Konsensuspapier zur Identifizierung von speziellen

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KONSENSUSPAPIER ZUR IDENTIFIZIERUNG VON SPEZIELLEN
RESISTENZMECHANISMEN UND ZUR INTERPRETATION VON ERGEBNISSEN DER
ANTIBIOTIKAEMPFINDLICHKEITSTESTUNG BEI GRAMPOSITIVEN UND
GRAMNEGATIVEN ERREGERN
H.K.GEISS, D.MACK und H.SEIFERT
Erregerisolierung und –identifizierung sind eine der wichtigsten Aufgaben im mikrobiologischdiagnostischen Labor, da das Ergebnis dieser Untersuchungen die Grundlage für die gezielte
Antibiotikatherapie ist. Die Durchführung der Testung basiert auf der Hemmung von bakteriellem
Wachstum in Gegenwart eines Antibiotikums unter definierten in-vitro Bedingungen. Erste
Vorschläge zur Standardisierung der Testung in den 50-er Jahren wurden 1961 in einem WHO
Report publiziert, wobei letztendlich die Arbeiten von Ericsson et al. (1960) und Bauer et al. (1966)
zur weltweiten Etablierung des Agardiffusionsverfahrens als der am weitesten verbreiteten Methode
führten. Trotz der offensichtlichen Einfachheit dieses Testverfahrens ist es bis heute nicht gelungen,
weltweit verbindliche Standards für die Durchführung und die Ergebnisbewertung zu etablieren. So
beziehen sich die Unterschiede auf die verwendeten Testmedien (z.B. Mueller-Hinton vs.
IsoSensitest), Inokulum (konfluierendes vs. semikonfluierendes Wachstum), Beschickungsmenge der
Testplättchen, Inkubationsbedingungen, Ableseverfahren sowie die Festlegung der Grenzwerte.
Ähnliches gilt teilweise für die MHK-Bestimmung im Bouillon-Dilutionsverfahren, wobei diese
Methode allerdings eine automatisierte Ablesung der Ergebnisse und einen höheren Grad an
Standardisierung erlaubt.
Zu diesen rein methodischen Fragestellungen ist in den letzten Jahren zunehmend ein Problem in den
Blickpunkt des Interesses gerückt, das in seiner Bedeutung von erheblicher klinischer Relevanz ist.
Erstmals offensichtlich wurde die Diskrepanz zwischen in-vitro Empfindlichkeit und in-vivo Resistenz
bei Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) Stämmen, und es hat viele Jahre
gedauert, bis sich in allen mikrobiologisch-diagnostischen Labors die korrekte Interpretation der
Resistenztestung im Sinne der klinischen Unwirksamkeit aller ß-Laktam-Antibiotika beim Vorliegen
einer Methicillin-Resistenz durchgesetzt hat. Die Änderung von Testbedingungen (erhöhter
Kochsalzgehalt, verlängerte Inkubation, Grenzwertkorrektur) erhöhte die Nachweisempfindlichkeit
der Methicillin-Resistenz, die aber mit phänotypischen Verfahren nicht bei 100% liegt.
Mittlerweile haben eine Reihe von Untersuchungen belegt, dass die Unzulänglichkeit, einen
vorhandenen Resistenzmechanismus mit Hilfe der Resistenztestung unter Zugrundelegung aktueller
Grenzwerte zu erkennen, nicht nur auf MRSA beschränkt ist, sondern auch zahlreiche andere
Bakterienarten und Antibiotikagruppen umfasst. Gleichzeitig werden wir weltweit mit dem Problem
der sich z.T. epidemisch ausbreitenden antibiotikaresistenten Mikroorganismen konfrontiert,
wodurch der schnellen und sachgerechten Empfindlichkeitstestung klinischer Isolate eine immer
größere Bedeutung zukommt. Die Voraussetzung hierfür ist allerdings die Kenntnis spezifischer
Resistenzmechanismen und insbesondere die Fähigkeit, diese unter Routinelaborbedingung zu
detektieren und zu interpretieren. Im Oktober 2002 fand in Heidelberg ein Konsensustreffen von
Mitgliedern der DGHM. DGI und PEG zu diesem Thema statt und es sollen nachfolgend die
Ergebnisse dieser Veranstaltung dargestellt werden. Dabei gliedert sich die Übersicht in 4 Teile:
1
•
Methicillin- und
•
Glykopeptid-Resistenz bei Staphylokokken,
•
Makrolid-Resistenz bei Staphylokokken und Streptokokken und schließlich
•
Breitspektrum-ß-Laktamase (ESBL)-bildende Enterobakterien.
RESISTENZ VON STAPHYLOKOKKEN GEGEN ß -LAKTAM-ANTIBIOTIKA
RESISTENZMECHANISMEN
Bei Staphylokokken wird Resistenz gegen ß-Laktam-Antibiotika durch zwei Mechanismen bewirkt.
Die Mehrzahl (> 80%) aller klinischen Staphylokokkenisolate bilden Penicillinase, die klassische
Penicilline sowie Amino- und Ureidopenicilline inaktiviert, während die Penicillinase-festen Penicilline
wie Methicillin und Oxacillin sowie Cephalosporine und Carbapeneme in ihrer Wirkung im
wesentlichen nicht beeinträchtigt werden. Hervorzuheben ist, daß die Bildung der Penicillinase
(Expression von blaZ) durch ß-Laktam-Antibiotika induziert wird (Berger-Bächi, 1997). Ein zweiter
Mechanismus der Resistenz gegen ß-Laktam-Antibiotika ist die sogenannte Methicillinresistenz, die
durch das mecA-Gen determiniert wird. MecA ist in einem nur bei Methicillin-resistenten
Staphylokokken vorkommenden zusätzlichen genetischen Element SCCmec (Staphylococcus
cassette chromosome mec) lokalisiert (Ito et al. 2001, Hiramatsu et al. 2001) und kodiert für das
Penicillin-Binde-Protein PBP2a. Staphylokokken besitzen 5 Penicillin-Binde-Proteine, die als
membrangebundene DD-Peptidasen eine Transpeptidasereaktion katalysieren, die zur
Quervernetzung des Peptidoglycans der bakteriellen Zellwand führt. ß-Laktam-Antibiotika sind
Substratanaloga, die kovalent an das Serin-aktive Zentrum der PBP binden und diese damit
inaktivieren. Die PBP’s 1-3, die eine hohe Affinität für die meisten ß-Laktam-Antibiotika besitzen,
sind essentiell für das Zellwachstum sowie das Überleben empfindlicher Stämme. Bei Methicillinresistenten Staphylokokken kann das PBP2a aufgrund seiner rund 1000-fach geringeren
Bindungsaffinität für ß-Laktam-Antibiotika diese essentiellen Funktionen übernehmen und dadurch
die Zellwandsynthese aufrecht erhalten (Chambers 1997, Labischinski 1992). Hierdurch kommt eine
klinische Kreuzresistenz von Methicillin-resistenten Staphylokokken gegen alle ß-Laktam-Antibiotika
einschließlich der Carbapeneme zustande, wie sich auch im Tiermodell exemplarisch zeigen lässt
(Ling et al. 1993). Die grundsätzlichen Mechanismen der Methicillinresistenz sind bei
Staphylococcus aureus und den Koagulase-negativen Staphylokokken identisch.
