Réseau moléculaire

Quelques outils et idées en
spectrométrie de masse assistée par
vos neurones et la bioinformatique
David TOUBOUL
CNRS
ICSN
Gif-sur-Yvette
[email protected]
La problématique des « big data »
L’étude des systèmes biologiques conduit à la nécessité de gérer des
données de plus en plus conséquentes de données afin d’évaluer un plus
grand nombre de variables (pertinentes ou non).
Deux approches sont possibles et complémentaires:
- Approches ciblées (connaissance a priori de l’objet à étudier ou
hypothèses initiales plus ou moins crédibles)
- Approches non ciblées (génération de « big data »)
- Comment les générer ?
- Comment les stocker ?
- Comment les analyser ?
2
Un cas simple: la protéomique
Simple car:
- 20 acides aminés principaux
- Des modifications connus et facile à implémenter
- Des bases de données riches (mais avec des erreurs d’annotation aussi)
3
Un cas compliqué: la métabolomique
Pas plus de complexité qu’en protéomique en terme de nombre de molécules détectées
Mais plus compliqué d’interprétation car:
- un grand nombre de fonctions chimiques et de squelettes carbonés
- base de données incomplètes
4
Première étape: choisir sa stratégie !
Shotgun:
Rapide
MS haute résolution nécessaire
Suppression ionique
Difficile pour la quantification
Chromatographie-MS:
Long
Pas de méthode universelle
pour toutes les classes de
molécules
MS haute résolution nécessaire
Moins de suppression ionique
Plus facile pour la quantification
5
Première étape: choisir sa stratégie !
DOI: 10.1021/acs.analchem.5b04491
Anal. Chem. 2016, 88, 524−545
6
La physico-chimie au cœur du problème
MTBE: Méthyl tert-butyl éther
Shotgun: tout est dans la préparation de l’échantillon
DOI: 10.1021/acs.analchem.5b04491
Anal. Chem. 2016, 88, 524−545
8
Chromatographie: un vaste choix …
!
Ne pas négliger la GC-MS !
DOI: 10.1021/acs.analchem.5b04491
Anal. Chem. 2016, 88, 524−545
9
Chromatographie: un vaste choix …
10
Source d’ionisation et polarité
11
Impact électronique

M+
e-

.
+
M
filament
+ 2 e70 V
ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ
électrons
+
repousseur
+
vers
l’analyseur
+
+
+
ions
molécules
V0
anode
(trappe)
12
Impact électronique


L’énergie d’ionisation dépend des électrons de la HOMO:
 Type d’orbitale: s, p, n
 Électronégativité de l’atome porteur
Et de la stabilité de l’ion formé
13
Impact électronique
14
Impact électronique
Esterification
O
R
C
OH
+
CH3 OH
O
KOH
BF3
R
C
O
Acide gras
CH
3
Ester méthylique
Silylation
O
t-BDMCS
O
R
C
OH
Acide gras
+
MTBSTFA
1H, 60°C
N-Methyl-N-[tertbutyldimethylsilyl]
trifluoroacetimide
R
CH CH3
3
C
O
Si
C
CH 3
CH3 CH 3
Dérivé t-BDMS
15
Impact électronique
Un spectre impact électronique 70 eV
M +•
CH2OH
-CH2O
-NO2
-H2O
NO2
M+• : m/z 153
-OH
-NO
-C2H2
-HCO
16
Banque de données en IE
Scheubert et al. Journal of Cheminformatics 2013, 5:12
17
GC-IE-MS
Un outil extrêmement robuste et fiable pour la métabolomique mais un accès
restreint au métabolome …
18
GC-IE-HRMS
19
Ionisation chimique

Première étape: Ionisation d’un gaz réactif (exemple: l’ammoniac):
NH3 + e→
NH3+. + 2 eNH3+. + NH3 → NH4+ + NH2.

