 1998a; Ito et al. 2001). HGF
45
Figure 31. Contact intercellulaire entre ovocyte et cellules de granulosa.
Source (Li and Albertini 2013)
Les projections transzonales sont composées de jonctions mécaniques (adherens junction) et de jonctions
communicantes (gap junction)..
stimule la prolifération des cellules de granulosa et augmente le nombre de follicules préantraux en culture d’ovaire ex vivo chez la souris (Guglielmo et al. 2011). Il influence
indirectement le développement de l’ovocyte en stimulant l’expression de KITLG dans les
cellules de granulosa (Guglielmo et al. 2011) et en retour KITLG stimule l’expression de HGF
formant une boucle positive de régulation (Parrott and Skinner 1998b).
Les signaux juxtacrines
La signalisation NOTCH est une voie de signalisation juxtacrine entre deux cellules au contact
l’une de l’autre puisque les ligands (DLL (Delta-Like Homolog ; Drosophila), JAG) et les
récepteurs NOTCH sont des protéines membranaires. Cette voie de signalisation joue un rôle
clé dans la communication cellulaire et influence la survie, l’apoptose ou la prolifération des
cellules voisines. Cette signalisation interagit aussi avec les voies de signalisation WNT et
Q_@*ériences d’hybridation in situ montrent que notch2, notch3 et le récepteur
jag2 sont exprimés dans les cellules de granulosa des follicules en croissance alors que jag1 est
exclusivement exprimé dans l’ovocyte des mammifères (Johnson et al. 2001). En présence
d’inhibiteur de la voie NOTCH, les follicules primaires arrêtent de se développer, les cellules
de granulosa se détachent et les ovocytes dégénèrent. NOTCH stimule le développement
folliculaire en stimulant la prolifération des cellules de granulosa (Zhang et al. 2011).
b. Les interactions physiques
En complément des différents facteurs paracrines et juxtacrines impliqués dans le dialogue
ovocyte-cellules somatiques, l’ovocyte et les cellules de granulosa mettent en place différents
types de contacts intercellulaires appelés projections transzonales : jonctions mécaniques et
communicantes (Figure 31). Ces projections transzonales augmentent en nombre et en
complexité au cours de la croissance folliculaire.
Les jonctions mécaniques sont composées :
- de microvillosités sur la membrane ovocytaire et les cellules de granulosa
- d'extension cytoplasmique des cellules de granulosa allant vers l’ovocyte et les
cellules de granulosa adjacentes (zones adhérentes et desmosomes).
Ces jonctions mécaniques apparaissent dès le stade primordial et se développent ensuite.
Les jonctions communicantes apparaissent au stade secondaire et correspondent à des canaux
transmembranaires principalement formés de protéines appartenant à la famille des connexines
(Makabe et al. 2006). Treize protéines de cette famille ont été identifiées dans l’ovaire de
différentes espèces dont la brebis (Grazul-Bilska et al. 1997). Parmi ces protéines, deux sont
46
essentielles et jouent un rôle très différent :
- la connexine 43 (CX43 ; CJA1) forme des jonctions entre les cellules de granulosa
- la connexine 37 (CX37; CJA4) se localise dans les jonctions ovocyte-cellules de
granulosa à partir du stade primaire.
Les ovaires de souris déficientes en connexine 43 ont une folliculogenèse bloquée au stade
primaire, sans multiplication des cellules de la granulosa et avec un retard dans la croissance
ovocytaire (Juneja et al. 1999).
L’invalidation de la connexine 37 chez la souris affecte la compétence méiotique et la
croissance ovocytaire. On observe également une absence presque totale de follicules antraux.
Cette connexine est essentielle pour le passage des follicules pré-antraux à antraux (Simon et
al. 1997).
c. Les signaux autocrines
Deux des 19 protéines de la famille WNT, wnt2 et wnt4 sont exprimées dans les cellules de
granulosa dès les stades précoces du développement folliculaire. L’invalidation conditionnelle
de wnt4 dans l’ovaire de souris dès les stades précoces, aboutit à des ovaires avec peu de
follicules antraux sains. Cette perte de follicules semble liée à une augmentation de l’atrésie
folliculaire. Différentes protéines de la voie de signalisation (FDZ4, CTNNB1, SFRP4
(secreted frizzled-related protein 4)) sont aussi exprimées dans les cellules de granulosa (Boyer
et al. 2010). CTNNB1 régule la transcription de gènes tels que CYP19A1 en interagissant avec
son partenaire NR5A1. CTNNB1 agit sur la prolifération, la différenciation et la survie des
cellules de granulosa. (pour revue (Boyer et al. 2010)).
d. Le rôle des hormones et des facteurs de croissance
Les hormones stéroïdes
Les androgènes (androstenedione et testostérone) sont produits par la thèque. Ils agissent
comme facteur paracrine essentiellement sur les cellules de granulosa en se fixant sur les
récepteurs à androgènes (AR). In vitro, la testostérone favorise la croissance des follicules préantraux chez la vache (Yang and Fortune 2006) et la brebis (Steckler et al. 2005). Elle est
capable d’inhiber l’expression de gdf9 chez la souris (Yang et al. 2010), d’augmenter
l’expression d’IGF1 et de son récepteur dans les cellules de granulosa et dans l’ovocyte des
primates (Vendola et al. 1999).
47
Stade
Primordial
Primaire
Petit pré-antral
Effets positifs
IGF-1 (p)
GDF-9 ( c )
Insuline (r,c,p)
KL ( r )
bFGF ( r )
IGF-II (p)
LIF ( r )
KGF ( r )
KITL ( r )
Progestérone ( r,c)
Androgènes ( c )
Estradiol ( c )
FSH (r )
EGF ( r )
TGF-ß (r )
Activine (r )
Androgènes (p )
GDF-9 ( r,p,s )
BMP15 (s )
KITL ( r )
VEGF ( c )
FSH (p,c )
bFGF ( c )
Androgènes (p )
EGF ( c )
Activine (r,c )
TGF-ß (r )
KGF ( r )
KITL ( r )
IGF-1 (r, c )
Effets négatifs
Sans effet
IGF-1 ( c )
IGF-1 (c,r)
GDF-9 ( r )
AMH ( r )
EGF (c )
Estradiol ( r )
Estradiol ( p)
FSH (c )
EGF ( r )
TGF-ß (c )
activine (r )
bFGF (c )
BDNF ( r )
FSH (c )
FSH (c )
IGF-1 ( c )
Tableau 9. Résumé des effets des hormones et facteurs de croissance sur la croissance
folliculaire.
Modifié de (Fortune 2003)
Entre parenthèsse : c=vache, r=rongeur, s=brebis, p=femme
VEGF
Le VEGF, puissant mitogène des cellules endothéliales, est très exprimé dans les cellules de
granulosa à partir du stade secondaire et à un moindre niveau dans les cellules thécales chez les
primates (Taylor et al. 2004). Chez les rongeurs, la vache et la truie son expression pendant la
phase basale est plus faible (Maisonpierre et al. 1997; Barboni et al. 2000; Greenaway et al.
2005) mais les profils d’expression sont similaires (Celik-Ozenci et al. 2003; Yang and Fortune
2007). Les récepteurs FLT1 (Fms-Related Tyrosine Kinase 1) et KDR (Fetal Liver Kinase 1)
sont également présents dans les cellules de granulosa et de thèque interne de rat. VEGF
stimule la transition primaire-secondaire des follicules de cortex ovarien en culture chez la
vache (Yang and Fortune 2007)
Les neurotrophines
Les neurotrophines NTF5 et BDNF et leur récepteur NTRK2, présent sur l’ovocyte, peuvent
ensemble diminuer le nombre de follicules secondaires (Paredes et al. 2004).
Un résumé des effets des hormones et des facteurs de croissance dans différentes espèces est
présenté Tableau 9.
Une synthèse du dialogue entre types cellulaires est présentée Figure 32.
Figure32. Dialogue moléculaire.
48
Figure 33. Biogenèse et régulation par les micro-ARN chez les mammifères.
Source (Hossain et al. 2012)
Ago1-4 : argonaute 1-4 ; m7G : 7-methyl-G cap
- : inhibition de la traduction ; + : favorise la déadénylation
Lieu
d’expression
Fonction
identifiée
Cible(s)
Changements au
cours du
développement
Espèce
(référence)
miR-224
Granulosa
Stimule la
prolifération
cellulaire,
Cyp19a1 et le
niveau
d’œstradiol
Smad4
Augmente l’induction
Q_@
follicules pré-antraux
Souris (Yao .
2010)
miR-383
Granulosa,
ovocyte
Stimule Cyp19a1
et le niveau
d’œstradiol
Rbms1
Diminue l’induction
Q_@ Souris (Yin . 2012)
follicules pré-antraux,
miR-23a
ND
Pro-apoptotique
dans la granulosa
XIAP
ND
Femme (Yang .
2012)
miR-26b
Follicule
Pro-apoptotique
dans la granulosa
ATM
Augmente pendant
l’atrésie folliculaire
Truie (Lin . 2012)
ND
Inhibe la
prolifération des
cellules de
granulosa
Acvr1b,
Ccnd2
ND
Souris (Yan .
2012)
Micro-ARN
Tableau 10. Rôle des miRNA identifiés pendant la croissance basale.
Modifié de (Donadeu et al. 2012)
e. Les micro-ARN
L’expression des gènes est précisément régulée dans le temps et dans l’espace. Des études
récentes mettent en évidence l’importance des micro- ARN (miRNA) dans cette régulation
(souris, truie, vache et brebis). La biogènese et la régulation de ces micro-ARN chez les
mammifères est décrite Figure 42. L’invalidation conditionnelle de dicer dans les ovocytes
(ZP3-cre) rend les souris stériles car les ovocytes ne sont pas fertilisables et la méiose s’arrête
en méiose I (Murchison et al. 2007). L’invalidation conditionnelle de dicer dans les tissus
exprimant l’AMH perturbe le développement folliculaire et la maturation de l’ovocyte. On
observe une accélération du recrutement folliculaire, une augmentation de l’atrésie folliculaire
et une diminution du nombre de follicule pré-antraux (Lei et al. 2010). Quelques études « in
vitro » plus ciblées sur les compartiments folliculaires ont été effectuées chez la souris, la
jument et la vache et montrent des différences entre compartiments (Donadeu et al. 2012). Une
synthèse des micro-ARN intervenant dans différents aspects du développement folliculaire est
présentée Tableau 10.
4.1
L’atrésie ovocytaire
La dégénérescence ovocytaire dépend largement de l’action balancée de protéines pro
apoptotiques et anti apoptotiques de la famille des BCL2 et concerne tous les stades de
développement (ovogonies, CGP et ovocytes). Chez la souris, l’invalidation des gènes ou la
délétion des protéines anti apoptotiques BCL2 et BCL2L1 (BCL2-like 1) réduit le nombre de
follicules primordiaux de la réserve et provoque une déficience en ovocytes respectivement.
Enfin, une délétion de la protéine pro apoptotique BAX (BCL2-associated X protein) augmente
le nombre de follicules primordiaux dans les ovaires de souris à la naissance. La
dégénérescence ovocytaire implique aussi des mécanismes alternatifs tels que l’autophagie
(Aitken et al. 2011).
4.2
L’atrésie folliculaire
Le mécanisme de base de l’atrésie folliculaire chez les mammifères est l’apoptose. C’est la
balance entre les signaux de survie (anti-apoptotiques) et de mort cellulaire (pro-apoptotiques)
qui va déterminer le devenir des follicules.
Au cours de la folliculogenèse basale, les modalités de mise en place de l’atrésie sont peu
étudiées mais différents facteurs influençant la croissance sont susceptibles d’intervenir. Une
49
diminution de GDF9 produit par l’ovocyte induit, par exemple, l’activation de la caspase 3 et
provoque l’apoptose des cellules de granulosa (Craig et al. 2007). La perturbation du couple
KITL/KIT pourrait aussi entraîner la dégénérescence ovocytaire dans les stades pré-antraux
(Packer et al. 1994).
50
Figure 34. Régulation du développement folliculaire basal.
Chapitre
spects moléculaires
L’initiation et la croissance folliculaire sont des processus qui nécessitent une suite
d’événements coordonnés impliquant des changements morphologiques et fonctionnels au sein
du follicule ovarien. La folliculogenèse basale n’est pas contrôlée par les hormones
gonadotropes hypophysaires mais par des facteurs locaux qui agissent de manière paracrines ou
autocrines.
e maintien vs l’activation des follicules primordiaux dépendent de la coordination entre
cellules somatiques et ovocytes et impliquent un ensemble de voies de signalisation ovocytaires
PI3K/PTEN-AKT-mTORC1-S6K- RPS6.
e maintien s’effectue grâce à l’action permanente
de facteurs inhibiteurs tels que FOXL2, AMH, PTEN, TSC....
’activation des follicules
semble être liée à une diminution de ces facteurs ou à une augmentation de facteurs stimulants
(KITL, LIF, NOBOX..). Les signaux extra ovocytaires activateurs de PI3K comme KITL,
l’insuline, etc, et la présence de facteurs inhibiteurs de la voie de signalisation intra ovocytaire,
comme PTEN, régulent finement le niveau optimal d’activation de PI3K. Une diminution des
signaux entraînerait une disparition des follicules primordiaux alors qu’une augmentation des
signaux entraînerait une activation de la croissance. Les interactions, par exemple entre KIT
ligand exprimé dans les cellules de granulosa et son récepteur KIT exprimé dans l’ovocyte,
sont un point critique dans l’activation des follicules.
a croissance folliculaire basale est contrôlée par des facteurs locaux. La communication
bidirectionnelle entre ovocyte et cellules somatiques joue également un rôle central dans ce
processus. Le dialogue se fait par l’intermédiaire de deux mécanismes: les projections
transzonales et les signaux paracrines/juxtacrines, impliquant différentes voies de signalisation.
L’ovocyte contrôle la prolifération des cellules de la granulosa et son propre développement.
Dès le stade primaire, l’ovocyte commence à exprimer, par exemple les facteurs GFD9 et
BMP15, qui sont indispensables pour la croissance des cellules de granulosa.
Les cellules de granulosa stimulent la croissance de l’ovocyte (via KITL) et régulent l’activité
de la thèque.
51
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52

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53
Microdissection à capture laser (LCM)
icrodissection
capture laser (LC )
Les ovaires de brebis ont été prélevés à la naissance et congelés à -80°C dans un milieu
d’enrobage (OCT : optimal cutting temperature compound). Des coupes de 8μm sont ensuite
posées sur des lames de verres et fixées dans un bain d’alcool de 70-75% pendant 30 s avant
d’être colorées.
Quatre types de colorations ont été évaluées : éosine-hématoxyline, histogène, toluidine,
crésyl violet (Article 1, Matériel et méthodes).
La microdissection à capture laser (LCM pour laser capture microdissection) a été effectuée
sous microscope avec le grossissement 40 avec les appareils Arcturus Veritas et XT. Les
follicules ont été isolés selon les critères de sélection suivants :
¾ PD (follicule primordial) : follicule d’un diamètre < 35 μm possédant un ovocyte
entouré de 2 à 3 cellules de pré-granulosa aplaties
¾ PM (follicule primaire) : follicule d’un diamètre compris entre 35-50 μm avec un
ovocyte entourés d’une couche de CG cuboïdales.
¾ SC (follicule secondaire) : follicule de 60 à 120 μm avec un ovocyte entouré de 2
couches de CG
¾ SA (follicule à petit antrum) : follicule de 250 à 500 μm avec un ovocyte entouré de
CG et un petit antrum.
Chaque compartiment de chaque stade a été capturé dans des capsules séparées pendant une
durée maximale de 2heures.
Chaque capsule a ensuite été congelée dans le milieu d’extraction des ARN.
Etant donné les faibles quantités de matériel, chaque échantillon microdisséqué est issu de 2 à
20 capsules (et de plusieurs animaux) qui ont été mélangées avant extraction de l’ARN.
Après extraction avec le kit « Picopure RNA isolation Kit » (Arcturus), les ARN ont été
soumis à 2 tours d’amplification linéaire avec l’ARN polymérase T7 (RiboAmp HS plus Kit).
La qualité de l’amplification a été contrôlée par électrophorèse en cytométrie de flux
(Bioanalyseur Agilent).
Des quantités croissantes de transcrits exogènes de Bacillus Subtilis (Affymetrix) ont été
rajoutées à tous les échantillons d’ARN, avant amplification pour vérifier, à l’analyse des
résultats RNA-seq, la linéarité de l’amplification.
54
Figure 35. Plan d’expérience
Chaque compartiment (ovocyte, cellules de granulosa) a été capturé pour les quatre stades de développement :
PD (primordial), PM (primaire), SEC (secondaire), SA (petit antrum). Enfin 4 répliques biologiques
indépendantes ont été isolées par condition.
Analyse du transcriptome
1. Support micro-array
Pour l’hybridation sur puce Affymetrix bovine (~24000 sondes), trois protocoles de marquage
de sondes des ARN d’ovaires fœtaux ont été comparés :
- protocole classique Affymetrix (1 tour d’amplification)
- marquage Affymetrix de l’ADN complémentaire (ADNc) après 2 tours
d’amplification (Kit RiboAmp HS PLUS)
- marquage indirect de l’ARN amplifié (ARNa) avec le kit « Biotin TURBO labeling
Kit » après les 2 tours d’amplification
La qualité des hybridations a été évaluée avec 3 paramètres donnés par l’algorithme
d’Affymetrix : le nombre de sondes hybridées (présentes), le facteur d’échelle et le rapport
3’/5’ UTR.
Le protocole expérimental n’inclut pas de répliques biologiques mais chaque échantillon est
une moyenne de plusieurs animaux. Nous avons donc appliqué un filtre stringent pour la
détection des sondes. Chaque transcrit qui est représenté par plusieurs sondes est déclaré
"exprimé" uniquement si toutes ses sondes sont détectées. Ce transcrit est alors représenté par
la sonde la plus en 3’UTR.
2. RNA-seq
De nouvelles expériences de captures laser sont ensuite venues compléter les échantillons
existants afin d’obtenir 3-4 répliques biologiques indépendantes par condition. Le plan
d’expérience est présenté dans l’article 2, Supplemental File 1; Figure S1 et est représenté
dans cette thèse en Figure 35.
Deux cents nanogrammes de chaque ARNa ont été rétro-transcrits et chaque réplique a été
étiquetée pour permettre sa reconnaissance (tagging). Le pyroséquençage s’est effectué avec
la technologie Hiseq 2000 à raison de 3 échantillons par ligne en mélange aléatoire. En
complément, 3 échantillons indépendants correspondant au mélange de 12 tissus ont
également été séquencés (MT) pour évaluer la spécificité d’expression.
55
2.1
Assemblageetannotation
Compte tenu de la particularité du jeu de données (ARNa induisant un biais de distribution
des lectures en 3’ UTR des gènes), deux types d’assemblage des séquences ont été effectués:
l’assemblage de novo et l’alignement sur la séquence génomique ovine (OARV2). La
procédure d’assemblage est détaillée dans l’article 2, Supplemental File 1; Figure S6.
Les contigs (assemblage de novo) et les fragments de séquence génomique (alignement sur la
séquence génomique) ont été annotés par alignement sur le génome bovin et par comparaison
avec la position des transcrits bovins (élargie si nécessaire de 500pb, 1 ou 3 kb en 3’UTR).
Le fichier final est constitué des fragments de séquence génomique les plus représentatifs des
gènes (fragments localisés en 3’UTR et regroupant le plus de lectures) et complété par les
gènes issus de l’assemblage de novo dont la séquence chez le mouton n’était pas disponible (~
600 gènes). L’expression des gènes correspond au nombre de lectures du fragment de
séquence génomique sélectionné pour chaque condition.
2.2
Validationexpérimentale
Les lectures de chaque transcrit de Bacillus Subtilis ont été normalisées en RPKM (reads per
kilobase of exon per million). Dans chaque échantillon, les transcrits ont été comparés au
transcrit le plus abondant (DAP) pour rendre les échantillons comparables entre eux.
2.3
AnalysesstatistiquesdesdonnéesRNAseq
Notre expérience a été conçue pour identifier de manière robuste (3-4 répliques biologiques)
des différences entre compartiments et stades de développement. L’analyse statistique de ce
jeu de données RNA-seq s’est donc effectuée en tenant compte de l’effet de 2 facteurs
(compartiment; stades de développement) à plusieurs niveaux (respectivement 2 niveaux
(ovocytes et CG) et 4 niveaux (PD, PM, SC, SA)) avec la méthode GLM du package DESeq
implémenté dans R. Trois modèles linéaires ont été évalués : le modèle complet
(expression~stade * compartiment), le modèle additif (expression ~stade + compartiment) et
le modèle réduit (expression ~1). Les différences significatives d’expression entre
compartiments, stades ainsi que les interactions stades*compartiments ont été ensuite
recherchées avec le test «nbinomGLMTest».
56
Validation par PCR en temps réel
a.
echerche des gènes
e pression enrichie dans un
compartiment
Les gènes à expression enrichie dans un compartiment ont été sélectionnés en réalisant un test
des échantillons multi-tissus (mélange de 12 tissus)) avec les critères suivants : FDR (false
discovery rate) <0,5% et un différentiel d’expression supérieur à 5 ou 10 pour les CG et
ovocytes respectivement.
b.
ènes différentiels au cours du dé eloppement folliculaire
précoce
L’analyse statistique du modèle additif a été complétée par une analyse statistique deux à
deux (nbinomTest). Les gènes différentiels ont été sélectionnés selon les critères suivants :
FDR <5% pour les effets globaux et p value <1% pour les comparaisons deux à deux avec un
différentiel d’expression supérieur ou égal à deux.
c.
echerche des biomarqueurs e pressionnels
Les biomarqueurs de la croissance folliculaire préférentiellement exprimés dans un
échantillon (PDO, PMO, SCO, SAO, PDG, PMG, SCG, SAG) ont été sélectionnés en
réalisant un test de comparaison deux à deux (nbinomTest) (chaque échantillon contre les
autres échantillons ovariens et les échantillons multi-tissus) avec les critères suivants : FDR
<5% et un différentiel d’expression supérieur à 3 ou 10 en fonction des comparaisons.
La capacité des biomarqueurs à grouper les classes de follicules a été évaluée en utilisant la
méthode (s) PLS-DA implémentée dans le package mixOmics dans R
alidation par C en temps réel
Les profils d’expression ont été contrôlés par RT-PCR en temps réel (ABI Prism 7900
Sequence Detection System 2.1, Applied Biosystems®) selon le protocole publié dans notre
article (Article 1).
L’expression différentielle entre compartiments et ou au cours de la croissance folliculaire
précoce a été mesurée par RT-PCR en temps réel sur l’ABI Prism 7900 (Sequence Detection
System 2.1, Applied Biosystems®) selon le protocole publié dans notre article (Article 1) ou
le Biomark de Fluidigm (896.96 Dynamic Array™ IFCs et BioMark™ HD System) après une
57
Interprétation biologique
pré-amplification de 14/17 cycles.
Après détection du nombre de cycles seuil pour chaque échantillon, nous avons appliqué la
méthode PFAFFL pour calculer l’expression relative de chaque gène. L’expression relative a
ensuite été normalisée par la moyenne géométrique provenant de 3 gènes de référence (RPL19
(ribosomal protein L19), actine et TMED4 (transmembrane emp24 protein transport domain
containing 4)) et transformée en logarithme ou racine quatrième (en fonction du jeu de
données). Les différentiels d’expression ont été ensuite évalués par la méthode ANOVA
(analysis of variance) en considérant un modèle à 2 facteurs (stade et compartiment) et
respectivement 2 niveaux (ovocytes et CG) et 4 niveaux (PD, PM, SC, SA).
L’expression spécifique des compartiments et des bioamarqueurs expressionnels a été ensuite
évaluée par un test de Student.
Le logiciel Ingenuity Pathway Analysis (IPA) a été utilisé pour aider à l’interprétation
biologique des différentiels d’expression. Ce logiciel combine les annotations fonctionnelles
de nos gènes différentiellement exprimés (GDE) avec les données de la littérature pour
identifier des fonctions et voies de signalisation statistiquement enrichies en GDE (test exact
de Fisher).
La significativité des voies de signalisation prend en compte 2 paramètres : 1- le rapport entre
le nombre de gènes du jeu de données qui appartiennent à la voie de signalisation et le nombre
total de gènes qui appartiennent à la voie de signalisation, 2- la valeur de p. Une fonction ou
une voie de signalisation est considérée comme significative pour une valeur de p <0,05.
Le module IPA « downstream effects analysis » de ce logiciel permet également en fonction
du changement d’expression des gènes sélectionnés, de prédire les conséquences attendues
dans les processus biologiques (augmentation ou diminution). Il recherche dans nos gènes
cibles ceux qui sont connus dans la littérature pour réguler les fonctions, il compare le sens
des changements d’expression par rapport à ceux attendus et prédit ainsi le sens du
changement du processus biologique en utilisant l’algorithme « regulation Z-score ».
Le module "IPA upstream regulator analysis” est utilisé pour comprendre la cause
58
pourraient expliquer en amont le changement d’expression des GDE. Enfin, pour chaque
régulateur, ce module d’IPA compare le sens du changement d’expression des GDE par
rapport aux changements décrits dans la littérature. Il prédit ensuite, avec l’algorithme
« regulation Z-score algorithm », l’effet du régulateur sur l’expression de chaque gène puis le
niveau global
d’activation du régulateur (au niveau protéique) d’un échantillon par rapport à un échantillon
contrôle.
Dans cette analyse, nous avons limité la liste des régulateurs prédits aux régulateurs exprimés
dans notre expérience.
Ces analyses permettent de rechercher les fonctions métaboliques, voies de signalisation et
régulateurs les plus pertinents pour l’expérience.
59
L A
60
RESULTATS
PREAMBULE
63
CHAPITREI.METHODESD’ANALYSEDESSTADESPRECOCESDELAFOLLICULOGENES
BASALECHEZLABREBIS
65
1.Résultats
66
1.1Isolementdesdifférentscompartimentsselonleursstadesdedéveloppement
66
1.2Morphologietissulaire
66
1.3Capture
66
1.4AmplificationdesARNmessagers
66
1.5Validationdelaspécificitédeséchantillons
67
1.6Analyseglobaled’expression
67
2.Conclusion
69
3.Article1
69
4.Annexesdel’article1
70
CHAPITREII.DESCRIPTIONDESTRANSCRIPTOMESDANSCHACUNDESDEUX
COMPARTIMENTSOVARIENS:SPECIFICITESFONCTIONNELLESETDIALOGUE
MOLECULAIRE.
1.Résultats
71
72
1.1Résultatsduséquençage
72
1.2Assemblage
72
1.3Descriptiondestranscriptomes
73
1.4Différentielsd’expressionglobaux
74
1.5Vérificationdelapertinencedenotrejeudedonnées
74
1.6Expressionenrichiedanslescompartiments
75
1.7ValidationparRT~PCRentempsréeldesdifférencesd’expressionentre
compartiments
75
1.8Annotationfonctionnelle
76
1.9Mécanismesetvoiesdesignalisation
76
1.10Interactionscellulaires
77
2.Conclusion
78
3.Article2
78
61
CHAPITREIII.PROFILDD’EXPRESSIONSPATIO~TEMPORELDELAFOLLICULOGENESE
BASALE:PREDICTIONDESPROCESSUSBIOLOGIQUESETSESREGULATIONS
1.Résultats
79
80
81
1.1Différentielsd’expressionaucoursdudéveloppementfolliculaire
81
1.2Analysefonctionnelleglobaledesfonctionsetvoiesdesignalisation
81
a.Lesfonctions
b.Lesmécanismes
1.3Validationdudifférentield’expressionparRT~PCRentempsréel
81
82
83
1.4Prédictiondesconséquencesduchangementd’expression:processus
biologiquesmisenœuvre
83
a.Dansl’ovocyte
b.Danslescellulesdegranulosa
c.Lescommunications
1.5Prédictiondescausesduchangementd’expression:régulationspendantle
83
83
84
développementprécoce
84
d.Facteursdecroissanceethormones
e.Mécanismes
f.Régulateurstranscriptionnels
1.6Latransitionfolliculeprimaire/folliculesecondaire
84
85
85
87
1.7Desmarqueursdelacroissancefolliculaireprécoce
87
2.Conclusion
87
2.Article3
89
90
62
Préambule
réambule
Une étude intégrée de la folliculogenèse doit inclure les changements d’expression des gènes
pour tous les types cellulaires. Pourtant, l'entité
follicule
mise en place lors de la
folliculogenèse basale et surtout les différents compartiments qui composent ces follicules
(ovocyte et les cellules de la granulosa) font objet finalement de peu d'études. En effet, les
études sont confrontées à deux difficultés majeures :
1- l’isolement des différents compartiments : la présence de tous les stades folliculaires
dans l’ovaire rend l'isolement de chaque compartiment encore plus difficile.
2- les petites quantités de matériel cellulaire disponibles : pendant la folliculogenèse
basale, les follicules sont de très petites tailles (40 à 200 μm).
Différents protocoles ont déjà été développés pour isoler les follicules à un stade donné lors
d'études in vitro chez l’homme, les rongeurs et les animaux domestiques, brebis incluse
(Gupta and Nandi 2012). Ces protocoles utilisent une digestion enzymatique de l’ovaire suivie
d’une sélection par gradient de ficoll (Martinez-Madrid et al. 2004; Dolmans et al. 2006), ou
microdissection (Oktay et al. 1997), filtration (Hornick et al. 2012), ainsi que des techniques
mécaniques (Amorim et al. 2000; Haag et al. 2013; Magalhães-Padilha et al. 2013).
Cependant, ces techniques ne permettent pas d’isoler précisément les différents
compartiments.
L’étude d’expression de gènes requiert également du matériel biologique en quantité
suffisante.
Pour ces raisons, les études transcriptomiques disponibles proviennent principalement
d’ovaire entier (Kezele et al. 2005; Dharma et al. 2009), de follicules entiers (Yoon et al.
2006) ou d’ovocytes isolés (Pan et al. 2005; Kocabas et al. 2006; Gallardo et al. 2007;
Markholt et al. 2012). Elles ont permis d'identifier l’expression de nombreux gènes (dont des
gènes nouveaux, des gènes spécifiques ou non de l'ovaire), et ont fourni une vue globale des
voies de régulation pendant la phase basale de la folliculogenèse chez différentes espèces dont
l’homme, la chèvre et la souris. Ces études transcriptomiques sont souvent complétées par des
analyses en immunohistochimie qui précisent le positionnement spatial des protéines
correspondantes.
L’ovocyte des follicules primordiaux est considéré comme quiescent mais ces études
63
Préambule
démontrent une activité transcriptionnelle et métabolique élevée (Kocabas et al. 2006;
Markholt et al. 2012). Gallardo et ses collaborateurs (Gallardo et al. 2007) ont analysé
l’expression des gènes dans des ovaires murins provenant de 4 stades de développement et
couvrant la période de l’assemblage des follicules et la croissance précoce (1, 7 et 14 jours
après la naissance) à l’aide d’un support microarray (puces Affymetrix). Ils ont conjointement
analysé l’expression de 14 tissus somatiques. Un groupe de 348 gènes à expression ovocytaire
enrichie a ainsi été mis en évidence chez la souris. Ces gènes montrent un enrichissement
génique sur le chromosome X.
Pan et ses collaborateurs (Pan et al. 2005) ont établi les profils d’expression des ovocytes de
follicules primordiaux jusqu’aux follicules à grand antrum isolés à partir d'ovaires de 2, 6, 12,
17 et 22 jours par hybridation des ARNm ovocytaires sur microarrays (puces Affymetrix). Ils
montrent que les changements d’expression plus importants dans l’ovocyte se situent à la
transition primordial-primaire et identifient une surreprésentation en gènes impliqués dans le
cycle cellulaire. Ces gènes sont ensuite majoritairement réprimés dans la suite du
développement. Certains ligands impliqués dans des voies de signalisation telles que NOTCH,
SHH (sonic hedgehog), EGF et TGFß, sont également détectés (Pan et al. 2005; Yoon et al.
2006).
Une étude récente a aussi été menée à partir de follicules secondaires et début d’antrum
provenant d’ovaires adultes de chèvre (Magalhães-Padilha et al. 2013). Cette étude met en
évidence trois principales voies métaboliques pendant la période pré-antrale : le métabolisme
lipidique, la mort cellulaire et le système hématologique.
Ces études restent encore descriptives, essentiellement réalisées à partir de modèles rongeurs
(espèce poly-ovulante) et tous les mécanismes moléculaires identifiés ne peuvent pas, à
l’évidence, être entièrement transposés aux espèces mono-ovulantes. Enfin, aucune de ces
études ne porte sur les cellules de granulosa isolées.
Les analyses d’expression haut débit permettent maintenant de décrire plus précisément les
niveaux d’expression des gènes. Néanmoins, le challenge actuel est d’intégrer et associer
l’information biologique disponible dans les bases de données publiques (localisation
cellulaire et chromosomique, fonction moléculaire, processus biologique), à ces listes de
gènes issues du NGS (next generation sequencing) pour en dégager une information
biologique intégrée et pertinente permettant de comprendre le processus physiologique. Les
limites actuelles concernent les espèces non modèles (autres que souris voire l'humain…) où
le manque d’information dans les bases de données est évident.
64
Titre de la publication
Tissus/espèces
Méthodologie
Type d’appareillage
de microdissection
(LCM)
Références
Global gene analysis of oocytes
from early stages in human
folliculogenesis shows high
expression of novel genes in
reproduction
Ovocytes de follicules
primordiaux, intermédiaires et
primaires de jeunes filles (11 et
21 ans)
Puces
oligonucléotides
Affymetrix
Arcturus Veritas
(Markholt et al.
2012)
Oocytes of baboon fetal
primordial ovarian follicles
express estrogen receptor beta
mRNA.
primordiaux de babouin
RT-PCR
Arcturus PixCell II
LCM
(Bocca et al. 2008)
Genomewide discovery and
classification of candidate ovarian
fertility genes in the mouse.
Ovocytes, cellules somatiques et
du stroma d'ovaire de souris de 3
semaines
Puces
oligonucléotides
Affymetrix
Arcturus PixCell II
LCM
(Gallardo et al.
2007)
.
Pas de répliquat biologique
New approach to in situ
quantification of ovarian gene
expression in rat using a laser
microdissection technique:
relationship between follicle types
and regulation of inhibin-alpha
and cytochrome P450aromatase
genes in the rat ovary.
Follicules pré antraux et antraux
provenant d’ovaires de rat
immature (24j)
RT-PCR
Leica Microsystems
(Sakurada et al.
2006)
Identification of genes expressed
in primate primordial oocytes.
primordiaux provenant de singe
(Macacca mulatta) de 6–13 ans
microarray
humain de 8K
(cDNA)
PixCell II LCM
system
(Arraztoa et al.
2005)
Expression of cell cycle
regulatory genes during
primordial-primary follicle
transition in the mouse ovary
Follicule primordiaux et
primaires de souris (but :
validation de résultats obtenus
par hybridation soustractive
suppressive)
RT-PCR
PixCell II LCM
system
(Park et al. 2005)
Basic fibroblast growth factor
expression in isolated small
human ovarian follicles.
Follicules primordiaux, primaires
et secondaires provenant de
biopsies d’ovaires de femmes
fertiles de 26–34 ans
RT-PCR
PixCell II LCM
system
(Quennell et al.
2004)
Tableau 11
iste des publications a ant utilisé la technologie C
folliculogenèse basale de différentes espèces
pour étudier la
Chapitre I. Méthode d’analyse des stades précoces de la folliculogenèse basale chez la brebis
Chapitre I. éthode d’analyse des stades précoces
de la folliculogenèse basale che la brebis
La microdissection à capture laser (LCM pour Laser Capture Microdissection) est une
technique récente et prometteuse qui permet d’isoler une population de cellules spécifiques
d’un tissu complexe et s’applique sur des coupes de tissu montées sur lame de microscope.
Cette technique commence à être utilisée sur la thématique de la folliculogenèse ovarienne
(Tableau 11) et le plus souvent, elle est couplée à de la RT-PCR pour étudier l’expression de
gènes spécifiques ou valider certaines études globales. Seules trois études transcriptomiques,
mais avec peu d’échantillons puisqu'elles nécessitent une quantité importante de matériel, ont
été réalisées jusqu’à présent pour étudier la folliculogenèse.
Pour atteindre le premier objectif et obtenir une vue globale de l’expression des gènes au
cours des stades précoces de la folliculogenèse, il était donc nécessaire dans un premier temps
d’optimiser les méthodologies aux petites tailles et quantités.
Dans ce but, nous avons choisi de combiner 1) la microdissection laser permettant d’isoler
spécifiquement les deux compartiments cellulaires d’intérêt (ovocytes et cellules de
granulosa) au cours de la folliculogenèse basale chez la brebis, 2) l’amplification des ARNm
et, 3) les puces à oligonucléotides (Affymetrix) permettant d’analyser l’expression d’un grand
nombre de gènes simultanément.
Les résultats de cette optimisation ont été publiés en 2011 : (Bonnet et al. 2011).
Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and ooc tes during earl
follicular development obtained b
aser Capture
icrodissection
65
Résultats
1.
ésultats
1.1
Isolementdesdifférentscompartimentsselonleursstades
dedéveloppement
Dans un premier temps, l’observation de coupes d’ovaires colorées provenant des différents
stades de développement (80 jpc, 100 jpc, 120 jpc, 135 jpc et naissance) a permis de vérifier
la chronologie du développement folliculaire précoce dans la race de brebis Lacaune (Figure
2). Nous avons choisi de n’utiliser que des ovaires prélevés à la naissance puisque des
quantités raisonnables de matériel ont été observées pour tous les stades de développement
folliculaire. La qualité du matériel obtenu par LCM dépend de trois facteurs : la morphologie
tissulaire, le succès de la capture et le maintien de l’intégrité moléculaire de l’ARN.
1.2
Morphologietissulaire
Quatre methodes de coloration ont été evaluées (Bleu de Toluidine, Histogène,
Hematoxyline Eosine, Crésyl Violet). La méthode de coloration au Cresyl Violet est, dans
notre cas, la plus adaptée car elle permet de bien repérer les structures tout en maintenant une
bonne qualité d’ARN (Article 1, Figure 1).
1.3
Capture
Pour améliorer le succès de la capture laser, les coupes ont été déposées sur des lames
froides (4°C), et la fixation s’est effectuée avec de l’éthanol froid (-20°C) et à 70% (contre
75% dans le protocole standard) (Article 1, Figure 2). Ce protocole maintient la qualité des
ARN durant la période de microdissection (2h) (RIN (RNA integrity number) >6) (Article 1,
Additional File 1). Les extractions d’ARN ont été effectuées après regroupement de plusieurs
séries de microdissection. A ce stade là, la quantité d’ARN est trop faible pour pouvoir être
dosée ou contrôlée.
Avec ce protocole, les ARN de trois répliques indépendantes pour chaque compartiment
folliculaire (cellules de granulosa (CG) et ovocyte (O) et au cours des quatre premiers stades
de développement (follicule primordial (PD), follicule primaire (PM), follicules secondaires
(SC) et petit follicule à antrum (SA) ont été obtenus, soit huit conditions en triple.
1.4
AmplificationdesARNmessagers
Etant donné que la quantité d’ARN messager (ARNm) obtenue après LCM est faible, les
ARNm ont été amplifiés deux fois par la méthode d’amplification linéaire T7 ARN
66
Résultats
Polymérase. Le spectre de taille des ARN amplifiés (ARNa) est compris entre 200 et 2000 pb
(Article 1, Additional File 2). La Table 1 de l’article indique les quantités d’ARNa obtenus
pour chaque échantillon.
1.5
Validationdelaspécificitédeséchantillons
La qualité des échantillons a été évaluée en mesurant par PCR quantitative l’expression de
gènes spécifiques de l’ovocyte ou des cellules de la granulosa. L’expression de 6 gènes
ovocytaires et de trois gènes des cellules de la granulosa a été analysée (exemple : ovocyte :
BMP15…; granulosa : AMH…) (Article1, Table 2). Des différences significatives
d’expression sont observées (P value <5%) entre compartiments pour tous les gènes testés.
Pour un compartiment donné, une augmentation significative d’expression au cours du
développement folliculaire est aussi observée pour six gènes sur neuf.
Nous avons donc des échantillons représentatifs des compartiments et des stades de follicules.
1.6
Analyseglobaled’expression
Les expériences de transcriptome ont été effectuées sur un support bovin (Affymetrix), espèce
la plus proche de la brebis en terme d’homologie de séquences et support le plus complet
disponible au moment de l’expérience. Une première étape a consisté à vérifier que
l’hybridation hétérologue entre l’ARN ovin et la puce Affymetrix bovine était comparable à
une hybridation homologue ARN bovin sur puce bovine. Nous obtenons 49,8% de sondes
d’ovaire fœtal ovin hybridées sur puce Affymetrix bovine contre 57,1% en sondes
homologues (ARN d’ovaire fœtal de vache) (Article 1, Additional File 3). Ces résultats sont
comparables à ceux obtenus par Flemming-Waddell et al : 40,6 % pour une hybridation de
muscle ovin sur puce Affymetrix bovine et 55,6 % pour une hybridation de muscle bovin sur
puce Affymetrix bovine (Fleming-Waddell et al. 2007).
Dans un deuxième temps, afin de conserver des ARNa pour les étapes de validation par RTPCR en temps réel, nous avons évalué les performances du marquage indirect de sondes
(protocole 3) par rapport aux protocoles préconisés par Affymetrix (Article 1, Additional File
3). Chaque tour d’amplification diminuant la longueur du transcrit, on observe pour les
échantillons soumis à deux tours d’amplification, une légère diminution du nombre de sondes
détectées et une augmentation du ratio 3’/5’. Les signaux d’hybridations obtenus par le
marquage indirect sont comparables à ceux obtenus par le marquage Affymetrix (r=0,8). Les
signaux d’hybridation des gènes exogènes (Bacillus Subtilis), avant et après amplification des
67
Résultats
ARN sont également comparables
(r=0,92) et valident la qualité de l’amplification.
L’hybridation des ARNa microdisséqués (un échantillon par stade et compartiment) identifie
un répertoire de 11291 sondes oligonucléotidiques présentes au cours des premiers stades de
la folliculogenèse basale. Ces sondes correspondent à 8652 transcrits annotés (Article 1, Table
2). Notre étude identifie 1050 gènes spécifiquement exprimés dans les cellules de la granulosa
(par rapport à l’ovocyte) et 759 dans l’ovocyte. L’analyse de l’expression de 10 gènes par RTPCR en temps réel confirme la spécificité d’expression de ces gènes pour 9 d’entre eux
(Article 1, Table 2). Une augmentation de l’expression au cours de la folliculogenèse basale
est également observée pour 3 gènes (FST, MAEL (maelstrom), SIRT7 (sirtuin 7)) (Article 1,
Figure 4).
La pertinence biologique de ces deux listes de gènes (1050 gènes des cellules de granulosa et
759 gènes de l'ovocyte) a été recherchée in silico grâce au logiciel Ingenuity Pathway
Analysis (IPA) (Article 1, Additional Files 4 et 5).
Cette analyse fonctionnelle identifie les trois principaux événements cellulaires connus pour
être impliqués dans la folliculogenèse basale (Article 1, Figure 5), à savoir :
1-
le passage des CG d’une forme allongée à une forme cuboïdale qui est associé
à trois fonctions cellulaires enrichies en gènes surexprimés dans les CG (mouvement,
assemblage et organisation, et morphologie cellulaire).
2-
une augmentation importante du nombre de CG décrite par deux fonctions
cellulaires également enrichies en gènes surexprimés dans les CG (prolifération et croissance
cellulaire, mort cellulaire).
3-
une augmentation du volume de l’ovocyte associée à un enrichissement des
gènes impliqués dans des mécanismes de guidage (« axonal guidance ») et de développement
cellulaire de l’ovocyte (« cellular development ») (Tableau Annexe 5 de l’article).
Nous mettons enfin en évidence des réseaux de gènes impliqués dans la communication entre
cellules (« cell cell signaling and interaction» (Article 1, Figure 5), « cellular immune
response ». Nous illustrerons ce dialogue d’une part, par une expression de BMP15 dans
l’ovocyte et d’autre part, par une expression accrue de composants de la voie de signalisation
des BMP (Figure Annexe 7 de l’article). D’autres gènes impliqués dans la communication
entre compartiments sont également identifiés dans cette analyse comme l’AMH, KITL, IL1B.
68
Conclusion
. Conclusion
En conclusion, l’association des technologies LCM, amplification des ARNm et support
transcriptomique permet d’analyser l’expression des gènes pour de faibles quantités de
cellules d’intérêt isolées à partir d’un tissu complexe. Cette approche a été optimisée dans
cette étude pour caractériser l’expression génique dans les deux compartiments d’intérêt au
cours de la folliculogenèse ovarienne basale. Ces résultats montrent que des données fiables
d’expression peuvent être produites.
