Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2

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Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2
Blanca M. Fernandez Rodriguez
Lavoro di diploma
Formazione Tecnico in Analisi Biomediche SSS
Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2
per l’identificazione di muffe di interesse clinico
Lavoro svolto presso Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona
2007
1
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
Indice
1. Riassunto, Abstract
3
2. Introduzione
4
3. I funghi
5
4. La classificazione
6
5. Gli aspetti clinici
7
6. Le regioni ITS1 e ITS2
8
7. Materiali e metodi
10
7.1. Campioni
7.2. Coltura
7.3. Estrazione
7.4. PCR
7.5. Seminested PCR
7.6. Controlli
7.7. Elettroforesi
7.8. Purificazione dei prodotti PCR
7.9. Reazione di sequenza
7.10. Purificazione dei prodotti della reazione di sequenza
7.11. Determinazione automatica della sequenza nucleotidica
7.12. Analisi delle sequenze
7.13. Costruzione dell’albero filogenetico
8. Risultati
8.1. Confronto fra Metodica 1 e Metodica 2 per l’estrazione del DNA
8.2. Coltivazione su piastra
8.3. Estrazione e amplificazione
8.4. Sequenze
8.5. Confronto fra identificazione morfologica e identificazione mediante analisi
delle sequenze
8.6. Albero filogenetico
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9. Discussione
27
10. Bibliografia
28
2
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11. Allegati
11.1. Tavole illustrate delle caratteristiche morfologiche degli Ascomiceti,
Zigomiceti, e basidiomiceti
11.2. Lista dei campioni
11.3. Lista delle sequenze di riferimento
11.4. Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro
11.5. Albero filogenetico
11.6. Classificazione secondo .S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras,
delle specie usate in questo lavoro
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34
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42
44
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1. Riassunto
Abstract
Il numero delle micosi é in continuo aumento
soprattutto nei pazienti ospedalizzati ed
immunocompremessi. Una rapida ed accurata
diagnosi permette d’iniziare una terapia
antimicotica
adeguata.
Le
tecniche
diagnostiche
comunemente
usate
in
laboratorio per l’identificazione dei miceti
sono tecniche biochimiche , sierologiche e
fenotipiche. Purtroppo queste tecniche
prevedono tempi d’esecuzione lunghi e non
sempre
forniscono
risultati
accurati
nell’identificazione della specie.
Per questo motivo l’Istituto Cantonale di
Microbiologia ha deciso di testare come
tecnica d’analisi per l’identificazione delle
muffe patogene l’utilizzo della polymerase
chain reaction (PCR). Una tecnica che si
presenta con un’alta sensibilità e specificità.
In questo lavoro abbiamo sfruttato la PCR per
ottenere le sequenze di una regione altamente
variabile presente nel DNA ribosomale, e
regioni ITS1 e ITS2, mediante l’utilizzo di
primers universali (ITS1, ITS4).Le sequenze
ottenute, appartenenti a 56 ceppi di 36 specie
diverse, sono state confrontate con le
sequenze
presenti
nella
GenBank
(NCBI).L’identificazione genotipica che
questa ha fornito é stata confrontata con
l’identificazione morfologica.
Le due tecniche d’analisi mostrano
un’identificazione identica a livello di genere
per il 98,2% e a livello di specie per il 44,6% .
L’identificazione fenotipica é risultata più
specifica a livello di specie per il 21,4%.
Mentre l’identificazione genotipica é risultata
più discriminante solamente per il 7,14%. Il
12,5% dei ceppi analizzati ha mostrato dei
risultati discrepanti fra le due tecniche
d’identificazione. In conclusione si può dire
che l’analisi delle diverse specie di funghi
mediante l’utilizzo delle sequenze ITS non
può
essere
un
valido
sostitutivo
dell’identificazione morfologica .
Invasive fungal diseases are increasing in
immunocompromised
and
hospitalized
patients. Early detection and accurate
identification of the fungi permits a rapid and
optimal initiation of antifungal therapy.
The diagnosis of mould is generally based on
biochemical, serological and phenotype
identification. However these methods take
time and do not always lead to a precise
identification of the microorganism. For this
reason, the Cantonal Institute of Microbiology
decided to test a molecular biological
technique, the polymerase chain reaction
(PCR), as identification procedure. In fact
PCR technology promises more rapid and
specific identification.
In this work we have evaluated the feasibility
of the sequence analysis of the internal
transcribed spacer regions (ITS) of the
ribosomal DNA for the identification of
pathological moulds.
The ITS sequences were obtained by
amplification of the ITS region (ITS1-5,8SITS2) with universal fungal primers (ITS1,
ITS4). The sequence analyses of 56 strains for
a total of 36 different species were compared
to reference data available at the GenBank
database, and the genotypic identification was
compared with phenotype identification.
For 98,2% of the strains, both methods gave
concordant results at the genus level. Of
these, 44,6% were assigned to the identical
species. Phenotypic criteria were more
specific in 21,4% and genotypic criteria were
more discriminative for 7,14%. 12,5% of the
strains showed discrepant results. We can
therefore conclude that identification of
medically important moulds at the level of
species by ITS sequencing is not a viable
alternative to conventional identification
methods.
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2. Introduzione
Il numero delle infezioni fungine é in continuo aumento soprattutto nei pazienti
immunocompromess [1]. L’identificazione precisa delle diverse specie nella diagnostica delle
micosi gioca dunque un ruolo molto importante per l’orientamento del trattamento medico.
Prendiamo per esempio il genere Scedosporium dove il Scedosporium apiospermun é sensibile ad
una determinata gamma di antimicotici mentre ill Scedosporium prolificans si mostra resistente alla
maggior parte di essi [2]. Oppure consideriamo il genere degli Aspergillus che comprendente più di
180 specie diverse, ma la principale causa di problemi broncopolmonari, delle cheratiti, delle
sinusiti, sopratutto nei pazienti immunocompromessi, sono unicamente l’Aspergillus fumigatus, l’A.
flavus e A. terreus [3, 4].
L’identificazione delle diverse specie fungine può essere effettuata con l’analisi diretta al
microscopio ottico del campione, mediante la
coltura su piastra e la differenziazione morfologica
delle diverse strutture, con test sierologici per la
ricerca di antigeni o anticorpi e test biochimici.
Oggi queste tecniche non sono più soddisfacenti
soprattutto a livello diagnostico poiché sono
tecniche laboriose, poco standardizzabili e con
tempi di esecuzione molto lunghi in particolar
modo per quanto riguarda la coltura su piastra i qui
tempi variano da specie a specie, ma richiedono un
minimo di 48h d’incubazione [2].
In oltre nella maggior parte dei casi queste tecniche
non forniscono risultati accurati poiché presentano
una bassa specificità nell’identificazione della
specie [2].
L’utilizzo di tecniche di biologiamolecolare
Figura 1. Tempi di crescita su piastra per
permette invece un’identificazione rapida e specifica
lieviti, muffe e funghi dimorfi [20]
con una sensibilità maggiore.
Molte pubblicazioni propongono infatti varie tecniche
fra le quali troviamo la PCR, la Real-time PCR, la PCR-Elisa, la RFLP (Restriction Fragment
Polymorfism) ecc. [5, 6, 7, 8, 21].
In questo lavoro si é deciso di testate come tecnica d’analisi per l’identificazione delle diverse
specie di muffe l’amplificazione mediante la PCR della regione altamente variabile ITS1 e ITS2
presente nel DNA ribosomiale.
Studi precedenti propongono l’utilizzo dei geni ribosomali poiché si presentano in più copie
all’interno del genoma e mostrano regioni conservate, come per esempio i geni 18S, 28S e 5.8S
comuni a tutti i funghi, e delle regioni altamente variabili fra le differenti specie, come le regioni
ITS. Queste regioni variabili sono quindi sfruttabili per la classificazione filogenetica e dunque
anche per un’identificazione a livello di specie necessaria per la diagnostica.[1, 3, 9, 10, 11].
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3. I Funghi
Gli organismi che costituiscono il regno dei funghi sono organismi eucarioti, non fotosintetici,
aerobi o anaerobi, pluricellulari o unicellulari. Possono presentarsi come lieviti, muffe o funghi
dimorfi, essere saprofiti, parassiti oppure vivere in simbiosi con l’organismo ospite. Sono provvisti
di una parete cellulare rigida, che può essere pluristratificata, composta da cellulosa, emicellulosa o
chitina e presentano un citoplasma spesso multinucleato.
I lieviti sono organismi unicellulari ovali di 3-5 µm di diametro; si riproducono principalmente per
gemmazione e possono formare delle pseudoife.
Le muffe sono funghi pluricellulari caratterizzati da un elemento di crescita tubulare ramificato
detto ifa. L’ifa può essere suddivisa da setti parietali o no: ifa settata o cenocitica. Dal suo sviluppo
per estensione apicale e laterale viene a formarsi il micelio (o tallo). Il micelio viene detto
vegetativo se aderisce e penetra nel terreno di coltura o nel tessuto ospite, riproduttivo o aereo se le
sue ife si proiettano sulla superficie del terreno e portano le cellule riproduttive o spore.
I fungi dimorfi sono definiti come miceti in grado di presentarsi sotto forma di lieviti o muffe al
variare delle condizioni ambientali [4, 12].
I funghi si riproducono in maniera asessuata o in maniera sessuata attraverso la produzione di spore.
