Virus de l`hépatite B : quels outils virologiques pour le clinicien

Dossier thématique
D ossier thématique
Virus de l’hépatite B : quels outils virologiques
pour le clinicien ?
Hepatitis B virus: which virologic tools are useful for clinical practice?
IP S. Chevaliez, J.M. Pawlotsky*
 Points forts
 Les marqueurs virologiques utiles pour le diagnostic et
la prise en charge des infections par le VHB sont : l’antigène
HBs, les anticorps anti-HBc totaux et les IgM anti-HBc, les
anticorps anti-HBs, l’antigène HBe et les anticorps anti-HBe,
la détection et la quantification de l’ADN du VHB.
 Les techniques de PCR en temps réel remplaceront progressivement les techniques classiques de quantification de
l’ADN du VHB, apportant une plus grande sensibilité et un
plus large éventail de valeurs quantifiables.
 Le diagnostic de l’hépatite B aiguë repose exclusivement
sur les tests sérologiques.
 La quantification de l’ADN du VHB est un des éléments
clés de la décision thérapeutique, mais pas le seul paramètre
considéré, au cours des hépatites chroniques B.
 La surveillance de l’efficacité du traitement des hépatites chroniques B par les molécules antivirales repose sur la
quantification régulière de l’ADN du VHB. La recherche de
mutations de résistance par technique moléculaire pourrait
devenir utile lorsque de plus nombreuses molécules seront
utilisées et lorsque des algorithmes décisionnels consensuels
auront été établis.
Mots-clés : Virus de l’hépatite B – Diagnostic – Sérologie –
PCR – ADN-VHB.
Keywords: Hepatitis B virus – Diagnosis – Serologic markers –
PCR – HBV-DNA.
L
e diagnostic et le suivi des hépatites virales B se fondent sur
deux types de tests virologiques : des tests permettant la mise
en évidence du virus ou de l’un de ses composants, antigène
ou génome viral (diagnostic direct), et d’autres permettant la mise
en évidence des anticorps sériques témoignant d’un contact du
malade avec le virus (diagnostic indirect). Les tests virologiques
jouent un rôle clé dans le diagnostic de l’infection par le virus de
l’hépatite B (VHB), la décision de mise en place d’un traitement
* Centre national de référence des hépatites virales B, C et delta, Laboratoire de virologie
et Inserm U635, hôpital Henri-Mondor, université Paris-XII, Créteil.
184
antiviral, le choix du schéma thérapeutique le mieux adapté et
le suivi de la réponse virologique au traitement (1).
outils du diagnostic virologique en 2006
Le tableau I résume l’ensemble des marqueurs virologiques
aujourd’hui disponibles pour les infections par le VHB.
Tableau I. Marqueurs virologiques disponibles pour le dépistage, le
diagnostic et le suivi virologiques des hépatites virales B.
Diagnostic direct
Antigènes
Antigène HBs
Antigène HBe
Diagnostic indirect
Génome viral Anticorps totaux ou IgG
ADN du VHB
IgM
Anticorps anti-HBs
Anticorps anti-HBe
Anticorps anti-HBc
IgM anti-HBc
Techniques immuno-enzymatiques pour la détection
des antigènes viraux et des anticorps spécifiques
Les méthodes de type ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
sont utilisées pour détecter et, parfois, quantifier les antigènes viraux
ou les anticorps spécifiques dans les liquides biologiques. Le résultat
est exprimé par un ratio, par rapport à un témoin. Les techniques
ELISA sont faciles à utiliser, automatisables et permettent de tester
un grand nombre d’échantillons. Elles sont, en outre, relativement
peu coûteuses. En pratique, les tests ELISA sont utilisés pour la
détection de l’antigène HBs et de l’antigène HBe (tests directs), et
pour celle des anticorps anti-HBs, des anticorps anti-HBc totaux et
de type IgM, et des anticorps anti-HBe (tests indirects).
