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Aus der Medizinischen Universitätsklinik
Abteilung Innere Medizin IV
Nephrologie
der Albert-Ludwigs - Universität Freiburg im Breisgau
Identifizierung von Kidney Injury Molecule (KIM 1) als neuer Interaktor von
Polycystin 2 und Charakterisierung der Intrazellulärdomäne in Bezug auf die ziliäre
Funktion von KIM 1
INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert- Ludwigs- Universität Freiburg i. B.
vorgelegt 2008 von:
Anne-Katharina John
geboren in Waldkirch
Dekan: Prof. Dr.med. Christoph Peters
Erstgutachter: Prof. Dr.med. Gerd Walz
Zweitgutachter: PD Dr. Thomas Günther
Jahr der Promotion: 2009
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ................................................................................................................ 1
1.1. Polyzystische Nierenerkrankung ...................................................................... 1
1.1.1. Krankheitsbild und Ätiologie ...................................................................... 1
1.1.2. Molekulare Hintergründe von ADPKD ....................................................... 3
1.2. ADPKD und die Rolle von Zilien....................................................................... 8
1.3. Das Kidney Injury Molecule 1 (KIM 1) ............................................................ 10
1.3.1. Die Familie der TIM Proteine ................................................................... 10
1.3.2. Funktionelle Eigenschaften von KIM 1 .................................................... 11
1.3.3 Molekulare Eigenschaften von KIM 1 ....................................................... 11
1.4. Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit .................................................. 13
2. Material und Methoden ......................................................................................... 14
2.1. Materialien und Lösungen .............................................................................. 14
2.1.1. DNA-Technologien .................................................................................. 14
2.1.2. Plasmide .................................................................................................. 14
2.1.3. Retrovirale Vektoren ................................................................................ 15
2.1.4. Zellkultur .................................................................................................. 15
2.1.5 Transfektion .............................................................................................. 16
2.1.6. Immunopräzipitation ................................................................................ 16
2.1.7 SDS-Gelelektrophorese und Immunoblot ................................................. 17
2.1.8. Immunfluoreszenz ................................................................................... 18
2.2. Methoden ....................................................................................................... 19
2.2.1 DNA Technologien und Klonierung .......................................................... 19
2.2.1.1 Ligation und Transformation .............................................................. 19
2.2.1.2 Amplifikation....................................................................................... 19
2.2.3. Zellkultur .................................................................................................. 20
2.2.3.1 Subkultivierung von Zellen ................................................................. 20
2.2.3.2. Herstellung stabil transfizierter Zelllinien ........................................... 20
2.2.4. Immunfluoreszenz ................................................................................... 21
2.2.5. Konfokale Mikroskopie ............................................................................ 21
2.2.6. Koimmunopräzipitation ............................................................................ 22
2.2.7. SDS Polyacrylamid-Gelelktrophorese und Immunoblot ........................... 22
3. Ergebnisse............................................................................................................ 24
3.1.Die Zilienlokalisation von KIM 1 ist abhängig von der zytoplasmatischen
Domäne ................................................................................................................ 24
3.3.1. Generierung von KIM 1 Trunkationen...................................................... 24
3.1.2 Die ersten sechs intrazellulären Aminosäuren bestimmen die Membranund Zilienlokalisation von KIM 1 ........................................................................ 25
3.1.3 Der intrazelluläre Teil von KIM 1 ist in der Lage ein membran-verankertes
Fusionsprotein in das Zilium zu lokalisieren. ..................................................... 30
3.2 Interaktion von KIM 1 und Polycystin 2 ........................................................... 31
3.2.1 SIg 7 KIM 1 interagiert mit PC 2 V5 in zilientragenden HEK 293t Zellen .. 31
3.2.2. KIM 1 interagiert mit PC 2 V5 .................................................................. 34
3.2.3 KIM Y 350.F interagiert nicht mit PC 2V5 ................................................. 36
3.3 Weitere Interaktionspartner von KIM 1 ............................................................ 38
3.3.1 TRPV4 interagiert mit KIM 1 ..................................................................... 38
4. Diskussion und Ausblick ....................................................................................... 41
4.1. Die Intrazellulärdomäne von KIM 1 in Bezug auf seine ziliäre Lokalisation.... 41
4.2 Die Interaktion von KIM 1 und Polycystin 2 ..................................................... 44
4.3 KIM 1 als Interaktionspartner von TRP Kanälen ............................................. 48
5. Zusammenfassung ............................................................................................... 50
6. Literaturverzeichnis............................................................................................... 51
7. Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................... 60
8. Abbildungsverzeichnis .......................................................................................... 62
9. Danksagung ......................................................................................................... 63
10. Lebenslauf .......................................................................................................... 64
-1-
1. Einleitung
1.1. Polyzystische Nierenerkrankung
1.1.1. Krankheitsbild und Ätiologie
Der Begriff der polyzystischen Nierenerkrankung beschreibt eine heterogene Gruppe
von erblichen Krankheiten, die durch eine progredienten Zystenentwicklung in den
Nieren charakterisiert sind. Die autosomal dominant polyzystische (ADPKD, ADPN)
und die autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD, ARPN,
PKDH1) stehen in dieser Gruppe im Vordergrund. Krankheitsbilder, welche ebenfalls
mit der Entwicklung von Nierenzysten einhergehen, sind die Nephronophtise und das
Bardet – Biedl – Syndrom sowie einer Reihe anderer pleiotropischer Syndrome. Die
rezessive Form der autosomalen polyzystischen Nierenerkrankung, ARPKD, ist
relativ selten. Sie tritt in 1:20000 Lebendgeburten auf (Guay-Woodford, 2003). Bei
der ARPKD liegt eine Mutation des Gens PKDH1 auf dem Genlocus 6p21.1-p12 vor
(Onuchic, 2002). Die ARPKD ist eine Erkrankung des Kindesalters, und kann
gelegentlich bereits pränatal diagnostiziert werden. Bei einer sehr schweren
Krankheitsausprägung
kommt
es
bereits
intrauterin
zu
einer
massiven
Zystenentwicklung an den Nieren. In diesen Fällen kann der Krankheitsverlauf
bereits im Perinatalstadium mit einer infausten Prognose einhergehen. Das
Krankheitsbild der ARPKD manifestiert sich hauptsächlich in den Nieren. Eine
kongenitale hepatische Fibrose ist jedoch in vielen Fällen mit der ARPKD
vergesellschaftet, da das mutierte Protein PKDH1 auch in der Leber exprimiert wird.
Bei Neugeborenen oder abgestorbenen Föten, die bereits mit massiven Zysten zur
Welt kommen, kann eine schwerste Lungenhypoplasie vorliegen. Als Folge der
abnormen Größe, welche die zystischen Nieren im Abdomen einnehmen, ist in
diesen Fällen eine regelrechte Lungenentwicklung behindert (Guay-Woodford, 2003).
Wesentlich häufiger tritt die dominante Form, ADPKD, mit einer Inzidenz von 1:400
bis 1:1000 Lebendgeburten auf. Die Ursache für ADPKD liegt bei Mutationen an den
zwei Genen, welche für Polycystin 1 und Polycystin 2 codieren (PC 1 / PC 2 oder
PKD 1 / PKD 2 oder TRPP1 / TRPP2) (Germino, 1992; Mochizuki, 1996).
Phänotypisch ist jedoch kein wesentlicher Unterschied zwischen einer Mutation im
PC 1 Gen oder im PC 2 Gen zu erkennen, was als Hinweis für einen gemeinsamen
Signalweg beider Proteine gesehen wird (Sutters, 2003). Ein mutiertes PC 1 Gen ist
-2in etwa 85% der Fälle für die Krankheit verantwortlich (Ong, 2005). Ein weiterer
entscheidender Pathomechanismus scheint das durch die Mutation entstehende
Missverhältnis zwischen Polycystin 1 und Polycystin 2 zu sein (Giamarchi, 2006).
Das für Polycystin 1 kodierende PC 1 ist auf dem kurzen Arm des Chromosoms 16
lokalisiert auf dem Genlocus 16p13.3. Polycystin 1 ist ein sehr großes Protein mit
4302 Aminosäuren. Das PC 2 Gen ist in der Chromosomen Region 4q22 lokalisiert.
Polycystin 2, ist mit 968 Aminosäuren wesentlich kleiner (Ong, 2005). Ist eines der
beiden Gene mutiert, so dass die Proteine Polycystin 1 oder Polycystin 2 nicht
funktionsfähig sind oder ein Missverhältnis zwischen den beiden Proteinen entsteht,
so kommt es zum Krankheitsbild der ADPKD. Nach der so genannten „second-hithypothese“ sind die mutierten Gene allerdings nicht alleine für den Phänotyp
verantwortlich. Eine zusätzliche somatische Mutation triggert nach dieser Hypothese
die phänotypischen Manifestationen (Devuyst, 2003; Pei, 2001). Erst wenn beide
Gene mutiert sind und somit zwei dysfunktionelle Proteine vorliegen (sog: „loss of
heterezygoty“), macht sich die Krankheit phänotypisch bemerkbar. Die Polyzystische
Nierenerkrankung ist charakterisiert durch die Entstehung multipler mit Flüssigkeit
gefüllter Zysten, verteilt über das gesamte Nephron. Im Gegensatz dazu sind die
Zysten bei der ARPKD vorwiegend im Sammelrohr zu finden (Guay-Woodford, 2003).
In vielen Fällen von ADPKD sind auch andere Organe wie die Leber, das Pankreas
und die Hirnbasisarterien von Zysten befallen. Bei Befall der Hirnbasisarterien sind
diese aneurysmatisch erweitert. In derartigen Fällen besteht die Gefahr einer Ruptur
des Aneurysmas, welche zu einer Subarachnoidalblutung führt und für einen Teil der
frühen Todesfälle verantwortlich ist. Im Endstadium der Erkrankung sind die Nieren
stark deformiert, das Gewicht einer Niere kann bei bis zu acht Kilogramm liegen. Die
Symptomatik ergibt sich aus der durch die Zysten stark veränderten Architektur des
Nierenparenchyms und einer daraus resultierenden eingeschränkten Nierenfunktion.
Die Mehrzahl der Erkrankten leidet an arterieller Hypertonie, rezidivierenden
Harnwegsinfektionen,
Nierensteinen,
Hämaturie,
Schmerzen
und
progredient
fortschreitender Nierenfunktionseinschränkung, die in der Regel zu einer terminalen
Niereninsuffizienz führt. Die Symptomatik sowie der klinische Verlauf sind sehr
variabel, bei Patienten mit einer Mutation des PC 2 Gen wurde eine etwas
schwächere Ausprägung beobachtet. Ist das PC 1 Gen mutiert, so liegt das
Durchschnittsalter für das Auftreten der terminalen Niereninsuffizienz bei 53 Jahren.
Mit durchschnittlich 69 Jahren erreichen Patienten mit einer Mutation im PC 2 Gen
-3das Stadium der terminalen Niereninsuffizienz. Frauen haben eine deutlich längere
mittlere Lebenserwartung als Männer (Hateboer, 1999). ADPKD ist eine progrediente
Systemerkrankung, da wie oben beschrieben, mehrere Organsysteme betroffen sein
können.
Zu
schweren
Komplikationen
mit
eventueller
Todesfolge
können
intrakranielle Aneurysmata, renale Hypertonie, Aortendissektion sowie Hernien
führen (Perrone, 1997). Das Manifestationsalter der dominanten Form liegt
überwiegend zwischen dem 20. bis zum 30. Lebensjahr. Die klinischen Zeichen sind
bei vielen der Erkrankten eine leichtgradige Proteinurie und ein auffälliger
Sonographiebefund sowie in manchen Fällen ein klopfschmerzhaftes Nierenlager.
Eine Evidenz – basierte, kausale Therapie der polyzystischen Nierenerkrankung ist
derzeit noch nicht möglich. Eine symptomatische Therapie der Krankheitsfolgen ist
allerdings unerlässlich. Beispiele hierfür sind die laparoskopische Zystotomie und die
obligatorische Behandlung der arteriellen Hypertonie. Neuere Untersuchungen an
Tiermodellen ergaben, dass sich durch Immunsupressiva wie Rapamycin die Größe
der Zysten und somit die Größenzunahme der gesamten Niere verringern lässt
(Shillingford, 2006). Ebenso aussichtsreich könnte eine Behandlung mit dem Protein
Kinase Inhibitor Roscovitine sein (Bukanov, 2006; Kuehn, 2007). Dieses Medikament
konnte im Mausmodell eine Progredienz im Zystenwachstum verhindern. Des
Weiteren werden eine totale Blockade des Renin – Angiotensin – Aldosteron
Systems, eine Blockade der cAMP Entstehung durch Vasopressin (V2) Antagonisten
oder Somatostatin Analoga als Therapieoptionen diskutiert. Die Inhibition des
Ras/Raf Signalweges wird im diesem Zusammenhang ebenfalls als Möglichkeit zur
Therapie gesehen. (Chapman, 2007) Diese neuen Entwicklungen haben dazu
geführt,
dass
mTOR
Inhibitoren
und
Vasopressin-Rezeptorantagonisten
in
kontrollierten klinischen Studien mit ADPKD Patienten erprobt werden.
1.1.2. Molekulare Hintergründe von ADPKD
Im Zuge der Entstehung der polyzystischen Nierenerkrankung macht das
physiologischerweise resorbierende Tublusepithel eine Umwandlung zu einem
sezernierenden Epithel durch. Bisherige Untersuchungen ergaben, dass die
Sekretion von apikalen Chlorid Kanälen abhängig ist (Greger, 1996; Barrett, 2000).
Diese Kanäle werden bei ADPKD vermutlich übermäßig stimuliert, so dass es zu
einer vermehrten Flüssigkeitssekretion kommt. Ein anderer Weg welcher zu der
Entstehung von Zysten führen könnte, zeigte die Arbeitsgruppe um Olteanu (Olteanu,
-42006). Im orpk Maus Modell konnte von dieser Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass
eine Veränderung der Natrium Absorption und nicht der Chlorid Sekretion den
zystischen Phänotyp verursachen. Welcher Pathomechanismus
letztlich der
entscheidende ist, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht geklärt werden. Die Proteine
Polycystin 1 und Polycystin 2, welche die ADPKD verursachen sind integrale
Membranproteine. Ihre molekulare Struktur ist jedoch von unterschiedlicher
Morphologie.