I due tipi di riproduzione possono alternasi durante il ciclo vitale. A dipendenza dello stadio in qui
si trova l’organismo, se nella forma telomorfa (riproduzione sessuata) o nella forma anamorfa
(riproduzione asessuata) possono prende una diversa nomenclatura. La specie Aspergillus nidulans,
per esempio, nella sua forma telomorfa prende il nome di Emericella nidulans (vedi allegato 11.4).
Se alla forma anamorfa é stata attribuita la stessa forma telomorfa allora si parla si sinamorfismo
[13].
Per molte specie e sconosciuta la forma telomorfa, perché l’organismo non é in grado di riprodursi
sessualmente oppure perché non é stata ancora identificata. Questi fungi vengono classificati in un
gruppo tassonomico artificiale: i Deuteromiceti o funghi imperfetti. Oggigiorno però, mediante
l’impiego di analisi molecolari la maggior parte dei Deuteromiceti é assegnata alla divisione degli
Ascomiceti ed una piccola parte ai Basidiomiceti [5].
La produzione assesuata avviene per scissione, gemmazione o formazione di spore. Queste a loro
volta possono essere prodotte per frammentazione e distacco di una parte della ifa oppure per
sporulazione. Le spore possono essere di tipo diverso, fra le più frequenti troviamo le tallospore,
formate per trasformazione di elementi preesistenti del tallo, oppure le conidiospore, prodotte da ife
specializzate.
La riproduzione sessuata prevede invece la plasmogamia e la cariogamia. Nei zigomiceti due ife
riproduttive si uniscono formando una zigospora all’interno della quale si formerà lo zigote che in
seguito a meiosi verrà liberato ed inizierà la fase asessuata.
Nei ascomiceti gli organi riproduttivi si uniscono formando l’asco contenente le ascospore. Nei
Basidiomiceti il corpo fruttifero produce numerosi basidi ciascuno dei quali svilluppa 4 spore [14].
(vedi tavole 11.1)
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4. La classificazione
La classificazione odierna prevede quattro divisioni del regno dei funghi: Ascomycota,
Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota [13].
Le diverse specie sono state raggruppate in base alle caratteristiche morfologiche del tallo e delle
strutture riproduttive. Dal 1970, per ovviare alle differenti classificazioni presenti in letteratura
dovute soprattutto alle nomenclature diverse attribuite alla stessa specie, si é cercato d’introdurre fra
i criteri che definiscono una specie l’analisi del DNA. Il regno dei funghi é comunque in continua
evoluzione con ca. 20 nuove specie all’anno [5, 9, 15].
Tabella 1. Divisione del regno dei funghi con alcune classi ed ordini di intersesse medico [13]
Ascomicota
Basidiomycota
Zygomicota
Archiascomycetes
Pneumocystidiales
Hymenomycetes
Agaricales
Stereales
Tremellales
Zygomycetes
Entomophthorales
Mortierellales
Mucorales
Hemiascomycetes
Saccharomycetales
Euascomycetes
Chaetothyriales
Clavicipitales
Dothideales
Eurotiales
Hypocreales
Leotiales
Microascales
Onygenales
Ophiostomatales
Pezizales
Phyllachorales
Pleosporales
Sordariales
Chytridiomycota
Urediniomycetes
Sporidiales
Ustilaginomycetes
Microstomatales
Tilletiales
Ustilaginales
Gli Ascomiceti rappresentano il più grande gruppo tassonomico del regno dei funghi. Raggruppano
il 50% di tutte le specie fungine e aprossimativamente l’80% dei funghi patogeni. Sono
caratterizzati da una riproduzione asessuata mediante la formazione di conidiospore e da una
riproduzione sessuata mediante la formazione di aschi contenenti le ascospore.
I Basisiomiceti comprendono circa 23'000 specie sopratutto funghi a cappello mangerecci. Sono
caratterizzati dalla formazione di copri fruttiferi contenenti numerosi basidi ciascuno dei quali
sviluppa 4 spore durante la riproduzione sessuata.
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Fra i Zigomiceti, caratterizzati dalla formazione di zigospore, troviamo 1% di tutte le specie del
regno dei funghi, molti dei quali responsabili di infezioni cutanee e gastrointestinali nell’uomo.
In fine i Chitridiomiceti rappresentano i funghi meno sviluppati, caratterizzati sopratutto da una
struttura unicellulare e da una riproduzione asessuata mediante la formazione di zoospore [ 4, 9].
(vedi tavole 11.1)
5. Gli aspetti clinici
Su più di 10'000 specie descritte all’incirca 100 sono coinvolte in micosi umane o animali. Le
micosi possono essere superficiali se colpiscono solo i peli e gli strati più esterni dell’epidermide
senza provocare dunque una risposta immunitaria [13]. Vengono comunemente denominate con il
nome di tigna o piedra [4].
Le micosi cutanee coinvolgono invece l’epidermide, i capelli, le unghie e le mucose esterne come
per esempio quelle dei genitali [13]. Queste micosi sono causate sopratutto dai generi
Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton [4].
Le micosi sottocutanee interessano cute, sottocute, muscoli e ossa. La malattia si sviluppa
lentamente e può impiegare anche degli anni dopo la penetrazione per raggiungere il tessuto sotto
cutaneo [4].
Ci sono in fine le micosi profonde o sistemiche che colpiscono gli organi interni ed i visceri. Sono
causate sopratutto da funghi dimorfi penetrati all’interno dell’organismo per inalazione delle spore,
in seguito ad operazioni chirurgiche, tramite l’utilizzo di cateteri, ecc.. L’infezione nasce con una
lesione polmonare che può diventare cronica ed entrare nel sistema sanguineo fino a raggiungere
altri organi [4, 13,].
Tabella 2. Alcuni miceti d’importanza medica [4]
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Troviamo poi le infezioni causate da fungi opportunisti come per esempio l’aspergillosi causate
soprattutto dall’ Aspergillus fumigatus, un fungo presente ovunque in natura che penetra all’interno
dell’organismo mediante l’inalazione delle spore causando problemi allergici e broncopolmonari.
Un’altro esempio di infezioni da funghi opportunisti sono le candidosi, causate dalla Candida
albicans comunemente presente nella flora normale delle nostre mucose che prende il sopravvento
quando questa viene alterata. Queste micosi colpiscono sopratutto i neonati, i pazienti
immunocompromessi in seguito a neoplasie, leucemie, chemioterapie, AIDS oppure pazienti in cure
intensive, gli ustionati ed inseguito all’utilizzo prolungato di antibiotici [3,10,13].
6. Le regioni ITS1 e ITS2
I ribosomi degli organismi eucariotici sono formati da due subunità strutturali, 60S e 40S, costituite
da frammenti di rRNA e proteine che prendono il nome dalla misura della loro velocità di
sedimentazione, in seguito a centrifugazione, definita in unità di Svedberg (S).
La subunità 60S presenta i frammenti di rRNA 28S, chiamato anche LSU (large subunit), 5,8S e 5S
e circa 50 proteine. La subunità 40S presenta un unico frammento di RNA 18S, chiamato anche
SSU (small subunit) e circa 33 proteine.
Al momento della traduzione del mRNA queste subunità si uniranno per formare i ribosomi 80S
[16].
Tabella 3. Struttura dei ribosomi procarioti ed eucarioti [16]
PROCARIOTI
EUCARIOTI
70 S
80 S
Subunità
rRNA
Proteine
50S
23S + 5S
~ 31
30S
16S
~ 21
60S
28S + 5,8S + 5S
~ 50
40S
18S
~ 33
I geni che codificano per i diversi frammenti di rRNA sono geni ripetuti, costituenti
dell’organizzatore nucleolare, NOR (Nucleolus organizer region). All’interno del cromosoma sono
raggruppati in unità strutturali separate da sequenze spaziatrici non codificanti, NTS
(nontranscribed spacer) o IGS (intergenic spacer).
Ogni unità strutturale é costituita da un spaziatore trascritto esterno, ETS (external transcribed
spacer), situato all’estremità 3’ del gene 18S, due spaziatori trascritti interni, ITS (internal
transcribed spacer), situati rispettivamente: l’ITS1 fra il gene 18S ed il gene 5,8S, l’ITS2 tra il gene
5,8S e l’estremità 3’ del gene 28S ed in fine il gene 5S separato dal gene 28S da una sequenza
spaziatrice non codificante.
I geni 18S, 5,8S e 28S verranno trascritti dalla DNA polimerasi I in un pre-rRNA 45S che in
seguito a maturazione tramite eliminazione delle sequenze spaziatrici ETS ed ITS formerà i
rispettivi frammenti di rRNA. Il gene 5S verrà transcritto dalla DNA polimerasi III nel suo
corrispettivo rRNA.[6, 9, 17]
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Figura 2. Struttura dei geni ribosomali degli organismi eucarioti
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7. Materiali e metodi
7.1. Campioni
I diversi ceppi di fungi usati per questo lavoro provengono da una raccolta interna all’ICM
effettuata dal 1995 al 2005. La raccolta comprende ceppi ottenuti da campioni clinici, ceppi
provenienti da corsi di aggiornamento effettuati presso la BioMérieux e ceppi provenienti da
controlli di qualità della NEQAS (National External Quality assesment Service, Regno Unito), tutti
identificati morfologicamente all’interno dell’istituto.
I campioni sono conservati a temperatura ambiente in acqua sterile.