Techniques moléculaires pour la détection
et la quantification de l’ADN du VHB
La quantification de l’ADN du VHB dans le sang périphérique
permet de mesurer le niveau de la réplication virale. On individualise deux catégories de techniques qui permettent de détecter
et de quantifier l’ADN du VHB : les techniques d’amplification de
la cible, essentiellement la polymerase chain reaction (PCR), et
les techniques d’amplification du signal, fondées sur l’utilisation
de la capture d’hybrides ou sur celle des ADN branchés (2).
Le principe de la PCR consiste à synthétiser un grand nombre
de copies du génome viral (ou amplicons) au cours de réacLa Lettre de l’Hépato-gastroentérologue - Vol. IX - n° 4 - septembre 2006
tions enzymatiques cycliques dont le nombre est variable (25 à
40 cycles) et qui utilisent plusieurs températures et une enzyme
thermostable, la Taq polymérase. Les copies du génome viral sont
des ADN double brins qui peuvent être détectés et quantifiés par
différentes méthodes. Dans les techniques de PCR classiques,
“compétitives”, la quantification est fondée sur l’amplification
compétitive d’une séquence témoin ajoutée à chaque échantillon
en quantité connue. Les quantités relatives de produits amplifiés
à partir de l’ADN du VHB et à partir du témoin sont mesurées
à la fin de la réaction et les résultats sont établis à l’aide d’une
courbe d’étalonnage établie en parallèle au cours de la réaction.
Roche Molecular Systems (Pleasanton, Californie) commercialise
la technique Amplicor HBV Monitor®, manuelle, et la technique
Cobas Amplicor HBV Monitor®, semi-automatisée grâce à l’utilisation de l’automate Cobas Amplicor® (tableau II, p. 186).
Le principe des techniques d’amplification du signal est la capture
des génomes viraux sur un support solide et l’hybridation de
l’acide nucléique viral à plusieurs sondes liées à des molécules
“signal”, afin d’augmenter le signal d’amplification, c’est-à-dire la
sensibilité analytique de la technique (2). L’émission du signal en
fin de réaction est directement proportionnelle à la quantité de
génomes présents dans l’échantillon et comparée à une courbe
d’étalonnage générée simultanément à partir de témoins ADN en
quantités connues. La technique HPV Digene Hybrid Capture II™
et sa version Ultrasensitive HPV Digene Hybrid Capture II™
(Digene Corporation, Gaithersburg, Maryland) sont fondées sur
le principe de la capture d’hybrides en milieu liquide (tableau II).
La technique des ADN branchés, Versant™ HBV DNA 3.0 Assay
(Bayer Healthcare, Tarrytown, New York) s’appuie, quant à elle,
sur l’utilisation d’ADN branchés (tableau II).
Les techniques classiques de détection et quantification de l’ADN du
VHB sont actuellement progressivement remplacées dans les laboratoires de virologie par les techniques de PCR “en temps réel”, dont
le principe est de détecter la synthèse des produits d’amplification
au cours de la réaction de PCR, à l’intérieur du tube fermé, plutôt
qu’à la fin de celle-ci comme c’est le cas au cours des techniques
classiques de PCR (2). La PCR en temps réel est beaucoup plus
sensible et plus rapide que les techniques classiques d’amplification
et elle diminue considérablement le risque de contamination. Ses
performances sont en cours d’optimisation et l’automatisation de
la technique ainsi que son applicabilité à une large échelle en feront
la technique de choix dans le futur proche pour la quantification
de l’ADN du VHB. Deux techniques de PCR en temps réel sont
d’ores et déjà disponibles pour la détection et la quantification
de l’ADN du VHB : Cobas Taqman® HBV et la version de ce test
disposant d’une extraction automatique de l’ADN du VHB, Cobas
Ampliprep®-Cobas Taqman® HBV, ou CAP-CTM® HBV (Roche
Molecular Systems) et Real-Art® HBV PCR Assay (Artus-Biotech,
Qiagen, Hambourg, Allemagne). Un nouveau kit commercialisé
par Abbott Diagnostic sera bientôt disponible (tableau II).