Die phänotypische Expression der Methicillinresistenz ist außerordentlich variabel und von einer
Vielzahl von Faktoren abhängig, wie z.B. Wachstumsmedium, Osmolarität, Temperatur sowie Typ
des induzierenden ß-Laktam-Antibiotikums. Grundsätzlich kann man zwischen Stämmen mit einem
homogenen und einem heterogenen Expressionsphänotyp unterscheiden (Tomasz et al. 1991). Bei
homogenen Stämmen haben nahezu alle Zellen der Population eine MHK gegen Methicillin von mehr
als 50 µg/ml. Bei heterogenen Stämmen hat ein größerer Anteil der Zellen in der Population eine
Methicillin-MHK im sensiblen Bereich, während nur eine kleine Subpopulation hoch resistent ist. Bei
sehr heterogen-resistenten Stämmen kann nur eine von 108 Zellen resistent sein. Bei Selektion der
hochresistenten Population durch ß-Laktam-Antibiotika kommt es zur phänotypischen Ausprägung
der homogenen Resistenz. Bei Passage ohne Selektion verliert sich der homogene Expressionstyp
jedoch in der Regel wieder und die Erreger werden wieder heterogen-resistent wie der
2
Ausgangsstamm. Bei klinischen Isolaten von Koagulase-negativen Staphylokokken ist der
Expressionstyp in der Regel noch heterogener als bei S. aureus.
Bei einem Teil der Methicillin-resistenten Staphylokokken ist die Expression von mecA durch
verschiedene ß-Laktam-Antibiotika induzierbar, was durch das Repressorgen mecI und das
Responseregulatorgen mecR1 reguliert wird (Berger-Bächi und Rohrer 2002). Beide Elemente sind
ebenfalls auf SCCmec kodiert. Zusätzlich hängt die phänotypische Expression der
Methicillinresistenz von einer Vielzahl unabhängiger Stoffwechselmerkmale (fem- oder auxFaktoren) sowie regulatorisch wirksamen Genen ab, die bisher am besten für S. aureus
charakterisiert sind (Berger-Bächi und Rohrer 2002, Mack et al. 2002).
Bei Staphylokokken mit einer geringfügig über dem Grenzwert liegenden Oxacillin-MHK sind
verschiedene Resistenzmechanismen möglich. Enthalten diese Stämme mecA, handelt es sich um
extrem heterogen exprimierende Methicillin-resistente Stämme, bei denen unter ß-LaktamExposition homogen resistente Stämme selektioniert werden können. Sind diese Stämme mecAnegativ, wird die Methicillinresistenz meistens durch eine Überexpression der Penicillinase (borderline
resistant S. aureus: BORSA) oder durch eine Modifikation der Penicillin-bindenden Proteine
(modified PBP S. aureus: MODSA) bewirkt. Die Prävalenz von BORSA und MODSA ist sehr
niedrig und therapeutisch werden bei Infektionen mit diesen Stämmen ß-Laktam-Antibiotika zumeist
als ausreichend wirksam angesehen (Chambers 1997).
EPIDEMIOLOGIE
Das epidemische Auftreten von Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) ist international ein ständig
wachsendes Problem. In Deutschland hat der Anteil von MRSA bei klinischen S. aureus Isolaten
seit 1990 dramatisch zugenommen und hat in der jüngsten Studie der PEG die 20%-Marke
überschritten1, wobei lokal erhebliche Unterschiede beobachtet werden. Koagulase-negative
Staphylokokken weisen im Gegensatz hierzu weltweit einheitlich eine Methicillinresistenz von 6080% auf.
DIAGNOSTIK
Penicillinresistenz
Der Nachweis der Penicillinresistenz von Staphylokokken ist nach DIN 58940 oder NCCLS
M100-S13 im Agardiffusionstest und durch MHK-Bestimmung ohne Probleme möglich
(Grenzwerte nach DIN: Agardiffusion < 28 mm resistent; MHK: > 0,125 µg/ml resistent; bzw. nach
NCCLS: Agardiffusion < 28 mm resistent; MHK: > 0,1 µg/ml resistent). Da Penicillin G bei
Infektionen mit empfindlichen Staphylokokken wegen seiner höheren Aktivität das Mittel der Wahl
ist, muss in diesen Fällen die Bestätigung der Penicillin-Empfindlichkeit mit Hilfe des PenicillinaseTests (z.B. Cefinase®) durchgeführt werden. Da die Penicillinase der Staphylokokken induzierbar
ist, sollen Staphylokokken erst nach Induktion mit subinhibitorischen Konzentrationen eines ßLaktam-Antibiotikums getestet werden. Hierzu kann entweder Koloniematerial vom Hemmhofrand
eines Oxacillin-Plättchens im Agardiffusionstest oder Zell-Suspension aus subinhibitorischen
Konzentrationen der MHK-Bestimmung verwendet werden (Swenson et al. 1999).
1
(http://www.antiinfectives-intelligence.de/peg/ag_resistenz/main.htm)
3
Methicillinresistenz
Die Detektion der Methicillinresistenz bei Staphylokokken ist mit genotypischen und phänotypischen
Verfahren möglich. Der Nachweis des mecA Gens mittels PCR oder anderer molekularbiologischer
Verfahren hat sich heute als Goldstandard etabliert, der zur Validierung der phänotypischen
Verfahren verwendet wird (Fluit et al. 2001). Jedoch sind die genotypischen Verfahren derzeit noch
so aufwendig und teuer, dass sie als Standardtests zur Bestimmung der Methicillinresistenz im
Routinelabor nicht in Frage kommen.
Zur Detektion der Methicillinresistenz bei Staphylokokken sind Methicillin und Oxacillin geeignet,
verwendet wird jedoch meist Oxacillin. Andere ß-Laktam-Antibiotika sind nicht geeignet und dürfen
zur Bestimmung der Methicillinresistenz bei Staphylokokken nicht verwendet werden. Die
nachfolgenden Verfahren orientieren sich an den Empfehlungen des DIN bzw. NCCLS (Tabelle 1).
Phänotypische Verfahren zur Bestimmung der Methicillinresistenz sind
•
MHK-Bestimmung,
•
Agardiffusionstest,
•
Agar-Screen-Test,
•
Oxacillin E-Test sowie der
•
immunchemische Nachweis des PBP2a mittels Latexagglutination
•
automatisierte Resistenzbestimmung.
Tabelle 1: Verfahren zur Bestimmung der Methicillinresistenz bei Staphylokokken
Verfahren
Medium
Substanz
Grenzwert (resistent)
MHK (NCCLS)
S. aureus
MH + 2% NaCl
Oxacillin
4µg/ml
Koagulase-negative
MH + 2% NaCl
Oxacillin
0,5 µg/ml
Staphylokokken
MHK (DIN)
MH + 3% NaCl
Oxacillin
2 µg/ml
Agardiffusion (NCCLS)
S. aureus
Koagulase-negative
Staphylokokken
Agardiffusion (DIN)
Agar-Screen (NCCLS)
S. aureus
Koagulase-negative
Staphylokokken
E-Test (AB Biodisk)
S. aureus
Koagulase-negative
Staphylokokken
Temperatur
Zeit
35 oC
35 oC
24 h
24 h
36 ± 1 oC
24 h
MHA
MHA
Oxacillin 1 µg
Oxacillin 1 µg
10-13mm*
17 mm
35 oC
35 oC
24 h
24 h
MHA
Oxacillin 5 µg
15 mm
36 ± 1 oC
18 ± 2 h
MHA + 4% NaCl
MHA + 4% NaCl
Oxacillin 6 µg/ml
Oxacillin 6 µg/ml
Wachstum
Wachstum
35 oC
35 oC
24
48 h
MHA + 2% NaCl
MHA + 2% NaCl
Oxacillin
Oxacillin
NCCLS/DIN
4/2 µg/ml
0,5/2 µg/ml
35 oC
35 oC
24
48 h
* resistent ≤ 10 mm; sensibel ≥ 13 mm; bei intermediärem Testergebnis muß ein Agar-Screen Test durchgeführt
MHK-Bestimmung mittels Bouillon-Dilutionstest (Mikrodilution)
4
Dieses Verfahren stellt die Standardmethode für die Bestimmung der Empfindlichkeit gegen Oxacillin
dar. Im NCCLS-Dokument M100-S13 werden Mueller-Hinton Bouillon + 2% NaCl, eine
Einsaatdichte von 3-7 x 105 KBE/ml und Inkubation bei 35 oC für 24 h empfohlen. Die Grenzwerte
für die Bewertung sind für S. aureus und Koagulase-negative Staphylokokken verschieden (Tab. 1).
