Test inter-laboratoires du LNR-OGM belge au sujet du système

Test inter-laboratoires du LNR-OGM belge
au sujet du système CoSYPS (combinatory
sybr®green pcr screening)
Nina Papazova, Sylvia Broeders, Nancy Roosens
Institut Scientifique de santé Publique (WIV-ISP), Plateforme Biotechnologie et Biologie moléculaire (PBB), rue J.
Wytsman 14, 1050 Bruxelles, Belgique
Eric Janssen, Gilbert Berben
Centre wallon de Recherches agronomiques (CRA-W), Unité Authentification et traçabilité, bâtiment Henseval, 24
Chaussée de Namur, 5030 Gembloux, Belgique
Isabel Taverniers, Marc De Loose
Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO), Eenheid Technologie & Voeding (T&V), Burg. Van Gansberghelaan 115, 9820 Merelbeke, Belgique
Ronny Martens, Ingrid De Vuyssere
Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaine Alimentaire (AFSCA), FLVVM, Brusselsesteenweg 370A, 9090 Melle,
Belgique
Introduction
L’analyse en routine de détection des organismes génétiquement modifiés (OGM) par qPCR (‘polymerase chain
reaction’ en temps réel) est un processus comprenant plusieurs étapes. Elle démarre par le criblage des échantillons, étape consistant en la recherche d’éléments génétiques communs tels que des promoteurs, terminateurs,
régions codantes ou autres séquences qui se retrouvent dans différents OGM. Le but est de réduire le spectre des
candidats à identifier lors d’une seconde étape via une méthode spécifique à l’événement OGM. Vu le nombre
sans cesse croissant de nouveaux événements transgéniques (1), il est indispensable de mettre en œuvre des
méthodes de criblage sensibles avec un bon rapport coût-efficience.
A cet effet, une série de méthodes de criblage d’OGM par qPCR dans le format SYBR®Green a été développée à
l’Institut Scientifique de Santé Publique (WIV-ISP). Ce set comprend les méthodes suivantes: 1/ quatre méthodes
spécifiques à des traits (CP4-EPSPS, CryIAb/Ac, pat, bar) (2); 2/ deux méthodes de détection d’éléments fréquemment employés dans les constructions transgéniques (p35S et tNOS) (3); 3/ trois méthodes spécifiques aux taxons
ciblant la lectine de soja (lec) , l’alcool déshydrogénase de maïs (adh) et la cruciférine (cru) du colza de façon à
déceler ces espèces végétales dans l’échantillon. En outre, une méthode permettant la détection d’un marqueur
universel de plantes est repris dans le set. Ce marqueur développé initialement au CRA-W (5) se fonde sur une
séquence d’un gène chloroplastique (rbcL). Enfin, un marqueur spécifique à la transcriptase inverse (CRT2) du virus
de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) a également été intégré. Ce dernier permet de vérifier qu’un signal positif
pour le marqueur p35S ne provient pas de son donneur naturel, le CaMV.
La combinaison de ces méthodes qPCR assure un criblage efficace pour déceler d’éventuels OGM en un seul «
run ». L’interprétation des résultats obtenus pour chacun des tests se fait par un système d’aide à la décision (SAD)
mis au point à l’ISP. Il recourt à un algorithme employant des nombres premiers pour déterminer quels éventuels
OGM sont susceptibles de se retrouver dans l’échantillon. Cette approche matricielle de recherche des OGM végétaux est dénommée « Combinatory SYBR®Green PCR Screening » ou « CoSYPS » (6).
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Le système CoSYPS a été validé par une étude collaborative à laquelle 13 laboratoires officiels de l’UE ont participé. Dans ce qui suit nous décrivons la conception de cette étude inter-laboratoires à petite échelle organisée en
2010 par le Laboratoire National de Référence Belge pour les Organismes Génétiquement Modifiés (LNR-OGM)
ainsi que les résultats auxquels cela a abouti.