L’étude préliminaire des répertoires d’expression des compartiments a identifié des gènes et
mécanismes moléculaires connus, intervenant essentiellement dans les communications entre
les compartiments.
De nouvelles expériences vont maintenant être menées par séquençage haut débit, pour
poursuivre le projet de manière plus exhaustive.
3.
rticle 1
Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and ooc tes during earl
follicular development obtained b
aser Capture
icrodissection
69
Bonnet et al. BMC Genomics 2011, 12:417
http://www.biomedcentral.com/1471-2164/12/417
RESEARCH ARTICLE
Open Access
Transcriptome profiling of sheep granulosa
cells and oocytes during early follicular
development obtained by Laser Capture
Microdissection
Agnes Bonnet1*, Claudia Bevilacqua2, Francis Benne1, Loys Bodin3, Corinne Cotinot4, Laurence Liaubet1,
Magali Sancristobal1, Julien Sarry1, Elena Terenina1, Patrice Martin2, Gwenola Tosser-Klopp1† and
Beatrice Mandon-Pepin4†
Abstract
Background: Successful achievement of early folliculogenesis is crucial for female reproductive function. The
process is finely regulated by cell-cell interactions and by the coordinated expression of genes in both the oocyte
and in granulosa cells. Despite many studies, little is known about the cell-specific gene expression driving early
folliculogenesis. The very small size of these follicles and the mixture of types of follicles within the developing
ovary make the experimental study of isolated follicular components very difficult.
The recently developed laser capture microdissection (LCM) technique coupled with microarray experiments is a
promising way to address the molecular profile of pure cell populations. However, one main challenge was to
preserve the RNA quality during the isolation of single cells or groups of cells and also to obtain sufficient amounts
of RNA.
Using a new LCM method, we describe here the separate expression profiles of oocytes and follicular cells during
the first stages of sheep folliculogenesis.
Results: We developed a new tissue fixation protocol ensuring efficient single cell capture and RNA integrity
during the microdissection procedure. Enrichment in specific cell types was controlled by qRT-PCR analysis of
known genes: six oocyte-specific genes (SOHLH2, MAEL, MATER, VASA, GDF9, BMP15) and three granulosa cellspecific genes (KL, GATA4, AMH).
A global gene expression profile for each follicular compartment during early developmental stages was identified
here for the first time, using a bovine Affymetrix chip. Most notably, the granulosa cell dataset is unique to date.
The comparison of oocyte vs. follicular cell transcriptomes revealed 1050 transcripts specific to the granulosa cell
and 759 specific to the oocyte.
Functional analyses allowed the characterization of the three main cellular events involved in early folliculogenesis
and confirmed the relevance and potential of LCM-derived RNA.
Conclusions: The ovary is a complex mixture of different cell types. Distinct cell populations need therefore to be
analyzed for a better understanding of their potential interactions. LCM and microarray analysis allowed us to
identify novel gene expression patterns in follicular cells at different stages and in oocyte populations.
* Correspondence: [email protected]
† Contributed equally
1
INRA, UMR444 Génétique Cellulaire, Auzeville, BP52627, F-31326 CastanetTolosan, France
Full list of author information is available at the end of the article
© 2011 Bonnet et al; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons
Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in
any medium, provided the original work is properly cited.
Background
Many studies have been carried out to identify the
mechanisms controlling early folliculogenesis (from follicle formation of the resting pool to the preantral stage).
These early stages are important in regulating the size
of the resting primordial follicle pool and the fate of the
follicles, which in turn affects reproductive life span and
fertility.
Even if the events of folliculogenesis are well-conserved among mammals, differences exist between species in the timing of specific developmental changes and
more specifically, the role of several genes was shown to
be different between mono-ovulating and poly-ovulating
species. The formation of primordial follicles occurs
within a few days after birth in rodents and during fetal
development in primates and ruminants such as sheep
(75 days of gestation) [1]. The primordial follicles are
composed of diplotene oocytes surrounded by flattened
pregranulosa cells. Transcriptomic studies in human and
in rodents, showed that a number of genes, such as
transcription factors (Figure 1 alpha) [2], zona proteins,
meiosis-specific enzymes and nerve growth factors [3]
have already been identified as being involved in primordial follicle assembly. Once formed, primordial follicles remain in a dormant phase until they are recruited
to initiate growth towards the primary stage. Orchestrated communication between oocytes and somatic
cells (granulosa cells and thecal cells) is required during
this transition and during the subsequent growth of follicles. Different components of the extra-cellular matrix,
such as growth factors and cytokines, acting in an autocrine and paracrine manner, are involved in this cross
Figure 1 Quality of tissue morphology with the four staining
protocols. New born ovary staining section (100 × magnifications)
produced by: A. Toluidin blue. B. Hematoxylin Eosin. C. Histogen®.
D. Cresyl Violet®. Abbreviations: Oo: oocyte, GC: granulosa cells.
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talk. For example, cytokines such as the kit-ligand,
expressed in granulosa cells, and its receptor c-kit,
expressed in oocyte and theca cells [4], are involved in
the formation of primary follicles. Then, oocyte-secreted
growth factors such as GDF9 and BMP15 are involved
in primary to secondary follicle transition [5,6]. They
co-operate to regulate proliferation of granulosa cells
[7]. In addition, other factors such as FOXL2, AMH or
NGF also play a role in these different steps of early folliculogenesis [8].
Until now, efforts to discover genes have mainly
focused on rodents and only a small number of genes
are currently known, meaning that our basic understanding of the gene expression patterns driving early
folliculogenesis is still very poor. More specifically, the
expression of various oocyte-specific genes was demonstrated to be essential at a specific time during early folliculogenesis but little is known exactly about which
granulosa cell factors play a specialized role in follicular
development.
Moreover, all findings in rodent species are not necessarily applicable to other mammals, especially monoovulating species. Indeed, whereas mutations in the
BMP15 gene cause infertility in ewes due to defects in
folliculogenesis [9] and have been associated with premature ovarian failure (POF) in women [10-12], most
defects in female mice lacking the bone morphogenetic
protein BMP15 are confined to the ovulation process
[13].
Finally, most transcriptomic studies of early folliculogenesis are based on homogenized tissues (whole ovary
or follicles) [14-16], and do not take the multiplicity of
cell types used in the analyses into consideration. Consequently, potentially valuable spatial information is lost
and the minor cell components, expressed only in few
cell types may be diluted below the level of detection.
Laser capture microdissection (LCM) allows precise
microscopic isolation of pure cell populations from heterogeneous tissues for subsequent extraction and analysis of nucleic acids [17]. Conducting LCM experiments
for gene expression profiling requires an acceptable tissue morphology to allow for histological selection of the
desired cell type and to guarantee RNA integrity. Particularly, single cell LCM requires a lot of time to search
for and identify cells of interest in the tissue section.
Preserving RNA quality during this long process is challenging. Indeed, most existing protocols [18-22] do not
guarantee the integrity of RNA during the long time
required for microdissection.
In the present study, LCM was used to isolate oocytes
and granulosa cells (GC) from new born sheep ovaries
and their respective transcriptomes were compared
using a 23 k bovine microarray and quantitative realtime PCR (qPCR).
We developed an LCM method allowing for a longer
microdissection time without RNA degradation, to gain
specific access to the follicular compartments, i.e. GC
and oocytes, at each follicular developmental stage [23].
Starting from amplified RNA, gene expression profiles
were monitored for each follicle population, according
to cell type on an Affymetrix GeneChip Bovine array.
Our results showed that microdissected samples were
representative of the different compartments and stages
and demonstrated the feasibility of using LCM and
array hybridization to identify cell type and/or stage
gene expression signatures in developing ovaries.
Results
LCM and RNA amplification
The purpose of any tissue preparation protocol for LCM
is to obtain tissue sections allowing for unambiguous
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identification and successful capture of the cells of interest, while maintaining RNA integrity. Four staining protocols: Toluidin blue, Hematoxylin-Eosin (H&E),
Histogen® and Cresyl Violet® were evaluated in terms
of tissue morphology, maintenance of molecular integrity and capture success. Figure 1 shows that the best
tissue morphology was provided by Cresyl Violet® and
H&E staining. The RNA Integrity Number (RIN) analysis revealed significant RNA degradation with Toluidin
blue and Histogen® staining (data not shown). Finally,
although the Cresyl Violet® protocol was the best both
for identifying structures and for maintaining the best
RNA quality, the ovary sections were fixed too tightly to
the glass and capture did not exceed 50%. Consequently,
we developed a new cold fixation protocol (70% ethanol
fixation at -10°C), allowing efficient single-cell capture
(Figure 2). In these conditions, RNA quality did not
Figure 2 Summary of the LCM capture of primordial follicular compartments. Representative photographs of a primordial follicle before (a)
and after (b) microdissection. GC were selected (a, arrow), dissected (b1) and collected in a cap (c1). The oocyte was dissected (b2) and collected
(c2). Abbreviation: Oo: oocyte.
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decrease more than 10% during the staining and microdissection period (up to 120 min). The RIN values typically obtained with RNA extracted from stained sections
ranged between 6 and 8.7 and were similar to those
obtained with standard fixation protocols (Additional
file 1).
Using this protocol, the follicular compartments, i.e.
GC and oocytes, were captured for each follicle stage:
primordial (Pd), primary (Pm), secondary (Sec) follicles
and the first antral stage as control (small antral: SA).
After RNA extraction and amplification, the LCMderived anti-sense-RNA (aRNA) samples appeared as a
highly reproducible smear, ranging from 200 to 2000
bases in length across all samples (Additional file 2A).
Table 1 summarizes the amount of estimated microdissected sections input and the aRNA yield for each
LCM-sample.
Validation of sample specificity
The purity of the LCM-derived aRNA samples and the
microarray data quality were examined by investigating
specific gene expression of nine genes using quantitative
real-time PCR (qPCR). Among them, six were oocytespecific genes (SOHLH2, MAEL, MATER, VASA, GDF9,
BMP15) and three known to be expressed in GC (KL,
GATA4, AMH). Table 2 summarizes the results of the
statistical analyses (see Material and Methods) for each
gene. We identified significant interaction effects
between compartments (oocyte, GC) and between stages
(including early stages (Pd, Pm, Sec) and the first antral
stage (SA)) for six genes. Significant differential expression between the compartments was confirmed for all
the genes tested. Moreover, four genes showed a significant increase in expression associated with early follicular development (Table 2). For example, BMP15, AMH
and MAEL expression increased between the primary
and secondary developmental stage respectively. By
contrast, VASA, KL and SOHLH2 displayed no significant differences between stages (Figure 3, 4). These
results demonstrated that the LCM-derived aRNA samples were representative of the cell type and/or developmental stage concerned.
Global gene expression analysis
To explore global gene expression in the cell types and/
or early developmental stages, the ovine LCM-derived
aRNA samples were hybridized to the Affymetrix Bovine
Genome Array, as generic microarray is not available in
sheep, and the bovine and ovine genomes are phylogenetically close.
First, to assess the reliability of the heterologous hybridization on the bovine microarray, we compared hybridizations with RNA from bovine and ovine fetal gonads.
Hybridization with the ovine fetal gonad RNA sample
revealed an average of 49.8% of the probe sets called as
“present” (scored probe sets detected using the Affymetrix algorithm) compared to an average of 57.1% for the
bovine counterpart sample. Around 90% of these probe
sets were shared (Additional file 3). The percentage of
ovine transcripts detected in this control experiment is
similar to a previous report using ovine mRNA on the
Affymetrix GeneChip Bovine array [24]. This result
demonstrated the possibility of using heterologous
hybridization in our conditions.
Next, in order to keep LCM-derived aRNA samples
for further expression experiments, we assessed the
quality of Arcturus turbo™ labeling (indirect labeling
after RNA amplification) compared to that of the Affymetrix labeling kit. Ovine fetal gonad RNA was subjected to three different labeling protocols (P1:
Affymetrix standard target labeling, P2: two amplification rounds followed by Affymetrix cDNA labeling and
P3: Arcturus turbo™ labeling kit) and hybridized to
the Affymetrix Bovine Genome Array. The sensitivity
Table 1 Microdissection and RNA yield
Follicular stage
Compartment
Replicates
Estimation of the number of sections input
aRNA yield (μg)
Primordial
Oocyte
3
130-160
7-28
Granulosa
3
600
6-49
Primary
Oocyte
Granulosa
4
4
35-100
100-490
3-28
2-24
Secondary
Oocyte
4
10-22
2-13
Granulosa
4
Corresponding to 12-20 follicles
4-16
Oocyte
2
13-15
4-20
Granulosa
2
Corresponding to 12-13 follicles
44-55
Small antral
Estimated number of microdissection sections input and corresponding yield of aRNA for each sample.
aRNA: amplified RNA
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Table 2 Results of qPCR analysis
Gene
Microarray analysis
qPCR analysis
Compartment effect (O/GC)
O/GC
Fold change
Fold change
P value class
SOHLH2
VASA
WEE
O only
194.5
184.6
2.2
***
***
*
MAEL
MATER
GDF9
BMP15
SIRT7
2.3
1.5
1.3
5.2
229.4
14.3
374.5
316.7
33.0
***
*
***
***
**
KL
GATA 4
LAS1L
PHGDH
-7.5
-2.1
GC only
GC only
-3.6
-8.7
-1.8
-3.6
**
*
*
NS: 0.067
AMH
FST
-7.3
-54.7
-697.5
*
*
Follicular stage
Fold change
P value class
Interactions
Compartment/stage
Expression profile
Oocyte (
) GC ( )
*
4.2
33.9
13.9
627.2
12.2
*
***
*
*
***
*
***
**
*
***
1608.8
122.3
**
*
**
*
O/GC fold change corresponds to the highest oocyte expression of the 3 follicular stages versus the lowest ones. For genes overexpressed in GC, a minus sign
was added to the GC/O fold change.
Follicular stage fold change corresponds to the highest expression stage versus the lowest within a compartment.
For each gene, a one-way ANOVA model was fitted with the 2 factors: “stage” (4 levels) and “compartment” (2 levels) with interactions using R statistical
software.
The expression profile column visualizes the expression level of each compartment: bold line is used for oocyte expression and double line for GC expression.
The slope symbolizes a significant increase of the expression during the follicular development.
P-value class: *: p < 0.05; **: p < 0.01; ***:p < 0.001; NS: non specific
Abbreviations: O: oocyte (red line), GC: granulosa cells (blue line)
and reliability of these protocols were evaluated using
three measures of GeneChip performance (see Materials and Methods) provided by the Affymetrix algorithm
(Additional file 3). The double round amplification
data revealed a slight reduction in the number of “present” calls. The Scale Factor was similar in all hybridizations. Finally in labeling protocols from amplified
RNA (P2; P3), the 3’/5’ signal ratio was higher than
the 3’/M ratio signal for two housekeeping genes
(GAPDH, GST), demonstrating that the mean size of
the aRNA obtained was shorter than Affymetrix standard labeling kit. Similar observations have been
reported by others [25,26]. Since each round of amplification shortens the length of the RNA transcript,
eventually resulting in the loss of 5’ regions, the signal
ratio between 3’ and 5’ probe sets consequently
increases. In addition, the intensity signal of Arcturus
turbo™ labeling aRNA showed a high level of concordance with the Affymetrix ones (r = 0.8).
The analysis of signal intensity values for the four
Bacillus subtilis control transcripts that were added to
all LCM-derived RNA samples before amplification (see
Materials and Methods) showed comparable amplification in all the LCM-derived RNA samples and the ovine
fetal ovary (r average: 0.92).
Cell profiling
Different follicle population hybridizations enabled us to
detect 11,291 probe sets corresponding to 8652 annotated transcripts, split into 6794 to 8344 probe sets
according to the samples (Table 3).
We also identified 1050 transcripts specifically
expressed in GC and 759 transcripts expressed only in
oocytes during early follicular development. Five genes
(KL, GATA4, MAEL, MATER, GDF9) known as having
compartment-specific expression were confirmed by
microarray data and qPCR analyses (Table 2). Five additional genes (SIRT7, FST, LASL1, WEE, PHGDH) showing a new spatiotemporal expression were checked by
qPCR and 4 of them were validated. Moreover, we
observed a significant increase in SIRT7, MAEL and FST
expression during early follicular development (Figure 4).
The biological relevance of the two specifically
expressed gene lists (1050 + 759) was evaluated in silico
using Ingenuity Pathway Analysis (IPA). A total of 1689
genes were identified as eligible by IPA and used to generate networks.
Seven significant biological networks for oocytes and ten
significant biological networks for GC were selected (score
> 18, Additional file 4). These networks identified common and specific top functions (Figure 5) with their
Figure 3 Gene expression profiles. Relative quantification
throughout early follicular development and in the two follicular
compartments (n = 3-4 except for Ant, n = 2). Profiles showed a
significant increase in gene expression for BMP15 and AMH from the
primary and secondary stage, respectively. By contrast, KL and VASA
genes were expressed at all stages from the primordial follicular
stage on, with no significant differential expression during the
process of early folliculogenesis. The Y axis corresponds to the
relative expression normalized by 2 reference genes (Actin b and
RPL19). The X axis corresponds to the different follicular stages of
the 2 follicular compartments. Abbreviations: Pd: primordial, Pm:
primary, Sec: secondary, SA: small antrum. *< 0.05, **< 0.01.
associated pathways (Additional file 5). The “Diseases and
Disorders” catalog was specific to GC and included the
most significant Genetic Disorder class, which contained
72% of the eligible genes. Genes from GC were also mainly
involved in “Cell Growth and Proliferation”, “Cell Death”
and “Lipid Metabolism” classes. We also identified GC
functions involved in “Cell Movement and Cell Interactions”. The oocyte-specific gene list highlighted two specific functions: “Reproductive System and Function” that
clearly targets folliculogenesis (including GDF9, FOXOA1
and SYCP3 genes) and the “Hematopoiesis Function” that
mainly includes differentiation processes.
Discussion
Gene expression profiling through the use of oligoarrays
is a powerful approach for characterizing the whole
population of transcripts in a tissue, and amplification
methods now allow these techniques to be used for very
rare material. Nevertheless, it is still difficult to obtain
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Figure 4 SOLHL2, MAEL, SIRT7 and FST expression profiles.
Relative quantification of SIRT7, SOLHL2, MAEL and FST mRNA
throughout early follicular development (Pd, Pm, Sec) and small
antrum (SA) and in the 2 follicular compartments (n = 3-4 except
for SA n = 2). The Y axis corresponds to the relative expression
normalized by 2 reference genes (Actin b and RPL19). The X axis
corresponds to the different follicular stages of the 2 follicular
compartments. Abbreviations: Pd: primordial, Pm: primary, Sec:
secondary, SA: small antrum. *< 0.05, ***< 0.001.
cell type specific expression profiles from heterogeneous
tissues. For these reasons, in the context of early folliculogenesis, our current knowledge has been largely
derived from rodent whole ovaries [14,27,28] and the
few isolation protocols available referred to oocytes
[29,30] or whole follicles [16,31] and did not differentiate GC. Although the expression profile of some compartment-specific genes could be inferred, the presence
together of different cell types confused the analysis.
Consequently, little information about the role of GC
during early folliculogenesis is available.
The strength of the present study is to develop a
method for obtaining reliable specific expression profiles
and to characterize GC and oocytes separately at several
key stages corresponding to major transitions during the
development of the follicles.
Quality of the LCM-derived aRNA
To obtain reliable microarray results, LCM must produce a sufficient amount of high quality RNA. In the
case of single cell LCM, we have to face the long
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Table 3 Microarray results
Our data
present probe sets
Mouse data (pan, 2005) Unigene
unique annotated genes
PDO
7828
6300
9258
PMO
6794
5603
9494
9420
SECO
7379
6039
PDG
8344
6631
PMG
6931
5708
SECG
8092
6545
Total detected
Chip representation
11291
24024
8652
12404
25535
Distribution of the detected probe sets and unique annotated genes among the LCM-derived RNA samples.
’Total detected’ refers to the whole detected probe sets within the LCM-derived RNA oocyte samples.
LCM-derived RNA oocyte samples were compared to Pan et al. data (Mouse oocyte data).
Figure 5 Statistically significant enriched functions of oocyte and granulosa cells. The 2 specifically expressed gene lists (oocyte/GC) were
evaluated in silico using Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Analysis revealed 3 statistically significant enriched categories (p-value < 10-3). The X
axis corresponds to the ratio between the focus genes versus the genes of the class. GC data are in blue color and oocyte data are in red color.
microdissection period required and the extraction of
only a limited amount of RNA. In this study, our modified protocol allowed us to capture the cells and to preserve the RNA integrity of the two follicular
compartments (Table 1) throughout microdissection (up
to 120 min, see Additional Data 2). First, we showed
that, as previously described in other tissues [32-35],
histological and RNA quality of the staining are tissue
specific (Figure 1) and probably depend on cell component reactions and intracellular RNAse content. The
success of capture depends on a number of tissue-slide
adhesion factors such as the type of slides used or the
method and temperature of fixation [19]. Sluka et al.
[35] found that maintaining testis tissue at a cold temperature during fixation and subsequent processing (e.g.
staining) was important to maximize preservation of tissue morphology. As recently described in mammary
gland [36], we showed in this study, that cold temperature was also important for the capture process.
Finally, our data showed that 500-600 single GCs were
sufficient to produce enough aRNA to perform both
microarray hybridization and qPCR experiments (Table
1). The decrease in the required number of oocytes captured according to the stage of follicular development is
also in agreement with an increase in the diameter of
the oocyte (34-73 μm) [23] and in their RNA content
[37-39].
Gene expression patterns
In this study, we documented nine ovine gene expression patterns in specific follicular compartments within
in vivo microenvironment (Table 2). We confirmed cell
type-specific expression in all the genes tested. As
described by Luzzy et al. [40], we identified variability
between the replicates (Figure 3) that could be associated with technical processing and/or with biological
microheterogeneity and individual variability. The
expression profiles of ovine BMP15, GDF9 MATER,
VASA and SOHLH2 oocyte-specific genes and ovine KL,
GATA4, AMH GC-specific genes are consistent with
previous reports on sheep fetal ovaries [41], germinal
vesicle (GV) oocytes [42] or other species [43-46]. In
addition, we report here an increase in the expression of
four cell type-specific genes during the early ovine
folliculogenesis.
Our data provide additional clues about species specificities. They underline differences in SOHLH2 and
MAEL gene expression patterns from those identified in
rodent species (Figure 4). The Sohlh2 gene is a spermatogenesis- and oogenesis-specific transcription factor
that was recently discovered in mouse species with a
restricted pattern of expression in oocytes of primordial
and primary ovarian follicles in immature ovaries
[47-49]. By contrast with mouse species, we observed
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constant expression of SOHLH2 until the SA stage.
Likewise, mael is a Drosophila spindle-class gene
required for Drosophila oogenesis that localizes to
nuage (nucleolus-like bodies) and is implicated in
miRNA/RNAi pathways [50]. Mael is expressed in the
early drosophila germ line [51]. In mouse, Gallardo et
al. showed that expression of Mael is high in primordial
oocytes but rapidly decreases during follicle growth to
disappear in the SA follicles [14]. We revealed that the
expression of MAEL is maintained until small antral follicles in sheep. Such SOHLH2 and MAEL expression
patterns suggest the existence of different mechanisms
as a function of species that will need further investigation. This underlines the importance of acquiring
expression data from different species and highlights
certain species specificities.
Accuracy of array data
The originality of this preliminary study was to identify
global gene expression in oocyte and GC separately for
key stages of early folliculogenesis. Several observations
support the accuracy of the expression data.
First, the level of “present” call probes from the oocyte
samples (43%) and the size of the annotated transcripts
detected (Table 3) were in accordance with mouse
oocyte data (43-47% of “present” call probes) [30] and
bovine oocyte data (54% of “present” call probes) [52].
In addition, we also identified the great majority of
genes previously found to be expressed in the four following studies: Dadé et al. [53], Arraztoa et al. [29], Pan
et al. [30] and Gallardo et al. [14] (Additional file 6). The
results of these studies mainly derived from oocytes
(mouse and monkey species). Figure 6A shows that 41%
of the oocyte genes reported in these studies were
expressed in our sheep oocyte samples. Our data on GC
during early folliculogenesis are quite unique, as even if
some information about GC expression was previously
available [14,30], it only concerned very few genes (33
genes). Figure 6B shows that 33% of these genes were
also detected in our GC data sets. These percentages take
into account the percentage of undetected genes (10 to
24%: Figure 6) which could be partly due to the relative
specificity of heterologous hybridizations and the high
percentage of missing genes (37 to 45%: genes reported
in the previous studies that were missing in the bovine
Affymetrix chip used here). This underlines the fact that
genomics of livestock animals have to face with incomplete arrays and/or incomplete genome annotations [54].
Biological significance
To confirm that these data are biologically meaningful
and a rich source for functional analysis, two lists of
compartment-specific genes were generated and subjected to Ingenuity Pathway Analysis (IPA).
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Figure 6 Accuracy of the gene data sets. Comparison of A - oocyte data sets and B - GC data sets with Arraztoa [29], Dadé [53], Gallardo [14]
and Pan [30] data sets.
This functional analysis identified the three main cellular events known to be involved in early follicle development (Figure 5) [23]. First, we observed three cellular
functions in GC ("Cell Movement”, “Cellular Assembly
and Organization”, and “Cell Morphology”) probably
associated with the first cellular event, the switch of cell
shape from flattened to cuboidal [55]. Second, the identification of genes involved in “Cellular Growth and Proliferation” and “Cell Death” is correlated with the second
cellular event: the marked increase in the number of GC
(× 40 in ovine species up to the secondary stage) [23], a
key process in the initiation and the development of primordial follicles. Finally, in oocytes, the “Axonal Guidance Signaling” pathway (Additional file 5) and the
“Cellular Development” function are consistent with the
third cellular event: oocyte enlargement. Axonal guidance signaling refers to the different receptors and signal transduction cascades that drive axons towards their
synaptic targets and finally lead to the reorganization of
the cytoskeleton and confer the adhesive properties the
cell requires for its spatial organization. This pathway
was previously mentioned in the analysis of regulatory
gene networks involved in primordial follicle development [56].
In addition, the importance of the crosstalk between
the oocyte and GC during follicular development [57,58]
may be illustrated by the expression of genes of the
BMP signaling pathway in GC in response to oocyte
BMP15 production (Additional file 7). This crosstalk
was also highlighted by the “Cell to Cell Signaling and
Interaction” function in both GC and oocytes (Figure 5)
and “Inflammatory and Immune Response” mechanisms
found in GC. These mechanisms featured the “Cytokine
Signaling” pathway, “Cellular Immune Response” pathways and the “Genetic Disorder” class (genes mainly
linked to inflammatory response mechanisms of the
colon). They include members of the TGFb gene family
such as AMH [46], and cytokines encoding genes such
as KL [4] both expressed in GC and known to interact
with oocytes and to play an essential role in early
folliculogenesis. We also identified the specific GC
expression of different interleukins such as the proinflammatory cytokine IL1-b previously reported in antral
follicles for their involvement in ovarian steroidogenesis,
in the ovulation process and in oocyte maturation
[59,60] and which are up-regulated during primordialprimary follicle transition (from rat ovary culture experiments) [61]. Interestingly, the IL1 receptor gene (IL1R)
appears to be only expressed in oocytes, which supports
the hypothesis of cytokine oocyte-GC crosstalk. However, the exact function of these genes in this context
remains to be elucidated.
Thanks to these specific gene lists, we were able to
show for the first time that expression of the SIRT7
gene is confined to the oocyte in sheep follicles (Figure
4). This gene was found to be expressed in most mouse
and human tissues including -at a lower level of expression- the ovary [62,63]. The detailed expression pattern
of the current study completes a previous rat expression
pattern comparing ovaries enriched in different follicle
populations [61]. The SIRT7 gene belongs to the sirtuin
family and is involved in the regulation of a wide range
of biological processes such as gene silencing, aging, cellular differentiation, and metabolism [64]. In human, the
colocalization of SIRT7 with Polymerase I and the
nucleolar transcription activator UBF suggest that
SIRT7 is a positive regulator of Pol I transcription [65].
Its oocyte expression is consistent with the high demand
for protein synthesis for oocyte growth. Like the basonuclin gene [66], this expression suggests a role for SIRT7
in the transcriptional regulation of sheep oocyte rDNA
that will need further experiments to verify nuclear localization. Finally, this study underlines the precise expression pattern in GC of the FST gene that plays an
important role in female fertility by regulating activin
and members of the BMP subfamily [67]. Different studies have shown induction of the FST gene expression
by recombinant human BMP15 [68] and suggested an
inhibitory action of FST on BMP15 function [69]. Its
strongly increased expression at the secondary stage in
sheep (Figure 4) combined with the BMP15 oocyteexpression pattern corroborate the results of these studies and are consistent with the BMP15 function to
enable the primary-secondary transition.
Page 10 of 15
water 2 s, 75% ethanol 30 s; 95% ethanol 30 s, diluted
eosin (1/4) 5 s (Sigma-Aldrich, ref: HT110316), 75%
ethanol 30 s, 95% ethanol 30 s, (100% ethanol 30 s) × 2,
(xylene 5 mn) × 2 (Sigma-Aldrich ref: 296325).
HistoGene™ LCM staining
Conclusions
In the present study, LCM and microarray analysis were
used as tools to identify distinct gene expression patterns in ovary cell populations and led to the identification of genes of potential significance in female fertility.
The data obtained here are in agreement with the literature regarding oocyte and GC-specific transcript lists.
We identified specific expression patterns in sheep
(SOHLH2, MAEL, SIRT7, FST). Our findings show that
the mRNA repertoire in the different cell types is regulated dynamically during the transition from primordial
to intermediate follicles.
This study is a starting point for further investigation
of the GC compartment in particular. Specific gene
expression patterns in the oocyte and GC could be of
great interest for deciphering the critical molecular processes and the complexity of the communication
between these two compartments, who enable the folliculogenesis process to occur as it is expected.
Methods
Tissue processing and staining
This study was conducted in compliance with institutional guidelines for research studies (animal experimentation authorization no 31-297, prefecture de la Haute
Garonne). Twelve lambs from Langlade INRA experimental farm (Castanet-Tolosan, France) were euthanized
at birth (< 1 day) with 3 ml of Dolethal (Vetoquinol,
ALCYON ZI, France). The ovaries were removed and
embedded in O.C.T. embedding matrix (CML, ref
KMA-0100-00A, France), frozen in liquid nitrogen and
stored at -80°C until use.
Eight-micrometer serial frozen sections were cut on a
cryostat at -20°C, mounted on cooled (4°C) sterile
microscope glass slides and stored in a 50 ml plastic
tube inside the cryostat chamber (-15°C) for few minutes [36]. The sections were fixed 30 s with 70-75%
ethanol (Fluka, Ref: 02855, Sigma-Aldrich) and stained
individually at room temperature before LCM. Four different staining protocols were compared: Toluidin blue,
Hematoxylin-Eosin (H&E), Histogene® staining solution
(Arcturus, Applied Biosystems ® ) and Cresyl Violet ® ,
LCM staining kit Ambion, Applied Biosystems®). The
sections were conserved under vacuum until LCM capture (< 1 day). The experiment was performed in
triplicates.
Hematoxylin and eosin staining
water15 s, Hematoxylin solution 5 s (Sigma-Aldrich, Ref:
MHS16), Scott water 5 s (Sigma-Aldrich, ref: S5134),
(Arcturus (Applied Biosystems ® ), ref: KIT0415) was
performed according to the manufacturer’s
recommendations.
Toluidin blue staining
Toluidin blue in alcoholic solution 1 mn (Sigma-Aldrich
ref: 31393-1G), water 15 s, (95% ethanol 30 s) × 2,
(100% ethanol 1 mn) × 2, (xylene 5 mn) × 2.
Cresyl violet staining
(Ambion Europe Ltd, LCM Staining Kit Ref AM 1935):
50% ethanol 20 s, cresyl violet 20-30 s, 50% ethanol 20
s, 75% ethanol 30 s, (95% ethanol 40 s) × 2, (100% ethanol 1 mn) × 2, (xylene 5 mn) × 2.
Staining protocols were evaluated in terms of tissue
morphology, capture success and maintenance of molecular integrity. The influence of the staining method on
RNA quality was assessed by controlling the quality of
total RNA extracted from tissue scrapes on the slide as
described in the RNA extraction section, prior to and
after fixation/staining steps using an Agilent 2100
bioanalyzer.
The capture was improved by taking slide temperature, fixation temperature and fixation duration into
account. The best capture efficiency for each section
was obtained by using a cooled slide (4°C) that was
fixed 30 sec with a ice cold 70% ethanol solution (-20°
C).
Laser capture microdissection
The follicular compartments (i.e. granulosa cells (GC))
and oocytes were selected for each follicle stage (primordial (Pd), primary (Pm) and secondary (Sec) follicles
and small antral (SA) as control) under microscope taking the observation of section series into account and
according to the classification by Lundy et al [23].
Briefly, the following criteria for the follicle stage selection were applied: i) primordial follicles (Pd) were
defined as an oocyte surrounded by 2-3 of flattened GC
and no cuboidal GC, ii) primary follicles (Pm) were
defined by a monolayer of cuboidal GC whatever the
oocyte size, iii) secondary follicles (SEC) were defined by
two layers of GC and iv) small antral follicles (SA) had a
diameter less than 500 μm diameter. Dissections were
carried out under 40× magnification microscopic visualization using the VERITAS™ and ARCTURUS XT apparatus (Arcturus, Applied Biosystems®). For the capture,
the laser pulse was carefully adjusted for each section,
so as to touch only the oocyte or the GC (laser length:
40-60 mw, duration: 10-20 ms). Taking care to not collect possibly atretic follicles (pycnotic oocytes or
fragmented nuclei, shredded ooplasm or disintegrated
follicular structures), we were able to identify and collect
into separate CapSure™ HS LCM caps (Arcturus, Ref
LCM 0214) oocytes and GC for the different follicular
stages. After two hours of microdissection, the cap was
removed, treated with 10-15 μl of extraction buffer from
Picopure RNA Isolation kit (Arcturus, ref: KIT0202) and
stored at -80°C until use.
RNA extraction
Total RNA from pooled section scrapes corresponding
to each cap was prepared by pipeting 50 μL of extraction buffer (Picopure RNA Isolation kit) directly onto
the tissue section on the glass slide, using the pipette tip
to gently scrape the tissue into the buffer Samples were
then transferred into an RNase-free microcentrifuge
tube and stored at -80°C. Total RNA was extracted
using the PicoPure RNA Isolation Kit according to the
manufacturer’s protocol, including on-column DNase
treatment (Qiagen, ref 79254, Courtaboeuf, France). The
quality of the RNA was assessed using an Agilent 2100
bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) with
an RNA6000 Pico Lab Chip and analyzed by the RNA
Integrity Number (RIN) algorithm [70].
For LCM-derived samples, as only very few cells were
captured per cap, the caps were pooled before total
RNA extraction, according to the quality of the total
RNA extracted from their corresponding sections
scrapes. Finally, each LCM-derived RNA sample (pool
of 2 to 20 caps coming from 1 to 4 animals) was performed in triplicate/quadruplets.
T7 linear amplification
To generate sufficient RNA quantities for Genome-wide
microarray analysis, LCM-derived RNA samples were
subjected to 2 rounds of T7 linear amplification: aRNA
was generated using RiboAmp® HS PLUS kit (Arcturus,
ref KIT0525), following the manufacturer’s protocol.
This protocol specified that a minimum input of 100500 picograms of total RNA are required for successful
amplification with this kit designed specifically for lowinput total RNA samples, which is equivalent to 10-50
cells. The RiboAmp HS process has been already validated for generating highly reproducible microarray
data, and the gene expression profiles obtained using
this method have shown high fidelity when compared
with profiles generated from unamplified samples [40].
After in vitro transcription, the optical density of antisense RNA (aRNA) was measured at 260 and 280 nm.
The yield and the size distribution of each aRNA sample
were evaluated using the Agilent Bioanalyzer 2100 with
a RNA 6000 Nano Lab Chip. In complement, four B.
Subtilis control transcripts (Affymetrix, GeneChip
Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit, ref 900433) were
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added to each LCM-derived RNA sample before amplification. Based on the average of 500 pg of starting RNA
(about 50 whole cells) the following serial dilutions were
used: 1:20, 1:50, 1:50, 1:10, 1:20 and 1 μl of the final
dilution 1:5 was added per RNA sample.
Microarray experiments
Ovine microarray experiments were performed using the
Affymetrix Bovine Expression Array (representing
approximately 23,000 transcripts). The quality of the
cross-species hybridizations was checked by comparison
of hybridization data of ovine fetal ovary RNA with
bovine fetal ovary RNA, generated with the standard
protocol (one Affymetrix round amplification).
Three biotin-labeling protocols were compared from
ovine fetal ovary total RNA:
- Protocol 1: 3 μg of total RNA were labeled according
to the standard Affymetrix protocol (one round of
amplification [71,72]).
- Protocol 2: total RNA was subject to two-rounds of
amplification using the RiboAmp ® HS PLUS kit until
the second-round cDNA synthesis. Biotin-labeled
cRNAs were synthesized following the Affymetrix protocol using the second-round cDNAs as templates (440
ng/8 μl).
- Protocol 3: total RNA was subject to two round of
amplification using the the RiboAmp® HS PLUS kit. Fifteen micrograms of aRNA were labeled using the Arcturus biotin turbo™ labeling kit (Arcturus, ref KIT0608)
[34].
Finally, one LCM-derived aRNA sample from each
condition coming from pools of different animals (Primordial, Secondary stages: 2 animals and Primary stage:
4 animals) was labeled using the Arcturus biotin
turbo™ labeling kit (protocol 3).
In accordance with the Affymetrix technical manual,
10 μg of cRNA was purified, fragmented and hybridized
at the concentration of 40 ng cRNA/μl hybridization
mix to Affymetrix Bovine Expression Arrays, in the
Microarray Core Facility of the Institute of Research of
Biotherapy, CHRU-INSERM-UM1 Montpellier.
Data management
All microarray CEL files from this study comply with
MIAME standards. They have been deposited in GEO
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo), accession number
GSE25652, using the BASE software adapted by SIGENAE
bioinformatics platform (http://www.sigenae.org).
Microarray data analysis
Signal intensities and detection call of probe sets from
each hybridized genechip were extracted using the Affymetrix software microarray suite 5 (MAS 5), using the
default parameters.
In LCM-derived aRNA sample hybridizations, all
probe sets called “absent” on all chips in the image
interpretation were filtered out. Because the experimental design did not include technical or biological replicates we applied a stringent filter to the probe sets
detected. For the transcripts, with different probe sets
called as “present”, we selected the most in 3’ UTR of
the gene and taking into account the probe set repetitions. Indeed, for half of the genes, the Affymetrix GeneChip system contains more than one probe sets,
providing a high number of repeated experiments within
a single chip for hybridization validation. However, the
discordant probe set signals within a transcript may be
the result of the ovine on bovine heterologous hybridization. Finally, only transcripts with a signal in all their
probe set replicates were considered as ‘’detected”.
The integrity of the RNA and the quality of hybridizations were evaluated using three measures of GeneChip
performance provided by the Affymetrix algorithm: the
number of “present” calls, the Scale Factor and and the
3’/5’ signal ratio. The number of “present” calls and the
Scale Factor (multiplier used to normalize the whole
chip to a target intensity of 100; inversely related to
chip brightness) are sensitive to RNA sampling, labeling,
scanning and data extraction. The 3’/5’ signal ratio is
designed to detect the 3’ and 5’ regions of the mRNA;
the 3’/middle ratio refers to the mRNA transcript from
3’ to the middle of the mRNA transcript. These values
provide information about the quality and the integrity
of the RNA.
Probe set annotations and biological network analysis
Primary annotation of probe set sequences were
obtained from the NetAffx Analysis Center. Probe set
sequences were also compared with Human and Bos
Taurus refseq_rna NCBI databases by BLAST to confirm and complete Affymetrix annotations (performed
by Sigenae team). Transcripts were then discussed by
gene name (HUGO gene symbols).
Ingenuity ® Pathway Analysis software (IPA; http://
www.ingenuity.com) was used to examine biological
functions and molecular pathways. This software combines functional annotations of our selected genes (focus
genes) and the corresponding bibliographic data to generate significant canonical pathways and biological
networks.
Biological analysis was focused on the two lists of
genes specifically expressed in oocytes or in GC. The
Bovine Genome Array was used as set reference. A
threshold network score of 18 corresponding to the
highest score obtained with the gene set reference was
applied to select the highest significant networks for
further analysis. Then, these selected networks were
explored to identify statistically significant functional
Page 12 of 15
categories (p-value < 10-3) and canonical pathways (pvalue < 5 10-2).
Quantitative RT-PCR
Gene primer designs were performed from ovine
mRNA, ovine EST or ISGC Data sequences (https://
isgcdata.agresearch.co.nz/). Gene primers were designed
in the 3’ UTR in the first 1000 base pairs using LightCycler Probe Design2 software (Roche Diagnostics). The
intron-exon organization of ovine genes was deduced by
comparison with the Human genome using the Iccare
software [73]. The primer pairs were confirmed by Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Sequences are
available in Additional file 8.
The LCM-derived aRNA samples were reverse transcribed in a reaction volume of 20 μL combining 500
nanogram of aRNA, 250 nanogram of random hexamers
(Promega, ref: C1181, Charbonnieres, France), 200 mM
dNTP, 10 mM DTT, 4 μl of 5× SuperScript II FirstStrand Buffer, 40 U RNase inhibitor (Promega, Ref:
N2111), and 200 U of SuperScript II (Invitrogen, ref:
18064-014, Cergy Pontoise, France). The reaction was
incubated according to the manufacturer’s protocol. The
reactions were completed to 50 μl and diluted at 1/12.5
before PCR. The assay for each gene consisted of 4-5
replicates per condition (except for SA = 2) and negative
controls.
The ovine fetal ovary total RNA sample was reverse
transcribed using Primer p(dT)15 for cDNA synthesis
(Roche Diagnostic, ref 10814270001, Meylan, France)
according to the manufacturer’s protocol.
QPCR was performed from 3 μl of the final dilution
using SYBR green fluorescence detection during amplification on an ABI Prism 7900 Sequence Detection System 2.1 (Applied Biosystems ®) as previously described
[74]. The real-time PCR amplification efficiency was calculated for each primer pair using six serial dilution
points from the ovine fetal ovary cDNA sample (1:9; 1:3;
1:3; 1:3; 1:2; 1:2). After determination of the threshold
cycle (Ct) for each LCM-derived aRNA sample, the
PFAFFL method was applied to calculate the relative
expression of each gene [75] using the 1:120 ovine fetal
ovary cDNA dilution as calibrator sample.
The relative expression was normalized by the corresponding geometric average of two reference genes
using geNorm v3.4 [76]: b-actin gene that was slightly
expressed in our micro-array experiment and RPL19
gene that was found to be highly expressed and not
regulated during follicle development.
The significance of the relative expression data was
tested using the one-way ANOVA models of R statistical software system (the Comprehensive R Archive
National, http://www.cran.r-project.org). Models on raw
data outlined a clear violation of the hypothesis of
variance homogeneity. Therefore data were log transformed. No departure from model hypotheses was
found in that case. For each gene, an ANOVA model
was fitted, with the 2 factors “stage” (4 levels) and “compartment” (2 levels) with interactions. A backward variable selection procedure was applied for each gene, to
decide whether the 2 factors have significant effects on
the expression of the considered gene, that is: interaction effects, additive effects, “compartment” effect only,
“stage” effect only or not differentially expressed. For
that purpose, F tests were applied (lm and ANOVA
functions in R).
Additional material
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Additional file 8: Primer sequence (5’3’) for real-time PCR.
Acknowledgements
We thank the Langlade INRA experimental farm that provided the lambs.
Affymetrix microarrays were processed in the Microarray Core Facility of the
Institute of Research of Biotherapy, CHRU-INSERM-UM1 Montpellier, http://
irb.chu-montpellier.fr/ We thank our colleagues at the genomic and Biochips
platforms Toulouse Genopole (http://genomique.genotoul.fr/, and http://
biopuce.insa-toulouse.fr/) for their help on this work.
We thank A. Vignal for english revision.
Affymetrix annotations and GEO submission were processed by Sigenae
team (http://www.sigenae.org/).
This work was supported by a grant of the ANR “GENANIMAL édition 2007”
program.
Author details
INRA, UMR444 Génétique Cellulaire, Auzeville, BP52627, F-31326 CastanetTolosan, France. 2INRA, UMR1313 Génétique Animale et Biologie Intégrative,
Plateforme de Microgénomique expressionnelle ICE, F-78350 Jouy-en-Josas,
France. 3INRA, UR631 Station d’Amélioration Génétique des Animaux
BP52627, F-31326 Castanet-Tolosan, France. 4INRA, UMR1198 Biologie du
Développement et de la Reproduction, F-78350 Jouy-en-Josas, France.