Gemäß DIN 58940-81 (Fassung vom Oktober 2002) wird Mueller-Hinton Bouillon + 3% NaCl2,
eine Einsaatdichte von 1-5 x 105 KBE/ml und eine Bebrütungsdauer von mindestens 24 h bei 36 ± 1
o
C für S. aureus empfohlen. Für Koagulase-negative Staphylokokken werden in der DIN-Norm
keine spezifischen Empfehlungen gegeben. Der Grenzwert ist für S. aureus und Koagulase-negative
Staphylokokken identisch, unterscheidet sich jedoch von den empfohlenen Grenzwerten der
NCCLS (Tab. 1).
Die von NCCLS in der Mikrodilution für S. aureus und Koagulase-negative Staphylokokken
festgelegten Grenzwerte wurden mit der mecA-PCR als Goldstandard von verschiedenen Autoren
validiert. Dabei konnten für S. aureus eine exzellente Sensitivität und Spezifität nachgewiesen
werden. Dies ist insbesondere für die Studie von Swenson et al. (2001a) bemerkenswert, bei der
MRSA-Stämme mit besonders heterogenem Expressionstyp und MSSA-Isolate mit einer OxacillinMHK nahe am Grenzwert untersucht wurden. Gleiches gilt bei Koagulase-negativen
Staphylokokken mit dem seit 1999 gültigen NCCLS-Grenzwert von ≥ 0,5 µg/ml nur für die Spezies
S. epidermidis und S. haemolyticus, während insbesondere bei S. saprophyticus und S.
lugdunensis eine sehr schlechte Spezifität nachgewiesen wurde (Gradelski et al. 2001, Horstkotte et
al. 2001a, Louie et al. 2001, Yamazumi et al. 2001a).
Agardiffusionstest
Die NCCLS empfiehlt für den Agardiffusionstest Mueller-Hinton Agar ohne NaClSupplementierung und ein 1 µg Oxacillinplättchen. Die Bebrütung soll für 24 h bei 35 oC erfolgen.
Für S. aureus und Koagulase-negative Staphylokokken werden seit 1999 verschiedene Grenzwerte
angegeben. Für S. aureus muß bei Ergebnissen im intermediären Bereich ein Agar-Screen-Test
(s.u.) angeschlossen werden.
Die DIN-Richtlinie 58940 empfiehlt für den Agardiffusionstest zur Bestimmung der Oxacillinresistenz
von Staphylokokken kein vom normalen Verfahren abweichendes Vorgehen. Die Testung erfolgt mit
Mueller-Hinton Agar ohne NaCl-Supplementierung und einem 5 µg Oxacillinplättchen. Das
Inokulum soll dicht, jedoch noch einzeln stehende Kolonien ergeben. Die Bebrütung erfolgt bei 36 ±
1 oC für 18 ± 2 h.
Das Verfahren der NCCLS wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen für S. aureus und Koagulasenegative Staphylokokken mit der mecA-PCR validiert. Die Sensitivität war für alle Staphylokokken
gut und lag in einem Bereich von 93,5% bis 100%. Die Spezifität für eine besonders problematische
Population von S. aureus (MRSA mit besonders heterogenem Expressionstyp und MSSA mit einer
Oxacillin-MHK nahe am Grenzwert) lag bei 89% (Swenson et al. 2001a). Die Spezifität lag bei
Koagulase-negativen Staphylokokken niedriger, was zu einem erheblichen Teil auf Koagulasenegative Staphylokokken der Spezies S. saprophyticus und S. lugdunensis zurückzuführen war
(Louie et al. 2001, Monsen et al. 2002).
2
Die Empfehlung für den höheren Anteil von 3% NaCl hat historische Gründe, wobei Vergleichsuntersuchungen
mit einem NaCl-Anteil von 2% keine Unterschiede ergaben (pers. Mitteilung Dr. Schmalreck, München)
5
Agar-Screen Test
Der Agar-Screen Test ist ein Breakpointverfahren, das von der NCCLS zur Bestimmung der
Methicillinresistenz für S. aureus empfohlen wird. Der Teststamm wird in physiologischer
Kochsalzlösung mit einer Keimdichte entsprechend 0,5 McFarland suspendiert. Mit einem in der
Suspension getränkten und von überschüssiger Flüssigkeit befreiten Tupfer wird das Inokulum auf
einer Fläche von 10-15 mm Durchmesser aufgebracht (Spot-Inokulation) oder auf einen Quadranten
einer mit 4% NaCl supplementierten Mueller-Hinton Agarplatte, die 6 µg/ml Oxacillin enthält,
ausgestrichen. Alternativ kann auch eine kalibrierte 1 µl Einmalöse zur Applikation des Inokulums auf
einer Fläche von 10-15 mm Durchmesser (Spot) verwendet werden. Die Bebrütung erfolgt bei 35
o
C für 24 h (S. aureus) oder für 48 h (Koagulase-negative Staphylokokken). Als positiv gilt
Wachstum von mindestens 2 Kolonien. Es ist zu beachten, dass nach der Umstellung der MHKGrenzwerte für Koagulase-negative Staphylokokken durch die NCCLS der Agar-Screen Test nicht
mehr für die Bestimmung der Methicillinresistenz von Koagulase-negativen Staphylokokken
empfohlen wird (Tenover et al. 1999).
Eine kürzlich veröffentlichte Studie zum Vergleich der Sensitivität der unterschiedlichen
Applikationsarten im Agar-Screen Test zeigte für das Spot-Verfahren (mit Tupfer) und den
Quadranten-Ausstrich eine gleich hohe Sensitivität und Spezifität, während sie bei der Applikation
mit einer Einmalöse vermindert waren. Aus diesem Grund sollten nur die (Tupfer-)Spot- und die
Quadrantenmethode zum Einsatz kommen (Swenson et al. 2001b). Darüberhinaus zeigte sich auch
die eingangs erwähnte deutliche Chargenabhängigkeit von den verwendeten Mueller-Hinton-Medien.