Abbildung 1: Schematisierte Darstellung von Polycystin 1 und 2. Intrazellulär findet eine
Interaktion beider Polycystine über eine coild – coil Domäne statt (Pfeil). (nachempfunden:
Yoder, 2006)
-5-
Polycystin 1 ist ein sehr großes, komplexes Protein mit einer molekularen Masse von
406 kDa. Es verfügt über 11 transmembranäre Domänen sowie eine große NH –
terminale, extrazelluläre Domäne (Sutters, 2003). Die extrazelluläre Domäne ist
essentiell für Zell - Zell sowie Zell - Matrix Interaktionen (Hughes, 1995; Gallagher,
2000). Der intrazelluläre COOH-Terminus ist kurz und enthält eine coiled - coil
Domäne. Derartige Domänen bestehen aus zwei alphahelikalen Proteinsträngen,
welche sich heptadenförmig umeinander winden wobei die Form durch hydrophobe
Aminosäuren aufrechterhalten wird. Dem c - terminalem Ende von Polycystin 1
werden wichtige Funktionen bezüglich der Morphogenese und der Regulation von
epithelialen Nierenzellen zugeschrieben (Sutters, 2001; Nickel, 2002). Hierbei
werden wichtige intrazelluläre Signalwege wie der Wnt - Signalweg, der JAK/STAT
Signalweg, cAMP- sowie Protein C und G - Protein gekoppelte Signalwege aktiviert
(Arnould, 1998). Eine Phosphorylierung ist über Proteinkinase A und eine srcähnliche Tyrosinkinase möglich (Li, 1999). Polycystin 1 unterliegt einer, für die
Funktion unerlässlichen, proteolytischen Spaltung der intrazellulären c – terminalen
Domäne (Qian, 2003; Chauvet, 2004). Am c - terminalen Abschnitt bildet Polycystin
einen Komplex mit dem Koaktivator P100 und STAT6, einem Regulator der
Transkription. Bei der proteolytischen Abspaltung des c – terminalen Endes,
unterliegt dieser Komplex einer Translokation zum Nukleus. Im weiteren Verlauf wird
die Transkription initiiert. Dieser Signalweg ist bei fehlendem oder defektem
Polycystin 1 hochreguliert, so kommt es zu einem Zellwachstum und zur Entstehung
von Zysten. (Low, 2006). Polycystin 1 ist in der Lage über seine coiled – coil Domäne
mit Polycystin 2 einen funktionellen Komplex zu bilden. Polycystin 2 ist ein wesentlich
kleineres Protein (107 kDa), mit sechs transmembranären Domänen. Sowohl der C wie auch der N - Terminus liegen bei Polycystin 2 intrazellulär. Polycystin 2 fungiert
als Calcium - permeabler Kationenkanal und wird kategorisch den TRP – Kanälen
(Transient Receptor Potential) zugeordnet (Mochizuki, 1996). TRP – Kanäle sind
zelluläre Ionenkanäle welche in sechs Unterfamilien gegliedert werden. In diversen
sensorischen Signalwegen spielen TRP – Kanäle eine wichtige Rolle (Ishimaru,
2006). Die TRPP Unterfamilie der Polycystine stellt eine eigene Untergruppe der
Familie der TRP - Kanäle dar.
-6Die Gliederung der TRP – Kanäle sieht folgendermaßen aus:

Klassische Untergruppe (TRPC)

Vanilloid-Rezeptor Untergruppe (TRPV)

Melastatin Untergruppe (TRPM)

Mucolipin Untergruppe (TRPML)

Polycystin Untergruppe (TRPP)

ANKTM1 (TRPA)
Die Gemeinsamkeit aller TRP- Kanäle ist, dass sie 6 transmembranäre Domänen
besitzen und für Kationen durchlässig sind. Polycystin 2 wird in der Systematik der
TRP – Kanäle auch als TRPP2 bezeichnet (Huang, 2004). Alle TRP – Kanäle
besitzen eine Sequenzhomologie von etwa 20 %. Innerhalb der Subfamilien sind
Homologien wesentlich häufiger. Polycystin 2 (TRPP2) zeigt eine große Ähnlichkeit
mit TRPC3 und TRPC6. Eine Homologie besteht zu den letzten sechs
transmembranären Domänen von PC 1 (TRPP1). Unlängst konnten zwei Mitglieder
der TRPP Untergruppe als Geschmacksrezeptoren für sauer identifiziert werden,
TRPP1L3 und TRPP2L1 (Huang, 2006; Ishimaru, 2006).
-7-
Abbildung 2: Systematik der TRP - Kanäle (modifiziert aus: Huang, 2004)
Hinsichtlich der polyzystischen Nierenerkrankung ist TRPV4 als ein Mitglied der
TRPV
Untergruppe
zu
erwähnen.
TRPV4
wird
in
den
verschiedenen
Tubulussegmenten unterschiedlich stark exprimiert. Das Verteilungsmuster ähnelt
dem von Polycystin 2 (Strotmann, 2000). Die Aktivierung des Kanals geschieht durch
Reize wie Wärme, Fettsäuren und Hypotonizität (Cohen, 2005). Unveröffentlichte
Daten aus dem Labor von Prof. Walz zeigen, dass TRPV4 mit Polycystin 2,
wahrscheinlich in Form von Heterotetrameren, interagiert. Eine funktionelle
Interaktion konnte sowohl genetisch in der Maus, als auch elektrophysiologisch im
Xenopus Oozyten nachgewiesen werden (Koettgen et al, Abstract ASN 2005).
-8-
1.2. ADPKD und die Rolle von Zilien
Zilien nehmen einen zentralen Stellenwert in der Pathogenese der polyzystischen
Nierenerkrankung ein (Yoder, 2007). Nahezu alle epithelialen Zellen besitzen ein
einzelnes Primärzilium (Praetorius, 2003). Diese fadenförmige Organelle, welche ca.
2 bis 10 µm aus der Apikalmembran der Epithelzelle herausragt, dient unter anderem
als Mechanosensor für Fließgeschwindigkeiten von Flüssigkeiten. Beim Abknicken
eines
Ziliums
von
kultivierten
Zellen
kommt
es
von
extrazellulär
zum
Calciumeinstrom, durch diesen wird ein intrazellulärer Calciumeinstrom ausgelöst
(Praetorius, 2001). Zilien sind von der Plasmamembran umgebene Strukturen, die im
Inneren das Axonem enthalten. Das Axonem besteht aus Mikrotubuli, die sich bei
beweglichen Zilien in einem speziellen 9 x 2 + 2 Muster anordnen. Dieses
charakteristische Muster entsteht durch die Bildung von Doppeltubuli (Duplet) von je
zwei Mikrotubuli. In der Mitte liegt ein Paar zentraler Tubuli. Das Primärzilium ist nicht
beweglich, ihm fehlt das zentrale Tubuluspaar; daher liegt ein 9 x 2 + 0 Muster vor.
Das Axonem ist mit dem Basalkörper (auch Kinetosom) der Zelle verankert. Vom
Basalkörper gehen so genannte Übergangs – Fasern aus, welche die Duplets mit der
Plasmamembran verbinden (Praetorius, 2003 Rosenbaum, 2002). Im Inneren der
Zilie existiert eine Transportmaschinerie, der sogenannte IFT (Intraflagellaren
Transport), welcher entlang der Mikrotubuli verläuft. Über IFT werden mit Hilfe der
Proteine Kinesin und Dynein große Proteinkomplexe (IFT Partikel) innerhalb des
Ziliums transportiert (Pazour, 2002; Rosenbaum, 2002). Kinesin transportiert Partikel
in Richtung der Zilienspitze, Dynein dagegen in Richtung Zellkörper. Ein korrekt
ablaufender IFT ist insbesondere für die Ziliogenese von großer Bedeutung. Ein
Beispiel hierfür stellt das Gen TG737 dar. Dieses Gen kodiert für das IFT Partikel
Protein 88. Protein 88 wird in Chlamydomonas reinardtii exprimiert, einer einzelligen
Grünalge mit zwei Flagellen. Im Mausmodell heißt das entsprechende Protein Polaris.
In Chlamydomonas führt die Mutation von IFT88 zum Verlust des Flagellums. Das
Gen TG737 beziehungsweise das Protein Polaris wurde in den 90er Jahren auch im
Mausmodell untersucht. Die ORPK Maus (Oak Ridge Polycystic Kidney Disease)
verdeutlicht den Zusammenhang zwischen pathologischer Zilienfunktion und
Nierenzysten. Die ORPK Maus ist durch ein hypomorphes Allel auf dem TG737
Locus gekennzeichnet (Moyer, 1994; Yoder, 1995). Phänotypisch weisen diese
Mäuse neben morphologisch verkürzten Zilien, polyzystische Nieren und einen situs
-9inversus auf. Cystin ist ein weiteres ziliäres Protein, welches im Fall einer Mutation
polyzystische Nieren verursachen kann. Cystin wurde im Mausmodell mit der CPK Maus (congenital polycystic kidney disease) identifiziert. Phänotypisch liegt bei der
CPK – Maus ein massiver Zystenbefall der Nieren und eine progrediente
Niereninsuffizienz vor, ähnlich zu ARPKD (Preminger, 1982; Fry, 1985, GuayWoodford, 2003). Ein weiteres ziliäres Protein, das eine zentrale Stellung in der
Beziehung von Zilien und Nierenzysten innehat, ist Inversin. Mutationen dieses
Proteins verursachen im Mausmodell Nephronophtise Typ II, eine rezessive
polyzystische Nierenerkrankung sowie einen situs inversus (Simons, 2005; Otto,
2003; Mochizuki, 1998). Die Entstehung eines situs inversus hat ihren Ursprung in
der Embryonalentwicklung. Bei Mausembryos konnte nachgewiesen werden, dass
hunderte von Monozilien im Embryonalknoten einen Fluss in Linksrichtung
generieren. Wenn dieser Linksfluss aufgrund ziliärer Dysfunktion gestört ist, kommt
es zu einer Links – Rechts Asymmetrie und im ausgeprägtesten Fall zu einem situs
inversus. (Ibanez-Tallon, 2003; Yamamoto, 2003; Nonaka, 2005). Vor einigen Jahren
konnten auch die für ADPKD verantwortlichen Proteine Polycystin 1 und Polycystin 2
im Primärzilium nachgewiesen werden (Yoder, 2002; Pazour, 2002). Man geht davon
aus, dass die beiden Proteine im Zilium einen Komplex bilden, wobei Polycystin 2 als
Calciumkanal für den ziliären Calcium - Einstrom verantwortlich ist (Nauli, 2003).
Polycystin 2 konnte allerdings auch intrazellulär am endoplasmatischen Reticulum
nachgewiesen werden (Qamar, 2007). Der Mechanismus, mit dem Polycystin 2 vom
ER zur Plasmamembran transportiert wird, konnte entschlüsselt werden. Hierbei
scheint ein Abschnitt im C-terminalen Ende von Polycystin 2 Ausschlag gebend zu
sein (Kottgen, 2005). So hat Polycystin 2 als Calciumkanal am ER eine weitere
bedeutsame Rolle inne. In Versuchen an Nierenepithelzellen konnte gezeigt werden,
dass
Polycystin 2
am
Calciumausstrom
aus
dem
ER
im
Rahmen
der
Inositoltriphosphat abhängigen ‚Calcium induzierten Calcium Freisetzung’ beteiligt ist.
(Koulen, 2002; Giamarchi, 2006). Im Folgenden soll jedoch die ziliäre Lokalisation
von Polycystin 2 im Mittelpunkt stehen. Die Frage, wie wichtig die Anwesenheit von
Polycystin 1 für die Funktionsfähigkeit des Calciumkanals Polycystin 2 ist, stellt
immer wieder den Inhalt verschiedener Forschungsprojekte dar. Die Arbeitsgruppe
um Stefan Somlo konnte vor kurzem feststellen, dass Polycystin 2 in der Lage ist,
unabhängig von Polycystin 1 ins Zilium zu gelangen (Geng, 2006). Diese
Beobachtung spricht dafür, dass Polycystin 1 für den Transport von Polycystin 2
- 10 entbehrlich ist. Die Frage, welche Bedeutung Polycystin 1 für die Funktionalität des
Kanalkomplexes hat, ist weiterhin unklar. (Delmas 2006; Koulen 2001; Cai, 1999).
1.3. Das Kidney Injury Molecule 1 (KIM 1)
1.3.1. Die Familie der TIM Proteine
Das Kidney Injury Molecule 1 (KIM 1) gehört zur Immunglobulin Gen Superfamilie
und wird der Familie der T – Zell Immunoglobulin Mucin Proteine (TIM Familie)
zugeordnet. Initial wurde es als Hepatitis A Virus zellulärer Rezeptor (HAVcr) kloniert
(Kaplan, 1996). Dieser Rezeptor nimmt das Hepatitis A Virus in die Zelle auf. In der
immunologischen Literatur wird HAVcr als TIM 1 bezeichnet (Kuchroo, 2003; Meyers,
2005). Die gesamte Familie gehört wiederum zu der Familie der cell adhesion
molecules: (CAM). In diese Gruppe gehören auch Selektine, Cadherine und Integrine.
Das Mucosal Adressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM 1) besitzt eine Struktur,
die den TIM Proteinen besonders ähnlich ist. Dieses Adhäsionsmolekül reguliert auf
der Schleimhaut den Eintritt von Lymphozyten (Briskin 1993). TIM 1 und 3 werden
auf TH1 - Zellen exprimiert und regulieren die durch T - Zellen initiierte Immunantwort.