1
Additional file 1: RNA integrity along LCM. Influence of the fixation
step and microdissection time on RNA quality. Y axis: the quality of total
RNA extracted from each staining section was checked using an Agilent
2100 bioanalyzer. X axis: time required for microdissection of each
section. The pink line corresponds to RIN from a staining section fixed
with 70% ethanol. The blue line corresponds to RIN from a staining
section fixed with 75% ethanol.
Additional file 2: Quality control of labeled aRNA integrity. One
microliter of labeled or unlabeled primordial granulosa cell aRNA was
analyzed on an RNA LabChip and Agilent Bioanalyser. A: unlabeled aRNA.
B: aRNA labeled with the Turbo labeling Kit (biotin).
Additional file 3: Microarray performance. Comparison of methods
used to generate biotinylated cRNA (see material and methods) using
quality control measures: % “present call” probe sets is the percentage of
scored probe sets detected by the Affymetrix Microarray suite 5.0
(MAS.5.0) Scale Factor is the multiplier used to adjust the trimmed mean
signal of a probe array to a selected target signal value (100 by default).
3’/5’ ratio is the ratio of the 3’ probe set signal intensity to the 5’ probe
set signal intensity of a transcript. 3’/M ratio is the ratio of the 3’ probe
set signal intensity to the Medium (M) probe set signal intensity of a
transcript.
Additional file 4: Functional networks for compartment-specifically
expressed genes (oocyte and GC).
Additional file 5: Canonical pathways of ocyte and granulosa cells.
Ten statistically significant enriched canonical pathway categories (pvalue < 5 10-2) were revealed in the specific oocyte and granulosa cell
gene lists. The X axis corresponds to the ratio of focus genes to pathway
genes. Red and blue numbers correspond to the number of focus genes
that contributed to the pathway (oocyte vs GC).
Additional file 6: Comparison of gene data sets with the literature.
Literature data: 1 - Dadé: Differentially expressed genes in mouse oocytes
compared to other tissues. The selection was performed by in silico
differential display between 3 mouse oocyte cDNA libraries and 13
selected tissues cDNA libraries. 2 - Gallardo: set of ovarian factor from
mouse Foxo3 ovaries. Gene classes were revealed by comparative
profiling from Mouse RNA affymetrix hybridization data sets including
ovary RNA extracted at four time points spanning follicle assembly and
early growth, and 14 somatic tissues containing LCM primary oocytes
and LCM somatic cells. 3 - Pan: Mouse oocyte differentially genes
expressed between primordial and primary follicular stages. Overall
change in oocyte gene expression was characterized using Pd, Pm, Sec,
SA and antral mouse follicles. 4 - Arraztoa: Primate oocyte-enriched
transcripts between microdissected primordial stage and placenta RNA
(control).
Additional file 7: BMP signaling pathway: an example of
compartment crosstalk. From the microarray data, we visualize the
focus genes involved in the BMP signaling pathway. The genes
specifically expressed in the oocytes are in red color and the genes
specifically expressed in GC are in green color.
Authors’ contributions
AB conceived and designed the study, performed LCM experiments,
analyzed the microarray data, carried out the RT-PCR and statistical analyses,
and was responsible for much of the writing. FB and JS participated in
obtaining embedded ovary and staining sections. MS, helped in the
statistical analyses. ET, CB and PM contributed to the development of the
LCM protocol. LB provided the animals. LB, CB, CC, LL, PM, MS, GTK and BMP
contributed to the conception and design of the study, and were involved
in the drafting and revising the manuscript. All authors read and approved
the final version of the manuscript.
Received: 14 February 2011 Accepted: 18 August 2011
Published: 18 August 2011
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doi:10.1186/1471-2164-12-417
Cite this article as: Bonnet et al.: Transcriptome profiling of sheep
granulosa cells and oocytes during early follicular development
obtained by Laser Capture Microdissection. BMC Genomics 2011
12:417.
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Annexes de l’article 1
.
nnexes de l’article 1
Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and ooc tes during earl follicular
development obtained b
aser Capture
icrodissection
dditional file 1
integrit along C
Influence of the fixation step and microdissection time on RNA quality.
Y axis: the quality of total RNA extracted from each staining section was checked using an
Agilent 2100 bioanalyzer.
X axis: time required for microdissection of each section
The pink line corresponds to RIN from a staining section fixed with 70% ethanol.
The blue line corresponds to RIN from a staining section fixed with 75% ethanol.
dditional file
ualit control of labeled a
integrit
One microliter of labeled or unlabeled primordial granulosa cell aRNA was analyzed on an
RNA LabChip and Agilent Bioanalyser.
: unlabeled aRNA
: aRNA labeled with the Turbo labeling Kit (biotin)
70
%Hybridized
Probesets
"presentcall"
Scale GAPDH GAPDH
factor 3'/5'ratio 3'/Mratio
GST GST
3'/5'
3'/M
ratio
ratio
Samples
Protocol
Bovinegonad
Protocol
1
57.1
3.79
1.17
1.13
0.53
0.96
Ovinegonad
Protocol
1
49.8
3.42
1.19
0.8
0.08
0.5
Ovinegonad
Protocol
2
38.6
5.1
67.67
10.76
1.49
2.86
Ovinegonad
Protocol
3
37.8
6.53
112.08
14.98
1.14
1.54
PDO
Protocol
3
34.13
3.00
20.82
13.84
2.54
4.45
PMO
Protocol
3
29.39
4.87
19.66
19.84
1.08
2.03
SECO
Protocol
3
31.96
4.59
Na
25.19
2.23
Na
PDG
Protocol
3
36.52
2.36
10.58
13.89
0.5
1.42
PMG
Protocol
3
30.12
4.83
31.25
21.08
4.5
5.03
SECG
Protocol
3
35.41
3.03
23.85
18.55
1.57
2.68
dditional file 3
icroarra performance
Comparison of methods used to generate biotinylated cRNA (see material and methods) using
quality control measures:
% “present call” probe sets is the percentage of scored probe sets detected by the Affymetrix
Microarray suite 5.0 (MAS.5.0)
Scale Factor is the multiplier used to adjust the trimmed mean signal of a probe array to a
selected target signal value (100 by default).
3’/5’ ratio is the ratio of the 3’ probe set signal intensity to the 5’ probe set signal intensity of
a transcript.
3’/M ratio is the ratio of the 3’ probe set signal intensity to the Medium (M) probe set signal
intensity of a transcript.
Annexes de l’article I
ID
1
2
Analysis
Molecules in Network
ADORA2B, ADRA1B, ALB, AMBP, APOA1, BMP1,
C4ORF41, CCDC88C, CCL3, CCR1, CHEMOKINE,
CHRM4, CLCA2 (includes EG:9635), CXCL10, DNTT,
FST, Gpcr, GPLD1, IGHG1, IRF3, ITIH5, KRT7,
Granulosa
LGMN, MAP7D1, P2RY4, PDZRN4, peptidase, Pld,
PLD4, PROC, SCN5A, STX1B, STXBP1, SYT7,
TPP1
Granulosa
ACTA1, Actin, ANXA13, AP4M1, CNN1, CSN1S1
(includes EG:1446), DCTN6, DNAJC13, DVL1,
FCER1A, Filamin, FLNB, GPR37, HECW1, Hsp70,
Ige, INPPL1, IPP, KLHL2, LALBA, MYRIP, NCALD,
OSBP, PACRG, Pak, PAK6, PFN1, PLEC1, PPM1E,
Profilin, ROCK1, SMG5, TFRC, VIPR1, XPO6
3
BCAS3, BCL9, C21ORF33, Cbp/p300, CD8A,
CHRNA3, CISH, Creb, CREB5, Cyclin A, DAB2IP,
DNMT3B, E4F1, EPO, ERAF, G6PD, HIRIP3, Histone
h3, Histone h4, HMGA2, IL15, MPZ, MRAS, NCF1,
Granulosa
NDUFA3, NDUFB5, OPN1LW (includes EG:5956),
PER2, Ras, RASSF1, RIN1, SATB1, SHOC2, SMC4,
TBL1X
4
ADIPOQ, AQP7, CCL22, CD80, CD3EAP, CIITA,
DGAT1, DNA-directed RNA polymerase, HSPA1A,
IKBKAP, IL1, IL8, IL-1R, IL1A, IL1B, IL1RAP, NFKB2,
NFkB (complex), NFKBIA, PDE8A, PDZK1, PMM1,
POLR1A, POLR2L (includes EG:5441), POLR3K,
Granulosa
PPARG, PRMT2, Pro-inflammatory Cytokine, RELB,
RNA polymerase II, SWI-SNF, TAF1A, TCERG1,
TNNT1, ZBTB7A
5
ACIN1, ADAM2, ADAM8, ADAM17, Akt, ATPase,
CARD11, CD53, CSK, DCK, DDX19B, DLG1,
ERCC3, FZD4, GRB10, GRID2, INSR, Integrin,
KITLG, MAD2L1, Metalloprotease, MIR1, MYLK2, NP,
Granulosa
Phosphorylase, PREX1, RUVBL2, SHANK2, SYT17,
TAOK3, Transferase, TSC1, TSC22D4, TSPAN4,
UBD
6
Granulosa
ABL1, AKAP13, ATN1, ATXN7, BAG1, BCAR3,
ENOX1, Estrogen Receptor, CGn5l, GIT1, GM2A,
HEXA, ITGB3BP, LIFR, LSS, LYZ, MAX, N-cor,
NEDD9, NR1H3, OSMR, PIP4K2A, POU1F1,
PPARCG1B, Proteasome, PSMB10, Rb, RCC1
(includes EG:1104), Rxr, SETD7, STAM, TAF6,
TOM1, tyrosine kinase, Ubiquitin
Score
41
38
38
36
36
34
Focus
Molecul
es
Top Functions
31
Infection
Mechanism,
Cardiovascular
Disease,
Tachycardia
29
Tissue
Development,
Cellular Assembly
and Organization,
Cellular
Compromise
29
Cell Cycle, CellTo-Cell Signaling
and Interaction,
Cellular Growth
and Proliferation
28
Gene Expression,
Lipid Metabolism,
Molecular
Transport
28
Cardiac Output,
Cardiovascular
System
Development and
Function, Cell
Cycle
27
Genetic Disorder,
Metabolic
Disease,
Neurological
Disease
7
8
9
10
1
2
3
Granulosa
C1q, CD34, CD36, CD93, COL18A1, Collagen type I,
Collagen(s), Complement component 1, CTSS,
ERP44, FCGBP, FLI1, FMOD, GLYCAM1, HAPLN1,
HSD11B1, IgG, IL2, IL18, IL12 (complex), IL12B,
ITGB6, NCAN, PRRX1, PTX3, SELP, SERPING1,
SRGN, Tgf beta, TGM2, TH1 CYTOKINE, Thyroid
hormone receptor, TNC, TNFAIP6, ZNF384
14-3-3, Alcohol group acceptor phosphotransferase,
ATYPICAL PROTEIN KINASE C, Calmodulin, CDK5,
DKC1, DUSP26, EIF2AK2, ERCC6L, ERK, G6PC,
GRK4, Hsp90, HSPB6, Ikk (family), IQGAP1, IRAK1,
Granulosa
KIF3A, KSR1, LLGL1, LYPLA2, MAP2K2, MAP2K5,
MAP3K6, MAPK3, Mek, NEFM, Par6, PARD6B,
PIM1, PLK1, PRKAA1, PRKCI, Rac, RGN
Granulosa
Granulosa
ATP6V0C, CES5, CES2 (includes EG:8824),
ELMO1, ELMOD2, HADHB, HDAC8, HNF4A, HPX,
IFRD2, KIF3B, MIR124-1, MLKL, NUAK1, OSBP,
PARP4, PARP16, PBX2, PGM1, PIGS, PNPLA6,
PODXL, PROP1, RHOG, ROCK1, S100A9,
SLC17A5, SLC39A7, SSFA2, STIM1, SULT1A1,
TBC1D15, TCIRG1, TLE3, USP2
C3ORF34, C8ORF41, CCDC82, CEBPB, DLG4,
E2F4, GUF1, HNF4A, ISOC1, L2HGDH, MRTO4,
MSRB2, NUDT11, ONECUT1, ORMDL1, SEPX1,
SGSH, SH3BGRL2, TMEM176A, TRAF6, TRMT6,
VHL, ZNF146
Oocyte
14-3-3, AFP, Akt, AKT1S1, BAG2, BMP15,
C5ORF22, CA9, CTNNAL1, DCC, DYRK1B, E2f,
E2F1, ELOF1, FOXA1, GDF9, Histone h3, HN1,
IL1R1, MLXIP, MTUS1, MYB (includes EG:4602),
NEK1, NFKB1, NFKBIL2, NR5A2, P38 MAPK, PI3,
PRLR, RHOBTB2, SKA2, THAP7, TRIB3, TSC2,
ZNF350
Oocyte
Ap1, APOB, ARG1, ATF3, BATF, CAMP, CEBPG,
CNKSR1, Creb, CREB1, Cyclin A, DBT, DNER,
DUSP10, EIF2S2, FANCC, FEN1, GIPC2, GTF2H3,
Hsp70, Jnk, MAFK, MAPK10, NFkB (complex),
QTRT1, Ras, Ras homolog, RHOG, RHOT2, RHPN1,
RNASEH2A, RPA2, SEMA4B, TNFRSF4, UNC119
Oocyte
Actin, Alpha tubulin, ATPase, CNP, COTL1, CRLF3
(includes EG:51379), DMAP1, DNASE1, DPYSL2,
EPN2, F Actin, FHIT, GDA, MIR124, MYH1, MYH8,
MYH9, Myosin, OCLN, Pak, PAK4, PFDN4, PHLDA1,
PTBP1, PXN, Rac, RASGRP2, SLC15A4, SNRPA,
STMN4, TBCD, Tubulin, VPS4B, WASF2, WBP4
32
30
21
19
45
38
36
26
Cell-To-Cell
Signaling and
Interaction, Tissue
Development,
Carbohydrate
Metabolism
25
Amino Acid
Metabolism, PostTranslational
Modification,
Small Molecule
Biochemistry
20
Carbohydrate
Metabolism, Cell
Death,
Developmental
Disorder
16
PostTranslational
Modification,
Gene Expression,
Cellular
Development
30
Cell-To-Cell
Signaling and
Interaction,
Reproductive
System
Development and
Function, Tissue
Development
27
Organismal
Development,
Gene Expression,
Cell Morphology
26
Cellular
Movement,
Nervous System
Development and
Function, Cellular
Assembly and
Organization
4
5
6
7
Oocyte
Calmodulin, CENPE, CENPF, CPNE2, CSNK1G2,
CYP26A1, CYP4F2, DIO1, DRD5, DSP, EID1,
Estrogen Receptor, GNA12, HEY1, Histone h4,
Hsp90, MTA1, PCNT, Phosphoinositide
phospholipase C, PLC, PLCB3, PLCD1, PLCZ1,
PPP5C, Rar, Rb, RUNX2, Rxr, RYR1 (includes
EG:6261), SLC9A1, SNAPC3, SOST, TRIM24,
UBAC1, UBR4
Oocyte
ACTN3, Alpha Actinin, CD37, CD82, COL10A1,
Collagen type I, Collagen(s), CSPG4, FGB,
Fibrinogen, ICAM1, IGF2, IGFBP5, Integrin, Integrin
alpha 3 beta 1, Integrin alpha 4 beta 1, Integrin,
ITGA3, ITGB2, LAMA3, Laminin, LGALS3, LMO7,
LTBR, MHC Class II, Mmp, MMP13, MMP19,
MMP23B, MYPN, PDLIM2, PLG, SERPINC1,
XPNPEP2, ZYX
Oocyte
ACP1, BCR, BLNK, CD3, CD8, CD38, CD79B,
CD8B, CUL4A, DDB2, IFN ALPHA RECEPTOR, Igm,
KLRA1 (includes EG:10748), LAT, LCK, MED15,
MHC Class I (complex), MHC CLASS I (family), NCK,
PRUNE, PTPN6, PTPN22, RBBP5, RNA polymerase
II, SLA2 (includes EG:84174), SLC27A2, SLC9A8,
Sos, SYK/ZAP, TCR, TNNT2, TRIM11, VAV, XAB2,
ZAP70
Oocyte
ATG9A, BAT4, C6ORF165, C6ORF170, CCDC49,
CCDC85B, CEBPZ, CHCHD3, ETV6, ETV7,
FAM164C, FAM50B (includes EG:26240), FBXL6,
FBXL7, FBXO32, HNF4A, HNRNPC, IPO13, KDM2B,
KIAA1045, L3MBTL, MIR293, NFYB, PLXNC1,
PRRG2, RBM41, SFRS17A, SKP1, SLC25A28,
SLC39A8, STAT4, TLE6, TM7SF3, ZNF524, ZNF764
dditional file
35
30
26
20
26
Cell Morphology,
Skeletal and
Muscular System
Development and
Function, Cell-ToCell Signaling and
Interaction
24
Cell-To-Cell
Signaling and
Interaction, Tissue
Development,
Cellular
Movement
22
Cellular
Development,
Hematological
System
Development and
Function,
Hematopoiesis
18
Gene Expression,
Cell Cycle,
Cellular
Movement
Functional net or s for compartment specificall expressed genes
ooc te and C
dditional file
Canonical path a s of oc te and granulosa cells
Ten statistically significant enriched canonical pathway categories (p-value<5 10-2) were
revealed in the specific oocyte and granulosa cell gene lists.
The X axis corresponds to the ratio of focus genes to pathway genes.
Red and blue numbers correspond to the number of focus genes that contributed to the
pathway (oocyte vs GC).
References
adé ( )
Species
Mouse
Compartment
oocyte
Data
Identified
gene
number
Bovine
Affymetrix
chip
Our data set
resent
gene
number
etected
gene
number
ocyte
detected
gene
number
enriched by In
silico DD
104
69
60
57
Class IA-follicle
assembly/meiosis
32
8
6
6
Class IC-oocytespecific, early
maturation only
14
3
3
3
Class IB-oocytespecific, early, and
late maturation
66
12
9
7
Class III-Unfertized
egg
84
50
37
31
Class ID-follicle
growth, somatic
24
12
8
increase
197
116
89
80
decrease
213
135
120
109
somatic cells
9
9
5
enriched/placenta
79
44
36
ranulosa
detected
gene
number
oocyte
allardo (2)
Mouse
somatic cells
6
oocyte PD/PM
an ( )
Arra toa ( )
Mouse
Monkey
oocyte PD
5
31
dditional file Comparison of gene data sets ith the literature
Literature data:
Dadé: Differentially expressed genes in mouse oocytes compared to other tissues.
The selection was performed by in silico differential display between 3 mouse oocyte cDNA
libraries and 13 selected tissues cDNA libraries.
Gallardo: set of ovarian factor from mouse Foxo3 ovaries.
Gene classes were revealed by comparative profiling from Mouse RNA affymetrix
hybridization data sets including ovary RNA extracted at four time points spanning follicle
assembly and early growth, and 14 somatic tissues containing LCM primary oocytes and
LCM somatic cells.
3- Pan: Mouse oocyte differentially genes expressed between primordial and primary
follicular stages.
Overall change in oocyte gene expression was characterized using Pd, Pm, Sec, SA and antral
mouse follicles.
4- Arraztoa: Primate oocyte-enriched transcripts between microdissected primordial stage and
placenta RNA (control).
dditional file
signaling path a
an example of compartment crosstal
From the microarray data, we visualize the focus genes involved in the BMP signaling
pathway.
The genes specifically expressed in the oocytes are in red color and the genes specifically
expressed in GC are in green color.
gene
Reference
Up primer
Down primer
GDF9
NM_001142888.1
CAACACTGTTCGCGTCTTCA
CACGAGATCCACTGATGGAA
BMP15
AF236078S2
CATGATGGCGCTGAAAGTAA
C
CCCGAGGACATACTCCCTTA
MATER
AY721594
CGTGGAGCGGTGTGGACTG
GGTCTGTAGATTAGAGGTGGGATCG
MAEL
CU653136
CAAACACACCCACTGGTGAC
GTATCCGTGTTTTGGGGATG
SOHLH2
CU638088
ACACGACACCCCAACTGTCT
GCGACCCAATAGGTGGTCTA
VASA
AF541971
CGAGGCGTGGATATTGAAAA
TCGCAGTATTTCCACCACGA
SIRT7
EE831540
TCGACGTCCTCATGGAT
ACTATGCGTCGCTTCTT
AMH
EV97COZ06DJDPJ
*
CCTCAGTCGGACCCGAA
TTCGCTGTGTAGCGTGT
FST
M63123
TCCAGCGACGTCTACAT
GGGTAGGTCACTCCATCA
GATA 4
XM_616466.4
CCCGGAGGTACGAGAGTTAT
TGTGGGTTAGGGAAGGGTAT
KITLG
EWZ7IHI02DESHV
*
CACAGGATAACTTTGAGTCG
TGTGTATGTGTATGTACTGTAAGTGT
ACTINE NM_001009784
CCACGACGATGAAGATCAAG
ACATCTCGTGGAAGGTGGAC
RPL19
AY158223
CACAACGTGAAGCGAGACAA
TGATGATTTCCTCCTTCTTGG
* available at https://isCGdata.agresearch.co.nz/
dditional file
rimer sequence
’3’ for real time C
Chapitre II. Description des transcriptomes dans chacun des deux compartiments ovariens :
spécificités fonctionnelles et dialogue moléculaire.
Chapitre II. Description des transcriptomes dans
chacun des deux compartiments ovariens :
Le développement rapide des technologies de séquençage haut débit, RNA-seq, nous permet
actuellement d’avoir accès à l’ensemble des transcrits exprimés dans nos deux compartiments
d'intérêt et fournit une analyse plus globale et exhaustive de l’expression des gènes. Le
couplage des deux technologies : LCM et séquençage haut débit, est encore peu répandu mais
a démontré son efficacité à partir d'échantillons de maïs pour :
- isoler des transcrits rares ou spécifiques d’un type cellulaire (Emrich et al. 2007),
- décrire précisément la progression dynamique du transcriptome de la feuille de maïs
en y incluant par exemple la composante "types cellulaires" (Li et al. 2010).
Ces technologies ont également été utilisées chez d’autres végétaux, comme la tomate (Matas
et al. 2011) ou Arabidopsis thaliana (Schmid et al. 2012a), le champignon Sordaria
macroscopa (Teichert et al. 2012b) ou les mammifères (neurones de rat) (Chen et al. 2011).
L’objectif ici est de décrire les transcriptomes des deux types cellulaires principaux de
l’ovaire (CG et O) pendant la phase basale de la folliculogenèse, d’identifier leur spécificité
d’expression, leur spécificité fonctionnelle et enfin de mettre en évidence un dialogue
moléculaire entre ces deux compartiments.
Les résultats obtenus ont été publiés en décembre 2013 dans BMC Genomics (Bonnet et al.
2013).
“An overview of gene expression dynamics during early ovarian
folliculogenesis: Specificity of follicular compartments and bi-directional
dialog”
71
Figure 36. Synthèse du nombre de séquences obtenues par échantillon.
Stratégie d’assemblage
Génomique
de novo
381 600
252 630
Nombre de gènes identifiés
18015
16310
% de gènes en communs
80,5
89
% de lectures annotées
42.1
33.7
Nombre de contigs/fragments
> 20 lectures
Tableau 12. Bilan des résultats obtenus avec les deux techniques d’assemblage.
Résultats
1.
Résultats
1.1
Résultatsduséquençage
Trois à quatre répliques par échantillon ont été analysées par la technique de RNA-seq. Nous
avons obtenu 2,65 milliard de séquences réparties sur l’ensemble des échantillons, soit une
moyenne de 36 millions de paires de séquences pour les échantillons microdisséqués (8
conditions) et 48 millions de paires de séquences pour les échantillons multi-tissus (Figure
36).
1.2
Assemblage
Deux types d’assemblage ont été évalués.
L’assemblage de toutes les lectures sur le génome de référence ovin a généré une banque de
381 600 fragments de séquence génomique. L’assemblage de novo a généré 91 378 contigs et
185 845 séquences non assemblées (séquences uniques). Le tableau 12 synthétise les résultats
obtenus par les deux assemblages.
L’assemblage sur séquence génomique permet d'accroïtre l’annotation des lectures et le
nombre de gènes identifiés (+ 10% / assemblage de novo).
L’assemblage de novo permet d’annoter des lectures et d’identifier des gènes, dont la
séquence n’est pas présente dans la version du génome ovin au moment de l’analyse (version
V2), par comparaison avec d’autres espèces (bovin, humain).
Nous avons donc choisi d’utiliser les résultats de l’assemblage sur la séquence génomique que
nous avons complété avec les contigs des gènes seulement présents dans l’assemblage de
novo, soit un total de 382 933 fragments de séquence (381 600 fragments de séquence
génomique et 1 333 contigs). La taille médiane des séquences obtenues est de 440 paires de
bases. Ces FS (fragment de séquence) regroupent 47,5% des lectures totales des échantillons
microdisséqués. 221 716 FS restent non annotés. Ces résultats sont résumés dans l’article 2,
Figure 1.
Le résultat de l’assemblage et de l’annotation montre que la distribution de lectures le long
des gènes est centrée sur les régions 3’UTR. Un exemple de distribution est donné en Annexe
1, Figure S7 avec le gène ZP4. Ce biais de distribution des lectures en 3’ UTR est attendu et
est la conséquence de l’amplification de l’ARN qui a suivi la LCM (Schmid et al. 2012a;
Teichert et al. 2012b). 86,8% des lectures annotées sont localisées dans la région comprenant
le codon stop ou la région 3’UTR et 6,5% sont localisées dans les introns (Article 2, Figure
1).
72
Résultats
Comme mentionné par différents auteurs (Ameur et al. 2011) (Teichert et al. 2012b), la
présence de séquences introniques pourrait correspondre à des transcrits non matures ou des
transcrits alternatifs. Finalement, chaque gène est représenté par une moyenne de 8 fragments
de séquence (FS) (Annexe 1, Figures 7-8). En conséquence, pour quantifier l’expression des
gènes, le fichier final conserve un seul FS par gène qui correspond au fragment le plus en
3’UTR et possède le nombre le plus important de lectures. Ce choix permet de s’affranchir du
biais lié à la longueur du gène (Oshlack and Wakefield 2009). Ce fichier comprend 89,7 %
des lectures annotées des échantillons microdisséqués. Les résultats sont disponibles dans
l’Article 2, Supplemental File 2, Table 1.
1.3
Descriptiondestranscriptomes
L’expression détectée de 15 349 gènes représente 78,6% des gènes présents dans la base de
données ovine et localisés sur le génome ovin (version d’assemblage Sheep Genome v2.0 Livestock Genomics de 18,656 gènes) et 62% des gènes présents dans la base de données
Ensembl bovine (UMD3.1 release 65).
Comme attendu, le nombre de gènes exprimés est uniformément distribué entre chromosomes
par comparaison au nombre attendu de gènes exprimés sauf pour le chromosome 15. Pour ce
chromosome, le nombre de gènes exprimés est significativement plus bas (Annexe 1 Figure
S1A) avec un pourcentage de gène transcrits de 57% contre une moyenne de 80% pour les
autres chromosomes. La couverture en gènes exprimés de ce chromosome identifie deux
régions moins exprimées (voir Article 2 ; Supplemental File 1, Figure S2B).
Pour la description des transcriptomes, les niveaux d’expression des gènes de chaque
échantillon sont mesurés en nombre de lectures par gène et normalisés par million de lectures
totales alignées (RPM). L’expression des gènes s’étale de 0,2 à 1000 RPM et 95% des gènes
regroupent 56% des lectures avec une expression médiane de 140 RPM (Article 2 ;
Supplemental File 1, Figure 3A-B). Dans l’ovocyte, les gènes les plus exprimés contribuent
peu au nombre total de lectures (1,2 à 4,7% des lectures pour les dix gènes les plus exprimés)
et comprennent des gènes ovocyte-spécifiques (ZP2 et ZP3 (zona pellucida glycoprotein),
GDF9). Dans les cellules de granulosa (CG) et les échantillons multi-tissus, les gènes très
exprimés contribuent davantage au nombre total de lectures (5 à 9,2 et 16,84% pour CG et
MT respectivement pour les dix gènes les plus exprimés) (Article 2 ; Supplemental File 1,
Figure S3 C-D). Les gènes les plus exprimés dans les CG sont des gènes ribosomiques ou
impliqués dans l’organisation de la cellule. Une diminution significative du nombre de gènes
exprimés dans les ovocytes au cours du développement folliculaire précoce est aussi mise en
73
Résultats
évidence (13 219 gènes dans les ovocytes de follicules primordiaux / 11 693 gènes dans les
ovocytes de follicules à petit antrum) alors que le nombre de gènes exprimés reste stable dans
les CG (Figure 55). 9 499 gènes présentent une expression ubiquitaire dans tous les
échantillons (y compris les « échantillons multi-tissus ») mais leur expression varie entre les
compartiments (comme RPL4 (ribosomal protein L4), VIM (vimentin), BSCL2 (BernardinelliSeip congenital lipodystrophy 2 homolog, human)).
Une analyse en composantes principales montre la cohérence du jeu de données : 52% de la
variabilité d’expression correspond à une différence d’expression entre les 2 compartiments
folliculaires (O vs CG) et 15% de la variabilité d’expression est liée au développement
folliculaire (Article 2, Figure 2B).
1.4
Différentielsd’expressionglobaux
L’analyse statistique des données de séquençage révèle une différence d’expression entre
compartiments cellulaires (5130 gènes : 33,4% des gènes (critères : FDR<0,5%, différentiel
d’expression >2)) ainsi qu’une dynamique d’expression au cours du développement (3015
gènes : 19,6% des gènes (critères : FDR<1%, différentiel d’expression >2)). Enfin, 4,3% des
gènes ont un profil d’expression différent entre les deux compartiments (nommé en statistique
« effet d’interaction entre stade et compartiment » : 674 gènes (FDR <0,5%)).
Parmi ces gènes, 2297 gènes sont sur exprimés dans les ovocytes et 2833 dans les CG. Les
différentiels d’expression sont détaillés dans l’Article 2, Table 1.
La suite de cette étude se limitera aux différentiels d’expression entre les deux
compartiments (5 130 gènes).
1.5
Vérificationdelapertinencedenotrejeudedonnées
Dans un premier temps, nous avons recherché le profil d’expression de 39 gènes, connus chez
la souris pour être exprimés spécifiquement dans un de nos compartiments d'intérêt. Ces
gènes sont détectés dans notre expérience. Trente sept d’entre eux présentent une expression
différentielle significative dans notre analyse statistique RNA-seq en accord avec les résultats
d’expression obtenus chez la souris.
74
Résultats
1.6
Expressionenrichiedanslescompartiments
Des études menées chez la souris ont déjà identifié des gènes à expression spécifique
présentant des fonctions importantes en termes de développement de l’ovocyte et du follicule
mais peu de données sont disponibles concernant uniquement les CG. Dans notre étude, nous
ne parlerons pas de gènes à expression spécifique mais d’expression enrichie puisque les
gènes ont été sélectionnés sur la base d’un fort différentiel d’expression entre l’un des deux
compartiments étudiés et les 12 tissus plus l’autre compartiment (différentiel >5-10). Cette
étude identifie donc 55 et 161 gènes à expression enrichie respectivement dans les CG
(FDR<0,5% ; différentiel d’expression >5) et les ovocytes (FDR<0,5% ; différentiel
d’expression >10). Parmi ces gènes, des gènes à expression granulosa-spécifique connus tels
que WNT4, FSHR, PTEN et d'autres comme WEE2 (WEE1 homolog 2, S. pombe), DDX4,
NRLP9, NLRP13, BMP15 exprimés dans les ovocytes, sont retrouvés.
De nouvelles expressions enrichies au cours de la folliculogenèse basale sont aussi identifiées
dans notre analyse, par exemple :
- dans les CG, DEFB112 (defensin, beta 112) IFNE (interferon, epsilon), BMP1,
IGFBP6 (insulin like growth factor 6), TCF23, CTP1 (CtIP-related endonuclease)
- et dans l’ovocyte, MUSK (muscle, skeletal, receptor tyrosine kinase), BTG4 (B-cell
translocation gene 4), ST8SIA3 (ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase
3), TECTA (tectorin alpha), ACCSL (1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase homolog ;
Arabidopsis (non-functional)-like).
Cette liste à expression enrichie comprend également des régulateurs transcriptionnels comme
HDAC9 (histone deacetylase 9), ASB9 (ankyrin repeat and SOCS box containing 9) LZTS1
(leucine zipper, putative tumor suppressor 1), HOXC4 (homeobox C4) dans les CG et BSX
(brain specific homeobox), SIX6 (sine oculis-related homeobox 6), PATL2 (protein associated
with topoisomerase II homolog 2; yeast)), DMRTC2 (doublesex and mab-3 related
transcription factor like family C2), etc, dans l’ovocyte.
1.7
ValidationparRTPCRentempsréeldesdifférences
d’expressionentrecompartiments
L’expression d’une sélection de gènes a été mesurée par RT-PCR en temps réel.
Ces gènes ont été sélectionnés comme suit :
1- montrant un différentiel d’expression entre les 2 compartiments (11),
2- impliqués dans une voie de signalisation (2),
75
Résultats
3- présentant une expression enrichie dans un compartiment par rapport à l’autre et les
12 tissus (17).
Le différentiel d’expression entre les deux compartiments a été confirmé pour tous les gènes
testés (Article 2, Table 2). L’expression enrichie de 13 gènes sur les 17 testés est également
confirmée (Article 2, Table 3).
La qualité de la mesure de l’expression obtenue par RNA-seq est confirmée par la similitude
des différentiels d’expression entre les 2 techniques (RNA-seq et par RT-PCR en temps réel)
(Article 2, Supplemental File 1, Figure S4). La Figure 2D de l’Article 2 illustre de nouveaux
profils à expression enrichie de compartiments mesurés par RT-PCR en temps réel.
1.8
Annotationfonctionnelle
Dans l’ovocyte, les gènes surexprimés (2297 gènes) sont impliqués dans le blocage du cycle
cellulaire (dont 14 gènes participant à la catégorie « arrêt de méiose »), la régulation de gènes,
la morphologie cellulaire et la reproduction (infertilité : 66 gènes incluant BMP15, GDF9,
BOLL (bol, boule-like (Drosophila)), FIGLA …). Dans les CG, les gènes surexprimés (2833)
sont associés à la survie et mort cellulaire, la morphologie cellulaire, le métabolisme lipidique
et à la fonction de reproduction (107 gènes dont 8 relatifs au « cancer des cellules de
granulosa » incluant l’AMH, FOXL2, INHA, GATA4 (GATA binding protein 4)...). La Figure
3A regroupe les fonctions biologiques surreprésentées en GDE en 17 catégories principales (p
value <0,05%).
1.9
Mécanismesetvoiesdesignalisation
« IPA canonical pathway analysis » identifie 36 voies de signalisation significativement
enrichies en gènes différentiels entre compartiments. Ces voies de signalisation sont
présentées dans l’article 2, Figure 3A, B et C. Cette analyse souligne une implication
différente dans les points de contrôle du cycle cellulaire en fonction du compartiment : un
enrichissement des gènes du point de contrôle G1/S pour les CG et G2/M pour les ovocytes
(Article 2, Figure 3B).
Dans les CG, nous pouvons noter l’importance des mécanismes relatifs à la prolifération des
cellules (catégorie « cancer ») et à l’apoptose ainsi que l’enrichissement en gènes impliqués
dans la signalisation des récepteurs nucléaires comme ESR1 (estrogen receptor 1), AR
(androgen receptor) ou PPARG (peroxisome proliferator-activated receptor gamma),
76
Résultats
LRX/RXR (liver X receptor / retinoid X receptor) et PXR (pregnane x receptor)/RXR
impliqués dans le métabolisme lipidique.
Un enrichissement est également décrit pour les voies de signalisation impliquant le calcium,
PTEN, eNos (nitric oxide synthase 3, endothelial cell), WNT/ß catenine et SHH. Nous
observons aussi un enrichissement en gènes dans la voie de signalisation AMPK (protein
kinase, AMP- activated, alpha 1 catalytic subunit), associée à la régulation de l’énergie. Enfin,
nous montrons l’expression de facteurs de croissance tels que PDGF et HGF et de leurs
récepteurs respectifs PDGFRA-B-L et MET.
Finalement, des voies de transduction du signal sont spécifiquement enrichies comme la
signalisation AMPc (adénosine monophosphate cyclique) et MAPKp38 (Article 2, Figure 3C
et D).
1.10 Interactionscellulaires
Une communication bidirectionnelle entre ovocyte et CG ou entre CG elles mêmes est
indispensable pour l’acquisition de la compétence ovocytaire et le développement folliculaire.
Le module « Canonical pathway analysis » du logiciel IPA montre un enrichissement en GDE
de différentes voies de signalisation pouvant être impliquées dans ce dialogue. Parmi elles,
nous trouvons les voies de signalisation IGF1, VEGF, FGF, NOTCH et les jonctions
communicantes. Pour ces voies de signalisation, nous identifions également l’expression des
ligands dans un compartiment et, dans l’autre compartiment, l’expression des récepteurs.
La Figure 4 de l’Article 2 illustre, un exemple de dialogue moléculaire ovocyte-CG avec la
surexpression d’IGF1R (IGF1 receptor) (FC (fold change) =3,33) dans l’ovocyte et la
surexpression d’IGF1 dans les CG (FC 3,57). La régulation de cette voie de signalisation est
complétée par la surexpression des gènes IGFBP2, IGFBP4, IGFBP6, IGFBP7 dans les CG.
La voie de signalisation NOTCH souligne également une interaction entre compartiments
avec la présence prédominante des transcrits NOTCH1, 2 et 3 dans CG et de ses ligands JAG1
dans l’ovocyte et CNTN1 (contactin 1) dans les CG (Figure 5A-B).
De la même façon, VEGFA est très exprimé dans CG (FC 4,87) alors que son récepteur FLT1
est surexprimé dans l’ovocyte (2,86) (Article 2, Figure 5C). Enfin, l’implication de FGF2
dans le dialogue O-CG est aussi confirmée par la surexpression de FGFR1 et FGFR2 dans les
CG. La surexpression nouvelle d’autres membres de la famille des FGF est aussi mise en
77
Conclusion
évidence : FGF16 et FGF20 dans l’ovocyte et FGF1, FGF11 et FGF12 dans CG. Pour
terminer, un différentiel d’expression est identifié pour les gènes impliqués dans les
connections cellulaires et l’adhésion. GJA1 (connexin 43) est surexprimée dans les CG et
GJA4 (connexin 37) est surexprimée dans les ovocytes (Tableau 19). Des gènes impliqués
dans les jonctions adhérentes (caténine, cadhérines et afadine) et étroites (TJP1 (tight junction
protein 1), claudines, cinguline) sont également surexprimés.
2. Conclusion
En conclusion, cette étude décrit précisément le profil d’expression d’un grand nombre de
gènes (15 349 gènes). Beaucoup de gènes sont exprimés dans les ovocytes mais ce nombre
diminue de manière significative au cours du développement folliculaire précoce. Une analyse
en composantes principales montre la cohérence du jeu de données. L’analyse statistique
identifie une quantité importante de gènes différentiels entre les deux compartiments (5130)
qui ont été intégrés avec les données bibliographiques. Notre analyse globale montre que ces
gènes différentiels sont impliqués dans la fonction de reproduction mais aussi dans le contrôle
du blocage de la méiose pour l’ovocyte et dans la prolifération pour les cellules de granulosa.
Certaines voies de signalisation sont enrichies en gènes différentiels comme WNT et SHH
dans les cellules de granulosa. Des voies de signalisation intervenant dans le dialogue entre
ovocytes et cellules de granulosa sont soulignées (IGF1, FGF, NOTCH). Enfin, de nouveaux
gènes majoritairement exprimés dans un compartiment, susceptibles de jouer un rôle
important dans ces étapes de la folliculogenèse ont été identfiés.
Ces données constituent une base précieuse pour approfondir nos connaissances sur les
mécanismes qui peuvent conditionner la fertilité.
3. Article 2
“An overview of gene expression dynamics during early ovarian
folliculogenesis: Specificity of follicular compartments and bi-directional
dialog”
78
RESEARCH ARTICLE
Open Access
An overview of gene expression dynamics during
early ovarian folliculogenesis: specificity of
follicular compartments and bi-directional dialog
Agnes Bonnet1,2*, Cedric Cabau3, Olivier Bouchez1,2,4, Julien Sarry1,2, Nathalie Marsaud4,5,6,7, Sylvain Foissac1,2,
Florent Woloszyn1,2, Philippe Mulsant1,2 and Beatrice Mandon-Pepin8
Abstract
Background: Successful early folliculogenesis is crucial for female reproductive function. It requires appropriate gene
specific expression of the different types of ovarian cells at different developmental stages. To date, most gene
expression studies on the ovary were conducted in rodents and did not distinguish the type of cell. In mono-ovulating
species, few studies have addressed gene expression profiles and mainly concerned human oocytes.
Results: We used a laser capture microdissection method combined with RNA-seq technology to explore the
transcriptome in oocytes and granulosa cells (GCs) during development of the sheep ovarian follicle. We first
documented the expression profile of 15 349 genes, then focused on the 5 129 genes showing differential expression
between oocytes and GCs. Enriched functional categories such as oocyte meiotic arrest and GC steroid synthesis reflect
two distinct cell fates. We identified the implication of GC signal transduction pathways such as SHH, WNT and RHO
GTPase. In addition, signaling pathways (VEGF, NOTCH, IGF1, etc.) and GC transzonal projections suggest the existence
of complex cell-cell interactions. Finally, we highlighted several transcription regulators and specifically expressed genes
that likely play an important role in early folliculogenesis.
Conclusions: To our knowledge, this is the first comprehensive exploration of transcriptomes derived from in vivo
oocytes and GCs at key stages in early follicular development in sheep. Collectively, our data advance our
understanding of early folliculogenesis in mono-ovulating species and will be a valuable resource for unraveling human
ovarian dysfunction such as premature ovarian failure (POF).
Keywords: RNA-seq, Early folliculogenesis, Molecular dialog, Transcriptome, Sheep, Oocyte, Granulosa cells,
Microdissection
Background
The major function of an ovary is to produce oocytes
intended for fertilization as eggs and to create a favorable environment for the beginning of gestation. In adult
mammals, the ovary is a heterogeneous organ containing
follicles at various stages of development and corpora
lutea, either active or at various stages of involution.
The formation of primordial follicles (oocytes surrounded by flattened pre-granulosa cells) occurs during
* Correspondence: [email protected]
1
INRA, UMR444 Génétique Cellulaire, Auzeville, BP52627, F-31326
Castanet-Tolosan, France
2
ENVT, UMR444, Laboratoire de Génétique Cellulaire, F-31326
Castanet-Tolosan, France
Full list of author information is available at the end of the article
fetal development in many species including human,
sheep (from 75 days of gestation) [1], cattle, and goat, or
after birth like in rodents. The primordial follicles represent a reserve of germ cells for the entire reproductive
life of the female. They remain dormant until their recruitment and irreversible growth towards the primary,
secondary and tertiary stages (with an antral cavity). The
gradual exit of primordial follicles begins shortly after
the formation of the primordial follicle pool and continues
throughout the reproductive years [2]. Consequently, this
early development is important as it regulates the size
of the resting primordial follicle pool and the fate of
the follicles, which, in turn, affects fertility and the reproductive life span.
© 2013 Bonnet et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an open access article distributed under the terms of the Creative
Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and
reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Early follicular development requires the appropriate
expression of many genes at different developmental
stages. Recent studies on natural mutations in sheep [3]
and on mutant mouse models demonstrated that the
expression of different oocyte-specific genes is essential
during early folliculogenesis in a stage specific expression pattern [2]. Figla, Nobox, Pten, Foxo3A and nerve
growth factor genes are involved in the formation of
primordial follicles, whereas genes such as βFGF, GDF
9 and BMP 4 are involved in the transition from primordial to primary follicles. Other genes such as BMP15
are not expressed in the oocyte until the primary follicle stage and are involved in the transition from primary to secondary follicles, as shown in sheep (for a
review see [4]).
This process also requires orchestrated communication between oocytes and granulosa cells (GCs), which
are the structural components of the early follicle.
Oocytes and GCs regulate follicle growth in an autocrine and paracrine manner via secreted factors and
direct gap junctional communications. On one hand, it
is assumed that oocytes control the proliferation of
GCs and later, their differentiation into steroid secreting cells and their metabolism [5]. On the other hand,
GCs are indispensable to oocyte growth, meiosis, cytoplasmic maturation and control of transcriptional activity within the oocyte [6]. This dialog also takes place
through GC cytoplasmic extensions that penetrate the
zona pellucida (ZP) and form gap junctions with oocyte
cell membrane [7].