7.2. Coltura
I ceppi sono stati coltivati su piastre di Petri, contenenti 25 ml di agar Sabouraud Cloramfenicolo
(SAB CHL-D, bioMérieux, Svizzera), ed incubati a 37°C.
7.3. Estrazione
Per l’estrazione del DNA sono state testate due metodiche differenti previste per il mini kit DNeasy
Plant (Metodica 1) e per il kit QIAamp DNA extraction della QIAGEN (QIAGEN, Svizzera)
(Metodica 2). Le due metodiche presentano una versione modificata dei processi di lisi previsti per i
protocolli originali.
Metodica 1
Prelevare una piccola quantità di micelio (ca. 1 cm2) dal terreno di coltura e depositarla in una
provetta Eppendorf. Aggiungere ca. 1,5 ml di azoto liquido ed attendere per ca. 30 s fino a completa
evaporazione dell’azoto. Mediante l’utilizzo di un pestello, schiacciare il micelio congelato fino a
ridurlo in una polvere fine.
Aggiungere 400 µl di tampone AP1 e 4µl di RNase A (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera
(vedi anche reagenti seguenti)) e vortexare vigorosamente. Incubare il tutto per 10 min a 65°C
miscelando 2 o tre volte durante l’incubazione. Aggiungere 130 µl di tampone AP2 ed incubare per
altri 5 min al freddo, immergendo le provette Eppendorf in un contenitore con ghiaccio.
Centrifugare il lisato per 5 min a 20'000 x g e trasferire il sovranatante in una QIAshedder Mini spin
column (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera). Centrifugare per 2 min a 20'000 x g e
aggiungere 795 µl di tampone AP3/E.
Pipettare 650 µl della soluzione in una DNeasy Mini spin column (DNeasy Plant Mini kit,
QIAGEN, Svizzera) e centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Ripetere il passaggio precedente con la
rimanente quantità di soluzione.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
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Posizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta, aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio
AW e centrifugare per 1 min a 6'000 x g . Ripetere l’operazione e centrifugare 2 min a 20'000 x g.
Eluire il DNA con 200 µl di tampone AE.
Metodica 2
Prelevare una piccola quantità di micelio (ca. 1 cm2) dal terreno di coltura ed incubarla per
10 min a 98°C in 200 µl di soluzione di lisi contenente 5 µl di NaOH 1M, 20 µl SDS al 5%, e 175µl
H2O. Neutralizzare la soluzione con 200 µl di HCl 25 mM. Aggiungere 400 µl di tampone di lisi
AL (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Svizzera (vedi anche reagenti seguenti)) ed incubare per
altri 10 min a 98°C [7]. Aggiungere 400 µl di etanolo al 100% e centrifugare per 5 sec a 20'000 x g.
Caricare 600 µl del supernatante su una colonnina DNA Mini spin (QIAamp DNA Mini Kit,
QIAGEN, Svizzera) e centrifugare per 1 min a 6'000 x g.
Posizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta ed aggiungere 500µl di soluzione di lavaggio
AW1. Centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Riposizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta
ed aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio AW2 . Centrifugare per 3 min a 20'000 x g.
Effettuare un’ulteriore centrifugazione per 1 min a 20'000 x g per asciugare completamente la
membrana della colonnina. Eluire il DNA con 200 µl di tampone di eluizione AE.
7.4. PCR
La PCR prevede l’amplificazione della regione ITS che comprende i geni spaziatori non codificanti
ITS1 e ITS2 ed il gene 5,8S, mediante l’utilizzo del forward primer ITS1 ed il revers primer ITS4
(Microsynth, CH) [3].
ITS1:
ITS4:
5’- TCC GTA GGT GAA CCT GCG G -3’
5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’
19 bp
20 bp
Il mix di reazione per un campione contiene 28,65 µl H2O molecular grade (FLUKA, Svizzera),
5 µl di tampone di reazione 10x, 3 µl MgCl2 25 mM, 1 µl dNTP mix 10 mM (dUTP, dATP, dGTP,
dCTP), 0,25 µl DNA Taq polimerasi (5U/µl) (HotStarTaq Master Mix Kit, QUIAGEN, Svizzera),
1µl ITS1, 1µl ITS4 10 µM (Microsynth, Svizzera), 0,1 µl UNG (1U/µl)(Uracil DNA Glicosilasi,
Roche, Svizzera) e 10 µl di DNA estratto.
La reazione d’amplificazione é stata eseguita con un termociclatore (Applied Biosystems 2700,
USA) e prevede un ciclo di prePCR di 5 min a 37°C, per l’attivazione dell’UNG e 15 min a 95°C
seguito da 40 cicli suddivisi in: 30 sec a 95 °C, 1 min a 55°C e 1 min a 72°C per l’estensione del
frammento. Si conclude con un’estensione finale 72°C per 1 min.
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7.5. Seminested PCR
Per i campioni per i quali la PCR ha fornito scarse quantità di amplificato é stata eseguita una
reazione di seminested PCR mediante l’utilizzo del forward primer ITS86 ed il reverse primer ITS4
[18].
ITS86:
ITS4:
5’- GTG AAT CAT CGA ATC TTT GAA C -3’
5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’
22 bp
20 bp
Il mix di reazione per un campione contiene 37, 75 µl H2O molecolar grade (FLUKA, Svizzera), 5
µl di tampone di reazione 10x, 3 µl MgCl2 25 mM, 1 µl dNTP mix 10 mM (dUTP, dATP, dGTP,
dCTP), 0,25 µl DNA Taq polimerasi (5U/µl) (HotStarTaq Master Mix Kit, QUIAGEN, Svizzera),
1µl ITS86, 1µl ITS4 10µM (Microsynth, Svizzera) e 1 µl di DNA amplificato.
I diversi passaggi della reazione d’amplificazione corrispondono a quelli visti per la PCR (vedi
paragrafo precedente).
7.6. Controlli
Per il controllo delle reazioni d’amplificazione sono stati usati 3 controlli positivi. Il BRF 15
Trichophyton rubrum, isolato da un campione clinico di pelle. Il BRF 24 Candida glabrata, isolato
da un espettorato e il BRF 32 Cladosporium sp. isolato da un campione clinico proveniente da
un’infezione batterica. La grandezza del loro prodotto di amplificazione con i primer ITS1 e ITS4
corrisponde rispettivamente a : Candida glabrata 820 bp, Cladosporium sp. 549 bp, Trichophyton
rubrum 692 bp [6, 7].
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Figura 3. Migrazione elettroforetica in
gel d’agarosio 1,5% dei controlli positivi.
1) DNA Molecular Weight Marker XIV
100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo
negativo, 3) campione 135, 4) 46, 5) 27,
6) 79a, 7) 79b, 8) BFR 32 Cladosporium
sp. 549 bp, 9) BFR 15 Trichophyton
rubrum 692 bp, 10) BFR 24 Candida
glabrata 820 bp
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7.7. Elettroforesi
I prodotti ottenuti dopo amplificazione sono stati fatti migrare mediante elettroforesi su gel di
agarosio al 1,5% in tampone TBE 1x a 10Volt/cm2 per circa 30 min. Per ogni campione sono stati
depositati 10µl dell’amplificato. Dopo elettroforesi il gel é stato immerso per circa 10 min in una
soluzione di bromuro di etidio (0,5-1.0 µg/ml), lavato in acqua e depositato in un transilluminatore
UV per la messa in evidenza dei frammenti di DNA.
7.8. Purificazione dei prodotti PCR
I campioni amplificati sono stati purificati mediante l’utilizzo di colonnine Montage PCR (Milliore,
Svizzera) sulle quali sono stati depositati 40 µl di amplificato. Dopo centrifugazione per 5 min a
1'020 x g, il DNA é stato eluato con 20 µl di tampone di eluizione AE (QIAamp DNA Mini Kit,
QIAGEN, Svizzera) e con sucessiva centrifugazione di 2 min a 1'020 x g.
7.9. Reazione di sequenza
Per ogni amplificato purificato sono state effettuate due reazione di sequenza usando separatamente
il primer ITS1 o il primer ITS86, per i campioni amplificati con la seminested PCR, e il primer
ITS4.
Il mix di reazione di sequenza contiene 2 µl di BigDye Reaction Mix, 3µl di tampone 5x Buffer
BigDye (ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Applied Biosystems, USA), 4µl di
H2O molecolar grade (FLUKA, Svizzera), 3µl di un primer 1µM(ITS1, ITS86 o ITS4) (Microsynth,
Svizzera) per mix di reazione e 3 µl di DNA purificato.
La reazione di sequenza é stata eseguita con un termociclatore (Applied Biosystems 2700, USA) e
prevede 25 cicli suddivisi in: 10 sec a 96 °C per la denaturazione del DNA, 5 sec a 50°C per
l’ibridazione del primer e 4 min a 60°C per l’estensione del frammento.
7.10. Purificazione dei prodotti della reazione di sequenza
I prodotti ottenuti dalla reazione di sequenza sono stati purificati mediante l’utilizzo di mini colonne
di Sephadex G50 (Sephadex G50 fine, Amersham Bioscences) ottenute mediante centrifugazione di
900µl della soluzione di Sephadex per 3 min a 770 x g. Sulle colonnine sono stati caricati e
centrifugati, per 3 min a 770 x g, i 15µl del prodotto della reazione di sequenza.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
14
7.11. Determinazione automatica della sequenza nucleotidica
I prodotti purificati della reazione di sequenza sono stati sequenziati mediante l’utilizzo del
sequenziatore automatico ABI Prism 310 (Applied Biosystems, USA). Sul sequenziatore sono stati
caricati 5 µl di prodotto della reazione di sequenza e 15 µl di H2O molecular grade (FLUKA,
Svizzera).