Deuxième étape: protonation de la molécule M par l'ion ammonium
M + NH4+ →
(M …..H….. NH3)+
→
m/z 18

m/z M+18
MH+ + NH3
m/z M+1
Lorsque l'on utilise un gaz réactif GH+, la réaction qui se produit avec la molécule M peut s'écrire de la
façon suivante:
M + GH+ → MH+ + G
GH+ → G + H+
MH+ → M + H+
ΔH°(G) = AP(G)
ΔH°(M) = AP(M)

Les enthalpies de ces deux réactions s'appellent "affinités protoniques" (respectivement du gaz et de la
molécule à analyser); elles correspondent au terme enthalpique de la basicité en phase gazeuse.

La réaction de protonation a lieu lorsque AP(G )< AP(M)

Concrètement, on choisira un gaz réactif adapté à la molécule étudiée (de plus faible AP), en général
dans le but de limiter les phénomènes de fragmentation.
20
Ionisation chimique
CH4
H2O
isobutane
NH3
21
Ionisation chimique
Un spectre IC positive
MH+
CH2OH
NO2
MH+ : m/z 154
-H2O
22
Source à pression atmosphérique
23
Une vue non globale du métabolome
Phase A: n-heptane/ethyl acetate (99.8:0.2, v/v),
Phase B : acetone/ethyl acetate (2:1; v/v) +0.02% acetic acid,
Phase C : propan-2-ol/water (85:15, v/v) + 0.05% acetic acid and ethanolamine.
Imbert L, Gaudin M, Libong D, Touboul D, Abreu S, Loiseau PM, Laprévote O, Chaminade P.
J Chromatogr A. 2012 Jun 15;1242:75-83.
24
Une vue non globale du métabolome
Imbert L, Gaudin M, Libong D, Touboul D, Abreu S, Loiseau PM, Laprévote O, Chaminade P.
J Chromatogr A. 2012 Jun 15;1242:75-83.
25
Une vue non globale du métabolome
PC, PE, SM, Cer, GalCer
7
ESI+
TOF-MS
-4
4
LPC, LPE
3
ESITOF-MS
3
-6
5
Intensity (x10 )
6
Intensity (x10 )
4
2
FFA
2
PE, PG, PI,
Cer, GalCer, ST,
1
1
0
0
0
2
4
6
8
10
0
2
4
6
8
10
Retention time (min)
Retention time (min)
Fig 1 : Positive ESI UPLC-MS lipid profile of a control brain sample
Fig 2 : Negative ESI UPLC-MS lipid profile of a control brain sample
Solvent A : H2O/ACN 60/40 + 10 mM AcONH4
Solvent B : ACN/iPrOH 50/50 + 10 mM AcONH4
26
Le spectromètre de masse
- Résolution spectrale
- Résolution chromatographique
- Résolution en masse
27
Le spectromètre de masse
Il est donc impératif de bien étalonner un spectromètre de
masse pour obtenir des mesures en haute précision en
masse (HRMS)!!!
28
Le spectromètre de masse
Élément
Isotope
Masse isotopique
Rapport
isotopique
H
1
1,00782503207
0,999885
2
2,0141017778
0,000115
12
12,0000000000
0,9893
13
13,0033548378
0,0107
14
14,0030740048
0,99636
15
15,0001088982
0,00364
16
15,99491461956
0,99757
17
16,99913170
0,00038
18
17,9991610
0,00205
C
N
0
Défaut de
masse!
29
Le spectromètre de masse
Élément
Isotope
Masse isotopique
Rapport
isotopique
Cl
35
34.96885268
0.7576
37
36.96590259
0.2424
79
78.9183371
0.5069
81
80.9162906
0.4931
190
189.959932
0.00014
192
191.9610380
0.00782
194
193.9626803
0.32967
195
194.9647911
0.33832
196
195.9649515
0.25242
198
197.967893
0.07163
Br
Pt
30
Le spectromètre de masse
- Basse résolution: quadripôle / trappe ionique (2D ou 3D)
- Haute résolution: TOF, Orbitrap, FT-ICR
- Et toutes les combinaisons de ces techniques !
Un seul impératif: il faut que le spectromètre de masse ait
une vitesse de scan compatible avec le système
chromatographique (identification versus quantification)