Although some large scale expression studies have been
conducted on rodent and human oocytes [8-11], expression profiling of follicular compartments is difficult to accomplish due to the very small size of the follicles and the
mixture of preantral stages in the ovary. Two studies in
particular identified the specific transcriptome of human
oocytes in the quiescent state [10,11]. These studies
highlighted enriched functions (transcription, RNA post
transcriptional modifications) and molecular mechanisms
(cell cycle, androgen signaling) in human oocytes, which
were also identified in the only preliminary analysis conducted in sheep species to date [12]. But exactly which
granulosa cell factors play a specialized role in early
follicular development is not known. Our knowledge of
the key mechanisms and the bidirectional communication underlying early folliculogenesis is consequently
still very limited and is mainly derived from rodents
(poly-ovulating species). Spatial and temporal information on gene expression patterns would facilitate the
identification of the regulatory gene networks that
underlie cell growth, differentiation, and the functional
specification of each follicular compartment.
The purpose of this study was thus to 1- describe global gene expression during early ovarian folliculogenesis
Page 2 of 19
in each follicular compartment (oocyte, GCs) in monoovulating species using sheep as the experimental model
(whose fertility, litter size, ovulation rate and fetus development is similar to humans, unlike rodents); 2- identify
differential and specific gene expression between these
two follicular compartments; 3- investigate specific functions and pathways, and 4- explore bi-directional communication between oocytes and GCs. This was achieved
using laser capture microdissection (LCM) to isolate oocytes and GCs during the earliest stages of folliculogenesis.
Gene expression profiles were monitored at each follicle
stage according to cell type using RNA-seq technology.
We report the successful isolation and generation of global
gene expression data sets of pure oocytes and GC populations at key stages of early follicular development. We describe the expression profile of 15 349 genes with 33.4% of
genes displaying differential expression between the two
compartments. In addition, we identified oocyte and GCspecific gene expression and the pathways involved in
oocyte-GC communication.
Results
We combined laser capture microdissection (LCM)
[12] and RNA-sequencing technologies to detect separate GCs and oocyte global transcriptome for each stage
of follicle development: primordial (PD), primary (PM),
secondary (SC) follicles and the small antral stage (SA)
as control. Three/four biological replicates were obtained per condition (8 conditions: cell type X stage).
For the experimental protocol, see Additional file 1:
Figure S1.
The RNA-seq experiment generated around 2.647 billion 100 bp reads with an average of 73.7 million per
LCM-derived amplified RNA sample (LCM-aRNA). The
result of the bioinformatics and annotation processing is
summarized in Figure 1 and detailed in Additional file 2.
Briefly, the genome assembly approach (mapping to
sheep genome sequence, assembly, followed by read
counting) generated a collection of 382 933 fragments
that aggregated 47.5% of LCM-aRNA reads. After 3′
UTR selection, the final dataset included 15 349 genes.
221 716 genomic fragments remained unannotated.
Exploring global gene expression
The 15 349 genes correspond to 62% of the bovine annotated genes in Ensembl UMD3.1 release 65, and to 78.6%
of the ovine annotated genes in CSIRO Oarv2.0 (18 656
genes). As expected, the number of expressed genes was
uniformly distributed between chromosomes according
to the number of expected genes except for chromosome 15 on which significantly fewer genes were
expressed (Additional file 1: Figure S2A). The percentage of genes transcribed for this chromosome was 57%,
compared to an average of 80% for the other chromosomes
Page 3 of 19
Genomic Fragments (GF) /genes
Reads
2647 million of reads :
73.7 million/LCM sample
Mapping
Genome assembly:
Ovine genome
De novo assembly:
Bovine genome
381600 GF
1333 GF
47.5% reads
382933 GF
Annotation
Not annotated
73% reads
Annotated
221720 GF
161213 GF
Dataset filtration
15349 genes
3’ UTR
Exons
86.8%
5.5%
Introns
5’ UTR
6.5%
1.2%
2.6%
89.4%
30.7% from 2647 million of reads
Figure 1 Summary of bioinformatics processes. The RNA-seq experiment produced a collection of 382,933 fragments that aggregated 47.5%
of the LCM-aRNA reads. The annotation strategy assigned 73% of the mapped reads. A total of 221,716 genomic fragments remain unannotated.
A total of 86.8% of the annotated reads are located in stop codon or 3′UTR regions, whereas only 5.5% are located in exons, 1.2% in start
codon/ 5′UTR regions and 6.5% in introns. The final dataset conserved a single fragment per gene corresponding to the nearest 3′UTR region
with the highest number of reads. This dataset aggregated 89.4% of the annotated LCM-aRNA reads (86.8% were located in 3′ UTR regions and
2.6% were located in exons).
(SD = 7.9%). The chromosome coverage of the expressed
genes overlays Oarv2.0 annotated genes (Additional file 1:
Figure S2B) except for chromosome 15 on which we identified two regions with fewer expressed genes. The density
of expressed genes in these two regions (45–50 MB and
77–80 Mb) was 75%-90% lower.
For each sample, the expression levels were measured
in read counts per gene (the 3′ UTR fragment being
the most representative) and a normalized expression
(RPM = sample gene read count/(sample total mapped
read /1 000 000)) was calculated to describe the transcriptome of the tissue. First, we visualized a dynamic
range of gene expression between 0.2 and 1 000 RPM
(Additional file 1: Figure S3A-B). We estimated that 95%
of the genes aggregated 56% of the reads. We then examined the highest expressed genes and detected a clear
distinction between cell types (Additional file 1: Figures
S3C-D). The highest oocyte-expressed genes contributed
less to the total number of reads than GCs and multitissue samples (MT: 12 different tissues). For example,
the ten highest oocyte-expressed genes contributed 4.2%
to 4.7% of the total reads, while the highest expressed
GC and MT genes contributed respectively 5% to 9.2%
and 16.84% of the total reads. In oocytes, the most
expressed genes included ZP2, ZP3 and GDF9, genes
known to be oocyte specific, but also ACTG, PAIP1,
PDK3. In GCs, the most expressed genes included
mainly ribosomal genes, such as RPL4, RPL14, RPS23,
genes involved in cellular assembly and organization,
such as ACTG, collagens, VIM and cell growth regulators, such as MGP.
Among these 15 349 expressed genes, we observed a
significant decrease in oocyte-expressed genes during
early follicular development, i.e., from 13 219 genes in
primordial oocytes to 11 693 genes in small antrum oocytes (Figure 2A). Conjointly 9 499 genes were found
to be expressed in all the samples (O + GCs + MT) and
were considered as ubiquitously expressed genes. However, their relative expression levels varied depending
on the type of cell, for example ribosomal genes
(RPL4, RPL14), VIM, SPARC, and low expressed genes
such as BSCL2.
In addition to this qualitative assessment, the transcriptome data set was analyzed using the R software package,
DESeq [13]. Principal component analysis of the DESeq
normalized data confirmed the relevance of the data
(Figure 2B). The first axis explained 52% of expression
variability and separated the two follicular compartments (O and GC). The second axis explained 15% of
expression variability and separated the samples according to their follicular stages.
Global differential gene expression
To identify differentially expressed genes, a generalized
linear model was applied to the data after DEseq
normalization (DESeq’s GLM method using the gene
A
14000
Gene number
13000
*
Page 4 of 19
B
12000
11000
10000
9000
8000
7000
6000
C
D
Figure 2 Global gene expression. A: Number of expressed genes. For each condition (stage x compartment) expressed genes are genes with
an average expression >10 reads for ¾ of the replicates. Ubiquitous genes are genes expressed in all the samples. *: pval < 0.05 between PDO-PMO and
SCO-SAO. B: Principal component analysis (PCA) of the transcriptome. PCA was performed on the gene data set after normalization using the R DEseq
package. The first axis explains 52% of the expression variability and separates the two follicular compartments (O vs. GCs). The second axis explains 15%
of the expression variability and separates the samples according to their follicular stages. C: Heatmap display of supervised hierarchical clustering of all
the differential genes between compartments. The 1,694 genes are displayed in rows and the mean of replicates per condition are displayed in columns.
Red, black and green represent up, mean, and down expression, respectively. D: Specific expression profiles. Relative quantification of BTG4 MCF2L,
STA8SIA3 oocyte-specific genes and IFNE, ITIH5, DEFB112 GC-specific genes in the 2 follicular compartments and throughout early follicular development
((n = 3-4), Pd: primordial, Pm: primary, Sc: secondary, SA: small antrum). Expression specificity was checked by comparison with the expression of 3 amplified
multi-tissue samples (3 independent pools of 12 tissues = MT) and non-amplified individual tissues. X axis from the left: PDO, PMO, SCO, SAO, PDG, PMG, SCG,
SAG, MT1, MT2, MT3, fetal ovary, pituitary gland, hypothalamus, muscle, skin, hurt, lung, intestine, stomach, liver, kidney, spleen, fetal ovary, theca. The left Y axis
corresponds to the relative expression normalized by 2 reference genes (Actin β and RPL19) from qPCR data (red color). The right Y axis corresponds to the
normalized counts from RNA-seq data (blue color).
data set). This model allowed statistical evaluation of the
factor effects (O, GC) and their interactions. The following criteria including FDR < 0.5% to 1% (BenjaminiHochberg procedure) and a fold change >2 were chosen
to determine significant differentially expressed genes.
Using these criteria, 33.4% of genes (FDR < 0.5%: 5 130
genes) were significantly differentially expressed between
the two compartments; 19.6% of genes were significantly
differentially expressed during early development (FDR
< 1%, 3 015 genes). We observed differences in expression profiles during early folliculogenesis between the
two compartments for 4.3% of the genes (interaction
effect FDR < 0.5%, 674 genes). For example, the expression
of the KCNN3 gene decreased in GCs during early development whereas its expression increased in oocytes. Differential expression is detailed in Table 1, which, interestingly,
shows that genes were under expressed in oocytes compared to in GCs (2 833 genes).
Focus on differential expression between compartments
(O/GCs)
We focused our analysis on the 5 130 significant differentially expressed genes (DEG) between compartments
(Additional file 3). The aim was to provide an overview
Page 5 of 19
Table 1 Summary of differential gene expression
Number of
differential genes
Total
Up
Down
5129
2297
2832
total
3015
1357
1658
oocyte
2173
1064
1109
granulosa cells
1192
408
784
total
674
oocyte
522
250
272
granulosa cells
262
91
171
Compartment effect: O/GCs
Stage effect: SA/PD
Interaction effect
gene regulation
of specific gene expression, mechanisms and functions
in these cell types, which may be involved in the dialog
between the oocyte and GCs, and regulate follicle
development.
First, we observed numerous genes on the DEG
list already known to have cell-type specific expression.
The expression of 39 genes known to be compartment
specific was investigated and the expression of 36 of
them was confirmed by the RNA-seq statistical analysis
(Additional file 4).
Last, the expression of 33% of the genes (1 694 genes)
varied during early follicular development. Supervised
hierarchical clustering was performed to identify groups
of genes with similar expression profiles. This led to a
clear separation between the two compartments and
identified clusters of genes according to the stage of follicular development, suggesting a difference in the dynamics of transcription between oocytes and GCs
(Figure 2C).
Compartment specific expression
Previous studies that were mainly devoted to rodent species identified oocyte-specific genes with important
functions related to oocyte development and folliculogenesis. However, few data are available for GCs. To gain
insight into the specific expression of each compartment, we performed a pair-wise comparison of the transcriptome of each compartment and both MT and
the other compartment transcriptomes. In this way, we
identified 55 highest differentially expressed genes in
GCs (FDR < 0.5%, FC > 5) and 161 highest differentially
expressed genes in oocytes (FDR < 0.5%, FC > 10. In so
doing, we confirmed the specific expression of the genes
already known as WNT4, FSHR, PTEN in GCs or WEE2,
DDX4, NRLP9, NLRP13, BMP15 in oocytes. We also
identified new compartment-specific expression of genes
such as IFNE, DEFB112, BMP1, IGFBP6 and TCF23 in
GCs and ST8SIA3, MUSK, TECTA, BTG4 and ACCSL in
oocytes. Among these genes, we also identified oocyte-
specific expression of 11 transcription regulators (BSX,
PATL2, DMRTC2, SIX6, etc.) and the GC-restricted expression of four transcription regulators (HDAC9,
LZTS1, HOXC4, ASB9). For a list of the highest differentially expressed genes, see Additional file 5.
Validation of differential expression by quantitative real
time RT-PCR
To validate the RNA-seq analysis, the expression profiles
of a subset of genes of interest were monitored using qRTPCR. These genes were selected as follows: (i) genes showing significant up or down expression in oocytes (11 genes:
Table 2), (ii) genes involved in particular canonical pathways (2 genes: Table 2) or (iii) compartment-specifically
expressed genes (17 genes: 8 oocyte-specific genes and
9 GC-specific genes; Table 3). Statistical analysis confirmed the differential expression between compartments
observed in RNA-seq data for all the genes tested
(Table 2) and the compartment-specific expression of
13 out of 17 genes (Table 3). The accuracy of our gene
expression measurement was also confirmed by the
similarity between RNA-seq and qRT-PCR fold change
(Additional file 1: Figure S4). Figure 2D illustrates the
new compartment-specific expressions checked by
qRT-PCR in oocytes (BTG4, MCF2L, ST8SIA3) and in
GCs (IFNE, ITIH5, DEFB112).
Biological trends
Biological functions
To investigate the biological functions associated with
the two compartments, the DEG list was subjected to Ingenuity Pathway Analysis (IPA) and tested for function
Table 2 qRT-PCR validation
Canonical
pathways
Gene
RNA-seq
analysis
O/GCs Fold
change
IGF1
Gap junction
Notch
PI3K
qPCR analysis
O/GCs Fold
change
P value
class
*
IGF1
0.284
0.52
INSL3
0.121
0.482
*
IGF1R
3.334
7.35
*
GJA4
20.84
4.247
*
GJA1
0.117
0.278
***
***
JAG1
2.053
2.909
PIK3R3
P
P
KITLG
0.266
0.218
**
KIT
2.244
3.962
**
Paxilin
PARVA
P
3.5
*
Others
GATA2
7.028
10.906
*
AMHR2
+∞
0.64
***
MAEL
3.255
5.661
***
*: pval < 0.05; **: pval <0.01; ***: pval < 0.005.
Page 6 of 19
Table 3 Validation of gene expression specificity
RNAseq data
HUGO gene name
qPCR data
O/GCs FC
Pvalue
O/G FC
Pvalue
WEE2
40.25
MUSK
22.52
6.46E-15
56.15
*
1.40E-10
108.64
*
SPO11
GAPT
13.16
7.71E-06
16.45
***
+ 9991
2.5E-05
60.91
*
MCF2L
ST8SIA3
41.16
3.82E-03
29.04
NS(0.068)
16.54
4.4E-03
74.5
*
TNIP3
41.79
GABRP
28.89
1.1E-03
21.74
NS(0.072)
1.79E-07
1369.57
*
IFNE
−999
5.18E-05
0.002
*
TCF23
0.096
5.29E −08
0.051
***
TLL2
0.118
3.00E-11
0.148
*
EFS
0.086
5.39E-06
0.24
***
WINT4
0.095
4.63E −03
0.106
*
ITIH5
0.142
4.97E −03
0.101
***
HTRIF
0.007
2.21E-06
0
TMEM167A
0.012
8.16E −04
0.025
DEFB112
0.087
1.60E-12
0.005
2
*
*: pval < 0.05; ***: pval < 0.005.
1
: expression only detected in oocytes.
2
: expression only detected in GCs.
enrichment (Additional files 6 and 7). In the oocyte compartment (2 297 genes), we found a high statistical enrichment of genes involved in the cell cycle (with 14 genes
contributing to the meiotic arrest), gene regulation, cell
morphology and organization, and the reproductive system.
The cell cycle function (mainly cell cycle progression) was
also enriched in GCs. Last, we observed different involvement of oocytes and GCs in the reproductive system.
On one hand, oocytes over-expressed 66 genes that have
been shown to play important roles in fertility. The genes
over-expressed in GCs (2 833 genes) were found to be
mainly related to cellular proliferation and atresia (“cellular
growth and proliferation”, “cell death” IPA functions), cell
morphology (148 genes involved in the “formation of
protrusions”) and movement, lipid metabolism and the reproductive system such as BMP15, GDF9, BOLL, FIGLA,
MOS, PIWIL1, INSL6. On the other hand, GCs overexpressed 107 genes involved in ovarian tumors of which
eight were related to GC cancer (AMH, FOXL2, GATA4,
GNAS, INHA, KRAS, NR5A1, ZFPM2). Figure 3A is a
graphic representation of the DEG biological functions in
which the 17 main categories (FDR <0.05) are shown.
Canonical pathways
Based on the results of the IPA canonical pathway analysis, we identified 36 significant pathways that encompassed metabolism, regulatory and cell signaling. These
pathways are shown in Figures 3B-D. This analysis
underlined two different cell cycle checkpoint regulations according to the compartment: enrichment of
genes involved in the G1/S checkpoint for GCs and
in the G2/M DNA damage checkpoint for oocytes
(Figure 3B). We observed significant cellular proliferation and apoptosis mechanisms in GCs, and gene enrichment in nuclear signaling receptors such as PPARG,
LRX/RXR and PRX/RXR involved in lipid metabolism.
We also identified GC-specific enrichment pathways
such as cAMP-mediated, p38 MAPK, wnt/β-catenin and
PDGF signaling pathways. Figures 3C-D provide further
evidence for the over-expression of growth hormoneencoding genes in GCs compared to oocytes during
early ovarian folliculogenesis, and for the involvement of
PTEN, calcium, eNos and SHH signaling pathways in
GCs. Last, we observed enrichment of genes involved in
AMPK signaling related to GC energy regulation.
Cell-cell interactions
In mammals, bidirectional communications between
oocyte-GC and GC-GC are required for meiotic maturation, acquisition of oocyte competence, and follicle
development. Analysis of the canonical pathways identified molecular events involved in these communications
including IGF1, VEGF, FGF, Notch and tight junction
signaling pathways. Figure 4 illustrates oocyte-GC
cross-talk with the over expression of IGF1R gene in
oocytes (FC = 3.33) and the over expression of IGF1
gene in GCs (FC = 3.57).
Regulation of the IGF1 system was then achieved
through the over expression of IGFBP2, IGFBP4,
IGFBP6, IGFBP7 genes in GCs. In the same way, VEGFA
was highly expressed in GCs (FC = 4.87) while its receptor FLT1 was over expressed in oocytes (FC = 2.86)
(Figure 5A). The involvement of FGF2 in oocyte-GC dialog was also evidenced by the over expression of FGF2
in oocytes and of FGFR1 and FGFR2 in GCs. We also
revealed for the first time over expression of FGF family
members such as FGF16 (FC = 7.14), FGF20 (FC = 4.3)
in oocytes and FGF1 (FC = 8.3), FGF11 (FC = 4.3),
FGF12 (FC = 6) in GCs. Notch signaling was assumed to
be involved in two kinds of interactions. Firstly, the
abundance of NOTCH1 transcripts in GCs and of its
ligand JAG1 in oocyte confirmed compartmental interactions (Figure 5B). Secondly, this pathway could be involved in GC interactions via its functional ligand
CNTN1 (Figure 5C).
Finally, we detected the differential expression of
genes involved in cellular connections and adhesions.
GJA1 (cx43), which is over expressed in GCs, and GJA4
(cx37), which is over expressed in oocytes (Table 2), are
known to participate to gap junctions and connect oocytes with GCs. We also observed over expression of
C
25
Gene enrichment (%)
B
- log(B-H P-value)
Gene enrichment (%)
A
Page 7 of 19
11
20
Gene enrichment (%)
65
**
15
10
15
5
0
25
18
32
20
***
15
***
8
7
10
10
5
22
18
***
18
24
*** 8**
15
8
**
34
*
34
21
62
** 43**
28
17
*
31
18
***
**
17
**
8
0
BMP
FGF
GNRH
HGF
IGF1
36
**
27
16
*
**
25
** ***
6
11
3
PDGF
TGFβ
VEGF
Oocyte
Granulosa cells
18
29
20
20
19
*** *** ***
9
5
9
36
16
26
36
25
20
27
45
*** ***
*** 18** 9** ***
23
6
23
15
63
**
***
6
AHR
D
12
*
12
30
18
28
27
*** ** *** ***
13
0
Figure 3 Functional enrichment and canonical pathways within oocyte and GCs. A: Functional enrichment. Genes differentially expressed
between the 2 compartments were evaluated in silico using Ingenuity Pathway Analysis (IPA). The figure shows the most significant functional
groups (p < 0.05, FDR < 5%). For each compartment, the gene list corresponds to up regulated genes compared to the other compartments. The
bars represent the p-value at logarithmic scale. GC data are in red and oocyte data are in blue. Red and blue numbers correspond to the number
of focus genes that contributed to the function concerned. B: Canonical pathways in oocytes and GCs. Significantly enriched canonical pathway
categories (p-value < 0.05) identified in the 2 compartments. The Y axis corresponds to percentage gene enrichment in the pathway. Red and
blue numbers correspond to the number of focus genes that contributed to the pathway concerned. *: FDR < 0.25 (likely to be valid 3 out of 4
times); **: FDR <0.10; ***: FDR < 0.05. C: Growth factor signaling pathways in oocytes and GCs. Significantly enriched growth factor signaling
pathways (p-value < 0.05) identified in the 2 compartments. The Y axis corresponds to percentage gene enrichment in the pathway. Red and
blue numbers correspond to the number of focus genes that contributed to the pathway concerned. *: FDR < 0.25; **: FDR <0.10; ***: FDR < 0.05.
D: Signaling pathway in oocytes and GCs. Significantly enriched signaling pathways (p-value < 0.05) identified in the 2 compartments. The Y axis
corresponds to percentage gene enrichment in the pathway. Red and blue numbers correspond to the number of focus genes that contributed
to the pathway concerned. *: FDR < 0.25; **: FDR <0.10; ***: FDR < 0.05.
genes involved in the adherent junctions (catenin, cadherins and afadin) and in the tight junctions (TJP1,
claudins, cingulin) (Additional file 1: Figure S5).
Transcription regulators
Oocyte and GC transcription factors (FIGLA, NOBOX,
FOXL2, etc.) play an important role in folliculogenesis
[14]. They control both oocyte development and GC
function. To identify new transcription regulators, we
performed IPA upstream regulator analysis on the
DEG data set. For each compartment, we predicted the
transcriptional regulators that were over expressed and involved in the regulation of this DEG: 47 GC regulators
and 9 oocyte regulators (pval < 0.05: Additional file 8).
Among them, the oocyte transcription regulator NOBOX
and 12 GC transcription regulators (GATA4, FOS, TP53,
etc.) were predicted to have their protein activated.
Discussion
To our knowledge, this is the first comprehensive exploration of transcriptome from oocyte and granulosa
cells separately and at several key stages corresponding
Normalised RNA-seq counts
Page 8 of 19
100000
IGF1
10000
1000
100
Normalised RNA-seq counts
PD
PM
SC
SA
1000
100
IGF1R
10
PD
PM
SC
SA
Oocyte
Granulosa cells
Figure 4 IGF signaling pathway. Gene expression involved in the IGF1 signaling pathway. Genes in red are over expressed in oocytes. Genes in green are
over expressed in GCs. Relative expression of IGF1 and IGF1R from RNAseq data in the graph. The Y axis corresponds to RNA-seq normalized read counts.
to in vivo major transitions during early folliculogenesis
in sheep. The study resulted in reliable transcriptional
profiling in time and space. We explored changes in
gene expression between the two follicular compartments and identified specific transcriptional programs in
either oocyte or granulosa cells. In addition, we identified pathways involved in bidirectional communication.
Thanks to mouse genetic models, a significant number of
targeted molecular data (gene expression and proteins) has
been accumulated during the past years. Recently, these
data were complemented by mouse and human oocyte
transcriptome data that give us more information about
the molecular mechanisms involved in early folliculogenesis. Our study expanded transcriptome data to GC and
enabled us to determine the precise expression of genes involved in these mechanisms in a mono ovulating species.
Oocyte and GC Transcriptional profiling
This study documented the expression of 15 349 genes
(which represents the majority of ovine genes) in ovarian
follicles during early follicular development. Thanks
to the sensitivity of RNAseq, we estimated a larger number of genes expressed in oocytes (14 172 genes
expressed in ¾ of replicates) than other microarray studies (Additional file 2; discussion section). In our study,
14 087 genes were also estimated to be expressed in
GCs. These high numbers of expressed genes were close
to the higher number of genes expressed in testis (15
000) compared to the other human and mouse tissues
(11 000 to 13 000 genes from RNA-seq data) [15].
The high number of expressed genes in both oocytes
and GC evidenced strong transcriptional activity. Interestingly, this analysis revealed a slight decrease in the
number of oocyte expressed genes during follicular development from SC follicles that coincides with the gain
in methylation from PM to SC follicle transition (oocyte
diameter of at least ~50 mm) [16]. The detection of a
large number of ubiquitous genes (Figure 2A) was previously reported by Ramköld et al. [15] suggesting that
functional specialization is not associated with a large
Page 9 of 19
A
B
GC
O
GC
GC
NOTCH1/2/3
HES
HERP
Transcriptionof target genes
Granulosa cells
Oocyte
C
VEGFA
GC
VEGFC-D
O
FLT1
Figure 5 (See legend on next page.)
Page 10 of 19
(See figure on previous page.)
Figure 5 VEGF and NOTCH signaling pathways. Gene expression involved in the VEGF and NOTCH signaling pathways. Genes in red are over
expressed in oocytes. Genes in green are over expressed in GCs. Relative expression of VEGF and FLT1 from RNAseq data. The Y axis corresponds
to RNA-seq normalized read counts. A: Oocyte-GC communications in the NOTCH signaling pathway. B: GC-GC communications in the NOTCH
signaling pathway. C: Oocyte-GC communications in the VEGF signaling pathway.
population of genes but results in more subtle and complex control.
RNA-seq has made it possible to identify novel transcripts. In this study, we uncovered 221 716 genomic
fragments that now need to be annotated. Some of them
present a high expression level and compartmentspecific expression (FC > 100) suggesting they play an
important role in early folliculogenesis. Further exploration using bioinformatics and gene expression validation will be necessary to refine these results.
Differential expression between compartments reflects
the fate of the cell types
The development of the follicle and the maturation of
oocyte require orchestrated communication between oocytes and GCs at all stages of early folliculogenesis. They
also require the expression of compartment-specific
genes. To investigate these molecular processes, we focused our analysis on differences in gene expression
between oocytes and GCs and identified a large number
(5 129) of differentially expressed genes. We identified
functional differences between oocytes and GCs and described the characteristics of each compartment that
lead to two specific cell fates. As described in our previous study [12], the top functions of differentially
expressed genes illustrated the three main cellular events
known to be involved in early follicular development:
the change in the shape of the GC cell from flattened to
cuboidal (IPA categories “cell movement”; “shape change
of tumor cell lines”: 30 genes including FLNB, EDNRA),
the marked increase in the number of GCs (x 40 in
sheep species up to the secondary stage) and oocyte enlargement [17] (x 300 between the primordial and antral
stages: IPA category “morphology of germ cells”: 31
genes including ASZ1, TDRD5). DEG comparison of
genes identified in five previous studies validated this list
(Additional file 2; discussion section). In addition to the
information provided by our previous study [12], IPA
RNA-seq analysis increased available information thanks
to the identification of additional DEG.
Meiotic regulation
In most mammals, meiosis is initiated during fetal life
and stops prenatally in the diplotene stage of prophase I
at the G2/M transition until development into a Graafian follicle (before ovulation).
This study highlights oocyte over expression of genes
involved in the regulation of meiotic progression,
acquisition of meiotic maturation, and maintenance of
meiotic arrest.
For instance, SPO11 is involved in initiating meiotic
recombination by catalyzing DNA double strand breaks
[18]. BTRC loss of function in mice results in slow progression through meiosis and abnormal divisions in
spermatocytes [19]. We also observed a significant
increase in sheep OVOL1 mRNA (FDR = 0.043) and
ASZ1 mRNA (FDR = 0.017) during early folliculogenesis.
Ovol1 is known to be involved in regulating the pachytene progression of male germ cells [20] and shown to
be expressed during sheep early folliculogenesis [21]. In
mice, the ASZ1 protein is a germ cell-specific protein
located in the cytoplasm of oocytes at all stages of development that may act as an important signaling protein and/or transcriptional regulator during germ cell
maturation [22].
The function of these genes is poorly understood in
mammalian ovary development but their expression in
early follicular development suggests they play a role in
the regulation of female meiosis.
Finally, we confirmed the expression of genes already
known to be involved in the regulation of the oocyte
and/or spermatocyte meiotic arrest (AURKA-C, PLK1,
PDE3A, BTRC, CDC25B-C, WEE2 etc.).
The establishment of GC steroid synthesis
This study clearly shows that GCs over-expressed genes
involved in steroid synthesis (such as CYP11A1, HSD3B
and HSD17) and in steroid regulation (such as nuclear
receptor genes (NRs)). NRs include orphan receptors
(NR5A1, NROB2), steroid hormone receptors (ESR1, AR,
LXR (NR1H2), FXR (NR1H4)), and retinoid acid receptors (RXRA), all of which are over expressed in GCs during preantral follicle stages.
NR5A1 (SF-1), which has already been described in
sheep GCs [23], is a master gene that regulates the expression of numerous genes including reproductive and
steroidogenic enzyme-encoding genes [24]. GC specific
SF-1 KO mice are infertile whose ovaries contain a reduced number of follicles and reduced expression of
AMH, which partially correlates with the reserve of ovarian follicles [25].
E2 and androgens hormones exert their influence on
early folliculogenesis via their respective receptors, ESR
and AR. Like in mice, E2 probably plays a role in controlling the primordial follicle pool [26] and androgen
signaling is crucial for normal folliculogenesis [27]. We
observed strong expression of AR in GCs, like in
humans [28]. Finally, for the first time, we identified
over expression of LXRB, FXRA and RXRA in GC preantral stages. RXR is a retinoid X receptor that binds as
heterodimers (LXR/RXR, FXR/RXR…) and becomes
transcriptionally active only in the presence of a ligand
(RXR-selective ligand or ligands of the other dimer).
LXRs are activated by oxysterols (generated by intermediates of steroid hormone and cholesterol synthesis
(CYP21A1, STAR, P450scc products)) and are key regulators of ovarian steroidogenesis at antral stages [29].
FXRs are activated by bile acid, sterol and different lipids
and are possibly important regulators of androgen homoeostasis in male gonads [30].
Complex regulation of follicular atresia
Atresia is an important process in folliculogenesis and
concerns the majority of the follicles. Apoptosis is found
in the oocytes of primordial follicles and progressively
extends to GCs of growing follicles.
We characterized the expression of different genes of
the BCL2 family either over expressed in oocytes
(BCL2L1, BCL2L10, BCL2L11 (BIM), BCL2L14 (BCLG))
or in GCs (BCL2 BCL2L2, BOK) and that mainly prevent
oocyte loss. For example, the BCL2L1 gene was shown
to play a crucial role in the survival of germ cells [31].
BCL2L10 may antagonize BAX activities and may also
play other roles related to cell cycle control and oocyte
maturation (for a review see [32]). In sheep, the high expression of BCL2L10 in oocytes and its up-regulation
during preantral stages reinforces its already important
role in oocyte development. By decreasing GC atresia,
the BCL2 gene family expressed in GCs, such as BCL2,
was also believed to increase the number of germ cells
and enhance their development. Lastly, BOK mRNA,
was found to be restricted to reproductive tissue and
was detected in GCs from PM to antral follicles in rat
species [33].
GC signaling pathways
The molecular pathways were mainly linked to GC proliferation, steroid production, and morphological change.
Sheep GCs over expressed members of the Sonic
hedgehog (Shh) signaling pathway (SMO, PTCH1 and
GLI1-2-3), which is consistent with a potential role for
the HH pathway in increased GC proliferation during
preantral stages [34]. Last, genes of the WNT family and
their receptors (WNT4-3A-5A-6, FDZ1, LRP1-11) and
Rho-GTPase activating proteins (ARHGAP9-20-21-3136-44) were shown to be over expressed in GCs. In the
ovary, the β-catenin dependant canonical pathway of
WNT4 leads to ovarian determining pathways. WNT
proteins can also signal via Rho-GTPases, using noncanonical pathways that involve changes in polarized cell
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shape and cell migrations [35]. This pathway may promote changes in cell shape that affect GCs during early
folliculogenesis.
Cell-cell communications
Follicular growth depends on close interactions between
oocytes and GCs but also between GCs themselves. Two
kinds of cell interactions are described in this study
demonstrating the existence of complex dialogs between
compartments: a molecular dialog (signaling pathways)
and physical communications (gap junctions and transzonal projections).
Signaling pathways: GC regulation of oocyte development
GCs are known to play a role in supporting the growth
of oocytes, regulating the progression of meiosis, and
modulating global oocyte transcription activity. Nevertheless, so far, few factors have been identified that
support these assumptions. To date, the most widely
studied ligand-receptor systems (that were also identified
in the present study) are the KIT/KITL and BMP pathways. Below we describe the involvement of other signaling pathways.
The Notch signaling pathway plays many roles in cell
communication by influencing cell proliferation, differentiation, and apoptosis [36]. In sheep, we found over
expression of NOTCH1-2-3 in GCs and over expression
of the NOTCH ligands JAG1 and DLL3 in oocytes that
perfectly illustrate oocyte-GC crosstalk (Figure 5A) and
that may influence oocyte apoptosis, like in postnatal
mice [37]. In addition, we suggest that NOTCH is involved in GC proliferation [38] through NOTCH1/
CNTN1 binding (Figure 5B).
Vascular endothelial growth factor (VEGF) was already
known to promote early folliculogenesis [39]. In this
study, we identified over expression of members of
VEGF pathway including VEGFA and NRP1 (a VEGF receptor) in GCs, and over expression of FLT1 (another
VEGF receptor) in oocytes. These gene expressions suggest a role for the VEGF pathway in GC-oocyte and GCGC crosstalks (Figure 5C). As already described, the
VEGF pathway may protect GC against atresia [40].
The crucial role of the IGF system is largely described
during terminal follicular growth [41] but is poorly documented in preantral stages. Ovarian IGF1 production was
shown to vary with the species. IGF1 is mainly expressed
by GCs in rat and pig species [42] but its protein was also
detected in the oocyte of rat preantral follicles [43]. Moreover, the IGF1 transcript was not detected in adult sheep
[44] or cattle ovaries [42] but its receptor IGF1R was
expressed from primary follicles and its expression increased with follicular growth [44,45]. Our study provides
a precise description of members of the IGF system in
sheep species at preantral stages (IGF1-2, IGFBPs, IGF1R).
The IGF1 pathway (Figure 4) suggests a role for IGF1 in
oocytes and GCs in agreement with studies on mice. Indeed, although insulin/IGF signaling is not essential in oocyte conditional knockout mice [46], IGF-1 significantly
increases oocyte maturation [47]. In GCs, the expression
of IGFR1 and the over expression of the downstream signaling molecules IRS1 and AKT2 are also in agreement
with the involvement of IGF1 in the regulation of GC survival [48]. Additional immunohistochemistry to detect
IGF1 and IGF1R proteins and in vitro early follicle cultures could be used to evaluate the effect of IGF1 on sheep
preantral growth. In vitro early follicle cultures are described in Mochida et al [49].
Signaling pathways: Oocyte regulation of GC function
Numerous studies have shown that oocytes are potent
stimulators of GC proliferation. A compilation of
oocyte-secreted factors that regulate GC function was
published in 2008 [50]. Among these factors, we describe the over expression of FGF2 in sheep oocytes and
FGFR1-2-L1 receptors in GCs that may influence primordial follicle development in accordance with in vitro
goat and rat studies [51,52]. We also report the over expression of FGF16-20 in oocytes for the first time in
mammals. A recent study on Nile tilapia species suggests that FGF16-20 are involved in early oocyte development in the female [53]. In other mammal tissues,
FGF16 and FGF20 promote cell proliferation and
differentiation.
Physical interactions
Transzonal projections (TZP) are GC specialized extensions corresponding to long cell projections and microvilli that are in close contact with the surface of the
oolemma or invaginate the cortical area of the oocyte.
These projections establish communicative (gap junctions) and adhesive junctions (tight junctions) both with
the oocyte and neighboring transzonal projections. In
this study, we observed an enrichment of genes involved
in the formation of cellular protrusions in both GCs and
oocytes (Additional files 5 and 6). We confirmed over
expression of two gap junction genes that are indispensable for the regulation of folliculogenesis and oogenesis:
GJA1 (Cx43) in GCs and GJA4 (Cx37) in oocytes. Moreover in our study, ZP2-4 were seen to significantly increase during preantral stages as shown in human fetal
ovaries before the formation of zona pellicida [54].
Regulators
In the present experiment, we identified a set of upstream transcriptional regulators able to regulate follicle
gene expression and ovarian development.
In sheep oocytes, NOBOX, which is known to promote
follicular growth in mice, was detected in this study at
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medium expression level in preantral oocytes and was
predicted to increase gene expression of BMP15, DNMT1,
GDF9, H1FOO, MOS, ZAR1 genes [55]. Analysis of IPA
upstream regulators also predicted activation of AHR in
oocytes (Additional file 9). AHR protein may act on oocyte
gene expression through the receptor nuclear translocator
ARNTL2 over expressed in oocytes. These findings are
consistent with AHR regulation of follicular growth by affecting germ cell death during female gametogenesis [56].
In GCs, transcriptional regulators referred to sterol
regulation (SREBF1, SREBF2) hormone response (EGR1,
CREB, SKIL, ETS1), cellular growth (TP53, XBP1, MYC,
NFIA, HIF1A), cellular differentiation (MITF), and increased transcription (MYC, NFIA). Here we describe
for the first time, over expression of NFIA and HIF1A in
GCs of preantral follicles. NFIA is a transcription factor
involved in the control of cell growth in both humans
and model systems [57]. HIF1A is an ARNT interacting
protein that activates the transcription of target genes
involved in energy metabolism, angiogenesis, and apoptosis [58]. We were able to predict the regulation of 59
genes by HIF1A and we observed an increased in its expression during early folliculogenesis, assuming it plays
a role in preantral development.
Genes preferentially expressed according to cell type
Oocyte-specific genes and their role in folliculogenesis
have been extensively studied in murine knockout
models [59] but there is a relative paucity of information
concerning GC-specific genes. In this study, we completed existing data by highlighting the expression of
216 preferentially expressed genes (161 O + 55 GCs), including genes whose function in ovarian folliculogenesis
is unknown. Nevertheless, GCs exhibited fewer preferentially expressed genes than oocytes.
In GCs, the DEFB112 gene is described for the first
time as preferentially expressed. This gene is poorly documented but is reported to have a regionalized expression in the epididymis in rat and in human and to be
related to sperm maturation [60]. As already described
in sheep, the preferential expression of BMP1, which
promotes BMP signaling via chordinase activities [61],
was confirmed. Finally, the molecular chaperone TCP1,
which assists the folding of proteins upon ATP hydrolysis (such as actin and tubulin), was specifically detected
at a slight but constant level of expression during the
preantral stage. TCP1 appears to play a key role in the
cytodifferentiation of spermatids that relies on the high
plasticity of microtubules [62]. Our result may be associated to the remodeling of the microtubule cytoskeleton
during the change in cell shape.
In oocytes, we identified the preferential expression of
genes such as BTG4. Although much about the function
of BTG4 remains unknown, it is known to be involved
in cell cycle arrest and to be endowed with antiproliferative properties. In mice, its expression is restricted to the
olfactory epithelium, testis, and oocyte [63]. The role of
BTG4 during preantral stages in sheep requires further
investigation. Another gene of interest is PATL2, a RNAbinding protein (called P100) that was originally characterized as being oocyte specific in Xenopus laevis, where
it acts as a translational repressor in a CPEB-containing
complex [64]. In Xenopus laevis, PATL2 is maternally
expressed in immature oocytes, but disappears upon meiotic maturation. Some authors suggest that PATL2 plays a
role in regulating the translation of specific maternal
mRNAs required for the progression of Xenopus laevis oocyte maturation [65]. The expression of PATL2 has not yet
been documented in mammals; but here we describe for
the first time increased specific expression of this gene in
oocytes during preantral stages in sheep. In comparison
with the role of PATL2 in Xenopus laevis, our finding suggests it plays an important role in the regulation of the
translation in preantral oocytes in sheep. Finally, we identified over expression of MUSK in oocytes at preantral
stages. MUSK is a receptor tyrosine kinase (RTK) which is
induced during skeletal muscle differentiation, and is dramatically down-regulated in mature muscle [66].
This study highlighted involvement of new gene expression in early folliculogenesis. Further investigations
are underway to estimate the implication of these genes
in mammalian folliculogenesis.
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guidelines for research studies (animal experimentation authorization no 31–297, prefecture de la Haute
Garonne). As described in that study, the ovaries were removed from lambs at birth and embedded in O.C.T. embedding matrix, frozen in liquid nitrogen and stored at
−80°C until use. LCM capture was performed using the
Arcturus XT apparatus (Arcturus, Applied Biosystems®)
from eight-micrometer frozen sections that were stained
individually using Cresyl Violet.
Each follicle stage was selected as a function of follicular diameter under the microscope taking the observation of series of sections into account and according to
the classification of Lundy et al. [17]. Briefly, the following criteria were applied for the selection of the follicle
stage : i) primordial follicles (PD <35 μM) were defined
as an oocyte surrounded by 2–3 flattened GCs and
no cuboidal GCs, ii) primary follicles (PM: 35-50 μM)
were defined as a monolayer of cuboidal GCs whatever
the size of the oocyte, iii) secondary follicles (SC: 60120 μM) were defined as two layers of GCs and iv) small
antral follicles (SA: 250-500 μM) had a diameter of less
than 500 μm. The follicular compartments (i.e. granulosa
cells (GCs)) and oocytes (O) for each follicular stage
were collected in separate CapSure™ HS LCM caps (Arcturus, Ref LCM 0214), treated with 10–15 μl of extraction buffer from Picopure RNA Isolation kit (Arcturus,
ref: KIT0202) and stored at −80°C until use.
RNA extraction
Conclusions
This work generated a significant amount of expression data
that accurately document early folliculogenesis in sheep.
The abundance of expressed genes and the differential expression profiles found in oocytes confirm the hypothesis
that oocytes are dynamic cells. The decrease in the number
of expressed genes following the development of oocytes is
in accordance with a general decrease in transcription.
This study identified specific functions and molecular
mechanisms involved in each cell type during early folliculogenesis and in the dialog between the different cell
types. We confirm and incorporate a large number of individual studies in different species. Last, we highlight
new gene expressions that support and extend current
knowledge on early folliculogenesis.
This study is the first thorough, integrated overview of
the molecular mechanisms involved in early folliculogenesis in a mono-ovulating species. It provides a valuable
data base for future functional studies in mono-ovulating
species including humans.
Methods
Laser capture microdissection
Ovaries were sampled during the preliminary experiment
[12] which was conducted in compliance with institutional
As very few cells were captured per cap, each RNA LCMderived sample comprised pooled caps and was extracted
using the PicoPure RNA Isolation Kit according to the
manufacturer’s instructions, including on-column DNase
treatment (Qiagen, ref 79254, Courtaboeuf, France) [12].
Finally, RNA of three/four independent replicates was extracted per biological condition (O and GC compartment
from PD, PM, SC, SA stages).
The 13 tissue samples (fetal ovary, pituitary gland,
hypothalamus, muscle, skin, heart, lung, intestine, stomach, kidney, spleen, liver, and theca) were sampled in
triplicate at the local slaughterhouse (3 individual animals), frozen in liquid nitrogen and stored at −80°C until
RNA extraction. Total RNA was isolated using the
Nucleospin RNA II kit (Macherey-Nagel GmbH & Co,
ref 740 955 50, HOERDT, France). The 12 total RNA tissue samples (except fetal ovary) were pooled in three independent groups.
T7 linear amplification
A total of 31 RNA LCM-derived (3PDO, 4PMO, 4SCO,
4SAO, 4PDG, 4PMG, 4SCG and 4SAG) and three multitissue RNA samples were subjected to two rounds of T7
linear amplification using the RiboAmp®HS PLUS kit
(Arcturus, ref KIT0525), as previously described [12].
After in vitro transcription, the optical density of antisense RNA (aRNA) was measured at 260 and 280 nm.
The integrity of the aRNA samples was checked by the
Agilent Bioanalyzer 2100 with a RNA 6000 Nano Lab
Chip. To complete the check, we added four Bacillus
subtilis control transcripts with decreasing quantities
and transcript length (6.54 kb; 3.36 kb; 2.4 kb and
1.6 kb) (provided by Affymetrix, GeneChip Eukaryotic
Poly-A RNA Control Kit, ref 900433) to each LCMderived RNA and multi-tissue RNA sample before amplification (1 μl of 5*10-7 dilution). These control transcripts
represented internal controls of gene expression for the
experimental process.
