Validation de la méthode TEMPO® TC pour le dénombrement des

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accrÄditation Cofrac
nÅ1-0144
portÄe disponible
sur www.cofrac.fr
SOCIETE BIOMERIEUX
Service Recherche &
D•veloppement Industrie
Chemin de l’Orme
69280 MARCY L’ETOILE
Validation AFNOR des m€thodes alternatives d’analyse
Application € la microbiologie alimentaire
Rapport de synthÄse
(Etudes pr•liminaire et collaborative
conduites selon la norme NF EN ISO 16140)
Validation de la mÅthode TEMPOÇ TC
pour le dÅnombrement des coliformes totaux
M€thodes quantitatives
Ce rapport comprend 44 pages dont 5 annexes.
La reproduction de ce rapport n’est autoris€e que sous sa forme int€grale.
SYNTHESE TEMPO‚ TC (Version 2)
4 aoƒt 2008
Annule et remplace la version prÄcÄdente
L’ancienne version doit •tre restitu‚e
ƒ ADRIA D‚veloppement ou d‚truite en interne.
ADRIA DEVELOPPEMENT
Creac’h Gwen - F. 29196 QUIMPER Cedex - T•l. (33) 02.98.10.18.18 - Fax (33) 02.98.10.18.08
E-mail : [email protected] - Site web : http://www.adria.tm.fr - Site r•serv• adh•rents : http://www.clubiaa.net
ASSOCIATION LOI DE 1901 - N‚ SIRET 306 964 271 00036 - N‚ EXISTENCE 532900006329 - N‚TVA FR4530696427100036
BIOMERIEUX
Sommaire
1
INTRODUCTION _______________________________________________ 5
1.1 R€f€rentiel de validation ____________________________________ 5
1.2 Protocole et principe de la m€thode alternative _________________ 5
1.3 Domaine d’application demand€ _____________________________ 6
1.4 M€thode de r€f€rence ______________________________________ 6
2
ETUDE COMPARATIVE _________________________________________ 7
2.1 Lin€arit€ _________________________________________________ 7
2.1.1
Matrices utilis•es et protocole de contamination __________________ 7
2.1.2
R•sultats bruts ___________________________________________ 7
2.1.3
Interpr•tation statistique ____________________________________ 8
2.1.4
Discussion_______________________________________________ 9
2.2 Exactitude relative _________________________________________ 9
2.2.1
Nombre et nature des •chantillons ____________________________ 9
2.2.2
Contamination artificielle des •chantillons ______________________ 10
2.2.3
R•sultats bruts __________________________________________ 10
2.2.4
Interpr•tation ____________________________________________ 10
2.2.5
Discussion______________________________________________ 12
2.3 Compl€ment d’€tude d’exactitude sur les produits v€g€taux _____ 13
2.3.1
Protocole_______________________________________________ 13
2.3.2
R•sultats _______________________________________________ 13
2.3.3
Interpr•tation ____________________________________________ 15
2.4 Limite de d€tection (LOD) et limite de quantification (LOQ) ______ 16
2.4.1
Protocole_______________________________________________ 16
2.4.2
R•sultats _______________________________________________ 16
2.5 Sensibilit€ relative ________________________________________ 17
2.6 Sp€cificit€/S€lectivit€ _____________________________________ 17
2.6.1
Protocoles d’essai ________________________________________ 17
2.6.2
R•sultats _______________________________________________ 18
2.7 Praticabilit€______________________________________________ 19
2.7.1
Temps r•el de manipulation et flexibilit• de la technique par rapport au
nombre d’•chantillons € analyser ____________________________ 19
2.7.2
D•lai d’obtention des r•sultats_______________________________ 20
2.7.3
Traƒabilit• des r•sultats____________________________________ 20
2.7.4
Maintenance par le laboratoire ______________________________ 21
ADRIA D•veloppement
Synth„se TEMPO‚ TC (Version 2)
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BIOMERIEUX
3
ETUDE COLLABORATIVE ______________________________________ 22
3.1 Organisation de l’€tude ____________________________________ 22
3.2 Contr…le des param„tres exp€rimentaux _____________________ 23
3.2.1
Stabilit• de la souche au cours du transport ____________________ 23
3.2.2
R•sultats obtenus pour les deux m•thodes _____________________ 24
3.2.3
Temp•rature des •chantillons € r•ception ______________________ 24
3.2.4
Temp•rature des •chantillons pendant le transport _______________ 24
3.3 R€sultats des analyses ____________________________________ 25
3.3.1
Synth„se des r•sultats obtenus par les deux m•thodes ___________ 25
3.3.2
Calcul du biais___________________________________________ 26
3.3.3
Calcul de la r•p•tabilit• ____________________________________ 27
3.3.4
Reproductibilit• __________________________________________ 27
3.3.5
Dispersion entre les laboratoires _____________________________ 28
3.4 Discussion ______________________________________________ 28
4
CONCLUSION ________________________________________________ 30
Annexe 1 - Notice d’utilisation de la m•thode alternative _________________________ 32
Annexe 2 - M•thode de r•f•rence __________________________________________ 36
Annexe 3 - Etude de lin•arit• ______________________________________________ 37
Annexe 4 - Exactitude relative _____________________________________________ 41
Annexe 5 - Exactitude relative : Compl•ment d’•tude … Produits v•g•taux † (dates
d’analyse : 12 et 20 octobre 2005)___________________________________________ 43
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BIOMERIEUX
Les modifications apportÅes au rapport sont indiquÅes par un double
trait dans la marge É gauche.
Avant Propos
L’accr€ditation du COFRAC atteste de la comp€tence des laboratoires pour les
seuls essais couverts par l’accr€ditation qui sont identifi€s par le symbole.
L’ensemble des renseignements permettant de valider la garantie des analyses
est tenu ‚ la disposition de la Soci€t€ BIOMERIEUX.
Les r€sultats sont synth€tis€s au sein de tableaux et interpr€t€s selon la norme
NF EN ISO 16140.
o Fabricant :
Soci€t€ BIOMERIEUX
Chemin de l’Orme
69280 MARCY L’ETOILE
o Laboratoire expert :
ADRIA D€veloppement
ZA Creac’h Gwen
29196 QUIMPER Cedex
o MÅthode É valider :
M€thode TEMPO‚ TC pour le d€nombrement
des coliformes totaux
o RÅfÅrentiel de validation : Norme NF EN ISO 16140 (octobre 2003) :
protocole pour la validation des m•thodes
alternatives
o MÅthode de rÅfÅrence : NF EN ISO 4832 (f•vrier 2003) : directives
g•n•rales pour le d•nombrement des coliformes m•thode par comptage des colonies
o Etendue de la validation : Tous produits d’alimentation humaine et pour
animaux de compagnie, „ l’exclusion du lait cru,
des boissons et de l’alimentation du b•tail