Techniques moléculaires pour l’analyse des
séquences virales
L’analyse des séquences génomiques virales permet de classer
les souches virales au sein des différents génotypes du VHB
La Lettre de l’Hépato-gastroentérologue - Vol. IX - n° 4 - septembre 2006
(A à H), d’identifier des substitutions nucléotidiques d’importance physiopathologique, comme les mutations dans la région
pré-C et dans la région promotrice du core, ou d’identifier des
substitutions amino-acidiques associées à la résistance du VHB
aux molécules antivirales (3).
Le séquençage direct des produits obtenus par amplification en
PCR est la technique de référence pour l’analyse de la séquence
des génomes viraux. Elle permet de déterminer la séquence
nucléotidique et de déduire la séquence en acides aminés du
fragment amplifié. L’examen de cette séquence à la recherche
de substitutions connues permet d’identifier les souches virales
résistantes aux antiviraux, tandis que l’analyse phylogénique
des séquences obtenues, par comparaison aux séquences de
souches prototypes disponibles dans les banques, est la méthode
de référence permettant la détermination des génotypes. Des
techniques rapides d’analyse de la séquence des génomes viraux
ont également été développées. La plus utilisée est l’hybridation
inverse des produits de PCR à des sondes oligonucléotidiques
fixées sur un support solide (membrane de nitrocellulose), telle
que la technique du line probe assay (Inno-LIPA, Innogenetics, Gand, Belgique). Cette technique peut être utilisée pour
l’identification du génotype du VHB, pour la mise en évidence
de mutations de la région pré-C et de mutations dans la région
promotrice du core, et pour la mise en évidence de mutations
associées à la résistance du VHB aux antiviraux (2, 3).
Dossier thématique
D ossier thématique
Indications et utilisation pratique des
tests virologiques au cours des infections
par le VHB
Dépistage des hépatites B
Le dépistage des marqueurs d’infection par le VHB est obligatoire
chez les donneurs de sang, d’organes, de tissus ou de cellules.
Il est recommandé chez les sujets avec des facteurs de risque
d’infection. En pratique, trois marqueurs sérologiques doivent
être recherchés par la technique ELISA : l’antigène HBs, les
anticorps anti-HBc totaux et les anticorps anti-HBs. La présence de l’antigène HBs signe le portage du VHB. En présence
d’anticorps anti-HBc et d’anticorps anti-HBs, on peut affirmer
que le sujet a guéri d’une hépatite B aiguë dans le passé. La
présence d’anticorps anti-HBc isolés doit conduire à la recherche de l’ADN du VHB par une technique moléculaire, car 10 à
30 % de ces sujets sont en fait porteurs chroniques du VHB. La
seule présence d’anticorps anti-HBs témoigne d’une vaccination
efficace contre le VHB.
Diagnostic de l’hépatite aiguë B
La figure, p. 186 montre la cinétique d’évolution des marqueurs
virologiques au cours de l’hépatite aiguë B. En pratique, les quatre
marqueurs suivants, antigène HBs, anticorps anti-HBc totaux,
IgM anti-HBc et anticorps anti-HBs, doivent être recherchés en
première intention devant toute suspicion d’hépatite aiguë B.
La mise en évidence de l’ADN du VHB n’est pas utile pour le
diagnostic d’infection aiguë.
185
Dossier thématique
D ossier thématique
Tableau II. Tests de détection et quantification de l’ADN du VHB (UI : unité internationale).