31
Workflow en métabolomique
doi:10.1038/nrd4510
33
Comparaison de deux populations: analyse
statistique univarié et multivarié
- Univariée: une seule variable comme observable
- Multivariée: prise en compte de tous les paramètres
34
Annotation de pics
35
Annotation de pics
36
Annotation de pics
37
Annotation de pics
Scheubert et al. Journal of
Cheminformatics 2013, 5:12
38
Banque de données
Banque de données
doi:10.1038/nrd4510
Comment identifier ?
- Spectrométrie de masse tandem (MS/MS, principalement CID
ou HCD pour les métabolites)
- Spectroscopie optique non destructive (UV-Vis, fluorescence…)
- Isolement et RMN
41
Quid des énergies de collision et de la
transposition des spectres MS/MS par collision ?
Scheubert et al.
Journal of
Cheminformatics
2013, 5:12
Mode d’acquisition des données
Mode d’acquisition des données
Méthode SWAT (Sciex)
Mode d’acquisition des données
Data-Dependant Acquisition (DDA)
DDA
50
20
s
s
10
Our condition in DDA mode:
MS 10 spectres/s
MS/MS a maximum of 4 precursor ions per cycle
MS
MS/MS
MS/MS
MS/MS
MS/MS
100 ms
250 ms
250 ms
250 ms
250 ms
s
Total operating time: 1.2 s between 2 scans
until 16 spectra
acquisitions in until 8 spectra
MSMS
acquisitions in
MSMS
47
DDA
MS-1 scan (100ms)
- iBuOH
Perte théo: 88,0524
Perte exp: 88,0516
- TiglOH
MS/MS-1 scan (250 ms)
Perte théo: 100,0524
Perte exp: 100,0554
48
Arbre décisionnel
DOI 10.1007/s11306-015-0882-8
49
Aide à l’identification des spectres MS/MS
50
Stratégies ???
51
Stratégies ???
52
Fragmentation in silico
Prédictions de structure
Arbre de fragmentation
Arbre de fragmentation
57
Un autre point de vue … la déréplication
Nat. Prod. Rep., 2015, 32, 779–810 |
58
Domaine en plein essor
59
Complexité et intérêt du vivant
doi:10.1038/nrd4510
Problématique
- Faire le tri entre le connu et l’inconnu
- Classer l’intérêt de l’inconnu
- Rapide et simple
61
Réseau moléculaire
Ce n’est, ni plus ni moins, qu’une manière
de classer des spectres de masse tandem
par homologie, donc assez similaire des
arbres de fragmentation sans décrire
réellement les voies de fragmentation!
62
Facteur de similarité
Similarité cosinus ou mesure cosinus
Facteur de similarité
64
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
Mol. BioSyst., 2012, 8, 2535–2544
65
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
66
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
67
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1203689109
68
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1203689109
69
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1203689109
70
Biofilms
The ISME Journal
(2015) 9, 2605–2619
71
Tous les pièges …
International Journal of Mass Spectrometry 377 (2015) 719–727
72
Cholestérol
73
Données redondantes …
74
Initialement …
pour l’analyse de séquences peptidiques
75
Pressure (bar)
CO2
Subcritical
Solid
Supercritical
Liquid
Subcritical
Gas
Temperature (°C)
SFC versus LC
SFC coupled to a Q-TOF mass spectrometer
 SFC 1260 Infinity (Agilent Technologies)
 Q-TOF 6540 (Agilent Technologies)
Pressure range
 10 bar
 50 bar
90-400 bar
90-600 bar
SFC module
Degasser
Caloratherm
Pumps
CO2
Pump