NF EN ISO 4832 : essai effectu• sous le couvert de l’accr•ditation par le laboratoire expert
‚
Synth„se TEMPO TC (Version 2)
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1
INTRODUCTION
1.1
R€f€rentiel de validation
Le r•f•rentiel de validation utilis• est la Norme NF EN ISO 16140 (octobre
2003) : protocole pour la validation des m•thodes alternatives.
1.2
Protocole et principe de la m€thode alternative
TEMPO… est une solution automatis•e qui permet de r•aliser le
d•nombrement des germes indicateurs de la qualit• sanitaire dans les
produits d’alimentation humaine et pour animaux de compagnie, „ l’exclusion
du lait cru, des boissons et de l’alimentation du b•tail.
La num•ration des micro-organismes est bas•e sur la m•thode NPP :
Nombre le Plus Probable associ•e „ la technologie des cartes TEMPO….
Le syst†me TEMPO… r•alise l’interpr•tation de la croissance microbienne de
chaque carte TEMPO… et calcule le r•sultat des num•rations (UFC/g).
TEMPO… est compos• en deux postes d'activit• distincts :
- poste de pr•paration TEMPO… pour r•aliser l’ensemencement, avec
distribution d'un •chantillon alimentaire dilu• dans un flacon de milieu,
puis remplissage et le scellage des cartes TEMPO… au moyen d'un
instrument : TEMPO… Filler.
- poste de lecture TEMPO… pour effectuer la lecture et l’interpr•tation des
cartes TEMPO… par l'interm•diaire d'un instrument : TEMPO… Reader.
‚
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BIOMERIEUX
La notice d’utilisation est donn•e en Annexe 1 ; le protocole g•n•ral est
pr•sent• ci-apr†s :
Pr•paration •chantillon 1/10†me en sac TEMPO‚
Diluant : peptone-sel
Dilution 1/4000
3,9 ml eau distill•e
Dilution 1/400
Dilution 1/40
3,9 ml eau distill•e st•rile
3 ml eau distill•e
‚
en flacon TEMPO TC
0,1 ml suspension 1/100
0,1 ml suspension 1/10
1 ml suspension 1/10
dans flacon (une carte)
Incubation 24 h - 27 h „ 30‚C  1‚C
Lecture
La dilution au 1/40†me permet une num•ration dans la gamme 10 „ 49 000 ufc/g.
La dilution au 1/400†me permet une num•ration dans la gamme 100 „ 490 000 ufc/g.
La dilution au 1/4000†me permet une num•ration dans la gamme 1 000 „
4 900 000 ufc/g.
1.3
Domaine d’application demand€
Tous produits d’alimentation humaine et pour animaux de compagnie, „
l’exclusion du lait cru, des boissons et de l’alimentation du b•tail.
1.4
M€thode de r€f€rence
La m•thode de r•f•rence est la norme NF EN ISO 4832 (f•vrier 2003)  :
directives g•n•rales pour le d•nombrement des coliformes - m•thode par
comptage des colonies.
Le protocole est sch•matis• en Annexe 2.

NF EN ISO 4832 : essai effectu• sous le couvert de l’accr•ditation par le laboratoire expert
‚
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2
ETUDE COMPARATIVE
2.1
Lin€arit€
2.1.1
Matrices utilis€es et protocole de contamination
Cinq cat•gories de produits ont •t• analys•es (une matrice par cat•gorie), „
cinq niveaux de contamination et deux r•p•titions ont •t• r•alis•es par
•chantillon. Au total, 50 analyses ont •t• effectu•es „ la fois par la m•thode
de r•f•rence et la m•thode alternative.
Les niveaux de contamination, les matrices test•es, ainsi que les souches
utilis•es sont list•s dans le tableau suivant :
Matrice test•e
Souche
Taux d’inoculation
Steak hach•
Klebsiella oxytoca 42
100 - 500 - 1 000 - 5.103 - 5.104
Tablettes au bœuf pour chien
Citrobacter freundii 35
100 - 500 - 1 000 - 5.103 - 5.104
Concombre tranch•
E. coli 19
100 - 500 - 1 000 - 5.103 - 5.104
Cr†me pˆtissi†re
Enterobacter agglomerans 74 100 - 500 -1 000 - 5.103 - 5.104
Poisson cru
Enterobacter cloacae Ad 230 100 - 500 - 1 000 - 5.103 - 5.104
Une dilution 1/40 a •t• effectu•e pour l’analyse d’•chantillons inocul•s „ des
taux compris entre 100 et 5.103 UFC/g. Une dilution 1/400 a •t• effectu•e
pour l’analyse d’•chantillons inocul•s „ des taux compris entre 100 et
5.104 UFC/g. Une dilution 1/4000 a •galement •t• r•alis•e pour l’analyse
d’•chantillons inocul•s „ des taux compris entre 5 000 et 5.104 UFC/g.
2.1.2
R€sultats bruts
Les •chantillons ont •t• test•s en double par chacune des deux m•thodes.
Deux interpr•tations de r•sultats ont •t• effectu•es :
- Interpr•tation avec des dilutions combin•es :
Niveau 1 : 1/40
Niveau 2 : 1/40
Niveau 3 : 1/400
Niveau 4 : 1/400
Niveau 5 : 1/4000
‚
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- Interpr•tation en minimisant la variation des dilutions :
Niveau 1 : 1/40
Niveaux 2-3-4-5 : 1/400
Les graphiques bidimensionnels sont donn•s en Annexe 3.
2.1.3
Interpr€tation statistique
Les r•sultats des interpr•tations statistiques sont donn•es dans les tableaux
suivants pour l’interpr•tation avec les dilutions combin•es ou non.
- Dilutions combin€es :
Matrice
R
R•gression
Rob.F
utilis•e
Valeur
P%
critique
Coefficient de
Droite de r•gression*
corr•lation
Steak hach•
2,29
OLS1
5,529
5,41
5
0,987
logAlt= 0,072+0,980logRef
4,43
OLS1
2,549
5,41
17
0,972
logAlt= -0,133+1,071logRef
Concombres
1,43
GMFR
9,573
5,41
2
0,994
Filet de cabillaud
3,00
OLS1
1,473
5,41
33
0,990
Tablette au bœuf
2,50
OLS1
23,280
5,41
0
0,982
pour chien
* le choix de l’abscisse et de l’ordonn•e d•pend du type de r•gression retenue.
Interpr•tation statistique :
P5%
:
pas significatif
P<1%:
tr†s significatif
1 % < P < 5 % : significatif
- Dilutions (1/40 – 1/400) :
Matrice
R
R•gression
Rob.F
utilis•e
Valeur
P%
Coefficient de
critique
Droite de r•gression*
corr•lation
Steak hach•
4,86
OLS1
0,231
5,41
87
0,982
logAlt = 0,254+0,909logRef
6,29
OLS1
2,055
5,41
22
0,947
logAlt = -0,057+1,030logRef
Concombres
2,57
OLS1
3,921
5,41
9
0,987
Filet de cabillaud
3,00
OLS1
1,907
5,41
25
0,988
Tablette au bœuf
7,75
OLS1
5,152
5,41
5
0,961
pour chien
* le choix de l’abscisse et de l’ordonn•e d•pend du type de r•gression retenue.
Interpr•tation statistique :
P5%
:
pas significatif
P<1%:
tr†s significatif
Les droites de r•gression sont donn•es en Annexe 3 (dilutions combin•es
ou non).
‚
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2.1.4
Discussion
Les tests de lin•arit• sont accept•s d’embl•e dans la plupart des cas :
- interpr•tations des dilutions 1/40 – 1/400,
- interpr•tations des dilutions combin•es pour les matrices Š steak hach• ‹,
Š cr†me pˆtissi†re ‹ et Š filet de cabillaud ‹.
Dans la plupart des cas, les coefficients de corr•lation sont sup•rieurs „
0,98, valeurs •lev•es pour mettre en d•faut la robustesse des tests de
lin•arit•. Ainsi, la lin•arit• ne peut Œtre r•fut•e pour les matrices concombres
et tablettes au bœuf pour chien lors de l’interpr•tation de dilutions
combin•es.
Le test de lin•arit• est accept• dans tous les cas.
2.2
Exactitude relative
2.2.1
Nombre et nature des €chantillons
Les cat•gories et types d’aliments analys•s sont r•pertori•s dans le
tableau 1.
Tableau 1 - Nombre et nature des €chantillons
Cat•gories
Types
Viande crue - Charcuterie
Produits carn•s
Produits laitiers
Fruits et v•g•taux
- Plats cuisin•s
Fromages au lait cru - Fromages
frais - Glaces - Divers
L•gumes IV†me gamme D•shydrat•s et divers - Congel•s
Produits de la mer
Crus - fum•s - plats traiteurs
Aliments pour animaux de
produits d•shydrat•s - pˆt•s -
compagnie
viandes crues
Nombre d’•chantillons
Nombre de r•sultats
analys•s
exploit•s
18
10
27
10
22
10
19
14
27
10
Les •chantillons non exploit•s sont dus „ l’obtention de r•sultats inf•rieurs
ou sup•rieurs au seuil de num•ration de l’une et/ou de l’autre des m•thodes.
‚
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2.2.2
Contamination artificielle des €chantillons
Quatre •chantillons ont •t• contamin•s par contamination crois•e :
- •chantillons n‚ 1218 et 1219 : contamin•s par du fromage au lait cru
- •chantillons n‚ 1222 et 1223 : contamin•s par un produit pour animaux de
compagnie cuit type saucisson.
2.2.3
R€sultats bruts
Les •chantillons ont •t• analys•s en double par chacune des deux
m•thodes.
Tableau 2
Cat€gorie d’aliments
Produits carn•s
Aliments pour animaux de compagnie
Produits laitiers
Produits de la mer
Domaine de contamination (log)
1,00 „ 4,63
1,00 „ 5,43
1,85 „ 6,15
1,52 „ 5,48
1,40 „ 5,04
Les graphiques bidimensionnels pour chaque cat•gorie et pour l’ensemble
des •chantillons sont donn•s en Annexe 4.
2.2.4
Interpr€tation
Tableau 3
Cat•gorie
n
R
Produits carn•s
10
2,15
Produits laitiers
10
Fruits et
v•g•taux
Produits de la
mer
1,32
R•gression
P%
a
t(a)
b
t(b)
T critique
„0
1
OLS1
-0,357
0,097
0,864
1,224
2,306
93
26
GMFR
-0,166
0,397
1,052
0,430
2,306
70
68
utilis•e
Ordonn•e
Pente „
10
3,90
OLS1
0,997
1,235
0,611
2,094
2,306
25
7
14
1,73
GMFR
-0,555
1,401
1,061
0,526
2,179
19
61
10
6,00
OLS1
0,0405
0,145
0,960
0,552
2,306
89
60
54
2,42
OLS1
0,184
0,835
0,855
2,397
2,00
41
2
Aliments pour
animaux de
compagnie
Tous produits
‚
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Les limites de r•p•tabilit• obtenues pour la m•thode alternative et la
m•thode de r•f•rence ainsi que le biais D obtenu entre les deux m•thodes
sont donn•es dans le tableau 4.
Tableau 4
Cat•gorie
Biais D
Limite de r•p•tabilit•
m•thode alternative
m•thode de r•f•rence
Produits carn•s
- 0,368
0,411
0,191
Produits laitiers
0,015
0,367
0,279
- 0,418
0,572
0,147
Produits de la mer
- 0,188
0,382
0,220
Aliments pour animaux de
- 0,063
0,705
0,117
- 0,303
0,435
0,176
compagnie
Toutes cat•gories confondues
Les droites de r•gression (sous la forme de graphiques et d’•quations) pour
chacune des matrices et pour l’ensemble des matrices sont donn•es en
Annexe 4.
Certains •carts de d•nombrements sont observ•s entre les deux m•thodes :
- d•nombrement sup•rieur par la m•thode de r•f•rence :





