3 Enzymaktivierung, Pathogenabwehr

1
Enzymaktivierung und Pathogenabwehr
Praktikumsabschnitt
zum Modul
Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen
WS 09/10
Versuch 1: Reduktive Aktivierung von NADP-MDH
2
Einleitung
2
Material
6
Durchführung
7
1.1 Herstellung eines Rohextrakts aus Blattmaterial
7
1.2 Bestimmung des Chlorophyllgehalts
9
1.3 Aktivierung und Aktivitätsbestimmung der NADP-MDH
9
Versuch 2: Abwehrreaktionen von Petersilie-Kulturzellen
12
Einleitung
12
Material
15
Versuch 2A: Induktion von PAL und Furanocumarinen
17
2A.1 Behandlung der Zellkulturen mit Elicitoren
17
2A.2 Kontrolle der Phytoalexinbildung
18
2A.3 Kontrolle der Vitalität der Kulturzellen
19
2A.4 Ernte der Kulturzellen und –medien
19
2A.5 Extraktion der Kulturzellen
20
2A.6 Extraktion und Aufkonzentrierung der Kulturmedien
21
2A.7 Analyse der Kulturextrakte
22
Versuch 2B: Induktion eines „oxidativen Bursts“
25
2B.1 Vorbereitung der Kulturzellen
25
2B.2 Elicitorbehandlung und ROS-Bestimmung
26
2
Versuch 1
Reduktive Aktivierung von NADP-abhängiger
Malatdehydrogenase aus Blättern
Einleitung
Licht ist die treibende Kraft der Photosynthese, in der anorganischer Kohlenstoff
(CO2) fixiert und zu Kohlenhydrat reduziert wird. Das Licht regt den photosynthetischen Elektronentransport an, der Reduktionsäquivalente (als NADPH) und
chemische Energie (als ATP) für die Reduktion des fixierten Kohlenstoffs liefert. Die
Reaktionen der CO2-Fixierung und der Reduktion und Weiterverarbeitung des
Fixierungsprodukts im Calvin-Zyklus werden durch eine Reihe von Enzymen
katalysiert, von denen einige irreversible Reaktionen ausführen (Abb. 1.1). Es ist
offensichtlich, dass diese Enzyme während der Lichtperiode aktiv sein müssen, um
den Ablauf des Calvin-Zyklus zu ermöglichen.
Abb. 1.1. Calvinzyklus mit den Enzymen, die irreversible Reaktionen katalysieren. Nach
Heldt (2003) Pflanzenbiochemie, 3. Auflage, S. 190.
Ein Weiterlaufen des Calvinzyklus im Dunkeln ist nicht notwendig. Hinzu kommt,
dass im Dunkeln der oxidative Pentosephosphatweg (OPP-Weg) abläuft, der einige
der Enzyme des Calvinzyklus auch verwendet (Abb. 1.2). Der OPP-Weg oxidiert und
decarboxyliert Fructose-6-P und Glucose-6-P, um NADPH zu gewinnen und Ribose5-P für die Nukleotidbiosynthese bereitzustellen. Diese Aktivitäten sind im Dunkeln
durchaus sinnvoll, aber im Licht würden sie die Kohlenhydratprodukte des Calvin-
3
zyklus zu einer Zeit wieder abbauen, wenn Reduktionskraft und Ribose-5-P ohnehin
keine Mangelware sind. Das gleichzeitige Ablaufen des Calvinzyklus und des OPP
wurde zu einem sinnlosen, ATP-verbrauchenden Zyklus führen.
Abb. 1.2. Der oxidative
Pentosephosphatweg
(OPP) in Relation zum
Calvinzyklus mit seinem
Schlüsselenzym Glucose6-P-Dehydrogenase und
mit Andeutung seiner
verwertbaren Reduktionsund Baustoff-Produkte.
Um dies zu vermeiden, wird dafür gesorgt, dass Schlüsselenzyme des Calvinzyklus
(Abb. 1.1) nur im Licht aktiv sind, während das Schlüsselenzym des OPP-Wegs
(Abb. 1.2) nur im Dunkeln aktiv ist. Somit läuft der Calvinzyklus nur im Licht ab,
während der OPP-Weg nur im Dunkeln aktiv ist. Dies wird dadurch erreicht, dass das
positive Redoxpotential des photosynthetischen Elektronentransports im Licht auf
aktivitätsbestimmende Disulfidbrücken der Schlüsselenzyme übertragen wird. Wenn
diese Disulfidbrücken zu zwei benachbarten SH-Gruppen reduziert werden, werden
die sonst inaktiven Calvinzyklusenzyme aktiv, und das sonst aktive Schlüsselenzym
des OPP-Wegs inaktiv. Diese Reduktionskraft stammt von der PSI-Seite des
photosynthetischen Elektronentransports: die Elektronen von Ferredoxin werden
nicht nur auf NADP geleitet, sondern auch auf Thioredoxine, kleine Moleküle, die
selbst reduzierbare Disulfidbrücken aufweisen. Die reduzierten Thioredoxinmoleküle
(nun mit zwei –SH-Gruppen) können dann die regulatorischen Disulfidbrücken der
Schlüsselenzyme des Calvinzyklus und des OPP-Wegs reduzieren (Abb. 1.3).
Ein weiteres chloroplastidäres Enzym, das durch Disulfidreduktion durch reduziertes
Thioredoxin und somit durch Licht aktiviert wird, ist die NADP-abhängige MalatDehydrogenase (NADP-MDH). Dieses Enzym ist Komponente eines shuttleSystems, das dazu dient, überschüssige Reduktionskraft aus belichteten Chloroplasten ins Cytosol für den Metabolismus dort zu exportieren. Es kann bei höherer
Lichteinstrahlung leicht dazu kommen, dass NADP schneller durch den photosynthetischen Elektronenfluss reduziert wird, als er durch NADPH-Verbrauch wieder
hergestellt werden kann. Bei dem limitierten Pool an NADP im Chloroplastenstroma
ist dann die reduzierte Form der Verbindung im Überschuss, und NADP steht nicht
mehr in ausreichendem Masse als Endakzeptor für den photosynthetischen
Elektronentransport zur Verfügung. Dies führt zur Überreduktion der Transportkette
und zur Gefahr von damit in Zusammenhang stehenden oxidativen Schäden.
4
Fd
FTR
FNR
Td
Ferredoxin
Ferredoxin-ThioredoxinTransferase
Ferredoxin-NADP-Reduktase
Thioredoxin
Durch den photosynthetischen Elektronenfluß werden regulatorische Disulfidbrücken
(S-S; Cystine) in Thiole (-SH; Cysteine)
überführt. Durch Sauerstoff werden diese
Thiole wieder reoxidiert.
Abb. 1.3. Die Übertragung von Elektronen aus dem photosynthetischen Elektronentransport
auf NADP oder auf Enzyme mittels Thioredoxin. Nach einer Darstellung von Prof. Dr.
R.Scheibe, Osnabrück.
Die redoxmodulierte, chloroplastidäre NADP-abhängige Malatdehydrogenase kann
jedoch (ohne ATP-Verbrauch) Oxalacetat unter NADPH-Verbrauch zu Malat
reduzieren und verschiebt dadurch das NADPH:NADP-Verhältnis zugunsten von
NADP, so dass der photosynthetische Elektronentransport wieder fließen kann. Das
gebildete Malat wird über den Malattranslokator der inneren Chloroplastenmembran
im Gegentausch mit Oxalacetat ins Cytosol exportiert. Das Zusammenwirken von
redoxmodulierter NADP-Malatdehydrogenase und Malattranslokator bezeichnet man
als "Malat-Ventil" (Abb. 1.4).