KIM 1 interagiert mit KIM 4, welches sich strukturell vor allem intrazellulär von KIM 1
unterscheidet (Shakhov, 2004). Durch diese Interaktion kommt es zur Proliferation
und Differenzierung von TH2 - Zellen. Das für KIM 1 kodierende Gen liegt auf dem
Chromosomen Abschnitt 5q23-35. Auf dem gleichen Chromosomenabschnitt liegen
auch Gene für andere Mitglieder der TIM – Familie sowie für die IL2 – induzierbare TZell Kinase ITK (Graves, 2005). Der Chromosomen Abschnitt 5q33.3 wird mit der
Immunantwort sowie der Entstehung von Atopien, Ekzemen und Asthma in
Verbindung gebracht (Graves, 2005). Strukturell besitzen alle Mitglieder der TIM –
Familie
eine
Immunglobulin
Domäne,
eine
Mucin
Domäne
und
eine
transmembranäre Domäne sowie einen kurzen intrazellulären Abschnitt (Meyers,
2005; Graves, 2005; Kuehn, 2002). Die Immunglobulin Domäne ist einem V –
Immunglobulin ähnlich und besitzt 6 Cysteine. An der Mucin Domäne, die reich an
Threonin, Serin und Prolin ist, findet eine posttranslationale O-Glykosilierung statt.
- 11 -
1.3.2. Funktionelle Eigenschaften von KIM 1
Die KIM 1 Expression ist in dedifferenzierten Zellen sowie in replizierenden Zellen
stark
hochreguliert.
So
ist
KIM 1
in
der
Niere
nach
Ischämie,
beim
Nierenzellkarzinom und bei der zystischen Nierenerkrankung nachzuweisen. Hierbei
zeigt sich dieses Protein vor allem an der luminalen Seite der beschädigten Tubuli.
Die Menge von KIM 1 korreliert mit dem Ausmaß der Parenchymzerstörung der Niere
(van Timmeren, 2007). Im Mausmodell für ADPKD konnte die Hochregulation von
KIM 1 in einigen, wenn auch nicht in allen, Nierenzysten dargestellt werden (Kuehn,
2002). In Zellkulturen konnte beobachtet werden, dass der extrazelluläre Teil von
KIM 1 in Membrannähe abgespalten wird (Bailly, 2002). Abgespaltene KIM 1
Fragmente konnten auch im Urin von Patienten mit akuter tubulären Schäden
nachgewiesen werden (Han, 2002). Hierbei kann mit einer Quantifizierung von KIM 1
Fragmenten Aufschluss über das Ausmaß der Niernenschädigung gegeben werden,
da eine Korrelation besteht. Auch bei Patienten mit malignen Nierentumoren (RCC)
konnte das abgespaltene KIM 1 Fragment im Urin nachgewiesen werden. Daher
könnte KIM 1 als Marker für Tubulusschäden und sogar als früher Tumormarker in
Betracht kommen (Han, 2002; Bonventre, 2007; Bagshaw, 2007). Die physiologische
Funktion von KIM 1 in der Niere ist allerdings weiterhin unklar.
1.3.3 Molekulare Eigenschaften von KIM 1
Die Proteine KIM 1, KIM 2 und KIM 3 enthalten ein hoch konserviertes intrazelluläres
Tyrosinkinase Phosphorylierungsmotiv (Kuchroo, 2003). Humanes KIM 1 besitzt
diese hochkonservierte Tyrosindomänen im intrazellulären Teil an Position 350.
Diese konservierte Domäne konnten in verschiedenen Spezies nachgewiesen
werden (de Souza, 2005). Neueren Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zufolge,
ist das Tyrosin 350 im Gegensatz zu dem ebenfalls intrazellulär gelegenen Tyrosin
314
essentiell
wichtig
für
bestimmte
Interaktionen
und
darauf
folgende
Signaltransduktionen. Bei KIM 1 wird dieses Tyrosin über die induzierbare T – Zell
Kinase (ITK) phosphoryliert. Ist das Tyrosin an der Position 350 allerdings zu
Phenylalanin
mutiert,
findet
keine
Phosphorylierung
statt.
Die
Tyrosin
Phosphorylierung von KIM 1 führt dazu, dass Bindungsstellen für SH 2 Domänen von
Bindungspartnern wie p 85, einer regulatorischen Untereinheit der Phosphoinositol 3
- 12 Kinase, generiert werden. Die Tyrosin Phosphorylierung von KIM 2 ist von der
Bindung des transmembranären Proteins Semaphorin 4a abhängig (Kumanogoh,
2002). Diese Bindung ist wiederum für die TH1 Antwort verantwortlich (Kuchroo,
2003). KIM 2 ist bislang nur bei der Maus identifiziert worden. KIM 3 wird auf TH1
Zellen und wie man seit kurzem weiß, auch in epithelialen Geweben exprimiert
(Monney, 2002: 536-41; van de Weyer, 2006). KIM 3 besitzt ein hochkonserviertes
Tyrosin an Position 265, welches wie bei KIM 1 von der ITK phosphoryliert wird. Die
Phosphorylierung von KIM 3 ist von Galectin 9 abhängig. Galectin 9 ist der
physiologische Bindungspartner von KIM 3 und induziert die Apoptose von TH1
Zellen (Monney, 2002; Sabatos, 2003; Sanchez-Fueyo, 2003; van de Weyer, 2006).
In der Arbeitsgruppe um Wolfgang Kühn konnte endogenes KIM 1 in Kolokalisation
mit acetyliertem Tubulin mittels konfokaler Mikroskopie im Zilium von MDCK – Zellen
nachgewiesen werden. Auch in Tubuli von Mäusenieren war eine ziliäre Lokalisation
von KIM 1 nachweisbar. Hierbei wurde ein spezifischer Antikörper gegen den c –
Terminus von KIM 1 verwendet. Sowohl eine Mutation von KIM 1, welche nur die
ersten 343 Aminosäuren enthält, wie auch eine KIM 1 Version mit zu Phenylalanin
mutiertem Tyrosin, sind ebenfalls im Zilium nachweisbar. Dem Tyrosin 350 kommt
demnach keine Bedeutung bezüglich der Lokalisation im Zilium zu. Trotz der ziliären
Lokalisation konnte in Knock - Down Experimenten keine Beeinflussung der
Ziliogenese durch KIM 1 Depletion nachgewiesen werden. Wie in Kap 1.2.
beschrieben, reagieren Zilien von MDCK Zellen auf Abknicken mit einem kurzen
Calciumeinstrom (Praetorius, 2001; Praetorius, 2003; Davenport, 2005). Da KIM 1
ein ziliäres Protein ist, stellt sich die Frage, ob KIM 1 die mechanosensorische
Funktion der Zilien beeinflusst. Flusskammer Untersuchungen von MDCK Zellen mit
Expression von am Tyrosin 350 mutierten KIM 1 zeigten, dass bei derartigen Zellen
der für Flussbedingungen spezifischen, vorübergehenden Calciumstroms ausbleibt.
Bei der Kontrolle mit am Tyrosin 314 mutiertem KIM 1 kam es zu einem, dem Wildtyp
ähnlichen, Calciumeinstrom (Kotsis, 2007). Diesen Ergebnissen zufolge, scheint das
KIM 1 und vor allem das Tyrosin 350 eine wichtige Funktion im Bezug auf die ziliäre
Mechanosensorik zu haben.
- 13 -
1.4. Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit
Zilien funktionieren als epitheliale Flusssensoren an der apikalen Tubulusmembran.
Liegt eine ziliäre Dysfunktion vor, so ist dies entscheidend für die Entstehung von
Nierenzysten (Han, 2002). Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht das ziliäre
Molekül KIM 1. Da KIM 1 in Zystenepithelzellen bei der ADPKD hochreguliert ist und
die Überexpression von KIM 1 Mutanten mit defekter Tyrosinbindungsdomäne die
ziliäre Funktion als Flusssensor unterbindet, sollte die ziliäre Funktion von KIM 1
genauer untersucht werden.
Für KIM 1 war nicht bekannt
durch welche
intrazellulären Aminosäureresiduen die ziliäre Lokalisation determiniert ist. Das für
den ziliären Calcium Signalweg wichtige Tyrosin 350 hat keinen Einfluss auf die
Lokalisation von KIM 1 im Zilium. Das erste Ziel dieser Arbeit war es zu überprüfen,
ob der c-Terminus von KIM 1 Aminosäuremotive enthält, welche essentiell für die
Lokalisation im Zilium sind. Sowohl Polycystin 2 als auch KIM 1 sind am
flussinduzierten ziliären Calcium Signalweg beteiligt. Polycystin 2 fungiert hierbei als
Calcium Kanal. Daher sollte im Zuge dieser Arbeit überprüft werden, ob KIM 1 mit
Polycystin 2 interagiert. Zudem sollte KIM 1 auf weitere mögliche, im Zilium
lokalisierte Interaktionspartner, getestet werden.
- 14 -
2. Material und Methoden
2.1. Materialien und Lösungen
2.1.1. DNA-Technologien
DMSO:
Dimethylsulfoxide
PCR Puffer:
10x Ultra Pfu Puffer; Stratgene
Pfu Ultra DNA Polymerase:
Stratgene; 2,5 U/µl
dNTP Mix:
100 mM, Stratgene
Min Elute PCR Purification Kit:
Qiagen
Restriktionsenzyme:
New England Biolabs
Puffer für Restriktionsenzyme:
New England Biolabs
T4 DNA Ligase:
Fermentas
T4 DNA Ligase Puffer:
10x, Fermentas
Kompetenter Bakterienstamm:
E-Coli DH10
SOC Medium:
2 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt,
10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2,
20 mM Glukose
Plasmid Mini Kit:
Qiagen
LB Medium:
20 g LB auf 1000 ml H2O;
100 µg/ml Ampicillin;
0,25 µg/ml Tetrazyklin (Resistenz abhängig)
Maxiprep Lösung 1:
10 mM EDTA; pH 8,0
Maxiprep Lösung 2:
0,2 M NaOH/ 1 % SDS
Maxiprep Lösung 3:
5 M Kaliumazetat
2.1.2. Plasmide
pcDNA3 hKIM 1-F:
cDNA Sequenz des open reading frame von
humanem KIM 1. fusioniert mit
C - terminalem Flag
pcDNA3 hKIM 1-350YF-F:
Mutation von hKIM 1-F am Tyrosin 350
zu Phenylalanin
- 15 sIg 7 KIM 1-F:
zytoplasmatischer Teil von hKIM 1-F
fusioniert mit transmembranärer und
extrazellulärer Ig-Domäne
sIg 7 KIM-Y350-F:
Mutation von sIg 7 KIM 1-F am Tyrosin 350
plxsn hKIM 1-1-311-venus:
Trunkation von hKIM 1 in plxsn, enthält die
erste intrazelluläre Aminosäure von hKIM 1
plxsn hKim-1-1-322-venus:
Trunkation von hKIM 1 in plxsn, enthält die
ersten 12 intrazellulären Aminosäuren von
hKIM 1
plxsn hKim-1-1-343-venus:
Trunkation von hKIM 1 in plxsn, enthält die
ersten 33 intrazellulären Aminosäuren von
hKIM 1
plxsn hKim-1-1-316-venus:
Trunkation von hKIM 1 in plxsn, enthält die
ersten 6 intrazellulären Aminosäuren von
hKIM 1
Eine genauere Beschreibung dieser Trunkationen findet sich in Kap 3.1
plxsn sIg 7-Venus-hKIM 1:
intrazellulärer Teil vom hKIM 1, fusioniert mit
transmembranärer und extrazellulärer IgDomäne, mit Venus markiert.
pcDNA6 PC 2 V5:
PC 2 mit c – terminaler V5 - Markierung
pcDNA3 TRPV4 V5:
TRPV4 mit c – terminaler V5 - Markierung
2.1.3. Retrovirale Vektoren
plxsn:
retroviraler Leervektor
pMD-G:
retrovirales Hilfsplasmid: kodiert für
Virushülle
pMD-g/p:
kodiert für gruppenspezifische Antigene und
Polymerase
2.1.4. Zellkultur
HEK 293t:
Human Embryonic Kidney Zellen; Humane,
immortalisierte Zelllinie aus Embryonalnieren
- 16 MDCK:
Mardin Darby Canine Kidney Zellen;
immortalisierte
Epithelzelllinie,
aus
dem
distalen Tubulus von Hundenieren
DMEM:
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium;
Bio Whittaker; 4,5 g/l Glucose,
2,5 mM L-Glutamine; Zusatz von 10 %
fetalem Kälberserum (FBS)
HAMS:
DMEM F 12; Biochrom; Zusatz von 10 %
fetalem Kälberserum
PBS:
136 mM NaCl; 2,7 mM KCl;
8,1 mM Na2HPO4; 1,5 mM KH2PO4
Trypsin EDTA:
2,5 g/l Trypsin, 0, 38 g/l EDTA*4Na in
Hank`s Balanced Salt Solution
HEPES Puffer:
1 M, pH 7-7,6; Sigma
Polybrene:
Hexadimethrinbromid; Sigma
Geneticin:
50 mg/ml, Sigma
2.1.5 Transfektion
2xHEBS:
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonat)
mit pH 7,05; 50 mM Hepes; 280 mM NaCl;
10 mM KCl; 1,5 mM Na2HPO4;
12 mM Dextrose
Calciumchlorid:
0,25 M
2.1.6. Immunopräzipitation
PBS:
136 mM NaCl; 2,7 mM KCl;
8,1 mM Na2HPO4; 1,5 mM KH2PO4
IP Puffer:
1 % Triton X-100; 20 mM Tris (pH 7,5)
50 mM NaCl; 50 mM NaF; 15 mM Na4P2O7;
0,1 mM EDTA; 2 mM Na3VO4; 0,25 mM
PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid)
Complete Protease-Inhibitor-Tbl.