•chantillon 505, jambon cuit
•chantillon 509, plat pr•par• „ base de poisson
•chantillon 423, cubes de tomate
•chantillon 1130, betteraves rouges
•chantillon 1132, petits pois surgel•s
Dans tous les cas, les colonies •taient de diam„tre sup•rieur € 0,5 mm
sur g•lose VRBL, avec une coloration rouge en absence d’aur•ole.
Des colonies ont •t• pr•lev•es sur g•lose VRBL : elles pr•sentent toutes
une activit• oxydase n•gative. Des caract•risations et identifications ont
•t• r•alis•es par galerie API. Ainsi, des souches montrant un ph•notype
lactose n•gatif ont •t• identifi•es aux esp†ces :
Enterobacter agglomerans pour l’•chantillon 509, 423 et 1132
 Serratia liquefaciens pour l’•chantillon 1132.

d•nombrement sup•rieur par la m•thode TEMPO‚ TC :
 •chantillon 1218, glace „ la vanille
‚
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BIOMERIEUX
2.2.5
Discussion
Les tests statistiques valident des ordonn•es „ l’origine proches de 0 et les
pentes proches de 1 pour chacune des cat•gories •tudi•es s•par•ment. Une
dispersion des r•sultats est observ•e entre les deux m•thodes pour la
cat•gorie v•g•taux. Cette dispersion semble Œtre imputable aux
d•nombrements de colonies caract•ristiques avec toutefois absence
d’aur•ole sur g•lose VRBL et montrant un [lactose]n•gatif. Si l’on s’accorde sur
le ph•notype lactose positif des ent•robact•ries rassembl•es dans le groupe
des coliformes, la m•thode de r•f•rence montre alors un manque de
sp•cificit•. Les biais entre les deux m•thodes sont compris entre
-0,418 Log UFC/g et 0,015 Log UFC/g. Ces observations permettent
d’appr•hender les r•sultats de tests statistiques indiquant une pente
diff•rente de 1 pour toutes cat•gories confondues. Enfin, les limites de
r•p•tabilit• de la m•thode alternative varient de 0,367 „ 0,705, celles de la
m•thode r•f•rence de 0,117 „ 0,279. Les limites de r•p•tabilit• de la
m•thode alternative sont sup•rieures „ celle de la m•thode de r•f•rence,
telle qu’observ•e de mani†re g•n•rale entre une m•thode bas•e sur le
principe NPP et une m•thode de d•nombrement sur g•lose (Gangar1 et
Gambrel-Lenarz, 1999).
1
Gangar V., Curiale M.S., Lindberg K., Gambrel-Lenarz S. (1999) Dry rehydratable film method for
enumerating confirmed Escherichia coli in poultry, meats and seafood: collaborative study. J.
AOAC Int., 82 (1) :73-8
‚
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BIOMERIEUX
2.3
Compl€ment d’€tude d’exactitude sur les produits v€g€taux
2.3.1
Protocole
Vingt produits v•g•taux ont •t• analys•s en double, „ la fois par la m•thode
TEMPO… TC et par la m•thode de r•f•rence NF EN ISO 4832, avec deux
marques de milieu VRBL afin d’•valuer la variabilit• entre milieux provenant
de fournisseurs diff•rents.
2.3.2
R€sultats
Les r•sultats bruts sont donn•s en Annexe 5. Les •chantillons analys•s sont
tous naturellement contamin•s. Une attention particuli†re a •t• port•e „
l’analyse de types peu repr•sent•s lors de l’•tude pr•sent•e le 19 septembre
2005, afin d’augmenter la variabilit• des matrices. Vingt-trois •chantillons ont
•t• analys•s pour obtenir vingt-deux r•sultats exploitables.
Les graphiques bi-dimensionnels sont donn•s figures 1 „ 4. Deux
repr•sentations et interpr•tations ont •t• r•alis•es pour le milieu A :
- la premi†re en cumulant les donn•es acquises lors du compl•ment
d’•tude „ celles acquises lors de l’•tude pr•liminaire, soit trente-deux
r•sultats,
- la deuxi†me avec uniquement les donn•es du compl•ment pour que cette
interpr•tation soit comparable „ celle r•alis•e avec le milieu B.
‚
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BIOMERIEUX
Figure 1 - Graphique bidimensionnel
TEMPO‚ TC / VRBL A (22 €chantillons)
Produits v€g€taux
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
5,00
5,00
4,00
4,00
3,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
l o g ( M €t hode de r€f €rence)
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
TEMPO‚ TC / VRBL B (22 €chantillons)
TEMPO‚ TC / VRBL A / VRBL B
8
8,00
7
7,00
6
6,00
5
VRBL
9,00
5,00
4
4,00
3
3,00
2
2,00
1
1,00
0
0
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
‚
2
4
VRBL A
14/43
6
TEMPO TC
VRBL B
4 aoƒt 2008
8
BIOMERIEUX
2.3.3
Interpr€tation
Les interpr•tations relatives „ l’acceptation des pentes „ 1 et des ordonn•es
„ 0 sont indiqu•es ci-dessous :
n
R
R•gression
a
+ (a)
b
+ (b)
Tcritique
P(0)
P (1)
0,374 0,824
0,814
1,836
2,042
42
8
utilis•e
Milieu A
32
2,31
OLS1
Milieu B
22
1,42
GMFR
- 0,630 1,765
1,067
0,840
2,086
9
41
Milieu A
22
2,08
OLS1
- 0,022 0,066
0,940
0,795
2,086
95
43
Les limites de r•p•tabilit• pour la m•thode alternative et pour la m•thode de
r•f•rence, ainsi que le biais obtenu entre les deux m•thodes sont donn•s
tableau ci-apr†s :
Biais D
M•thode alternative
M•thode de r•f•rence
Milieu A
(n = 32)
- 0,205
0,440
0,191
Milieu A
(n = 22)
- 0,140
0,396
0,191
Milieu B
(n = 22)
- 0,217
0,396
0,279
Les droites de r•gression pour chacune des interpr•tations figurent en
Annexe 5.
2.3.3.1 Discussion
Les r•sultats obtenus avec les deux milieux VRBL montrent une diff•rence
importante au niveau de l’ordonn•e „ l’origine : celle-ci est de - 0,630 avec le
milieu B et de - 0,022 avec le milieu A. Selon le nombre d’•chantillons
consid•r•s, les pentes varient de 0,814 „ 0,940 lors d’une comparaison avec
le milieu A. Elle est de 1,067 pour le milieu B.
Le graphique bidimensionnel pr•sent• figure 4 permet d’•valuer la variabilit•
des r•sultats g•n•r•s par la m•thode de r•f•rence selon le milieu VRBL
utilis•, indiquant l’h•t•rog•n•it• de la flore d•nombr•e entre deux milieux
diff•rents utilis•s dans une mŒme m•thode de r•f•rence. Alors, selon le cas,
le d•nombrement par la m•thode TEMPO‚ TC est davantage similaire „
celui obtenu sur milieu VRBL A, ou au contraire, „ celui obtenu sur milieu
VRBL B.
‚
15/43
4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
2.4
Limite de d€tection (LOD) et limite de quantification (LOQ)
2.4.1
Protocole
La limite de d•tection de la m•thode a •t• r•alis•e en cultures pures.
Trois niveaux d’inoculation ont •t• test•s, „ raison de six r•plicats par
niveau, soit dix-huit analyses par la m•thode alternative.
Une dilution 1/40 a •t• effectu•e. Une souche d’E. coli a •t• utilis•e pour la
limite de d•tection de la m•thode TEMPO… TC.
La limite de quantification a •t• effectu•e pour six d•terminations