Die reduktive Aktivierung der NADP-MDH ist stark vom NADP/NADPH-Verhältnis im
Chloroplasten abhängig, d.h. NADP hemmt die reduktive Aktivierung. Im Licht wird
NADP-MDH also nur dann in größerem Ausmaß aktiviert, wenn z.B. durch Mangel an
Elektronenakzeptoren (CO2) oder an ATP ein Anstau von NADPH2 vorliegt (d.h.
wenig NADP). Durch Malatbildung (NADPH2-Verbrauch) kann diese Überreduktion
beseitigt werden (Malat-Ventil). Die Reduktionsäquivalente können in anderen
Zellkompartimenten verwendet werden.
Die NADP-MDH hat zwei Disulfidbrücken, die zur Aktivierung des Enzyms reduziert
werden müssen: eine am N-terminalen, die andere am C-terminalen Ende. Versuche
mit limitierter Proteolyse haben gezeigt, dass beide dieser Gruppen an der
Regulation der Aktivität beteiligt sind (Abb. 1.5).
5
Abb. 1.4. Das Malatventil in belichteten
Chloroplasten. Überschüssige Elektronen
werden zur Malatsynthese verwendet. Das
gebildete Malat wird ins Cytosol
exportiert und kann dort metabolisiert
werden. Nach einer Darstellung von Prof.
Dr. R. Scheibe, Osnabrück.
Abb. 1.5. Die zwei regulatorischen Disulfidbrücken der NADP-MDH sind an den N- und Cterminalen Enden des Enzyms. Aus Heldt (2003) Pflanzenbiochemie, 3. Auflage, S. 196, bzw.
nach Darstellungen von Prof. Dr. R. Scheibe, Osnabrück.
6
In dieser Praktikumsaufgabe soll die reduktive Aktivierung der NADP-MDH anhand
Dithiol (Dithiothreitol: DTT; stellvertretende für reduziertes Thioredoxin) demonstriert
werden.
Material
Pflanzenmaterial
• Blätter von z.B. Spinat, Gerste, Arabidopsis, Senf, Gartenkresse
Geräte:
• Schere
• Waage; mit Halterung für Eppis
• Leder- und Stoff-Handschuhe
• Dewargefäße (mindestens 3)
• Reibschalen (6), Pistille (6), Zangen (3), lange Pinzetten (3), Styropor-Unterlage
(Küvettenschachtel-Deckel aus Styropor) (3)
• Spatel (größer, klein)
• Eppendorf-Reaktionsgefäße ("Eppis"): 1,5 und 2 ml
• Zentrifuge für Eppis
• Whirlimixer
• Spektralphotometer (3), mit Rührstäbchen
• Halbmikroküvetten
Reagenzien
• Flüssiger N2 (im Dewargefäß)
• Extraktionspuffer "XP": 0,1 M Tris/Acetat mit 5 mg MgCl2, pH 8,0
-
1,22 g Tris (MG 121,1) und 0,102 g MgCl2.6H2O (MG 203,3) in 80 ml Aqua bidest lösen
-pH auf 8,0 mit Essigsäure einstellen
auf 100 ml mit Aqua bidest auffüllen
• Methanol p.a.
• 0,5 M Bis-Tris-Propan-Puffer ("BTP"; pH 9,0)
-
7,06 Bis-Tris-Propan (MG 282,3) in 35 ml Aqua bidest lösen
-pH auf 9,0 mit HCl einstellen
auf 50 ml mit Aqua bidest auffüllen
• 5 M NaCl
-
14,61 g NaCl (MG 58,44) in 35 ml Aqua bidest lösen
auf 50 ml mit Aqua bidest auffüllen
• 1 M DTT (gestellt)
-
155 mg Dithiothreitol (DTT: MG 154,3) in 1 ml Aqua bidest lösen
∗ bei Zimmertemperatur aufbewahren, um DTT in Lösung zu halten!
∗ kann über längere Zeit eingefroren aufbewahrt werden;
• 50 mM Oxalacetat (OAA)
-
14,7 mg OAA (MG 132,1; 90-95%) in 2,0 ml 0,1 M Tris/HCl (pH 8,0) lösen
∗ frisch ansetzen, im Eis aufbewahren!
7
• 10 mM NADPH
-
17,0 mg NADPH (Na4-Salz, MG 833,4) in 2,0 ml 0,1 M Tris/HCl (pH 8,0) lösen
∗ im Eis aufbewahren
∗ kann über längere Zeit eingefroren aufbewahrt werden
• 0,5 M MgCl2
-
5,09 g MgCl2.6 H2O (MG 203,11) in 40 ml Aqua bidest lösen
- auf 50 ml mit Aqua bidest auffüllen
• 0,1 M Tris/HCl (pH 8,0)
-
-
1,22 g Tris (Trizma: MG 121,1) in 80 ml Aqua bidest lösen
pH mit HCl auf 8,0 einstellen
auf 100 ml mit Aqua bidest auffüllen
Versuch 1: Durchführung
Blätter von verschiedenen Pflanzenarten werden mit flüssigem N2 zu einem feinen
Pulver zerrieben. Aus Portionen dieses Pulvers werden Rohextrakte für Proteinuntersuchung und Chlorophyllbestimmung hergestellt. NADP-abhängige Malatdehydrogenase imProtein-Rohextrakt wird mit DTT aktiviert und die Aktivität des
reduzierten Enzyms photometrisch bestimmt. Die Aktivität wird auf den Chlorophyllgehalt der Blätter bezogen, der mit dem Chlorophyllextrakt bestimmt wird. Die
Aktivierung des Enzyms wird kinetisch verfolgt.
1.1 Herstellung eines Rohextrakts aus Blattmaterial
Extrakte, die für die Aktivierung der NADP-MDH eingesetzt werden, werden aus
frischem Blattmaterial gewonnen. Ca. 3 g Blattmaterial werden unmittelbar vor
Beginn der folgend beschriebenen Extraktionsprozedur mit einer Schere von der
Pflanze abgeschnitten und locker in etwas Alufolie eingewickelt.
1.1.1 Homogenisieren des Probenmaterials:
Im Folgenden wird die Prozedur für eine Probe von Pflanzenmaterial beschrieben.
Zum Arbeiten mit tiefgekühlten Gegenständen Schutzhandschuhe tragen!