Test
Fabricant
Méthode
Seuil inférieur de détection
Intervalle de quantification
HPV Digene Hybrid Capture II™
Digene Corp., Gaithersburg,
Maryland
Capture d’hybrides
(amplification du signal)
142 000 copies/ml
142 000-1 700 000 000 copies/ml
Ultrasensitive HPV Digene
Hybrid Capture II™
Digene Corp., Gaithersburg,
Maryland
Capture d’hybrides
(amplification du signal)
4 700 copies/ml
4 700-57 000 000 copies/ml
Amplicor HBV Monitor TM
Roche Molecular Systems,
Pleasanton, Californie
PCR compétitive manuelle
1 000 copies/ml
ou 180 UI/ml
1 000-4 000 000 copies/ml
ou 180-715 000 UI/ml
Cobas Amplicor HBV Monitor TM
Roche Molecular Systems,
Pleasanton, Californie
PCR compétitive semi-automatisée
200 copies/ml
ou 35 UI/ml
200-200 000 copies/ml
ou 35-35 700 UI/ml
Versant™ HBV DNA 3.0 Assay
Bayer Healthcare, Diagnostics
Division Tarrytown, New York
AND branches
(amplification du signal)
357 UI/ml
357-17 857 000 UI/ml
Cobas Taqman™ HBV
Roche Molecular Systems,
Pleasanton, Californie
PCR en temps réel avec extraction
automatique Ampliprep
12 UI/ml
54-110 000 000 UI/ml
Real-Art® HBV PCR Assay
Qiagen, Hambourg, Allemagne
PCR en temps réel
4 UI/ml
9-4 100 000 000 UI/ml
Diagnostic de l’hépatite chronique B
Anticorps anti-HBc totaux
Antigène HBs
IgM anti-HBc
Anticorps anti-HBs
ADN du VHB
0
4
8
12 16
20
24 28 32
36
52
100
Semaines après l'infection
Figure. Cinétiques des marqueurs virologiques du VHB au
cours de l’hépatite aiguë B.
En cas de présence certaine ou possible d’antigène HBs, une
nouvelle détermination doit être réalisée sur un deuxième
prélèvement, différent du premier (Journal officiel, 12 août
1997). La présence simultanée d’antigène HBs et d’IgM antiHBc dans un contexte d’hépatite aiguë signe avec certitude
le diagnostic d’hépatite aiguë B. La présence d’anticorps
anti-HBc totaux en l’absence d’antigène HBs et d’anticorps
anti-HBs est possible­ lors de la phase de convalescence qui
précède la guérison sérologique. Dans ce cas, la présence
d’IgM anti-HBc permet le diagnostic, confirmé par l’apparition ultérieure des anticorps anti-HBs. Toutefois, des IgM
anti-HBc sont parfois décelables, le plus souvent à un faible
titre, chez les patients souffrant d’une infection chronique
(4). Le diagnostic différentiel dépend alors de l’anamnèse et
des données cliniques.
La disparition de l’antigène HBs est le critère sérologique de
guérison d’une hépatite aiguë B. Elle est habituellement suivie,
après 2 à 4 mois, par l’apparition des anticorps anti-HBs (séroconversion HBs). La persistance de l’AgHBs au-delà de 6 mois
caractérise l’évolution vers l’infection chronique.
186
Devant des signes cliniques (asthénie, ictère, etc.) ou biologiques
(élévation de l’activité sérique des transaminases, parfois cholestase) d’hépatite chronique, les tests sérologiques renseignent
sur le statut virologique de l’infection, mais ne permettent pas
d’évaluer la gravité de la maladie. Seule la ponction-biopsie
hépatique (PBH) ou les tests non invasifs d’évaluation de la
fibrose permettent de mesurer la gravité de l’atteinte hépatique
et de poser les indications du traitement antiviral.
En cas de suspicion d’hépatite chronique B, la recherche de
l’antigène HBs, des anticorps anti-HBs et des anticorps anti-HBc
doit être réalisée en première intention. Le portage chronique du
VHB est caractérisé par la persistance depuis plus de 6 mois de
l’antigène HBs en l’absence d’anticorps anti-HBs. Les anticorps
anti-HBc sont également présents. La recherche quantitative de
l’ADN du VHB par méthode moléculaire doit alors être systématiquement réalisée. Les malades avec une réplication virale et
un antigène HBe présent en l’absence d’anticorps anti-HBe sont
infectés par un VHB dit “sauvage”. Lorsque l’antigène HBe est
absent en présence d’anticorps anti-HBe, le malade est infecté par
un VHB dit “mutant de la région pré-C”, c’est-à-dire présentant
une substitution nucléotidique dans la région pré-C qui empêche
la production de la protéine non structurale HBe.