ind•pendantes de diluant st•rile.
2.4.2
R€sultats
Les donn•es sont intrins†ques „ la m•thode. Les r•sultats sont donn•s dans
les tableaux suivants :
Tableau 5
Niveau
Nombre d’•chantillons positifs
Ecart-type
Biais
0 UFC/g
0/6
/
/
10 UFC/g
4/6
12,785
10
50 UFC/g
6/6
207,29
71
Tableau 6
Formules
Valeurs obtenues
LC
1,65 S0 + X0
31,1
LOD
3.3 S0 + X0
52,2
LOQ
10 S0 + X0
137,9
‚
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
2.5
Sensibilit€ relative
Les donn•es sont intrins†ques „ la m•thode. Elles sont obtenues „ partir des
r•sultats obtenus dans l’•tude de lin•arit•.
Les profils de pr•cision obtenus pour les diff•rentes matrices sont pr•sent•s
figure 5.
Figure 5 - Profils de pr€cision obtenus pour les diff€rentes matrices
100,0%
90,0%
80,0%
70,0%
CV(<x(y)>)
60,0%
Steak hach•
Barres pour chien
50,0%
Concombres
Filet de cabillaud cru congel•
Cr†me patissi†re
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
0
1
2
3
4
5
6
7
M€thode de r€f€rence log ufc/g (x)
2.6
Sp€cificit€/S€lectivit€
2.6.1
Protocoles d’essai
Apr†s d•cong•lation et cultures en bouillon BHI aux temp•ratures
appropri•es, des dilutions d•cimales ont •t• effectu•es et d•nombr•es en
double „ la fois par la m•thode TEMPO… TC et la m•thode ISO 4832. Un
d•nombrement a •t• effectu• en parall†le en g•lose PCA par inclusion afin
de v•rifier le taux d’inoculation.
‚
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BIOMERIEUX
2.6.2
R€sultats
Inclusivit€
Sur les 30 souches test•es, 4 n’ont pas r•pondu par le syst†me TEMPO…
TC. Il s’agit de :
-
Enterobacter sakazakii 90, de ph•notype lactose positif,
Escherichia hermanii 395, de ph•notype lactose n•gatif,
Hafnia alvei 40, de ph•notype lactose n•gatif,
Hafnia alvei 167, de ph•notype lactose n•gatif.
Sur la base de la d•finition du groupe des coliformes rassemblant des
ent•robact•ries de ph•notype [lactose]positif, la croissance de trois de ces
souches sur g•lose VRBL met en d•faut la s•lectivit• de la m•thode de
r•f•rence.
11 souches non cibles montrent une croissance sur g•lose VRBL :
Lactobacillus paracasei ATCC 10746, Morganella morganii CIP A236,
Proteus mirabilis 54, Proteus vulganis 56, Providencia rettgeri 12,
Providencia stuartii 46, 3 souches de Salmonella, Shigella flexneri CIP 8248
et Xanthomaras maltophilia CIP 6077. La m•thode TEMPO… TC d•tecte 5
d’entre elles : 3 souches de Salmonella, Lactobacillus paracasei ATCC
10746 et Proteus mirabilis 54.
La m•thode TEMPO… TC montre une sp•cificit• et une s•lectivit•
sup•rieures „ celles de la m•thode de r•f•rence, permettant d’expliquer
certains •carts de d•nombrements entre les deux m•thodes observ•s lors de
l’•tude d’exactitude relative, principalement pour la cat•gorie V•g•taux.
‚
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BIOMERIEUX
2.7
Praticabilit€
2.7.1
Temps r€el de manipulation et flexibilit€ de la technique par
rapport au nombre d’€chantillons ƒ analyser
Temps en minutes
Etape
Pr•l†vement
Ajout diluant
Broyage
Pr•paration
des bo•tes (2)
Dilutions
Ensemencements
Lecture
Temps total
Temps pour
1 •chantillon
M€thode NF ISO 4832
1 •chantillon 20 •chantillons
4
45
M€thode TEMPO TC
1 •chantillon 20 •chantillons
4
45
2
15
2
15
0,3
13
/
/
4
64
2
20
2,5
12,8
60
197
0,45
8,45
2
82
12,8
9,9
8,45
4,1
Les temps indiqu•s ne tiennent pas compte de la pr•paration des milieux qui
vient s’ajouter uniquement pour la m•thode de r•f•rence. La m•thode
TEMPO utilise le milieu TEMPO… TC qui est prŒt „ l’emploi.
L’utilisation de la m•thode TEMPO… TC r•duit consid•rablement les temps
de manipulation, en particulier au niveau du poste de lecture. Il faut deux fois
moins de temps pour r•aliser la m•thode TEMPO… TC que la m•thode
NF ISO 4832 lors de l’analyse d’une grande s•rie (20 •chantillons).
Il faut souligner •galement le gain de temps au niveau de la gestion des
d•chets.
Le volume des consommables par la m•thode TEMPO… TC est n•gligeable
par rapport au volume des consommables n•cessaires pour la m•thode NF
ISO 4832. Pour un •chantillon, il faut :
- pour la r•alisation de la m•thode TEMPO :
* 90 ml de diluant,
* 1 carte TC,
* 1 flacon TC,
(2)
3 dilutions x 2 bo•tes
‚
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BIOMERIEUX
- pour la r•alisation de la m•thode NF ISO 4832 :
* 90 ml de diluant,
* 2 tubes de TS de 9 ml,
* 6 bo•tes de VRBL.
L’espace d’incubation n•cessaire pour la m•thode TEMPO… TC est
particuli†rement restreint par rapport „ celui de la m•thode NF ISO 4832. Un
portoir de 20 cartes TEMPO (20 tests TC) mesure 22,5 cm x 10,5 cm ; pour
la m•thode NF ISO 4832 (analyse de 20 •chantillons), il faut 120 bo•tes, soit
20 piles de 6 bo•tes de P•tri.
2.7.2
D€lai d’obtention des r€sultats
Etape
M€thode NF ISO 4832
M€thode TEMPO TC
J0
J0
J1
J1
Pr•l†vement
Broyage
Analyse
Lecture
Le d•lai d’obtention des r•sultats est identique pour les deux m•thodes.
2.7.3
Tra„abilit€ des r€sultats
Une traŽabilit• compl†te est assur•e au niveau du TEMPO Filler et du
TEMPO Reader, „ savoir :
- identification de l’•chantillon,
- heure de r•alisation du test,
- manipulateur ayant r•alis• le test,
- lots de r•actifs et consommables utilis•s,
- dur•e d’incubation •coul•e ou restant avant lecture des cartes,
- heure de lecture des cartes,
- nombre de lecture r•alis•e pour chaque carte
- manipulateur ayant r•alis• la lecture,
- •dition des r•sultats, associant le r•sultat (UFC/g) „ l’•chantillon, au
param†tre test• et „ la date d’analyse,
- transfert possible vers un LIMS (Laboratory Information Management
System).
‚
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BIOMERIEUX
2.7.4
Maintenance par le laboratoire
Les performances du TEMPO Reader sont contr•l•es une fois par mois „
l’aide du kit TEMPO QC qui est compos• de :
-
3 flacons TEMPO QC 8 •M,
2 flacons TEMPO QC 20 •M,
3 cartes TEMPO QC 8 •M,
2 cartes TEMPO QC 20 •M,
1 notice.
Ce kit permet de v•rifier que le niveau de fluorescence donn• par le TEMPO
Reader se situe bien dans la plage de valeurs attendues, signifiant que
l’appareil est conforme.
L’int€r†t majeur de la m€thode TEMPO‚ TC r€side :
- dans le gain de temps important au niveau de l’analyse
et de la lecture,
- dans le gain de place ‡ l’incubation des cartes TEMPO‚ TC
et la gestion facilit€e des d€chets,
- dans la traˆabilit€ compl„te de l’analyse.
‚