Zur Vorbereitung:
Für jede Probe werden folgende Gegenstände in flüssigem N2 in Dewargefäßen
tiefgekühlt:
• in einem Dewargefäß wird das geerntete Pflanzenmaterial in seiner AlufolieVerpackung im flüssigen N2 tiefgekühlt
• in einem zweiten Dewargefäß werden eine kleine Reibschale und Pistill
tiefgekühlt, sowie ein größerer und einen kleinerer Spatel
• in einem dritten Dewargefäß werden 4 beschriftete∗ 2 ml-Eppis (offen!) in den
flüssigen N2 hineingeworfen und dort aufbewahrt
8
∗ Die Eppis sollen vorher entsprechend ihrem Zweck beschriftet
werden: alle mit dem Kürzel für die Pflanze (z.B. „Sp“ für „Spinat“),
sowie mit den Kürzeln für den jeweiligen Extraktionszweck: z.B. „P“
für die Extraktion von Protein, bzw. „C“ für die Extraktion von
Chlorophyll
Durchführung:
Das nun tiefgefrorene Blattmaterial wird mit flüssigem N2 zu einem feinen Pulver
zerrieben. Portionen des Pulvers werden zur Extraktion von Protein und Chlorophyll
separat ausgewogen. Zum Zerreiben des Probenmaterials:
• zunächst wird die tiefgekühlte Reibschale – mit etwas flüssigem N2 gefüllt –
dem zweiten Dewargefäß mit einer Zange entnommen und auf eine
Styroporunterlage gestellt
• das Probenmaterial wird dem ersten Dewargefäß entnommen und in den
flüssigen N2 in dem tiefgekühlten Mörser gelegt. Das Blattmaterial wird dann
mit dem tiefgekühlten Pistill zu einem feinen Pulver zerrieben
Vier Portionen des tiefgefrorenen Blattpulvers werden hintereinander in die
tiefgekühlten Eppis mit einem tiefgekühlten Spatel eingewogen. Dies soll zügig
erfolgen, um mögliches Auftauen des Probenmaterials zu vermeiden:
• das jeweilige, beschriftete Eppi wird aus dem flüssigen N2 genommen und in
einem Ständer auf einer Feinwaage aufgestellt. Nach Tarierung auf 0 g wird
das tiefgefrorene Pulver hinein gewogen (Spatel vorher in flüssigem N2
tiefkühlen!):
• zur Proteinextraktion werden zweimal ca. 0,4 g des Blattpulvers
eingewogen (Eppis P1 und P2: Gewichte notieren!)
• zur Extraktion von Chlorophyll werden zweimal ca. 0,25 g des Blattpulvers
eingewogen (Eppis C1 und C2: Gewichte notieren!)
• Gleich nach dem Einwiegen des Probematerials wird das Eppi wieder in den
flüssigen N2 in dem dritten Dewargefäß geworfen
Es empfiehlt sich, die Pulverportionen von sämtlichem Probenmaterial, das in einer
Arbeitssitzung verarbeitet werden soll, wie oben beschrieben in flüssigem N2 zu
sammeln! Die Pulverportionen können dann gemeinsam den folgend beschriebenen
Extraktionsprozeduren unterworfen werden:
1.1.2 Extraktion des Probenmaterials:
1.1.2.1 Zur Extraktion von Proteinen:
Beschreibung für eine Probe tiefgefrorenen Blattpulvers P:
• das 2 ml Eppi mit den 0,4 g tiefgefrorenen Pulvers wird aus dem flüssigen N2 mit
einer Zange oder Pinzette genommen und mit 0,4 ml Extraktionspuffer XP versetzt
und unter Mischen aufgetaut. Dann werden weitere 0,4 ml XP hinzugegeben, gut
gemischt (Whirlimixer) und das Eppi auf Eis aufbewahrt
9
• das Eppi mit dem Homogenat wird 10 min bei 14,000 U/M in der EppendorfTischzentrifuge bei 4oC zentrifugiert. Ein ml des Überstands (= Blatt-Rohextrakt)
wird in ein 1,5 ml Eppi überführt
• 0,4 ml des Rohextrakts wird in einem neuen Eppi mit 0,2 g Glycerin an der Waage
versetzt und vermischt. Dieser Glycerin-haltige Protein-Rohextrakt wird „PE/G“
(„Protein-Extrakt mit Glycerin“) genannt und wird bei -20oC gelagert (als ReserveExtrakt)
Der Rest des Rohextrakts wird einfach „PE“ genannt und wird zur MDH-Aktivitätsbestimmung auf Eis aufbewahrt
1.1.2.2 Zur Extraktion des Chlorophylls:
Beschreibung für eine Probe tiefgefrorenen Blattpulvers C:
• das 2 ml Eppi mit den 0,25 g tiefgefrorenen Pulvers wird aus dem flüssigen N2
genommen, mit 1,0 ml Methanol versetzt und unter Mischen aufgetaut. Dann
werden weitere 0,5 ml Methanol hinzugegeben und erneut gut gemischt
(Whirlimixer)
• das Eppi mit dem Homogenat wird 30 min im Eis im Dunkeln bei gelegentlichem
Mischen gehalten
• das Homogenat wird 5 Min bei 14,000 U/M in der Eppendorf-Tischzentrifuge
zentrifugiert. Der Überstand (= Chlorophyllextrakt „CE“) wird in ein 1,5 ml Eppi
überführt und bei -20oC im Gefrierschrank aufgehoben
1.2 Bestimmung des Chlorophyllgehalts
• Der Chlorophyllextrakt CE wird dem Gefrierschrank entnommen. 0,5 ml des
Extrakts werden mit 0,5 ml Methanol in einer Halbmikroküvette gemischt und einige
Minuten im Dunkeln zum Angleich an die Raumtemperatur gehalten.
• Die Extinktion des Gemisches wird bei 663 nm und 645 nm gegen Methanol im
Spektralphotometer gemessen
Der Chlorophyllgehalt der Lösung wird nach folgender Formel berechnet:
mg Chl/ml = (8,02 x E663nm + 20,2 x E645 nm)/1000
Der berechnete Chlorophyllgehalt soll auf das Frischgewicht des Blattmaterials
bezogen werden.
1.3 Aktivierung und Aktivitätsbestimmung der NADP-MDH
1.3.1 Aktivierung:
Im extrahierten Zustand ist das Enzym nicht aktiv: es muss vorher aktiviert werden.
Die Aktivierung erfolgt ziemlich rasch unter teilweise denaturierenden Bedingungen
10
(pH 9,0; 0,5 M Salz), wobei ein reduzierendes Dithiol (z.B. Dithiothreitol: DTT) die
Bildung der für die Aktivität notwendige Sulfhydrylgruppen bewirkt.
Durchführung:
• Vorpipettieren in ein 1,5 ml Eppi:
60 μl Puffer (0,5 M BTP, pH 9,0)
20 μl 5 M NaCl
20 μl 1 M DTT
• Aktivierung starten: durch Zugabe von 100 μl Rohextrakt PE (gut mischen!)
• dieser Ansatz entspricht dem Zeitpunkt "0"!
• 20 μl aliquote Teile werden diesem Inkubationsansatz nach 1, 4, 7, 10, 15 und 20
min entnommen. Diese „Aktivierungsansätze“ werden dann jeweils sofort für die
Bestimmung der Enzymaktivität - wie unten unter 1.3.2 beschrieben – getestet.
• Kontrolle ohne Aktivierung: 10 μl RE werden ohne Aktivierung getestet!
1.3.2 Aktivitätstest:
Die Malat-Dehydrogenase katalysiert die Reduktion von Oxalacetat zu Malat
(Rückreaktion!) unter Verbrauch von NADPH2, was über eine Extinktionsabnahme
bei 334 nm verfolgt werden kann.
Getestet wird in einem „Testmix“ bei pH 8,0 in Gegenwart von 1 mM Oxalacetat
(OAA), 0,2 mM NADPH2 und 10 mM MgCl2.
Der jeweilige Aktivierungsansatz wird mit einem Testmix stark verdünnt, wobei nun
günstige Bedingungen für die Enzymaktivität herrschen: das teilweise denaturierte
Enzymmolekül kann sich wieder korrekt falten und damit seine Enzymaktivität
wiedererlangen. Durch Zugabe von Aktivierungsansatz zum Testmix wird somit
gleichzeitig die Malatdehydrogenase-Reaktion gestartet .