Untersuchungen verschiedener Arbeitsgruppen zur Spezifität und Sensitivität des Agar-Screen Tests
zeigten für S. aureus und Koagulase-negative Staphylokokken sehr gute Werte (Tab. 2). Probleme
traten auf bei BORSA-Stämmen, MRSA-Isolaten mit gering ausgeprägter Resistenz gegen andere
Antibiotikaklassen und extrem heterogen exprimierenden MRSA-Stämmen. Bei Koagulasenegativen Staphylokokken zeigte sich der Agar-Screen Test in zwei Untersuchungen nach 48 h
Bebrütung als äußerst sensitiv und spezifisch (Louie et al. 2001, Horstkotte 2003).
Tabelle 2: Detektion von MRSA und MRSE mittels Agar-Screen Test
Anzahl (N)
200
397
90
310
55
200 (KNST)*
201 (KNST)*
Sensitivität
(%)
98,0
99,0
93,3
Spezifität (%)
99,0
89,5
100
97,6
99,2
98,1
91,7
99
98,7
96
98,0
85,5
100
Bemerkungen
37 BORSA
NMDR MRSA
problematisch
Challenge set
Spot
Quadrant
Autor
Yamazumi 2001b
Louie 2000, Merlino 2002
Merlino 2002
Sakoulas 2001
Sakoulas 2001
(Louie 2001)
(Horstkotte, 2003)
KNST: koagulasenegative Staphylokokken, * NCCLS-Grenzwerte nach 48 h bei 35oC
NMDR: non-multidrug-resistant
6
Als Kontrollstämme sind im Agar-Screen Test ein heterogen-exprimierender mecA-positiver S.
aureus (z.B. ATCC 43300) sowie ein mecA-negativer S. aureus (z.B. ATCC 29213) mitzuführen.
Oxacillin MHK-Bestimmung mittels E-Test
Der E-Test (AB Biodisk, Solna, Schweden) hat sich mittlerweile als leicht durchführbare Alternative
zur Mikrodilutions-Methode für die MHK-Bestimmung bewährt. Nach Empfehlungen des
Herstellers soll für den Oxacillin E-Test Mueller-Hinton Agar mit 2% NaCl sowie ein Inokulum mit
einer Dichte entsprechend 1,0 McFarland angelegt werden. Die Bebrütung erfolgt bei 35oC für 24 h
(S. aureus) oder 48 h (Koagulase-negative Staphylokokken). Bei der Ablesung der MHK muss
schleierförmiges Wachstum, Mikrokolonien und einzeln stehende Kolonien im Bereich der
Hemmhofellipse als Wachstum berücksichtigt werden . Der Kontrollstamm S. aureus ATCC 43300
soll eine MHK von 16 bis 64 µg/ml aufweisen. Die Bewertung erfolgt nach den DIN- bzw.
NCCLS-Kriterien.
Die Validierung des Oxacillin E-Testes für S. aureus und Koagulase-negative Staphylokokken
(Felten et al. 2002, Frebourg et al. 1998, Huang et al. 1993, Louie et al. 2001, Merlino et al. 1993,
Monsen et al. 2002) ergab bei S. aureus eine etwas schlechtere Sensitivität als die MHKBestimmung mittels Mikrodilutions-Test nach NCCLS. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, daß
bei sehr heterogen exprimierenden MRSA die Ablesung der maximalen MHK der Gesamtpopulation
schwieriger ist als bei einer konventionellen MHK-Bestimmung. Die Spezifität erwies sich als sehr
gut.
Die Untersuchungen des Oxacillin E-Testes bei Koagulase-negativen Staphylokokken spiegeln die
Probleme der Grenzwertfestlegung bei diesen Erregern wieder. In zwei Studien war die Sensitivität
bei Anwendung der Grenzwerte der DIN (≥ 2 µg/ml) deutlich unter 90%, während der Grenzwert
der NCCLS (≥ 0,5 µg/ml) zu einer sehr guten Sensitivität führte (Frebourg et al. 1998, Monsen et al.
2002). Auch beim Oxacillin E-Test zeigte sich, dass die neuen Grenzwerte der NCCLS für
Koagulase-negative Staphylokokken anderer Spezies als S. epidermidis und S. haemolyticus zu
einer deutlich schlechteren Spezifität führen (Louie et al. 2001).
Immunchemischer Nachweis von PBP2a mittels Latexagglutination
Eine neue, attraktive Möglichkeit zur Detektion der Methicillin-Resistenz bei Staphylokokken ist der
direkte Nachweis des PBP2a mittels Latexagglutination mit einem für PBP2a spezifischen
monoklonalen Antikörper (MRSA-Screen, Denka Seiken, Japan; PBP2’ Latex Agglutination Kit,
Oxoid, UK). Der Test ist von der FDA zur Bestimmung der Methicillinresistenz bei S. aureus und
Koagulase-negativen Staphylokokken zugelassen und wird von der NCCLS auch für Koagulasenegative Staphylokokken empfohlen. Wichtig bei diesem Test ist die exakte Durchführung nach den
Angaben des Herstellers, da es sonst leicht zu falschen Ergebnissen kommen kann. Darüber hinaus
wird für Koagulase-negative Staphylokokken die Präparation des Testinokulums von einer Kultur
empfohlen, die für 24 h unter Induktion mit einem 1 µg Oxacillin-Plättchen subkultiviert wurde. Als
Kontrollstämme sollen MRSA ATCC 43300 bzw. der MSSA ATCC 29213 mitgeführt werden.
Zwar kann das Inokulum von Kulturen, die auf verschiedenen Agarmedien angezüchtet wurden,
hergestellt werden, die besten Ergebnisse werden jedoch mit Kolonien von Blutagar-Medien erzielt.
Das Testergebnis liegt innerhalb von 30 Minuten vor und trägt damit zur erheblichen Beschleunigung
des MRSA-Nachweises bei.
7
Untersuchungen zur Wertigkeit dieses Testverfahrens wurden von zahlreichen Arbeitsgruppen
durchgeführt (Andrews et al. 2000, Brown und Walpole 2001, Cuny et al. 1999, Felten et al. 2002,
Gosbell et al. 2001, Horstkotte et al. 2001a, Hussain et al. 2000 und 2002, Louie et al. 2000,
Merlino et al. 2002, Rohrer et al. 2001, Sakoulas et al. 2001, Swenson et al. 2001a, Yamazumi et
al. 2001 a + b, Zbinden et al. 2001). Dabei zeigte sich generell sowohl für S. aureus als auch für
Koagulase-negative Staphylokokken eine exzellente Sensitivität und Spezifität. Wenn falsch-positive
Resultate bei Koagulase-negativen Staphylokokken auftraten, war das meist bei den Spezies S.
lugdunensis, S. warneri, S. simulans und S. hominis zu beobachten. Da die Sensitivität des Tests
letztlich von der Quantität des exprimierten PBP2a abhängt, wurden die in einigen Studien
festgestellten Probleme einer geringeren Sensitivität entweder durch ein höheres Inokulum
(Horstkotte et al. 2001a, Sakoulas et al. 2001), eine verlängerte Agglutinationszeit (Swenson et al.
2001) oder eine Induktion der Expression von PBP2a durch ß-Laktamantibiotika gelöst (Hussain et
al. 2000 und 2001, Roher et al. 2001). Diese Modalitäten sind in der aktuellen Arbeitsvorschrift
berücksichtigt.