1 Tbl in 2 ml H2O (25x Stock); Roche
Protein G Beads:
Amersham
- 17 M2 Beads:
Sigma
2x Läemmli-Puffer:
Läemmli-Stammlösung:
125 ml
Tris
1M
pH 6,8; 20 g SDS; 100 ml Glycerol; 5 mg
Bromphenol Blau; 270 ml H20;
Gebrauchslösung: 900 μl Stammlösung plus
100 μl DTT (Dithiothreitol)
6x Läemmli-Puffer:
100 ml Tris 1 M pH 6,8; 48 g SDS; 200 ml
Glycerol; 50 mg Bromphenolblau;
100 ml β-Mercaptoethanol (14,7 M)
2.1.7 SDS-Gelelektrophorese und Immunoblot
Polyacrylamidgel:
Trenngelpuffer:
90 ml 2 M Tris HCl, 285 ml 2 M Tris Base
10 ml 20 % SDS, 115 ml H20; pH 8,8
Sammelgelpuffer:
121 ml 2 M Tris HCl, 4 ml 2 M Tris Base,
10 ml 20 % SDS, 365 ml H20
Laufpuffer:
191,8 mM Glycin; 3,5 mM SDS;
247,7 mM Tris Base
Transferpuffer:
24, 7 mM Tris Base; 3,5 mM SDS;
187,8 mM Glycin; 15 Vol % Methanol
Waschpuffer:
9 ml Tris pH 7.5; 18 ml 5 M NaCl;
0.9 ml Tween 20
- 18 BSA:
Bovines Serum Albumin; Sigma;
5% in Waschpuffer
Membran:
PolyScreen PVDF Transfer Membran;
Life Science
ECL:
enhanced chemiluminescence; Lösung A:
(100 mM Tris pH 8,5; 2,5 mM Luminol;
0,4 mM Coumarin in H20) Lösung B:
(100 mM Tris pH 8,5; 1,5 % H2O2 in H20)
Verhältnis 1:1
Film:
Fudji Medical X-Ray Film
Primärantikörper:
anti V5; monoclonal; Serotec (1:1000);
Anti Flag M2; monoclonal; Sigma (1:3000)
Sekundärantikörper:
anti mouse HRP; Dako (1:10000);
Anti human IgG HRP: (1:10000)
2.1.8. Immunfluoreszenz
PBS:
136 mM NaCl; 2,7 mM KCl;
8,1 mM Na2HPO4; 1,5 mM KH2PO4
Fixierlösung:
3 % Paraformaldehyd, 5 % Sucrose in PBS
Blockierlösung:
5 % Ziegenserum, 0,1 % Triton in PBS
Primärantikörper:
anti acetyliertes Tubulin; monoklonal;Sigma
Sekundärantikörper:
anti mouse Cy 3 (488 nm)
Hoechst Stain 33342:
Kernfärbung; Molecular Probes
ProLong-Antifade Kit:
Molecular Probes
- 19 -
2.2. Methoden
2.2.1 DNA Technologien und Klonierung
2.2.1.1 Ligation und Transformation
Für die Klonierung eines Plamides wurden sowohl der Vektor wie auch das Insert mit
den, in der Regel gleichen, Restriktionsenzymen verdaut. Das Insert wurde meist
mittels PCR aus einem bereits vorhandenen Plasmid gewonnen. Mit dieser Methode
konnten mit sequenzspezifischen Primern auch im Vergleich zum Orginalprotein
kürzere Proteinfragmente so genannte Trunkationen gewonnen werden. Nach einer
Gelelektophorese mit 1,5 % niedrig schmelzendem Nusieve - Gel, wurden die
verdauten und aufgetrennten DNA – Fragmente aus dem Gel ausgeschnitten. Diese
Gelstückchen wurden bei 70°C verflüssigt. Anschliessend erfolgte die zweistündige
Ligation nach Zugabe des Enzyms Ligase sowie des dazugehörigen Puffers und
Wasser bei Raumtemperatur. Im nächsten Schritt folgte die Transformation in den
Bakterienstamm E. coli DH10. Bei der Transformation wurde der Vektor in welchem
sich nun das gewünschte Insert befand von den kompetenten Bakterien internalisiert.
Es folgte die Ausplattierung der Bakterien auf eine mit Antibiotikum versetzte
Agarplatte. Über die Induktion des Resistenzgens des jeweiligen Vektors wurde
sichergestellt, dass sich lediglich Bakterien vermehren konnten, bei denen die
Transformation erfolgreich war.
2.2.1.2 Amplifikation
Nach erfolgter Klonierung wurden Einzelkolonien in 3 ml flüssigem LB - Medium mit
entsprechendem Antibiotikum über Nacht zu kleinvolumigen Kulturen, sogenannte
Minikulturen, angezogen. Aus diesen Bakterienkulturen wurde entweder nach
laboreigenem Minipräparations - Protokoll oder mit dem Qiagen® Plasmid Mini Kit
die Plasmid-DNA gewonnen. Eine dem Kontrollverdau, mit den zur Klonierung
verwendeten Restriktionsenzymen, folgende Gelelektrophorese zeigte, ob Vektor
und Insert die richtige Größe hatten.
Um die Menge an Plasmid DNA zu vermehren, wurden positive Minikulturen in einem
1 Liter-Ansatz über Nacht zu so genannten Maxikulturen angezogen. Die Bakterien
wurden abzentrifugiert. Es folgten mehrere Schritte welche die Zellen sowie
Zellbestandteile zerstörten und im letzten Schritt die Plasmid DNA freisetzen. Mittels
- 20 der Cäsiumchlorid - Ethidiumbromid - Methode erfolgte die auf einem Gradienten
beruhende Aufreinigung der Plasmid DNA. Ein positiver Kontrollverdau bestätigte
den Erfolg der Amplifikation. Die DNA-Konzentration wurde mittels Photometer
gemessen. Die Berechnung erfolgt nach folgender Formel:
C = A260 * V * 40 [µg/ml]
A= Absorption; V = Verdünnungsfaktor.
Um eventuelle Spontanmutationen ausschließen zu können, wurden alle PCR
klonierten Konstrukte sequenziert. Der Ansatz bestand aus DNA, Primer, BigDye-Mix
und H2O. Die Reaktion fand mit einem 26 zyklischen Programm im PCR-Cycler statt.
Die folgenden Arbeitsschritte wurden von der Sequencing Core Facility ausgeführt.
Diese Methode basiert auf der von F. Sanger im Jahr 1977 beschriebenen Methode
der Didesoxynukleotidterminationsmethode (Sanger, 1977).
2.2.3. Zellkultur
2.2.3.1 Subkultivierung von Zellen
Die zwei Zelllinien, HEK 293t und MDCK, wurden in einem befeuchteten, 37°C
warmen
und
mit
5%
CO2
begastem
Brutschrank,
sowie
in
10 cm
Gewebekulturschalen kultiviert. IMCD - Zellen wurden in HAMS Medium plus 10 %
FBS, die anderen beiden Zelllinien DMEM Medium plus 10% FBS kultiviert. Zur
Subkultivierung wurden die Zellen in der Regel alle zwei Tage passagiert. Dazu
wurden die Zellen nach dem Absaugen des alten Mediums sowie einem
Waschschritt mit sterilem, warmem PBS, mit 1 ml Trypsin bedeckt und zurück in den
Brutschrank gestellt. Nach ~ 10 Minuten konnten die Zellen mit frischem, sterilem,
warmen Medium aufgenommen, sanft resuspendiert und entsprechend dem
Passagierverhältnis auf neue Schalen verteilt werden. Die Wirkung des Trypsins
wurde durch die des FBS sofort neutralisiert. Um Kontaminationen zu vermeiden,
wurde unter einem sterilen Abzug und sterilen Bedingungen gearbeitet.
2.2.3.2. Herstellung stabil transfizierter Zelllinien
Alle stabil transfizierten Zelllinien, welche ein gewünschtes Protein exprimieren,
wurden mit Hilfe von Retroviren hergestellt. Als erstes wurde nach transienter
Transfektion in HEK293t Zellen Virus produziert. Am Vortag im Verhältnis 1:6
- 21 gesplittete 293t Zellen wurden mit 10 µg Expressionsplasmid + 7,5 µg pMD g/p +
2,5 µg pMD g gemischt mit 500 µl CaCl und 500 µl 2 x Hebs beträufelt. Diese
Methode der transienten Transfektion wurde bereits 1987 von Chen, C. & Okayama,
H (Chen, 1987). beschrieben. Nach acht Stunden konnte die Transfektion mit 8 ml
DMEM + 160 µl Hepes-Puffer gestoppt werden. drei Tage später wurde der
Überstand, d.h. das Medium welches sich auf den Zellen befand, gesammelt und
filtriert. Nach einer anschließenden vierstündigen Zentrifugation, entstand ein
Viruspellet, das in 3 ml DMEM reuspendiert wurde. Subkonfluente MDCK - Zellen
wurden mit diesem Viruskonzentrat und Polybrene an drei aufeinander folgenden
Tagen transduziert. Die Selektion der erfolgreich transfizierten Zellen erfolgte mit
Geneticin.
2.2.4. Immunfluoreszenz
Mit
Hilfe
von
fluoreszierenden,
an
den
Primärantikörper
bindenden
Sekundärantikörpern können intrazelluläre Proteine sichtbar gemacht werden. Das
Prinzip beruht auf der Erkennung von Epitopen auf dem Zielprotein durch den
Primärantikörper. Zellen wurden hierfür auf sterile Glasplättchen in einer 6-well-Platte
ausgesät und über variable Zeiträume kultiviert. Die Zellen auf den Glasplättchen
wurden mit PBS gewaschen und anschließend mit einer PFA - haltigen Lösung fixiert.
Nach weiteren Waschschritten erfolgte eine Permeabilisierung mit einer Triton haltigen Lösung. Die Inkubation mit dem Primärantikörper erfolgte für eine Stunde bei
Raumtemperatur
und
vorgegebener
Verdünnung
(s.
Kap
2.1.8.).
Zum
Sekundärantikörper wurde immer Hoechst 33342 in einer 1:1000 Verdünnung zur
Kernfärbung hinzugefügt. Die Inkubation dauerte eine halbe Stunde. Abschließend
wurde das Glasplättchen, mit der Zellseite nach unten und einem Tropfen Antifade®,
welches das Ausbleichen verhindert, fixiert. Die Analyse erfolgte unter einem Epi Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axioplan 2) mit Hilfe eines Zeiss Plan Neofluar 63x/1.2
Ölobjektivs.
2.2.5. Konfokale Mikroskopie
MDCK SIg 7 KIM 1 Venus Zellen sowie die Venus – markierten KIM-1 Trunkationen
wurden unter Lebendbedingungen, mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die
Mikroskopie von lebenden Zellen eignet sich besonders gut für die Untersuchung von
- 22 Zilien. Für diese Art der Mikroskopie werden lebende Zellen in eine spezielle
Kammer gesetzt und mit Ringerlösung umspült. Ein Plan Neofluar 100 / 1.3
Ölobjektiv (LSM 510 Meta, Carl Zeiss GmbH, AIM, Jena) wurde für die Betrachtung
der Zellen eingesetzt. Das fluoreszierende Molekül Venus (eine Variante des Yellow
Fluorescent Protein YFP) wurde mit 514 nm angeregt. Um die Emission wurde mit
Hilfe des Meta – Detektor aufgenommen. Die Analyse der Bilder wurde mit der LSM
5 Software durchgeführt. Die Bildbearbeitung erfolgte mit dem Photoshop 7.01 von
Adobe.
2.2.6. Koimmunopräzipitation
Um beurteilen zu können, ob zwei Proteine miteinander interagieren, bedient man
sich des Verfahrens der Koimmunopräzipitation. Hierbei wurden HEK293t Zellen mit
je 4,5 µg der beiden im Interesse stehenden Plasmide, nach der oben beschriebenen
Methode transient transfiziert. Nach zwei bis drei Tagen wurden die Zellen mit
eiskaltem PBS geerntet. Die Lyse erfolgte für eine halbe Stunde mit Proteaseinhibitor
- haltigem IP-Puffer. Nach einem Zentrifugationsschritt, wurden 50 µl proteinreiches
Lysat abgenommen und mit 10 µl 6x Lämmli versetzt. die Lysate inkubierten für
10 Minuten im 37°C Heizblock. Die restlichen 950 µl wurden mit Beads versetzt. Für
die Versuche in denen hKIM 1.F präzipitiert werden sollte, fanden M2 Beads
Verwendung. Bei M2 Beads ist der anti - Flag Antikörper kovalent an
Agarosekügelchen gebunden, daher sind diese Beads in der Lage Flag - makierte
Proteine direkt zu präzipitieren. Für die Versuche mit sIg 7 / sIg 7 KIM 1 wurde mit
Protein G Beads gearbeitet. Protein G Beads können an den Fc-Teil von
verschiedenen Immunglobulinen binden und sind daher ideal für die sIg 7 Konstrukte.
Die Beads wurden eine Stunde langsam bei 4°C über – Kopf - geschüttelt. Nach
mehreren Waschschritten wurden die an die Beads gekoppelten Proteine mit 2x
Läemmli versetzt und bei 95°C für 5 Minuten denaturiert.
2.2.7. SDS Polyacrylamid-Gelelktrophorese und Immunoblot
Ein
Proteingemisch
mit
Proteinen
verschiedener
Größe
kann
mittels
Gelelektrophorese aufgetrennt werden. Dies geschieht unter denaturierenden
Bedingungen in einem SDS haltigen Gel. Die Gele bestanden aus zwei Phasen,
wobei die Proben (10 bis 20 µl) in die Taschen des Sammelgels pipettiert wurden
- 23 und 30 Minuten bei 70 Volt durch dieses hindurch wanderten. Das Trenngel wurde
bei einer anliegenden Stromstärke von 20 mA über einen Zeitraum von zwei Stunden
durchwandert.
Nach der Elektrophorese wurden die Proteine mit dem so genannten semi-dryVerfahren auf eine PVDF-Membran transferiert. Bevor die Membran mit dem
Primärantikörper
inkubiert
werden
konnte,
wurden
sämtliche
unspezifische
Bindungsstellen mit BSA abgesättigt. Der Primärantikörper wurde für mindestens
eine Stunde, der Sekundärantikörper für eine halbe Stunde mit der Membran
inkubiert. Zwischenzeitlich wurden mit Waschpuffer die nötigen Waschschritte
durchgeführt. Der Sekundärantiköper ist gegen den Fc-Teil des Primärantikörper
gerichtet und an die Meerettichperoxidase (HRP engl: horse radich peroxidase)
gekoppelt. Die Visualisierung ist HRP und Luminol abhängig. Luminol führt in
Anwesenheit
bestimmter
Katalysatoren
zur
Chemolumineszenz.