Durchführung:
• Testmix ansetzen (Vorratsansatz: im Eis aufbewahren!)
• für 30 ml (reicht für 4 Aktivitätstests):
0,6 ml
0,6 ml
0,6 ml
28,2 ml
0,05 M OAA
0,01 M NADPH2
0,5 M MgCl2
0,1 M Tris/HCl (pH 8,0)
• ca. 10 Min. vor dem Testbeginn werden sechs 980 μl Testmixportionen in
Halbmikroküvetten pipettiert und zum Erreichen von Raumtemperatur stehen
gelassen. Kurz vor dem Testbeginn wird die erste Küvette ins Photometer gestellt
und die Basislinie der Extinktion auf einen hohen Schreiberwert eingestellt (bei 334
nm!)
• Test starten: durch Zugabe von 20 μl Aktivierungsansatz nach Ablauf der jeweiligen
Aktivierungszeit:
• die 20 μl Aktivierungsansatz in jeweils eine der 980 μl Testmixportionen (in
einer Halbmikroküvette, s.o.) hinein pipettieren
• Reaktionsgemisch mit einem Plastikspatel rasch mischen
11
• Küvette in das Photometer stellen, Basislinie evtl. einstellen
• Aktivität verfolgen bei E334 nm über mindestens 3 min.
Auswertung:
• Eine ΔE von 6,18 entspricht dem Verbrauch von 1 μmol NADPH2 in der Küvette.
Auf dieser Basis wird die Aktivität als μmol Malat gebildet pro Minute berechnet.
• Das Ergebnis soll auf Blatt-Frischgewicht und den Chlorophyllgehalt des Blattes
bezogen werden.
• Die Aktivierung des Enzyms wird als Zeitkinetik dargestellt.
12
Versuch 2
Induktion der Phytoalexinbildung durch einen Elicitor in
Petersilien-Kulturzellen
Einleitung
Die pflanzliche Pathogenabwehr kann eingeteilt werden in die spezifische und die
allgemeine Abwehr. Erstere beschreibt Rassen- und Kultivar-spezifische Gen-fürGen-Interaktionen, letztere verbreitete und gegen eine Vielzahl potentieller Pathogene gerichtete Mechanismen, wie etwa lokale Zellwandverstärkungen oder die
Synthese antimikrobiell wirkender Phytoalexine. Spezifische wie allgemeine Abwehr
sind abhängig von der Pathogen-Erkennung durch die Pflanze. Allgemeine Abwehrreaktionen (auch: „innate immunity“) werden durch Elicitoren, bestimmte von der
Pflanzenzelle erkannte Moleküle, ausgelöst. Man spricht heute meist von „pathogen
associated molecular patterns“ (PAMPs), die eine Pflanzenzelle für die Erkennung
von potentiellen Pathogenen und die Auslösung von Abwehrmaßnahmen nutzt.
PAMPs sind molekulare Strukturen, die erstens für Bakterien oder Pilze charakteristisch und zweitens aufgrund essentieller Funktionen hochkonserviert sind. Untersuchungen der letzten Jahre haben für einige PAMPs die molekularen Mechanismen
der Erkennung und Signaltransduktion aufgeklärt. Bestverstandenes Beispiel ist die
Flagellin-Erkennung durch Arabidopsis thaliana-Zellen. Erkennung eines 22 Aminosäuren langen Peptids aus Flagellin durch einen spezifischen Rezeptor (FLS2) führt
über eine Signaltransduktionskaskade zur massiven Umsteuerung der Genexpression. Verlust des Rezeptors resultiert in einem partiellen Verlust der Resistenz
gegenüber bakteriellen Pathogenen.
Für lange Zeit war Pep-13 der bestverstandene Elicitor (s. z.B. Nürnberger et al., Cell
78, 449-460, 1994). Bei Pep-13 handelt es sich um ein Peptid, dass aus einem von
Phytophthora sojae sekretierten 42 kD Glycoprotein stammt (Abb. 2.1). Seit einigen
Jahren ist bekannt, dass es sich bei diesem Protein um eine Zellwand-ständige
Transglutaminase handelt, deren genaue Funktion allerdings unbekannt ist. Pep-13
wird durch einen hochaffinen Rezeptor in der Plasmamembran kultivierter Petersilien
(Petroselinum crispum)-Zellen erkannt. Der Rezeptor konnte bisher nicht molekular
identifiziert werden. Die Erkennung löst eine Signaltransduktionskaskade aus, die
über Ca2+-Einstrom einen „oxidative burst“ und eine MAP-Kaskade u.a. zur Aktivierung einer Vielzahl von Genen führt. Zu den aktivierten Genen gehören solche, die an
der Biosynthese von Furanocumarin-Phytoalexinen beteiligt sind. Diese antimikrobiell wirkenden Stoffe werden von den Zellen in das Zellkulturmedium abgegeben.
Die Furanocumarin-Biosynthese leitet sich aus dem Phenylpropan-Stoffwechsel ab
(Abb. 2.2: in der Abbildung ist auch der Zusammenhang mit der im Pflanzenphysiologischen Praktikum untersuchten Anthocyanbildung gezeigt). Ausgangspunkt ist pCumarsäure, die aus dem PAL-Produkt trans-Zimtsäure durch eine P450-Monooxygenase synthetisiert wird. Die Bildung von Psoralen, ein Furanocumarin, aus pCumarsäure ist in Abb. 2.3 skizziert.
13
Abb. 2.1. Die Erkennung von Pep-13, einem „Pathogen associated molecular pattern“
(PAMP) aus Phytophthora sojae, führt in Zellkulturen der Petersilie zur Auslösung von
Abwehrreaktionen. Zu diesen gehört die Synthese von Furanocumarin-Phytoalexinen. Aus:
Buchanan, Gruissem, Jones (2000) Biochemistry & Molecular Biology of Plants
14
Cumarine
Anthocyane
Abb. 2.2. Übersicht der Produkte des Phenylpropanoid-stoffwechsels. Aus Heldt (2003):
Pflanzenbiochemie, 3. Aufl., S. 446, modifiziert
In dieser Praktikumsaufgabe wird die Wirkung von Pep-13 auf den Phenylpropanoidstoffwechsel (PP-Weg) von Petersilien-Kulturzellen untersucht. Die Inkubation der
Kulturzellen mit dem Peptid soll die Bildung von reaktiven Sauerstoffmolekülen
("reactive oxygen species: ROS") anregen, die von einer verstärkten Expression von
PAL-Protein und schließlich von der Akkumulation von Furanocumarinen in dem
Kulturmedium begleitet wird. In einem Versuchsteil (Versuch 2A) wird die Bildung
von Cumarinen im Kulturmedium durch die Fluoreszenz dieser Verbindungen aufgezeigt und verschiedene Cumarinarten werden auch durch ihre Fluoreszenz nach
Extraktion, Aufkonzentrierung und Auftrennung durch Dünnschichtchromatographie
identifiziert. Die Induktion der Bildung von PAL-Protein soll mittels der Western-BlotTechnik nach Extraktion der Kulturzellproteine und deren Auftrennung mittels SDSPAGE gezeigt werden. In einem separaten Versuch (Versuch 2B) wird die Bildung
von ROS im Kulturmedium durch Chemilumineszenz nachgewiesen und quantifiziert.