7.12. Analisi delle sequenze
Le sequenze ottenute sono state corrette manualmente mediante la lettura dell’ettroferogramma e
mediante l’allineamento dei frammenti ottenuti con il forwar primer ed il revese primer.
L’allineamento delle sequenze é stato effettuato con il programma MEGA 3.0 (Molecular Evolution
Genetics Analysis).
Le sequenze consenso sono state confrontate con le sequenze presenti nella GenBank usando il
BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) della NCBI (National Center for Biotecnology
Information, USA) per l’identificazione del frammento.
L’identificazione é stata fatta in base alla maggior percentuale di omologia della sequenza
analizzata rispetto alle sequenze presenti nella banca dati.
Le sequenze presenti nella GenBank con maggior omologia sono state prese come sequenze di
riferimento e sono state introdotte nel programma d’analisi MEGA 3.0. Queste sequenze sono state
in seguito utilizzate come riferimento per il taglio del frammento nella regione esatta ITS1 ed ITS2.
7.13. Costruzione dell’albero filogenetico
Le sequenze ottenute e le sequenze di riferimento prese dalla GenBank (NBCI) sono state allineate
mediante l’uso del programma MEGA 3.0. La costruzione dell’albero, che rappresenta le relazioni
esistenti tra le sequenze, é stata fatta in base al numero di differenze di nucleotidi utilizzando il
metodo matematico UPGMA (Unweighted pair group method using aricmetic averages).
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
15
8. Risultati
8.1. Confronto fra Metodica 1 e Metodica 2 per l’estrazione del DNA
L’ottenimento del DNA da amplificare inizia con la lisi cellulare, ma la struttura della parete
cellulare dei funghi composta da chitina, glucani, lipidi e peptidi presenti in forma variabile da
specie a specie, influisce con le diverse metodiche di estrazione che siano enzimatiche, chimiche o
fisiche. Trovare un metodo che sia adatto per tutte le diverse especie risulta dunque molto difficile
[5].
Per questo lavoro sono state testate due metodiche che si basano su due processi di lisi diversi. La
Metodica 1 prevede una lisi cellulare mediante reazione meccanica, chimica e termica, mentre la
Metodica 2 si basa su reazioni chimiche e termiche.
L’efficienza dell’estrazione del DNA delle due metodiche è stata verificata mediante l’utilizzo della
PCR con i primers ITS1 e ITS4 effettuata su 8 campioni appartenenti a 8 specie diverse aventi lo
stesso volume di eluizione pari a 200 µl di tampone AE (QIAamp DNA Mini Kit, DNeasy Plant
Mini Kit, QIAGEN, Svizzera).
Si è ottenuta un’amplificazione di 7/8 campioni con la Metodica 1 e di 8/8 campioni con la
Metodica 2.
Tabella 4. Campioni usati per il confronto delle 2 metodiche di estrazione
Estrazione DNA
Specie
Identificazione fenotipica
Ceppo
No. Micoteca
Aspergillus candidus
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus nidulans
Aspergillus japonicus
Aspergillus ochraceus
Aspergillus versicolor
Malbranche sp.
M6558/03
Neqas 6657/M19635
R10937/03
M9618/CQ015888
M45878/02
Neqas 6406/M35301
M42299
90
94
56
91
62
82
83
N.P.
Metodica 1
Metodica 2
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
L’analisi dei diversi amplificati migrati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 1,5% ed
evidenziati con bromuro di etidio non mostra differenze significative delle diverse bande di
migrazione.
I tempi di esecuzione per ambedue le metodiche si aggirano attorno ai 30 min ca..
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
1
2
3
4
5
6
7
8
9
16
10
Figura 4.Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei campioni estratti con la Metodica 1 (versione
modificata DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Svizzera) evidenziati con il bromuro d’etidio. 1) DNA
Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 56, 4) 91, 5)
82, 6) 94, 7) 83, 8) 62, 9) M42299, 10) 90
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Figura 5 Figura 6.Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei campioni estratti con la Metodica 2
(versione modificata QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN, Svizzera) evidenziati con il bromuro d’etidio.
1) DNA Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 56, 4)
90, 5) M42299, 6) 94, 7) 62, 8) 83, 9) 82, 10) 91
Per lo svolgimento del lavoro si è così scelto l’utilizzo della Metodica 2, non solo per il maggior
numero di risultati positivi ma anche perché si presenta manualmente più facile da eseguire. Infatti,
questa metodica presenta un minor numero di passaggi riducendo dunque i rischi di contaminazione
e soprattutto non prevede l’utilizzo dell’azoto liquido; sostanza non facilmente maneggiabile.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
17
8.2. Coltivazione su piastra
Sono stati coltivati su piastra agar Sabouraud Cloramfenicolo a 37°C, 86 ceppi appartenenti a 49
specie diverse (vedi allegato 11.2) selezionati dalla micoteca in modo casuale. Si è riscontrata una
crescita per 77/86 campioni .
Tabella 5. Campioni non cresciuti
Specie
Identificazione fenotipica
Ceppo
No. Micoteca
Absidia corymbifera
Acremonium sp.
Alternaria alterneta
Alterneria alternata
Aspergillus terreus
Aureobasidium sp.
Cunninghamella berthalletiae
Geotrichum candidum
Mucor sp.
Neqas 5891/M9621
Neqas 6210/M7440
Neqas 6325/M19931
CQ12.96
CQ99/M14318
CQ99/M28018
ID ZH/95
64
75
78
35
54
57
53
1
48
8.3. Estrazione e amplificazione
Sono state eseguite 143 estrazioni, utilizzando la Metodica 2, per i 77 ceppi con un’amplificazione
positiva della regione ITS1-5,8S-ITS2 per 66/77 campioni.
Per i campioni Aspergillus glaucus 58, Aspergillus clavatus 109 e Trichophyton tonsurans 3, è stata
eseguita una seconda amplificazione di PCR seminested poiché la prima amplificazione a fornito
scarse quantità di amplificato.
Tabella 5 Estrazioni DNA non riuscite
Specie
Identificazione fenotipica
Ceppo
No. Micoteca
Caldosporium cladosporioides
Cladosporium sp.
Cladosporium sphaerospermum
Cunninghamella bertholletiae
Fusarium oxysporum
Fusarium solani
Hormographiella aspergillata
M29240
M753/97
Neqas 7355/M5569
Neqas 6659/M19638
R36234
M35303/02
R8459
71
41
140
96
119
79
139
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
18
Tabella 5. (Continuazione)
Specie
Identificazione fenotipica
Ceppo
No. Micoteca
Malbranchea sp.
Microsporum persicolor
Monascus ruber
Trichoderma sp.
Tbc22067
corso 2004 BioMérieux
CQ99
M948
113
135
2
27
8.4. Sequenze
Sono state ottenute 56/66 sequenze della regione ITS1-5.8S-ITS2 di 56 ceppi differenti appartenenti
a 36 specie diverse (vedi allegato 11.2.) mediante l’amplificazione con i primer ITS1 e ITS4. Le
sequenze corrette (vedi.) presentano una lunghezza variabile fra 286-810 bp e un omologia
compresa fra il 90-100 % con le sequenze di riferimento prelevate dalla GenBank (NCBI).
Come sequenze di riferimento sono state prese dalla GenBank (NCBI) 80 sequenze che
presentavano la maggior percentuale di omologia per le rispettive sequenze analizzate. Queste
sequenze provengono dall’analisi di ceppi certificati e ceppi ottenuti da altri istituti di ricerca.
(vedi allegato 11.3)
Le sequenze dei campioni Aspergillus glaucus 58, Aspergillus clavatus 109 e Trichophyton
tonsurans 3, ottenute con la seminested PCR sono state escluse dal lavoro poiché non coprivano
l’intero gene.
8.5. Confronto fra identificazione morfologica e identificazione mediante
l’analisi delle sequenze
Fra i campioni per i quali si é ottenuta la sequenza del frammento ITS1-5.8S-ITS2, l’identificazione
morfologica forniva un’identificazione a livello di specie per 44/56 ceppi. I restanti 12 ceppi erano
identificati a livello di specie.
L’identificazione mediante l’analisi delle sequenze ha fornito invece un’identificazione a livello di
specie per 36/56 ceppi, di genere 19/56 e di ordine 1/56.
Tabella 6. Confronto fra identificazione morfologica e genotipica
Specie
Genere
Ordine
Identificazione morfologica
Analisi della sequenza
78,6% (44/56)
21,4% (12/56)
-
64,3% (36/56)
33,9% (19/56)
1,8% (1/56)
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
19
Messe a confronto, le due tecniche presentano un’identificazione identica per 32/56 campioni di qui
25 campioni identificati a livello di specie e 7 a livello di genere con un’omologia con le sequenze
di riferimento che varia dal 90-100%.
Si può notare come per tre ceppi differenti di Aspergillus flavus la sequenza risulta identica alla
sequenza della specie Aspergillus oryzae.
Il campione No. 98 Absidia corymbifera presenta un’omologia al 100% con l’Absidia corymbifera
ATCC 46774. La sequenza di riferimento però, copre solamente la regione 5.8S-ITS2.