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BIOMERIEUX
3
ETUDE COLLABORATIVE
3.1
Organisation de l’€tude
Laboratoires collaborateurs
Douze laboratoires ont particip• „ l’•tude.
Instructions aux laboratoires collaborateurs
Les instructions d•taill•es ont •t• transmises aux laboratoires par le
laboratoire expert.
Echantillons
Du lait pasteuris• demi-•cr•m• a •t• inocul• par Escherichia coli 94, isol•e
de produit laitier.
Inoculation
Les taux d’inoculation vis•s ont •t• les suivants :
-
<10 UFC/ml,
100 – 1 000 UFC/ml,
1 000 – 10 000 UFC/ml,
10 000 – 100 000 UFC/ml.
Les •chantillons ont •t• r•partis „ raison de 25 ml par flacon ; chaque
laboratoire a reŽu deux flacons par taux. Un •chantillon non inocul• a •t•
joint au colis pour d•nombrement de la flore a•robie m•sophile par la
m•thode NF ISO 4833.
Etiquetage, exp€dition
Les •chantillons cod•s (code connu uniquement du laboratoire expert) ont
•t• plac•s dans des caisses isothermes contenant des blocs r•frig•rants et
exp•di•s aux diff•rents laboratoires „ l’aide d’un transport express.
‚
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BIOMERIEUX
Un flacon t•moin temp•rature contenant un enregistreur de temp•rature a
•t• joint au colis, afin de suivre la temp•rature au cours du transport et de la
mesurer „ r•ception.
Les •chantillons ont •t• livr•s en 24 h aux laboratoires collaborateurs. La
temp•rature des •chantillons devait Œtre inf•rieure ou •gale „ 8‚C pendant le
transport, et comprise entre 0‚C et 8‚C „ l’arriv•e.
Analyses
Les laboratoires collaborateurs et le laboratoire expert ont effectu• les
analyses „ la fois par la m•thode alternative et par la m•thode de r•f•rence.
3.2
Contr…le des param„tres exp€rimentaux
3.2.1
Stabilit€ de la souche au cours du transport
Afin de v•rifier la stabilit• de la souche de Escherichia coli 94, un
d•nombrement des six flacons inocul•s a •t• effectu• le jour de l’inoculation,
ainsi qu’apr†s 24 h et 48 h de conservation „ 2‚C ; les r•sultats sont report•s
dans le tableau 7.
Tableau 7 - D€nombrement d’Escherichia coli 94
par la m€thode NF EN ISO 4832 (en log UFC/ml)
Taux 1
Taux 2
Taux 3
R•p•tition R•p•tition R•p•tition R•p•tition R•p•tition R•p•tition
1
2
1
2
1
2
J0
1,91
2,04
2,97
2,93
3,96
3,83
J1
1,89
1,77
2,92
2,99
3,83
3,90
J2
1,98
2,04
2,88
2,93
3,84
3,90
Aucune •volution de la souche n’est observ•e au bout de 48 h de
conservation dans la caisse isotherme.
‚
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
3.2.2
R€sultats obtenus pour les deux m€thodes
Les r•sultats de d•nombrement des coliformes par le laboratoire expert par
la m•thode ISO 4832 et par la m•thode TEMPO… TC sont pr•sent•s dans le
tableau 8, ainsi que les r•sultats obtenus „ partir des dilutions 1/40 et 1/400
pour la m•thode TEMPO… TC.
Tableau 8 - R€sultats du laboratoire expert (en log UFC/g)
Taux vis•
(log UFC/g)
M•thode de r•f•rence
ISO 4832
Duplicat 1
<1
1„2
2„3
3„4
< 1,00
1,89
2,92
3,83
Duplicat 2
< 1,00
1,77
2,99
3,90
M•thode alternative TEMPO… TC
Duplicat 1
D 1/40
D 1/400
< 1,00
< 1,00
1,85
2,08
2,92
2,86
3,83
3,83
Duplicat 2
D 1/40
D 1/400
< 2,00
< 2,00
2,00
< 2,00
2,93
2,86
4,32
4,08
Les taux de contamination vis•s ont •t• atteints.
3.2.3
Temp€rature des €chantillons ƒ r€ception
Les temp•ratures mesur•es „ r•ception sont donn•es dans le tableau 9.
Tableau 9 - Temp€rature des €chantillons ‡ r€ception
Laboratoires
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
3.2.4
Temp•rature mesur•e
„ r•ception (‚C)
2,6
3,4
4,9
2,0
4,2
3,2
3,2
4,8
2,7
1,4
4,9
4,8
Date de r•ception
des •chantillons
Date
d’analyse
J1 (18/10/2005)
J1 (18/10/2005)
Temp€rature des €chantillons pendant le transport
Aucune anomalie n’a •t• observ•e pendant le transport ; la temp•rature
mesur•e pendant le transport •tait comprise entre 0 et 3,5‚C.
‚
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BIOMERIEUX
3.3
R€sultats des analyses
3.3.1
Synth…se des r€sultats obtenus par les deux m€thodes
Une synth†se des r•sultats est pr•sent•e tableau 10 (r•sultats obtenus avec
la dilution 1/40 par la m•thode TEMPO… TC) et tableau 11 (r•sultats obtenus
avec la dilution 1/400 par la m•thode TEMPO… TC).
Tableau 10 - Synth„se des r€sultats obtenus avec la dilution 1/40
par la m€thode TEMPO‚ TC (en log UFC/g)
Niveau 0
Laboratoires M‚thode de
Niveau 1
Niveau 2
Niveau 3
M‚thode
M‚thode de
M‚thode
M‚thode de
M‚thode
M‚thode de
M‚thode
r‚f‚rence
alternative
r‚f‚rence
alternative
r‚f‚rence
alternative
r‚f‚rence
alternative
A
<1
<1
<1
<1
2,00
1,95
2,00
1,85
2,90
2,96
2,97
3,23
3,95
3,95
4,08
3,72
B
<1
<1
<1
<1
2,04
2,00
2,00
2,11
2,93
2,98
3,04
3,04
4,00
3,92
4,32
4,04
C
<1
<1
<1
<1
1,93
2,00
1,86
2,11
2,71
2,83
2,86
2,72
3,85
3,85
3,96
4,08
D
<1
<1
<1
<1
1,98
1,90
1,64
2,00
2,91
2,91
3,00
2,72
3,89
3,95
4,08
4,04
E
<1
<1
<1
<1
2,04
2,11
1,77
1,84
2,93
2,93
2,92
2,86
3,93
3,99
4,04
3,89
F
<1
<1
<1
<1
1,88
1,95
2,00
1,85
2,83
2,90
2,80
2,86
3,94
3,93
4,04
4,08
G
<1
<1
<1
<1
1,98
2,11
2,04
2,04
2,80
2,90
3,11
2,76
3,85
3,77
3,96
4,32
H
<1
<1
<1
<1
2,00
1,78
2,15
2,15
2,77
2,82
2,96
3,00
3,89
3,95
4,32
4,40
I
<1
<1
<1
<1
2,08
1,95
2,08
1,85
2,86
2,95
3,04
3,04
3,93
3,94
4,08
4,18
J
<1
<1
<1
<1
1,81
1,85
1,00
1,86
3,04
2,90
2,86
2,92
3,85
3,87
3,96
3,89
K
<1
<1
<1
<1
1,98
1,85
1,93
1,77
2,90
2,91
2,92
3,08
3,89
3,95
4,08
4,04
L
<1
<1
<1
<1
2,04
1,93
1,65
2,11
2,92
2,97
2,95
3,08
3,96
4,00
4,18
4,48
Tableau 11 - Synth„se des r€sultats obtenus avec la dilution 1/400
par la m€thode TEMPO‚‚ TC (en log UFC/g)
Niveau 0
M‚thode
Laboratoires de r‚f‚rence
Niveau 1
Niveau 2
Niveau 3
M‚thode
alternative
M‚thode
de r‚f‚rence
M‚thode
alternative
M‚thode
de r‚f‚rence
M‚thode
alternative
M‚thode
de r‚f‚rence
M‚thode
alternative
A
<1
<1
<2
<2
2,00
1,95
<2
2,00
2,90
2,96
2,64
2,86
3,95
3,95
3,92
3,97
B
<1
<1
<2
<2
2,04
2,00
2,32
<2
2,93
2,98
2,76
2,65
4,00
3,92
4,00
3,91
C
<1
<1
<2
<2
1,93
2,00
<2
2,00
2,71
2,83
2,77
2,32
3,85
3,85
4,04
3,85
D
<1
<1
<2
<2
1,98
1,90
<2
2,32
2,91
2,91
2,77
2,85
3,89
3,95
4,08
4,18
E
<1
<1
<2
<2
2,04
2,11
<2
2,00
2,93
2,93
2,65
2,52
3,93
3,99
3,76
3,66
F
<1
<1
<2
<2
1,88
1,95
2,32
2,00
2,83
2,90
3,18
2,04
3,94
3,93
3,84
3,86
G
<1
<1
<2
<2
1,98
2,11
2,52
2,00
2,80
2,90
2,93
2,86
3,85
3,77
4,04
3,98
H
<1
<1
<2
<2
2,00
1,78
<2
<2
2,77
2,82
2,76
2,65
3,89
3,95
3,92
3,90
I
<1
<1
<2
<2
2,08
1,95
2,32
<2
2,86
2,95
2,51
2,95
3,93
3,94
4,11
3,81