15
p-Cumarsäure wird aus trans-Zimtsäure durch eine
Monooxygenase gebildet. Durch Hydroxylierung von pCumarsäure entsteht Psoralen über die Bildung von
Umbelliferon. Psoralen geht durch die UV-Strahlung des
Sonnenlichtes in den angeregten Zustand über und reagiert
dann mit den Pyrimidinbasen der DNA. Dies führt zur
Blockierung von Transkription und DNA-Reparatur.
Abb. 2.3. Synthese von p-Cumarsäure aus trans-Zimtsäure und die Bildung von Psoralen,
einem Furanocumarin, aus p-Cumarsäure. Aus Heldt (2003) Pflanzenbiochemie, 3. Auflage,
S. 448/450.
Material
Pflanzenmaterial
• heterotrophe Suspensionskulturen von Petersilie (Petroselinum crispum)
• werden im Dunkeln bei 25oC in 40 ml Portionen in 250 ml Erlenmeyerkolben
geschüttelt; Portionen werden alle 7 Tage in neues Medium übertragen
Geräte
• 250 ml Erlenmeyerkolben (6, steril)
• 10 ml Pipetten mit abgesägter Spitze zum Pipettieren von Kulturzellen
• Zellkulturplatte mit 6 x 4 Vertiefungen (2)
• Schüttler für Zellkulturplatt im Dunkeln
• UV-Lichtquelle, Schutzbrillen, Schutzhaube
• 100 ml Saugflasche mit Frittentrichter; Wasserstrahlpumpe
• Waage, Alufolie, Spatel, Eppi-Ständer
• 50 ml Falcon-Röhrchen (6)
• Dewargefäße (mindestens 3)
• Reibschalen (5), Pistille (5), Zangen (3), lange Pinzetten (3), Styropor-Unterlagen
(3)
• 2,0 und 1,5 ml Eppis, Verschlusskappen
16
• Eppendorf-Tischzentrifuge
• Thermoblock für 95oC, bzw. Wasserbad zum Kochen
• Scheidetrichter (3), 100 ml Erlenmeyerkolben (6)
• Rundkolben mit Stöpseln: 250 ml und 10 ml (jeweils 6)
• Wasserbad bei 37oC
• Spektralphotometer (3)
• Chromatographieplatten, klein und groß (Kieselgel)
• Chromatographiekammer (6 klein, 1 groß)
• Geräte für SDS-PAGE
Elektrotranfer
Western-Blot
Reagenzien
• Pep-13: 1 mM Stammlösung (gestellt)
- 1,62 mg PEP 13 werden in 1 ml bidest. Wasser gelöst. Wird bei -20oC aufgehoben.
• 0,1 M CuSO4 (gestellt)
- 0,798 g CuSO4.2 H20 werden in 40 ml bidest. Wasser gelöst und auf 50 ml mit bidest.
Wasser aufgefüllt
• 0,1 M AgNO3 (gestellt)
- 0,85 g AgNO3 werden in 40 ml bidest. Wasser gelöst und auf 50 ml mit bidest. Wasser
aufgefüllt
• Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC): gestellte Lösung
• Flüssiger Stickstoff
• Extraktionspuffer XP: 0,1 M Tris/Acetat (pH 8,0), mit 5 mM MgCl2 (s. Versuch 2)
- vor Gebrauch mit 2 μl 2-Mercaptoethanol/ml versetzen (Abzug!)
• 4-fach konzentrierter SDS-Auftragspuffer (gestellt)
• Glycerin (wasserfrei), in Röhrchen mit Pasteurpipette
• Na2SO4 (wasserfrei)
• Chloroform
• Chromatographie-Laufmittel (gestellt)
- Toluol-Ethylformiat-Ameisensäure (5:4:1)
• Lösungen von Cumarinstandards (Umbelliferon, Xanthotoxin, us.w.: gestellt)
• Reagenzien für: SDS-PAGE
Elektrotransfer
Western-Blot
17
Versuch 2A
Induktion von PAL und Bildung von Furanocumarinen in
Petersilien-Kulturzellen nach Behandlung mit Pep-13
In diesem Versuchsteil wird die Wirkung von sowohl Pep-13 als auch von Metallionen
auf die Bildung von Furanocumarinen untersucht. In dem "Hauptversuch" werden
größere Kulturvolumina mit verschiedenen Konzentrationen an Pep13 versetzt. Nach
Einwirkung des Elicitors über Nacht werden Extrakte aus den Kulturzellen und das
Medium gewonnen, womit die Analyse von PAL-Expression bzw. Cumarinzusammensetzung durchgeführt wird. Parallel dazu wird die Wirkung von einer Konzentration an CuSO4 in der gleichen Weise geprüft (Versuchsteil 2A1.1). In einem
ergänzenden Versuch wird die Bildung von Cumarinen in kleinen Kulturvolumina bei
Einwirkung von Pep-13, CuSO4 und AgNO3 über einen größeren Konzentrationsbereich untersucht. Hierzu wird auch die Vitalität der Zellen in der Gegenwart dieser
Wirkstoffkonzentrationen überprüft (Versuchsteil 2A1.2).
Durchführung
2A.1 Behandlung der Petersilien-Zellkultur mit Pep-13 und
Metallionen
Diese Arbeiten werden an der Steril-Bank durchgeführt: Die angesetzten Kulturen
müssen nicht absolut steril sein, aber doch möglichst ohne Kontamination!
2A1.1 Versetzen von 30 ml Kulturen mit Pep-13 und CuSO4
Der Inhalt von 4 Kolben von 14 Tage alten Kulturen wird gemischt und daraus
werden 5 möglichst homogene 25 ml Portionen in autoklavierte 250 ml Erlenmeyerkolben pipettiert.
• Die einzelnen Kulturen werden mit den folgenden Lösungen versetzt:
• nichts (Kontrolle)
• Pep-13-Lösung für Endkonzentrationen von 10 nM, 100 nM und 1 μM
• AgNO3-Lösung für eine Endkonzentration von 50 μM
• Diese Kulturen werden im Dunkeln bei 25oC über Nacht geschüttelt. Zur weiteren
Untersuchung siehe 2A.2 und dann 2A.4.
18
2A1.2 Versetzen von 1 ml-Kulturen mit Pep-13, CuSO4 und AgNO3
Von einer weiteren Kultur wird jeweils 1 ml der Kultursuspension in jedes der Löcher
einer 6 x 4 Zellkulturplatte pipettiert. Die 6-er Reihen werden von oben bis unten mit
A-D bezeichnet.
• In Reihe A sollen die folgenden Konzentrationen von Pep-13 durch Zupipettieren der
entsprechenden Volumina der Pep-13-Stammlösung erhalten werden:
kein Pep-13 (Kontrolle)
- 100 pM Pep-13
1 nM Pep-13
- 10 nM Pep-13
- 100 nM Pep-13
1 μM Pep-13
• In Reihe B sollen die folgenden Konzentrationen von CuSO4 durch Zupipettieren
der entsprechenden Volumina der CuSO4-Stammlösung erzielt werden:
kein CuSO4 (Kontrolle)
- 10 μM CuSO4
- 33 μM CuSO4
- 100 μM CuSO4
- 330 μM CuSO4
- 1 mM CuSO4
• In Reihe C sollen die folgenden Konzentrationen von AgNO3 durch Zupipettieren
von entsprechenden Volumina AgNO3-Stammlösung erhalten werden:
kein AgNO3 (Kontrolle)
- 10 μM AgNO3
- 33 μM AgNO3
- 100 μM AgNO3
- 330 μM AgNO3
- 1 mM AgNO3
• In die zusätzlichen Kulturportionen der Reihe D werden kleine Mengen von
authentischen Furanocumarinen hinzupipettiert.