Mass accuracy down to 2 ppm
High mass resolution :
20 000 - 40 000 at m/z 922
MS/MS capabilities
Sampler
Oven
BPR
Oven
Q-TOF 6540
(Agilent technologies)
Pump
Isocratic Pump
UV
Choice of the column
N°
Polarité de la phase
1
2
apolaire
3
4
5
Hybride
6
7
8
9
10
11
Polaire
Colonne
Octadécyle silane C18 Eclipse 150 * 2,1 mm et 1,8 µm de diamètre
de particules
Carbone graphite poreux HypercarbR 100 * 2,1 mm et 3 µm de
diamètre de particules et 100 * 2,1 et 5µm de diamètre de particules
Zirconium ZR carbon 150 * 2,1 mm et 3µm de diamètre de particules
Torus 1-aminoanthracène (1-AA) 150 * 2,1 mm et 1,7 µm de
diamètre de particules
Torus 2-picolylamine (2-PIC) 150 * 2,1 mm et 1,7 µm de diamètre de
particules
Torus diéthylamine (DEA) 150 * 2,1 mm et 1,7 µm de diamètre de
particules
Pentafluorophényl (PFP) 150 * 2 mm et 3 µm de diamètre de
particules
Diphényl 250 * 2 mm et 3 µm de diamètre de particules
Ethyl pyridine (EP) 100 * 2,1 mm et 1,5 µm de diamètre de particules
Cyano (CN) 100 * 2,1 mm et 1,8 µm de diamètre de particules
Silanol (Rx sil) 150 * 4,6 mm et 5 µm de diamètre de particules et
100 * 2,1 mm et 1,8 µm de diamètre de particules
Fournisseur
Agilent
Thermo
Supelco
Waters
Waters
Waters
Agilent
Agilent
Agilent
Agilent
Agilent
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse
Investigation d’Euphorbia amygdaloides subsp semiperfoliata
Euphorbia amygdaloïdes subsp semiperfoliata
Materiel végétal sec (m = 450 g) (LF-015)
Extrait AcOEt (Zypertex)
m = 30,4 g / σ = 6 %
EC90 CHIKV < 0.8 μg / mL
Évaluation de phorboids commerciaux connus pour leurs
activité anti-HIV
C13H 27
O
O
12 13
1
H
10 Fractions (A-J)
4
Fraction I = 5,1 g
EC90 CHIKV < 0.8 μg/mL
Plusieurs étapes
chromatographiques (!)
15 molécules isolées
OAc
O
H
OH
6
OH
H
EC50 CHIKV = 2.9 ± 0.3 nM
SI = 1965
C9H 21
OH
20
O
O
C9H 21
O
O
P-12,13-DD
EC50 CHIKV = 6.0 ± 0.9 nM
SI = 686
OAc
H
OH
Ester de jatrophane (σ = 0.0006 %) Jatrohemiketal
EC50 CHIKV = 0.76 ± 0.14 μM/ SI = 208
TPA
O OH
H
H
H
OH
O
OH
H
H
OH
Prostratin
EC50 CHIKV = 2.7 ± 1.2 μM
SI = 23
OH
Nothias-Scaglia, L.-F.; Dumontet, V.; Neyts, J.; Roussi, F.; Costa, J.; Leyssen, R.; Litaudon, M.; Paolini, J. Fitoterapia 2015, (in press). Nothias-Scaglia, L.-F.; Retailleau, P.; Paolini, J.; Neyts, J.; Dumontet, V.;
Roussi, F.; Leyssen, P.; Costa, J.; Litaudon, -M. J. Nat. Prod. 2014, 77 (6), 1505–1512. Nothias-Scaglia, L.-F.; Gallard J.-F.; Dumontet V.; Roussi F.; Costa J. Bogdan I. I.; Paolini J.; Litaudon M. J. Nat. Prod.
2015 (accepted). Bourjot, M.; Delang, L.; Nguyen, V. H.; Neyts, J.; Guéritte, F.; Leyssen, P.; Litaudon, M. J. Nat. Prod. 2012. Nothias-Scaglia, L.-F.; Pannecouque, C.; Renucci, F.; Delang, L.; Neyts, J.; Roussi,
F.; Costa, J.; Leyssen, P.; Litaudon, M.; Paolini, J. J. Nat. Prod. 2015.
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse
Investigation d’Euphorbia amygdaloides subsp semiperfoliata : Récolte n°2
Euphorbia amygdaloïdes subsp semiperfoliata
Materiel végétal sec (m = 370 g) (LF-023)
65 % Heptane / 35 % Acétone
Molybdate sulfurique
Extrait AcOEt (Zypertex)
m = 24,7 g / σ = 6.7 %
EC90 CHIKV < 0.8 μg / mL
4.2 g
2.4 g
10 Fractions (A-J)
2.0 g
Analyse par SFC-MS/MS et
génération de réseaux moléculaires.
5.3 g
1.7 g
1.8 g
Extrait
AcOEt
Résultats validés comme
CHIKV spécifiques par
observation au microscope
EC90 CHIKV en μg/ml
KB à 10 μg/ml
en % d’inhibition
E
F
G
H
I
J
< 0,8
> 100