Um
die
Lichtemission sichtbar machen zu können, wurden die ECL-Lösungen auf der
Membran gemischt. Anschließend wurde die Membran in einer Kassette unter den
Röntgenfilm gelegt und mehrere Sekunden belichtet.
- 24 -
3. Ergebnisse
3.1.Die Zilienlokalisation von KIM 1 ist abhängig von der zytoplasmatischen
Domäne
3.3.1. Generierung von KIM 1 Trunkationen
KIM 1 ist ein transmembranäres Zilienprotein. Zilien spielen eine wichtige Rolle für
die Zellpolarität. Liegt eine Ziliendysfunktion, z.B. durch gestörten intraflagellaren
Transportvor, so kann dies zu Zystennieren und anderen schwerwiegenden Schäden
führen. Diese Tatsache warf die Frage auf, welche Lokalisationssequenzen den
Transport von KIM 1 in das ziliäre Kompartiment steuern. Es ist bereits bekannt, dass
der ziliär lokalisierte Rezeptor des Sonic Hedgehog Signalweges, Smoothened eine
ziliäre Lokalisationssequenz aus Tryptophan und Arginin (WR) im membrannahen Cterminalen Anteil besitzt (Corbit, 2005). Allerdings konnte bei KIM 1 bislang kein
ähnliches Motiv entdeckt werden. Um untersuchen zu können, welcher Teil der
zytoplasmatischen Domäne von KIM 1 für die Lokalisation im Primärzilium eine
wichtige Rolle spielt, wurden am c - terminalen, intrazellulären Ende gekürzte
Proteinfragmente, so genannte Trunkationen generiert. Hierbei handelt es sich im
Speziellen um die retroviralen Konstrukte: plxsn.hKIM 1-1-311.venus (Terminierung
an der ersten intrazellulären Aminosäure), plxsn.hKIM 1-1-316.venus (enthält die
ersten sechs intrazelluläre Aminosäuren) und plxsn.hKIM 1-1-322.venus (enthält die
ersten 12 intrazellulären Aminosäuren), sowie plxsn.hKIM 1-1-343.venus (enthält die
ersten 33 intrazellulären Aminosäuren). Der intrazelluläre Anteil von KIM 1 umfasst
gesamt folgende 49 Aminosäuren:
AKKYFFKKEV QQLSVSFSSL QIKALQNAVE KEVQAEDNIY IENSLYATD
Daraus ergibt sich für die Trunkationen folgende Aminosäuresequenz für die
intrazelluläre Domäne:

plxsn.hKIM 1-1-311.venus: A

plxsn.hKIM 1-1-316.venus: AKKYFF

plxsn.hKIM 1-1-322.venus: AKKYFFKKEV QQ

plxsn.hKIM 1-1-343.venus: AKKYFFKKEV QQLSVSFSSL QIKALQNAVE KEV
- 25 -
Alle diese Konstrukte waren C - terminal mit Venus gekoppelt, einem modifizierten
Yellow Fluorescent Protein (YFP), um sie sichtbar machen zu können. MDCK –
Zellen, die diese Konstrukte nach retroviraler Transduktion stabil exprimierten,
wurden bis zum Zilienstadium kultiviert und unter Lebendbedingungen mittels
konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Analyse unter Lebendbedingungen erleichtert
die Aufnahme der Zilien, da sie im Gegensatz zum fixierten Material senkrecht nach
oben stehen. Auf diese Weise konnten die Zellen und die Lokalisation des jeweiligen
KIM 1 - Konstruktes dreidimensional dargestellt werden. Bei allen unten abgebildeten,
mittels konfokaler Mikroskopie hergestellten Zilienbildern gibt es drei Versionen pro
Konstrukt. Als erstes wird ein durchlichtoptisch erzeugtes DIC Bild (engl: Diferential
Interference Contrast) erstellt. Damit können Zellstrukturen wie das Zilium erkannt
werden und plastisch dargestellt werden. Das zweite Bild zeigt das mit Venus
markierte Konstrukt. Dieses erscheint grün im Bild. Das dritte Bild entsteht durch eine
Überlagerung der ersten beiden Bilder und vermittelt somit einen Eindruck über die
Verteilung des Konstruktes in der Zelle.
3.1.2 Die ersten sechs intrazellulären Aminosäuren bestimmen die Membranund Zilienlokalisation von KIM 1
Das zelluläre Verteilungsmuster der längsten KIM 1 Trunkation hKIM 1-1-343, welche
die ersten 33 intrazellulären Aminosäuren enthält, wurde als erstes mikroskopisch
untersucht. Dieses Konstrukt zeigt eine Verteilung, die sich streng auf die apikale
Zellmembran und auf das Zilium beschränkt. Weder an der lateralen noch an der
basalen Zellseite sind fluoreszierende Signale dieser KIM 1 Trunkation zu sehen.
Dieses Verteilungsmuster entspricht der ziliären und membranären Verteilung von
KIM 1 Wildtyp (Abb.3).
- 26 a)
b)
c)
d)
Abbildung 3: a) hKIM 1-1-343.venus exprimierende MDCK Zellen, konfokal mikroskopiert,
gezeigt sind die x/y, x/z und y/z – Felder; b) DIC – Aufnahme des x/z – Feldes; c) hKIM 1-1343.venus; d) Überlagerungsbild; Der rote Pfeil markiert das Zilium.
Die Trunkation hKIM 1-1-322 unterscheidet sich hinsichtlich ihrer Verteilung in der
Zelle von KIM 1 Wildtyp und der Trunkation plxsn hKIM 1-1-343 venus. Das
Konstrukt ist nicht nur an der apikalen Zellmembran und in den Zilien lokalisiert,
sondern auch an der lateralen Zellmembran (Abb4).
- 27 -
a)
c)
b)
d)
e)
f)
Abbildung 4: a) hKIM 1-1-322 venus exprimierende MDCK Zellen, Übersicht über konfluente
Zellen, venus; b) Ausschnitt, vergrößert, venus; c) DIC Aufnahme der z – Achse; d) venus; e)
Überlagerungsbild; f) Vergleichsbild KIM wt nach 8 Tagen. Der rote Pfeil markiert das Zilium.
Der blaue Pfeil markiert die laterale Zellmembran.
Eine laterale Lokalisation von Wildtyp KIM 1 wird im zilientragenden Stadium nicht
beobachtet (Abb. 5F) und zeigt somit, dass diese Trunkation veränderte
Eigenschaften im Vergleich zum Wildtyp aufweist. Eine laterale Lokalisation des
Konstrukts könnte auch ein Hinweis für eine veränderte Zellpolarität dieser Zellen
sein, dagegen spricht allerdings die ungestörte Ziliogenese. Die ersten 12
intrazellulären Aminosäuren reichen diesem Ergebnis zufolge nicht aus, um eine
korrekte apikale und ziliäre Lokalisation des Proteins zu determinieren.
- 28 Die kürzeste der vier Trunkationen, hKIM 1-1-311, enthält lediglich die erste
intrazelluläre Aminosäure, ein Alanin. Hier zeigt sich ein vollkommen verändertes
zelluläres Verteilungsmuster (Abb 5).
a)
a)
b)
c)
Abbildung 5: a) hKIM 1-1-311.venus exprimierende MDCK Zellen, Übersicht; b) DIC Aufnahme
der x/z – Ebene; c) venus; d) Überlappung; Der rote Pfeil markiert das Zilium.
Es zeigt sich eine diffuse Verteilung in der Zelle, jedoch keine membrannahe oder
ziliäre Lokalisation des Konstruktes. Die erste intrazelluläre Aminosäure ist demnach
nicht alleine in der Lage eine für KIM 1 Wildtyp typische, apikale und ziliäre
Verteilung in der Zelle zu schaffen. Wiederum eine apikale, laterale, und ziliäre
Lokalisation ist bei der Trunkation hKIM 1-1-316 zu beobachten. Die Trunkation,
welche die ersten sechs intrazellulären Aminosäuren enthält, ist in der Lage ein
ähnliches Verteilungsmuster wie die Trunkation plxsn hKIM 1-1-322 venus mit den
ersten 12 Aminosäuren zu generieren (Abb 6).
- 29 -
a)
b)
a)
b)
c)
Abbildung 6: a) hKIM 1-1-316 .venus exprimierend MDCK Zellen Übersicht, venus; b)
Ausschnitt, vergrößert, venus, c) DIC Aufnahme der z – Achse; d) venus; e) Überlagerungsbild;
Der rote Pfeil markiert das Zilium, der blaue die laterale Zellmembran
Die Summe dieser Beobachtungen zeigt, dass mit zunehmender Kürzung des
intrazellulären Teiles von KIM 1, eine Ungenauigkeit bezüglich des apikalen und
ziliären Verteilungsmusters auftritt. Die ziliäre Lokalisation scheint eng mit einem
Vorhandensein des Konstruktes an der apikalen Zellmembran gekoppelt zu sein. Der
deutliche Unterschied der Verteilungsmuster zwischen plxsn hKIM 1-1-311 venus
und
plxsn
hKIM 1-1-316
venus
zeigt,
dass
innerhalb
der
ersten
sechs
membrannahen Aminosäuren die Sequenz für die membranäre und ziliäre
Lokalisation enthalten sein muss.
- 30 -
3.1.3 Der intrazelluläre Teil von KIM 1 ist in der Lage ein membran-verankertes
Fusionsprotein in das Zilium zu lokalisieren.
Um zu eruieren, ob die Extrazellulärdomäne von KIM 1 für die ziliäre Lokalisation
wichtig ist, wurde der intrazelluläre Teil von KIM 1 mit einem unverwandten
Transmembranmolekül fusioniert. Hierfür wurde das Fusionsprotein sIg 7 verwendet.
Dieses Konstrukt kodiert für eine membranverankerte Fc - Domäne von humanem
IgG. Die intrazelluläre KIM 1 Domäne ist wie in den KIM 1-venus Konstrukten C terminal mit venus fusioniert. Die Fusion mit venus diente in diesem Fall erneut der
Auswertung unter Lebendbedingungen. MDCK - Zellen wurden mit diesem Konstrukt
stabil transduziert und im zilientragenden Stadium unter dem konfokalen Mikroskop
analysiert. Wie in der Abbildung 7 zu sehen, ist dieses Konstrukt ebenfalls in der Zilie
lokalisiert. Das Protein sIg 7KIM 1 enthält nur die intrazelluläre Domäne von KIM 1.
Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass diese Domäne alleine für die ziliäre
Lokalisation entscheidend ist.
a)
b)
c)
Abbildung 7: sIg 7.KIM 1.venus exprimierend MDCK Zellen a) DIC Aufnahme der z – Achse; b)
venus; c) Überlagerungsbild; Der rote Pfeil markiert das Zilium
- 31 -
3.2 Interaktion von KIM 1 und Polycystin 2
3.2.1 SIg 7 KIM 1 interagiert mit PC 2 V5 in zilientragenden HEK 293t Zellen
KIM 1 ist ein ziliäres Protein mit einer Rezeptor Struktur. Flusskammerversuche mit
KIM 1-venus exprimierenden Zellen weisen darauf hin, dass KIM 1 eine Rolle in der
ziliären Funktion des Flusssensors spielt. Bisher ist bekannt, dass diese Funktion
durch einen mechanosensorischen Komplex vermittelt wird, der aus Polycystin 1 und
2 besteht (Nauli, 2003). Basierend auf diesen Beobachtungen stellte sich die Frage,
ob KIM 1 Teil dieses Komplexes ist. Für die geplanten Versuche war es von großer
Bedeutung, dass die verwendeten Zellen Zilien tragen. Um dies vorab sicherstellen
zu können, wurden HEK 293t Zellen in einer Versuchsreihe auf Zilien untersucht.
HEK 293t Zellen sind für Interaktionsstudien sehr gut geeignet, da sie sich
unkompliziert und schnell kultivieren lassen und effizient mit der Calciummethode
transfizierbar sind. Für die Versuchsreihe wurden die Zellen über mehrere Tage
kultiviert und mittels Immunfluoreszenz im Zeitverlauf auf Zilienentwicklung überprüft.
Bei der Immunfluoreszens wurden die zytoskelettalen Bestandteile mit acetyliertem
Tubulin angefärbt. Bei der mikroskopischen Auswertung (Abb.8) waren eindeutig
Zilien zu sehen.
- 32 a)
b)
c)
Abbildung 8: HEK 293t Zellen a) anti acetyliertes Tubulin; b)Dapi; c)Überlagerungsbild; Der
Antikörper gegen acetyliertes Tubulin (rot) markiert die Zilien (Pfeil)
Da HEK 293t Zellen den oben beschriebenen Ergebnissen zufolge die Fähigkeit zur
Zilienbildung besitzen, wurden die Interaktionen zwischen KIM 1 und PC 2 in diesen
Zellen getestet. Intial wurde die Interaktion mit dem sIg 7.KIM 1 Konstrukt getestet,
da es sich sehr gut mit Protein G präzipitieren lässt. Dieses Konstrukt codiert für die
wichtige intrazelluläre Domäne von KIM 1 mit seiner darin enthaltenen konservierten
Tyrosin Bindungsstelle. Die Versuche wurden mittels Transfektion von sIg 7.KIM 1
und PC 2.V5, welches für Polycystin 2 in voller Länge kodiert und c - terminal mit V5
markiert ist in HEK 293T Zellen durchgeführt. Nach drei Tagen wurden die Zellen
geerntet. Nach Koimmunopräzipitation und Western Blot zeigte sich im Ansatz mit
sIg 7.KIM eine Bande bei 107 kDa für PC 2.V5.