- Durchführungshinweise hierzu vom Praktikumsbetreuer!
Diese Platte wird auch bei 25oC im Dunkeln über Nacht geschüttelt. Zur weiteren
Untersuchung siehe 2A.2 und dann 2A.3.
2A.2 Kontrolle der Phytoalexinbildung
Beim Betrachten unter UV-Licht Schutzbrille (besser: Schutzhaube!) tragen!
Die am Vortag angesetzten Zellkultur-Kolben und -Testplatten (2A.1) werden unter UVLicht betrachtet:
• Wenn Cumarine durch die Behandlung mit Pep-13 bzw. CuCl2 gebildet worden
sind, wird dies an der Fluoreszenz der Kultursuspensionen (Vergleich mit den mit
Cumarinen versetzten Proben!) erkannt.
19
2A.3 Kontrolle der Vitalität der Kulturzellen
Dies betrifft nur die Zellkulturplatte vom Versuchsteil 2A.1.2 mit den 1 ml
Kulturproben:
• 0,5 ml von jeder der 1 ml Kulturportionen in den Reihen A-C werden mit einer 1 ml
Automatikpipette und einer vorne "abgesägten" blauen Pipettenspitze in ein entsprechend
beschriftetes 1,5 ml Eppi pipettiert.
• Die Kultursuspension in dem Plattenloch muss vor der Entnahme durch Aufund Abpipettieren gut homogenisiert werden!
• Zu jeder 0,5 ml Kultursuspensions-Portion werden 100 μl einer Triphenyl-Tetrazolium-Chlorid- (TTC-) Lösung pipettiert und mit den Zellen mit dem Whirlimixer gut
vermischt. Die Eppis werden im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahrt:
• Nach ca. eine Stunde sollen die Zellen betrachtet werden. Lebende Zellen
färben sich rot an, da physiologische Reduktion des sonst farblosen TTC
(durch NADH) zur Bildung eines unlöslichen, rot gefärbten Formazanprodukts
führt.
2A.4 Ernte der Kulturzellen und -medien
Die Zellen und die Medien der 25 ml Kulturen, die unter 2A1.1 mit Pep-13 bzw.
CuSO4 versetzt wurden, werden am nächsten Tag wie folgt (für eine Kultur
beschrieben) geerntet:
• Eine Saugflasche mit Frittentrichter (Glasfritte „3“) bereit stellen, ebenso
Alufolie, einen Spatel, ein beschriftetes 50 ml Falcon-Röhrchen und 4 x 2 ml
Eppis (beide beschriftet!).
• Der Inhalt des Kulturkolbens wird in den Frittentrichter überführt und das
Kulturmedium wird bei stark aufgedrehter Wasserstrahlpumpe in die Saugflasche
durchgesaugt:
• Das Kulturmedium (das Filtrat) wird in das 50 ml Falcon-Röhrchen dekantiert
und bis zu seiner Extraktion bei -20oC aufbewahrt!
• Die Zellen auf der Fritte werden nun mit 50 ml bidest. Wasser gewaschen: Die
Zellen werden bis zur größtmöglichen Trockenheit abgesaugt (nach dem
Verschwinden des Waschwassers auf der Fritte noch 30 Sek. weitersaugen).
• Ein Quadrat Alufolie (ca. 10 x 10 cm) wird auf der Feinwaage tariert. Die
trockengesaugten Zellen werden von der Fritte mit dem Spatel heruntergekratzt
und möglichst vollständig auf die Alufolie überführt. Die geernteten Zellen werden
nun auf der Folie gewogen (Gewicht notieren!).
• Ca. 3 g der Zellen werden getrennt in Alufolie eingewickelt und bei -20oC bis zu
ihrer Extraktion (s. 2A.5) aufbewahrt.
• Die übrigen Zellen werden auch als Reserve in Alufolie eingewickelt bei -20oC
aufgehoben.
20
2A.5 Extraktion der Kulturzellen
Die geernteten Kulturzellen werden in der gleichen Weise wie das Blattmaterial im
Versuch 1 extrahiert:
2A.5.1 Homogenisieren der Zellen:
Im Folgenden wird die Prozedur für eine Probe von Kulturzellmaterial beschrieben.
Zum Arbeiten mit tiefgekühlten Gegenständen Schutzhandschuhe tragen!
Zur Vorbereitung:
Für jede Probe werden folgende Gegenstände in flüssigem N2 in Dewargefäßen
tiefgekühlt:
• In einem Dewargefäß werden die ca. 3 g Portion von geernteten Zellen in ihrer
Alufolie-Verpackung in den flüssigen N2 tiefgekühlt
• In einem zweiten Dewargefäß wird eine kleine Reibschale und Pistill tiefgekühlt,
sowie ein größerer und einen kleinerer Spatel
• In einem dritten Dewargefäß werden 2 beschriftete∗ 2 ml-Eppis (offen!) in den
flüssigen N2 hineingeworfen und dort aufbewahrt
∗ Die Eppis sollen entsprechend ihrem Zweck beschriftet werden: Beide
mit einem Kürzel für die Zellen und Behandlung, z.B. Pep für „Pep13“ sowie beispielsweise 10 nM für die Behandlungskonzentration
Durchführung:
Die tiefgefrorenen Zellen werden mit flüssigem N2 zu einem feinen Pulver zerrieben.
Portionen des Pulvers werden zur Extraktion von Protein separat ausgewogen. Zum
Zerreiben des Probenmaterials:
• Zunächst wird die tiefgekühlte Reibschale – mit etwas flüssigem N2 gefüllt –
dem zweiten Dewargefäß mit einer Zange entnommen und auf eine
Styroporunterlage gestellt
• Die Alufolie mit der Zellprobe wird dem ersten Dewargefäß entnommen und
die tiefgefrorenen Zellen werden in den flüssigen N2 im tiefgekühlten Mörser
überführt. Das Zellmaterial wird dann mit dem tiefgekühlten Pistill zu einem
feinen Pulver zerrieben
Zwei Portionen des tiefgefrorenen Blattpulvers werden hintereinander in tiefgekühlte
Eppis mit einem tiefgekühlten Spatel eingewogen. Dies soll zügig erfolgen, um
mögliches Auftauen des Probenmaterials zu vermeiden:
• Das jeweilige, beschriftete Eppi wird aus dem flüssigen N2 genommen und in
einem Ständer auf einer Feinwaage aufgestellt. Nach Tarierung auf 0 g werden
0,4 g des tiefgefrorenen Pulvers eingewogen (Spatel vorher in flüssigem N2
tiefkühlen!):
• Gleich nach dem Einwiegen des Probenmaterials wird das Eppi wieder
in den flüssigen N2 in dem dritten Dewargefäß geworfen.