Library preparation and massive parallel sequencing
All RNA-seq libraries were constructed from 200 ng of
aRNA using Illumina TruSeq RNA Sample Prep (Illumina,
San Diego, CA USA) according to the manufacturer’s
instructions (Additional file 1: Figure S1). Each biological
replicate was identified by a different index. Libraries
were quantified using the QPCR NGS Library Quant Kit
(Agilent). Three libraries were pooled and loaded randomly per lane at a concentration of 8 pM. The PDG4
library was loaded twice as a technical replicate (PDG4,
PDG4b). The 11 flow cell lanes were split into five runs
(four runs for LCM derived RNA samples and one run for
RNA multi-tissue samples). Sequencing was performed on
an Illumina HiSeq2000 using the Illumina TruSeq SBS kit
v2 (209 cycles including the index) to obtain paired-end
reads (2x100 bp). The quality of sequencing results was
summarized and plotted using the NG6 storage platform
(http://ng6.toulouse.inra.fr) [67].
Mapping strategy
The sheep genome sequence recently became available
in public databases but the 3′ UTR non-coding sequences of ovine genes were still poorly documented.
Due to the specificity of our data (enrichment of 3′UTR
non-coding sequences [68]), we evaluated two different
assembly strategies to maximize transcript identification
(Additional file 1: Figure S6A).
Genome strategy
For each sample, the reads were mapped with bwa aln to
the sheep genome sequence [69] (CSIRO Oarv2.0 released
March 2011: http://www.livestockgenomics.csiro.au/sheep/).
Bam files were filtered (keeping only reads in a proper pair
with mapq > 30) and converted into BED files. All BED files
were individually merged (overlapped genomic fragments
or which shared reads from same pair) and then grouped
before being merged to produce a collection of genomic
fragments. The number of reads per genomic fragment was
computed and only genomic fragments with more than 20
reads were kept to perform annotations.
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De novo transcriptome strategy
Reads were assembled per condition using SOAPdenovoTrans-31kmer. After each assembly, GapCloser was used
to resolve N-spacers introduced in the scaffolding process.
All contig files were thereafter concatenated and a metaassembly was performed using TGICL. All contigs and
singlets highlighted were used to create a reference to
map back all input reads. Bam files were filtered to keep
only reads in a proper pair with no more than four mismatches. A counting file was generated for each contig
and each condition using all count files.
Annotation strategy
In comparison to sheep, more gene annotations are available for cattle. In agreement with Jager [70], our preliminary analysis showed that the use of bovine transcripts for
the annotation substantially increased the number of
genes identified. Consequently, genomic fragments and de
novo contigs were aligned with the bovine genome sequence [71,72] (Ensembl Bos taurus UMD3.1) using Blat.
Blat results were filtered to keep only hits with genomic
fragment or contig coverage > = 80%, identity > = 90% and
best hit score 3 fold greater than other hits. Blat targets
(i.e. cattle slices) were crossed with the Ensembl Bos taurus
GTF file (Bos_taurus.UMD3.1.65.gtf). Iteratively, for Bos
taurus slices not linked to a described gene, we searched
for overlaps with downstream gene regions extended by
500 bp, 1 kb and 3 kb (Additional file 1: Figure S6B).
All the non-annotated genomic fragments and contigs
(not mapped to the bovine transcript) were discarded
from the data set. Finally, the annotated contigs (from
the de novo strategy) were mapped to the sheep genome
and contigs whose sequence was unknown in the public
sheep genome database were added to the final data set.
Dataset filtration
As a gene was represented by a mean of eight genomic
fragments (Additional file 1: Figure S8) and because
most of the RNA-seq reads are located at the end of the
genes (amplification bias), the genomic dataset was filtered to conserve only the best genomic fragment per
gene (the genomic fragment with the highest count and
the most 3′ UTR localization) with more than 20–30
reads per condition (20 reads for PDO in the three replicates and 30 reads for the other conditions in the four
replicates). This counting method was the most informative for this experiment and did not require gene length
normalization. This genomic data set was completed
with the annotated contigs from the de novo strategy
missing in the genome strategy data set.
Experimental validation
Increasing amounts of four Bacillus subtilis control transcripts were added to all LCM-derived RNA samples
before amplification to control the amplification and
RNA-seq processes. For each sample, the reads were
mapped with bwa aln on the 4 B. subtilis sequences. The
RPKM (reads per kilobase of exon per million) was computed for each control transcript. To make the samples
comparable for experimental validation, the amount of
each B. subtilis control transcript was calculated for each
sample in proportion to the highest one (DAP).
Statistical analysis
The significance of differential gene expression was determined using DESeq package for multifactor design [13] in
R software (R 2.14.0; DESeq release 1.6.1) (Additional file
1: Figure S6C). Our experimental design included 2 factors: stage (with 4 levels: PD, PM, SC and SA) and compartment (2 levels: O, GCs) with interactions. After
DESeq normalization, the best dispersion estimation of
our data set was obtained using the following arguments:
method ‘pooled’, sharingMode ‘fit-only’, fitType ‘local’. The
GLM method was then used to estimate the coefficient
and deviance for each gene. For inference, we specified
three models: the full model regressing gene expression
on both compartments and follicular stages and taking
interaction effects into account (count ~ stage*compartment), the additive model (count ~ stage + compartment)
and the reduced model (count ~ 1). We tested the effects
of the compartments, follicle stages, and their interactions
on gene expression using nbinomGLMTest. Differential
gene expression between compartments and differential
expression profiles between compartments (interaction effect) were selected with FDR < 0.5% (Benjamini-Hochberg
procedure) and a fold change >2. To establish the differential expression profile during early follicular development,
we selected genes whose intra-compartment variance was
differentially expressed in at least one of the stages (nbinomGLMTest). Thereafter, for each compartment, the
expression value of each gene at each follicle stage
was compared using pairwise comparison (nbinomTest).
Differential gene expression during early follicular development was selected with a FDR <5% for global ‘intracompartment’ effect (nbinomGLMTest) and pval <1% for
pairwise comparison (nbinomTest) with a fold change >2.
The most expressed genes in a specific compartment
(O, GCs) were identified using pairwise comparisons
with FDR <0.5% and a fold change >10 for the oocyte
compartment (O/GCs + MT) and >5 for GC compartment (GCs/O + MT).
Biological trends
Ingenuity® Pathway Analysis software (IPA; http://www.
ingenuity.com) was used to examine functional and molecular pathway enrichment for differentially expressed
genes based on Fisher’s exact test. This software combines functional annotations of differentially expressed
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genes (focus genes) and the corresponding bibliographic
data to generate significant signaling pathways and regulation networks. The biological analysis focused on the
list of differentially expressed genes. The Ingenuity Pathways Knowledge Base was used as the reference set.
Functional category analysis identified the functions in the
IPA library that were most significant to the input data set.
The significance of the association between the data set and
the functional category was determined by a P value calculated using Fischer’s exact test corrected for multiple testing
(p-value < 0.05; FDR < 0.05 (Benjamini-Hochberg test)).
Canonical pathway analysis identified the pathways in
the IPA library of canonical pathways that were most significant to the input data set. The significance of the association between the data set and the canonical pathway
was determined based on two parameters: (1) the ratio of
the number of genes from the data set that mapped to the
pathway divided by the total number of genes that mapped
to the canonical pathway and (2) a P value calculated using
Fischer’s exact test corrected for multiple testing to determine the probability that the association between the genes
in the data set and the canonical pathway is due to chance
alone (p-value < 0.05; FDR < 0.05-0.25 (FDR threshold
<0.25 is proposed as appropriate for enrichment gene sets
in BROAD GSEA analyses (http://www.broadinstitute.org/
gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.html). In these conditions, the result is likely to be valid 3 out of 4 times).
Downstream effects analysis was used to identify the expected effect of the observed change in gene expression on
the functions (expected to increase or decrease). This analysis examined genes in our data set that are known to
affect functions, compared the gene direction of change to
expectations derived from the literature, and provided a
prediction for each function based on the direction of
change (in the list of differential gene expression). IPA uses
the regulation z-score algorithm to make predictions.
In the same way, IPA upstream regulator analysis was
used to understand the cause of the observed change in
gene expression. This analysis identifies the cascade of
upstream transcriptional regulators (any molecules that
can affect the expression of other molecules) that can
explain the observed change in gene expression in the
dataset. The overlap pvalue measures statistically significant differences between genes in the data set and the
genes that are regulated by a transcriptional regulator.
The activator z-score infers the activation state to the
transcriptional regulator (activator z-score < −2 and >2).
Without identified bias, this z-score can always be used
as an independent test to call downstream regulators. A
bias means that the activation z-score and pvalue must
be used to call downstream regulators. The expression
and/or differential expression of the transcriptional regulator in the data set provides more evidence for the biological mechanism.
Combining oocyte and GC upstream effect/ regulator
analyses provided clues to the putative regulation involved in the oocyte-GC dialog.
Quantitative real time RT-PCR analysis for gene
expression
Gene primers were designed from RNA-seq sequences
(Additional file 10). The intron–exon organization of
ovine genes was deduced by comparison with the Human genome using the NCBI database. Gene primers
were designed preferentially in the 3′ UTR (last 1000
base pairs) or the last exon using LightCycler Probe Design2 software (Roche Diagnostics). The primer pairs
were confirmed by Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Sequences are available in Additional file 8.
The LCM-derived aRNA samples were reverse transcribed as previously described [12]. The resulting LCMderived cDNA samples were completed to 50 μl and
diluted 1/20 before PCR. The assay for each gene consisted
of four replicates per condition (except for PDO = 3) and
negative controls.
Total tissue RNA samples (2 μg) were reverse transcribed using Primer p(dT)15 for cDNA synthesis
(Roche Diagnostic, ref 10814270001, Meylan, France)
and 200 U of SuperScript II (Invitrogen, ref: 18064–014,
Cergy Pontoise, France) according to the manufacturer’s
instructions. The resulting tissue cDNA samples were
completed to 50 μl and diluted 1/50 before PCR. The
assay for each gene consisted of a pool of three independent replicates per tissue.
QPCR for compartment specific genes (17 genes) was
performed using 3 μl of the final dilution (~1.5 ng LCMderived cDNA samples (31 LCM-derived samples) and
2.4 ng tissue cDNA samples (12 tissue + fetal ovary)
using SYBR green fluorescence detection during amplification on an ABI Prism 7900 Sequence Detection System 2.1 (Applied Biosystems®) as previously described
[12]. The efficiency of real-time PCR amplification was
calculated for each primer pair using five serial dilution
points from an sheep fetal ovary cDNA sample (1:6
(~16 ng cDNA/point); 1:3; 1:3; 1:2; 1:2).
The expression of genes involved in canonical pathways (28 genes) was analyzed using 96.96 Dynamic
Array™ IFCs and the BioMark™ HD System from Fluidigm. Two specific target amplifications (STA) were performed on the 36 cDNA samples (31 LCM-derived
aRNA samples, 3 multi-tissue aRNA samples, a calibrator sample (pool of all the LCM-derived aRNA samples)
and a pool of cDNA from total fetal ovary RNA (for the
calculation of PCR amplification efficiency) in 96-well
PCR plates. A mix was prepared containing 132 μL 2X
TaqMan® PreAmp Master Mix plus (ref 4391128, Applied Biosystem) 26.4 μL 10X Preamplification Primer
Mix (500 nM each primer (for 60 genes + 2 reference
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genes (β-actin and TMED4)), and 3.75 μL of this mix
was added to each cDNA sample from aRNA (2 μl: 1 ng
cDNA) and fetal ovary cDNA pool (2 μl =11 ng). Following a brief vortex and centrifugation, the plate was
transferred to a thermal cycler and subjected to the following thermal protocol: 95°C for 10 min; 14/17 cycles
of (95°C for 15 s; 60°C for 4 min); 4°C hold. RLP19 gene
primers were not included in the STA Primer Mix. The
resulting STA cDNA samples were then treated with
Exonuclease I to digest the primers. A mix was prepared
containing 24 μL 20 units/μL Exonuclease I (M02935,
NEB), 12 μL 10 x Exonuclease I Reaction Buffer and
84 μL H2O. Two μL of this mix was added to 5 μl of
each STA cDNA sample. Following a brief vortex and
centrifugation, the plate was transferred to a thermal cycler and subjected to the following thermal protocol: 37°C
for 30 min; 80°C for 15 min; 4°C hold. 3.5 μl of each STA
cDNA sample were diluted by adding 9 μL buffer consisting of 10 mM Tris–HCl, pH 8.0; 0.1 mM EDTA (1/5 dilution) and stored at −20°C.
For the determination of the PCR amplification efficiency specific to each gene, the STA cDNA sample of
the fetal ovary cDNA pool (11 ng cDNA) was serial diluted (1, 1:3; 1:3; 1:2; 1:2).
In order to load the chip, a sample pre-mix and primer
pre-mix were prepared. The sample pre-mix consisted of
440 μL 2X Taqman Gene Expression Master Mix (ref
4369510, Applied Biosystem), 44 μL 20X DNA Binding
Dye Sample Loading Reagent (ref 100–0388, Applied Biosystem), 44 μl 20X EvaGreen (ref BI1790, Interchim) and
132 μL 1X TE. A 6 μL aliquot of this mix was dispensed to
each well of a 96-well assay plate. A 2 μL aliquot of diluted
STA cDNA samples (14 cycle STA cDNA samples and
17 cycle STA cDNA samples) was added to each well and
the assay plate was briefly vortexed and centrifuged. The
primer pre-mix consisted of 440 μl of 2X assay loading reagent and 110 μl of 1X TE and 6 μl of this mix was dispensed to each well of a 96-well primer plate. Aliquots
(2 μl, 20X) of individual primer assay were added to each
well and the primer plate was briefly vortexed and centrifuged. Following priming of the IFC in the IFC Controller
HX, 5 μL from each well of the 96-well assay plate (cDNA
sample + reagent mix) were dispensed to each sample inlet
of 96.96 IFC and 5 μL of each well of the 96-well primer
plate were dispensed to each detector inlet of the 96.96
IFC. After loading, the chip was transferred to the BioMark
HD and PCR was performed using the thermal protocol:
UNG and Hot Start at 50°C for 120 s; 95°C for 600 s, PCR
Cycles: 35 cycles of (95°C for 15 s; 60°C for 60 s) followed
by a melting phase. Data was analyzed using Fluidigm
Digital PCR Analysis software using the Linear (Derivative)
Baseline Correction Method, the User (Global) Ct Threshold Method with the threshold set at 0.01, and a Ct Range
of 12 to 25 cycles.
After determination of the threshold cycle (Ct) for
each LCM-derived aRNA sample, the PFAFFL method
was used to calculate the relative expression of each
gene [73]. The relative expression was normalized by
the corresponding geometric average of three reference genes using geNorm v3.4 [74]: β-actin, TMED4
and RPL19 genes, which were respectively slightly,
moderately and highly expressed and not regulated
during follicle development or between follicular
compartments.
The significance of compartment-specific and biomarkers differential gene expression was evaluated using
Student’s test after fourth square transformation.
The significance of the differential expression of genes
involved in canonical pathways was tested using the oneway ANOVA model in the R statistical software system
(the Comprehensive R Archive National, http://www.cran.
r-project.org) after fourth square transformation of the
data. For each gene, an ANOVA model was fitted, with
the 2 factor stage (4 levels) and compartment (2 levels)
with interactions. A backward variable selection procedure
was applied as previously described [12].
Data access
All the raw RNA-seq data have been deposited in [EMBLEBI ArrayExpress http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/ under
accession number E-MTAB-1587].
Additional files
Additional file 1: Supplemental Figures. This section includes 9
Supplemental Figures that illustrate the RNAseq design, bioinformatics
processes, validation, and signaling pathways.
Additional file 2: Supplemental Results and Discussion. This section
provides a detailed description of LCM, RNA-seq, expression level
preservation and reproducibility results followed by a comparative study
of gene expression in 5 previous studies.
Additional file 3: Differentially expressed genes (DEG) between
compartments.
Additional file 4: Gene expression of known genes. *: pval < 0.05; **:
pval <0.01; ***: pval < 0.005.
Additional file 5: Compartment specific gene analysis.
Additional file 6: Oocyte functional enrichment.
Additional file 7: CC functional enrichment.
Additional file 8: Transcriptional regulators. Ingenuity identified the
cascade of upstream transcriptional regulators that explain the observed
changes in gene expression in our data set. Pval is based on a significant
overlap between genes in our data set and known target regulated and
transcriptional regulators. The activator z-score infers the activation state
to the transcriptional regulator. Without identified bias, this z-score can
always be used as an independent test to select downstream regulators.
Bias means activation z-score and pval must be used to select
downstream regulators. The fold change column lists FC in the data set:
fold change =1 corresponds to a differential expression between compartments (>2); fold change ≠ 1 refers to the differential fold change during follicular development.
Additional file 9: Upstream regulator analysis.
Additional file 10: Primer sequences for real-time PCR.
Page 17 of 19
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
Authors’ contributions
AB conceived and designed the study, performed the LCM experiments,
analyzed the RNA-seq data, carried out the RT-PCR and statistical analyses,
and was responsible for much of the writing. OB, NM and JS performed RNA
sequencing. CC and SF carried out the RNA-seq bioinformatics analysis. FB
and FW helped obtain embedded ovary and staining sections. PM and BMP
contributed to the conception and design of the study, and were involved
in the drafting and revising the manuscript. All authors have read and
approved the final version of the manuscript.
Acknowledgements
We thank the Langlade INRA experimental farm that provided the lambs.
LCM was processed at FR3450 set, TRI platform Toulouse, Genopole (http://
tri.genotoul.fr/index.php?id=36). RNA sequencing was processed at the
genomic platform Toulouse, Genopole (http://genomique.genotoul.fr/). We
thank Katia Feve for her help with Fluidigm experiment. We thank our
colleagues at the Biochips platform Toulouse Genopole (http://biopuce.insatoulouse.fr/) for their help on this work.
This work was supported by an INRA “Bioressources 2010” grant.
Author details
1
INRA, UMR444 Génétique Cellulaire, Auzeville, BP52627, F-31326
Castanet-Tolosan, France. 2ENVT, UMR444, Laboratoire de Génétique
Cellulaire, F-31326 Castanet-Tolosan, France. 3INRA, SIGENAE, UR83
Recherches Avicoles, F-37380 Nouzilly, France. 4GeT-PlaGe, Genotoul, INRA
Auzeville, F31326 Castanet-tolosan, France. 5Université de Toulouse; INSA,
UPS, INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse, France. 6INRA,
UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400
Toulouse, France. 7CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France. 8INRA,
UMR1198 Biologie du Développement et de la Reproduction, F-78350
Jouy-en-Josas, France.
Received: 6 June 2013 Accepted: 10 December 2013
Published: 19 December 2013
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Cite this article as: Bonnet et al.: An overview of gene expression
dynamics during early ovarian folliculogenesis: specificity of follicular
compartments and bi-directional dialog. BMC Genomics 2013 14:904.
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Chapitre II. Description des transcriptomes dans chacun des deux compartiments ovariens : spécificités
fonctionnelles et dialogue moléculaire.
Supplemental File 1
This section includes nine Supplemental Figures that illustrate the RNAseq design, bioinformatics processes,
validation, and signaling pathways.
Figure S1: Experimental design
79
Figure S2: Genome-wide repartition of expressed genes
A) Number of expected vs. observed expressed genes during early folliculogenesis on chromosomes
based on the sheep genome Oarv2.0 build. The genes of chromosome 15 are significantly less
implicated in the follicular process (Fisher’s exact test P-value <5%).
Expected genes corresponded to 0.7865 (total expressed genes/total annotated genes (OarV2.0: 18656)
X the number of annotated genes per chromosome (from OarV2.0).
B) Distribution of expressed genes on chromosomes 1, 2, 10, 15, 23, X.
The number of genes derived from OarV2.0 data are in blue. The number of expressed genes is in red.
Y axis: Number of genes in the 1MB interval
X axis: Distribution along the chromosome using 1MB interval.
Figure S3: transcriptome overview
A-B) A dynamic range of gene expression:
X axis: cumulative distribution of the expression level per gene (RPM/gene: read average
/gene normalized by the total number of mapped reads per sample (expressed per million of
mapped reads))
Y axis: cumulative percentage of expressed genes
A: Gene expression in oocytes; B: Gene expression in granulosa cells
C-D) Complexity of transcriptomes
C: oocyte samples; D: Granulosa cell samples
Fraction of reads derived from the most highly expressed genes in the different conditions:
For example, the 10 most expressed genes in oocyte samples (C) aggregated an average of
4.4% of the reads.
X axis: Cumulative number of genes ranked from highest to lowest expressed genes
Y axis: Cumulative fraction of reads used.
Figure S4: RNA-seq and qPCR data comparison
R=0.92
Figure S5: Tight junction signaling pathway
Figure S6: workflow
A: Bioinformatic process:
Genome assembly. After mapping to sheep genome, the overlapping reads were merged and
the fragments assembled from each sample. Then, all samples were grouped and merged to
produce a collection of genomic fragments. Last, the number of reads per genomic fragment
was computed.
De novo assembly. Reads were assembled for each sample to generate contigs. All contig files
were thereafter concatenated and a meta-assembly was performed. All contigs and singlets
highlighted were used to create a reference and to generate a counting file for each sample.
B: Annotation process.
Genomic fragments and de novo contigs were aligned with the Bos taurus UMD3.1 genome
using Blat. Iteratively, for fragments or contigs not linked to a described gene, a search was
made for overlaps with downstream gene regions extended by 500bp, 1kb and 3kb. All the
non-annotated genomic fragments and contigs (not mapped to the bovine transcript) were
discarded from the data set. Final data set corresponds to the annotated genomic fragments.
Last, the annotated contigs (from the de novo assembly) were mapped to the sheep genome
and added to the final data set if they did not map to sheep genome (unknown sequences in
the public sheep genome database).
C: Statistical process.
The genomic data set was filtered to conserve only the best genomic fragment for each gene.
After experimental validation, the normalization and significance of differential gene
expression were determined using the DESeq package. Last, IPA was used to examine
functional meaning.
Figure S7: Example of distribution of reads in an annotated region (ZP4 gene)
Graphs represent from top to bottom:
- The sheep genomic location (OAR25),
- The number of total reads for each genomic fragment (y axis) identified in the dataset (blue
curve),
- Read coverage (log) and read alignment visualized by IGV software,
- Location of the ZP4 gene exons (in blue).
- Location of the genomic fragments identified by the bioinformatic workflow (red line).
The non-uniformity of the sequence coverage by the reads is clearly visible with the
maximum close to the 3’ UTR of the gene then a decrease towards the 5’.
Figure S8: Number of genomic fragments per gene
Figure S9: Level of gene expression preservation
For each condition (PDO, PMO, SCO, SAO, PDG, PMG, SCG, SAG, MT), each curve
represents the percentage of measured transcripts compared to the DAP transcript.
The Y axis corresponds to the % of each transcript compared to the DAP transcript.
The black curve represents the theoretical profile (deduced from Affymetrix RNA amounts).
The other colors represent the different replicates.
The profile of all the samples is similar to the theoretical profile with a correlation >0.94
except for SCG3 (0.86), SAG2 (0.8) and SAG3 (0.84).
Supplemental File 2
This section provides a detailed description of LCM, RNA-seq, expression level preservation and
reproducibility results followed by a comparative study of gene expression between 5 previous studies.
Supplemental results
Generation of compartment-specific samples using laser microdissection
To better understand transcriptome dynamics during early ovarian follicular development and
molecular cross-talk between oocyte and granulosa cells (GCs), we modified and optimized the Laser
Capture Microdissection (LCM) protocol [1]. We combined this technology with high throughput
sequencing (RNA-sequencing) to characterize the whole transcriptome. First, using LCM, GCs and
oocytes were captured separately at each stage of follicle development: primordial (PD), primary
(PM), secondary (SC) follicles and the small antral stage (SA). Three/four biological replicates were
obtained per condition. Due to the limited amount of total RNA generated with this procedure, LCMRNA samples were subjected to two rounds of linear RNA amplification to obtain the amount of RNA
required for Illumina cDNA library generation and QPCR validation. The experimental protocol is
illustrated in Supplemental Figure S1.
Generation of GCs and oocyte transcriptomes using RNA-sequencing
Three cDNA libraries per lane were sequenced using a Hiseq 2000 (Illumina) with a paired-end
protocol. In addition, three multi-tissue-RNA samples were amplified and sequenced to highlight
compartment specific transcripts (Supplemental Figure S1). We obtained around 2.647 billion 100 bp
reads with an average of 73.7 million per LCM-derived amplified-RNA sample (LCM-aRNA).
Because of the animal model (sheep), two assembly strategies (genome assembly and de novo
assembly) were evaluated to maximize transcript identification (Supplemental Figure S6A). The
genome strategy produced 381 600 genomic fragments. The de novo assembly produced 91 378
contigs and 185 845 singlets.
The genome strategy identified 10% more genes than the de novo transcriptome strategy and was
consequently used for further analysis. The result of the bioinformatics processing is summarized in
Figure 1.
Processing produced a collection of 382 933 fragments (381 600 genomic fragments and 1 333 de
novo contigs (genes from de novo strategy where the mRNA sequence was unknown in the public
sheep genome or absent from the genome strategy dataset) that aggregated 47.5% of the LCM-aRNA
reads. Last, the annotation strategy based on the bovine genomic sequence homology and annotation
search was extended to downstream regions of the genes (500 bp, 1 kb and 3 kb, Supplemental Figure
S6B) improved the read annotation by 8% and assigned 73% of the mapped reads. This strategy
revealed a longer 3’ untranslated region than available in the EMBL sequence database for at least
3 186 genes (from the final data set). A total of 221 716 genomic fragments remain unannotated.
The result of the assembly and annotation processes showed that the read distributed along the genes
clustered mostly towards the 3’ UTR ends and is illustrated with ZP4 gene in Supplemental Figure S7.
This 3’ bias was expected and reflects the RNA amplification that follows LCM [2, 3]. This bias
increased the heterogeneity of expression along the genes. A total of 86.8% of the annotated reads
were located in stop codon or 3’UTR regions, whereas only 5.5% were located in exons, 1.2% in start
codon or 5’UTR regions, and 6.5% in introns (Figure 1). As reported by Ameur and Teichert [3, 4],
the presence of intronic RNA might represent incompletely processed transcripts or alternative
splicing events. In addition, we observed that a gene was represented by a median number of eight
fragments (Supplemental Figures S7-8). Consequently, to quantify gene expression, the final dataset
conserved a single fragment per gene that located closest to the 3’UTR region with the highest number
of reads and aggregated 89.4% of the annotated LCM-aRNA reads (86.8% were located in 3’ UTR
regions and 2.6% were located in exons). For each sample, supplemental Table 1 (in Supplemental
Results and Discussion) summarizes the number of reads, fragments and genes identified during the
bioinformatic workflow.
The level of expression throughout the experiment (amplification, RNA-seq) was examined using a set
of 4 B. subtilis transcripts (Supplemental Figure S6C). Supplemental Figure S9 shows that the
expression profile of these transcripts was similar to the theoretical expression profile (derived from
the Affymetrix amount) for all the samples (correlation >0.8). As previously described [5, 6], the two
rounds of amplification and RNA-seq processes resulted in no significant distortion of the transcript
population. Finally, to evaluate the reproducibility of the RNA-seq measure, PDG4 was sequenced
twice (PDG4 and PDG4B). The two technical replicate files showed a good correlation (r=0.99) and
indicated that the transcript abundance measurement was reproducible.
Supplemental Discussion
Comparative studies of gene expression
This RNA-seq study documented the global expression of 15 349 genes in ovarian follicles during
early follicular development in sheep. Using this technology, we estimated a larger number of genes
expressed in oocytes (14 172 genes expressed in ¾ of replicates) than other microarray studies
performed on mouse and human during early follicular development. Pan et al. detected around 9 330
unigenes in PD, PM, SC and SA mouse oocytes [7] and Markholt et al. found a total of 6 301 unique
genes expressed in PD/PM human oocytes [8].
Compared to our preliminary study [1], we found that RNA-seq technology was better and more
sensitive for the study of basal folliculogenesis in sheep. In practice, microarray supports are often
poorly annotated, poorly oriented and incomplete for non-model species and do not enable the study of
complete processes like folliculogenesis [9]. On one hand, the bovine Affymetrix chip included 24 024
probes of which only 64% are annotated, corresponding to 12 404 unique genes. In addition, a great
number of known ovarian genes are not present on bovine Affymetrix chip (37% of the oocyte genes
and 47% of the GC genes already identified in four previous studies [1]). On the other hand, our RNAseq experiment identified the expression of 2.5 times more genes (14 561 genes in PD, PM and SC
samples compared to 5 909 genes in the Affymetrix experiment). This significant difference between
the two technologies can be attributed to more exhaustive detection combined with better detection by
RNA-seq of weakly expressed genes. Indeed, we identified a large number of genes with a lower
expression (the median expression was 140 RPM in a scale that ranged from 0.2 to 1 000 RPM).
Finally, RNA-seq detected an additional 20% of known mouse genes compared to the bovine
Affymetrix support. An increase of 22% in the number of genes detected by RNA-seq versus
Affymetrix chip was also mentioned with respect to human colon cancer by Xu et al. [10]. Sixty-six
percent of the specifically expressed genes reported in our preliminary sheep study using the bovine
Affymetrix chip [1] were detected by RNA-seq but only 23% of them were confirmed as differentially
expressed by DESeq (Supplemental Table 2: in supplemental Results and Discussion). Indeed, RNAseq statistical analysis described and accounted for the marked variation in biological replicates (3-4
biological replicates) and produced a more robust statistic (pval<0.5%) than previous microarray data
(without replicate).
Finally, our RNA-seq data recovered between 44% and 76% of the genes previously described in
studies of mouse oocytes/ Paillisson et al. [11], Pan et al [7] and Gallardo et al. [12], Arraztoa et al.
[13] (Supplemental Table 2: from supplemental Results and Discussion).
Supplemental Tables
Table 1 - Summary of bioinformatics data processing
The table summarizes the results of dataset processing in terms of the number of reads (columns 2-5)
and genomic fragments (columns 6-8) for:
1- Mapping against the ovine genome sequence and bovine genome sequence (for annotated
de novo contigs without ovine sequences)(columns 3 and 6),
2- The annotation using the bovine genome reference (columns 4 and 7)
3- The filtration process (columns 5 and 8)(see methods)
Each independent biological replicate is noted 1, 2, 3, or 4.
* corresponds to the number of expressed genes (see Methods: a single genomic fragment/ annotation)
Sample
Number of
reads
number of
mapped reads
number of
annotated
reads
number of
posttrimmed
reads
number of
fragments
number of
annotated
fragments
number of
post-trimmed
annotated
fragments*
PDO1
59107022
29491038
21909066
19631107
136856
66644
14239
PDO2
78712828
36565964
26131630
22729122
106849
52346
13455
PDO3
52507048
25887008
18696000
16543170
83224
41212
12545
PMO1
66533942
31717742
23153342
20776619
100956
50312
13417
PMO2
54853348
28382894
20326266
17842928
100424
48642
13237
PMO3
74817756
36443126
25827283
22727998
82386
39525
12267
PMO4
67907894
34265311
24841668
21911423
167705
77813
14504
SCO1
28458350
13823263
9943772
8772385
73667
37139
12227
SCO2
76037636
34143054
23995757
20995166
56313
29439
11590
SCO3
134799296
67472656
48449300
43076217
91600
45448
13181
SCO4
82581444
40182001
28964036
25669933
103392
50055
13261
SAO1
104296372
47013302
33675297
29846215
63058
33146
12037
SAO2
76471372
39081300
29148055
25856211
71998
38993
12038
SAO3
48871602
26189650
19199688
17002822
97704
48588
12919
SAO4
86505876
43520726
31963871
28382605
105008
52207
12984
PDG1
86604614
37224960
26966837
23901793
42206
24291
11131
PDG2
54018012
25413078
19392375
17696441
113951
59895
13841
PDG3
68940288
30094125
22381382
20121546
116789
61000
14153
PDG4
115879260
51665660
38470899
35310535
56959
30249
11905
PDG4bis 107046614
56024584
41736494
38332627
35454
21782
10890
PMG1
62812266
29252010
21649829
19295340
90234
47001
13230
PMG2
85018548
41612883
30941975
27962486
122106
63168
14126
PMG3
63606594
29225551
21444332
19192578
73164
39176
12762
PMG4
86011686
41612635
30220703
26903780
118362
57917
13789
SCG1
53898266
26460705
19580775
17755101
113648
58361
13784
SCG2
52965602
23645969
16876449
15337656
58372
33977
12293
SCG3
80019298
38465753
28445158
25718671
114032
59356
13778
SCG4
77829738
32695128
23602913
21414045
78404
43141
12848
SAG1
59971074
25976393
18723373
16636318
124343
68239
13967
SAG2
61153832
30256762
22904620
20571566
171387
86781
14614
SAG3
66867882
31460220
23000486
20452438
99503
56172
12912
SAG4
82098424
35892383
26382440
24039685
105829
57793
13268
MT1
101386238
45749122
33890909
29529526
75286
43735
12748
MT2
95179366
41085315
29208160
25055305
69103
40702
12761
MT3
93123920
41470348
29655324
25178294
74152
43671
12850
total
2646893308 1249462619
911700464
812169652
382933
161211
15349
Table 2 - Comparative studies of gene expression
Literature data:
1- Bonnet: Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular
development obtained by Laser Capture Microdissection (Affymetrix bovine chip)
2- Dadé: Differentially expressed genes in mouse oocytes compared to other tissues.
The selection was performed by in silico differential display between three mouse oocyte cDNA
libraries and 13 selected tissues cDNA libraries.
3- Gallardo: set of ovarian factors from mouse Foxo3 ovaries.
Gene classes were obtained by comparative profiling from Mouse Affymetrix data sets including
ovary RNA extracted at four time points spanning follicle assembly and early growth, and 14 somatic
tissues containing LCM primary oocytes and LCM somatic cells.
4- Pan: - The overall change in oocyte gene expression was characterized using Pd, Pm, Sec, SA and
antral mouse follicles.
- Mouse oocyte differentially expressed genes between primordial and primary follicular
stages.
5- Arraztoa: Primate oocyte-enriched transcripts between the microdissected primordial stage and
placenta RNA (control).
RNAseq Data
references
Experiment
in present
study
Bonnet [1]
Paillisson [7]
Gallardo [9]
species compartment
Sheep
Data
O/ GCs
O/GCs
GCs/O
DEG
detected
differential differential
number
gene
gene
gene
number
number
number
5130
2297
2832
oocyte
over expressed in
oocyte
759
505
102
63
GCs
over expressed in
GCs
1050
690
66
175
oocyte
enriched by In
silico DD
104
79
26
11
Class IA-follicle
assembly/meiosis
32
14
6
2
Class IC-oocytespecific, early
14
8
5
1
Sheep
Mouse
Mouse
oocyte
maturation only
somatic cells
Pan [8]
Mouse
oocyte
PD/PM
Arraztoa [10]
Monkey
oocyte PD
Class IB-oocytespecific, early,
and late
maturation
66
28
17
1
Class IIIUnfertized egg
84
46
11
12
Class ID-follicle
growth, somatic
24
21
0
13
over expressed in
oocyte
2578
1908
428
227
increase
197
125
18
6
decrease
213
121
13
6
enriched/placenta
79
36
4
9
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Supplemental File 4: Gene expression of known genes
*: pval<0.05; **: pval <0.01; ***: pval<0.005
genename
AMH
AMHR2
BMP15
BMP4
BMP7
GDF9
DDX4
KIT
KITLG
WNT4
WISP1
FSHR
FGF2
FGF7
INHA
FST
NOBOX
H1foo
DAZL
GATA4
NLRP5
NLRP9
NLRP13
NLRP14
GJA1
GJA4
MAEL
SOHLH1
SOHLH2
FOXL2
OOSP1
AURKA
AURKB
AURKC
FIGLA
BOLL
WEE2
FBXW7
FBXW8
pval
***
***
***
NS
*
***
***
***
***
***
***
***
***
NS
***
***
***
***
***
***
***
**
***
***
***
***
***
***
***
***
*
***
NS
***
***
***
***
***
***
foldchange
O/GCs
0.0081
GCs/O
123.69
0.00
15.32
0.065
0.72
1.39
2.28
0.44
4.61
0.22
11.47
0.087
2.24
0.45
0.266
3.77
0.078
12.74
0.23
4.43
0.0081
127.17
3.94
0.25
0.737144137638324 1.36
0.012
86.77
0.038
26.38
2.6
0.38
3.46
0.29
2.00
0.50
0.232
4.32
8.01
0.12
10.88
0.092
14.60
0.068
6.23
0.16
0.12
8.54
20.84
0.048
3.255
0.31
1.71
0.58
2.91
0.34
0.159
6.29
4.48
0.22
2.33
0.43
0.67
1.49
4.83
0.21
3.58
0.28
7.22
0.14
32.49
0.031
2.11
0.47
2.00
0.50
Supplemental File 10: Primer sequences for real-time PCR
gene
IGF1
INSL3
IGF1 R
GJA4
GJA1
JAG1
PIK3R3
KITLG
KIT
PARVA
GATA2
AMHR2
MAEL
MUSK
WEE2
SPO11
GAPT
GABRP
MCF2L
Sequence reference
Primer
ARN
(OARV2 genomic
sequence
location
location)
location
Up 593,
OAR3:1709949123' UTR Down
171001871
706
Up 59,
5159866
191
Up65,
7107814
187
Up 692,
9416358
801
Up 320,
16966101
431
Up 357,
3403964
477
Up 59,
20274794
191
Up 49,
EWZ7IHI02DESHV 3' UTR Down
198
Up 105,
E0FD4S101C5L19
Down
207
Up
OAR15:400716641419,
3' UTR
40074907
Down
1526
Up 159,
EE762537
Down
261
Up 283,
132852079
382
Up 192,
exon
CU653136
Down
10-12
310
Up 259,
12674127
374
Uo 816,
OAR4:104194933- exon 5Down
104196092
6
1033
UP 630,
58173549
748
Up 745,
21054051
878
Up 517,
OAR16:2792484Down
2793152
618
OAR10:83074041exon
Up 8,
83074322
18
Down
Up primer
Down primer
sequence
length
CATTAGGATCGATATTCCTCTGC
TGACTGGTCATTCATTATATCTGTCT
114
GACAGGAGATGACGGGAAA
GGTGCAATCCAGTGCTTT
133
GTCCACGTGCCAGTCTC
CTGTTGTGGTGTTGGGATTG
120
GGCTTTGTCCCAAGCATG
GGGTAAGTTGTCTCCGAATCC
110
CAGAACACATGATCGATGGAC
ATGAAGAGTTACAATGAGAAATGCTA
112
TCTGGGAGGGGTTTCAAG
CCTGGGTCTGTCTGGTGA
121
GACAGGAGATGACGGGAAA
GGTGCAATCCAGTGCTTT
133
CACAGGATAACTTTGAGTGC
TGTGTATGTGTATGTACTGTAAGTGT
150
AACTACACCTTGTGGGTTCC
AGCTGAATTGGAGAGATGG
103
TGTATTACGGAATCACTTTGCTGT
GGCTAAATTGGAAGGACCAGATA
108
AAATACTGCCGATCCTTCT
AGAGGACTGTGCTGATG
102
GTCCAGGTAGGTTGAGGATTTC
TCCTCCCGTCTGCCATT
100
CAAACACACCCACTGGTGAC
GTATCCGTGTTTTGGGGATG
179
TTCTCTTTCCCGTTTATTTGCTT
TTCCCAGTGGAGTCCATACA
116
GCTGATTGGTTTCTCTCTGC
CTCTTCCACTTTGGGATTGC
88
GAACATTTGTCCTTTGCACAAC
CAAACTAAAATTTGGTGGGTGGAT
119
GCAGGAGCTGGTTCTCAGATA
AGCATCACTGGTGGTTCG
134
GAGGTGGATGCCACTGTATG
CAAAAATTAATGCTTGACTAGAGTTT
101
TGGAGACCTACACGGACTG
GCTTTAAGGAGCAGCTTCG
114
121
ST8SIA3
OAR23:5721760957218888
exon
TNIP3
OAR6:45267364527280
3' UTR
IFNE
OAR2:8974508989746281
SPEF2
OAR16:3867694138677774
DEFB112
OAR20:2260647122608526
3' UTR
TCF23
OAR3:3379403333795108
3' UTR
TLL2
OAR22:1699187116995168
EFS
OAR7:2121859321219292
3' UTR
WNT4
OAR2:244678863244679555
3' UTR
HTRIF
OAR1:154599556154600464
exon
ITIH5
CL27200Contig1
exons
1-3
TMEM16
7A
OAR4:112054095112054903
3' UTR
Up 787,
Down
929
Up 102,
Down
225
Up 586,
Down
714
Up 166,
Down
303
Up 376,
Down
509
Up 408,
Down
519
Up 293,
Down
407
Up 440,
Down
550
Up 567,
Down
666
Up721,
Down
823
Up 110,
Down
216
Up 322,
Down
429
GGATTGGACAACTGATGCACTA
CCCGCTATTTCCAACCAC
143
AGTCAGCAACGCCTGCTA
AACTGGACTATGGCTCGTTT
124
CTGCAAACTGCTTATTCATGTC
GCTAGCAACAATGAGAAATATTAGG
129
AGGACAACAGCCAAATCCA
CCACAGGAACATGCTTGTCTTA
111
GGACACAACTTACAAAGCAGACT
CCATGTTATTCCATATCTCACTCC
134
TCTTGGCAGCTGTGAGTGTA
GAAGTCGGGTGAGCATCTT
112
AACAATGACAACACCACGAA
GCTCAACCTGGTTACATCATT
115
CCTCAATAAACCGGGCTTTC
CACAAACCCTAAAGGCAGAC
111
AGCTCTGGATGCTGCTACC
TGCACCAGACTATTTCATGAGG
100
TCTCAATTCCCTTATAAACCCACT
AACTTCTTTGAACTAACATCGACATC
103
TTCTCGGTGAAATCTACCATCAT
ATCTGCATCTGAAACGTGAC
107
CTGAGTCTTGAAACCAGCATCT
CTCAGCGGTGAGTACAACTT
108
Chapitre III. Profils d’expression spatio temporel de la folliculogenèse basale : Prédiction des
processus biologiques et ses régulations
Chapitre III. rofils d’e pression spatio temporel de
la folliculogenèse basale : rédiction des processus
biologiques et ses régulations
Si les études globales d’expression décrivant le développement tardif de la folliculogenèse
sont nombreuses chez l’homme et la souris, elles le sont beaucoup moins pour le
développement
précoce.
Quelques
études
se
sont
focalisées
sur
la
transition
primordial/primaire du développement ovarien (Kezele et al. 2005; Dharma et al. 2009) ou
des ovocytes (Markholt et al. 2012) mais seulement deux études ont été menées de manière
plus précise sur le développement précoce. Elles concernent le développement de l’ovocyte
(Pan et al. 2005) et le follicule entier (Yoon et al. 2006) (voir objectif de la thèse). Aucune
étude à ce jour ne décrit les différentes étapes de folliculogenèse dans les deux compartiments
folliculaires.
L’objectif de ce chapitre est donc d’identifier les gènes impliqués dans le développement
folliculaire précoce de la brebis et de mettre en évidence les processus moléculaires et
facteurs importants et des « biomarqueurs » de la croissance folliculaire précoce.
Les résultats obtenus sont en cours de rédaction en vue d'une publication :
Spatio temporal
gene
expression
profiling
during
earl
ovarian
folliculogenesis predicted biological processes and regulations
80
Résultats
1.
ésultats
1.1
Différentielsd’expressionaucoursdudéveloppement
folliculaire
L’analyse statistique globale a été effectuée pour chaque compartiment folliculaire à partir du
fichier d’expression des 15 349 gènes. Elle révèle une différence d’expression globale au
cours du développement folliculaire pour 19,6% des gènes (3015 GDE (FDR<5%)). Une
classification hiérarchique non supervisée des GDE montre une bonne séparation des
compartiments et décrit une dynamique d’expression pour les deux compartiments (Article 3,
Figure 1).
Les changements d’expression globaux sont plus importants dans l’ovocyte que dans les CG
(2173/1192 gènes). La majorité de GDE des CG a une expression qui diminue pendant le
développement folliculaire précoce alors que le nombre de gènes sous ou sur exprimés est
équivalent dans les ovocytes (Article 3, Table1).
Chez la brebis et dans nos conditions expérimentales, peu de différences d’expression sont
observées pendant la transition PD-PM (Article 3, Figure 2A et B). Dans l’ovocyte, les
changements d’expression les plus importants commencent à la transition du follicule
primaire à secondaire où 74% des GDE sont sous exprimés Le nombre de GDE se maintient
ensuite pendant la transition SC-SA (Article 3, Figure 2A). Par contre, dans les CG, les
changements d’expression se situent essentiellement pendant la transition PM-SC où 67 %
des gènes sont sous exprimés (Article 3, Figure 2B). Le nombre de GDE chute ensuite
pendant la transition SC-SA (55 GDE). (Article 3, Figure 2A et B).