L’identificazione fenotipica a livello di specie risulta più discriminante per 12/56 campioni, mentre
a livello di genere per 1/56 campioni.
Al contrario l’identificazione a livello di specie effettuata mediante l’analisi delle sequenze risulta
più discriminante per 4/56 campioni le qui percentuali di omologia variano fra il 92-100%.
Infine per 7/56 campioni otteniamo delle identificazioni contrastanti. Di questi, 6 campioni sono
comunque classificati correttamente a livello di genere.
Dunque possiamo dire che l’identificazione mediante l’analisi delle sequenze fornisce
un’identificazione identica a l’identificazione fenotipica a livello di genere per 55/56 campioni.
Tabella 7. Confronto fra identificazione fenotipica ed identificazione mediante l’analisi delle sequenze a livello di
genere e specie
No. campioni
Percentuale
Identificazione fenotipica a livello di genere identica 55/56
all’identificazione mediante sequenza
98,2%
Identificazione fenotipica a livello di specie identica 25/56
all’identificazione mediante sequenza
44,6%
Identificazione fenotipica a livello di specie più 12/56
discriminante
21,4%
Identificazione mediante sequenza a livello di specie
più discriminante
4/56
7,14%
Risultati discrepanti fra fenotipo e sequenza a livello
di specie
7/56
12,5%
8.6. Albero filogenetico
L’albero filogenetico é stato creato mediante il programma MEGA 3.0 introducendo 80 sequenze di
riferimento provenienti dalla GenBank (NCBI) e le 56 sequenze ottenute appartenenti a 36 specie
diverse. L’albero mostra un buon raggruppamento degli ordini e delle famiglie salvo per il
campione 55 Paecilomices lilacinus, appartenente all’ordine delle Eurotiales, e il campione 99
Geotricum candidum, appartenente appartenente all’ordine dei Saccharomycetales, i quali si
trovano raggruppati all’interno dell’ordine delle Hypocreales. (vedi allegato 11.5)
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
20
Tabella 8. Tabelle risultati
A.
Identificazione fenotipica a livello di specie identica all’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2
No.
Micoteca
ICM
Ceppo
Specie
Identificazione fenotipica
Specie
Identificazione ITS
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella
GenBank (NCBI)
No.
GenBank
(NCBI)
98
90
18
102
5
10
15
23
56
62
Neqas 6758/M34707
M6558/03
DSM 816/95
CQ99
M9618/CQ015888
Absidia corymbifera
Aspergillus candidus
Aspergillus clavatus
Aspergillus clavatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus japonicus
Absidia corymbifera
Aspergillus candidus
Aspergillus clavatus
Aspergillus clavatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus japonicus
32
37
83
R5340 esp 96
CQ97/M89
Neqas 6406/M35301
Aspergillus niger
Aspergillus terreus
Aspergillus versicolor
Aspergillus niger
Aspergillus terreus
Aspergillus versicolor
138
99
76
Corso BioMérieux
Neqas 6759/M34711
M19220/02
Epidermophyton floccosum
Geotrichum candidum
Microsporum canis
Epidermophyton floccosum
Galactomyces geotrichum
Microsporum canis
111
M21559
Microsporum canis
Microsporum canis
11
117
VA2397/97
M35037
Microsporum gypseum
Microsporum gypseum
Arthroderma gypseum
Arthroderma gypseum
100% di omologia con Absidia corymbifera ATCC 46774
100% di omologia con Aspergillus candidus ATCC 1002
100% di omologia con Aspergillus clavatus ATCC 58869
100% di omologia con Aspergillus clavatus ATCC 58869
100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197
100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197
100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197
100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197
100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197
100% di omologia con Aspergillus japonicus CBS 61178
100% di omologia con Aspergillus aculeatus CBS 17266
100% di omologia con Aspergillus niger ATCC 16888
100% di omologia con Aspergillus terreus ATCC 1012
100% di omologia con Aspergillus versicolor 2014
99% di omologia con Aspergillus versicolor ATCC 9577
100% di omologia con Epidermophyton floccosum ATCC 26072
99% di omologia con Galactomyces geotrichum YF01C
100% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828
100% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57
100% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828
100% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57
100% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 258.61
99% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 161.69
AF117937
AY373842
AY373847
AY373847
AY939790
AY939790
AY939790
AY939790
AY939790
AY585562
AY585558
AY373852
AY373871
AM158229
AY373880
AY213646
DQ668351
AY213657
AJ252329
AY213657
AJ252329
AJ970141
AJ000621
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
21
(continuazione)
A.
No.
Micoteca
ICM
Ceppo
Specie
Identificazione fenotipica
Specie
Identificazione ITS
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella
GenBank (NCBI)
No.
GenBank
(NCBI)
136
137
55
61
Corso BioMérieux
Corso BioMérieux
CQ00/17436
Neqas 5775/M38017
Microsporum gypseum
Microsporum praecox
Paecilomyces lilacinus
Paecilomyces variotii
149
Neqas 7640/M36113
Paecilomyces variotii
Arthroderma gypseum
Microsporum praecox
Paecilomyces lilacinus
Paecilomyces variotii
Paecilomyces variotii
Paecilomyces variotii
N.P.1
VA460449
Schizophyllum comune
Schizophyllum commune
100% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 258.61
100% di omologia con Microsporum praecox CBS 468.74
100% di omologia con Paecilomyces lilacinus ATCC 10114
99% di omologia con Paecilomyces variotii NRRL 1115
97% di omologia con Paecilomyces variotii ATCC 22319
99% di omologia con Paecylomices variotii NRRL 1115
97% di omologia con Paecylomices variotii ATCC 22319
100% di omologia con Schizophyllum commune HNO34
AJ970141
AJ970148
AY213665
AF033395
AY373941
AF033395
AY373941
AF280758
1
N.P., campione non presente nella micoteca
22
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
B.
Identificazione fenotipica a livello di genere identica all’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2
No.
Micoteca
ICM
Ceppo
Specie
Identificazione fenotipica
Specie
Identificazione ITS
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella
GenBank (NCBI)
No.
GenBank
(NCBI)
51
-
Acremonium sp.
Acremonium sp.
116
68
M25474
Neqas 6019/M22420
Acremonium sp.
Exophiala sp.
Hypocreales sp.
Exophiala sp.
24
-
Fusarium sp.
Fusarium sp.
72
M4938
Penicillium sp.
Penicillium sp.
93
R13266/03
Penicillium sp.
Penicillium sp.
105
R5798
Trichoderma sp.
Trichoderma sp.
147
M39284/05
Trichoderma sp.
Trichoderma sp.
100% di omologia con Acremonium sp. KMU 4529
100% di omologia con Acremonium strictum UW 836
97% di omologia con Hypocreales sp. LM92
90% di omologia con Exophiala sp. CBS 115831
90% di omologia con Exophiala xenobiotica CBS 117674
100% di omologia con Fusarium oxysporum Ppf15
100% di omologia con Fusarium sp. 448
100% di omologia con Fusarium subglutinans CNFM 960512
100% di omologia con Penicillium chrysogenum EPA 467
100% di omologia con Penicillium commune wb153
100% di omologia con Penicillium sp. PC6
100% di omologia con Penicillium citrinum WM 05.3
100% di omologia con Penicillium westlingii NRRL 800
100% di omologia con Hypocrea jecorina ATCC 24449
100% di omologia con Hypocrea schweinitzii ICMP 5426
100% di omologia con Trichoderma longibrachiatum ATCC52326
100% di omologia con Hypocrea koningii GJS 95-175
100% di omologia con Hypocrea rufa GJS 96-47
100% di omologia con Trichoderma koningiopsis Dis326h
100% di omologia con Trichoderma ovalisporum Dis 203c
100% di omologia con Trichoderma sp. YM2
AB158290
AY138844
EF060464
AY857539
DQ182589
EF495237
AY729069
AY898246
AY373903
AF455544
EF105368
DQ249207
AF033423
DQ000625
X93966
Z48935
AF456923
AJ230685
DQ379015
DQ315458
AB297794
23
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
C. Identificazione fenotipica a livello di specie più discriminante dell’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2
No.
Micoteca
ICM
Ceppo
Specie
Specie
Identificazione fenotipica Identificazione ITS
50
CQ98/9792
Aspergillus flavus
Aspergillus sp.
94
Neqas 6657/M19635
Aspergillus flavus
Aspergillus sp.
N.P.
CQR5708
Aspergillus flavus
Aspergillus sp.
91
R10937/03
Aspergillus nidulans
Aspergillus sp.
82
M45878/02
Aspergillus ochraceus
Aspergillus sp.
25
M1023/95
Aspergillus versicolor
Aspergillus sp.
86
M4859/03
Fusarium oxysporum
Fusarium sp.
34
CQ12.96
Fusarium solanii
Fusarium sp.
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella
GenBank (NCBI)
No.