Automatisierte Resistenzbestimmungsverfahren
Im klinisch-mikrobiologischen Labor ergänzen bzw. ersetzen automatisierte Identifizierungs- und
Resistenzbestimmungssysteme wie VITEK-2 (bioMérieux), Phoenix (Becton Dickinson) und
MicroScan Walkaway (Dade Behring) zunehmend die klassischen manuellen oder
halbautomatisierten Verfahren. Ein Problem bei der Bewertung von Studien zur Validation dieser
Systeme zur Bestimmung der Methicillinresistenz von Staphylokokken ist, dass die für diese Systeme
angebotenen Reagenzien und die Auswertungssoftware einer kontinuierlichen Modifikation und
Verbesserung unterworfen sind und damit Angaben in Publikationen häufig schon wieder überholt
sind.
Beispielhaft seien Untersuchungen zur Validierung von VITEK 2 bei S. aureus und Koagulasenegativen Staphylokokken im Vergleich zur mecA-PCR dargestellt. Für S. aureus ergab sich in zwei
Studien eine gute Sensitivität und Spezifität (Felten et al. 2002, Sakoulas et al. 2001). Bei diesen
Studien wurde die in den VITEK 2 Karten parallel durchgeführte ausgedehnte Breakpoint-Analyse
im relevanten MHK-Bereich für Oxacillin und der Oxacillinresistenz-(OR)-Test allerdings nicht
getrennt ausgewertet. In einer Untersuchung mit Koagulase-negativen Staphylokokken zeigte sich
eine sehr gute Sensitivität für die im VITEK-2 durchgeführten ausgedehnten Breakpoint-Analyse im
relevanten MHK-Bereich mit den aktuellen Grenzwerten der NCCLS und für den OR-Test
(Horstkotte et al. 2002). Die Spezifität dieser Methode war im Vergleich zum OR-Test wesentlich
weniger günstig, wie sich dies auch für andere MHK-basierende Tests für Koagulase-negative
Staphylokokken ergeben hat. Ähnliche Spezifitäts-Probleme bei guter Sensitivität (99,2%), die mit
der Wahl der Grenzwerte durch die NCCLS für Koagulase-negative Staphylokokken
zusammenhängen, zeigten sich auch für das Phoenix-System (Horstkotte et al. 2001b).
Empfehlungen zur Bestimmung der Methicillinresistenz
Die unterschiedlichen Untersuchungen zur Validierung der verschiedenen Verfahren zur Bestimmung
der Methicillinresistenz bei Staphylokokken belegen, daß kein einzelnes Verfahren in der Lage ist, für
alle denkbaren problematischen Situationen optimale Ergebnisse zu liefern. Dies gilt sicher auch für
den molekularbiologischen Nachweis des mecA-Gens, der sich in Studienkonstellationen zwar als
Goldstandard etabliert hat, im Routineeinsatz jedoch ebenfalls mit Problemen der Sensitivität und
Spezifität behaftet ist.
8
Zur Detektion von Methicillin-resistenten S. aureus sollte grundsätzlich der Agar-Screen Test
eingesetzt werden. Wegen der großen Bedeutung der sicheren Detektion von MRSA sollte dieser
Test durch einen parallel durchgeführten zweiten phänotypischen Test wie z.B. Agardiffusionstest,
MHK-Bestimmung in der klassischen Mikrodilutions-Methode, Oxacillin E-Test oder auch durch
automatisierte Methoden der Resistenzbestimmung ergänzt werden. Wenn ein nicht eindeutiges oder
unplausibles Testergebnis vorliegt, muss die Testung mit einem weiteren Referenzverfahren überprüft
werden. In Frage kommen dabei der direkte Nachweis des PBP2a mittels Latexagglutination oder
ein genotypischer mecA-Nachweis mit einer validierten Methode.
Die Resistenztestung bei Koagulase-negativen Staphylokokken ist problematischer. Zwar ist die
Sensitivität der meisten Verfahren gut, jedoch ist die Spezifität der Detektion von Methicillinresistenten Koagulase-negativen Staphylokokken wesentlich vom verwendeten Grenzwert (DIN
oder NCCLS) abhängig. Derzeit ist die Diskussion über den "richtigen" Grenzwert nicht
abgeschlossen. Es wäre denkbar, dass Grenzwerte in Abhängigkeit von der jeweiligen Spezies zur
Lösung dieses Problems beitragen. Die NCCLS empfiehlt deshalb z.B. S. saprophyticus nicht
routinemäßig auf Oxacillinresistenz zu testen.
So ist derzeit für das Routinelabor neben der Speziesidentifizierung klinisch relevanter Koagulasenegativer Staphylokokken-Isolate zusätzlich zum Agar-Screen Test die MHK-Bestimmung
empfehlenswert. Als Alternative bietet sich z.B. Agardiffusionstest nach NCCLS-Version und
ergänzend der direkte PBP2a- oder ein genotypischer mecA-Nachweis an.
Befundinterpretation
Das Ziel der Resistenzbestimmung von Staphylokokken bezüglich Penicillin und Oxacillin ist die
interpretative Festlegung der Empfindlichkeit der Stämme gegen eine Reihe von ß-LaktamAntibiotika.
•
Bei Methicillin-Resistenz werden alle Staphylokokken als resistent gegen alle ß-LaktamAntibiotika interpretiert.
•
Bei Methicillin-empfindlichen Staphylokokken erfolgt die Interpretation auf der Grundlage
ihrer Empfindlichkeit gegenüber Penicillin:
o Bei Penicillinase-positiven Staphylokokken sind alle nicht Penicillinase-festen
Penicilline (klassische Penicilline, Aminopenicilline, Ureidopenicilline) als unwirksam
einzustufen. Penicillinase-feste Penicilline, Penicillin- ß-Laktamase-InhibitorKombinationen, parenterale und orale Cephalosporine der Gruppen 1 und 2 und
Carbapeneme sind als wirksam zu bewerten. Auch die Cephalosporine der 3. und 4.
Generation sind mit Ausnahme von Ceftazidim in der Regel gegen Staphylokokken
wirksam, sind aber aufgrund ihrer geringeren Aktivität nicht Mittel der Wahl bei
Infektionen mit Staphylokokken.
o Bei Penicillinase-negativen Staphylokokken sind alle Penicilline, Penicillinase-festen
Penicilline, Carbapeneme und parenterale und orale Cephalosporine der Gruppen 1
und 2 als wirksam einzustufen. Für die übrigen Cephalosporine gilt das oben
gesagte.
9
o Die oralen Cephalosporine der Gruppe 3 haben eine geringe Aktivität gegen
Staphylokokken und sind zum Teil unwirksam gegen diese Erreger (Scholz et al.
1999).
RESISTENZ VON STAPHYLOKOKKEN GEGEN GLYKOPEPTIDE
Grundsätzlich lassen sich derzeit zwei unterschiedliche Formen der Glykopeptidresistenz bei
Staphylokokken unterscheiden (Walsh und Howe, 2002). Erstmals beschrieben Hiramatsu et al.
(1997) einen klinischen MRSA-Stamm Mu50 mit einer MHK für Vancomycin von 8 µg/ml. Die
Bewertung dieses Stammes hängt entscheidend von den verwendeten Grenzwerten ab. Nach
NCCLS (≤ 4 µg/ml sensibel, ≥ 32 µg/ml resistent) ist dieser Stamm als intermediär zu bewerten.