- 33 PC 2 V5
150
Präzipitate
150
Lysate
Anti - Ig
Lysate
100
sIg 7
sIg 7 KIM 1
Abbildung 9: Western Blot der Koimmunopräzipitation sIg 7 KIM 1 und PC 2 V5, Kontrolle sIg 7
Leervektor plus PC 2 V5
Der Kontrollansatz mit dem sIg 7 Leervektor zeigte keine entsprechende Bande. In
den Lysaten zeigte sich für beide Ansätze eine annähernd gleiche Konzentration von
PC 2.V5. Auch die sIg 7 Konstrukte waren im Kontroll Blot mit humanem IgG gleich
stark exprimiert. Aus diesem Ergebnis lässt sich ableiten, dass der intrazelluläre
Schwanz von KIM 1 mit PC 2 einen Komplex bildet. Da diese Interaktion in
zilientragenden
Zellen
nachgewiesen
werden
konnte
und
da
beide
Interaktionspartner im Zilium lokalisiert sind, ist es möglich, dass diese Interaktion im
Zilium stattfindet.
- 34 -
3.2.2. KIM 1 interagiert mit PC 2 V5
In einem weiteren Versuch sollte überprüft werden, ob full length KIM 1.F mit
PC 2.V5 interagiert. KIM 1.F codiert für humanes KIM in voller Länge mit c terminalem Flag. Durch diesen Versuch sollte die Möglichkeit ausgeschlossen
werden, dass im Versuch 3.2.1 die sIg 7 Domäne die Interaktion mit PC 2 beeinflusst
hat. Für dieses Experiment wurden erneut HEK 293t Zellen transient transfiziert, mit
M2 Beads koimmunopräzipitiert sowie per Gelelektrophorese und Western Blot
analysiert. Die verwendeten M2 Beads binden an die Flag Markierung und
präzipitieren dadurch das KIM 1 Konstrukt. Im Western Blot wurde mit dem anti V5
Antikörper PC 2.V5 im KIM 1.F Präzipitat detektiert und es ist, wie im Versuch mit
sIg 7 KIM 1 eine gut sichtbare Bande bei 107 kDa zu erkennen (Abb 10). Kontrolliert
wurde in diesem Versuch mit Flag markiertem GFP, dort zeigte sich keine Interaktion.
Die Expressionskontrolle bezüglich KIM 1 wurde mit anti Flag (M2) Antikörper
durchgeführt
- 35 PC 2 V5
150
Präzipitate
150
Lysate
Anti - Flag
100
Lysate
25
F.GFP
KIM 1.F
Abbildung 10: Western Blot der Koimmunopräzipitation von KIM 1.F plus PC 2.V5. In der
Expressionskontrolle liegt KIM 1 in zwei Banden vor, die obere ist stärker glykosiliert
- 36 -
3.2.3 KIM Y 350.F interagiert nicht mit PC 2V5
Das konservierte Tyrosin 350 in der zytoplasmatischen Domäne von KIM 1, hat eine
wichtige Funktion im ziliären Flusssensor. Expression einer Mutante, bei der Tyrosin
350 zu Phenylalanin mutiert ist, unterbindet die flussinduzierte Calciumantwort.
Daher stellte sich die Frage ob die Y350 F Mutation die Interaktion zwischen KIM 1
und Polycystin 2 aufhebt. Eine mögliche Interaktion zwischen Flag markiertem
KIM 1.Y350 F und PC 2.V5 wurde abermals mittels Koimmunopräzipitation überprüft.
Für die Positivkontrolle wurde KIM 1.F eingesetzt. Als Negativkontrolle diente Flag
markiertes GFP. Die Expressionskontrolle wurde mit einem anti Flag (M2) Antikörper
durchgeführt. Abbildung 11 zeigt dass keine mit der Positivkontrolle vergleichbare
Interaktion nachzuweisen ist. Die Probe gleicht der Negativkontrolle. Diese Tatsache
bestärkt die Hypothese dass dem Tyrosin 350 eine Schlüsselstellung innerhalb des
KIM 1 Proteins zukommt. Es scheint die Interaktionsfähigkeit modifizieren zu können
und ist somit in der Lage die Eigenschaften von KIM 1 durch Phosphorylierung zu
verändern.
- 37 PC 2 V5
Präzipitate
150
Lysate
150
Anti - Flag
100
Lysate
25
F.GFP
KIM 1 Y350 F
KIM 1.F
Abbildung 11: Western Blot der Koimmunopräzipitation KIM 1.Y350 F mit PC 2.V5 (zweite Bahn),
Positivkontrolle wildtyp KIM 1 plus PC 2.V5 (erste Bahn), Negativkontrolle F.GFP plus PC 2.V5
(dritte Bahn). Die Lysate sind in der gleichen Reihenfolge. Die Expressionskontrolle von KIM 1.
F.GFP ist nicht dargestellt.
- 38 -
3.3 Weitere Interaktionspartner von KIM 1
3.3.1 TRPV4 interagiert mit KIM 1
TRPV4, ein Mitglied der Familie der TRP - Kanäle, (Transient Recptor Potential) zu
der auch Polycystin 2 gehört (TRPP2), konnte ebenfalls als neuer Interaktionspartner
für KIM 1 identifiziert werden. Das Konstrukt TRPV4.V5 kodiert für einen nicht selektiven Ionenkanal, der sowohl mechanosensorische als auch osmosensitive
Eigenschaften hat und der mit PC 2 interagiert (s. Kap.1.1.2). Auch in diesem
Versuch wurden Zellen transient transfiziert, koimmunopräzipitiert und mittels SDSPage und Western Blot analysiert. Im ersten Teil wurde eine mögliche Interaktion von
TRPV4.V5 mit sIg 7.KIM überprüft. Hierzu wurde sIg 7 KIM mit Protein G präzipitiert,
im Western Blot detektierte ein V5 Antikörper das V5 markierte TRPV4.
TRPV4 V5
150
Präzipitate
150
Lysate
Anti Ig
Lysate
100
sIg 7 KIM 1
sIg 7
Abbildung 12: Western Blot der Koimmunopräzipitation sIg 7 KIM 1 mit TRPV4 V5
- 39 Der Re - Blot mit anti humanem IgG diente als Expressionskontrolle für sIg 7. Die
Negativkontrolle wurde mit dem sIg 7 Leervektor plus TRPV4.V5 durchgeführt. Im
Western Blot war eine deutliche Interaktion von sIg 7.KIM 1 und TRPV4.V5 im
Vergleich zur Kontrolle mit dem sIg 7 Leervektor zu sehen. Um die Interaktion zu
verifizieren, wurde der gleiche Versuch statt mit sIg 7 KIM mit Flag markiertem KIM 1
durchgeführt.
KIM 1.F
F.GFP
150
Präzipitate
150
Lysate
Anti Flag
100
Lysate
25
TPV4 V5+F.GFP
PC 2 V5+ KIM 1.F
TRPV4 V5+KIM 1.F
Abbildung 13: Western Blot der Koimmunopräzipitation KIM 1.F mit TRPV4.V5 (erste Bahn),
Positivkontrolle KIM 1.F plus PC 2.V5 (zweite Bahn), Negativkontrolle F.GFP plus TRPV4.V5
(dritte Bahn). Die Expressionskontrolle von KIM 1. F.GFP ist nicht dargestellt
- 40 -
Für die Präzipitation von KIM 1.Flag wurden wie im vorherigen Versuch M2- Beads
eingesetzt. Die Expressionskontrolle wurde bei diesem Versuch mit dem M2
Antikörper durchgeführt. Als Positivkontrolle diente die Interaktion zwischen
KIM 1.Flag und PC 2.V5, die Negativkontrolle war Flag – GFP plus TRPV4.V5. In
Abb. 14 ist eine sehr starke Kopräzipitation von KIM 1.F mit TRPV4.V5 zu sehen,
was auf eine Interaktion der beiden Moleküle schließen lässt. Da TRPV4 wie auch
KIM 1 unter anderem auch im Zilium lokalisiert ist, liegt die Vermutung nahe, dass die
Interaktion der beiden Moleküle im Zilium stattfindet.
- 41 -
4. Diskussion und Ausblick
4.1. Die Intrazellulärdomäne von KIM 1 in Bezug auf seine ziliäre Lokalisation
Zilien und ihre Bedeutung für die Entstehung von Krankheiten sind in den letzten
Jahren zunehmend Gegenstand intensiver Forschung (Davenport, 2005). So
konnten in den letzten Jahren eine Vielzahl krankheitsrelevanter Proteine im Zilium
nachgewiesen werden. Die Zilie agiert als Flusssensor wobei die Biegung des
Ziliums durch einen Flüssigkeitsstrom einen intrazellulären Calciumanstieg hervorruft.
Zudem ist das Zilium nachweisbar in diverse Signalwege involviert (Bisgrove, 2006).
Zu diesen Signalwegen, gehören unter anderem der Sonic Hedghog Signalweg,
sowie der Wnt Signalweg, der in der Form des non – canonical Wnt Signalweg
wiederum mit der planaren Zell Polarität (PCP) in Verbindung steht (Haycraft, 2005;
Corbit, 2005; Park, 2005). Die polyzystische Nierenerkrankung steht in einem
direkten Zusammenhang mit der Dysfunktion ziliär lokalisierter Proteine (s. Kap 1.2).
Die für die autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung verantwortlichen
Proteine Polycystin 1 und Polycystin 2 konnten im Jahr 2002 erstmalig im Zilium
dargestellt werden (Pazour, 2002). Beide Proteine sind für die ziliäre Flussantwort
notwendig. Neben Fibrocystin dem PKHD1 Genprodukt, welches bei der autosomal
rezessiven polycystischen Nierenerkrankung mutiert ist, stellt KIM 1 ein weiteres
Protein dar, welches eine Rolle in der ziliären Flussantwort spielt (Kotsis, 2007).
KIM 1 ist ein ziliäres Protein, dessen Expression in Nierenzysten hochreguliert ist,
während die Überexpression von KIM 1 Mutanten mit defektem Tyrosin 350 die
ziliäre Flussantwort unterbindet. Diese Beobachtungen legen eine wichtige
physiologische Funktion von KIM 1 im Zilium nahe. In dieser Arbeit wurde die
Bedeutung intrazellulärer Residuen von KIM 1 für seine ziliäre Funktion untersucht.
Im Speziellen wurden in der vorliegenden Arbeit Versuche hinsichtlich der ziliären
Lokalisation sowie eines vermuteten gemeinsamen Signalwegs von Polycystin 2 und
KIM 1 gemacht. Fluoreszenz gekoppeltes überexprimiertes KIM 1 konnte schon vor
geraumer Zeit im Zilium von MDCK Zellen (Kotsis, 2007) nachgewiesen werden.
Dieser
Ansatz
eignet
sich
für
die
Untersuchung
der
Lokalisation
von
fluoreszenzmarkierten KIM 1 Mutanten. Die Frage nach der ziliären Lokalisation und
die
daraufhin
durchgeführten
Versuche
deuteten
auf
die
Wichtigkeit
der
intrazellulären Domäne hin. Mit Hilfe der in Kap 3.3.1 und 3.3.2 beschriebenen
Versuche konnte gezeigt werden, dass der intrazelluläre Teil von KIM 1. für die
- 42 Lokalisierung in der ziliären und der apikalen Membran essentiell wichtig ist. Dabei
zeigte sich auch, dass der Transport von KIM 1 in das Zilium eng mit der Lokalisation
an der Plasmamembran vergesellschaftet ist. Ist der intrazelluläre Teil von KIM 1 mit
sIg 7 gekoppelt, so zeigen mit diesem Konstrukt transfizierte MDCK Zellen eine
ziliäre Lokalisation von sIg 7.KIM 1. Daraus kann geschlossen werden, dass die
KIM 1-Intrazellulärdomäne alleine die ziliäre Lokalisation ermöglicht und die
extrazellulär gelegene Muzin und Ig-Domäne diesbezüglich keine Rolle spielen. Die
in Kap 3.3.1 untersuchten KIM 1 Trunkationen waren so konzipiert, dass sie
entweder nur die erste Aminosäure enthielten, die ersten sechs Aminosäuren
inklusive des konservierten Tyrosin 314, die ersten 12 Aminosäuren inklusive des
konservierten basischen Doublets Lysin 317 und - 18 oder die ersten 32
Aminosäuren inklusive des konservierten Serin 324 und des Clusters LQNA 335-8
(Leucin-Glutamin-Asparagin-Alanin) (Abb. 14).
Abbildung 14: Intrazelluläre Aminosäurenabfolge von KIM 1, in verschiedenen Spezies
Alle Trunkationen, welche die ersten sechs Aminosäuren enthielten, waren im Zilium
und an der apikalen Membran lokalisiert. Diesen Ergebnissen zufolge ist die für die
Lokalisation wichtige Sequenz innerhalb der ersten sechs Aminosäuren AKKYFF
(Alanin-Lysin-Lysin-Tyrosin-Phenylalanin-Phenylalanin) zu finden. In der Literatur
sind diverse Hinweise auf ziliäre Signalsequenzen zu finden. Als Sequenz, welche für
eine ziliäre Lokalisation transmembranärer Proteine verantwortlich ist, wurde für
Polycystin 2 das konservierte N-terminale RVxP Motiv beschrieben (Geng, 2006).