GenBank
(NCBI)
100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043
100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103
100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043
100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103
100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043
100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103
100% di omologia con Emericella nidulans NRRL 2395
100% di omologia con Emericella dentata IFM 42021
100% di omologia con Emericella quadrilineata UWFP 613
100% di omologia con Emericella cleistominuta IFM 48170
100% di omologia con Emericella rugulosa IFM 54242
99% di omologia con Aspergillus ochraceus ATCC 18412
99% di omologia con Aspergillus westerdijkiae NRRL 35197
100% di omologia con Aspergillus versicolor NHRC-FE078
100% di omologia con Emericella nidulans 2172
90% di omologia con Exophiala xenobiotica CBS 117674
99% di omologia con Fusarium oxysporum 10L-201-Mexico
99% di omologia con Fusarium bulbicola NRRL 13618
99% di omologia con Gibberella sacchari wb 395
99% di omologia con Fusarium lactis NRRL 25200
99% di omologia con Gibberella moniliformis FV 4773
100% di omologia con Fusarium oxysporum FO-05
100% di omologia con Fusarium solani WB 853
AY939782
AY373857
AY939782
AY373857
AY939782
AY373857
AY373888
AB249000
AY213644
AB248989
AB249002
AY373854
DQ250530
AJ937755
AM158232
DQ182589
AY904065
U61676
AF455450
U61681
AY428795
AY928412
AY569560
24
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
C. ( Continuazione)
No.
Micoteca
ICM
Ceppo
Specie
Specie
Identificazione fenotipica Identificazione ITS
133
Corso BioMérieux
Microsporum audouinii
Microsporum sp.
134
Corso BioMérieux
Microsporum canis
Microsporum sp.
143
Neqas 7432/M14243
Penicillium Chrysogenum
Penicillium sp.
81
CQ5/02/M19992
Rhizopus oryzae
Rhizopus sp.
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella
GenBank (NCBI)
No.
GenBank
(NCBI)
99% di omologia con Microsporum audouinii CBS 344.50
100% di omologia con Microsporum rivalieri CBS 409.51
100% di omologia con Microsporum langeronii CBS 408.51
99% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828
99% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57
99% di omologia con Microsporum ferrugineum CBS 426.63
100% di omologia con Penicillium chrysogenum EPA 467
100% di omologia con Penicillium commune wb153
100% di omologia con Penicillium sp. PC6
100% di omologia con Rhizopus oryzae CBS 395.95
100% di omologia con Rhizopus japonicus AHU6525
100% di omologia con Rhizopus microsporus AHU6527
100% di omologia con Amylomyces rouxii SDM34
AJ252333
AJ000625
AJ252334
AY213657
AJ252329
AJ252338
AY373903
AF455544
EF105368
AY213684
AB097347
AB097348
AB181338
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
D.
25
Identificazione a livello di specie mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 più discriminante dell’identificazione fenotipica
No.
Micoteca
ICM
110
20
46
N. P.
Ceppo
Specie
Identificazione fenotipica
Specie
Identificazione ITS
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella
GenBank (NCBI)
No.
GenBank
(NCBI)
M21439
M1292/97
M19793/98
M42299
Chaetomium sp.
Chrysosporium sp.
Penicillium sp.
Malbranchea sp.
Chaetomium funicola
Chrysosporium keratinophilum
Penicillium nalgiovense
Auxarthron conjugatum
92% di omologia con Chaetomium funicola CBS 141.50
100% di omologia con Chrysosporium keratinophilum IFO 7584
100% di omologia con Penicillium nalgiovense IBT 12108
97% di omologia con Auxarthron conjugatum GFI 149
AJ279450
AJ131681
AJ004895
AJ608967
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
E.
26
Risultati discrepanti fra identificazione fenotipica e identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 a livello di specie
No.
Micoteca
ICM
Ceppo
13
69
21
M430/95
Neqas 6020/M22415
M41912/01
95
40
38
Neqas 6658/M19637
M742/97
M1609/96
100
Neqas6760/M34712
Specie
Identificazione fenotipica
Specie
Identificazione ITS
Aspergillus candidus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus nidulans
Emericella corrugata
Chrysosporium keratinophilum Aphanoascus reticulisporus
Chrysosporium articulatum
Chrysosporium keratinophilum Aphanoascus fulvescens
Curvularia lunata
Curvularia trifolii
Exophiala spinifera
Exophiala jeanselmei
Exophiala oligosperma
Paecilomyces lilacinus
Curvularia trifolii
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella
GenBank (NCBI)
No.
GenBank
(NCBI)
100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197
100% di omologia con Emericella corrugata IFM 54743
100% di omologia con Aphanoascus reticulisporus
100% di omologia con Chrysosporium articulatum UAMH 4320
100% di omologia con Aphanoascus fulvescens UAMH 5117
100% di omologia con Curvularia trifolii wb 403
100% di omologia con Exophiala jeanselmei CBS 463.80
100% di omologia con Exophiala oligosperma IP 2118.92
100% di omologia con Curvularia trifolii wb 403
AY939790
AB264794
AJ390381
AJ007841
AF038357
AF455446
AY163552
DQ836797
AF455446
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
27
9. Discussione
L’identificazione della specie nella diagnostica delle micosi gioca un ruolo fondamentale per lo
svolgimento del trattamento medico. Un’identificazione basata sulla morfologia delle ife o delle
spore non é purtroppo sempre facile da eseguire poiché specie molto vicine filogeneticamente
possono presentare tratti fenotipici uguali o difficilmente differenziabili.
Oltre alle difficoltà di identificazione morfologica dobbiamo prendere in considerazione i tempi che
la crescita su piastra prevede: tempi troppo lunghi per un tipo di diagnostica che vuole risultati
precisi in tempi sempre più brevi.
In questo lavoro si é voluto così testare una tecnica alternativa, che fosse più specifica rispetto alla
morfologia nella determinazione della specie, e che in un futuro potesse essere applicata ad una
determinazione direttamente dal campione.
Si é deciso quindi, di effettuare l’identificazione dei diversi funghi mediante analisi delle sequenze
dei geni ITS1-5.8S-ITS2.
Le sequenze di 56 ceppi appartenenti a 36 specie diverse ottenute tramite amplificazione del DNA
ribosomale, mediante l’impiego di primers specifici per i funghi, sono state confrontate con le
sequenze presenti nella GenBank (NCBI) ed i risultati ottenuti sono stati messi a confronto con
l’identificazione fornita dalla morfologia.
I risultati ottenuti mostrano un’alta specificità di questa tecnica nell’identificazione esatta a livello
di genere con un’identificazione corrispondente all’identificazione morfologica di 55/56 (98,2%)
ceppi.
A livello di specie purtroppo si é riscontrato che l’identificazione morfologia riesce ad essere più
discriminante con un’identificazione di specie di 44/56 ceppi (78,6%) rispetto all’identificazione
mediante l’analisi delle sequenze che posiziona a livello di specie 36/56 (64,3%) ceppi fra i quali
solamente 25 con un’identificazione identica all’identificazione fenotipica.
Da notare che per 4 campioni dove la morfologia forniva solo la classificazione a livello di genere
l’identificazione mediante la sequenza é risultata più discriminante.
Si può dunque concludere che l’identificazione dei diversi funghi mediante l’analisi dei geni ITS15,8S-ITS2 non può sostituire un’identificazione morfologica bensì essere un appoggio in caso di
difficoltà nell’identificazione fenotipica.
Altre prospettive di analisi potrebbero contemplare invece l’utilizzo dell’amplificazione della
regione ITS accompagnata dall’amplificazione di un’altro gene ribosomiale come potrebbe essere il
28S o il 18S. Oppure ancora si potrebbe cercare di classificare le diverse specie mediante l’utilizzo
di geni codificanti per alcune proteine come l’actina, la chitina sintetasi, l’acetil coenzima sintetasi e
sopratutto l’Į-tubulina e la ȕ-tubulina, due geni che si presentano altamente variabili fra le diverse
specie [9,19].
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
28
10. Bibliografia
1. J. L. Rakeman, U. Bui, K. LaFe, Y.-C. Chen, R. J. Honeycutt, B. T. Cookson; Multilocus
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2. J. Pontón; Diagnostico micróbiologico de las micosis; Revista Iberoamericana de Micología,
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3. T. Henry, P. C. Iwen, S. H. Hinrichs; Identification of Aspergillus Species Using Internal
Transcribed Spacer Regions 1 and 2; Journal of Clinical Microbiology, 38, 1510-1515, 2000
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5. D. E. Ciardo; Molecular Identification of Fungal Pathogens using the ITS Region; Diss.
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6. L. B. Lourenço, P. C. A. Garcia, S. M. Recco-Pimentel; Restriction fragment analysis of the
ribosomal DNA of Paratelmatobius and Scythrophrys species (anura, Leptodactyliadae);
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9. J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical
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10. S. N. Leaw, H. C. Chang, H. F. Sun, R. Barton, J. Bouchara, T. C. Chang; Identification of
Medically Yeast Species by Sequence Analysis of the Internal Transcribed Spacer Regions;
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11. S. F. Yeo, B. Wong; Current Status of Nonculture Methods for Diagnosis of Invasive
Fungal Infections; Clinical Microbiology Reviews, 15, 465-484, 2002
12. G. Delfino, E. Lanciotti, G. Liguri, M. Stefani; Medicina e Biologia, Dizionario
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13. G.S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras; Atlas of Clinical fungi; 2° ed., Universitat
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14. G. Deysson, A. Delcourt; Cryptogamie, Mycologie générale et appliquée; 2° ed., SEDES et
C.D.U., Paris, 1980
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
29
15. M. R. Costa, C. Da Silva Lacaz, M. Kawasaki, Z. P. De Camargo; Conventional versus
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of Fungal Pathogens by PCR and by ITS2 and 5,8S Ribosomal DNA Typing in Ocular
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19. P. J. Keeling; Congruent evidence from Į-tubulin and ȕ-tubulin gene phylogenies for a
zygomycete origin of microsporidia; Fungal Genetics and Biology, 38, 298-309, 2003
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23. K. Voigt, E. Cigelnik, K. O’Donnell; Phylogeny and PCR Identification of Clinically
Important Zygomycetes Based on Nuclear Ribosomal-DNA Sequence Data; Journal of
Clinical Microbiology, 37., 3957-3964, 1999
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
11. Allegati
30
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
31
11.1. Tavole illustrate delle caratteristiche morfologiche degli Ascomiceti,
Zigomiceti e Basidiomiceti
Tavola 1. Ascomiceti
J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology
Reviews, July, 454-500, 1999.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
32
Tavola 2. Zigomiceti
J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology
Reviews, July, 454-500, 1999.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
33
Tavola 3. Basidiomiceti
J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology
Reviews, July, 454-500, 1999.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
34
11.2. Lista dei campioni
Specie
Ceppo
No. Micoteca
No. Sequenza
Sequenza
ITS1-5.8S-ITS2
Lunghezza frammento bp
Absidia corymbifera
Absidia corymbifera
Absidia corymbifera
Acremonium sp.