J
<1
<1
<2
<2
1,81
1,85
<2
2,32
3,04
2,90
3,11
3,00
3,85
3,87
4,00
3,76
K
<1
<1
<2
<2
1,98
1,85
2,00
2,00
2,90
2,91
2,77
3,04
3,89
3,95
4,04
3,85
L
<1
<1
<2
<2
2,04
1,93
<2
<2
2,92
2,97
2,77
2,85
3,96
4,00
4,26
4,08
‚
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
3.3.2
Calcul du biais
Pour chaque niveau, la diff•rence des moyennes des r•plicats (di) obtenues
par la m•thode alternative et la m•thode de r•f•rence est calcul•e : di =
(Mi,alt - Mi, r•f).
La m•diane (MED {di} des di permet de d•terminer le biais D
(MED{di} = biais D).
Le biais D et l’•cart-type robuste S {di} = K1Sn donnent une statistique de t
(t(d) = MED{di} n /S{di}). Cette valeur de t obtenue est compar•e „ une
valeur critique trouv•e dans la table de Student (pour n = 12,
t critique = 2,201).
Les valeurs de t(d) obtenues par niveau sont report•es dans le tableau 12.
Tableau 12 - Valeurs de t(d) obtenues par niveau
Niveau
Nombre de
r‚sultats
exploitables
(nombre de
laboratoires)
0
Biais D
t(d)
d 1/40
d 1/400
d 1/40
d 1/400
t critique
ddl (n-1)
n = 12
/
/
/
/
/
/
1
n = 12
- 0,05
/
1,684
/
2,201
Biais non significatif
2
n = 12
0,08
- 0,16
2,400
3,647
2,201
Biais significatif
2,201
Biais significatif
Biais non significatif
(D 1/400)
3
n = 12
0,16
0,02
3,766
0,650
Conclusion
Niveau critique : t(d) < t critique
‚
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
3.3.3
Calcul de la r€p€tabilit€
Les valeurs obtenues pour la limite de r•p•tabilit•, ainsi que les valeurs
obtenues pour le test F sont donn•es dans le tableau 13.
Tableau 13 - Valeurs obtenues pour la limite de r€p€tabilit€
et valeurs pour le Test F
Nombre de
Limite de r‚p‚tatibilit‚
r‚sultats
M‚thode
M‚thode
Niveau exploitables
alternative
de
(nombre de
r‚f‚rence d 1/40 d 1/400
laboratoires)
d 1/40
d 1/400
F
critique
(0,05 ; n ; n)
P%
d 1/40 d 1/400
1
n = 12
0,226
0,458
/
4,12
/
2,69
1
/
2
n = 12
0,161
0,277
0,371
2,98
5,35
2,69
4
0
3
n = 12
0,144
0,319
0,279
4,88
15,44
2,69
1
0
Interpr•tation statistique
P  5% : non significatif
0,1 % < P < 1 % : tr†s significatif
3.3.4
F
calcul‚
P < 0,1 % : hyper significatif
Reproductibilit€
Les valeurs obtenues pour la limite de reproductibilit•, ainsi que les valeurs
obtenues pour le test F sont donn•es dans le tableau 14.
Tableau 14 - Valeurs obtenues pour la limite de reproductibilit€
et valeurs pour le Test F
Niveau
Nombre de
r‚sultats
exploitables
(nombre de
laboratoires)
Limite de reproductibilit‚
M‚thode
M‚thode
alternative
de
r‚f‚rence d 1/40 d 1/400
F calcul‚
(ou 1/F)
d 1/40
d 1/400
P%
F critique
(0,05 ; n - 1; n - 1)
d 1/40
d 1/400
1
n = 12
0,274
0,500
/
3,34
/
2,82
3
/
2
n = 12
0,183
0,392
0,550
4,57
9,01
2,82
1
0
3
n = 12
0,157
0,445
0,308
8,07
3,87
2,82
0
2
Interpr•tation statistique
P  5% : non significatif
0,1 % < P < 1 % : tr†s significatif
‚
P < 0,1 % : hyper significatif
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
Les rapports limite de reproductibilit• / limite de r•p•tabilit• sont donn•s dans
le tableau 15.
Tableau 15 - Rapports limite de reproductibilit€ /
limite de r€p€tabilit€
Niveau
Nombre de
r‚sultats exploitables
(nombre de laboratoires)
Limite de reproductibilit‚ / limite de r‚p‚tabilit‚
M‚thode alternative
M‚thode de r‚f‚rence
d 1/40
d 1/400
1
n = 12
1,213
1,091
/
2
n =12
1,141
1,412
1,481
3
n =12
1,087
1,398
1,106
Niveau critique : reproductibilit• / r•p•tabilit• : < 2
3.3.5
Dispersion entre les laboratoires
Nombre de
r‚sultats exploitables
(nombre de laboratoires)
M‚thode
de r‚f‚rence
F ou 1/F*
1
n =12
2
3
Niveau
M‚thode alternative
F ou 1/F
F crititque
(0,05 ; n - 1 ; n)
d 1/40
d 1/400
1,942
1,382
/
2,79
n =12
1,602
2,990
1,602
2,79
n =12
1,363
2,907
1,447
2,79
Niveau critique : F ou 1/F < F (critique)
3.4
Discussion
Il est „ noter qu’un seul lot de milieu VRBL prŒt „ l’emploi, fourni par la
Soci•t• BIOMERIEUX a •t• utilis• pour la r•alisation de la m•thode de
r•f•rence par les laboratoires collaborateurs, •vitant ainsi d’introduire toute
variabilit• li•e au milieu utilis• dans la m•thode de r•f•rence.
Le biais obtenu entre la m•thode TEMPO… TC et la m•thode ISO 4832 est
non significatif pour le niveau 1 avec la dilution 1/40 et pour le niveau 3 avec
la dilution 1/400. Un biais significatif est observ• pour le niveau 2 avec les
deux dilutions et pour le niveau 3 pour la dilution 1/40. Cependant, les •carts
observ•s entre les deux m•thodes sont faibles, •tant compris entre -0,16 et
+0,16 Log UFC/g. Les valeurs observ•es lors de l’•tude pr•liminaire variaient
de -0,368 Log UFC/g et 0,015 Log UFC/g.
‚
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
Les tests statistiques indiquent une diff•rence entre les limites de
r€p€tabilit€ et de reproductibilit€ des deux m•thodes. L’annexe 6
r•pertorie des limites de r•p•tabilit• et de reproductibilit• calcul•es au cours
de diff•rentes •tudes collaboratives pour les m•thodes de r•f•rence. Ainsi,
selon le niveau de contamination et le type de matrice, les valeurs observ•es
pour la m•thode ISO 4832 varient de :
- 0,117 et 0,352 pour les limites de r•p•tabilit•,
- 0,157 et 0,951 pour les limites de Reproductibilit•.
En fonction du taux de contamination et de la dilution r•alis•e, la m•thode
alternative TEMPO‚ TC montre :
- des limites de r•p•tabilit• comprises entre 0,277 et 0,371
- des limites de Reproductibilit• comprises entre 0,308 et 0,550.
Les valeurs obtenues pour la m•thode de r•f•rence au cours de cette •tude
sont particuli†rement satisfaisantes ; les valeurs de la m•thode alternative
TEMPO… TC sont similaires aux valeurs habituellement observ•es pour la
m•thode ISO 4832.
Les rapports limite de reproductibilit€ / limite de r€p€tabilit€ observ•s
pour la m•thode TEMPO… TC et la m•thode de r•f•rence sont comparables
entre les laboratoires.
La dispersion entre les laboratoires est d’ordre similaire entre les deux
m•thodes :
- au niveau 1,
- aux niveaux 2 et 3, avec la dilution 1/400 lors de la r•alisation de la
m•thode TEMPO… TC.
La dilution 1/40 g•n†re une dispersion entre laboratoires, sup•rieure „ celle
de la m•thode de r•f•rence aux niveaux 2 et 3. Il est „ noter que cette
dilution ne repr•sente pas la dilution usuellement utilis•e pour ces niveaux
de contamination.
‚
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
4
CONCLUSION
Les conclusions de l’€tude comparative sont les suivantes :