21
Es empfiehlt sich, die Pulverportionen von sämtlichem Probenmaterial, das in einer
Arbeitssitzung verarbeitet werden soll, wie oben beschrieben in flüssigem N2 zu
sammeln! Die Pulverportionen können dann gemeinsam den folgend beschriebenen
Extraktionsprozeduren unterworfen werden:
2A.5.2 Extraktion der homogenisierten Zellen:
• Das 2 ml Eppi mit den 0,4 g tiefgefrorenen Pulvers (P) wird aus dem flüssigen N2
mit einer Zange oder Pinzette genommen und mit 0,8 ml Extraktionspuffer XP (kurz
vorher mit 28 mM Mercaptoethanol ergänzt!) versetzt und unter Mischen
(Whirlimixer) aufgetaut. Nach gründlichem Mischen wird auf Eis aufbewahrt.
• Das Eppi mit dem Homogenat wird 10 Min bei 14,000 U/M in der EppendorfTischzentrifuge bei 4oC zentrifugiert. Ein ml des Überstands (RE = BlattRohextrakt) wird in ein 1,5 ml Eppi überführt.
• 200 μl des Rohextrakts RE werden auf Eis zur Vorbereitung für SDS-PAGE (s.
2A.5.3) aufbewahrt.
2A.5.3 Vorbereitung der Extrakte für SDS-PAGE:
• 0,8 ml 4-facher SDS-PAGE-Probenpuffer (gestellt) wird mit 0,2 ml 2-Mercaptoethanol in einem 2 ml Schraubgefäß versetzt und vermischt („4 x SDS-PP + ME“)
• 200 μl RE werden in einem 2 ml Schraubgefäß mit 67 μl 4 x SDS-PP + ME (s.o.)
versetzt und vermischt. Das Schraubgefäß wird dann 10 Min. bei 95oC in einem
Heizblock oder 5 Min. in einem kochenden Wasserbad erhitzt. Nach dem Abkühlen
wird die Probe kurz (einige Sekunden) zentrifugiert und dann erneut gemischt.
Diese Probe zur SDS-PAGE-Analyse wird als „RE/P“ („RE/PAGE“) bezeichnet.
Die RE/P-Proben können bis zu ihrer Untersuchung im Kühlschrank aufgehoben
werden
2A.6 Extraktion und Aufkonzentrierung der Kulturmedien
Cumarine werden aus den geernteten Kulturmedien (s. 2A.4) mit Chloroform
extrahiert, und der Chloroformextrakt wird zur chromatographischen Analyse
aufkonzentriert. Hier die Beschreibung für eine Probe Medium:
Arbeiten mit Chloroform im Abzug!
• Das bei -20oC gelagerte Kulturmedium wird aufgetaut und dann 5 min bei
maximaler Tourenzahl in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird
abdekantiert und das Volumen gemessen.
• Es soll das gleiche Volumen für jede Medium-Probe weiter untersucht werden!
22
• Die abzentrifugierte Medium-Portion wird in einen Scheidetrichter überführt. Sie
wird dort dreimal mit jeweils 20 ml Chloroform extrahiert:
• 20 ml Chloroform wird zu dem Medium zugegeben, der Trichter wird
verschlossen und kräftig durchgeschüttelt. Nach 10 min wird die schwerere
Chloroform-Phase unten abgelassen und in einem 100 ml Erlenmeyerkolben
aufgehoben.
• Diese Extraktion wird noch zweimal wiederholt; die einzelnen ChloroformExtrakte werden in dem 100 ml Erlenmeyerkolben vereinigt.
• Zu dem kombinierten Chloroform-Extrakt wird ein Spatelspitze Na2SO4 zugegeben
und der Kolbeninhalt etwas umgeschwenkt. Das Chloroform wird nun durch einen
Faltenfilter filtriert und in einen 250 ml Rundkolben überführt.
• Das Chloroform in dem Rundkolben wird nun bis zur Trockenheit in einem
Rotationsverdampfer eingeengt (Bedienungsanleitung durch den
Praktikumsbetreuer!).
• Der Rückstand in dem Rundkolben wird mit 1 ml Chloroform aufgenommen und in
einen kleinen (10 ml) Rundkolben überführt. Dieser konzentrierte ChloroformExtrakt kann im verschlossenen Kolben im Kühlschrank aufbewahrt werden.
2A.7 Analyse der Kulturextrakte
Gelöste Substanzen in den aufkonzentrierten Chloroformextrakten der Zellkulturmedien werden mittels Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Cumarine auf den
Dünnschichtplatten werden durch Fluoreszenz bei Bestrahlung mit UV-Licht
identifiziert (2A.7.1): Hierdurch kann die Cumarin-Bildung durch die Wirkung von
Pep-13 bzw. Cu2+ semi-quantitativ und auch qualitativ geprüft werden.
Proteine in den Rohextrakten aus den Kulturzellen werden durch SDS-PAGE
aufgetrennt und dann mit der Western Blot-Technik immunchemisch auf die Bildung
von Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL) untersucht (2A.7.2). Auf diese Weise wird
geprüft, ob die PAL-Expression mit der Bildung von Cumarinen zusammenhängt.
2A.7.1 Chromatographische Darstellung von CumarinPhytoalexinen
Die Cumarine in den konzentrierten Kulturmedium-Extrakten werden mittels Dünnschichtchromatographie „TLC“ („Thin Layer Chromatography“) auf Kieselgelschichten
untersucht. Voruntersuchungen können mit kleinen TLC-Platten eine erste
Vorstellung von dem Cumarinmuster des Extraktes geben, eine Prozedur, die hier
beschrieben wird. Wenn dieser erste Ansatz gute Ergebnisse liefert, kann er leicht in
größerem Maßstab zum direkten Vergleich mehrerer Proben durchgeführt werden.
Im Folgenden die Beschreibung der Arbeitsweise einer Praktikumsgruppe:
Vorbereitung:
• In eine kleine Kammer wird genügend Laufmittel eingefüllt, so dass der
Kammerboden gerade bedeckt ist (ca. 10 ml). Die Kammer wird mit einem Deckel
23
verschlossen, und die beschickte Kammer etwa 30 min zur Sättigung des
Luftraums mit Laufmitteldämpfen stehen gelassen.
Alle Arbeiten mit dem chromatographischen Laufmittel im Abzug durchführen!
• Ein Zentimeter von einem der schmalen Enden einer fertig geschnittenen 20 x 5 cm
Kieselgel-TLC-Folie wird ein Strich mit einem weichen Bleistift gezeichnet. Vier
Auftragspunkte werden bei 1, 2, 3 und 4 cm vom linken Ende dieses Striches
markiert.
Durchführung:
• Auf die linken und rechten Auftragspunkte davon werden gestellte Lösungen von
Cumarin-Standards aufgetragen. Auf die zwei mittleren Auftragspunkte werden
konzentrierte Chloroformextrakte aus den Kulturmedien aufgetragen: von einer
Behandlungsvariante und von der Kontrolle. Die Auftragung erfolgt durch wiederholtes Aufspotten von 2,5 μl Portionen mit einer 10 μl Kolbenpipette. Die aufgetragenen Proben werden zum Schluss gut getrocknet:
• Die Auftragsmengen und Wahl der Standards werden mit dem Praktikumsbetreuer besprochen.
• Die beschickte TLC-Folie wird mit der Auftragsseite nach unten in die Chromatographiekammer gestellt; die Kammer wird mit dem Deckel verschlossen. Die
Chromatographie wird durchgeführt, bis das Laufmittel kurz vor dem oberen Rand
der Folie angelangt ist (ca. 12 min).