Chez les malades avec une hépatite chronique B, la décision
thérapeutique est fondée sur l’évaluation de multiples paramètres
cliniques, biologiques et pronostiques, dont les plus importants
sont le niveau de l’activité sérique des aminotransférases, la
charge virale et la sévérité de l’atteinte hépatique.
Suivi des hépatites chroniques B non traitées
Le traitement n’est habituellement pas recommandé lorsque l’ADN
viral est indétectable ou la charge virale basse (inférieure à 103-104
unités internationales [UI]/ml, selon que les malades sont porteurs
d’une infection par un VHB sauvage ou mutant de la région pré-C).
Une surveillance régulière est alors conseillée. Elle comprend la
La Lettre de l’Hépato-gastroentérologue - Vol. IX - n° 4 - septembre 2006
surveillance biologique de l’activité des aminotransférases sériques
(associée, chez les patients atteints de cirrhose, à la mesure du taux
de prothrombine, et à la surveillance de la survenue du carcinome
hépatocellulaire par échographie et dosage de l’alphafœtoprotéine).
La répétition de la quantification de l’ADN du VHB est utile à la prise
d’une éventuelle décision thérapeutique si celle-ci augmente.
Décision thérapeutique et suivi virologique
de la réponse
Les porteurs chroniques du VHB dits “réplicants” – avec un
ADN du VHB présent à un titre significatif (supérieur à 103104 UI/ml) – sont éligibles pour un traitement antiviral. On peut
aujourd’hui administrer deux types de traitement aux malades
souffrant d’une hépatite B chronique : l’interféron alpha pégylé et
des inhibiteurs spécifiques de la réplication du VHB (lamivudine
et adéfovir-dipivoxil qui disposent d’une autorisation de mise sur
le marché [AMM] dans cette indication, entécavir qui devrait la
recevoir très bientôt, enfin ténofovir et la combinaison ténofoviremtricitabine ou FTC qui sont disponibles pour le traitement des
infections par le virus de l’immunodéficience humaine) [5].
Il n’existe pas actuellement de consensus sur le traitement de
première intention de l’infection chronique par le VHB. Un taux
sérique de l’alanine aminotransférase élevé, la présence d’antigène
HBe et une charge virale modérée sont de bons arguments en
faveur d’une réponse prolongée à l’interféron alpha. Si le génotype
A du VHB semble celui qui répond le mieux au traitement par
l’interféron pégylé, le génotype D est celui associé au plus faible
taux de réponse. Néanmoins, aucune étude n’a à ce jour validé la
valeur de la détermination du génotype avant de commencer le
traitement afin d’orienter le choix thérapeutique. La détermination
du génotype du VHB n’a donc, pour l’instant, aucune indication
en pratique clinique. Chez les malades présentant des facteurs de
réponse à l’interféron alpha, l’efficacité du traitement est attestée
par la perte de l’antigène HBe, suivie de la séroconversion HBe
(apparition des anticorps anti-HBe) dans un contexte de diminution importante de l’ADN du VHB qui devient indétectable (6, 7).
Une faible proportion de ces malades développe ultérieurement
une séroconversion HBs, avec disparition de l’antigène HBs et
apparition des anticorps anti-HBs.