Acremonium sp.
Acremonium sp.
Acremonium sp.
Acremonium sp.
Alternaria alterneta
Alterneria alternata
Aphanoascus fulvescens
Arthrinium phaeospermium
Aspergillus candidus
Aspergillus candidus
Aspergillus clavatus
Aspergillus clavatus
Aspergillus clavatus
Aspergillus flavus
Aspergillus flavus
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus glaucus
Aspergillus japonicus
Aspergillus nidulans
Aspergillus nidulans
Aspergillus niger
Aspergillus ochraceus
Aspergillus terreus
Aspergillus terreus
Aspergillus versicolor
Aspergillus versicolor
Aureobasidium sp.
Bipolaris sp.
Caldosporium cladosporioides
Chaetamium sp.
Neqas1 5891/M9621
R12109/01
Neqas 6758/M34707
CQ97/M89
M18768/98
Neqas 6210/M7440
M25474
Neqas 6325/M19931
CQ12.96
M732/ZH96
M29513/05
M430/95
M6558/03
DSM 816/95
Neqas 7021/M19740
CQR5708
CQ98/9792
Neqas 6657/M19635
CQ99
CQ00/M19448
M9618/CQ015888
Neqas 6020/M22415
R10937/03
R5340 esp 96
M45878/02
CQ97/M89
CQ99/M14318
M1023/95
Neqas 6406/M35301
M26530
M29240
M21439
64
66
98
39
45
51
75
116
78
35
31
146
13
90
18
102
109
N.P.2 / CQR5708
50
94
5
10
15
23
56
58
62
69
91
32
82
37
54
25
83
57
115
71
110
810
492
488
512
508
515
515
510
510
510
512
512
512
512
512
490
481
481
514
504
523
482
471
488
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
35
Specie
Ceppo
No. Micoteca
No. Sequenza
Sequenza
ITS1-5.8S-ITS2
Lunghezza frammento bp
Chrysosporium keratinophilum
Chrysosporium keratinophilum
Chrysosporium sp.
Cladosporium sp.
Cladosporium sphaerospermum
Cunninghamella berthalletiae
Cunninghamella bertholletiae
Curvularia lunata
Epidermophyton floccosum
Exophiala sp.
Exophiala spinifera
Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum
Fusarium solani
Fusarium solanii
Fusarium sp.
Geotrichum candidum
Geotrichum candidum
Hormographiella aspergillata
Malbranche sp.
Malbranchea sp.
Microsporum audouinii
Microsporum canis
Microsporum canis
Microsporum canis
Microsporum gypseum
Microsporum gypseum
Microsporum gypseum
Microsporum persicolor
Microsporum praecox
Monascus ruber
Mucor sp.
Ochroconis sp.
Paecilomyces lilacinus
Paecilomyces lilacinus
Paecilomyces variotii
Paecylomices veriotii
Penicillium Chrysogenum
Penicillium sp.
Penicillium sp.
Penicillium sp.
Rhizopus oryzae
Schizophyllum comune
M41912/01
Neqas 6658/M19637
M1292/97
M753/97
Neqas 7355/M5569
CQ99/M28018
Neqas 6659/M19638
M742/97
corso 2004 BioMérieux
Neqas 6019/M22420
M1609/96
M4859/03
R36234
M35303/02
CQ12.96
ID ZH/95
Neqas 6759/M34711
R8459
M42299
Tbc22067
corso 2004 BioMérieux
M19220/02
M21559
corso 2004 BioMérieux
VA2397/97
M35037
corso 2004 BioMérieux
corso 2004 BioMérieux
corso 2004 BioMérieux
CQ99
M31577/01
CQ00/17436
Neqas6760/M34712
Neqas 5775/M38017
Neqas 7640/M36113
Neqas 7432/M14243
M19793/98
M4938
R13266/03
CQ5/02/M19992
VA460449
21
95
20
41
140
53
96
40
138
68
38
86
119
79
34
24
1
99
139
N.P. / M42299
113
133
76
111
134
11
117
136
135
137
2
48
70
55
100
61
149
143
46
72
93
81
N.P. / VA460449
515
516
520
515
695
540
541
461
489
459
286
492
649
652
652
652
581
534
581
555
511
515
528
528
500
500
500
468
562
549
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
36
Specie
Ceppo
No. Micoteca
No. Sequenza
Sequenza
ITS1-5.8S-ITS2
Lunghezza frammento bp
Trichoderma sp.
Trichoderma sp.
Trichoderma sp.
Trichophyton tonsurans
M948
R5798
M39284/05
CQ95/M106
27
105
147
3
552
519
-
1.
2.
National External Quality assesment service, UK
Non presente nella micoteca
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
37
11.3. Lista delle sequenze di riferimento
Specie
Ceppo
GenBank (NCBI)
No. Referenza
Lunghezza sequenza bp
ITS1-5.8S-ITS2
Absidia corymbifera
Acremonium sp.
Acremonium strictum
Amylomyces rouxii
Aphanoascus fulvescens
Aphanoascus reticulisporus
Arthroderma gypseum
Arthroderma gypseum
Aspergillus aculeatus
Aspergillus candidus
Aspergillus clavatus
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus japonicus
Aspergillus niger
Aspergillus ochraceus
Aspergillus oryzae
aspergillus terreus
Aspergillus versicolor
Aspergillus versicolor
Aspergillus versicolor
Aspergillus westerdijkiae
Auxarthron conjugatum
Chaetomium funicola
Chrysosporium articulatum
Chrysosporium keratinophilum
Curvularia trifolii
Emericella cleistominuta
Emericella corrugata
Emericella dentata
Emericella nidulans
Emericella nidulans
Emericella quadrilineata
Emericella rugulosa
Epidermophyton floccosum
Exophiala jeanselmei
Exophiala oligosperma
Exophiala sp.
Exophiala xenobiotica
Fusarium bulbicola
Fusarium lactis
Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum
Fusarium solani
Fusarium sp.
Fusarium subglutinans
ATCC1 46774
KMU 4529
UW 836
SDM34
UAMH 5117
CBS2 258.61
CBS 161.69
CBS 17266
ATCC 1002
ATCC 58869
ATCC 20043
ATCC 9197
CBS 61178
ATCC 16888
ATCC 18412
SRRC 2103
ATCC 1012
NHRC-FE078
ATCC 9577
2014
NRRL3 35197
GFI 149
CBS 141.50
UAMH 4320
IFO 7584
wb 403
IFM 48170
IFM 54743
IFM 42021
NRRL 2395
2172
UWFP4 613
IFM 54242
ATCC 26072
CBS 463.80
IP5 2118.92
CBS 115831
CBS 117674
NRRL 13618
NRRL 25200
Ppf15
10L-201-Mexico
FO-05
WB 853
448
CNFM 960512
AF117937
AB158290
AY138844
AB181338
AF038357
AJ390381
AJ970141
AJ000621
AY585558
AY373842
AY373847
AY939782
AY939790
AY585562
AY373852
AY373854
AY373857
AY373871
AJ937755
AY373880
AM158229
DQ250530
AJ608967
AJ279450
AJ007841
AJ131681
AF455446
AB248989
AB264794
AB249000
AY373888
AM158232
AY213644
AB249002
AY213646
AY163552
DQ836797
AY857539
DQ182589
U61676
U61681
EF495237
AY904065
AY928412
AY569560
AY729069
AY898246
420 sequenza parziale 5.8S-ITS2
492
492
562
516
515
581
534
490
508
515
510
512
490
514
502
510
523
482
482
471
501
494
494
515
520
515
481
481
481
481
402
481
481
695
541
541
520
519
461
461
459
461
494
494
459
459
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
Specie
Ceppo
GenBank (NCBI)
No. Referenza
Lunghezza sequenza bp
ITS1-5.8S-ITS2
Galactomyces geotrichum
Gibberella moniliformis
Gibberella sacchari
Hypocrea jecorina
Hypocrea koningii
Hypocrea rufa
Hypocrea schweinitzii
Hypocreales sp.
Microsporum audouinii
Microsporum canis
Microsporum distortum
Microsporum ferrugineum
Microsporum langeronii
Microsporum praecox
Microsporum rivalieri
Paecilomyces lilacinus
Paecilomyces variotii
Paecilomyces variotii
Penicillium chrysogenum
Penicillium citrinum
Penicillium commune
Penicillium nalgiovense
Penicillium sp.