La m€thode TEMPO‚ TC montre une lin€arit€ et une exactitude
relative satisfaisantes. Certains €carts de d€nombrements sont
observ€s entre les deux m€thodes, plus particuli„rement dans la
cat€gorie v€g€taux. Vingt produits v€g€taux suppl€mentaires ont €t€
analys€s, par la m€thode TEMPO‚ TC et par la m€thode de r€f€rence
NF EN ISO 4832, avec deux marques de milieu VRBL. Lors de la
comparaison des donn€es avec les d€nombrements issus de la
m€thode TEMPO‚ TC, les r€sultats montrent l’h€t€rog€n€it€ de la
flore d€nombr€e entre deux milieux diff€rents utilis€s dans une
m†me m€thode de r€f€rence. Alors, selon le cas, le d€nombrement
par la m€thode TEMPO‚ TC est davantage similaire ‡ celui obtenu
par l’un ou l’autre des milieux VRBL test€s. Les identifications
men€es ‡ partir de colonies sur milieu VRBL indiqueraient de
meilleures s€lectivit€ et sp€cificit€ de la m€thode TEMPO‚ TC en
comparaison ‡ celles de la m€thode de r€f€rence, m€thode de
r€f€rence dont les caract€ristiques de sp€cificit€ et s€lectivit€
d€pendraient de la marque de milieu utilis€.
Les limites de r€p€tabilit€ de la m€thode alternative sont
sup€rieures ‡ celle de la m€thode de r€f€rence, mais montrent des
valeurs satisfaisantes.