Les malades avec un antigène HBe présent, des transaminases
faiblement élevées et une charge virale forte, ainsi que la majorité
des sujets infectés par un VHB mutant de la région pré-C (donc
antigène HBe négatifs) sont candidats à un traitement prolongé
(à vie pour certains d’entre eux) par un ou plusieurs inhibiteurs
spécifiques du VHB. Le suivi de l’efficacité thérapeutique repose
alors sur la quantification de l’ADN du VHB tous les 3 à 6 mois
en fonction du pronostic naturel de l’infection. Dans tous les cas,
lorsqu’une réponse initiale au traitement par un inhibiteur spécifique a été observée (réduction significative de la charge virale) et
qu’elle est suivie d’une rechute (réascension de celle-ci), on doit
suspecter une résistance virale au médicament, après vérification
de la bonne observance du traitement. La résistance, fréquente
avec la lamivudine, plus rare avec les autres molécules ou en cas
d’utilisation d’une combinaison thérapeutique, est caractérisée par
la sélection de virus présentant des changements amino-acidiques
La Lettre de l’Hépato-gastroentérologue - Vol. IX - n° 4 - septembre 2006
au sein du gène de l’ADN polymérase qui confèrent la résistance à
l’action antivirale du médicament. On peut mettre ces mutations
en évidence par séquençage direct du génome viral ou par hybridation inverse après PCR. Ces techniques n’ont pas d’indication
en routine aujourd’hui, mais pourraient devenir utiles dans un
avenir proche pour guider la prescription thérapeutique lorsque
de plus nombreuses molécules seront présentes sur le marché et,
surtout, lorsque des algorithmes décisionnels consensuels auront
été établis, permettant la prise de décision en fonction des résultats
des tests de mise en évidence de la résistance (8).
Dossier thématique
D ossier thématique
Conclusion et perspectives
L’utilisation et la bonne interprétation des tests virologiques sont
aujourd’hui indispensables au diagnostic et à la prise en charge
thérapeutique des malades infectés par le VHB. Les techniques
de quantification de la charge virale ont été améliorées et continueront de l’être dans le futur. Leur sensibilité analytique toujours
plus grande devrait permettre de détecter l’ADN du VHB chez
pratiquement tous les porteurs de l’antigène HBs ainsi que de
mettre en évidence des niveaux de réplication très faibles chez
des sujets qui répondent de façon appropriée aux traitements antiviraux. C’est pourquoi l’interprétation des résultats de ces tests ne
devra plus se faire sur la base de la “présence” ou de l’ “absence” de
l’ADN du VHB, mais sur la base de seuils de charge virale ayant
une valeur diagnostique, pronostique ou thérapeutique, qui restent
à déterminer. Si la détermination du génotype et l’identification
des mutations de la région pré-C et de la région promotrice du
core n’ont pas, aujourd’hui, d’utilité en pratique courante, elles
devront être utilisées pour établir seuils et algorithmes décisionnels
à l’intérieur de populations homogènes de malades, ces seuils et
algorithmes pouvant varier d’une population à l’autre. Enfin, l’arrivée
prochaine sur le marché de nombreuses nouvelles molécules pour
le traitement de l’hépatite chronique B pourrait justifier l’emploi
des tests d’identification des mutations associées à la résistance
aux antiviraux pour l’adaptation du traitement au long cours. n
R éférences bibliographiques
1. Hodinka RL. Laboratory diagnosis of viral hepatitis. In Viral Hepatitis: dia-
gnosis, therapy and prevention. S. Spector, Ed. Humana Press, Totowa, New Jersey, 1999:193-249.
2. Pawlotsky JM. Molecular diagnosis of viral hepatitis. Gastroenterology
2002;122:1554-68.
3. Pawlotsky JM. Hepatitis B virus (HBV) DNA Assays (methods and practical
use) and viral kinetics. J Hepatol 2003;39(Suppl. 1):S31-5.
4. Senecal D, Pichon E, Dubois F et al. Acute hepatitis B after autologous stem
cell transplantation in a man previously infected by hepatitis B virus. Bone Marrow Transplant 1999;24:1243-4.
5. Zoulim F. Antiviral therapy of chronic hepatitis B. Antiviral Res 2006;71:206-15.
6. Marcellin P. Advances in therapy for chronic hepatitis B. Semin Liver Dis
2002; 22(Suppl. 1):33-6.
7. Ganem D, Prince AM. Hepatitis B virus infection: natural history and clinical
consequences. N Engl J Med 2004;350:1118-29.
8. Locarnini S, Hatzakis A, Heathcote J et al. Management of antiviral resistance in patients with chronic hepatitis B. Antivir Ther 2004;9:679-93.
187