Gleiches gilt für die Grenzwerte des DIN (≤ 4 µg/ml sensibel, ≥ 16 µg/ml resistent). Die British
Society for Antimicrobial Chemotherapy gibt jedoch einen Grenzwert von 4 µg/ml für Vancomycin
an, womit dieser Stamm als resistent zu bewerten ist (Walsh et al., 2001). Stämme dieser Art
werden derzeit als VISA oder GISA bezeichnet. Die verminderte Vancomycin-Empfindlichkeit hat
vermutlich auch klinische Relevanz, da ein Versagen einer Therapie mit Vancomycin bei Infektionen
mit solchen Stämmen beschrieben wurde (Smith et al., 1999). Zusätzlich wurden Stämme wie der
MRSA Mu3 beschrieben, die zwar eine MHK gegenüber Vancomycin von 4 µg/ml hatten, bei
denen jedoch eine Subpopulation (bis zu 1 von 106 Zellen) eine MHK > 4 µg/ml aufwiesen
(Hiramatsu, 1997). Solche Stämme werden als hetero-VISA (hVISA) oder hGISA bezeichnet. Die
klinische Bedeutung von hGISA ist derzeit ungewiß. Möglicherweise sind jedoch solche Stämme
Vorläufer von GISA, die unter Vancomycintherapie selektioniert werden können.
Alle bisherigen Untersuchungen zeigen, daß GISA und hGISA auch eine verminderte Empfindlichkeit
gegenüber Teicoplanin aufweisen (Walsh et al., 2001). Die Grenzwerte für die Beurteilung der
Teicoplanin-Empfindlichkeit sind nach NCCLS (≤ 8 µg/ml sensibel; ≥ 32 µg/ml resistent) und nach
DIN (≤ 4 µg/ml sensibel; ≥ 16 µg/ml resistent) ebenfalls verschieden.
Bisher wurden weltweit 21 GISA-Stämme isoliert und beschrieben (Walsh und Howe, 2002). Die
Prävalenz von hGISA wird in den meisten Untersuchungen sehr niedrig angegeben (um 1%), jedoch
wurde auch ein Anteil von bis zu 20% mitgeteilt (Walsh und Howe, 2002). GISA-Stämme wurden
auch in Deutschland nachgewiesen, die Prävalenz ist derzeit aber sehr niedrig (Geisel et al., 1999;
Bierbaum et al., 1999). Problematisch bei der Beurteilung von Studien zur Prävalenz von hGISA ist
die bisher fehlende Standardisierung und Validierung der in den verschiedenen Untersuchungen
angewandten Techniken zur Detektion von hGISA, so daß die epidemiologischen Aussagen derzeit
unsicher sind.
Von GISA/hGISA-Stämmen abzugrenzen sind S. aureus Stämme mit einer echten VancomycinResistenz, die durch Transfer der vanA-Determinante von Vancomycin-resistenten Enterokokken
entstanden sind. Erstmals wurden im Jahre 2002 zwei derartige klinische MRSA-Isolate in den USA
mit einer Vancomycin-MHK von bis zu 1024 µg/ml nachgewiesen und als VRSA bezeichnet (Chang
et al. 2003). Die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von vanA- oder vanB-vermittelter Resistenz ist
wegen der derzeit noch geringen Prävalenz von VRE in Deutschland als extrem gering anzusehen. Ein
Auftreten solcher
10
Stämme ist allerdings auch in Deutschland nicht auszuschließen. Bei Koagulase-negativen
Staphylokokken sind insbesondere bei der Spezies S. epidermidis und S. haemolyticus vereinzelt
klinische Stämme mit verminderter Vancomycin-Empfindlichkeit und sogar Resistenz gegen
Teicoplanin beschrieben worden (Srinivasan et al., 2002). Eine durch vanA und vanB oder andere
aus Enterokokken stammende Resistenzdeterminanten verursachte Resistenz gegen Glykopeptide ist
bei Koagulase-negativen Staphylokokken bisher nicht aufgetreten.
DETEKTION VON GISA UND VRSA
Ziel der Empfindlichkeitstestung von Glycopeptiden bei Staphylokokken muß es sein, sowohl
Staphylokokken mit einer vanA- oder vanB-vermittelten Resistenz (VRSA) als auch GISA/hGISA
zu erkennen.
Der Agardiffusionstest ist für die Detektion von VRSA und GISA/hGISA nicht geeignet (Walsh and
Howe, 2002). Auch mit automatisierten Resistenzbestimmungssystemen wie MicroScan und VITEK
wurde über Probleme mit der Sensititvität berichtet (Srinivasan et al., 2002; Midolo et al., 2003).
Für VITEK wird derzeit deswegen vom Hersteller empfohlen, alle Isolate mit einer VancomycinMHK von 4 µg/ml mit einem unabhängigen Verfahren auf GISA/hGISA zu prüfen (K. Kähler,
BioMérieux, persönliche Mitteilung). Eine definitive Bestätigung von GISA/hGISA erfordert eine
Populationsanalyse, die in der Regel nur von Referenzlaboratorien durchgeführt werden kann.
Die Detektion von VRSA ist mit einem Agar-Screen Test (BHI-Agar + 4 µg/ml Vancomycin) oder
auch dem Bouillon-Dilutionsverfahren nach NCCLS oder DIN oder mittels E-Test möglich. Auf der
Grundlage der bisherigen wissenschaftlichen Untersuchungen ist der Agar-Screen Test
wahrscheinlich am empfindlichsten. Die anderen Verfahren, die zum Nachweis Vancomycinresistenter Enterokokken empfohlen werden, sind vermutlich aber auch geeignet, es liegen allerdings
noch keine ausreichenden Erfahrungen vor.
Auch bei Koagulase-negativen Staphylokokken kann nur durch ein MHK-Bestimmung eine
reduzierte Glykopeptidempfindlichkeit festgestellt werden. Sowohl Agardiffusionstest als auch
automatisierte Verfahren weisen eine geringe Sensitivität auf (Jones et al. 2000).
Dem klinisch-mikrobiologischen Labor stehen zum Screening auf GISA/hGISA verschiedene Tests
zur Verfügung. Zu beachten ist, daß die wissenschaftliche Diskussion über das optimale
Nachweisverfahren noch nicht abgeschlossen ist. Nach dem derzeitigen Stand sind im Routinelabor
drei Verfahren möglich:
• Vereinfachte Populationsanalyse
• E-Test (Makroverfahren‚Walsh et al. 2001)
• Bouillon-Dilution nach NCCLS
1. Vereinfachte Populationsanalyse:
Bei der vereinfachten Populationsanalyse werden 10 µl einer Suspension (0,5 McFarland) des
Teststammes auf eine BHI-Agarplatte mit 4 µg/ml Vancomycin aufgebracht. Die Inkubation
erfolgt für insgesamt 48 h bei 37 oC (Witte 1997, Walsh et al. 2001). Bei Wachstum nach 24 h
kann ein GISA-Phänotyp (cave VRSA) angenommen werden. Bei Wachstum nach 48 h kann ein
hGISA-Phänotyp angenommen werden. Dieses Verfahren kann GISA/hGISA von normalen
MRSA mit einer Sensitivität von 71% und einer Spezifität von 88% unterscheiden (Walsh et al.
2001). Eine Modifikation dieses Verfahrens sieht die Applikation von 10 µl einer BHI-Bouillon
Übernachtkultur auf MHA + 5 µg/ml Teicoplanin vor. Die Bebrütung erfolgt ebenfalls für 24 bzw.
11
48 h. Obwohl derzeit keine publizierten Ergebnisse zur Validität dieses Verfahrens vorliegen, wird
es vom European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) als besonders sensitiv
zum Screening auf GISA/hGISA empfohlen (T. R. Walsh, University of Bristol, UK, persönliche
Mitteilung).