1.2
Analysefonctionnelleglobaledesfonctionsetvoiesde
signalisation
Pour rechercher les fonctions biologiques associées au développement précoce nous avons
créé six listes de GDE en tenant compte des analyses statistiques par paire, soit PMO/ PDO ;
SCO/ PMO+PDO ; SAO/SCO+PMO+PDO pour l’ovocyte et de la même manière
PMG/PDG ; SCG/PMG+PDG ; SAG/SCG+PMG+PDG pour les cellules de granulosa.
a. Les fonctions
L’analyse fonctionnelle effectuée par IPA met en évidence un changement important dans les
fonctions ovocytaires au stade secondaire par rapport à PM et PD, alors que pour les cellules
de granulosa ce changement est moins drastique (Article 3, Supplemental File 2, Figure S1)
81
Résultats
(FRD<5%)). IPA identifie 11 catégories fonctionnelles majeures enrichies en GDE
(FDR<5%) (Article 3, Figure 3).
Dans les cellules de granulosa, les catégories relatives aux protéines (synthèse, dégradation et
transport), ainsi que celle « production d’énergie » sont particulièrement enrichies en gènes
(SCD
(stearoyl-CoA
desaturase
(delta-9-desaturase)),
BDH2
(3-hydroxybutyrate
dehydrogenase, type 2), CPT (carnitine palmitoyltransferase)). Les catégories relatives aux
protéines sont nettement enrichies en GDE aux stades secondaires par rapport aux autres
stades (PD/PM).
b. Les mécanismes
Différents mécanismes sont préférentiellement enrichis en GDE dès la transition
primaire/secondaire et sont présentés ci-dessous :
Dans l’ovocyte (Article 3, Supplemental File 2, Figure S2), IPA identifie un enrichissement
spécifique en gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire (« cyclins and cell cycle
regulation »), la méthylation de l’ADN et la répression transcriptionnelle (DNMT3B (DNA
methyltransferase 3B), RBBP7 (retinoblastoma binding protein 7), DNMT1 (DNA
methyltransferase (cytosine-5) 1), la signalisation ATM et les hormones stéroïdes
(œstrogènes).
D’autres mécanismes comme :
- la transmission des signaux (« axonal guidance », « ephrin receptor signaling »),
- les mécanismes d’endocytose (« Caveolar-mediated Endocytosis Signaling »),
- et la réponse au stress et aux cytokines (« eNOS », « IL8 and interferon signaling »)
sont également enrichis en DGE (Article 3, Supplemental File 3).
Enfin, différentes voies de signalisation sont enrichies en GDE (Article 3, Figure 4) pendant
la croissance pré-antrale (NF-KB (Nfkb1 : nuclear factor of kappa light polypeptide gene
enhancer in B cells 1, p105), ERK/MAPK (mitogen-activated protein kinase 1), RhoGDI (Rho
GDP dissociation inhibitor (GDI)), BMP et FGF). Une vue globale des GDE, composants des
voies de signalisation BMP est présentée Figure 5 de l’Article 3.
Dans les cellules de granulosa, les GDE regroupent aussi des gènes impliqués dans les voies
de signalisation des protéines G couplées aux récepteurs et mTOR. Ils confirment
l’enrichissement en gènes des voies de signalisation G12/13, PKA, Rho GTPase et WNT
mis en évidence dans l’Article 2 (Article3, Figure 4).
82
Résultats
1.3
Validationdudifférentield’expressionparRTPCRen
tempsréel
L’expression différentielle de 21 gènes impliqués dans les voies de signalisation a été
recherchée par RT-PCR en temps réel et 17 d’entre eux ont été validés statistiquement
(Article 3, Table 2).
1.4
Prédictiondesconséquencesduchangement
d’expression:processusbiologiquesmisenœuvre
L’analyse IPA « Downstream Effects Analysis » a été utilisée pour prédire les conséquences
des changements d’expression sur les processus biologiques (Article 3, Figure 6).
a.
ans l’o ocyte
Le « contrôle de la méiose » est augmenté pendant la transition du follicule primordial à
primaire. Ce contrôle implique les gènes AURKA (aurora kinase A), BTRC (beta-transducin
repeat containing E3 ubiquitin protein ligase), CDC25B (cell division cycle 25B), CPEB1
(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1), DDX4, EXO1 (exonuclease 1),
FANCL (Fanconi anemia, complementation group L), HSPA2 (heat shock 70kDa protein 2),
KIT, MAEL (maelstrom), PDE3A (phosphodiesterase 3A cGMP-inhibited), RPS6KA3
(ribosomal protein S6 kinase, 90kDa, polypeptide 3), SMC1B structural maintenance of
chromosomes 1B), TEX12 (testis expressed gene 12) (Article 3, Figure 6A). Enfin, 37 GDE,
connus pour avoir un rôle important dans la fertilité (GDF9, BMP15, SOHLH2, FIGLA …)
seraient également impliqués dans la transition PD-PM.
b.
ans les cellules de granulosa
L'analyse IPA prédit une activation de la prolifération et de la différenciation à tous les stades
du développement folliculaire précoce (Article 3 ; Figure 6A).
Elle prédit aussi l’inhibition ou l’activation de processus spécifiques au cours de la croissance
folliculaire précoce (Article 3, Figure 6A) :
- une inhibition de l’atrésie,
- une augmentation de la phosphorylation des protéines,
- et une augmentation de la synthèse de stéroïdes.
a. Les communications
L’accroissement des communications physiques et moléculaires entre ovocyte et CG est
prédit dès la transition PD-PM du follicule.
83
Résultats
Dans les CG, l’analyse par IPA des GDE prédit une augmentation de la formation de
microvillosités au stade primaire (« tubulation » : 25 gènes COL1A1 (collagen, type I, alpha
1), VIM, CAV1 (caveolin 1, caveolae protein), ITGB (Cdkn1a cyclin-dependent kinase
inhibitor 1A (P21)), S1PR1 (sphingosine-1-phosphate receptor 1), ALCAM (activated
leukocyte cell adhesion molecule)…) et une augmentation des projections cytoplasmiques
(regroupe 2 catégories de 79 et 97 gènes : GJA1, KITLG, NOTCH1, ROBO1 (roundabout
homolog 1, Drosophila), SLIT2 (slit homolog 2, Drosophila), WINT3A, MET…) et des
déformations cellulaires (2 catégories de 128 et 168 gènes : ROR1 et 2 (receptor tyrosine
kinase-like orphan receptor 2), FGF1 et 13,
STMN2 (stathmin-like 2), DPYSL2 (dihydropyrimidinase-like 2), SEMA3D (sema domain,
immunoglobulin domain (Ig), short basic domain, secreted, (semaphorin) 3D), ICAM5
(intercellular adhesion molecule 5, telencephalin)…) pendant toute la période basale.
Dans l’ovocyte, seul le phénomène de déformations cellulaires semble s’amplifier pendant la
période PD-SC (2 catégories de 70 et 121 gènes : KIT, LIFR (leukemia inhibitory factor
receptor alpha), FIGF (c-fos induced growth factor) …).
L’activation de la signalisation entre les compartiments cellulaires est aussi un mécanisme
attendu pendant la transition du follicule primordial au follicule primaire dans les CG
(« activation of cell », 156 gènes) et dans l’ovocyte (« neurotransmission », 46 gènes) (Article
3, Figure 6B).
1.5
Prédictiondescausesduchangementd’expression:
régulationspendantledéveloppementprécoce
Le module « IPA upstream regulator analysis » a été utilisé pour identifier des régulateurs
potentiellement responsables du changement d’expression des gènes. Il prédit également un
état et un niveau d’activation de ces régulateurs (au niveau protéique).
a.
acteurs de croissance et hormones
L’analyse par IPA du différentiel d’expression au cours du développement folliculaire
précoce permet de prédire l’effet de certains facteurs de croissance : EGF, PDGF et TNF
(tumor necrosis factor) (Article 2, annexe 2, Figure S3A). Ces résultats sont appuyés par
l’expression des récepteurs correspondants (Article 2, annexe 2, Figure S3B). Par exemple,
IPA prédit une activation de la protéine PDGFC dans les CG et nous observons une
augmentation de l’expression de PDGFC et des récepteurs PDGFRA et PDGFRB dans les
CG. IPA prédit également l’inhibition de PDGFC dans l’ovocyte qui peut être associé à une
84
Résultats
diminution de l’expression des récepteurs dans l’ovocyte. La protéine BMPER a une activité
prédite accrue dans l’ovocyte au stade secondaire et EGF a une activité prédite accrue dès le
stade secondaire.
Enfin, IPA prédit une action accrue des hormones stéroïdes, telles que l’œstradiol, sur
l’ovocyte et les cellules de granulosa (Article 3, Annexe 2, Figure S4).
b.
écanismes
En complément de l’étude précédente, nous mettons en évidence une activation maximale des
voies de signalisation SHH et WNT dans les cellules de granulosa pendant la transition PDPM suivie d’une diminution de cette activation dans les stades suivants. (Article 3, Annexe 2,
Figure S5).
Dans notre étude, le profil d’expression des antagonistes de WNT tels que DKK1, WIF1 et
SFRP est précisément décrit et varie en fonction du compartiment et du stade de
développement précoce (Article 3, Figure 7A et B). En particulier, l’expression de DKK1
augmente au cours de la croissance ovocytaire et sa protéine est identifiée comme un
régulateur potentiel dans CG. Il est, en effet, le régulateur de 10 gènes cibles de notre liste de
GDE somatiques comprenant WNT5A.
c.
égulateurs transcriptionnels
21 régulateurs transcriptionnels sont susceptibles d’être impliqués dans les changements
d’expression mis en évidence au cours du développement folliculaire précoce (p value <5% et
2< z score >2).
Les gènes codant pour ces régulateurs potentiels sont soit très exprimés dans l’un des deux
compartiments (19 régulateurs « cellules spécifiques »), soit avec une expression qui varie au
cours du développement folliculaire précoce (deux régulateurs « stades spécifiques » : 1 dans
l’ovocyte and 1 dans les CG) (Article 3, Table 4).
Les 19 régulateurs potentiels, dont les gènes sont surexprimés dans un des deux
compartiments (3 régulateurs dans l’O et 16 dans les CG), présentent une activation accrue de
leur protéine qui dépend du stade de développement folliculaire :
- dès le stade primaire (8 régulateurs : EGR1 (early growth response 1), XBP1 (X-box binding
protein 1), SOX10 (SRY-box containing gene 10 : ovocyte)…),
- dès le stade secondaire (six régulateurs : FOXL2, NOBOX (ovocyte), SOX9, E2F1
(E2F transcription factor 1 (ovocyte…)
- et enfin au stade petit antrum (cinq régulateurs : ETS2 (v-ets avian erythroblastosis
85
Résultats
virus E26 oncogene homolog 2), SRF (serum response factor (c-fos serum response elementbinding transcription factor)), MITF (microphthalmia-associated transcription factor), NFIA
(nuclear factor I/A), SREBF2 (sterol regulatory element binding transcription factor 2).
La prédiction de l’état d’activation des protéines NOBOX dans l’ovocyte et de FOXL2 dans
les CG, est, par exemple, illustrée Figure 8A et 8B (au stade SA).
NOBOX est connu chez la souris pour activer l’expression des gènes BMP15, DNMT1,
GDF9, H1FOO (H1 histone family, member O, oocyte-specific), MOS (Moloney sarcoma
oncogene), ZAR1 zygote arrest 1) dans l’ovocyte (Rajkovic et al. 2004). Dans notre
expérience, ces gènes sont surexprimés au stade SC et SA (Article 3, Figure 7A, gènes en
rouge). Nos résultats sont en accord avec ceux décrit par Rajkovic et ses collaborateurs
(Rajkovic et al. 2004), IPA prédit donc une activation de l’expression de chacun ces gènes par
NOBOX dans notre expérience (Figure 7A flèches rouges).
a protéine
a une
activité prédite globale accrue au stade SC et S par rapport aux autres stades
et ou SC .
Dans la littérature, la protéine FOXL2 stimule l’expression de FST, NR5A2 …. Elle inhibe
celle de GDF9 et CYP26B1 (Pisarska et al. 2011; Caburet et al. 2012). Notre expérience
identifie le même sens de changement d’expression dans les CG au stade SA et IPA prédit
une activation (FST, NR5A2 (nuclear receptor subfamily 5, group A, member 2)…) ou une
inhibition (GDF9, CYP26B1) de l’expression de ces gènes par FOXL2 (trait bleu).
prédit donc une activation globale accrue de la protéine F
les C
par rapport aux stades
rticle 3 Figure
au stade SC et S
dans
et ou SC .
Les 2 régulateurs transcriptionnels potentiels dont l’expression est régulée au cours du
développement folliculaire précoce ont leur protéine potentiellement activée ou inhibée pour
un stade de développement donné (Article3, Table 4).
- l’activité protéique est accrue et les quantités d’ARNm augmentent au cours du
développement folliculaire (HIF1A (hypoxia inducible factor 1, alpha subunit (basic helixloop-helix transcription factor)) : activation prédite dans les CG à partir du stade SC, Table 4)
- l’activité protéique est inhibée et les quantités d’ARNm diminuent au cours du
développement folliculaire. C’est le cas de KLF9 (Kruppel-like factor 9) (expression inhibée
dans l’ovocyte et activité protéique inhibée au stade SA) (Article 3, Figure 7C). Dans la
littérature, la protéine KLF9 active l’expression de Ccnd1 (cycline D1) et Col1a1 et inhibe
celle de Calb2 (calbindin 2) et Ghr (growth hormone receptor). Dans notre expérience, nous
observons les effets contraires au niveau de l’expression de ces messagers. IPA prédit donc
86
Conclusion
une inhibition de l’activité protéique.
1.6
Latransitionfolliculeprimaire/folliculesecondaire
Pendant cette transition, les GDE peuvent être associés aux mécanismes de jonctions
cellulaires (Article 3, Table 5) et de dialogue moléculaire.
Dans l’ovocyte, les voies de signalisation AHR, intégrines et PTEN sont statistiquement
enrichies en gènes. Dans CG, les voies de signalisation identifiées correspondent à RHO GDI
(Rho GDP dissociation inhibitor (GDI)), RHO GTPase et mTOR.
Cinq gènes ovocytaires codant pour des régulateurs transciptionnels potentiels ont une
expression qui diminue et l’activité de leur protéine inhibée pendant cette transition PM/SC
(EDN1 (endothelin 1), BCL2, MET, TGFBR2 (transforming growth factor, beta receptor II),
ETS1 (E26 avian leukemia oncogene 1, 5' domain)). Aucun régulateur caractéristique du
passage du follicule primaire en secondaire n’a été identifié dans les cellules de granulosa.
1.7
Desmarqueursdelacroissancefolliculaireprécoce
Différents protocoles ont été développés chez les espèces mammifères de rente (brebis, buffle,
vache…) pour mener des études fonctionnelles in vitro ou évaluer des protocoles de
cryoconservation de cortex ovarien. Il est important pour ces études de pouvoir disposer de
marqueurs de la croissance folliculaire in vivo. Dans cet optique, nous avons effectué des
comparaisons par paire (voir méthodes) et sélectionné 29 gènes à expression enrichie. Ce jeu
de biomarqueurs moléculaire permet de séparer les différents stades de développement
(Article 3, Figure 9A).
Le différentiel d’expression de 24 de ces marqueurs a été validé par analyse statistique après
quantification par RT-PCR en temps réel (Article 3, Table 5). La classification des
échantillons est similaire à celle obtenue avec les données de RNA-seq (Article 3, Figure 9B).
. Conclusion
Cette étude in vivo montre que, dans des ovaires de brebis à la naissance, le transcriptome issu
des différents compartiments ovariens varie au cours du développement avec des variations
plus marquées lors de la transition du follicule primaire au secondaire.
L’analyse fonctionnelle in silico des gènes différentiels, effectuée par comparaison avec les
données bibliographiques, suggère les conclusions suivantes :
87
Conclusion
¾ Au cours de la transition du follicule primordial en primaire les gènes
différentiels ovocytaires sont impliqués dans le contrôle de la méiose et dans le contrôle de la
prolificité. Le contact et le dialogue moléculaire entre les deux compartiments se mettent en
place. Des voies de signalisation comme SSH et WNT dans les cellules de granulosa et la voie
de signalisation des œstrogènes dans l’ovocyte sont activées.
¾ La progression de la croissance du follicule primaire à secondaire est associée à
des changements importants dans des fonctions biologiques des CG (« métabolisme
protéique » et « production d’énergie») et de l’ovocyte (régulations du « cycle cellulaire » et
« transcriptionnelle »). Des voies de signalisation s’enrichissent en gènes différentiels :
- RhoGDI dans l’ovocyte
- Rho GTPase, mTOR et WNT dans les CG.
¾ Dans le follicule à petit antrum, des voies de signalisation (NF-KB, BMP et
FGF) sont enrichies en gènes différentiels et sont activées dans l’ovocyte.
Enfin, PDGFC et WNT sont potentiellement impliqués dans les transitions entre stades.
Vingt et un régulateurs transcriptionnels sont identifiés comme potentiellement la cause des
changements d’expression et susceptibles de jouer un rôle important dans la croissance
folliculaire précoce.
Enfin, un jeu de 25 gènes, marqueurs de la croissance folliculaire précoce, a été obtenu et
pourra être utilisé comme base de référence in vivo de la folliculogenèse basale.
Cette étude améliore notre compréhension des mécanismes mis en œuvre dans la
folliculogenèse basale. Elle décrit précisément le profil d’expression in vivo des gènes
impliqués dans différents mécanismes et fonctions qui ont été le plus souvent étudiés in vitro
et étudiés plutôt au cours du stade antral chez la brebis. Elle propose une implication nouvelle
de gènes. Des expériences supplémentaires devront cependant être menées pour compléter ces
résultats.
88
Article 3
3.
rticle 3
n cours de rédaction
Spatio temporal
folliculogenesis
gene
net or
expression
profiling
anal sis predicted
during
earl
ovarian
iological processes and
regulations
89
Spatio-temporal gene expression profiling during early
ovarian folliculogenesis: predicted biological processes
and regulations
Agnes Bonnet 1,2§,,Bertrand Servin1,2 , Julien Sarry 1,2, Katia Feve1,2, Florent Woloszyn
1,2
, Philippe Mulsant 1,2, Beatrice Mandon-Pepin 3
1
INRA, UMR444 Génétique Cellulaire, Auzeville, BP52627, F-31326 Castanet-Tolosan, France
2
ENVT, UMR444, Laboratoire de Génétique Cellulaire, F-31326 Castanet-Tolosan, France
3
INRA, UMR1198 Biologie du Développement et de la Reproduction, F-78350 Jouy-en-Josas,
France
§
Corresponding author
Email addresses:
AB: [email protected]
BS: [email protected]
JS: [email protected]
KF: [email protected]
FW: [email protected]
PM: [email protected]
BMP: [email protected]
1
Abstract
Background
Results
Conclusions
Keywords
RNA-seq, early folliculogenesis, molecular dialog, transcriptome, sheep, oocyte, granulosa
cells, microdissection
Background
Results
Previous experiment including three/four biological replicates per sample (Bonnet et al submitted)
produced separate GCs and oocyte transcriptome for each stage of early follicle development:
primordial (PD), primary (PM), secondary (SC) and small antral stage (SA) follicles. This study was
achieved using 3 combined methodologies: laser capture microdissection, RNA amplification and
RNA-seq. The first study focused to compartment specificity and bidirectional communications.
To have a complete overview of the early folliculogenesis, the present study explored the expression
profile of the 15,349 genes previously described in the RNA-seq dataset, to highlight genes that may
be associated to early follicular development.
Global differential gene expression during the early follicular development
In order to bring out dynamic transcription over early follicular development, a generalized linear
model (DESeq's GLM) was applied to each compartment dataset (O, GCs) using following criteria:
FDR < 5% (Benjamini-Hochberg procedure) for global effects and pval <1% for pair wise
comparison, fold change >2. With these criteria, we identified 19.6% of genes significantly
differentially expressed (DEG) during early development (3,015 genes) (Supplemental File 1). An
unsupervised hierarchical clustering was performed to explore DEG and confirmed the relevance of
the data. The analysis led to a clear separation between the two compartments and allowed the
classification of the genes according to the stage of follicular development. This appropriate
clustering depicts the dynamics of transcription in oocytes and GCs (Figure 1).
On the 3,015 DEG, we observed much more differentially expressed genes (DEG) in oocyte than in
GC (2,173/1,192). A majority of DEG were down regulated in GC during the whole early
folliculogenesis, while the number of up and down regulated genes was similar in oocytes (Table 1).
Last we pointed out major change in expression that occurred between the PM and SC follicles (Figure
2A-B, Table 1). In our experimental condition, little differential expression was specifically identified
during PD-PM transition. In oocytes, the greatest differences in expression began during PM-SC
transition where 74% of the oocyte DEG showed a decreased expression. Then, the number of DEGs
was maintained during SC-SA transition (476 in PM-SC/494 in SC-SA). At contrary, in GCs, the main
changes in expression concerned PM-SC transition where 67.4 % of the GC DEG showed a decreased
expression. Few differential expressions were found in GC during SC-SA transition: 55 genes (Figure
2A-B).
To validate the RNA-seq analysis, the expression profiles of 24 genes of interest involved in canonical
pathways were monitored using qRT-PCR and statistical analysis confirmed the DE observed in the
RNA-seq dataset for 17 of them (Table 2).
2
Global outlook on gene functions and pathways
To investigate the biological functions associated with the early follicular development, 6 global DEG
lists taking account of all the pair wise comparisons, were created and subjected to Ingenuity Pathway
Analysis (IPA)(oocyte lists (PMO/PDO, SCO/ others, SAO/ others); GC lists (PMG/PDG, SCG/
others, SAG/ others). These lists were tested for function and metabolism enrichment.
Biological functions IPA analysis pointed out a major functional change at the secondary stages in
oocytescompared to PM and PD, whereas the functional enrichment was more progressive in GCs
(Supplemental File 2 Figure S1).
Eleven main functional categories were identified as significantly enriched in DEG lists (pvalue<0.05) and presented in Figure 3. In Gc, We highlighted 4 specific enriched functions that
referred to energy and protein (degradation, synthesis and trafficking). Energy production assembled
SCD, BDH2, CPT, PPARGC1A… implicated in the fatty acid metabolism for energy storage. Genes
coding for proteins categories are mainly over-represented in the secondary DEG list. Particularly, the
protein trafficking was likely to play significant role in GC during this stage. Last, the DNA
replication, recombination and repair category was involved in follicular development at 2 distinct
follicular stages according to the compartment: oocytes of PM follicles and GCs of SA follicles.
Canonical pathways: Based on the results of the IPA canonical pathway analysis, we identified
significant pathways that encompassed cell cycle regulation, signaling pathways, cytokines and
inflammatory signaling and were mainly enriched from secondary stages compared to PM an PD
stages. This analysis was available in Supplemental File 3-4. Some pathways were only significantly
enriched at SA stage.
In oocytes (Figure S2), we pointed out a specific and progressive enrichment of genes involved in cell
cycle regulation (for example G2/M DNA damage checkpoint), DNA methylation and transcriptional
Repression Signaling (DNMT3B, RBBP7, DNMT1 ), ATM signaling and steroid hormone signaling
(estrogen and androgen signaling) We also observed the DEG enrichment of additional pathways
involved in neuronal signal transmission (axonal guidance, ephrin receptor signaling), endocytosis
mechanisms (Caveolar-mediated Endocytosis Signaling), stress and cytokine response (eNOS, IL8 and
interferon signaling) (supplemental File 3).
Finally, Figure 4 exhibited different significantly enriched signaling pathways during early follicular
development (NF-KB, ERK/MAPK and RhoGDI). It provided further evidence for the involvement of
BMP signaling and FGF signaling in oocyte development. An overview of the DE of members of
BMP signaling, their regulators and FGF families was presented respectively Figure 5 and Table 3.
Last, NFkB signaling was only enriched in DEG at the end of the early follicular development (SAO).
In GCs, we identified specific enrichment pathways such as G12/13, G protein coupled receptor
signaling, PKA, Rho family GTPase, mTOR and WNT (Supplemental File 4) already identified in
the previous article (Bonnet and al submitted). Figure 4 depicts the GC gene enrichment for some of
these signaling pathways.
Differential expression validation by quantitative real time RT-PCR
To validate DEG during early folliculogenesis, the expression profiles of 21 genes, components of
canonical pathways, were monitored using qRT-PCR and statistical analysis confirmed the DE
observed in the RNA-seq dataset for 17 of them (Table 2).
Global Predicted biological processes from DEG
The IPA Downstream Effects Analysis examined the genes in our dataset that are known to affect
function and, using the Z score algorithm, predicted the downstream effects of our observed gene
expression change on the functions (expected activated or inhibited). The predicted downstream
effects derived from our DEG lists was summarized Figure 6 (Supplemental File 4-5).
In oocytes, the transport of molecules, DNA repair were predicted to be activated while the genes
AURKA, BTRC, CDC25B, CPEB1, DDX4, EXO1, FANCL, HSPA2, KIT, MAEL, PDE3A, RPS6KA3,
SMC1B, TEX12 controlled the meiosis at the primordial/primary transition (Figure 6A). Last, the
predicted effect of the gene expression on fertility was mainly associated with oocyte
3
primordial/primary transition (37 DEG involved including fertility genes as GDF9, BMP15, SOHLH2,
FIGLA…).
In GCs, specific effects were associated to DEG such as inhibition of atresia (including genes as
ESR1, FGFR2, FOXL2, GATA4, GATA6, RXRA, WNT5A…), and activation of protein
phosphorylation, steroid production and vasculogenesis (already identified in the previous study)
(Figure 6A). Figure 6B showed an active GC intracellular re-organization (cytoplasm, cytoskeleton,
microtubule) during early folliculogenesis, while in oocytes the intracellular organization appeared to
be maximum at PM and SC stages.
Last cell-cell communication was implemented during PD/PM transition through mechanical and
molecular dialog. IPA predicted an increase of tubulation formation, cytoplamic projection and
protrusion in GC during early folliculogenesis. In oocytes, only protrusion formation amplified up to
secondary stage. The cell to cell signaling and interaction was also expected to be activated in GCs
(activation of cell: 156 genes involved) and in oocytes (neurotransmission, 46 genes involved) during
PD/PM transition (Figure 6B).
Putative regulators involved during early folliculogenesis
IPA Upstream Regulator analysis was used to understand the cause of the observed gene expression
change. The analysis identifies the cascade of upstream regulators that can explain the observed gene
expression change in the dataset and predicts the activity of their encoded protein. It inferred an
activation state to each regulator (activated state=activator z-score >2; inhibited state= activator zscore <2) (cf method section). Taking into account the gene expression profile (expressed and/or DE)
for each predict upstream regulator gives more evidence for the biological mechanism. The results of
this analysis are presented in Supplemental File 6.
Growth factors and hormones: The IPA analysis predicted a spatio-temporal effect of different
growth factors as EGF, PDGFs and TNF (Supplemental File 2, Figure S3A) during follicular
development. This result was corroborated by the expression of their respective receptors
(Supplemental File 2, Figure S3B). For example, we noticed in oocytes a decrease in PDGFC protein
activity that may be associated to a decrease of its receptor gene expression (PDGFRA and
PDGFRB). Last in oocytes, BMPER had a predicted increased activity status at SA stage and EGF
from SC stages.
Finally IPA underlined a predicted effect of steroid hormones during early folliculogenesis that was
also supported by the presence of their receptor transcripts (Supplemental File 2, S4). E2 has a predict
activity on oocytes and Gcs that began in PM/SC transition in oocytes.
Canonical pathways: In complement to previous study that identified enriched signaling pathways as
SSH, WNT in GC compartment (Bonnet et al in process), IPA predicted their maximal activation in
PD/PM transition followed by a decreased activity in subsequent stages. Last this analysis highlighted
a Ca ++ activity during oocyte PD/PM transition (Supplemental File 2, Figure S5).
Finally, we identified putative regulation of the Wnt signaling pathway during early follicular
development (Figure 7A). Indeed, The GC WNT signaling was balanced by antagonists as Dickkopf
(DKKs), Wnt inhibitory factor 1 (WIF-1), secreted Frizzled-related proteins (SFRPs) and modulated
by low density lipoprotein related receptors (LRPs). The pattern of expression of these inhibitors
changed function of the compartment and the follicular stage (Figure 7B). Particularly, the expression
of DKK1 increased in oocytes during early development and its protein was identified as a GC
predicted regulator. In our experiment, it was predicted to act on 10 GC target molecules including
WNT5A. Last WNT1 was also predicted to act in PD/PM oocyte transition (Figure 8C) and was
associated to the increase of FDZ8 during PD/PM oocyte transition.
Transcription regulator (TR): Using this procedure, we predicted the involvement of 21 TRs in gene
regulation during early folliculogenesis (Table 4). Their corresponding genes were also present in the
DEG lists. Indeed, they were differentially expressed between compartments (19 regulators) or
differentially expressed during early development (2 regulators: 1 in oocyte and 1 in GC)
(Supplemental File 6).
The 19 potential TRs that were over expressed in one of the compartments (respectively 3 and 16 TR
overexpressed in oocytes and GCs) had a predicted activation of their protein function of follicular
stages. Eight TR showed an increased activation from PM to SA stages (EGR1, ETS1, XBP1,
4
SOX10…). Then, 6 TR (including FOXL2, NOBOX, SOX9…) showed an increased activation from
SC stage and 5 TR (ETS2, MITF, MFIA, SREBF2, and SRF) from SA stage (Table 4). Figure 8A-B
depicts the predicted effects of NOBOX expressed in oocytes and of FOXL2 expressed in GCs during
sheep early folliculogenesis.
In mice, Nobox activates the expression of BMP15, DNMT1, GDF9, H1FOO, MOS, ZAR1 genes in
oocytes [1]. In our experiment, these genes were over expressed at SA stage compared to the other
stages (Figure 7A; gene in red colour). Our results were in accordance with those of Rajkovic et al;
IPA therefore predicted for each of these genes, a NOBOX activated status (Figure 7A, red arrow).
Finally, IPA predicted a global increased of the NOBOX activation at SA stage compared to the other
stages.
In the same way, different authors showed that FOXL2 increases Fst, Nr5a2... expression and
inhibited Gdf9 and Cyp26b1 expression. The same direction of change was identified in our
experiment (GDF9 and CYP16B1 were down regulated in SA stage of GCs compared to the other
stages) and IPA predicted an activated status for FST, NR5A2 ... and inhibited ones for GDF9 and
CYP26B1 (Figure 7B, blue line). Our results were in agreement with literature and IPA predicted a
global increased of the FOXL2 activation at SA stage of GCs compared to the other stages.
Last, IPA predicted an increased or inhibited protein activation level, function of follicular stages, for
2 potential TRs showing a differential expression during early folliculogenesis:
- Predicted protein activity and gene expression increased during early follicular development (eg
HIF1A, predicted protein activation in GC at SC stage, Table 4).
- Predicted protein activity and gene expression decreased during early follicular development (eg
KLF9, predicted protein inhibited status in oocytes at SA stage, Figure 8C). Bibliography shows that
KLF9 protein stimulates Ccnd1 and Col1a1 expression and inhibited Calb2 and Ghr ones. In our
experiment we observed reverse effects and IPA predicted a protein inhibited status.
Focus on PM/SC transition
During this transition, cell junction signaling and WNT signaling were over represented in DEG in
both compartments (Table 5) and may be associated to cell-cell communication.
In oocyte, the Aryl Hydrocarbon Receptor, integrin and PTEN signaling were statistically enriched in
DEG. In GCs, this transition was also associated with enriched RHO GDI, RHO GTPase and mTOR
signaling pathways. Last, we identified 5 putative oocyte upstream transcriptional regulators (EDN1,
BCL2, MET, TGFBR2, ETS1) with a decrease of their expression during PM/SC transition and a
predicted protein inhibited state at this stage. In addition, GATA2, already described in this study, had
an increased expression in oocytes during this transition and predicted to inhibit gene expression
(Figure 9B). No transcriptional regulators were predicted in GCs (Supplemental File 7).
Focus on biomarkers of early folliculogenesis
A number of protocols were developed for many domestic species like cattle, buffalo, sheep
to perform in vitro functional analysis, manipulation and embryo production; or to evaluate
cryoconservation for sterility preservation. Identification of biomarkers that can be used to
monitor the survival and development of follicles was of great importance. In this goal, to
provide a set of biomarkers that may be used as “in vivo” reference to predict follicular
development, we performed a pair wise comparison for each sample transcriptome against the
other samples including multi-tissues samples (FDR<5%, FC>3-10) and selected the 29 most
differentially expressed. PLS-DA analysis without variable selection was performed on the
biomarker dataset to explore the classification and discrimination of the follicular stages
(Figure 9A). This biomarker dataset provide a good separation of the follicular classes and
compartments.
Biomarker validations by quantitative real time RT-PCR
To validate the biomarker dataset, the expression profiles of the 29 genes were monitored using qRTPCR. Statistical analysis confirmed the compartment differential expression observed in RNA-seq data
for 24 genes upon the 29 genes tested (Table 6). The accuracy of the 24 gene expression was
5
confirmed by the similarity between RNA-seq and qRT-PCR PLS-DA analysis (Figure 9B).This list
included known genes as SPO11, BMP15, FST and WEE2.
Discussion
Conclusions
Methods
To summary briefly the previous methods (Bonnet et al submitted):
- The follicular compartments (i.e. granulosa cells (GCs)) and oocytes (O) were selected for each
follicle stage function of follicular diameter (primordial (Pd<35μM), primary (Pm: 35-50μM),
secondary (Sec: 60-120μM) follicles and small antral (SA: 250-500μM)), captured by laser capture
microdissection and extracted using the PicoPure RNA Isolation Kit. Three/four independent
replicates were obtained per sample.
- Thirteen tissue samples (fetal ovary, pituitary gland, hypothalamus, muscle, skin, hurt, lung,
intestine, stomach, kidney, spleen, liver, and theca) were sampled in triplicates at the local
slaughterhouse (3 individual animals) for RNA extraction. The 12 total RNA tissue samples (except
fetal ovary) were pooled into 3 independent groups.
- A total of 31 RNA LCM-derived (3PDO, 4PMO, 4SCO, 4SAO, 4PDG, 4PMG, 4SCG and 4SAG)
and 3 multi-tissue RNA samples were subjected to 2 rounds of T7 linear amplification.
- Sequencing was performed on an Illumina HiSeq2000 using the Illumina TruSeq SBS kit v2 (209
cycles including the index) to obtain paired-end reads (2x100 pb).
- Due to the specificity of our data (enrichment of 3’UTR non-coding sequences [2]), we used two
different assembly strategies to maximize the transcript identification: assembly using the genome
reference and de novo asssembly.
- Genomic fragments and de novo contigs were aligned with Bos taurus UMD3.1 genome using Blat.
- The genomic fragment dataset was filtered to conserve only the best genomic fragment per gene and
was completed by the genes from de novo strategy of which no mRNA sequence was previously
available or because there were absent in the genome strategy dataset.
Statistical analysis
Significance of differential gene expression was determined using DESeq package [3] in R software
for multifactor design (R 2.14.0; DESeq release 1.6.1). Our experimental design included 2 factors:
“stage” (with 4 levels: PD, PM, SC and SA) and “compartment” (2 levels: O, GCs). After DESeq
normalization, the best dispersion estimation of our dataset was obtained using the following
arguments: method ”pooled”, sharingMode “fit-only”, fitType “local”. Then, GLM method estimated
coefficient and deviance for each gene. To establish the differential expression profile along early
follicular development we identified the genes whose intra compartment variance was differentially
expressed in at least one of the stages (nbinomGLMTest). For this, we specified 2 models: the stage
model (count ~ stage) and the reduced model (count ~ 1) and applied them to each compartment
dataset. Then for each compartment, the expression value of each gene was compared between each
follicle stage using paired wise comparison (nbinomTest). Last, differential gene expression during
early follicular development was selected with a FDR <5% for global intra compartment effect
(nbinomGLMTest) and pval <1% for paired wise comparison (nbinomTest) with a fold change >2.
The molecular biomarkers of early folliculogenesis (mostly expressed in PDO, PMO, SCO, SAO,
PDG, PMG, SCG, SAG) was determined using paired wise comparisons with FDR <5% and a fold
change >3-10.
6
We used the PLS regression for classification and discrimination of the samples ((s) PLS-DA).
(s)PLS-DA is implemented in mixOmics package in R solftware.
Quantitative real time RT-PCR analysis for gene expression
Gene primer designs were performed from RNA-seq sequences. The intron–exon organization of
ovine genes was deduced by comparison with the Human genome using the NCBI database. Gene
primers were designed preferentially in the 3’ UTR (last 1000 base pairs) or the last exons using
LightCycler Probe Design2 software (Roche Diagnostics). The primer pairs were confirmed by
Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Sequences are available in Supplemental File 8.
The LCM-derived aRNA samples were reverse transcribed as previously described (Bonnet et al
2011). The reactions were completed to 50μl and diluted at 1/20 before PCR. The assay for each gene
consisted of 4 replicates per condition (except for PDO= 3) and negative controls.
Briefly as previously described:
- Two μg of total RNA samples (tissue RNA samples) were reverse transcribed and the reactions were
completed to 50μl and diluted at 1/50 before PCR. The assay for each gene consisted of a pool of three
independent replicates per tissue.
- The expression of molecular biomarkers (29 genes) and genes involved in canonical pathways (24
genes) was analyzed using 96.96 Dynamic Array™ IFCs and the BioMark™ HD System from
Fluidigm.
- Two specific target amplifications (STA) were performed on the 37 cDNA samples (32 LCMderived aRNA samples, 3 multi-tissue aRNA samples, a calibrator sample (pool of all the LCMderived aRNA samples) and a pool of cDNA from total fetal ovaries RNA for PCR amplification
efficiency calculation) in a 96-well PCR plates. A mix was prepared containing 132L 2× TaqMan®
PreAmp Master Mix plus (ref 4391128, Applied Biosystem) 26.4L 10× Preamplification Primer Mix
(500 nM each primer (for 60 genes + 2 reference genes (-actin and TMED4)), and 3.75L of this mix
was added to each cDNA sample from aRNA (2μl: 1 ng cDNA) and fetal ovaries cDNA pool (2μl
=11 ng). Following a brief vortex and centrifugation, the plate was transferred to a thermal cycler and
subjected to 14/17 amplification cycles. RLP19 gene primers were not included in the STA reactions.
Reactions were then treated with Exonuclease I in order to digest the primers. The final reaction was
diluted (1/5) and stored at 20°C.
For the determination of the PCR amplification efficiency specific to each gene, the STA reaction of
foetal ovary cDNA pool (11 ng cDNA) was serial diluted (1, 1:3; 1:3; 1:2; 1:2).
The final PCR was performed on the BioMark HD using 35 amplification cycles followed by a
melting phase. Data was analyzed using Fluidigm Digital PCR Analysis software using the Linear
(Derivative) Baseline Correction Method, the User (Global) Ct Threshold Method with threshold set
at 0.01, and a Ct Range of 12 to 25 cycles.
After determination of the threshold cycle (Ct) for each LCM-derived aRNA sample, the PFAFFL
method was applied to calculate the relative expression of each gene [4]. The relative expression was
normalized by the corresponding geometric average of three reference genes using geNorm v3.4 [5]:
-actin, TMED4 and RPL19 genes that were respectively slightly, moderately and highly expressed
and not regulated during follicle development or compartment.
The significance of biomarkers differential gene expression was evaluated by student test after fourth
square transformation.
The significance of the relative expression data from genes involved in canonical pathways was tested
using the one-way ANOVA model of R statistical software system (the Comprehensive R Archive
National, http://www.cran.r-project.org) after fourth square transformation of the data. For each gene,
an ANOVA model was fitted, with the 2 factors “stage” (4 levels) and “compartment” (2 levels) with
interactions. A backward variable selection procedure was applied as previously described [6].
Biological trends
Ingenuity® Pathway Analysis software (IPA; http://www.ingenuity.com) was used to examine
functional and molecular pathways enrichment for differential expressed genes based on the Fisher’s
Exact Test. This software combines functional annotations of our differentially expressed genes (focus
genes) and the corresponding bibliographic data to generate significant signaling pathways and
7
regulation networks. The Biological analysis was focused on differential gene expression during
follicular development The Ingenuity Pathways Knowledge Base was used as set reference.
Functional categories analysis identified the functions, from the IPA library, which were most
significant to the input data set. The significance of the association between the data set and the
functional category was determined by a P value calculated using Fischer’s exact test.
Canonical pathways analysis identified the pathways, from the IPA library of canonical pathways,
which were most significant to the input data set. The significance of the association between the data
set and the canonical pathway was determined based on two parameters: (1) A ratio of the number of
genes from the data set that map to the pathway divided by the total number of genes that map to the
canonical pathway and (2) a P value calculated using Fischer’s exact test determining the probability
that the association between the genes in the data set and the canonical pathway is due to chance
alone.
We considered that functional categories and canonical pathways were statistically significant
enriched if the p-value was below 5.10-2.
Downstream Effects Analysis was used to identify the expected effect of our observed gene expression
change on the functions (expected to increase or decrease). The analysis examines genes in our dataset
that are known to affect functions, compares the genes’ direction of change to expectations derived
from the literature, then issues a prediction for each function based on the direction of change (in the
differential gene expression list). IPA uses the regulation z-score algorithm to make predictions.
In the same way, IPA Upstream Regulator analysis was used to understand the cause of the observed
gene expression change. It identifies the cascade of upstream transcriptional regulators (any molecules
that can affect the expression of other molecules) that can explain the observed gene expression
change in the dataset. The overlap pvalue measures statistically significance between the dataset genes
and the genes that are regulated by a transcriptional regulator. The activator z-score infers the
activation state to the transcriptional regulator (activator z-score <-2 and >2). If the DE is consistent
with literature across gene list, IPA predicts that the upstream regulator is more active between the 2
conditions. If DE is anti-correlated with literature, IPA predicts an inhibition state. Without bias note
this z-score can be use always as an independent test to call downstream regulators. Bias note means
activation z-score and pval must use to call downstream regulators. The expression and/or differential
expression of the transcriptional regulator in the dataset give more evidence for the biological
mechanism.
Combination of oocyte and GC Upstream effect/ Regulator analyses gave clues on putative regulation
involved during oocyte- GC dialog.
Data access
All the raw RNA-seq data have been deposited in [EMBL-EBI
http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/ under accession number E-MTAB-1587].
ArrayExpress
Competing interests
The author(s) declare that they have no competing interests'.
Author’s contributions
AB conceived and designed the study, performed LCM experiments, analyzed the RNA-seq data,
carried out the RT-PCR, statistical and IPA analyses, and was responsible for much of the writing.BS
performed the follicular modelisation and prediction. JS and KF participated in qRT-PCR
experiments. PM and BMP contributed to the conception and design of the study, and were involved
in the drafting and revising the manuscript. All authors read and approved the final version of the
manuscript.
Acknowledgements
LCM
was
processed
at
FR3450
set,
TRI
platform
Toulouse,
Genopole
(http://tri.genotoul.fr/index.php?id=36). RNA sequencing was processed at the genomic platform
8
Toulouse, Genopole (http://genomique.genotoul.fr/). We thank Katia Feve for their help on Fluidigm
experiment.
This work was supported by “Bioressources 2010” grant of INRA programs.
References
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Rajkovic A, Pangas SA, Ballow D, Suzumori N, Matzuk MM: NOBOX deficiency disrupts
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Terenina E, Martin P et al: Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes
during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC
Genomics 2011, 12:417.
Figure legend
Figure 1 - Heatmap display of unsupervised hierarchical clustering of all the
differential genes during early folliculogenesis.
The genes are displayed in lines and the mean of replicates by condition are in columns. Red, black
and green represent the expression level: up, mean and down respectively.
Figure 2 - Analysis of the expression change during stage transition
We report for each compartment the number of differentially expressed genes (total, down and up
regulated for each follicular transition: oocytes (A), granulosa cells (B).
Figure 3 - Metabolism enrichment
The differentially expressed genes during early development were evaluated in silico using Ingenuity
Pathway Analysis (IPA) for each compartment (FDR <5%)..
Bar color corresponds to enriched functions from PM/PD gene expression comparison, SC enriched
functions (vs PM and PD comparisons), SA enriched functions (vs SC, PM and PD comparisons).
The X axis corresponds to the level of significance of the function: -log(B-H pvalue).
GC data are in red color and oocyte data are in blue color.
Numbers corresponds to the number of focus genes that contributed to the function.
Figure 4 - I Signaling pathways
*: Significant enriched canonical pathway categories (p-value<5 10-2) were revealed during follicular
development
The Y axis corresponds to gene enrichment in the dataset (%).
pathway (GCs vs oocytes).
Figure 5 –Gene expression profiles of the genes involved in BMP signaling
Y axis corresponds to normalized counts from RNA-seq data.
9
Figure 6 – Predicted functional protein activation
The figure refers for each compartmernt the direction of change per function (increase or decrease),
based on the regulation z-score (Ingenuity prediction).
Y axis: Activation Z-score ( z_score <>2 and pval<5%).
Z-score >2 : activation ; Z-score<2 : inhibition.