> 100
1,2
3,4
< 0,8
77
16 ± 13
%
0%
0%
0%
51 ± 6
%
45 ±
15 %
0%
Prenols: diterpinoids
Dideoxyphorbol
Deoxyphorbol
Jatrophane
Analyses by LC with strong percentage of organics solvent
30 mL acétonitrile by one LC run
82
Collaboration with ICSN and University of Corte
Choice of the column
C18: 1 min
Torus 1-AA: 3 min
ZR carbon: 18 min
Si: 7 min
Hypercarb: 17 min
Hypercarb
Time (min)
0
3
13
17
20
21
23
EtOH (%)
3
3
10
20
20
3
3
Flow rate: 1.5 mL/min
DDA analysis
to attribute a peak to a compound 5 at 10 MS/MS spectra
are necessary
50
20
s
s
10
Our condition in DDA mode:
MS 10 spectres/s
MS/MS a maximum of 4 precursor ions per cycle
MS
MS/MS
MS/MS
MS/MS
MS/MS
100 ms
250 ms
250 ms
250 ms
250 ms
s
until 16 spectra
acquisitions in until 8 spectra
MSMS
acquisitions in
MSMS
Total operating time: 1.2 s between 2 scans
Energie de collision …
5
80
671
611
83
60
40
20
0
Relative intensity (%)
Relative intensity (%)
100
4
551
491
299
281
253
3
2
1
0
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Colission energy (eV)
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Colission energy (eV)
86
DDA analysis
MS-1 scan (100ms)
Perte théo: 88,0524
- iBuOH
Perte exp: 88,0516
- TiglOH
MS/MS-1 scan (250 ms)
Perte théo: 100,0524
Perte exp: 100,0554
Choice of the column
semiperfoliata
- AcOH
- iBuOH
- TiglOH
- BzOH
- PhAcOH (-180.0423)
- 3x AcOH (-180.0634)
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
Représentation des réseaux moléculaires (analyses SFC-qTOF) des fractions anti-CHIKV
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
Représentation avec calque m/z
480
650
820
m/z de l’ion précurseur
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
Ajout de spectres MS2 de références isolées de la même plante:
- Esters de jatrophane du groupe A
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
Ajout de spectres MS2 de références isolées de la même plante:
- Esters de jatrophane du groupe B
Molecular network
MS2 fingerprint
m/z 313, 295, 285, ...
Esters de deoxyphorbol ?
Activité anti-CHIKV ?
MS2 fingerprint
m/z 311, 293, 283, ...
Autre type d’esters
de jatrophane ?
TiglO
OiBu
12 13
1
H
4
O
MS2 fingerprint d’ester de
jatrophane du group A
m/z 327, 309, 299, ...
MS2 fingerprint d’ester de
jatrophane du group B
m/z 313, 295, 285, ...
H
H
OH
6
20
OH
Molecular network
For example:
Red arrow corresponding to ∆m =
42.011 uma (acetate group)
jatrophane ester
A
Latex
Extraction totale
Jatrophane ester B
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
Représentation de la répartition par fraction
MS2 fingerprint
m/z 313, 295, 285, ...
Esters de deoxyphorbol ?
Activité anti-CHIKV ?
MS2 fingerprint
m/z 311, 293, 283, ...
Autre type d’esters
de jatrophane ?
Fraction G
Fraction H
Fraction I
MS2 fingerprint d’ester de
jatrophane du group A
m/z 327, 309, 299, ...
MS2 fingerprint d’ester de
jatrophane du group B
m/z 313, 295, 285, ...
Etude de l’activité anti-CHIKV d’Euphorbia de Corse par réseaux moléculaires MS/MS
Purification par SFC-semiprep, guidée par molecular networking MS/MS
m/z 523.266
C29H40O7
abs
int
m/z 717.279
C34H46O15
m/z 483.235 m/z 675.263
C34H46O15
C26H36O7
min
m/z 637.262
C33H42O11
m/z 521.251
C29H38O7
m/z 693.252
C35H42O13
TiglO
OiBu
12 13
1
Fraction
contenant
groupe de
jatrophane
inconnu
4
O
6
H
abs
OH
UV 230 nm
OH
20
H
O
H
OH
TiglO
Deuxième
SFC-prep
min
H
OiBu
H
O
H
20
Aetiology: Annonaceae