But du test interlaboratoire belge CoSYPS
Le but était d’évaluer l’applicabilité et la praticabilité du système CoSYPS au sein du LNR-OGM belge. Dans cette
perspective, des problèmes mis en évidence lors d’un test circulaire antérieur lui aussi organisé au niveau européen (7) ont été éliminés ou largement atténués: 1/ tous les participants ont reçu une formation théorique et
pratique avant la mise en œuvre de l’essai; 2/ les échantillons ont été produits selon le Guide ISO 43 par le Laboratoire de Référence de l’Union Européenne sur les OGM (EU-RL GMFF ; 8). La réalisation du test était couplée au test
comparatif ILC-CRL-GMFF-CT02/10 organisé par l’EU-RL GMFF en septembre 2010.
Echantillons du test et analyse qPCR
Deux farines de maïs à des teneurs différentes en maïs transgéniques de l’événement MON 810 (0,8% et 3,8% en
fraction massique) ont été utilisées. Par échantillon, trois extractions d’ADN ont été réalisées au moyen d’un protocole propre à chaque laboratoire participant à l’étude. Seuls deux de ces extraits ont subi le reste de l’analyse.
Un seul ‘run’ de qPCR a permis de traiter dans chacun des laboratoires participant les deux échantillons et de les
soumettre aux 11 tests qPCR en format SYBR®Green. Selon des conditions préalablement décrites (2). Les thermocycleurs employés étaient ceux disponibles dans les laboratoires participants.
Cinq laboratoires ont participé à cet exercice. Etaient mis à la disposition des participants: le protocole CoSYPS
complet, les amorces, les témoins positifs, le master Mix universel en SYBR®Green ainsi que le SAD CoSYPS en
usage en routine à l’ISP au moment de l’étude (6).
Analyse des données
L’évaluation des résultats s’est faite par teneur en OGM (n=2), par méthode qPCR (n=11) et par événement transgénique (n=1). Vingt résultats étaient générés au total par marqueur (2 teneurs x 2 extraits x 5 laboratoires). Des
données brutes de la qPCR, deux paramètres ont été encodés dans le SAD CoSYPS: le Ct et le Tm. Un extrait est
considéré comme positif pour le marqueur testé si la valeur du Ct n’excède pas 35 et pour autant que sa température de dissociation se situe dans l’intervalle défini par le Tm du témoin positif à 1°C près. Cet intervalle a été
étendu à 2°C pour le test Cry1Ab/Ac de façon à pouvoir couvrir les deux différentes séquences de cette cible dans
les constructions transgéniques.
Les résultats des laboratoires participants ont été comparés aux résultats attendus en terme de présence/ absence pour un marqueur spécifique. La sensibilité, la spécificité ainsi que les taux en résultats faux positifs ou faux
négatifs ont été calculés pour toutes les méthodes et tous les échantillons avec en parallèle les valeurs prédictives
positives ou négatives (http://www.cebm.net/index.aspx?o=1042).
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Résultats
Quatre des marqueurs envisagés (rbcL, adh, p35S et CryIAb/Ac) devaient ne fournir que des résultats positifs dans
les deux échantillons. Toutefois, les résultats ont montré qu’un résultat sur 20 s’est avéré négatif pour les marqueurs p35S et Cry1Ab /Ac (Tableau 1). Une réponse négative était attendue pour les autres marqueurs. Néanmoins, un résultat faux positif a été constaté pour le marqueur pat (Tableau 1).
La sensibilité des marqueurs positifs était de 100% pour rbcL et adh. Elle était moindre pour p35S et Cry1Ab/Ac, soit
respectivement 95% et 94.7% (Tableau 1). La spécificité des marqueurs négatifs était de 100% sauf pour pat (95%,
Tableau 1).
Tableau 1. Résultats du test inter-laboratoires. Les marqueurs pour lesquels une réponse positive est attendue sont repris
en vert tandis que ceux pour lesquels la réponse attendue est négative sont en rouge.
Cry1Ab /
Ac
pat
bar
CRT2
rbcL
lec
adh
cru
p35S
tNOS
CP4EPSPS
# résultats positifs
20
0
20
0
19
0
0
18
1
0
0
# résultats négatifs
0
20
0
20
1
20
20
1
19
20
20
95
100
100
Sensibilité (%)
100
100
Specificité (%)
100
95
100
94.7
100
100
Au cours de ce test inter-laboratoires, la sensibilité et la spécificité sur l’ensemble ont très bien donné (99%). Les
valeurs prédictives positives et négatives atteignent des valeurs élevées de respectivement 97 et 99% (Tableau 2)
avec des taux de résultats faux positifs et faux négatifs bas (<5%).
