Mesure de la libération calcique intracellulaire - Arpege

Date : 20/02/2014
Page : 1/ 11
Mesure de la libération calcique intracellulaire
L'objet de ce chapitre est de présenter le principe du Fluo-4 AM, une sonde calcique
de synthèse principalement utilisée sur la plateforme ARPEGE pour mesurer la
libération
calcique
intracellulaire
dépendante
de
l'activation
des
protéines
hétérotrimériques de type Gq. Impliqué dans de nombreux processus physiologiques
(libération de neurotransmetteurs, contraction musculaire, coagulation sanguine,
ossification...) et dans la signalisation intracellulaire où il agit comme second
messager, le calcium est un élément essentiel à la vie, ce qui explique sa très fine
régulation au sein de l'organisme (homéostasie calcique) et donc l’importance de son
étude.
Historiquement, la première sonde fluorescente chimérique1 sensible aux oscillations
calciques intracellulaires a été développée par Miyawaki et ses collaborateurs 2 .
Depuis, de nombreux efforts ont été réalisés dans le développement de sondes
toujours plus sensibles. Les sondes principalement utilisées pour étudier la
dynamique
de
la
signalisation
calcique
intracellulaire
3
sont
des
protéines
4
fluorescentes modifiées comme l'aequorine et le GCaMP6 , ou des molécules
synthétiques comme le Fura-2 ou le Fluo-4. Ces sondes ont été utilisées avec
succès dans différentes applications comme la fluorimétrie en microplaques ou
encore la microscopie.
Une des premières sondes synthétiques utilisée en microscopie de fluorescence
pour le suivi dans le temps de la libération intracellulaire du calcium fut le Fura-2
développé par le groupe de Roger Tsien5. Plus tard, ce même groupe développa des
versions améliorées de cette sonde dont le Fluo-36 et son analogue optimisé, le Fluo47.
1
Protéine artificielle obtenue par la combinaison de différentes protéines.
Miyawaki A, et al., Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin,
Nature (1997).
3
Contrairement aux sondes classiques l'aequorine émet spontanément des photons en présence de Ca2+. Il n’est
donc pas nécessaire de l’exciter avec une source lumineuse. De plus, de par sa nature protéique, la sonde est
directement produite par les cellules ce qui permet d'éviter les étapes de chargement des cellules avec la sonde
comme pour les fluorophores organiques.
4
Chen TW et al., Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity, Nature (2013).
5
Grynkiewicz G, et al., A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties, JBC
(1985).
6
Minta A, et al., Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein
chromophores, JBC (1989).
7
Gee KR, et al., Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+ indicator dyes, Cell calcium (2000).
2
Date : 20/02/2014
Page : 2/ 11
Mesure de la libération calcique intracellulaire
Structure du Fluo-4 :
Le Fluo-4 est constitué de deux parties :
- le fluophore (fluorescein-like),
- le chélateur spécifique de l’ion calcium Ca2+ (BAPTA8-like).
Les caractéristiques du Fluo-4 sont résumées dans le tableau ci-dessous :
Fluo4
λmax (exc.) (ion-bound)
λmax (em.) (ion-bound)
Kd (Ca2+)
494 nm
516 nm
345 nM
εmax
ε488 nm
88 000 cm-1M-1
QY
0,14
77 000 cm-1M-1
λmax (exc.) et λmax (em.) : longueurs d'ondes maximales d'excitation et d'émission en présence de
calcium,
2+
9
Kd (Ca ) : constante de dissociation pour le calcium,
εmax : coefficient d'extinction molaire au maximum d'absorption,
ε488nm : coefficient d'extinction molaire à 488 nm (longueur d'onde généralement utilisée pour
l'excitation de ce type de molécule),
QY : rendement quantique.
10
(afin de mieux comprendre ces caractéristiques, voir le chapitre sur le transfert d'énergie )
Lorsque la sonde est excitée avec une source lumineuse centrée sur son pic
d'absorption, autours de 488 nm, l’émission de photons par le fluorophore sera
principalement dépendante de la présence de calcium dans le milieu (Figure 1).
8
Le BAPTA est un acide aminopolycarboxylique capable de former un complexe avec le calcium.
Le Kd ou constante de dissociation (unité en Molaire, M) reflète ici l'affinité du chélateur calcique pour l'ion
calcium. Lorsque le calcium intracellulaire est à une concentration correspondant au Kd, on considère que la
moitié des sondes calciques présentes ont liées un ion calcium.