Environment: link with consumption of Annonaceae
 Edible fruits (as Annona muricata)
 Traditional medicine
 High consumption for all patients
Neurotoxicity of acetogenins
 Lipophilic polyketides
 Highly cytotoxic
 Strong inhibitors of mitochondrial complex I
Major safety concern for the FDA and ANSES
What about the football world cup in Brazil ???
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Structural diversity
 Classification
Polyoxygenated domain :
Tetrahydrofurans, epoxides...
32/34
)m
+/- substitutions
Hydroxyls, ketones...
( )n
γ-methyl-γlactone
(
 Types
Bermejo, Nat. Prod. Rep. 2005
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Structural diversity
Muricin-A
MS study
Goniothalamicin
Muricartetrocins
Intensity (counts x106)
Limitations
1.5
EIC m/z 619
1.0
0.5
0.0
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
Time (min)
Gigantetrocin-B
Annonacin
Arianacin
Muricin-C
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Structural diversity
100
80
60
40
20
0
Optimization of the collision
energy
Li+
Two values are retained : 60 and 80 eV
4
3
[M+Li-H2O]+
3
[M+Li-CO2-2H2O]+
[M+Li-CO2]+
2.0
1.5
2
1.0
1
0.5
0.0
0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
[M+Li-CO2-H2O]+
Relative intensity (%)
MS/MS study
[M+Li]+
3
[M+Li-CO2-3H2O]+
1.5
2
1.0
1
1
0.5
0
0
0.0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
2
0 20 40 60 80 100
80 X4-H2O
60 X4-2H2O
40
X4-3H2O
40
20
20
0
0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
60
10
8
6
4
2
0
X4
X3
60
X2
4
3
2
1
0
0 20 40 60 80 100
3
40
2
20
1
0
0 20 40 60 80 100
Z1
X1
0
0 20 40 60 80 100
0 20 40 60 80 100
collision energy (eV)
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100
60 eV
1400
80 eV
X4-2H2O
10000
X4
12000
X4-H2O
Structural diversity
1200
X4-3H2O
1000
800
Y1
X3
400
X2
X4
600
Z1
+
[M+Li-H2+
O]
[M+Li]
[M+Li-CO2]
X4-3H2O
X3
400
X2
800
X4-2H2O
4000
X4-H2O
+
[M+Li-CO2-2H2O]
+
[M+Li-CO2-2H2O]
+
+ [M+Li-CO2-H2O]
6000
Y1
Intensity (counts)
8000
200
0
0
120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 520 560 600
m/z
120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 520 560 600
m/z
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A3
A3-H2O
C1-H2O
X3
A2
Z1
C1
X4
B1
Spectra acquired with an ion mobility mass spectrometer
MOBICS project (LCP, Orsay, G. Van der Rest, P. Maitre)
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