2. Für den E-Test in der "Makroversion" wird der Teststamm auf eine Dichte entsprechend 2,0
McFarland eingestellt und ein Aliquot von 200 µl auf BHI-Agar ausgespatelt oder mit einem
Tupfer gleichmäßig verteilt (Walsh et al. 2001). Nach Antrocknen des Inokulums werden
Vancomycin und Teicoplanin E-Teststreifen appliziert. Inkubation erfolgt bei 35oC für 48 h (AB
Biodisk, Beschreibung des Herstellers). Die Ablesung der MHK erfolgt unter der
Berücksichtigung von Mikrokolonien, einzeln stehenden Kolonien und schleierförmigem
Wachstum. Als verdächtig für GISA/hGISA gelten Stämme mit Vancomycin und TeicoplaninMHK ≥ 8 µg/ml oder Teicoplanin-MHK ≥ 12 µg/ml. Das beschriebene Verfahren erwies sich als
das mit der besten Sensitivität (96%) und Spezifität (97%) zur Abgrenzung von GISA/hGISA von
normalen MRSA (Walsh et al. 2001).
3. Die NCCLS empfiehlt beim Bouillon-Dilutionstest für Vancomycin die Einhaltung einer
Inkubationszeit von 24 h, damit auch GISA erkannt werden. Bei Inkubation für nur 18 h wurde
eine schlechte Sensitivität (11%) für die Abgrenzung von GISA/hGISA von normalen MRSA
festgestellt, die auch bei Verwendung von Teicoplanin nur wenig besser wurde (Sensitivität 40%)
(Walsh et al. 2001). Problematisch war vor allem die Detektion von hGISA.
Nach dem derzeitigen Kenntnisstand ist der E-Test in der Makroversion das am besten validierte
Verfahren zur Detektion von GISA/hGISA, ist jedoch mit relativ hohen Kosten verbunden.
EMPFEHLUNGEN ZUR BESTIMMUNG DER WIRKSAMKEIT VON GLYKOPEPTIDEN
•
Wenn eine Empfindlichkeitsprüfung von S. aureus Isolaten gegen Glykopeptide durchgeführt
wird, muß diese mit einem geeigneten Verfahren erfolgen, das eine vanA- oder vanB- oder
durch andere Resistenzdeterminanten von Enterokokken vermittelte Glykopeptidresistenz
ausschließt (VRSA). Hierzu kann aufgrund der Datenlage derzeit uneingeschränkt nur der AgarScreen Test (BHI-Agar + 4 µg/ml Vancomycin) empfohlen werden.
•
Ein Screening auf GISA/hGISA ist zumindest bei den S. aureus Stämmen von Patienten
empfehlenswert, bei denen eine längerdauernde Glykopeptidtherapie (> 6 Wochen) erfolgt. Es
ist sinnvoll, auf GISA/hGISA in einem zweistufigen Test zu untersuchen. Im ersten Schritt wird
die vereinfachte Populationsanalyse durchgeführt. Im positiven Fall sollte wegen der relativ
geringen Spezifität der vereinfachten Populationsanalyse im zweiten Schritt der E-Test in der
Makroversion durchgeführt werden, der ebenfalls jedem klinisch-mikrobiologischen Labor
verfügbar ist. Als Qualitätskontrolle können S. aureus Mu50 (GISA), Mu3 (hGISA) und z.B.
ATCC 29213 verwendet werden.
Bestätigt sich der Verdacht auf GISA/hGISA, sollten die Isolate zur weiteren Untersuchung an
ein Referenzlaboratorium (z.B. Nationales Referenzzentrum für Staphylokokken, Wernigerode)
versandt werden. Hierbei soll der verdächtige Stamm direkt mit der E-Testplatte versandt
werden.
12
•
Für Koagulase-negative Staphylokokken können diese Verfahren sinngemäß angewendet
werden, jedoch liegen keine Untersuchungen zur Sensitivität und Spezifität der Detektion von
Koagulase-negativen Staphylokokken mit verminderter Empfindlichkeit gegen Glykopeptide vor.
MLS B-RESISTENZ BEI STAPHYLOKOKKEN UND STREPTOKOKKEN
Die Resistenz gegenüber Makroliden und Lincosamiden ist durch drei Mechanismen bedingt
(Douthwaite 2001, Leclercq 2002):
• Veränderungen an der ribosomalen Bindungsstelle durch Methylierung oder Mutation (target-site
modification)
• Effluxmechanismen
• Enzymatische Inaktivierung
Im Vordergrund stehen dabei die ersten beiden Mechanismen, während die enzymatische
Inaktivierung der Antibiotika nur eine untergeordnete Rolle spielt.
Der Wirkmechanismus der Makrolide und der anderen Vertreter der MLS B-Antibiotika, zu denen
die Lincosamide, Ketolide und Streptogramine der Gruppe B gehören (Tab. 3), beruht auf der
Hemmung der bakteriellen Proteinsynthese durch ihre Bindung im Bereich des Peptidyl-TransferaseZentrums innerhalb der 50S-Untereinheit des bakteriellen Ribosoms, welche dazu führt, dass die
Translation der Messenger-RNA verhindert wird (Douthwaite und Champney 2001). Makrolide
binden an die Nukleotide A2058 und A2059 der Domäne V der 23S rRNA sowie in geringerem
Ausmaß an A752 der Domäne II. Die Ketolide zeichnen sich gegenüber den Makroliden durch eine
erheblich stärkere Bindung an A752 aus. Letztendlich kommt es zu einer Blockierung des PeptidExit-Channels der ribosomalen 50S-Untereinheit und einem Abbruch der wachsenden Peptidkette.
Außerdem verhindern Makrolide und Ketolide offenbar den Aufbau neuer 50S-Untereinheiten des
bakteriellen Ribosoms aus ihren Vorstufen, u.a. 5S- und 23S rRNA (Douthwaite und Champney
2001).
13
Tab. 3: Übersicht über MLS-Antibiotika
Substanzklasse
Antibiotikum
Handelsname (Auswahl)
Erythromycin
Clarithromycin
Dirithromycin
Oleandomycin
Roxithromycin
Erythrocin®
Klacid®
mit 15-gliedrigem Laktonring
(Azalide)
Azithromycin
Zithromax®
Josamycin
Rokitamycin
Spiramycin
Wilprafen®
Ketolide
Telithromycin
Ketek®
Lincosamide
Lincomycin
Clindamycin
Albiotic®
Sobelin®
Makrolide
Streptogramine 1
Gruppe A
Gruppe B
1
Rulid®
Selectomycin®
Dalfopristin
Pristinamycin IIA
Virginiamycin M
Quinupristin
Pristinamycin IA
Im Handel befindliche Streptogramin-Antibiotika enthalten ein Gemisch aus jeweils einem StreptograminAntibiotikum der Gruppe B und A: Pristinamycin IA und Pristinamycin IIA (Pristinamycin), Quinupristin und
Dalfopristin (Synercid®)
Target-site Modifikationen
Methylierung der ribosomalen Bindungsstelle
Durch Methylierung der Bindungsstelle A2058 der 23S rRNA innerhalb der großen ribosomalen
50S-Untereinheit erfolgt eine Konformationsänderung der 23S rRNA, durch die die Bindung von
Erythromycin an seine Zielstruktur verhindert wird (Leclercq 2002). Als Folge ihrer überlappenden
ribosomalen Bindungsstellen wird auch die Bindung von Lincosamiden und Streptograminen der
Gruppe B beeinträchtigt, wodurch eine Kreuzresistenz gegenüber allen Makroliden, Lincosamiden
und Streptograminen der Gruppe B (sogenannter MLS B-Resistenzphänotyp) resultiert. Durch ihre
erhaltene Bindung an die Domäne II (A752) wird die Aktivität der Ketolide gegenüber S.
pneumoniae, S. pyogenes und anderen Streptokokken dagegen in der Regel nur unwesentlich
vermindert (MHK 0.06-1 mg/l gegenüber 0.004-0.015 mg/l bei S. pneumoniae Wildtyp-Stämmen).