• Die TLC-Folie wird herausgenommen und die Laufmittelfront sofort mit einem
weichen Bleistift markiert. Das Chromatogramm wird in einem Pressluftstrom im
Abzug gut getrocknet (bis es nicht mehr scharf riecht – ca. 15 min) und dann in
einem dunklen Raum unter UV-Licht betrachtet. Fluoreszierende Flecken deuten
auf Furanocumarine hin. Das Chromatogramm wird im Dunkeln aufbewahrt.
• Weiße Kleidung beim Betrachten unter UV-Licht nicht tragen!
• Die Fluoreszenz und somit das chromatographische Bild bleibt im Dunkeln
stabil. Somit kann das Fluoreszenzbild zur gegebenen Zeit mit einer
Digitalkamera aufgenommen werden und dann die Lage der fluoreszierenden
Flecken mit Bleistift markiert werden.
Nach Sichtung des Chromatographie-Ergebnisses kann eine größer dimensionierte
TLC mit Vergleich aller Kulturmediumproben angesetzt werden. Hierzu Rücksprache
mit dem Praktikumsbetreuer nehmen!
24
2A.7.2 Immunchemischer Nachweis von PAL mittels Western
Blotting
Diese Untersuchung wird mit den für SDS-PAGE vorbereiteten Protein-Rohextrakten
aus den Zellen der 25 ml-Kulturen, die mit Pep-13 bzw. CuSO4 behandelt worden
waren (s. 2A.5.3), durchgeführt. Die Anleitungen zur SDS-PAGE und zum Western
Blotting werden separat durch den Praktikumsbetreuer ausgegeben und die
Anordnung der Analysen wird im Praktikum mit dem Betreuer beschlossen.
25
Versuch 2B
Induktion eines „oxidativen Bursts“ in Petersilien-Kulturzellen nach Behandlung mit Pep-13 und Metallionen
Reaktive Sauerstoffspezies („ROS“) werden infolge einer mikrobiellen Infektion (Pep13!) von Pflanzen gebildet („oxidativer Burst“). Die Funktionen von ROS in der
pflanzlichen Pathogenabwehr liegen in ihrer antimikrobiellen Wirkung (Toxizität), ihrer
Fähigkeit zur oxidativen Vernetzung von Zellwandstrukturen (resultiert in einer
Verstärkung des mechanischen Abschlusses der Pflanzenzellen) sowie in ihrer
Beteiligung am Signaltransfer bei der Ausprägung anderer pflanzlicher Abwehrreaktionen (wie z.B. der Phytoalexinbiosynthese) begründet. Elicitoren können die
Biosynthese von ROS auch in suspensionskultivierten Pflanzenzellen induzieren. Im
vorliegenden Versuch soll die Kinetik der ROS-Produktion bei verschiedenen
Konzentrationen an Pep-13 festgestellt werden: die Schwellenkonzentration dieses
Elicitors zur Auslösung eines oxidativen Bursts soll bestimmt werden. Es soll auch
geprüft werden, ob Metallionen wie Cu2+ und Ag+ gleichermaßen induzierend auf die
ROS-Produktion wirken.
ROS können durch die Reaktion mit Luminol (= 3–Aminophthalsäurehydrazid) mit
H202 erfasst werden. Die Gesamtreaktion von Luminol mit H202 ist wie folgt:
Diese durch Kaliumferricyanid (K3[Fe(CN)6] katalysierte Reaktion wird durch die
Freisetzung von bläulichem Lumineszenzlicht begleitet, die mit einem entsprechenden Gerät quantitativ erfasst werden kann: Der „Biocounter“ oder das „Luminometer“
der Firma Lumac. Da H202 ein Zersetzungsprodukt des O2− -Ions ist, das durch die
Aktivität der pflanzlichen NADH-Oxidase entsteht, ist seine Bildung bei Behandlung
mit Pep-13 ein Maß für den durch den Elicitor ausgelösten oxidativen Burst.
Durchführung
2B.1 Vorbereitung der Kulturzellen
• Suspensionskultivierte Zellen der Petersilie eines Kulturkolben (ca. 6 Tage nach
Übertragung) werden mit einer Saugfritte, die auf eine Saugflasche aufgesetzt ist,
geerntet. Die getrockneten Zellen werden mit 20 ml frischem HA-Medium
(Zellkulturmedium) gewaschen.
26
• Danach werden die Zellen gewogen und in einem frischen Erlenmeyerkolben in
frischem HA-Medium auf eine Dichte von 10 g/100 ml eingestellt. Pro Elicitortyp
und -konzentration werden je 2 ml der Zellsuspension mit Hilfe einer
abgeschnittenen Glaspipette in 20 mm Wells einer Suspensionszellkulturplatte
überführt und vor Zugabe der Elicitoren für 30 min unter Schütteln im Dunkeln
inkubiert.
Danach werden die Zellen mit Elicitoren versetzt und nach verschiedenen
Inkubationszeiten für ROS getestet
2B.2 Elicitorbehandlung und ROS-Bestimmung
Der Elicitor wird aus hochkonzentrierten Stammlösungen zugesetzt und auf die
gewünschte Endkonzentration eingestellt. Folgende Endkonzentrationen sollen in
Doppelbestimmungen auf ihre Fähigkeit zur Induktion des „oxidativen Bursts“ in
Petersilienzellen getestet werden:
Pep-13: 0, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000 nM;
evtl. auch weitere Konzentrationen
CuSO4 bzw. AgNO3: nach Absprache mit dem Praktikumsbetreuer.
• Nach 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, und 120 min werden jeweils 50 µl
Suspension (Achtung: abgeschnittene Pipettenspitzen verwenden!) in
Messröhrchen überführt, die zuvor mit 750 µl 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,9
gefüllt wurden.
• Zu jedem dieser Messzeitpunkte werden vier (4!) 50 µl Suspensionsportionen in die Messröhrchen pipettiert: 2 x Konzentration X, und
2 x die Kontrolle!
• Nach Zugabe der Zellsuspension werden 200 µl Luminol (0,3 mM in 50 mM
Kaliumphosphatpuffer, pH 7,9, frisch ansetzen, über Nacht lösen) zugesetzt und
vorsichtig geschüttelt. Das Röhrchen wird anschließend in die Messkammer des
messbereiten Lumac Biocounters eingestellt und diese geschlossen. Durch
Betätigung des „Start“- Knopfes werden 100 µl Kaliumferrycyanid (K3[Fe(CN)6], 14
mM in Wasser, frisch ansetzen) automatisch zugegeben und nach 3 s beginnt die
Messung über 10 s.
• Nochmals: zu jeder Messzeit müssen 4 Suspensionsproben „verarbeitet“
werden (s. oben!): Es müssen Messungen an jeweils 2 Parallelen der mit
Elicitor behandelten Probe und an 2 Parallelen der Kontrolle innerhalb der zur
Verfügung stehenden 5 min erfolgen!
Es ist sehr wichtig, dass die Messröhrchen nicht weggeworfen werden! Sie
müssen unbedingt zur Reinigung und Wiederverwendung aufbewahrt werden!
Die erhaltenen Messwerte werden graphisch ausgewertet: die Konzentration an H202
wird gegen die Zeit nach Zugabe des Elicitors aufgetragen. Zur Quantifizierung soll
der Messausschlag mit einer Eichreihe an H202–Konzentrationen kalibriert werden.
Hierzu Rücksprache mit dem Praktikumsbetreuer!