10
http://www.arpege.cnrs.fr/IMG/pdf/Principe_techniques_RET.pdf
9
Date : 20/02/2014
Page : 3/ 11
Mesure de la libération calcique intracellulaire
Figure 1. Spectre d'émission du Fluo-4 dans une solution contenant de 0 à 39,8 µM
de calcium libre (test in vitro).
Afin de rendre le Fluo-4 perméant, c'est-à-dire capable de traverser la membrane
plasmique des cellules, un groupement acétoxyméthylester (AM) a été ajouté au
Fluo-4 pour former le Fluo-4 AM (Figure 2). Ce groupement masque les charges
négatives des groupements carboxyles (R-COOH) de la sonde ce qui la rend
hydrophobe (lipophile). Sous cette forme, le Fluo-4 AM est capable de traverser la
membrane des cellules mais l’ajout de ce groupement le rend insensible au calcium
(empêche la complexation11 de l'ion par le chélateur).
Figure 2. Structure du Fluo-4 AM.
11
Désigne la capacité de groupements fonctionnels (-COOH...) à former des complexes avec des cations comme
ici le calcium.
Date : 20/02/2014
Page : 4/ 11
Mesure de la libération calcique intracellulaire
C’est une fois dans le cytoplasme que des estérases endogènes 12 clivent par
hydrolyse le groupement AM du Fluo-4 AM, libérant ainsi la forme carboxylée active
de la sonde (-COOH) : le Fluo-4 (Figure 3).
A
B
Figure 3. A) Entrée du Fluo-4 AM dans la cellule et mesure de la libération calcique
intracellulaire. B) Clivage des groupements AM par les estérases endogènes.
Sous cette forme, la sonde devient sensible aux ions calcium qu’elle peut alors lier
(Figure 4A). Le Fluo-4 lie le calcium avec un Kd de 345 nM qui se situe dans la
gamme des niveaux de calcium intracellulaire de la plupart des lignées cellulaires13
(Figure 4B). Cette liaison se traduit par une augmentation de l’intensité de
fluorescence du Fluo-4. Il est ainsi possible de suivre des cinétiques rapides de
variation de la concentration intracellulaire en calcium en mesurant en temps réel
l'intensité de la fluorescence du Fluo-4.
12
Enzymes intracellulaires capables de cliver des groupements ester R-COO-R'.
A l’extérieur de la cellule, le calcium est à une concentration relativement élevée (>1 mM) dont un tiers
environ est lié à des protéines (albumine). La concentration en calcium est également élevée dans différents
compartiments cellulaires comme le réticulum endoplasmique. Au niveau du cytoplasme, au contraire, la
concentration du Ca2+ est faible (100 nM), mais elle peut s’élever rapidement (> 1 µM) sous l'effet d'un
stimulus extracellulaire.
13
Date : 20/02/2014
Page : 5/ 11
Mesure de la libération calcique intracellulaire
A
B
Figure 4. A) Liaison d'un ion calcium par le Fluo-4. B) Concentrations cellulaires en
calcium. La valeur en noir correspond à l'état de repos et en rouge lors d'une
stimulation.
MECANISME PHYSICO-CHIMIQUE DE LA VARIATION D’INTENSITE DE FLUORESCENCE
DU FLUO-4 EN PRESENCE OU EN ABSENCE DE CALCIUM
:
La complexation de l'ion calcium au niveau de la sonde entraîne une modification de
l’environnement électronique et un changement de propriété de fluorescence du
Fluo-4. Ceci est dû à la structure chimique du Fluo-4 qui forme un système donneuraccepteur d'électrons. Le chélateur correspond au donneur d'électron lorsque celui-ci
n’est pas complexé à un ion calcium et le fluorophore joue le rôle d'accepteur
d'électron (Figure 5).
Date : 20/02/2014
Page : 6/ 11
Mesure de la libération calcique intracellulaire
Lorsque l’on excite la sonde par une source lumineuse, le fluorophore passe, au
niveau électronique, d'un état fondamental à un état excité. Dès lors, deux
phénomènes principaux peuvent intervenir (Figure 5) :
- la fluorescence (voir cours d'introduction sur la fluorescence14),
- le transfert d’électron photo-induit (Photoinduced Electron Transfer, PET)15
•
En absence d’ion calcium :
La désexcitation du fluorophore s’effectue par un processus d’oxydo-réduction 16
impliquant un transfert d’électron photo-induit. Cela signifie qu’au sein du Fluo-4, le
chélateur va jouer le rôle de donneur d’électron (réducteur) et le fluorophore excité le
rôle d’accepteur d’électron (oxydant). Cette voie de désexcitation est non radiative
(sans émission de lumière) et le rendement de fluorescence du fluorophore est donc
quasiment nul.