Tableau 2. Données de sensibilité et de spécificité sur l’ensemble et valeurs prédictives positive et négative
Positifs mesurés
Négatifs mesurés
Positifs attendus
77
2
97%
Valeur prédictive positive
Négatifs attendus
1
139
99%
Valeur predictive négative
99%
99%
sensibilité
spécificité
Conclusions
De manière générale, les résultats obtenus lors du test inter-laboratoire LNR-OGM démontrent que les méthodes
qPCR en format SYBR®Green ont permis une détection correcte des marqueurs présents dans les deux échantillons: le marqueur spécifique au maïs, les marqueurs de constructions transgéniques (p35S et Cry1Ab/Ac) ainsi que
le marqueur universelle plante (rbcL). Il faut en conclure que le SAD CoSYPS est applicable pour le criblage des
OGM dans de tels échantillons.
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Par ailleurs, tous les laboratoires participants ont pu effectuer le côté expérimental du protocole qPCR sans aucun
problème. En outre, il était possible d’analyser tous les échantillons et tous les marqueurs en un seul « run ».
D’autre part, aucun besoin spécifique n’est nécessaire concernant l’infrastructure et les instruments qPCR puisque
chaque laboratoire a pu utiliser son propre instrument. Ceci démontre la praticabilité des méthodes SYBR®Green
utilisées et la configuration combinée comme appliqué dans le système CoSYPS. Il est toutefois utile de fournir
une courte formation théorique aux futurs utilisateurs concernant le fonctionnement du SAD et comment s’en
servir.
Prenant en compte à la fois les résultats de l’étude de validation européenne (7) et de l’étude interlaboratoires du
LNR-OGM présentée ici, il peut être affirmé que le SAD CoSYPS est un outil fiable et efficace dans le criblage des
OGM dans les denrées alimentaires et en alimentation animale.
Perspectives
Les méthodes SYBR®Green ont entre-temps été complètement validées (7). Elles seront dès lors reprises dans
la banque de données européenne des méthodes de référence pour l’analyse des OGM (9) (http://gmo-crl.jrc.
ec.europa.eu/gmomethods/). Enfin signalons que l’approche de criblage des OGM présentée peut toujours être
étendue à de nouvelles méthodes (10) de façon à accroître la couverture et le pouvoir discriminant du SAD.
Références
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
James (2013). Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2013. ISAAA: Brief 46.
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Ready®, LibertyLink®and CryIAb traits in genetically modified products. Eur Food Res Technol 234:13–23.
Barbau-Piednoir et al. (2010). SYBR®Green qPCR screening methods for the presence of ‘‘35S promoter’’ and
‘‘NOS terminator’’ elements in food and feed products. Eur Food Res Technol 230:383–393.
Mbongolo Mbella et al. (2011). SYBR®Green qPCR methods for detection of endogenous reference genes in
commodity crops: a step ahead in combinatory screening of genetically modified crops in food and feed
products. Eur Food Res Technol 232:485-496.
Debode et al. (2012). DNA Detection by Conventional and Real-Time PCR After Extraction from Vegetable
Oils. J AOCS 89 (7), 1249-1257.
Van den Bulcke et al. (2010). A theoretical introduction to “Combinatory SYBR®Green qPCR Screening”, a
matrix-based approach for the detection of materials derived from genetically modified plants. Anal Bioanal
Chem 396:2113–2123.
Barbau-Piednoir et al. (2014). Inter-laboratory Testing of GMO Detection by Combinatory SYBR®Green PCR
Screening (CoSYPS). Food Anal Methods, DOI 10.1007/s12161-014-9837-3
Charels et al. (2010). Comparative Testing Report on the Detection and Quantification of Maize Event MON
810. EUR 25028 EN – 2011.
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J AOAC Int 95 (6): 1713 – 1719.
Broeders et al. (2013). New SYBR®Green methods targeting promoter sequences used for screening of
several GM events pending for authorisation in Europe. Eur Food Res Technol 236:537–547.
[email protected]
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