Dieses Motiv stellt möglicherweise eine Interaktionsstelle für Proteine dar. Am CTerminus von Polycystin 2 modulieren Proteine wie PACS 1 und PACS 2 durch
- 43 Interaktion an einem acidic cluster die Verteilung des Proteins zwischen ER und
Plasmamembran (Kottgen, 2005). In C. elegans konnte eine Interaktion von einem
Polycystin 2 Homolog und dem Kinesin KLP-6 nachgewiesen werden. Diese
Interaktion hat Einfluss auf die ziliäre Verteilung des Polycystin Komplexes und ist
möglicherweise über verschiedene Spezies konserviert (Peden, 2005). In neueren
Untersuchungen des Tiermodells C. elegans konnte gezeigt werden, dass der
transmembranäre Teil von dem Polycystin 2 Homolog wichtig für die ziliäre
Lokalisation in vivo ist. Der C-terminale Abschnitt enthält bei C. elegans eine
spezielle ER Retentionssequenz, allerdings kein Acidic Cluster wie SäugerPolycystin 2. Diese Beobachtungen sprechen dafür, dass es innerhalb der TRP
Kanäle diverse Lokalisationssequenzen gibt. (Knobel, 2007). Ein Motiv aus Histidin,
Leucin, Alanin (HLA) wurde in einem Aktin ähnlichen Protein von Trypanosoma
brucei entdeckt. Dieses Motiv kommt auch in dem Protein PFRA vor, welches im
Flagellum von Trypanosoma vorhanden ist. Eine Deletion des HLA Motivs führt zu
einer Misslokalisation der beiden Proteine (Ersfeld, 2000). Ein weiteres Protein mit
einer ziliären Signalsequenz ist Smoothened, ein bedeutendes Protein des
Hedgehog Signalweg. Eine c-terminal lokalisierte konservierte Sequenz (WR Motiv)
aus hydrophoben und basischen Aminosäuren (… Tryptophan-Arginin-Arginin…) ist
gleichsam wichtig für die ziliäre Lokalisation von Smoothened wie auch für die
Aktivität des Proteins (Corbit, 2005). Sowohl beim HLA Motiv, wie auch beim WR
Motiv sind basische Aminosäuren mit großer Hydrophobizität vorhanden: Histidin und
Arginin. Das Lysin, das in der vermuteten ziliären Sequenz von KIM 1 doppelt
vorhanden ist, besitzt ebenfalls diese Eigenschaften. Es ist daher anzunehmen, dass
im unmittelbar membannahen Teil die drei basischen, hydrophoben Aminosäuren wie
Arginin, Histidin und Lysin essentiell für eine ziliäre Signalsequenz sind. Inwieweit
das doppelte Vorkommen der basischen Aminosäuren von Bedeutung ist, muss noch
geklärt werden. Interessanterweise geht aus den hier gezeigten, sowie bereits
veröffentlichten Daten hervor, dass weder die konservierten Tyrosine an Position 314
und 350, noch das konservierte Serin 324 eine Rolle für die ziliäre Lokalisation
spielen. Darüberhinaus fällt auf, dass die Sortierung der Trunkationen 1-316 und 1322 trotz korrekter Lokalisation an der apikalen Membran und im Zilium eine
aberrante Lokalisation an der lateralen Membran zeigen. Diese Beobachtung lässt
eine Fehlsortierung dieser Mutanten vermuten und legt nahe, dass die Sortierung
- 44 von KIM 1 keinem alles – oder - nichts – Prinzip folgt, sondern einem ‚fine tuning’
entspricht, für das verschiedene intrazelluläre Residuen eine Rolle spielen.
4.2 Die Interaktion von KIM 1 und Polycystin 2
Die Tatsache, dass KIM 1 im Zilium lokalisiert ist und eine Rolle in der ziliären
Flussantwort spielt warf die Frage auf, ob eine mögliche Interaktion zwischen KIM 1
und dem ebenfalls ziliär lokalisiertem Komplex aus Polycystin 1 und Polycystin 2
besteht. Eine Interaktion dieser Proteine könnte die Rolle von KIM 1 in der ziliären
Flussantwort erklären. Publizierte Daten zeigen, dass Polycystin 1 und Polycystin 2
für den flussinduzierten Calcium Einstrom notwendig sind (Qamar, 2007).
Polycystin 2 fungiert hierbei als Calcium durchlässiger Kationen Kanal. In Zellen aus
Zysten von ADPKD Patienten konnte beobachtet werden, dass es unter
Flussbedingungen nicht zu der erwarteten signifikanten Erhöhung der intrazellulären
Calcium Konzentration kommt. Auch der Calciumspiegel im endoplasmatischen
Reticulum ist in Zystenzellen erniedrigt (Xu, 2007) und neuere Untersuchungen
zeigen, dass Polycystin 2 mit dem Ryanodin Rezeptor ko-immunopräzipitiert und
Einfluss auf die Regulation dieses Rezeptors zu haben scheint (Anyatonwu, 2007).
Polycystin 2 hat als Calcium durchlässiger Kationenkanal vermutlich einen direkten
Einfluss auf den Calcium Signalweg. Wie in Kap 3.2. beschrieben interagieren KIM 1
und Polycystin 2 miteinander. Zunächst konnte PC 2 mit sIg 7.KIM 1, einem
membranständigen
Fusionskonstrukt
mit
der
KIM 1-Intrazellulärdomäne,
ko-
immunpräzipitiert werden. In folgenden Versuchen konnte auch die Interaktion von
full length KIM 1 mit PC 2 nachgewiesen werden. Leider konnte diese Interaktion
nicht als endogene Interaktion in der Mausniere nachgewiesen werden, da keine
hochaffinen Antikörper gegen die endogenen Proteine zur Verfügung standen. Die
Ergebnisse von Flusskammer Versuchen aus unserer Arbeitsgruppe (Kotsis, 2007)
zeigen, dass MDCK Zellen, welche Y350 mutiertes KIM 1 exprimieren, unter
Flussbedingungen nicht mit einem transienten Calciumeinstrom reagieren. Da KIM 1
mit PC 2 interagiert, besteht die Möglichkeit, dass Y350 von KIM 1 eine Rolle in der
Interaktion mit Polycystin 2 spielt. Diese Hypothese wird dadurch untermauert, dass
die Interaktion beider Proteine über die KIM 1 Intrazellulärdomäne stattfindet. Y350
ist Teil einer hoch konservierten SH2 Bindungsstelle (siehe Abb. 15). Bisher
unveröffentlichte Daten zeigen, dass Y350 durch die induzierbare T-Zell Kinase
- 45 phosphoryliert
werden
kann
und
somit
wahrscheinlich
die
Interaktion
mit
Adaptormolekülen reguliert. In Koimmunopräzipitationen, bei denen an Stelle von
KIM 1 das mutierte KIM 1.Y350F verwendet wurde, konnte in der Tat keine
Interaktion der beiden Proteine festgestellt werden. Somit spielt die konservierte
Region um Y350 in KIM 1 eine entscheidende Rolle für die Interaktion von KIM 1 und
PC 2. Der Mechanismus wie die Interaktion von KIM 1 und Polycystin 2 den
zilienabhängigen Calciumsignalweg reguliert, ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt
ungeklärt. Das Zilium als gemeinsamer Expressionsort nimmt eine zentrale Stellung
in der Verbindung zwischen KIM 1 und Polycystin 2 ein. Da sowohl Polycystin 2 wie
auch KIM 1 ziliär lokalisiert sind ist es denkbar, dass die Interaktion im Zilium
stattfindet.
Die Rolle von KIM 1 beim flussinduzierten Calciumanstieg lässt vermuten, dass die
ziliäre
Flussantwort
chemosensorische
Komponenten
aufweist.
Diese
chemosensorische Komponente lässt sich an den Zilien des Ventralknotens
beschreiben. Untersuchungen über den Ventralknoten haben gezeigt, dass Mäuse
mit einem homozygoten Defekt am pkd 2 Gen (PC 2-/-), in den frühen
Entwicklungsstadien Normabweichungen aufzeigen. Nachzuweisen ist sowohl ein
teilweiser bis hin zum kompletten situs inversus (Pennekamp, 2002), wie auch eine
fehlende Calciumerhöhung auf der linken Seite des Ventralknotens (McGrath, 2003).
Polycystin 2 ist mit seiner Funktion als Calciumkanal also auch am Ventralknoten
während der frühen Embryonalentwicklung von großer Bedeutung. Für die ziliär
vermittelte
Signalübertagung
am
Ventralknoten
existieren
unterschiedliche
Erklärungsansätze. Das klassische Modell ist das der Mechanosensorik. Über das
durch Flussbedingungen hervorgerufene Abknicken des Ziliums kommt es zu einer
Calciumerhöhung (Praetorius, 2001). Neue Untersuchungen legen jedoch den
Grundstein für eine andere Hypothese. Am Ventralknoten konnte dargestellt werden,
dass die spezifische linksseitige Calciumerhöhung durch die Zugabe von einem
Inhibitor des fiboblast growth factors rezeptors (FGFR) nahezu komplett verhindert
werden kann (Tanaka, 2005). Durch Zugabe von N-terminalen Fragmenten von
Sonic Hedgehoc (Shh) und Retinolsäure kann dieser Effekt allerdings wiederum
komplett aufgehoben werden, so dass die charakteristische Calciumerhöhung
linksseitig des Ventralknotens wieder nachweisbar ist. Diese Daten legen die
Vermutung nahe, dass die ziliäre Flussantwort und damit auch Polycystin 2 als
ziliärer Calciumkanal durch chemosensorisch Stimulation (Ma, 2005) moduliert
- 46 werden kann. KIM 1 fungiert ebenfalls als Chemosensor: in differenzierten TH2
Zellen findet eine Interaktion von KIM 1 und TIM 4 statt (Meyers, 2005). Darüber
hinaus agiert KIM 1 neuen Untersuchungen zufolge als Phosphatidylserin -Rezeptor
(Miyanishi
2007).
Phophatidylserin
dient
auf
apoptotischen
Zellen
als
prophagozytisches Signal, so dass diese Zellen phagozytiert werden. Die KIM 1
Expression ist während der akuten Tubulus Nekrose erhöht, so dass eine der
physiologischen Funktionen von KIM 1 in der Beseitigung von apoptotischen Zellen
liegen könnte.
Phosphatidylserine sind auch auf Exosomen exprimiert. Interessanterweise wurden
im Embryonalknoten exosomenartige, mikrovesikuläre Strukturen entdeckt, welche
durch Fluss transportiert werden (Tanaka 2005). Es wurde postuliert, dass sie
Wachstumsfaktoren und chemosensorische Botenstoffe transportieren, welche an
den lateralen Zilien freigesetzt werden, um dort Signalwege zu aktivieren. Analog zu
dieser Theorie wäre es denkbar, dass KIM 1 im renalen Zilium Exosomen erkennt
und für die ziliäre Signaltransduktion rekrutiert. Tatsächlich enthält das Proteom des
Urins weit über 1000 verschiedene Proteine. Unter den im Urin ausgeschieden
Proteinen sind in Exosomen verpackte und sezernierte Membranproteine aus
Nierenzellen
Kationenkanäle
wie
Aquaporine,
(Adachi,
2006).
und
Auch
verschiedene
Polycystin 2
spannungsgesteuerte
wurde
als
sezerniertes
Membranprotein in Exosomen beschrieben (Pisitkun, 2004). Es ist denkbar, dass
Exosomen im Urin chemosensorische Liganden transportieren, um von KIM 1 ziliär
an einen PC 2 enthaltenden Komplex rekrutiert zu werden und zilienabhängige
Signaltransduktion zu aktivieren. Zukünftige Untersuchungen werden klären, ob
ziliäres KIM 1 in der Lage ist harnständige Exosomen zu binden.
- 47 -
andere Proteine
KIM
1
Calcium
m
PC2
Bindung von Exosomen
Calcium
Freisetzung von Mediatoren
Calcium
Calciumeinstrom und Aktivierung der Signalkaskade
Abbildung 15: Schematische Darstellung der Aktivierung der ziliären Signalkaskade über PC 2
durch die Bindung von Exosomen an KIM 1.
Interessant
wird
es
sein
zu
untersuchen,
ob
die
Überexpression
von
Fusionskonstrukten der KIM 1 Intrazellulärdomäne mit Extrazellulärdomänen, welche
nicht an Exosomen binden können, die ziliäre Flussantwort unterdrückt. Von großem
Interesse wird auch die Frage sein, ob KIM 1 im Embryonalknoten exprimiert ist, was
eine Rolle bei der Exosomenerkennung untermauern würde.
- 48 -
4.3 KIM 1 als Interaktionspartner von TRP Kanälen
Die Familie der TRP Kanäle (transient receptor potential) zu denen Polycystin 2 als
spannungsabhängiger Calciumkanal gehört, besteht aus einer heterogenen Gruppe
von spannungsgesteuerten Kationen Kanälen (s.Kap: 1). Mutationen an Vertretern
dieser
Gruppe
verursachen
Krankheitsbilder
wie
beispielsweise
Mukopolysaccharidose Typ IV (Morquio-Syndrom) (TRPML1), Familiäre fokalsegmentale
Glomerulonephritis
(TRPC6),
Hypomagnesiämie
mit
sekundärer
Hypocalciämie (TRPM6) und ADPKD (TRPP2) (Winn, 2005; Reiser 2005; Bassi 2000;
Sun, 2000; Schlingmann 2002). Im Zuge dieser Arbeit wurde getestet, ob neben
Polycystin 2 (TRPP2) eine Interaktion von KIM 1 mit einem Vertreter der TRPV
Unterfamilie, TRPV4 besteht. Die TRPV Kanäle sind charakterisiert durch die
Reaktion auf mechanische, osmotische und chemische Stimuli wie saure Fettsäuren,
wobei die Kanäle teilweise auch über weitere Signalkaskaden wie Tyrosinkinasen
aktiviert werden. (Cohen, 2005). Die Kanäle TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 werden
als sogenannte „thermo- TRP`s“ bezeichnet, da sie speziell auch auf thermische
Stimulation reagieren. Als erster Vertreter dieser Gruppe wurde im Jahr 1997 TRPV1
als Rezeptor für Caspaicin entdeckt (Caterina, 1997). TRPV4 wurde im Jahr 2000
zum ersten Mal als ein aus vier Untereinheiten bestehender Kanal beschrieben
(Liedtke, 2000; Strotmann, 2000; Wissenbach, 2000). Dieser Kanal ist ein Homolog
zum Caenorrhabditis elegans Protein Osm 9, das für die Mechanosensorik und somit
für die Sensibilität dieses Organismus verantwortlich ist (Goodman, 2003) und
interessanterweise mit Polycystin 2 interagiert (Knobel, 2007). TRPV4 spielt als nicht
selektiver Kationen Kanal für die osmotische Homöostase, Mechanosensation,
Thermosensibilität, Gefäßregulation, und vielleicht für das Hörvermögen eine
bedeutende Rolle (Liedtke, 2005; Liedtke, 2005; Strotmann, 2000). Die Verteilung
von TRPV4 im Organismus erstreckt sich von den Tubuli der Niere, zu Endothelien
der Gefäße, bis zu Neuronen des Hypothalamus (Caterina, 2003). Bisher
unveröffentlichte Daten aus der Gruppe von Prof. Walz zeigen, dass Polycystin 2 mit
TRPV4 interagiert und dessen Kanaleigenschaften beeinflusst. In der Tat konnte in
dieser Arbeit TRPV4 als Interaktionspartner von KIM 1 etabliert werden. Für TRPV4 /- Mäuse ist beschrieben worden, dass ein Defekt in der flussabhängigen
Kaliumsekretion vorliegt, so dass eine funktionelle Relevanz von TRPV4 in der
ziliären Signaltransduktion durchaus denkbar ist (Taniguchi, 2007). Die hier
- 49 vorgestellten Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass KIM 1 mit dem ziliären
Flusssensorkomplex interagiert.