•
En présence d’ion calcium :
La chélation du calcium modifie les propriétés électroniques du chélateur ce qui ne
favorise plus le transfert d’électron photo-induit. La désexcitation du fluorophore
s’effectue donc par le retour de l’électron de l'état excité vers son état fondamental
avec émission d’un photon. C’est le phénomène de fluorescence.
Dans le cas du Fluo-4, on parle donc de « système off-on ».
14
http://www.arpege.cnrs.fr/IMG/pdf/Principe_techniques_RET.pdf
Prasanna de Silva A et al., Fluorescent PET (Photoinduced Electron Transfer) sensors as potent analytical
tools, Analyst (2009).
16
Une réaction d'oxydoréduction est une réaction chimique au cours de laquelle se produit un échange
d'électron entre le réducteur qui cède un électron à l’oxydant qui le capte.
15
Date : 20/02/2014
Page : 7/ 11
Mesure de la libération calcique intracellulaire
A
B
Figure 5. Transfert d'électrons au sein du Fluo-4. A) En l'absence de calcium et
après excitation du fluorophore par une source lumineuse (1), le chélateur se
comporte comme un donneur d'électron (2) empêchant le retour de l'électron du
fluorophore17 vers son état fondamental18. Ce dernier se désexcite et prend la place
de l'électron perdu par le chélateur (3). B) La liaison du calcium en modifiant les
propriétés électroniques du chélateur favorise le retour de l'électron vers son état
fondamental avec émission d'un photon de fluorescence (2).
UTILISATION DU FLUO-4 ET CELLULES VIVANTES
Différentes étapes sont nécessaires avant toute mesure du signal calcique en
cellules vivantes.
•
Chargement des cellules avec la sonde :
Il est nécessaire de charger dans un premier temps les cellules avec le Fluo-4 AM19.
La solution de charge contient généralement un inhibiteur de transporteurs
17
Ici les électrons du niveau fondamental sont représentés par des flèches antiparallèles qui représentent le spin
des électrons soit, de manière approximative, l'état de rotation des deux électrons.
18
L'état fondamental est aussi appelé HOMO pour Highest Occupied Molecular Orbital.
L'état excité est aussi appelé LUMO pour Lowest Unoccupied Molecular Orbital.
19
Incubation des cellules pendant 1h en présence de 1 µM de Fluo-4 AM en général afin de charger le
cytoplasme des cellules avec le Fluo-4 AM.
Date : 20/02/2014
Page : 8/ 11
Mesure de la libération calcique intracellulaire
anioniques (OAT pour Organic Anion Transporters) : le probénicide. En effet,
certaines cellules comme les HEK293 présentent à leur surface des OAT qui
expulsent hors de la cellule le Fluo-4.
•
Lavage des cellules :
Les sondes encore présentes dans le milieu extracellulaire sont éliminées par
lavages.
•
Stimulation de protéines membranaires induisant une libération intracellulaire
de calcium :
Le Fluo-4 est classiquement utilisé pour des tests de criblage dont le but est de
caractériser les effets pharmacologiques de petites molécules extracellulaires
agissant sur des protéines transmembranaires comme les Récepteurs Couplés aux
Protéines G ou RCPG (Figure 6).
signal de base (bruit de fond)
Figure 6. Cinétique de la libération intracellulaire du calcium (cellule HEK293) induite
par l'activation d'un RCPG stimulé par des doses croissantes d'agoniste. L'activation
de ce récepteur par une molécule agoniste induit, au travers de l'activation de son
premier effecteur (la protéine Gq), une libération de calcium intracellulaire.
