janvier 2008b

Master 1 BFA Parcours Biochimie - Janvier 2008
Sujet de : Hélène Dauchel.
Durée : 1h
Analyse du transcriptome abdominal d'Anopheles gambiae
Le moustique Anopheles gambiae est le premier vecteur de transmission de la malaria (ou paludisme) à l'homme. L'hématophagie est
indispensable à la femelle du moustique pour la production des oeufs. Le « repas sanguin » conduit en effet à des changements importants de
l'expression des gènes dans plusieurs organes de la femelle dont l'abdomen et les ovaires. Une infection concomittante de la femelle lors du repas
sanguin par le parasite Plasmodium, protozoaire unicellulaire parasite agent de la malaria, modifierait fortement ce système de régulation et la
production des oeufs.
Afin de mieux comprendre ces réponses physiologiques (de digestion et de vitellogenèse) et physiopathologiques (d'infection) de la femelle
moustique, des chercheurs* se sont interessés à l'expression différentielle des gènes dans l'abdomen de la moustique femelle après «un
repas sanguin» ou après une infection par Plasmodium berghei, un protozoaire unicellulaire parasite agent de la malaria chez les rongeurs
(modèle de l'agent de la malaria Plasmodium falciparum chez l'homme). Cet inventaire des gènes exprimés au cours de la digestion du sang, de la
vittelogenèse et de l'infection par Plasmodimum est réalisé au travers d'une approche expérimentale de séquençage et de l'analyse d'EST .
*BMC Genomics 2006, 7:119
Question 1 : obtention et séquençage des EST
Three unidirectionally cloned cDNA libraries were constructed from mRNA
isolated from abdomens of A. gambiae females that had been fed on 20%
sucrose (repas de sucrose , S library), on rat blood (repas sanguin sur un
rat sain, RB), or on rat blood infected with Plasmodium berghei (repas
sanguin sur un rat infecté , IRB). cDNA clones were picked at random from
the S, RB and IRB abdomen libraries, cDNA inserts were amplified by PCR
and sequenced from their 5' ends through single-pass sequencing on an ABI
3700 Sequencer. [...] Consensus sequences (567) derived from the
alignment of multiple ESTs were defined as contigs, whereas ESTs that did
not assemble into a cluster were defined as singletons (1408).
Figure 1 :Transcript abundance distribution within the 567 multi-EST contigs
of the S, RB and IRB libraries. The 1408 singletons are not shown.
a. Schématisez sous forme d'organigramme ce protocole.
b. Expliquez les conséquences des termes soulignés.
c. Shématisez la notion de cluster puis décrivez et interprétez la figure 1.
d. Pourquoi les chercheurs n'ont-ils pas normalisé les banques d'ADNc ? Reproduisez sur votre copie très succintement l'allure
générale de la figure 1 et ajoutez l'allure générale attendue en cas de normalisation.
Question 2 : annotation fonctionnelle des EST et profilage in silico
Les 1975 séquences au total (567 contig assemblés et 1408 séquences
singletons)
ont été comparés contre des bases de données avec le programme BLAST.
a. Selon la procédure assez typique avec des EST, quelles sont les trois grandes
catégories de base de données contre les quelles ces comparaisons ont été
faites ?
b. La figure 2 présente la distribution taxonomique des séquences homologues
aux EST de l'anophèle. Commentez . En particulier comment interprétez-vous
les 13% de séquences de type « unknown » ?
Figure 2 : Taxonomic distribution of all 1975 assembled
sequence homologies following BLAST searches
c. L'identification fonctionnelle des produits des gènes présents dans les 3 banques d'abdomens a été réalisée par le report des
annotations de la « Gene Ontology » des séquences homologues. Elle a mis en évidence une régulation particulière de gènes
appartenant à trois catégories fonctionnelles en particulier, impliquées dans les processus de digestion, de production d'oeufs et
de réponse à une infection parasitaire.
Le tableau ci-contre présente un extrait du comptage du
nombre d'ESTs pour 8 gènes dans les trois banques d'EST.
Analysez et proposez une interprétation de ce profilage in
silico.
Séquences impliquée dans la vitellogenèse : 996, 447, 24 et 230
Séquence impliquée dans la digestion : 99 et 28
Séquences impliquées dans le processus de réponse à une infection
parasitaire: 475 (mucine, protéine membranaire protectrice de la barrière
épithélial du système digestif), 145 (agent de la réponse immunitaire
inflammatoire chez les vertébrés).
Question 3 : profilage d'expression par qRT-PCR
a. Parmi les 8 gènes précédents, l'expression des 5 d'entre eux a été étudiée par qRT-PCR dans les trois mêmes conditions
expérimentales S, RS et IRB. Quel est l'objectif de ce type d'expérience ?
b. Que pouvez vous déduire de ces résultats ? (Mettez les en relation avec la réponse à la question 2c. )
analyFigure 3 : qRT-PCR of selected genes identified as differentially expressed in A. gambiae abdomens by in silico profiling
Question 4 : Concluez sur l'effet de l'infection de l'anophèle par l'agent de la malaria sur la digestion après «un repas sanguin»
et la production d'oeufs.