Figure 7 –Regulation of WNT signaling pathway
The genes over expressed in oocyte compartment are in pink color, genes over expressed in granulosa
cell compartment are in green color.
A: The gene expression of the ligands, receptors and regulators expressed in follicles are reported on
the WNT signaling pathway.
The genes over expressed in oocyte compartment are in pink color, genes over expressed in granulosa
cell compartment are in green color.
B: Gene expression profiles of genes involved in the regulation of WNT signaling
Y axis corresponds to normalized counts from RNA-seq data.
Figure 8– Predicted activation of NOBOX, FOXL2 and KLF9 prtoteins
A: NOBOX activation in oocytes at SA stage compared to PD and/or PM and/or SC
B: FOXL2 activation in GC at SA stage compared to PD and/or PM and/or SC
C: KLF9 activation in oocytes at SA stage compared to PD and/or PM and/or SC
Figure 9 – the (s)PLS-DA analysis of the biomarker set transcriptome
(s) PLS-DA was performed on the biomarker dataset after normalization using the DEseq R package
to classify follicular stages according to the gene expression.
The figure visualized the three components of the analysis.
A: RNA-seq dataset
B: qRT-PCR dataset (four square transformation)
Tables
Table 1 - Summary of differential gene expression
total
total
oocyte
granulosa cells
3015
2173
1192
number of differential genes
gene regulation
Global stage effect
up
down
PM
sec
SA
1357
1658
1064
1109
173
1005
2074
408
784
171
732
1074
10
Table 2 - QRT-PCR validation
Canonical
pathway
Gene
RNA-seq analysis
qPCR analysis
effect
O/GC
Fold
change
MAGED1
NOG
BMP
(1)
AMH
SMURF1
ACVRL1
IGF1
IGF1
INSL3
SPRY4
Gapjunction GJA1
WIF1
(1)
WNT
FGF
Notch
PI3K
RAR
activation
μRNA
Apoptosis
0,159
0,172
O
Fold
change
GC
Fold
change
0,261
0,002
0,008
3,267
0,006
0,059
0,274
0,005
0,284
0,121 10,7/0,106 27,330
0,0036/579
6,800
0,117
0,175
2,814
FDZ1
LRP2
(1)
WNT4
0,218
6,220
FGF16
JAG1
PIK3R3
KITLG
KIT
CRABP
1
MAEL
BCL2
GATA2
MYC
MOS
7,145
2,053
9,400
0,182
0,078
0,266
2,244
4,620 16,75/0,1
0,256
0,005
8,860
0,270
0,005
3,255
0,159
7,028
0,097
4,735
P
value
class
0,340
0,420
***
0,104
**
**
0,320
78,900
5,600
0,260
GC
Fold
change
P
O
value
Fold
change class
P
value
class
NS
0,005
**
**
64,870
***
*
3,21/0,0041 ***
3,068
0,520
0,482
**
1,200
*
0,278
4,460
***
0,153
**
*
NS
42,240 *
NS
5,600 *
0,289 *
***
**
**
0,554
6,464
***
0,144
***
7,887
2,909
***
0,218
3,962
**
NS(0,079)
4,770 ***
***
0,070 ***
***
0,005
5,661
0,280
10,906
0,252
7,447
NS
*
0,123
0,002
5,300
O/GC
Fold
change
Interactions
Stage effect
***
**
*
***
***
***
NS
2,38/0,16 ***
NS
NS
13,310 *
NS
***
*
NS
~0,080
NS
0,730
*
NS(0,06 ~
*
4,850 ***
3,970 *
5,080 ***
NS
*
*
*
***
*:pval<0.05;**:pval<0.01;***:pval<0.005
(1)
:genesstatisticallynodifferentialinRNA~seqdata
11
Table 3 – FGF family involvement during early follicular development
GENE
NAME
O/GFold
change
FGF1
FGF2
0,12
3,93
FGF9
O/GFDR PM
2,32E~13
6,6910~4
SCO SAO
8,08E~02
~2,70
~6.96
FGF11
0,23
0,6910~4
FGF12
0,16
0,00E+00
FGF16
7,14
0,00E+00
FGF20
4,30
2,21E~08
PMG
SCG SAG
~68.29
~
3.73
~3.91
4.02
4.6
3.14
16.75
~
3.12
3.2
Significant fold change between the two compartments during early follicular
development from RNA- seq data
12
Table 4 – Summary of the predicted TR activation status
Protein predicted activation
state
way of
regulation
during
development
number of
regulators
activated
3
3 (NOBOX,
SOX10, E2F1)
GC
16
16 *
total
19
location
expression
status
oocytes
expressed
oocytes
GC
regulated
during
development
total
total
down
1
up
1
1(HIF1A)
2
1
inhibited
1 (KLF9)
1
21
* EGR1, ETS1, GLI1, NF2L2, SKIL, CREB1, ETS2, FOXL2, MITF, NFIA, SREBF1,
SREBF2, SRF, TP53, XBP1, SOX9
13
Table 5 – IPA significant canonical pathways from PM/SC DEG
Ingenuity Canonical
Pathways
-log(pAnalysisName value)
RhoGDI Signaling
SCG/PMG
1,88E00 3,55E-02
Sertoli Cell-Sertoli Cell
Junction Signaling
SCG/PMG
1,81E00 3,59E-02
mTOR Signaling
SCG/PMG
1,67E00 3,32E-02
Androgen Signaling
Germ Cell-Sertoli Cell
Junction Signaling
Wnt/-catenin Signaling
Signaling by Rho Family
GTPases
SCG/PMG
1,56E00 3,5E-02
Molecules
CDH2,CDH3,DIRAS3,GNB2,ITGA5,PIP4K2A,G
NG4
CTNNA2,PRKAR2B,CLDN15,TJP1,ITGA5,MT
MR2,NOS2
TSC1,PRKCQ,DIRAS3,HIF1A,EIF3E,RPS17/R
PS17L,PDGFC
PRKCQ,PRKAR2B,GNB2,GTF2H5,GNG4
SCG/PMG
1,51E00 3,66E-02
CDH2,CTNNA2,TJP1,DIRAS3,ITGA6,MTMR2
SCG/PMG
1,39E00 3,47E-02
SCG/PMG
1,32E00 2,78E-02
Ovarian Cancer Signaling
SCO/PMO
2,78E00 6,34E-02
Leukocyte Extravasation
Signaling
SCO/PMO
2,38E00 5,08E-02
Integrin Signaling
SCO/PMO
2,27E00 4,83E-02
ILK Signaling
SCO/PMO
1,87E00 4,69E-02
Wnt/-catenin Signaling
SCO/PMO
1,67E00 4,62E-02
SCO/PMO
1,66E00 5,62E-02
SCO/PMO
1,54E00 4,35E-02
SFRP4,CDH2,GJA1,CDH3,DKKL1,BTRC
CDH2,CDH3,DIRAS3,GNB2,ITGA5,PIP4K2A,G
NG4
EDN1,PIK3CG,FGF9,PTGS1,CD44,MMP2,CC
ND1,WNT5A,BCL2
RAC2,ITGAM,MMP28,CDH5,PIK3CG,CD44,JA
M2,PECAM1,MMP2,DLC1
MYLK (includes
EG:107589),RAC2,MPRIP,ITGAM,RND3,PIK3
CG,DIRAS3,CAV1,ITGB8,TSPAN6
RND3,KRT18,PIK3CG,DIRAS3,PPAP2B,PPP2
R2B,ITGB8,CCND1,DSP
TGFBR2,SFRP4,SOX9,CDH5,PPP2R2B,CD44
,CCND1,WNT5A
MYLK (includes
EG:107589),RAC2,MPRIP,RND3,DIRAS3
NR2F1,GSTM1,ALDH1A3,NFIB,CCND1,ESR1,
CYP1B1
SCO/PMO
1,51E00 6,67E-02
Regulation of Actin-based
Motility by Rho
Aryl Hydrocarbon Receptor
Signaling
Myc Mediated Apoptosis
Signaling
PTEN Signaling
SCO/PMO
IL-8 Signaling
SCO/PMO
Germ Cell-Sertoli Cell
Junction Signaling
Estrogen-Dependent
Breast Cancer Signaling
Fatty Acid -oxidation
SCO/PMO
Ratio
IGF1,PIK3CG,CASP8,BCL2
TGFBR2,RAC2,PIK3CG,PDGFRA,CCND1,BCL
2
RAC2,ITGAM,RND3,PIK3CG,DIRAS3,MMP2,C
1,43E00 3,92E-02
CND1,BCL2
TGFBR2,RAC2,TUBB3,RND3,PIK3CG,DIRAS3
1,38E00 4,27E-02
,PPAP2B
1,48E00 4,44E-02
SCO/PMO
1,36E00 5,56E-02
IGF1,PIK3CG,CCND1,ESR1
SCO/PMO
1,33E00 9,52E-02
ALDH1A3,NAD+
14
Table 5 – qRT-PCR validation of the biomarker set gene expression
gene
SPOCK1
IGF2BP1
KCNK9
TECTA
CREG2
MEST
BMP15
MUSK
FSCB
ACCSL
SPO11
WEE2
BTG4
MAP1LC3C
THSB2
BMP3B
TMEM190A
MPZL2
CNR1
NEPH
SYNG1
DEFB112
FST
GEM
GABR
CNTNAP5
CGGBP1
MCHR1
SEMA6B
Oocyte
RNAseq
expression PD
specificity
PDO
PDO
PMO
SCO
PMO
PMO
SCO
SCO
SAO
SAO
SAO
SAO
SAO
PDG
PDG
PDG
PMG
SCG
SCG
SCG
SAG
SCG
SAG
SAG
SCO
SCO
PMG
PMG
PDO
NS
*
NS
NS
*
*
NS
***
***
***
*
NS
NS
NS
NS
*
*
NS
***
NS
***
*
NS
NS
NS
NS
Granulosa
PM
SC
SA
PD
PM
SC
SA
MT
*
NS
*
NS
NS
NS
***
***
***
*
*
NS
NS
*
***
***
*
***
*
***
***
NS
NS
NS
NS
NS
**
***
*
NS
NS
NS
***
*
*
*
*
*
*
NS
***
***
***
***
*
***
***
NS
NS
NS
***
***
*
*
*
NS
NS
NS
***
*
*
NS
NS
***
*
***
NS
***
*
NS
NS
NS
*
NS
*
*
*
**
**
*
***
***
*
***
***
***
*
NS
***
***
***
***
*
***
NS
NS
NS
NS
NS
NS
***
NS
*
**
NS
*
***
***
*
***
***
***
*
*
NS
NS
NS
***
***
*
***
*
***
*
NS
NS
NS
***
*
*
*
*
*
***
*
*
***
***
***
*
*
NS
NS
NS
*
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
***
*
**
*
*
*
***
*
NS
***
***
***
*
*
NS
NS
NS
***
**
*
NS
NS
NS
NS
NS
NS
*
*
**
***
*
**
***
***
NS
***
***
***
*
***
NS
NS
NS
*
***
NS
*
NS
*
NS
NS
NS
NS
NS
NS
qPCRexpression
specificity
PDO
PD/PM
PDO/PMO
SCO
PDO/PMO/SCO
O
PMO/SCO/SAO
PMO/SCO/SAO
SAO
SAO
SAO
SAO
PD
SCG
SCG
SAG
SC/SA
SCG/SAG
SCG/SAG
NS
NS
NS
NS
*:pval<0.05;**:pval<0.01;***:pval<0.005
15
Supplemental data files
Supplemental File 1 - follicular development statistical analysis
Supplemental File 2 -Supplemental Figures
Supplemental File 3: oocyte significant canonical pathways involved in follicular
development
Supplemental File 4: Granulosa cell significant canonical pathways involved in follicular
development
Supplemental File 5: Functional predicted functional activation
Supplemental File 6: Predicted regulators
Supplemental File 7: Predicted transcription regulators in PM/SC transition
Supplemental File 8: Primer sequences for real-time PCR
16
Figure 1
Figure
Figure 3
Figure
Figure
Figure
A
B
Figure
Figure
Figure
.
nnexes de l’article 3
upplemental ile 2 - upplemental igures
Figure S1 functional enrichment during earl follicular development
The differentially expressed genes during early development were evaluated in silico using
Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for each compartment.
Bar color corresponds to enriched functions from PM/PD gene expression comparison, SC
enriched functions (vs PM and PD comparisons), SA enriched functions (vs SC, PM and PD
comparisons).
The X axis corresponds to the level of significance of the function.
The y axis corresponds to – log(FDR (Benjamini-Hochberg)
GC data are in blue color and oocyte data are in red color.
Numbers correspond to the number of focus genes that contributed to the function.
90
Figure S
cell c cle regulation during earl follicular development
*: Significant enriched canonical pathway categories (p-value<5 10-2) were revealed during
follicular development
The Y axis corresponds to gene enrichment in the dataset (%).
pathway (respectively GCs and oocytes).
Figure S3 ffects of ro th hormones during follicular development
A)
Activation Z-score infers to growth hormones (IPA upstream regulator analysis )
B)
Significant fold change during early development identified by statistical analysis of
the RNAseq data.
Fold change =10: over expression in the compartment but not differential during follicular
development..
Fold change =0.5: expressed genes (but not differentially expressed)
Figure S Steroid hormone action
Y axis: Activation Z-score from IPA upstream regulator analysis
Figure S Canonical path a s involvement during follicular development
Activation Z-score infers canonical pathways (IPA upstream regulator analysis)
I C
I
AL
91
DISCUSSIONGENERALE
METHODOLOGIES
93
CARACTERISTIQUESDESTRANSCRIPTOMES
96
ETUDEDESCOMPARTIMENTS
99
1.Lesfonctions
99
2.Lesmécanismes
99
2.1L’ovocyte
99
2.2Lescellulesdegranulosa
a.Prolifération
b.Stéroïdogenèse
100
100
102
3.Lescommunicationscellulaires
103
4.Lesspécificitésdecompartiments
104
4.1Ovocyte
105
4.2Cellulesdegranulosa
105
LEDEVELOPPEMENTFOLLICULAIREPRECOCE
106
1.Lesfonctions
106
2.Mécanismesmisenplaceaucoursdudéveloppementfolliculaire
106
3.Régulationdelacroissance
107
3.1Voiesdesignalisationetfacteursdecroissance
108
3.2Régulateurstranscriptionnels
109
a.Danslescellulesdegranulosa
b.Dansl’ovocyte
4.Lesspécificitésdestades
109
110
111
92
Méthodologies
éthodologies
La croissance folliculaire requiert l’expression coordonnée d’un grand nombre de gènes. Elle
dépend aussi de l’expression spécifique de différents gènes ovocytaires ou somatiques et d’un
dialogue moléculaire très étroit qui se met aussi en place entre les cellules somatiques et les
cellules germinales. Pour mieux comprendre et maitriser ce processus, il est donc important
d’identifier l’ensemble des gènes exprimés dans chaque compartiment. Les études disponibles
sont cependant limitées dues à la taille et de la quantité du matériel d’intérêt accessible dans
l’ovaire.
Dans la première partie de cette étude, nous avons combiné et adapté un ensemble d’outils
(LCM, amplification des ARN et RNA-seq) permettant d’obtenir le transcriptome le plus
complet possible issu des compartiments folliculaires et des stades folliculaires précoces.
Notre étude fait également partie d’« une étude pilote » pour la mise en place des nouvelles
technologies de LCM et RNA-seq sur la genopole de Midi-Pyrénées.
La première difficulté de l’étude concernait donc l’isolement des compartiments folliculaires
et des stades précoces, en mélange au sein d’un tissu hétérogène. Un nouveau protocole de
LCM a été développé pour permettre une capture correcte des compartiments en maintenant la
qualité des ARN. L’amplification des ARN a ensuite permis d’obtenir des échantillons
d’ARNa représentatifs des compartiments folliculaires et des stades précoces de la
folliculogenèse en quantité suffisante pour mener des analyses transcriptomiques. Les profils
d’expression de gènes connus pour avoir une spécificité d’expression, sont en accord avec les
études précedentes (LaVoie 2003; Silva et al. 2006; Visser et al. 2006; Anderson et al. 2007;
Feary et al. 2007; Bebbere et al. 2008). La variabilité entre répliques qui avait été mise en
évidence par Luzzi et ses collaborateurs, est aussi également observée dans notre expérience
(Luzzi et al. 2003). Elle peut être associée à une variabilité biologique.
La deuxième difficulté de l’étude concernait l’analyse du transcriptome (ensemble des
transcrits présents dans une cellule à un moment donné) dans une espèce possédant peu de
supports transcriptomiques. Le transcriptome décrit donc les niveaux d’expression et le type
des transcrits (isoformes). Différentes technologies ont été développées jusqu’à présent, pour
caractériser le transcriptome telles que les hybridations sur micro-arrays (sondes ADNc ou
oligonuclétidiques), le séquençage Sanger (technique SAGE (serial analysis of gene
93
Figure 3 . ertinence des eux de données.
Source Article 1, Figure 6
Comparaison des gènes identifiés dans les 4 études par rapport aux ::
A- gènes détectés dans l’ovocyte de brebis (total 789 gènes)
B- gènes détectés dans les cellules de granulosa (total 33 gènes)
Méthodologies
expression) et depuis quelques années, la technologie de séquençage haut débit RNA-seq ou
séquençage à ARN.
Cette dernière avancée technologique, en particulier, est en plein développement car elle
permet d’obtenir en théorie l'ensemble des séquences ARN présentes à un moment donné
dans un tissu ou une cellule et autorise une analyse plus en profondeur de l’ARN (faibles
expressions et isoformes). C’est une technologie intéressante qui contrairement aux
technologies micro-arrays ou PCR, ne dépend pas de la connaissance des différents transcrits
issus du matériel biologique de départ. Elle permet donc d’identifier des nouveaux transcrits.
Pour l’espèce ovine, deux supports transcriptomiques commerciaux sont disponibles : le
micro-array affymetrix bovin de 24 000 sondes (oligonucléotides de 20 paires de bases) et le
micro-array Agilent ovin 15 000 sondes (oligonucléotides de 60 paires de bases). Le support
le plus complet et le mieux annoté au moment de l’expérience est la puce oligonucléotidique
Affymetrix bovine qui peut décrire l’expression de 12400 gènes uniques annotés.
L’hybridation hétérologue d’ARN de brebis sur cette puce bovine est possible car
l’homologie de séquences entre les deux espèces est supérieure à 95%. Une première analyse
transcriptomique a donc été effectuée sur puce Affymetrix bovine (Article 1) suivie d’une
deuxième analyse effectuée avec la technologie RNA-seq (Article 2).
Dans notre étude, l’analyse transcriptomique sur puce Affymetrix bovine confirme la qualité
des ARNa et la spécificité des échantillons microdisséqués. Le nombre de transcrits annotés
détectés dans l’ovocyte est similaire aux études précedentes effectuées chez la souris et la
vache (Table 2) (Pan et al. 2005; Fair et al. 2007). Si nous comparons nos résultats aux quatre
études transcriptomiques principales (figure 37) (Dade et al. 2003; Arraztoa et al. 2005; Pan et
al. 2005; Gallardo et al. 2007), nous observons que :
¾ 37 et 47 % des gènes identifiés dans ces quatre études, respectivement pour
l’ovocyte et les CG, ne sont pas représentés sur la puce Affymetrix bovine
¾ 10 et 24 % (ovocyte-CG) des gènes identifiés dans les quatre études de la
littérature et présents sur la puce Affymetrix ne sont pas détectés dans notre analyse.
¾ 41% des gènes ovocytaires identifiés (324/789 gènes) dans les quatre études
sont détectés dans l’ovocyte de brebis,
¾ et enfin, 33% des gènes somatiques (CG) identifiés (11/33 genes) dans les 4
études sont détectés dans les CG de brebis.
Nous détectons donc la majorité des gènes identifiés des 4 études préalablement citées
94
Méthodologies
lorsqu'ils sont représentés sur la puce Affymetrix et nous décrivons aussi pour la première fois
le transcriptome des CG pendant les stades précoces.
A l'issu de nos expériences, nous pouvons constater que la technologie RNA-seq semble plus
adaptée et plus sensible pour étudier la folliculogenèse basale de la brebis. La détection de
transcrits connus chez la souris est augmentée de 20% par rapport à la puce Affymetrix
bovine. Le séquençage ARN à haut débit détecte aussi une expression accrue de gènes (14561
gènes dans les échantillons PD, PM et SC, soit 68% de gènes supplémentaires (5909 gènes)
par rapport à la puce Affymetrix (8652 gènes (Article 1)). Cette forte différence de détection
entre les deux technologies peut s’expliquer par le fait que :
¾ Les supports transcriptomiques sont souvent mal annotés, mal orientés et
incomplets pour les espèces non modèles et pour l’étude de certains processus comme la
folliculogenèse (Bonnet et al. 2008). Pour la puce Affymetrix bovine disponible qui comprend
24024 sondes, seulement 64% de ces sondes sont annotées et représentent 12404 gènes
uniques. Enfin, un grand nombre de gènes connus pour intervenir dans la folliculogenèse ne
sont pas représentés sur cette puce (Figure 45).
¾ L’analyse RNA-seq a détecté, dans notre expérience, l’expression d’un grand
nombre de gènes qui ont une expression globalement faible (médiane 140 RPM pour une
échelle dynamique de 0,2 à 1000 RPM). Avec cette technique, l’augmentation du nombre de
gènes exprimés (20% de détection supplémentaire de gènes connus) peut donc s’expliquer par
une augmentation de la sensibilité de détection. Dans une étude sur le cancer du colon
humain, Xu et collaborateurs (Xu et al. 2013) montrent également une augmentation de 22%
des gènes détectés grâce à l'utilisation de la technique RNA-seq en comparaison avec les
microarrays Affymetrix humains. Ils attribuent aussi ce résultat à une meilleure détection des
gènes faiblement exprimés.
La technique de RNA-seq est confrontée à différents challenges qui nécessitent le
développement d’outils et de nouvelles compétences sur :
¾ la gestion des fichiers informatiques de grosse taille,
¾ la détection des biais techniques (composition en nucléotides GC (Benjamini
and Speed 2012), répétition de motifs, biais d’amorçage (Zheng et al. 2011), biais de longueur
des ADNc (Mortazavi et al. 2008; Oshlack and Wakefield 2009), biais de séquençage (Sudo
et al. 1994)…),
¾ les biais expérimentaux (variabilité expérimentale (Hansen et al. 2012)…),
95
Caractéristiques des transcriptomes
¾ les biais bioinformatiques (alignement multiple, comptages (Wang et al.
2009),…)
¾ l’annotation des séquences,
¾ et l’analyse statistique des données (variabilité des petits comptages,
normalisation, modèles statistiques) (Bullard et al. 2010).
L’exploration des données est donc une étape préliminaire indispensable, en amont de
l’analyse, et qui permet de s’assurer de la qualité des données. Comme concluait déjà Wright
en 2003 : « Conducting data analysis is like drinking a fine wine. It is important to swirl and
sniff the wine, to unpack the complex bouquet and to appreciate the experience. Gulping the
wine doesn’t work” (Wright 2003).
Une particularité de notre jeu de données provient de l’étape d’amplification de l’ARN qui
induit un biais dans la distribution des lectures en 3’ UTR. Ce biais est attendu et a déjà été
décrit dans d’autres études (Li et al. 2010; Schmid et al. 2012a; Teichert et al. 2012b). Les
processus de traitements bioinformatiques et de nettoyage des données ont été adaptés pour
tenir compte de cette spécificité et seule l’expression globale du gène peut, dans notre cas,
être étudiée. Enfin, le positionnement des lectures en 3’UTR et un séquençage non orienté,
rendent l’annotation et la détection de nouveaux transcrits plus difficile. Ceci peut expliquer
qu’une grosse partie des lectures est ainsi restée sans annotation (>50%).
Comme nous l’avons vu dans l’introduction, les études menées chez les rongeurs (espèces
poly-ovulantes) ont permis d’accumuler une quantité importante de données d’expression qui
demeurent essentiellement ovocytaires. Peu de données sont actuellement disponibles chez les
espèces mono ovulantes.
Ce travail décrit donc pour la première fois, un transcriptome séparé pour chaque
compartiment et stade de la folliculogenèse basale de la brebis.
En premier lieu, notre jeu de données d’expression décrit bien notre processus biologique
puisque l’analyse descriptive en composantes principales sépare les compartiments et les
différents stades de développement (Article 2, Figure 2B).
96
Le nombre élevé de gènes exprimés au cours de la folliculogenèse atteste d’une importante
activité transcriptionnelle que ce soit dans l’ovocyte ou les cellules de granulosa (15349 gènes
soit 78,6% des gènes annotés et localisés sur le génome ovin (version d’assemblage du
génome Sheep Genome v2.0). Notre étude identifie aussi, comme Ramkold et ses
collaborateurs (Ramskold et al. 2009), un nombre important de gènes ubiquitaires (exprimés
dans les deux compartiments et les 12 tissus), ce qui suggère que la spécialisation des
compartiments ne soit pas liée à un grand nombre de gènes mais résulte plutôt d’un contrôle
complexe et subtil des gènes.
L’analyse statistique globale identifie ensuite des différences d’expression entre les
compartiments (5129 gènes) et au cours du développement folliculaire (3015 gènes).
L’ensemble de cette étude met en évidence deux groupes d’expression bien distincts entre
PD-PM et SC-SA qui montrent que la transition primaire- secondaire est une transition
importante chez la brebis. Cette transition implique de gros changements d’expression et de
fonctions, avec :
¾ une diminution significative du nombre de gènes exprimés dans l’ovocyte entre
les 2 groupes (PD-PM et SC-SA : ~11% de gènes en moins, Article 2, Figure2A).
¾ des profils d’expression qui constituent clairement deux groupes d’expression
(Article 2, Figure 2C ; Article 3, Figure 1).
¾ des différentiels d’expression dans l’ovocyte de brebis qui sont associés à une
diminution de l’expression des gènes, soit 74% des GDE dans l’ovocyte (Article 3, Figure 2).
¾ Un changement dans l’expression ovocytaire qui reflète des variations
importantes dans les fonctions à partir des stades secondaires (Article 3, Figure S1).
Cette diminution du nombre de gènes et de transcrits dans l’ovocyte à partir du stade
secondaire coïncide avec l’initiation de la méthylation de l’ADN de certains gènes à
empreinte (~ovocytes de 50 μm) (Denomme et al. 2012) et pourrait être associée à ce
processus. D’autres études rapportent également une augmentation du niveau de méthylation
de l’ADN en fonction du stade folliculaire (Hiura et al. 2006; Song et al. 2009).
L’étude de Pan et ses collaborateurs à partir d’ovocytes de souris (Pan et al. 2005), situe les
changements majeurs d’expression entre le follicule primordial et primaire. Ce décalage entre
les deux espèces (changements majeurs chez la brebis PM/SC et chez la souris PD/PM)
pourrait refléter une différence dans la vitesse du développement ovocytaire.
97
Nous observons également une dynamique d’expression différente entre les deux
compartiments folliculaires. D’une part trois fois plus de gènes ont une expression qui varie
au cours de la croissance précoce dans l’ovocyte (Tableau 21). D’autre part de gros
changements d’expression s’observent au cours de la transition PM/SC et SC/SA dans
l’ovocyte alors que es changements d’expression interviennent principalement au cours de la
transition PM/SC dans les CG (Figure 16).
Afin de mieux comprendre les processus moléculaires mis en place au cours de la croissance
folliculaire basale, nos travaux se sont focalisés :
¾ d’une part sur les différences d’expression entre les deux compartiments
folliculaires (O/CG) (Article 1 et 2 (5129 gènes)) pour nous permettre d’identifier un dialogue
moléculaire entre les cellules ainsi que les expressions « spécifiques » de compartiments.
¾ et d’autre part sur les différences d’expression au cours de la croissance
folliculaire basale (Article 3 : 3015 gènes) afin d’identifier les processus clés de cette
croissance et d’en isoler des biomarqueurs expressionnels.
L’interprétation biologique de ces listes de gènes différentiellement exprimés a été effectuée
avec le logiciel IPA en recherchant les mécanismes enrichis en GDE, la conséquence (sens
d’activation des mécanismes) et la cause des changements d’expression (état d’activation des
régulateurs).
Cette analyse apporte un éclairage sur l’implication de différentes fonctions et mécanismes
dans ce processus biologique.
98
Figure 38. Réseau des gènes impliqués dans la regulation de l’atrésie ovocytaire.
Source Article 2, Figure 6
La couleur rouge représente les gènes surexprimés dans l’ovocyte.
Etude des compartiments
Les fonctions
tude des compartiments
1.
es fonctions
L’ensemble de ces travaux (puces Affymetrix et RNA-seq ; Article 1 et 2) montre que les
gènes différentiellement exprimés interviennent dans des fonctions qui décrivent le devenir
des deux types cellulaires :
¾ L’ovocyte a un volume qui augmente de l’ordre de 300 fois entre le stade
primordial et antral (enrichissement de la catégorie fonctionnelle « morphology of germ
ells ») (McNatty et al. 1999), se bloque en fin de méiose I (« cell cycle», « meiotic arrest ») et
produit et stocke des ARN pour permettre le début de l’embryogenèse (« gene regulation »).
¾ Les CG changent de forme (forme aplatie à cuboïdale : catégories « cell
movement »; « shape change of tumor cell lines »), se multiplient (x 40 chez la brebis
jusqu’au stade secondaire : « cellular growth » et produisent des stéroïdes (« lipid
metabolism »).
.
es mécanismes
2.1
L’ovocyte
Deux mécanismes importants sont soulignés dans cette analyse : le blocage de la méiose et la
survie de l’ovocyte.
Chez les mammifères, la méiose est initiée pendant la vie fœtale et la prophase I reste bloquée
au stade diplotène lors de la transition G2/M du cycle cellulaire jusqu’à la reprise de la méiose
avant l’ovulation. Notre étude identifie la surexpression dans l’ovocyte d’un grand nombre de
gènes impliqués dans la régulation de la méiose chez la souris (Morelli and Cohen 2005)
(SYC1-3, FKBP6, DDX4 (Mvh), SPO11, BRCA2 (beta-transducin repeat containing E3
ubiquitin protein ligase 2), SMC1B, EXO1, PIW1L1 (piwi-like RNA-mediated gene silencing
1), DMC1, MSH4, CDC25B, PLK1 (pyruvate dehydrogenase kinase, isoenzyme 1)) (Article 2
supplemental File 6).
99
Les mécanismes
L’atrésie folliculaire est un processus important qui concerne la majorité des follicules
L’apoptose est détectée dans les ovocytes des follicules primordiaux puis se propage aux CG
de follicules en croissance. L’augmentation de l’expression des gènes anti-apoptotiques
dans l’ovocyte témoigne d’une protection contre l’atrésie (Figure 38 ; Article 2, Figure 6).
Nous décrivons en détail, par exemple, différents gènes de la famille de BCL2 qui sont
surexprimés dans l’ovocyte (BCL2L1-10-11-14). Les gènes BCL2L1, BCL2L10 et BCL2L11
sont déjà connus chez la souris et l’homme pour leur implication dans la survie, le
développement et l’apoptose des ovocytes (revue (Sui et al. 2010; Boumela et al. 2011). La
Figure 38 suggère également l’implication d’autres facteurs de survie comme VEGF, KIT,
DAZL and FIGLA susceptibles de protéger l’ovocyte de l’atrésie.
2.2
Lescellulesdegranulosa
Dans les CG, des mécanismes enrichis par les gènes surexprimés viennent appuyer les
fonctions précédemment décrites :
a.
rolifération
La croissance précoce des follicules est régulée localement par des facteurs de croissance
autocrine et paracrines. Notre analyse identifie des facteurs bien connus pour stimuler la
prolifération des cellules de granulosa, tels que la famille des BMP et FGF (Article 2 Figure
4 ; Article 1 Figure annexe 7). L’expression de PDGFC-D et de leurs récepteurs (PDGFRAB-L) qui avait été préalablement décrite chez la souris par Yoon et ses collaborateurs (Yoon et
al. 2006) est aussi confirmée chez la brebis.
ous détectons pour la première fois dans les C , l’expression de HGF et son récepteur
MET ainsi qu’un enrichissement en gènes de sa voie de signalisation (Article 2, Figure 3).
Chez la souris, hgf est faiblement exprimé dans les CG et montré essentiellement exprimé
dans la thèque. La protéine HGF stimule in vitro la prolifération des cellules de granulosa et
influence indirectement le développement de l’ovocyte en stimulant l’expression de KITLG
dans les cellules de granulosa (Guglielmo et al. 2011).
n complément des données existantes qui identifient l’expression de GLI3 dans l’ovocyte
de souris pendant la phase basale (Pan et al. 2005), nos résultats montrent que les cellules de
granulosa de brebis possèdent la machinerie des voies de signalisation SHH (gènes SMO,
PTCH1 et GLI1-2-3). GLI3 est plus exprimé dans les CG que dans l’ovocyte chez la brebis et
son expression ne varie pas de manière significative au cours de la croissance précoce. La
100
Les mécanismes
voie de signalisation Hedgehog (HH) est impliquée dans la fonction ovarienne chez la
drosophile mais son rôle est moins connu chez les mammifères. GLI3, par exemple, est un des
facteurs de transcription centraux de cette voie de signalisation et régule des gènes comme les
BMP et WNT (Cohen 2003). HH stimule la croissance des CG aux stades pré-antraux chez la
souris (Russell et al. 2007). Nous ne détectons pas d’expression de gènes de la famille HH
dans les follicules pré-antraux de brebis.
Dans l’ovaire la voie de signalisation WNT/ caténine joue aussi un rôle important dans les
processus de migration des CGP et dans la différenciation précoce de l’ovaire (Figure 18)
puis, dans les stades tardifs, l’ovulation et la lutéinisation (Boyer et al. 2010). Cette voie de
signalisation est par contre peu décrite au cours de la folliculogenèse basale. Seules les
expressions de WNT 2 et WNT4 sont bien caractérisés dans les CG à ce jour. L’invalidation
conditionnelle de wnt4 dans l’ovaire de souris dès les stades précoces, aboutit à des ovaires
avec peu de follicules antraux sains. Cette perte de follicules semble liée à une augmentation
de l’atrésie folliculaire (Boyer et al. 2010). Une activation constitutive et conditionnelle de
ctnnb1 change également le devenir des CG en cellules pré-cancéreuses. Ces travaux
montrent donc aussi le rôle important de ctnnb1 dans la prolifération des cellules de
granulosa. En complément, WNT peut, dépendamment ou non de la CTNNB1, utiliser la voie
de signalisation des Rho-GTPases pour favoriser un changement de forme et d’activité
transcriptionnelle (Schlessinger et al. 2009).
otre étude décrit donc l’expression de WNT4
et pour la première fois l’expression des ligands WNT 3A-5A-6 et des récepteurs FDZ1,
LRP1-11 dans les CG de brebis. L’expression de CTNNB1 et un enrichissement en GDE de la
voie de signalisation Rho-GTPases sont aussi identifiés. L’ensemble de ces résultats
suggèrent un rôle dans la prolifération et ou dans le changement de forme des CG.
Par ailleurs, la surexpression des gènes ESR1 et AR, récepteurs respectifs de l’œstradiol et des
androgènes, propose l’implication des hormones stéroïdes dans le développement folliculaire.
Le rôle des androgènes dans l’activation et la croissance des follicules a déjà été montré in
vitro sur du cortex ovarien de vache (Yang and Fortune 2006). L’invalidation conditionnelle
d’ar dans les souris induit aussi un POF avec des ovaires contenant plus de follicules préantraux (Sen and Hammes 2010).
En complément, les voies de transduction du signal les plus impliquées dans les cellules de
granulosa correspondent à l’AMPc et PKA. PKA est aussi capable d’interagir avec la
signalisation p38 MAPK et ERK (Gerits et al. 2008) (Article 2, Figure 6D).
101
Les communications cellulaires
b.
téro dogenèse
Dans les CG, nous observons l’expression de gènes impliqués dans les métabolismes des
lipides et des stéroïdes comme par exemple CYP11A1 (cytochrome P450, family 11,
subfamily A, polypeptide 1), HSD3B (hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta) et
HSD17B (hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase) nécessaire à la synthèse des stéroïdes.
Nous détectons aussi l’expression de gènes appartenant à la superfamille des récepteurs
nucléaires :
¾ des récepteurs orphelins (NR5A1, NROB2 (NROB2 small heterodimer partner),
¾ des récepteurs d’hormones stéroïdiennes (LXR (NR1H2), FXR (NR1H4)),
¾ ainsi que le co-récepteur de l’acide rétinoïque RXRA
Ces récepteurs nucléaires sont des régulateurs clés intervenant dans de nombreux processus
(reproduction, croissance cellulaire, développement). L’invalidation conditionnelle de nr5a1
(sf1) dans les CG de souris provoque la stérilité. Les ovaires ont moins de follicules une
expression réduite d’amh (Pelusi et al. 2008). Nous décrivons enfin pour la première fois dans
l’ovaire, l’expression de gènes comme LXRB et FXRA qui se lient au récepteur RXRA pour
former des hétérodimères. LXR est activé par les oxystérols, produits intermédiaires dans la
production des hormones stéroïdes et la synthèse du cholestérol et est impliqué dans la
régulation de la stéroïdogenèse chez la souris au stade antral (Beltowski and Semczuk 2010).
FXR est activé par les acides biliaires, les stérols et différents lipides. C’est un régulateur
probable de l’homéostasie des hormones androgènes dans la gonade mâle (Koutsounas et al.
2012). Les voies de signalisation PPAR et AMPK tiennent aussi des rôles importants dans le
métabolisme lipidique. AMPK inhibe, par exemple, la production de progestérone dans
plusieurs espèces (Dupont et al. 2008) (Article 2 Figure 3D).
Ces résultats montrent que les follicules précoces possèdent la machinerie nécessaire pour
produire les hormones stéroïdes. Ils renforcent les résultats précédents qui suggéraient une
production et un effet des stéroïdes dès le stade primordial (chez la souris (Kezele et al.
2005) et la femme (stades PD/PM) (Markholt et al. 2012).
3.
es communications cellulaires
La communication bidirectionnelle entre ovocyte et cellules somatiques joue un rôle central
dans la croissance folliculaire. Nos résultats tracent les deux types de communication mis en
102
Les communications cellulaires
jeu : les interactions physiques (jonctions transzonales) et le dialogue moléculaire entre les
deux compartiments.
Le dialogue moléculaire entre les deux compartiments peut être illustré par les voies de
signalisation NOTCH, VEGF et IGF1.
ous retrouvons pour chacune de ces voies de
signalisation l’expression des ligands dans un compartiment et les récepteurs dans
l’autre. La présence des protéines respectives dans l’ovocyte et les CG reste à confirmer.
Chez la brebis, nous détectons les transcrits 2 et 3 de NOTCH1, dans les CG et leurs ligands
JAG1 et DLL3 (Delta-Like Homolog, Drosophila) et les facteurs de transcription cible HES1
et HEY dans l’ovocyte (Article 2, Figure 5A). En complément du rôle connu de NOTCH sur
la croissance et la maturation de l’ovocyte (Trombly et al. 2009), notre étude suggère
l’implication de NOTCH dans la prolifération des CG grâce à la liaison possible de NOTCH1
sur son récepteur CNTN1, également exprimé dans les CG (Zhang et al. 2011) (Article 2,
Figure 5B).
VEGF est un facteur de croissance déjà connu pour stimuler la transition primaire-secondaire
chez la vache (Yang and Fortune 2007). Nous identifions l’expression de VEFGA et son
corécepteur NRP1 (natriuretic peptide receptor 1) dans les CG.
’expression de son
recepteur FTL1 est identifiée pour la première fois dans l’ovoc te o il est très exprimé
(Article 2, Figure 5C). Comme nous l’avons mentionné dans l’introduction (Croissance
folliculaire/Rôle des hormones et facteurs de croissance), Ftl1 et Kdr sont exprimés, chez les
primates et les rongeurs et la brebis (CG). Notre étude montre que VEGFA pourrait intervenir
comme facteur paracrine sur l’ovocyte par liaison sur son recepteur FLT1 pour agir sur la
réorganisation de l’actine ovocytaire (Kearney et al. 2004).
Chez les mammifères, le rôle de l’insuline et d’IGF1 est largement décrit pour les stades
tardifs de la folliculogenèse. L’IGF1 et l’insuline régulent, à ces stades, la stéroïdogenèse et
l’apoptose des cellules de granulosa. Le rôle d’IGF1 et de l’insuline est, par contre, peu étudié
dans les stades précoces. Ces deux hormones agissent en se fixant sur leurs récepteurs INSR
(insulin receptor) et IGF1R (IGF1 receptor). La production d’IGF1 par l’ovaire est différente
en fonction des espèces. Igf1 est exprimé principalement par les cellules de la granulosa chez
le rat et la truie (Mazerbourg et al. 2003) mais ce facteur est aussi présent dans l’ovocyte des
follicules pré-antraux chez le rat (Zhao et al. 2001). Différemment, le transcrit ne semble pas
être présent dans les ovaires de brebis adulte (hybridation in situ (Perks et al. 1995)) et de
vache (Mazerbourg et al. 2003). L’expression de son récepteur IGF1R est détectée dans les
103
A
B
Figure 3 . ilan des connaissances sur le dialogue moléculaire
A.
B.
Données connues dans la littérature
Données obtenues dans notre expérience chez la brebis
En rouge les gènes ou la signalisation des CG
En jaune, les gènes ou la signalisation des ovocytes
En vert, les nouvelles données
Les spécificités de compartiments
follicules dès le stade primaire et augmente avec la croissance folliculaire chez la brebis et la
vache (Wandji et al. 1992; Perks et al. 1995). La signalisation insuline/IGF1 ne semble pas
essentielle pour cette phase précoce dans l’ovocyte de souris (Pitetti et al. 2009). Chez les
souris invalidées pour le récepteur Igf1r dans l’ovocyte seulement, les femelles sont fertiles
avec un développement et une maturation ovocytaire normale. Cependant, les souris, pour
lesquelles le gène Igf1 est invalidé, sont stériles car les follicules n’atteignent pas le stade
antral. IGF1 semble essentiel pour la prolifération des CG (Kadakia et al. 2001).
Notre étude fournit donc une description précise de l’expression des membres du système IGF
chez la brebis pendant la période pré-antrale.
lle montre pour la première fois comme
chez le rat et la truie, une expression d’IGF1 et IGF2 et de différentes IGFBP
principalement dans les C . Une expression enrichie de différents composants de cette voie
de signalisation (Article 2, Figure 4) est aussi observée chez la brebis. L’expression de IGF1R
est, elle, enrichie dans l’ovocyte. Même si la voie insuline/IGF1 n’est pas essentielle pour
l’ovocyte (Pitetti et al. 2009), ces données suggèrent un effet d’IGF1 sur la maturation de
l’ovocyte pendant la phase basale chez la brebis (Kiapekou et al. 2005).
La figure 39 résume d’une part le dialogue moléculaire connu dans la littérature (A) et celui
identifié dans notre expérience chez la brebis (B). Les nouveaux résultats sont identifiés en
vert sur ce schéma.
.
es spécificités de compartiments
Les gènes ovocytaires et leur rôle dans la folliculogenèse ont été relativement bien décrits
grâce aux modèles « souris » mais peu d’information est disponible sur les gènes spécifiques
des CG. Nous avons mis en évidence dans notre étude l’expression préférentielle de 216
gènes (161 ovocytaires et 55 somatiques) comprenant des gènes dont la fonction est inconnue
dans la folliculogenèse. Peu de gènes préférentiellement exprimés ont été identifiés dans les
CG.
4.1
Ovocyte
Dans les ovocytes nous avons identifié des gènes comme BTG4, connus pour avoir des
propriétés antiprolifératives et être impliqué dans l’arrêt du cycle cellulaire. Son expression
est restreinte à l’épithélium olfactif, le testicule et l’ovocyte chez la souris. Son rôle au cours
de la folliculogenèse basale est inconnu (Buanne et al. 2000).
104
Les spécificités de compartiments
PATL2 (P100) est une protéine de liaison à l’ARN (Marnef et al. 2010), qui s’exprime
spécifiquement dans l’ovocyte immature chez le xénope et disparait à la maturation
méiotique. Il est impliqué dans la régulation de la traduction des ARN maternels nécessaires à
la maturation de l’ovocyte (Nakamura et al. 2010). L’expression de ce gène n’est pas
documentée chez les mammifères et nous décrivons pour la première fois l’expression et
l’augmentation de son expression au cours de la croissance ovocytaire précoce chez la brebis.
Nos résultats suggèrent un rôle important de ce gène dans la répression de la traduction des
gènes pendant la période pré-antrale.
Enfin MUSK est un récepteur à tyrosine kinase qui est exprimé à faible niveau dans les
myoblastes en prolifération, qui induit la différenciation du muscle. La protéine diminue
drastiquement dans les myoblastes différenciés et reste localisée au niveau des jonctions
neuromusculaires (Kim and Burden 2008). Chez la brebis, son expression qui augmente au
cours de la croissance folliculaire basale suggère son implication dans les déformations
ovocytaires et la formation des projections transzonales nécessaires à la communication entre
les compartiments (Article 3, Supplemental File 7).