Date : 20/02/2014
Page : 9/ 11
Mesure de la libération calcique intracellulaire
Comme on peut le noter sur le graphique de la Figure 6, un signal de base est
mesurable (après stimulation lumineuse) bien que les cellules ne soient pas encore
stimulées par l’agoniste. Il est important de rappeler que les cellules ont en moyenne
une concentration cytoplasmique de calcium libre de 100 nM (voir plus haut). Par
conséquent, le simple chargement des cellules avec la sonde permet de détecter ce
niveau de base en calcium intracellulaire. Le signal mesuré avant la stimulation des
cellules correspond au bruit de fond et il dépend principalement du nombre de
cellules présentes dans les puits au moment de la mesure ainsi que de l'efficacité
d'incorporation de la sonde20.
L'activation du récepteur par l’agoniste induit, au travers de l'activation de son
premier effecteur (la protéine Gq), une libération de calcium intracellulaire. Cette
libération de calcium est généralement transitoire avec un pic qui est atteint au bout
de quelques secondes. Le signal décroit ensuite rapidement du fait d'une part de la
rapide recapture du calcium libre au niveau d'organites comme le réticulum
endoplasmique (ATPases) ou de la mitochondrie (échangeur Na+/Ca2+) et d'autre
part
de
son
expulsion
à
l'extérieur
de
la
cellule
par
des
pompes
membranaires (ATPase). Il est important de rappeler que la complexation du calcium
par le Fluo-4 est réversible, c'est-à-dire que le calcium fixé au Fluo-4 peut repasser à
l'état libre.
•
Appareil de mesure (fluorimètre) :
Les mesures du flux calciques sont réalisées sur un lecteur de type Flexstation®
(Molecular Devices). Ce lecteur semi-robotisé permet de réaliser des mesures
dynamiques de la libération de calcium intracellulaire (Figure 7).
20
Généralement pour les HEK293, 70-100 000 cellules sont ensemencées par puits d'une plaque 96 puits.
Date : 20/02/2014
Page : 10/ 11
Mesure de la libération calcique intracellulaire
pointes utilisés pour injecter les composés
plaque contenant les composés à injecter
plaque contenant les cellules
Figure 7. Lecteur de plaque Flexstation® 3. Le signal de base est mesuré dans les
puits de la plaque contenant les cellules. Après un temps défini, les composés sont
injectés dans les puits contenant les cellules et l'évolution du signal de fluorescence
est mesurée en temps réel pendant un temps donné.
•
Analyse des résultats :
Différentes méthodes d'analyse peuvent être utilisées pour exploiter les signaux
calciques (aire sous la courbe, signal maximum - minimum...). Nous retiendrons ici
l'analyse en variation du signal de fluorescence :
ΔFluorescence = FMax - FMin
avec FMax qui correspond à l'intensité du signal de fluorescence à son pic et FMin à
l'intensité du signal de fluorescence avant stimulation par l'agoniste. Ce mode de
calcul permet de représenter l'amplitude du signal pour une condition donnée. Ce
mode de calcul permet de s'affranchir des différences de signal basal.
Dans l'exemple de la Figure 8, le récepteur métabotropique du glutamate mGluR5 a
été activé par son agoniste naturel le glutamate. Ce récepteur étant couplé aux
protéines Gq, son activation induit entre autre, une libération de calcium
intracellulaire qui peut être suivie en temps réel avec la sonde Fluo-4.
Date : 20/02/2014
Page : 11/ 11
Mesure de la libération calcique intracellulaire
Figure 8. Activation du récepteur mGluR5 exprimé dans des cellules HEK293 par du
glutamate. Après ajout de glutamate sur les cellules HEK293, la fluorescence du
Fluo-4 varie au cours du temps. Le première phase, augmentation du signal de
fluorescence, correspond à la libération de calcium intracellulaire transitoire induite
par l'activation du récepteur mGluR5. Après une dizaine de secondes, le pic calcique
(FMAX) est atteint et le signal de fluorescence revient rapidement à son niveau basal
(FMIN) (≈ 1 minute) du fait de la recapture/expulsion du calcium intracellulaire par la
cellule.
Conclusion
Le choix de la sonde calcique dépend essentiellement de l'origine du signal calcique
que l'on souhaite mesurer. Comme nous l'avons mentionné précédemment, le Fluo-4
est une sonde parfaitement adaptée à la mesure de la dynamique des oscillations
calciques cytoplasmiques. Cependant, d'autres sondes seront mieux adaptées à des
mesures locales de la concentration calciques dans des organites particuliers
comme le réticulum endoplasmique ou la mitochondrie21.
21
Paredes RM et al., Chemical calcium indicators, Methods (2008).