Penicillium sp.
Penicillium westlingii
Rhizopus japonicus
Rhizopus microsporus
Rhizopus oryzae
Schizophyllum commune
Trichoderma koningiopsis
Trichoderma longibrachiatum
Trichoderma ovalisporum
Trichoderma sp.
YF01C
FV 4773
wb 395
ATCC 24449
GJS 95-175
GJS 96-47
ICMP 5426
LM92
CBS 344.50
ATCC 23828
CBS 190.57
CBS 426.63
CBS 408.51
CBS 468.74
CBS 409.51
ATCC 10114
NRRL 1115
ATCC 22319
EPA 467
WM 05.3
wb153
IBT 12108
PC6
ZN 105
NRRL 800
AHU6525
AHU6527
CBS 395.95
HNO34
Dis326h
ATCC 52326
Dis 203c
YM2
DQ668351
AY428795
AF455450
DQ000625
AF456923
AJ230685
X93966
EF060464
AJ252333
AY213657
AJ252329
AJ252338
AJ252334
AJ970148
AJ000625
AY213665
AF033395
AY373941
AY373903
DQ249207
AF455544
AJ004895
EF105368
DQ810189
AF033423
AB097347
AB097348
AY213684
AF280758
DQ379015
Z48935
DQ315458
AB297794
286
461
461
552
519
519
552
487
649
652
652
652
649
555
649
511
529
514
500
468
500
500
500
468
468
562
562
562
549
519
552
519
519
1.
2.
3.
4.
5.
American Type Culture Collection, USA
Centraalbureau voor Schimmelcultures, Netherlands
Northen Regional Research Laboratory, USA
University of Washington Fungal Project, USA
Pasteur Institute Collection Fungi, France
38
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
11.4. Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro
Anamorfismo
Telomormismo
Monascus ruber
Absidia corymbifera
Acremonium sp.
Acremonium strictum
Alternaria alternata
Amylomyces rouxii
(Mucor rouxii)
Arthrinium phaeospermum
Aspergillus candidus
Aspergillus clavatus
Aspergillus cleistominutus
Aspergillus corrugatus
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus glaucus
Aspergillus japonicus
(Aspergillus aculeatus)
Aspergillus nidulans
Aspergillus niger
Aspergillus ochraceus
Aspergillus oryzae
Aspergillus rugulosus
Aspergillus terreus
Aspergillus versicolor
Aspergillus westerdijkiae
Aureobasidium sp.
Bipolaris sp.
Caldosporium cladosporioides
Chaetomium funicola
Chaetomium sp.
Chrysosporium articulatum
Chrysosporium keratinophilum
Chrysosporium sp.
Chrysosporium sp.
Chysosporium sp.
Cladosporium sp.
Cladosporium sphaerospermum
Emericella cleistominuta
Emericella corrugata
Emericella nidulans
Emericella quadrilineata
Emericella dentata
Emericella rugulosa
Discophaerina sp.
Cochliobolus sp.
Aphanoascus keratinophilus
Aphanoascus fulvescens
Aphanoascus sp.
Aphanoascus reticulisporus
39
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
Anamorfismo
Cunninghamella bertholletiae
Curvularia lunata
Curvularia trifolii
Epidermophyton floccosum
Exophiala jeanselmei
Exophiala oligosperma,
( Melanchlenus oligospermus,
Rhinocladiella atrovirens)
Exophiala sp.
Exophiala spinifera
Exophiala xenobiotica
Fusarium bulbicola
(Fusarium sacchari)
Fusarium lactis
(Fusarium Moniliforme)
Fusarium oxysporum
Fusarium solani
Fusarium sp.
Fusarium subglutinans
Fusarium verticillioides
Geotrichum candidum
Hormographiella aspergillata
Malbranchea sp.
Malbranchea sp.
Microsporum audouinii
(Microsporum rivalieri)
Microsporum canis
(Microsporum distortum)
Microsporum ferrugineum
Microsporum gypseum
Microsporum langeronii
Microsporum persicolor
Microsporum praecox
Mucor sp.
Ochroconis sp.
Paecilomyces lilacinus
Paecilomyces variotii
Penicillium Chrysogenum
Penicillium citrinum
Penicillium commune
Penicillium nalgiovense
Penicillium sp.
Telomormismo
Cochliobolus lunatus
Cochliobolus sp.
Gibberella sacchari
Nectria haematococca
Gibberella sp.
Nectria sp.
Gibberella moniliformis
Galactomyces geotrichum
Coprinopsis cinerea
Auxarthron sp.
Auxarthron conjugatum
Arthroderma otae
Arthroderma gypseum
Arthroderma persicolor
40
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
Anamorfismo
Penicillium westlingii
Rhizopus microsporus
Rhizopus oryzae
(Rhizopus arrhizus,
Rhizopus japonicus)
Schizophyllum commune
Trichoderma citrinoviride
Trichoderma koningii
Trichoderma koningiopsis
Trichoderma longibrachiatum
Trichoderma ovalisporum
Trichoderma reesei
Trichoderma sp.
Trichophyton tonsurans
Tricoderma viride
41
Telomormismo
Hypocrea schweinitzii
Hypocrea koningii
Hypocrea sp.
Hypocrea jecorina
Hypocrea sp.
Hypocrea rufa
Referenze
1. D. E. Ciardo; Molecular Identification of Fungal Pathogens using the ITS Region; Diss.
ETH 16410, 2006
2. G.S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras; Atlas of Clinical fungi; 2° ed., Universitat
Rovira i Virgili, 2000
3. NCBI, Taxonomy Browser. http://ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
11.5. Albero
42
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
11.6. Classificazione secondo .S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras,
delle specie usate in questo lavoro
Ascomicota
Euascomycetes
Eurotiales
Trichomaceae
Aspergillus candidus
Aspergillus clavatus
Aspergillus cleistominutus
Aspergillus corrugatus
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus glaucus
Aspergillus japonicus
Aspergillus nidulans
Aspergillus niger
Aspergillus ochraceus
Aspergillus oryzae
Aspergillus rugulosus
Aspergillus terreus
Aspergillus versicolor
Aspergillus westerdijkiae
Paecilomyces lilacinus
Paecilomyces variotii
Penicillium Chrysogenum
Penicillium citrinum
Penicillium commune
Penicillium nalgiovense
Penicillium sp.
Penicillium westlingii
Epidermophyton floccosum
Ascomicota
Euascomycetes
Onygenales
Onygenaceae
Chrysosporium articulatum
Chrysosporium keratinophilum
Chrysosporium sp.
Chrysosporium sp.
Chysosporium sp.
Malbranchea sp.
43
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
Ascomicota
Euascomycetes
Onygenales
Arthrodermataceae
Microsporum audouinii
Microsporum canis
Microsporum ferrugineum
Microsporum gypseum
Microsporum langeronii
Microsporum persicolor
Microsporum praecox
Epidermophyton floccosum
Ascomicota
Euascomycetes
Sordariales
Chaetomiaceae
Chaetomium funicola
Chaetomium sp.
Ascomicota
Euascomycetes
Hypocreales
Hypocreaceae
Acremonium sp.
Acremonium strictum
Trichoderma citrinoviride
Trichoderma koningii
Trichoderma koningiopsis
Trichoderma longibrachiatum
Trichoderma ovalisporum
Trichoderma reesei
Trichoderma sp.
Trichophyton tonsurans
Tricoderma viride
Fusarium bulbicola
Fusarium lactis
Fusarium oxysporum
Fusarium solani
44
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
Fusarium sp.
Fusarium subglutinans
Fusarium verticillioides
Ascomicota
Euascomycetes
Chaetothyriales
Herpotrichiellaceae
Exophiala jeanselmei
Exophiala oligosperma,
( Melanchlenus oligospermus,
Rhinocladiella atrovirens)
Exophiala sp.
Exophiala spinifera
Ascomicota
Euascomycetes
Pleosporales
Pleosporaceae
Curvularia lunata
Curvularia trifolii
Basidiomycota
Hymenemycetes
Stereales
Schizophyllaceae
Schizophyllum commune
Zygomicota
Mucorales
Mucoraceae
Absidia corymbifera
Rhizopus microsporus
Rhizopus oryzae
Amylomyces rouxii
Rhizopus microsporus
Rhizopus oryzae
Schizophyllum commune
45
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico
46
Ringraziamenti
Ringrazio coloro che mi hanno aiutato in questo lavoro. In primo luogo ringrazio il direttore
dell’Intituto Cantonale di Microbiologia, il Dr. Orlando Petrini, per avermi concesso la possibilità di
svolgere il mio lavoro di diploma presso il loro laboratorio di sierologia.
Ringrazio la Dr.ssa Gladys martinetti per la fiducia che mi ha concesso in questi mesi e soprattutto
per la scelta dell’argomento del lavoro di diploma; un lavoro che mi ha coinvolto pienamente.
Ringrazio la Dr ssa Antonella Demarta Aeschbacher e la Dr.ssa. Simona Casati per avermi seguito
durante l’elaborazione dei dati
Non in minor modo rigrazio i tecnici in analisi biomediche Anna Paola Caminada, Marilena
Chiaravalloti, Karin Gervasoni-Bolgiani, Tecla Fondrini per il loro importante supporto tecnico
Ed in fine ringrazio il direttore della Scuola Medico Tecnica Andrea Boffini, le docenti Daniela
Marcacci, Sonja Marci e Susan Gilbert.

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