4.2
Cellulesdegranulosa
Dans les cellules de granulosa, DEFB112 est également décrit pour la première fois. Ce gène
est peu documenté mais, chez le rat et l’homme, il est exprimé dans l’épididyme et la
localisation de sa protéine est fonction de la maturation (Patil et al. 2005). Il est susceptible
d’avoir un rôle équivalent dans l’ovaire. L’expression de BMP1 dans les CG de brebis est
confirmée ici. Ce gène favorise la signalisation BMP (Canty-Laird et al. 2010). Enfin, CTP1
est une protéine chaperone exprimée de manière constante dans les CG. Elle a un rôle clé dans
la cytodifférenciation des spermatides en lien avec la plasticité des microtubules (Soues et al.
2003). Son expression suggère un rôle dans le changement de forme des cellules et la
formation des projections transzonales.
L’expression nouvelle de ces gènes dans les follicules pré-antraux est en accord avec les
données existantes et renforce leur rôle potentiel au cours de la folliculogenèse basale.
105
Le développement folliculaire précoce
Les fonctions
Le dé eloppement folliculaire précoce
1.
es fonctions
L’analyse des gènes différentiellement exprimés au cours de la croissance précoce montre que
les changements d’expression génique dans l’ovocyte ne reflètent pas d’augmentation de la
synthèse de protéines et suggère plutôt la mise en place d’un stockage des ARN (Article 3,
Figure 3). Notre analyse ne montre pas non plus, de changement d’expression génique
important pour les gènes impliqués dans la production d’énergie, ce qui suggère, comme au
stade antral, une faible implication de l’ovocyte dans cette fonction. Différentes études
montrent en effet, que la croissance et la maturation de l’ovocyte dépendent des cellules de
granulosa pour la production d’énergie et la biosynthèse de cholestérol (Li and Albertini
2013). Pendant la phase antrale, les ovocytes ne peuvent pas métaboliser le glucose,
synthétiser le cholestérol et assimiler l’alanine. Ces substances sont fournies par les CG. Les
facteurs ovocytaires tels que BMP15, GDF9 et FGF8B favorisent ces changements
métaboliques dans les CG en stimulant l’expression des transcrits codant pour les enzymes
clés impliquées dans ces processus. Elles transforment par exemple le glucose et la cystine
respectivement en pyruvate et cysteine avant de les transporter dans l’ovocyte (Sugiura et al.
2005; Su et al. 2008). Par contre dans les CG, cette catégorie « energy production» regroupe
des gènes qui interviennent dans le métabolisme des acides gras, élément de stockage de
l’énergie (SCD, BDH2, CPT).
.
écanismes mis en place au cours de du développement folliculaire
Les changements d’expression dans l’ovocyte au cours de la phase de croissance décrivent
d’une part :
¾ une intensification du contrôle du blocage de la méiose pendant la transition
PD-PM (Article 3 Figure 6A).
¾ l’initiation de l’acquisition de la compétence méiotique à partir du stade
secondaire (illustré par un enrichissement en DGE des mécanismes de régulation du cycle
106
Figure
. Chronologie des modifications cellulaires potentielles mises en place pendant
la croissance folliculaire basale.
Régulation de la croissance
cellulaire) (Article 3, Supplemental File 2, Figure S2), en accord avec les études de Pan et
collaborateurs chez la souris (Pan et al. 2005). Une augmentation progressive de l’expression
est en effet observée à partir du stade secondaire pour CCNB1 et CDK1 (CDC2), constituants
du facteur MFP (maturation promoting factor) ainsi que des gènes susceptibles de contrôler
son activation comme WEE2 (WEE1B) (Oh et al. 2011).
¾ une augmentation de la répression transcriptionnelle (augmentation de
l’expression de DNMT3B et DNMT1 par exemple) à partir du stade secondaire qui peut être
associée à la sous expression de la majorité des gènes différentiels à ce stade. Chez la souris
cette répression semble intervenir à un stade plus tardif (SA) (Pan et al. 2005).
Des modifications cellulaires sont mises en évidence au cours du développement. Elles
s’achèvent globalement au stade secondaire pour l’ovocyte et se maintiennent pendant la
durée de la croissance précoce dans les CG. Elles illustrent un changement de forme et la mise
en place des interactions physiques :
¾ Dans l’ovocyte la réorganisation du cytoplasme et la déformation cellulaire
sont en adéquation avec l’augmentation de taille de l’ovocyte. La surexpression de ZP2 et
ZP4 à partir du stade secondaire et de GJA4 (CX37) signe la formation de la membrane
pellucide et des jonctions communicantes dans l’ovocyte.
¾ Dans les CG, le changement de forme des cellules et la mise en place des
jonctions communicantes (projections cytoplasmiques, villosités, déformations cellulaires)
sont également mis en évidence. Ces résultats sont renforcés par la surexpression de GJA1
(CX43) gènes indispensables à la formation des jonctions communicantes : dans les CG. Ils
complètent des analyses morphologiques et structurelles effectuées par microscopie chez la
chèvre (Lucci et al. 2001). Ces résultats sont résumés Figure 40.
3.
égulation de la croissance
La croissance folliculaire basale est régulée par des facteurs intra ovariens et dépend d’un
dialogue moléculaire étroit entre les types cellulaires. Cette étude suggère l’activation de
différents mécanismes et régulateurs, capables d’expliquer les changements d’expression au
cours de la croissance folliculaire. Les régulations les plus significatives sont résumées sur les
Figures 41 et 42.
107
Figure 41. Régulateurs potentiels impliqués dans la croissance folliculaire basale.
Figure 42. Facteurs de transcription potentiels impliqués dans la croissance folliculaire
basale.
Encadré jaune : gènes ovocytaires
Encadré rose : gènes CG
En vert sont représentés les protéines inhibées, en rouge les protéines activées
3.1
Voiesdesignalisationetfacteursdecroissance
Les membres de la famille WNT sont majoritairement exprimés dans les CG. Chez la brebis
leur expression et celle de leurs récepteurs augmentent au cours de la croissance, ce qui
renforce leurs rôles potentiels dans le développement précoce de la folliculogenèse. Par
contre, les antagonistes de cette voie de signalisation présentent des profils d’expression
spatio temporels différents, ce qui souligne la complexité des régulations (Figure 41).
Chez la brebis l’expression de PDGFC et ses récepteurs PDGFRA et PDGFRB augmente au
cours de la folliculogenèse basale, ce qui suggère comme chez la souris un rôle de ce facteur
de croissance dans le contrôle de la prolifération des CG (Figure 41).
Chez la brebis, différentes mutations ont été identifiées sur les gènes BMPR1B (bone
morphogenetic protein receptor, type 1B) et BMP15 et ont montré que la signalisation BMP
était indispensable à une folliculogenèse adéquate chez la brebis (Galloway et al. 2000; Fabre
et al. 2003; Bodin et al. 2007). Une activité réduite de la voie de signalisation BMP (brebis
hétérozygotes) conduit à diminuer la prolifération des cellules de granulosa et augmenter la
sensibilité à FSH. Ceci aboutit à l’ovulation de plusieurs follicules de plus petites tailles.
Notre étude propose l’implication de BMPER (BMP-binding endothelial regulator) pendant la
transition du follicule primaire en secondaire (Figure 41). BMPER est un modulateur de la
voie de signalisation de BMP (BMP2, BMP4, BMP6) (Willis et al. 2013) et présente une
affinité importante avec un autre antagoniste des BMP : la chordine (CHRD) (Zakin et al.
2010). Dans la littérature, ce gène est peu documenté par rapport à une activité ovarienne.
Chez la souris, bmper s’exprime à partir du stade primaire (ovaires de 8 jours : étude sur gel
(Fenwick et al. 2011) mais n’est pas détecté dans l’ovocyte. Ce gène est décrit ici pour la
première fois comme étant principalement exprimé dans l’ovocyte de brebis avec une
expression qui augmente à partir du stade secondaire (Article 3, Figure5). Le gène CHRDL1
(chordin-like 1) est également exprimé dans les deux compartiments et son expression
augmente dans les CG au cours du développement. Dans notre jeu de données, les cibles
potentielles identifiées de BMPER sont ACTA2, ACVRL1 (activin A receptor type II-like 1),
MGP (matrix Gla protein) et PECAM1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule 1), dont
leurs expressions diminuent au stade secondaire. Des expériences complémentaires sont
nécessaires pour comprendre le rôle de BMPER au cours de la folliculogenèse. Les
différentiels d’expression d’autres antagonistes de la voie de signalisation BMP sont aussi mis
en évidence dans cette étude dans les CG et/ou les ovocytes : FST, WFIKKN2 (WAP,
follistatin/kazal, immunoglobulin, kunitz and netrin domain containing 2), GREM2 (DAN
108
domain family member 3; cysteine knot superfamily 1, BMP antagonist 1). Ceux-ci illustrent
la complexité des régulations.
3.2
Régulateurstranscriptionnels
Parmi les 21 régulateurs transcriptionnels potentiellement impliqués dans les changements
d’expression, nous soulignons en accord avec la littérature, le rôle de NOBOX dans l’ovocyte
et de FOXL2 dans les CG à partir du stade secondaire (Rajkovic et al. 2004).
a.
ans les cellules de granulosa
Les régulateurs potentiellement activés sont associés à la régulation des stérols (SREBF2
(Sakakura et al. 2001)), la réponse hormonale (EGR1, CREB (cAMP responsive element
binding protein 1), SKIL (SKI-like), ETS1), la croissance cellulaire et le développement
(TP53, XBP1, MYC (myelocytomatosis oncogene), SOX9 (Guth and Wegner 2008), ETS2
(Dwyer and Liu 2010), NFIA, HIF1A, NFIA (Gronostajski 2000)), la différenciation (MITF
(Wan et al. 2011), SRF (Modak and Chai 2010), IRF6 (Restivo et al. 2011)). Nous décrivons
pour la première fois la surexpression de NFIA et HIF1A ainsi que l’activation de leur
protéine dans les CG pendant la phase pré-antrale. Ces deux gènes sont susceptibles de jouer
un rôle important dans la croissance folliculaire.NFIA est un facteur de transcription impliqué
dans le contrôle de la croissance chez l’homme et la plupart des espèces modèles
(Gronostajski 2000).
HIF1A est une protéine qui interagit avec ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear
translocator) (voie de signalisation AHR) et active des gènes impliqués dans le métabolisme
énergétique, l’angiogénèse et l’apoptose (Zagórska and Dulak 2004). L’expression de 59
gènes est potentiellement stimulée par HIF1A dans notre expérience et l’expression de ce
gène augmente significativement au cours de la croissance (3,5 fois).
MITF est aussi un facteur de transcription central reliant la signalisation extracellulaire et les
gènes cibles de la mélanogenèse (spécialisation cellulaire précoce de l’œil (épithélium de la
rétine) et le développement de la peau) (Wan et al. 2011). Il est lui-même activé par d’autres
facteurs de transcriptions tels que les co-activateurs de PPARG (Shoag et al. 2013). Enfin,
SREBP2 est un facteur de transcription ubiquitaire clé qui induit la biosynthèse de cholestérol
(Sakakura et al. 2001) et des stéroïdes. Il active par exemple l’expression de star et cyp17a1
(cytochrome P450, family 17, subfamily A, polypeptide 1) (Shea-Eaton et al. 2001; Ozbay et
al. 2006).
109
n complément certains de ces régulateurs transcriptionnels sont aussi potentiellement
spécifiques de stade. A l’exception de SOX9 (activé au stade PM), ils sont activés au stade
SA (ETS2, MITF, SRF, IRF6, NFIA, SREBF2, PPARG1A) (Figure 42).
b.
ans l’o ocyte
es facteurs de transcription spécifiques de stade sont impliqués dans :
¾ la différenciation (SOX10 (Guth and Wegner 2008), MEF2C (myocyte
enhancer factor 2C) (Potthoff and Olson 2007)),
¾ la sensibilité aux oestrogènes (KLF9) (Natesampillai et al. 2008).
L’activité de KLF9 ainsi que son expression diminuent en fin de stade pré-antral (SA). Ce
facteur est impliqué dans un grand nombre de fonctions dont la fonction de reproduction. Il
module la sensibilité des cellules à l’œstradiol dans les cellules de l’endomètre (Simmen et al.
2010). Dans les CG, il réprime la transcription de LDLR (low density lipoprotein receptor),
cyp11 et stimule STAR (steroidogenesis acute response) (Natesampillai et al. 2008). Son rôle
dans l’ovocyte reste à élucider. MEF2C, est un facteur de transcription important dans la
différenciation de plusieurs types cellulaires et dans l’organogenèse (muscles, cerveau…). Il
joue un rôle central dans la transmission des messages extracellulaires au génome et dans
l’activation des programmes génétiques qui contrôlent la différenciation, prolifération,
apoptose… (Potthoff and Olson 2007). L’expression et l’activité augmentée de MEF2C au
stade avancé de différenciation de SA est en adéquation avec le développement de l’ovocyte.
Enfin, les gènes de la famille SOX jouent un rôle très important dans l’embryogenèse et la
différenciation des cellules. SOX9 est impliqué dans le développement de la gonade mâle
(Introduction bibliographique, chapitre III, Ovogenèse foetale), des chondrocytes et des crêtes
neurales et SOX10 dans la survie et la différenciation des cellules des crêtes neurales pendant
leur migration (Guth and Wegner 2008). De manière surprenante, nous détectons une
expression stable de SOX9 dans les GC chez la brebis au cours de la croissance précoce
(période néonatale). Néanmoins chez la souris, même si la localisation spatiotemporelle est
différente, la protéine est présente dans les follicules. Une expression transitoire de la protéine
a été détectée dans les cellules de thèque interne des follicules pré-antraux et antraux en
fonction du cycle sexuel chez l’adulte. Aucune protéine n’est détectée chez les souris
immatures (Notarnicola et al. 2006). SOX9 active l’expression de l’amh et son rôle potentiel
au stade secondaire chez la brebis est en accord avec un début d’expression de l’AMH dans
ces cellules. (De Santa Barbara et al. 1998). SOX10 est identifié pour la première fois dans
110
Les spécificités de stades
l’ovocyte au cours de la croissance folliculaire et son expression est accompagnée d’une
activation prédite de la protéine au stade primaire. Le rôle de ces deux gènes SOX dans la
croissance folliculaire reste à préciser.
Les régulateurs de transcription spécifiquement activés à un stade donné sont présentés Figure
42.
.
es spécificités de stades
Un jeu de 29 marqueurs expressionnels préférentiellement exprimés à un stade de
développement folliculaire in vivo donné a été sélectionné. Les gènes BMP15, SPO11, WEE2,
FST connus pour leur rôle important dans la transition primaire secondaire, la méiose et la
folliculogenèse basale sont retrouvés parmi ces marqueurs expressionnels.
Ces marqueurs sont, comme les gènes d’expression spécifique de compartiments, susceptibles
de jouer un rôle important dans le développement ovarien. Le gène CNR1 (type 1-cannabinoid
receptor) exprimé dans les CG au stade SC, par exemple, code un des récepteurs des
cannabinoïdes impliqué dans la régulation des fonctions neuronales (Compagnucci et al.
2013) et dans les réponses inflammatoires (Gaffal et al. 2013). Une étude récente montre que
ce récepteur régule la différenciation des spermatides. L’invalidation du gène influence le
remodelage de la chromatique spermatique en réduisant le déplacement des histones (Cacciola
et al. 2013). Son rôle dans les CG reste à définir. Le gène KCNK9 (potassium channel,
subfamily K, member 9) exprimé dans l’ovocyte au stade PD, code pour une protéine de la
famille des canaux potassium, présente chez la vache dans la membrane ovocytaire (Hur et al.
2009). Enfin le gène IGF2BP1 fait partie d’une famille de protéines oncofœtales se liant à
l’ARNm. Ces protéines ne sont généralement pas exprimées dans les tissus adultes à
l’exception du testicule. L’expression des protéines IGF2BP1, 2 et 3 a été confirmée dans les
gonades femelles de souris et d’humain (Hammer et al. 2005). L’expression de la protéine
IGF2BP1 est ubiquitaire jusqu’au stade embryonnaire de 16,5 jours chez la souris puis elle est
restreinte aux cellules germinales. A 32 semaines de gestation, l’ovaire fœtal humain montre
une expression faible de la protéine dans l’ovocyte. A l’âge adulte les trois protéines sont
détectées dans les ovocytes à tous les stades et plus légèrement détectées dans les CG des
follicules. Une expression similaire de la protéine a été mise en évidence dans des ovaires de
brebis à la naissance (non publié). Nos résultats montrent ici un découplage entre la quantité
111
Figure 3.
ènes montrant des différences d’expression les plus significatives.
Encadré jaune : gènes ovocytaires
Encadré rose : gènes CG
Les spécificités de stades
de transcrits et la celle de la protéine. IGF2BP1 reste néanmoins un marqueur expressionnel
des ovocytes primordiaux. Les marqueurs montrant des différences d’expression les plus
significatives sont représentés Figure 43.
Différents protocoles de culture in vitro ont été développés pour étudier la folliculogenèse
basale au niveau fonctionnel, produire des embryons ou évaluer les protocoles de
cryoconservation de cortex ovarien. L’ensemble des marqueurs expressionnels mis en
évidence dans notre étude sera très utile pour déterminer la qualité et le développement des
cultures de cortex.
112
C
CL
I
C I
113
Conclusions méthodologiques
Conclusions méthodologiques
Le challenge méthodologique de ce travail était d’obtenir une vue globale des gènes exprimés
in vivo dans les deux compartiments folliculaires au cours des stades précoces de la
folliculogenèse chez la brebis.
Les nouvelles approches méthodologiques permettent maintenant d’investiguer les différents
compartiments de tissus hétérogènes de plus en plus précisément et d’utiliser des quantités
d'échantillons biologiques de plus en plus petites. Nous avons choisi d’optimiser 2 technologies
complémentaires pour atteindre notre objectif :
¾ la LCM pour isoler le matériel biologique qui permet d’obtenir une précision
d’isolement à l’échelle de la cellule et peut donc séparer nos deux compartiments folliculaires,
¾ et le RNA-seq pour les approches haut débit du transcriptome qui permet de
s’affranchir de la connaissance à priori de la séquence génomique, qui est sans limite critique
pour la détection du transcrit et permet donc la détection des transcrits de faible abondance.
La combinaison de ces deux technologies présente l’avantage de fournir des transcriptomes très
complets et spécifiques des types cellulaires (et non plus de l’organe), permettant ainsi
d’explorer les interactions cellulaires.
Cependant, des défis importants restent encore à relever. Ils concernent :
¾ l’amplification des ARN,
¾ le volume de données générées,
¾ les outils bioinformatiques et statistiques qui sont continuellement en
développement et qu’il est difficile de standardiser,
¾ l’annotation fonctionnelle: l’approche couramment utilisée est de déduire la
fonction des gènes par la recherche de similitude de séquence avec un organisme modèle.
Toutefois, le transfert des fonctions des gènes d'un organisme à un autre peut conduire à des
erreurs d'interprétation.
.
Conclusions biologiques
Le travail entrepris dans le cadre de ce projet de thèse est un travail original qui a généré, pour
la première fois chez une espèce mono ovulante, une base précieuse de profils d’expression
114
Conclusions biologiques
pour les deux compartiments folliculaires, ovocytes et cellules de granulosa, au cours de la
croissance précoce.
Notre étude fait le lien entre les données obtenues pendant les périodes fœtale et adulte. Elle
décrit précisément l’expression de gènes impliqués dans différentes fonctions et mécanismes
qui ont été préalablement identifiés chez la souris au cours de la période fœtale ou dans les
stades antraux.
Il ressort de ce travail que dans nos conditions expérimentales:
¾ les ovocytes et les CG font l’objet d’une activité expressionnelle intense pendant
la période basale (sur 79% des gènes ovins annotés).
¾ Les profils d’expression génique entre les deux compartiments sont bien
distincts et participent à des fonctions qui décrivent le devenir des deux types cellulaires
(cellules reproductrices (stockage d’ARNm et régulation de la méiose) et cellules nourricières
(synthèse de protéines et d’énergie).
¾ Les follicules précoces expriment des composants de différentes voies de
signalisation (NOTCH, WNT, IGF1, VEGF, SHH…).
¾ les follicules précoces possèdent la machinerie nécessaire pour produire et
réguler les hormones stéroïdes.
¾ la transition du follicule primaire au secondaire chez la brebis est une transition
capitale qui implique d'importantes variations d’expression et de fonctions.
¾ 161 et 55 gènes présentent une expression particulièrement enrichie,
respectivement dans l’ovocyte et les cellules de granulosa, et sont susceptibles d’être des gènes
importants pour le développement folliculaire basal.
Les analyses fonctionnelles « in silico » suggèrent :
¾ une protection contre l’atrésie dans l’ovocyte,
¾ une activation des communications bidirectionnelles dès la transition primordialprimaire. Deux types de communications sont suggérés :
* les interactions physiques (déformation cellulaire de l’ovocyte,
projections cytoplasmiques et microvillosités somatiques)
* la signalisation moléculaire entre cellules somatiques (WNT) et entre
compartiments O-CG (NOTCH, VEGF, IGF1, BMP…) qui s’appuie sur l’expression spatio
temporelle des ligands, récepteurs et transducteurs du signal.
- une implication de facteurs de croissance (PDGF, HGF, TNF)
115
Perspectives
Notre étude identifie des régulateurs tels que SOX10, KLF9, NOBOX, FOXL2, SOX9 …
susceptibles d’être impliqués dans les changements d’expression au cours de la croissance
folliculaire basale in vivo chez la brebis. Actuellement, de nombreuses interrogations existent
encore quant aux mécanismes de régulation de la croissance folliculaire précoce.
Disposer d’un jeu de biomarqueurs qui permettent de suivre la croissance précoce est un enjeu
important pour évaluer les protocoles expérimentaux in vivo ou in vitro. L’expression des 25
gènes que nous avons sélectionnés permet de discriminer les stades folliculaires précoces et
fournit donc une signature moléculaire de la croissance précoce. Ces gènes jouent
probablement des rôles importants dans le processus de croissance folliculaire.
erspecti es
La technologie RNA-seq produit une quantité de plus en plus importante d’information de
séquences et met en évidence des régions peu annotées dans le génome.
Notre étude montre en particulier que plus de 50% des fragments de séquence génomique n’ont
pas pu être associés à un gène. Certains de ces fragments apparaissent cependant
particulièrement intéressants. Ils regroupent un nombre non négligeable de lectures et montrent
une expression différentielle entre les deux compartiments supérieure à 100 fois. Ces données
suggèrent l’existence de nouvelles régions transcrites. Des méthodes de prédiction de gènes
pourront être utilisées pour investiguer ces nouvelles régions transcrites. Des validations
biologiques par PCR en temps réel pourront aussi être envisagées pour confirmer l’expression
de ces transcrits potentiels et déterminer leur nature.
Les analyses fonctionnelles « in silico » ont permis de proposer l’implication de différentes
voies de signalisation, régulateurs et gènes d’expression spécifiques au cours de la croissance
folliculaire précoce. Une approche fonctionnelle est maintenant requise afin de déterminer le
rôle précis de ces facteurs dans le dialogue bidirectionnel entre l’ovocyte et les CG ou dans le
contrôle de l’expression des gènes et de la folliculogenèse.
.
116
LI
C
LICA I
ICA I
117
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onnet
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osters
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118
Liaubet, Magali Sancristobal, Julien Sarry, Elena Terenina, Patrice Martin, Gwenola TosserKlopp, Beatrice Mandon-Pepin “Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes
during early follicular development obtained by Laser Capture Microdissection.” The 1st
Meeting of the Ovarian Club “The Oocyte: from Basic Research to Clinical Practice”
Barcelona, Spain, November 3-6, 2011
119
Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes
during early follicular development obtained by Laser Capture
Microdissection.
A. Bonnet1 㼲, Claudia Bevilacqua2, Francis Benne1, Loys Bodin3, Corinne Cotinot4, Laurence Liaubet1, Magali
Sancristobal1, Julien Sarry1, Elena Terenina1, Patrice Martin2, Gwenola Tosser-Klopp1, Beatrice Mandon-Pepin4
1 INRA,
UMR444 Génétique Cellulaire, Auzeville, BP52627, F-31326 Castanet-Tolosan, France
UMR1313 Génétique Animale et Biologie Intégrative, Plateforme de Microgénomique expressionnelle ICE, F-78350 Jouy-en-Josas, France
UR631 Station d’Amélioration Génétique des Animaux BP52627, F-31326 Castanet-Tolosan, France
4 INRA, UMR1198 Biologie du Développement et de la Reproduction, F-78350 Jouy-en-Josas, France
2 INRA,
3 INRA,
In different species such as sheep or mice, studies identified
oocyte
mutations in genes expressed from the beginning of the ovarian
follicle formation which could lead to sterility or hyper-prolificacy granulosa
Secondary follicle
according to the animal genotype. These reports demonstrate that
Primary follicle
a correct achievement of early folliculogenesis is a crucial step
Primordial follicle
which affects reproductive life span and fertility.
Nevertheless, due to the difficulty in obtaining biological materiel, these early mechanisms are still poorly
understood, especially in large mammals.
^JX'>"^"&@J%@%
w'X+@<|*J+^+&+^w^
The challenge of this study is to provide new insights into the regulatory mechanisms of two compartments
of follicles (granulosa cells and oocyte) during early folliculogenesis in sheep, animal model for studies of
biomedicine including reproduction.
^JX'>"^"&@J%@%
w'X+@<|*J+^+&+^w^
Capture
C
t
off the
th different
diff
t compartments
t
t
(oocyte/granulosa) and stages
(primordial/primary/secondary)
䘆 Validations:
RNA amplification
Gene expression identification
Laser Capture Microdissection (100x) :
a) Granulosa cell selection
b) Granulosa cells captured
c) Follicle after the capture
qPCR
Affymetrix geneship
(24K genes)
䘆 Sample capture and amplification
oocyte specific gene expression (qPCR)
Pd: Primordial follicle
Pm: Primary follicle
Sec: Secondary follicle
SA: Small antrum follicle
䘆 Biological significance
Three main cellular events involved in early follicle development:
1- Switch of GC from
flattened to cuboidal shape
2- Increase in the number
of GC
䘆 Microarray results
3- Oocyte enlargement
Red: Oocyte
Green: Granulosa cells
Statistically significant enriched functions of oocyte and granulosa cells using IPA
䘆 Crosstalk
between the oocyte and GC
The BMP signaling pathway
Distribution of the detected probe sets and unique annotated genes among the LCM-derived RNA samples.
䘆 Oocyte vs GC transcriptome
- 1050 Granulosa cell specific transcripts
- 759 Oocyte specific transcripts
Red: Oocyte gene expression
Green: Granulosa cell gene expression
These results demonstrated that the LCM-derived aRNA samples were representative of the cell type and/or
developmental stage concerned.
New experiments are in progress to identify oocyte and GC biomarkers and decipher the critical molecular processes and
the complexity of the communication during early folliculogenesis.
!"##
C
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A
IA I
129
ACC L
1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase homolog; Arabidopsis (non-functional)like
AC L1
activin A receptor type II-like 1
ADNc
ADN complémentaire
A
aryl hydrocarbon receptor
AKT1
thymoma viral proto-oncogene 1
ALCAM
activated leukocyte cell adhesion molecule)…)
ALK
activin receptor-like kinase
AM
anti-Mullerian hormone
AM 2
récepteur de l'AMH type 2
AMPc
adénosine monophosphate cyclique
AMPK
protein kinase, AMP-activated, alpha 1 catalytic subunit
ANOVA
ANalysis Of Variance
C
adenomatosis polyposis coli
A
androgen receptor
A KADIA/ nf11 ring finger 111, E3 Ubiquitin-Protein Ligase
ARN
Acide ribonucléotidique
ARNa
Acide ribonucléotidique amplifié
ARNm
Acide ribonucléotidique messager
ARNT
aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator
A B
ankyrin repeat and SOCS box containing 9
ATM
ataxia telangiectasia mutated homolog, human
AT
ataxia telangiectasia and Rad3 related
A KA
aurora kinase A
BAD
BCL2-associated agonist of cell death
BAMBI
BMP and Activin membrane bound inhibitor
BA
BCL2-associated X protein
BCL2
B cell leukemia/lymphoma 2
BCL2L1
BCL2 like 1
BD 2
3-hydroxybutyrate dehydrogenase, type 2
BD F
brain derived neurotrophic factor
BID
BH3 interacting domain death agonist
BMP
Bone Morphogenetic Protein
BMP
BMP-binding endothelial regulator
BMP 1B
bone morphogenetic protein receptor, type 1B
B LL
bol, boule-like (Drosophila)
BPES
Blepharophimosis Ptosis Epicantus inversus Syndrome
B CA1
breast cancer 1
B CL2
Bernardinelli-Seip congenital lipodystrophy 2 homolog, human
B
brain specific homeobox
BTG
B-cell translocation gene 4
BT C
beta-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase
CA 1
caveolin 1, caveolae protein
CALB2
calbindin 2
CB 2/M33
Chromobox homolog 2, Drosophila, polycom class
CC D1
cycline D1
CDC2 ou CDC1
cyclin-dependent kinase 1
CDC25B
cell division cycle 25B
CDK
Cyclin-dependent kinase
CDK 1B
(p2 kip1) cyclin-dependent kinase inhibitor 1B
C
cellules de granulosa
C
cellules germinales primordiales
C D
chordin
C DL1
chordin-like 1
C T 1
contactin 1
C 1
type 1-cannabinoid receptor
CP B1
cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1)
C T
carnitine palmitoyltransferase
C B
cAMP responsive element binding protein 1
CT F
connective tissue growth factor
CTP1
CtIP-related endonuclease
CT B1
catenin (cadherin-associated protein), beta 1
C L1A1
collagen, type I, alpha 1
C 3 ou C A connexin 37
C 3 ou C A1 connexin 43
C CL12 ou DF1 chemokine (C-X-C motif) ligand 12
C C
chemokine (C-X-C motif) receptor 4
C P11A1
cytochrome P450, family 11, subfamily A, polypeptide 1
C P1 A1
cytochrome P450, family 17, subfamily A, polypeptide 1
C P1 A1
aromatase, Cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1
C P26A1
cytochrome P450, family 26, subfamily a, polypeptide 1
C P26B1
cytochrome P450, family 26, subfamily b, polypeptide 1
differential screening selected gene abberative in neuroblastoma
Dazl
deleted in azoospermia-like
DD / A A/Mvh
D-E-A-D (aspartate-glutamate-alanine-aspartate) box polypeptide)
D FB112
defensin, beta 112
D
diethylstilbestrol
DKK
dickkopf
DLL
Delta-Like Homolog, Drosophila
DMC1
disrupted meiotic cDNA 1 homolog
DM TC2
doublesex and mab-3 related transcription factor like family C2
D D1
dead end homolog 1, zebrafish
D MT1
DNA methyltransferase (cytosine-5) 1
D MT3B
DNA methyltransferase 3B
DP103
DEAD box-containing
DP L2
dihydropyrimidinase-like 2
D 1
endothelin 1
2F1
E2F transcription factor 1
GF
Epidermal growth factor
G 1
early growth response 1
M 2
Empty Spiracles, Drosophila, 2, Homeobox of 2
eNos
nitric oxide synthase 3, endothelial cell
K/MAPK1 mitogen-activated protein kinase 1
1
estrogen receptor 1
T 2
v-ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 2
130
1
exonuclease 1
FA CL
Fanconi anemia, complementation group L
FA
TNF receptor superfamily member 6
FC
Fold change / differentiel d’expression
FDR
false discovery rate
FGF
fibroblast growth factor
FGF2
fibroblast growth factor 2, basic
FGF
fibroblast growth factor receptor
FIGLA
folliculogenesis specific basic helix-loop-helix
FIGF
c-fos induced growth factor
KC K
potassium channel, subfamily K, member 9
FKBP-12/ FKBP1a
FK506 binding protein 1a
F
FK506 binding protein 6
FLT1
Fms-Related Tyrosine Kinase 1
F G2
zinc finger protein, FOG family member 2
FC
Fold change
F L2
FORKHEAD box L 2
F
3A
Forkhead o3a
FS
fragments de séquence
FSH
hormone folliculostimulante
F
follicle stimulating hormone receptor
F T
follistatine
F D
Frizzed family receptor
GAB1
growth factor receptor bound protein 2-associated protein 1
GATA2
GATA binding protein 2
GATA
GATA binding protein 4
GC A1
germ cell nuclear antigen 1
GDE
gènes différentiellement exprimés
GDF
Growth Differentiation Factor 9
G
growth hormone receptor
GLI1
Glioma-Associated Oncogene Homolog 1
GLI2
3
GLM
Modèle linéaire généralisé
GMPc
guanosine monophosphate cyclique
Gn
uteinizing-releasing hormone
GPC
G-Protein Coupled Receptor
G M1 et 2 DAN domain family member 3; cysteine knot superfamily 1, BMP antagonist 1 et 2
G P3/ A G P3
RAS guanyl releasing protein 3 (calcium and DAG-regulated)
G K3
glycogen synthase kinase 3 beta
1
H1 histone family, member O, oocyte-specific
DAC
histone deacetylase 9
1
hairy and enhancer of split 1, Drosophila
2
HES-related repressor protein 2
GF
hepatocyte growth factor
IF1A
hypoxia inducible factor 1, alpha subunit (basic helix-loop-helix transcription factor))
PK
ribonucléoprotéine K
C
homeobox C4
D3B
D1 B
PA2
IAP
ICAM5
IF
IGF1
IGF1
IGFBP
IGF2BP1
IL1B
I
I
IOP
IPA
ITGB
AG1
jpc
jpp
KD
KGF FGF
KIT ou c-KIT
KITL
KLF
LCM
LDL
LH
L 8
L
LIF
LIF
LIM1
L P
L
l
L T 1
MA L
M F2C
MITF
M T/c-M T
MGP
MOF
M
MPF
M
mTORC1
S
M C
A G
hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta
hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase
heat shock 70kDa protein 2
Inhibitors of apoptosis
intercellular adhesion molecule 5, telencephalin
interferon, epsilon
insulin like growth factor 1
IGF1 receptor
insulin-like growth factor binding protein
insulin-like growth factor 2 binding protein 1
interleukin 1, beta
inhibine
insulin receptor
insuffisance ovarienne précoce
Ingenuity Pathway Analysis software
Cdkn1a cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (P21)
protein jagged-1
jour post coïtum
jour post partum
Fetal Liver Kinase 1
keratinocyte growth factor
v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog
Kit-ligand appelé aussi Stem cell factor
Kruppel-like factor 9
Laser capture microdissection (microdissection à capture laser)
low density lipoprotein receptor
Hormone lutéinisante
LIM homeobox protein 8
LIM Homeobox gene 9
leukemia inhibitory factor
leukemia inhibitory factor receptor alpha
LIM Homeobox gene 1
Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein
iver X receptor
leucine zipper, putative tumor suppressor 1
maelstrom
myocyte enhancer factor 2C)
microphthalmia-associated transcription factor
met proto-oncogene
matrix Gla protein
Multiple ovocyte follicles
Moloney sarcoma oncogene
maturation promoting factor
mutS homolog 4 ,E. coli
mamalian target of rapamycin
muscle, skeletal, receptor tyrosine kinase
myelocytomatosis oncogene
Nanog homeobox
131
A
2
S3
nanos homolog 2, Drosophila
nanos homolog 3, Drosophila
FIA
nuclear factor I/A
NF-KB/ Nfkb1 nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B cells 1, p105
GF
nerve growth factor
NGS
next generation sequencing
L P
NLR family, pyrin domain containing
B
newborn ovary homeobox protein
TC
neurogenic locus notch homolog protein
G
noggin
NPPC
natriuretic peptide type C
P 1
natriuretic peptide receptor 1
1 2/L
nuclear receptor subfamily 1, group H, member 2
1 /F
nuclear receptor subfamily 1, group H, member 4
r a1 SF 1 : récepteur liver homologue 1,nuclear receptor subfamily 5, group A, member 1
5A2
nuclear receptor subfamily 5, group A, member 2
6A1
nuclear receptor subfamily 6, group A, member 1
B2
NROB2 small heterodimer partner
T3
neurotrophin 3
T / TF5
neurotrophin 4/5
T K1/T KA neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 1
T K2
neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2
O
ovocyte
CT
optimal cutting temperature compound
ct
POU class 5 homeobox 1
PATL2
protein associated with topoisomerase II homolog 2 ; yeast
P53/TP53
tumor protein p53
P CAM1
platelet/endothelial cell adhesion molecule 1
PD
follicule primordial
PD 3A
phosphodiesterase 3A cGMP-inhibited
PDGF
platelet derived growth factor
PDK1
pyruvate dehydrogenase kinase, isoenzyme 1
PI3K
protéine kinase 1 3- phosphoinositide-dépendante
PIP2
phosphoinositol 4,5bis phosphate
PIP3
phosphoinositol 3,4,5 triphosphate
PI IL1
piwi-like RNA-mediated gene silencing 1
PM
follicule primaire
POF
premature ovarian failure
P 5F1/ CT / CT3 POU class 5 homeobox 1 transcription factor
PPA G
peroxisome proliferator-activated receptor gamma
P DM1/ limp1 PR Domain-Containing Protein 1
PTC 1
patched1
PTC 2
patched2
PT
Phosphatase and Tensin homolog
PTG 2/C -2 prostaglandine synthase 2
P
pregnane x receptor
RA
acide rétinoïque
ALD
rétinal-déhydrogénase
A
retinoic acid receptor
RARE r
etinoic acid response element
A /
A 1 Harvey rat sarcoma virus oncogene 1
RHO GDI
Rho GDP dissociation inhibitor (GDI)
RIN
RNA integrity number
RNA-seq
séquençage à ARN
B 1
roundabout homolog 1, Drosophila
2
receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2
ROS
Reactive Oxygen Species : espèces radicalaires de l'oxygène activées
RPK/RPTK
receptor protein- tyrosine kinase
PL
ribosomal protein L4
PL1
ribosomal protein L19
RPM
nombre de lectures par gène et normalisés par million de lectures totales alignées
RPKM
nombre de lectures pour mille paires de bases d’exon et normalisés par million de
lectures totales alignées
P 6
ribosomal protein S6
P 6KA3
ribosomal protein S6 kinase, 90kDa, polypeptide 3
P 1
R-spondin-1
RT-PCR
Reverse transcription P olymerase Chain Reaction
retinoid X receptor
6K1/ P 6KB1
ribosomal protein S6 kinase, polypeptide 1
SA
follicule à peit antrum
A A/ F
zinc finger, FYVE domain containing 9
SC
follicule secondaire
SCD
stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase)
MA3D
sema domain, immunoglobulin domain (Ig), short basic domain, secreted, (semaphorin)
3D
KIL
SKI-like
LIT2 slit homolog 2, Drosophila
5A1/ F-1 Steroidogenic Factor 1
F P
secreted frizzled-related protein
sonic hedgehog
I T1
sirtuin 1 déacétylase NAD-dependante
I T
sirtuin 7
I 6
sine oculis-related homeobox 6
MAD
Mothers Against Decapentaplegic, Drosophila, Homolog Of
MC1
structural maintenance of chromosomes 1B
M / F D11 Smoothened
M C 1 et 2 SPARC-related Modular Calcium-Binding 1 et 2
M F
SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1
L
spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix
10
SRY-box containing gene 10
2
SRY-box containing gene 2
SRY (sex determining region Y)-box 9
10
SRY-Related HMG-Box Gene 10
S 11
meiotic protein covalently bound to DSB homolog, S. cerevisiae
1P 1
sphingosine-1-phosphate receptor 1
BF2
sterol regulatory element binding transcription factor 2
F
serum response factor (c-fos serum response element-binding transcription factor)
132
sex determining region Y
sonic hedgehog
T
somatostatine
T
récepteur de la somatostaine
TAG3
stromal antigen 3
TA
steroidogenesis acute response
TAT
signal transducer and activator of transcription
TM 2
stathmin-like 2
T A8
stimulated by retinoic acid gene 8
T8 IA3
ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 3
CP
synaptonemal complex protein
TAF II
TAF2 RNA Polymerase II, TATA Box Binding Protein (TBP)-Associated Factor
TAF B
RNA Polymerase II, TATA Box Binding Protein (TBP)-Associated Factor 4B
TBP
TATA-binding protein
TCF21/P D1 facteur de transcription 21
TCF23
transcription factor 23
T CTA
tectorin alpha
Tex12
testis expressed gene 12
TGFB 2
transforming growth factor, beta receptor II
TGF
Transforming Growth Factor, Beta
TM D
transmembrane emp24 protein transport domain containing 4
T P1
tight junction protein 1
T F
tumor necrosis factor
T K
récepteur à tyrosine kinase
T C
Tuberculous sclerosis complex
T :
UnTranslated Region
F
vascular endothelial growth factor
IM
vimentin
2
WEE1 homolog 2, S. pombe
FIKK 2
WAP, follistatin/kazal, immunoglobulin, kunitz and netrin domain containing 2
IF1
WNT Inhibitory Factor 1
T
Wingless-Type MMTV Integration Site Family
T1
Wilms tumor 1
BP1
X-box binding protein 1
A 1
zygote arrest 1
1 3
zona pellucida glycoproteins 1-2-3
2A
H2A histone family
Résumé en français
Le bon déroulement de la folliculogenèse ovarienne basale, est une étape clé qui conditionne la
fertilité des femelles à l'âge adulte. Pourtant, les mécanismes moléculaires contrôlant ce processus sont
encore mal connus et les études d’expression limitées par la difficulté d'obtention du matériel
biologique. Les données actuelles proviennent essentiellement d’études réalisées chez les rongeurs
(espèces poly-ovulantes). L’objectif de ce travail est de décrire, pour les deux compartiments
folliculaires (ovocytes et cellules de granulosa), les spécificités d’expression et les gènes impliqués
dans le dialogue moléculaire entre ces compartiments ainsi qu'aux différents stades de développement
folliculaire basal « in vivo » chez une espèce mono-ovulante : la brebis.
Nous avons développé, dans un premier temps, une méthode d'analyse du transcriptome pour les
stades précoces qui combine microdissection à capture laser, amplification des ARN et microarrays.
Puis, nous avons présenté, par la technique RNA-seq, et pour la première fois, un répertoire de 15349
gènes décrivant le profil d’expression de ces gènes dans chaque compartiment folliculaire et en
fonction de leur stage de développement. L’analyse statistique révèle une différence d’expression entre
compartiments folliculaires (5130 gènes) ainsi qu’une dynamique d’expression au cours du
développement (3015 gènes). Nous avons également identifié 161 et 55 gènes présentant une
expression préférentiellement enrichie dans l’ovocyte et dans les cellules de granulosa,
respectivement. L’analyse fonctionnelle « in silico » combinée avec les données d’expression mettent
en évidence des voies de signalisation (IGF1, VEGF, FGF, NOTCH) susceptibles d’être impliquées
dans le dialogue moléculaire entre les deux compartiments folliculaires.
Enfin, dans nos conditions expérimentales, nous montrons d’importantes variations d’expression au
cours du développement folliculaire basal, lors de la transition du follicule primaire en secondaire chez
la brebis. La cinétique d’expression de gènes impliqués dans des voies de signalisation tels que BMP
et WNT a été précisément décrite. Un jeu de 25 gènes a été sélectionné en tant que biomarqueurs
expressionnels des différentes classes folliculaires. Il pourra être utilisé pour évaluer la croissance
folliculaire basale.
Abstract
Correct achievement of early ovarian folliculogenesis is a crucial step which determines female
fertility in adulthood. However, molecular mechanisms controlling this development are not well
characterized. Furthermore, gene expression studies are restricted by the difficulty to collect biological
material. Moreover, available data are mainly derived from rodent models (poly-ovulating species). In
this project, we intended to describe, in both follicular compartments (oocytes and granulosa cells), the
specificity of expression, to point out genes involved in molecular dialog and during early follicular
development in sheep species (mono-ovulating species).
First, we developed a transcriptome methodology to study early folliculogenesis that combined laser
capture microdissection, RNA amplification and microarrays.
Then, we described for the first time, the gene expression profile of 15349 genes for each follicular
compartment during early follicular development using RNA-seq technology. Statistical analysis
underlined differential expression between compartments (5120 genes) and during development (3015
genes). We identified 161 and 55 genes with a preferentially enriched expression in oocytes and
granulosa cells respectively. “In silico” fonctional analysis combined with gene expression data
underlined signaling pathways as IGF1, VEGF, FGF,and NOTCH that may be involved in molecular
dialog between the two follicular compartments.
Last, in our experimental conditions we showed important gene expression changes occurred during
primary to secondary follicular transition in sheep. The expression profiles of genes involved in
pathways as BMP and WNT were precisely described. A set of 25 genes was selected as follicular
class biomarkers that may be used to evaluate early follicular growth.