Les biais entre les deux m€thodes sont faibles, compris entre
-0,368 Log UFC/g et 0,015 Log UFC/g.

La m€thode TEMPO‚ TC montre une s€lectivit€ et sp€cificit€
satisfaisantes

L’int€r†t majeur de la m€thode TEMPO‚ TC r€side :
-
dans le gain de temps important au niveau de l’analyse
et de la lecture,
dans le gain de place ‡ l’incubation des cartes TEMPO‚ TC
et la gestion facilit€e des d€chets,
dans la traˆabilit€ compl„te de l’analyse.
‚
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
Les conclusions de l’€tude interlaboratoire sont les suivantes :
Les biais observ€s entre les deux m€thodes montrent des valeurs
faibles.
Les limites de r€p€tabilit€ et de Reproductibilit€ de la m€thode
TEMPO‚ TC sont comparables ‡ celles g€n€ralement observ€es
pour la m€thode de r€f€rence ISO 4832.
La dispersion des r€sultats entre laboratoires est similaire entre les
deux m€thodes, pour les dilutions g€n€ralement appliqu€es au
d€nombrement des coliformes totaux par la m€thode TEMPO‚ TC.
‚
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
Annexe 1 - Notice d’utilisation de la m€thode alternative
‚
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BIOMERIEUX
‚
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BIOMERIEUX
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BIOMERIEUX
‚
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BIOMERIEUX
Annexe 2 - M€thode de r€f€rence
Suspension m†re (produit solide)
Echantillon pour essai (produit liquide)
 et dilutions d•cimales en tryptone NaCl
1 ml par bo•te

Ajout de 15 ml de milieu s•lectif solide : g•lose lactos•e bili•e au cristal violet
et au rouge neutre VRBL

Solidification

Ajout de 4 ml de VRBL (double couche)

Incubation 24 h  2 h „ 30‚C  1

Comptage des colonies caract•ristiques
(violac•es, d'un diam†tre de 0,5 mm ou plus,
parfois entour•es d'une zone rougeˆtre)
‚
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BIOMERIEUX
Annexe 3 - Etude de lin€arit€
Graphiques bi-dimensionnels : analyse avec dilutions combin€es
Barres pour chien
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
log(M€thode alternative)
Steak hach€
6,00
5,00
4,00
3,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
log(M€thode de r€f€rence)
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
Cr„me patissi„re
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
4,00
Concombres
6,00
5,00
4,00
3,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
3,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0,00
9,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Filet de cabillaud
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
‚
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BIOMERIEUX
Graphiques bi-dimensionnels : analyse avec dilutions les plus usuelles
Barres pour chien
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
Steak hach€
5,00
4,00
3,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
Cr„me patissi„re
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
4,00
Concombres
6,00
5,00
4,00
3,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
3,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Filet de cabillaud
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
‚
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
Droites de r€gression : dilutions combin€es
Barre pour chien - R€gression OLS 1
Concom bres - R€gression GMFR
6,00
6,00
y = 1,2193x - 0,7233
y = 1,0532x - 0,172
5,00
5,00
4,00
4,00
3,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0,00
6,00
1,00
2,00
4,00
5,00
6,00
Filet de cabillaud - R€gression OLS 1
Cr„m e patissi„re - R€gression OLS 1
6,00
6,00
y = 1,1318x - 0,5623
y =1,0706x - 0,1333
5,00
5,00
4,00
4,00
3,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
3,00
R€f €r e n c e
R€f €r e n c e
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0,00
6,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
R€f €r e n c e
R€f €r e n c e
Steak hach€ - R€gression OLS 1
6,00
y = 0,9803x + 0,0719
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
R€f €re nc e
‚
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
Droites de r€gression : dilutions usuelles
Barre pour chien - R€gression OLS 1
Concom bres - R€gression OLS 1
6,00
6,00
y =1,1336x - 0,4879
y =1,1746x - 0,6388
5,00
5,00
4,00
4,00
3,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0,00
6,00
0,00
1,00
2,00
R€f €r e n c e
3,00
4,00
5,00
6,00
R€f €re nc e
Cr„m e patissi„re - R€gression OLS 1
Flet de cabillaud - R€gression OLS 1
6,00
6,00
y =1,0302x - 0,0568
5,00
y =1,1449x - 0,5753
5,00
4,00
4,00
3,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0,00
6,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
R€f €re nc e
R€f €re nc e
Steak hach€ - R€gression OLS 1
6,00
y = 0,9099x + 0,254
Alternative
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
R€f€rence
‚
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
Annexe 4 - Exactitude relative
Graphiques bidimensionnels
Produits alimentation animale
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
Produits carn€s
5,00
4,00
3,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
Produits laitiers
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
4,00
5,00
4,00
3,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
3,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Produits de la mer
Tous produits
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
6,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00
‚
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
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4 aoƒt 2008
BIOMERIEUX
Droites de r€gression pour chacune des matrices et pour l’ensemble des
matrices
Produits carn€s - R€gression OLS 1
Produits d'alimentation animale R€gression OLS 1
6,00
6,00
y = 0,9597x + 0,0405
5,00
5,00
4,00
4,00
Alternative
Alternative
y = 0,8638x - 0,0347
3,00
2,00
1,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0,00
0,00
6,00
1,00
3,00
4,00
5,00
6,00
R€f€rence
Produits v€g€taux - R€gression OLS 1
Produits laitiers - R€gression GMFR
6,00
6,00
y = 0,6109x + 0,9972
y = 1,0522x - 0,1655
5,00
5,00
4,00
4,00
Alternative
Alternative
2,00
R€f€rence
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
3,00
2,00
1,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0,00
1,00
R€f€rence
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
R€f€rence
Produits de la mer - R€gression GMFR
y = 1,0608x - 0,555
Tous produits - R€gression OLS 1
6,00
6,00
5,00
5,00
4,00
4,00
Alternative
Alternative
y = 0,8551x + 0,1842
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
3,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0,00
6,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
R€f€rence
R€f€rence
1,00
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BIOMERIEUX
Annexe 5 - Exactitude relative :
Compl€ment d’€tude ‰ Produits v€g€taux Š
(dates d’analyse : 12 et 20 octobre 2005)
Droites de r€gression pour la cat€gorie ‰ Produits V€g€taux Š
8,00
y = 0,9402x - 0,0223
6,00
4,00
2,00
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
R€f €r e n c e
TEM PO‚ TC / VRBLA (32 €chantillons)
8,00
y = 0,814x + 0,3744
6,00
4,00
2,00
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
R€f €r e n c e
TEMPO‚ TC / VRBL B (22 €chantillons)
Produits v€g€taux - R€gression GMFR
8,000
y = 1,0675x - 0,63
6,000
4,000
2,000
0,000
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
R€f € r e n c e
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4 aoƒt 2008

Validation de la méthode TEMPO® TC pour le dénombrement des

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