KIM 1 besitzt den hier vorgestellten Ergebnissen zufolge, die Fähigkeiten mit zwei
unterschiedlichen Vertretern aus der Familie der TRP Kanälen Interaktionen
einzugehen. Es wäre nun interessant zu wissen, ob TRP Kanäle generell eine
spezielle konservierte Sequenz besitzen, die sie mit KIM 1 interagieren lässt. Dazu
müssten die Interaktionsstelle durch Mapping bestimmt und Versuche mit anderen
Vertretern der TRP Kanäle durchgeführt werden. Umgekehrt stellt sich die Frage,
inwiefern TRP Kanäle in ihrer Funktion auf andere Transmembranmoleküle
angewiesen sind und ob Mitglieder der Familie der TIM Proteine generell in
Verbindung mit TRP Kanälen agieren.
Die im Zuge dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse weisen einen molekularen
Mechanismus für die Rolle von KIM 1 als Interaktor von Polycystin 2 in der ziliären
Flussantwort auf. Sie untermauern die Hypothese, dass die flussinduzierte
Signaltransduktion über mechanische Vorgänge hinaus eine chemosensorische
Komponente aufweist. In Verbindung mit der kürzlich publizierten Erkenntnis, dass
KIM 1 als Phsophatidylserin-Rezeptor fungiert ergeben sich neue, testbare Konzepte,
in welcher Art die ziliäre Signaltransduktion aktiviert wird. Die Interaktion von KIM 1
mit TRPV4 als weiterem TRP Kanal wirft die grundsätzliche Frage nach der Rolle von
nicht zur TRP Familie gehörenden Transmembranmolekülen in der Funktion von
TRP Kanälen auf. Zukünftige Untersuchungen in unterschiedlichen Modellsystemen
werden notwendig sein, um
die physiologische Funktion dieser wichtigen
Rezeptorfamilie eingehend zu klären.
- 50 -
5. Zusammenfassung
Die Gruppe der Polyzystische Nierenerkrankungen wird durch die Dysfunktion ziliär
lokalisierter Proteine verursacht. Von besonderer Bedeutung für die ADPKD sind die
beiden Polycystine PC 1 und PC 2, beide Proteine sind über ihre ziliär vermittelten
mechanosensorische Eigenschaften in den Calciumsignalweg involviert. Polycystin 2
ist ein Calciumkanal und gehört zu der Familie der TRP-Kanäle. Das Zilium nimmt in
der wissenschaftlichen Betrachtung der Polycystischen Nierenerkrankung eine
zentrale Rolle ein. KIM 1 ist ein ebenfalls ziliär lokalisiertes Protein, welches bei einer
ischämischen Schädigung des Nierengewebes eine verstärkte Expression aufweist.
Zudem ist KIM 1 auch in zystisch verändertem Nierengewebe nachweisbar. Am
Zilium wirkt KIM 1, wie die Polycystine, auf den Calciumsignalweg ein und besitzt
chemosensorische Eigenschaften. Die ziliäre Lokalisation von KIM 1 ist essentiell für
die mechanosensorischen Eigenschaften dieses Proteins. Mit Hilfe von Trunkationen
konnte gezeigt werden, dass die ziliäre Lokalisation von KIM 1 durch eine Sequenz
innerhalb der ersten sechs intrazellulären Aminosäuren festgelegt wird. Die
Vermutung liegt nahe, dass wie bei anderen ziliären Signalsequenzen auch hier
besonders basische, hydrophobe Aminosäuren, in diesem Fall Lysin, Arginin und
Histidin entscheidend sein könnte. Zwischen KIM 1 und Polycystin 2 konnte mittels
Koimmunopräzipitationen eine Interaktion nachgewiesen werden. Diese Interaktion
könnte auf eine direkte Verbindung von KIM 1 zu ADPKD hinweisen. Dies hätte eine
Bedeutung für die Diagnostik von akuten, wie auch heriditären Nierenerkrankungen.
Des Weiteren könnte KIM 1 zukünftig als Biomarker an Bedeutung gewinnen, da eine
abgespaltene
Ektodomäne
vom
KIM 1
im
Urin
von
Patienten
mit
Nierenparenchymschäden nachgewiesen werden konnte. Zudem existieren Hinweise,
dass KIM 1 eine Rolle als Exosomenfänger im renalen Tubulus innehaben könnte. Im
Zuge dieser Arbeit gelang die Identifikation eines weiterer Interaktionspartner von
KIM 1. KIM 1 zeigte in Koimmunopräzipitationen eine Interaktion mit TRPV4. TRPV4
ist wie Polycystin 2, ein ziliär lokalisierter Kationenkanal, der Familie der TRP-Kanäle.
Die Betrachtung dieser Ergebnisse legt die Vermutung nahe, dass KIM 1 über eine
spezifische Sequenz Interaktionen mit weiteren TRP Kanälen eingehen könnte.
- 51 -
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novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett 485, 127-34.
107. Xu, C. et al. (2007), Human ADPKD primary cyst epithelial cells with a novel,
single codon deletion in the PKD1 gene exhibit defective ciliary polycystin
localization and loss of flow-induced Ca2+ signaling. Am J Physiol Renal Physiol
292, F930-45.
108. Yamamoto, M. et al. (2003), Nodal signaling induces the midline barrier by
activating Nodal expression in the lateral plate. Development 130, 1795-804.
109. Yoder, B. K. (2007), Role of primary cilia in the pathogenesis of polycystic
kidney disease. J Am Soc Nephrol 18, 1381-8.
- 59 110. Yoder, B. K., Hou, X. & Guay-Woodford, L. M. (2002), The polycystic kidney
disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in
renal cilia. J Am Soc Nephrol 13, 2508-16.
111. Yoder, B. K. et al. (1995), Insertional mutagenesis and molecular analysis of a
new gene associated with polycystic kidney disease. Proc Assoc Am Physicians
107, 314-23.
- 60 -
7. Abkürzungsverzeichnis
Abb
Abbildung
ADPKD
englisch: Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease
ADPN
Autosomal Dominante Polyzystische Nierenerkrankung
ARPKD
englisch: Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease
ARPN
Autosomal Rezessive Polyzystische Nierenerkrankung
BSA
Bovines Serum Albumin
bzw
beziehungsweise
Ca
Calcium
CAM
englisch: Cell Adhesion Molecule
cAMP
zyklisches Adenosin Monophosphat
CPK
englisch: Congenital Polycystic Kidney Disease
d.h.
das heisst
DIC
Differential Interference Contrast
DMEM
Dubelcco`s Modified Eagel Medium
DNA
Desoxyribonucleic Acid = Desoxyribonukleinsäure
ECL
englisch: enhanced chemiluminescence
EDTA
Ethylamin-N,N,N’,N’-Tetraessigsäure
E – coli
Escherichia Coli
et.al
latein: et altera
.F
Flag
FBS
Fetales Bovines Serum
g
Gramm
GFP
englisch: Green Fluorescent Protein
HAVCR
englisch: Hepatitis A Virus Cellular Receptor
HEBS
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonat
HEK
englisch: Human Embryonic Kidney
HRP
englisch: Horseradish peroxidase
IFT
Intraflagellarer Transport
Ig
Immunglobulin
Il
Interleukin
IP
Immunpräzipitation
- 61 ITK
Induzierbare Tyrosinkinase
Jak
Janus Kinase
Kap
Kapitel
KCl
Kaliumchlorid
kDa
Kilodalton
Kg
Kilogramm
KIM
englisch: Kidney Injury Molecule
M
Molar
mA
Miliampere
MgCl
Magnessiumchlorid
mM
Milimolar
MADCAM
englisch: Mucosal Adressin Cell Adhesion Molecule
MDCK
englisch: Madin Darby Canine Kidney
NaCl
Natriumchlorid
NaOH
Natriumhydroxid
ORPK
englisch: Oak Rich Polycystic Kidney
PC 1 / 2
Polycystin 1 / 2
PCR
englisch: Polymerase Chain Reaction
PKD
Polycystic Kidney Disease
RCC
englisch: Renal Cell Carcinoma
SDS
Sodium Dodecyl Sulfat
s.u.
siehe unten
Tbl
Tablette
TEMED
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
TIM
englisch: Tissue Injury Molecule
TRP
englisch: Transient Receptor Potential
U
Unit = internationale Einheit
µg
Microgramm
µl
Microliter
YFP
englisch: Yellow Fluorescent Proteine
- 62 -
8. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematisierte Darstellung von Polycystin 1 und 2 ............................... 4
Abbildung 2: Systematik der TRP - Kanäle................................................................. 7
Abbildung 3: hKIM 1-1-343.venus exprimierende MDCK Zellen............................... 26
Abbildung 4: hKIM 1-1-322 venus exprimierende MDCK Zellen............................... 27
Abbildung 5: hKIM 1-1-311.venus exprimierende MDCK Zellen............................... 28
Abbildung 6: hKIM 1-1-316 .venus exprimierend MDCK Zellen................................ 29
Abbildung 7: sIg 7.KIM 1.venus exprimierend MDCK Zellen .................................... 30
Abbildung 8: HEK 293t Zellen................................................................................... 32
Abbildung 9: Western Blot der Koimmunopräzipitation sIg 7 KIM 1 und PC 2 V5 .... 33
Abbildung 10: Western Blot der Koimmunopräzipitation von KIM 1.F plus PC 2.V5. 35
Abbildung 11: Western Blot der Koimmunopräzipitation KIM 1.Y350 F mit PC 2.V5 37
Abbildung 12: Western Blot der Koimmunopräzipitation sIg 7 KIM 1 mit TRPV4 V5 38
Abbildung 13: Western Blot der Koimmunopräzipitation KIM 1.F mit TRPV4.V5...... 39
Abbildung 14: Intrazelluläre Aminosäurenabfolge von KIM 1 ................................... 42
Abbildung 15: Schematische Darstellung der Aktivierung der ziliären Signalkaskade
über PC 2 durch die Bindung von Exosomen an KIM 1. ........................................... 47
- 63 -
9. Danksagung
An erster Stelle möchte ich Herrn Professor Gerd Walz, Ärztlicher Direktor der
Abteilung IV der medizinischen Universitätsklinik Freiburg für die Überlassung des
Dissertationsthemas danken. In seinem herausragenden Labor konnte ich sieben
überaus lehrreiche Monate verbringen und bereichernde Einblicke in das
wissenschaftliche Denken und Arbeiten bekommen.
Ein besonderer Dank gilt dem Betreuer dieser Arbeit, Dr. Wolfgang Kühn, der mit
seiner großen Geduld und seinem Vertrauen den größten Anteil zum Gelingen dieser
Doktorarbeit beigetragen hat. Auch in schwierigen Phasen schaffte er es mit seiner
Begeisterung für die Wissenschaft die Motivation aufrecht zu erhalten und neue
Impulse zu geben. Vor allem auch während der schriftlichen Ausarbeitung dieser
Arbeit stellte er eine große Unterstützung dar.
Des Weiteren möchte ich allen MitarbeiterInnen des Labors für wertvolle Ratschläge
und hilfreiche Anregungen danken, besonders genannt sei hierbei Frau Simone Bräg.
Meinen Mitdoktoranden Petra Mühlenhardt und Philipp van de Weyer danke ich für
wertvolle Anregungen und motivierende Gespräche.
Ein spezieller Dank geht an meine Eltern die mir mein Studium ermöglichen und mir
mit ihrem immerwährenden Vertrauen eine besondere Unterstützung waren. Ein
letzter Dank geht an meinem Freund Patrick Zipfel, der mir während meines ganzen
Studiums zur Seite gestanden ist.
- 64 -
10. Lebenslauf
Anne- Katharina John, geboren am 19.07.1982 in Waldkirch
Bildungsweg:
06/02: Abitur am Friedrich-Gymnasium, Freiburg
09/02: Medizinstudium an der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i.Br
09/04: Ärztliche Vorprüfung
02/08 bis 12/08:
Praktisches Jahr
04/09: 2. Ärztliche Prüfung
Praktika, Famulaturen und Kurse:
03/05: Famulatur in hausärztlicher Praxis
Dr. med. Eisele, Waldkirch
09/05: Famulatur, AKH, Wien, Abteilung für Kardiologie
09/06: Famulatur, Helios Klinik Müllheim,
Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe
10/06 bis 10/07:
Arbeit als Nachtwache
Dialysezentrum, Emmendingen
05/07: Famulatur, Praxis für Gynäkologie & Geburtshilfe
Dr. med. Birmelin, Freiburg
07/07: Teilnahme an der „International Summer School
on Reproduktive Health“, Groningen, NL
08/07: Famulatur, Herzzentrum, Bad Krozingen
Abteilung für Anästhesiologie & Intensivmedizin
02/08: 1.Tertial des PJ, Gynäkologie & Geburtshilfe
Luzerner Kantonsspital, Dep.Wolhusen, CH
06/08: 2.Tertial des PJ, Chirurgie
Kantonsspital Liestal, CH
09/08: 3. Tertial des PJ, Innere Medizin
Medizinische Klinik der UKL Freiburg