14
Bei S. aureus mit induzierbarer MLSB-Resistenz (s.u.) liegen die MHK-Werte zwischen 0.06 und
0.25 mg/l, bei konstitutiver Expression der MLS B-Resistenz dagegen bei = 128 mg/l (Felmingham
2001). Die für die Methylierung verantwortliche Methylase wird durch Plasmid- oder Transposonübertragene erm-Gene (erythromycin ribosome methylase) kodiert, von denen bisher über 40
verschiedene Gene beschrieben sind. Die wichtigsten gehören den bei Staphylokokken
vorkommenden Klassen erm (A) und erm (C) sowie der bei Streptokokken und Enterokokken
vorkommenden Klasse erm (B) an.
Die Expression der MLS B-Resistenz kann konstitutiv oder induzierbar sein. Im ersteren Fall wird
aktive Methylase-mRNA auch ohne einen Induktor gebildet, während im Falle der induzierbaren
MLSB-Resistenz eine inaktive mRNA gebildet wird, die erst in Anwesenheit eines Induktors aktiv
wird und die Produktion der Methylase erlaubt. Diese Induktion ist abhängig von der Anwesenheit
eines Attenuators strangaufwärts des erm-Gens. Bakterienstämme mit induzierbarem erm-Gen sind
resistent gegenüber dem Induktor, bleiben aber empfindlich für Non-Induktoren wie z.B.
Clindamycin und Telithromycin. Während die konstitutive Methylase-Produktion zu dem oben
erwähnten charakteristischen MLS B-Resistenz-Phänotyp führt, kann die Diversität der induzierbaren
Makrolidresistenz dagegen zu sehr unterschiedlichen Resistenz-Phänotypen führen.
Expression der MLS B-Resistenz bei Staphylokokken
Bei Methicillin-resistenten Staphylokokken dominieren die auf Transposons kodierten Gene der
erm(A) Klasse, während bei Methicillin-sensiblen Staphylokokken Plasmid-übertragene Gene der
erm(C) Klasse für die Makrolid-Resistenz verantwortlich sind. Die Resistenzphänotypen bei
induzierbarer Expression sind ähnlich, die Stämme sind resistent gegenüber Makroliden mit 14- und
15-gliedrigem Laktonring, welche als Induktoren fungieren, während Makrolide mit 16-gliedrigem
Laktonring, Lincosamide, Streptogramine der Gruppe B und Ketolide nicht als Induktoren fungieren
und aktiv bleiben. Allerdings kann die induzierbare Expression der Resistenz durch eine einzige
Punktmutation in der Attenuator-Region der induzierbaren ermC Methylase in eine konstitutive
Expression der MLS B-Resistenz übergehen, so dass in vitro in Anwesenheit von Lincosamiden eine
Selektion konstitutiv resistenter Mutanten in einer Häufigkeit von 1:107 KBE auftritt (Leclercq 2002).
Bei Infektionen mit hohen bakteriellen Inokula wie Pneumonie, Mediastinitis und ausgedehnten Haut/Weichteilinfektionen kann eine solche Selektion auch in vivo erfolgen und bei einer Therapie mit
Lincosamiden zu einem Therapieversagen führen (Drincovic et al. 2001). Auch bei Ketoliden ist eine
in vitro Selektion konstitutiv resistenter Mutanten beschrieben (T. Wichelhaus, Frankfurt, persönl.
Mitteilung). Beide Substanzen stellen daher bei Infektionen mit Staphylokokken mit induzierbarer
MLSB-Resistenz keine vertretbare Therapieoption dar (siehe Tab. 4).
Expression der MLS B-Resistenz bei Streptokokken und Enterokokken
Hier ist die Resistenz in der Regel durch Gene der erm(B) Klasse, seltener durch Gene der erm(TR)
Untergruppe der erm(A) Klasse bedingt. Die allerdings viel seltener bei S. pneumoniae als bei S.
pyogenes vorkommende induzierbare Resistenz (Montanari et al. 2001) kann im Gegensatz zu den
Staphylokokken zu ganz unterschiedlichen Resistenz-Phänotypen führen, wobei sowohl Low-LevelResistenz als auch Hochresistenz gegenüber Makroliden und Empfindlichkeit aber auch Resistenz
gegenüber Clindamycin beobachtet wird.
Im Gegensatz zu den Staphylokokken fungieren bei den Streptokokken die meisten MLS15
Antibiotika, einschließlich der Makrolide mit 16-gliedrigem Laktonring und Clindamycin, nicht
dagegen Telithromycin, als Induktoren der MLS B-Resistenz (Douthwaite und Champney 2001,
Leclercq 2001). Wie bei Staphylokokken wird auch bei Streptokokken mit induzierbarer MLS BResistenz von einer Therapie mit Clindamycin abgeraten (Leclercq 2002), während die Ketolide in
der Regel wirksam bleiben (Felmingham 2001).
Target-Site-Mutationen
Mutationen im Bereich der ribosomalen Bindungsstelle A2059 sowie innerhalb der Gene, die für die
ribosomalen Proteine L4 und L22 kodieren, sind weitere Mechanismen, die zur Resistenz von S.
pneumoniae gegenüber Makroliden, nicht aber gegenüber Clindamycin führt (Vester und
Douthwaite 2001). Mutationen an der Position 2058 (A2058G bei S. pneumoniae) führen dagegen
zur klassischen MLSB-Resistenz. Die Häufigkeit und klinische Bedeutung dieser und anderer
Mutationen ist aber bisher nicht ausreichend geklärt.
Efflux
Effluxmechanismen, die zur Makrolid-Resistenz führen, sind bei grampositiven Bakterien auf zwei
Transportsysteme zurückzuführen. Dies sind bei Staphylokokken ABC (ATP binding cassette)
Transporter, die durch Plasmid-übertragene msr (A) Gene (macrolide streptogramin resistance)
kodiert werden und als spezifische Effluxpumpe für Makrolide mit 14- und 15-gliedrigem Laktonring
und Streptogramine der Gruppe B fungieren, während Makrolide mit 16-gliedrigem Laktonring,
Lincosamide und Telithromycin nicht transportiert werden. Der resultierende Resistenz-Phänotyp ist
der MSB-Phänotyp. Makrolide mit 16-gliedrigem Laktonring, Clindamycin, Telithromycin und
Streptogramine der Gruppe A bleiben gegenüber Stämmen mit diesem Resistenz-Mechanismus
daher uneingeschränkt wirksam (Leclercq 2001, Felmingham 2001, Leclercq 2002).
Bei S. pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae sowie weiteren Streptokokken-Spezies und bei
Enterokokken wird der Effluxmechanismus auf einen Transporter der major facilitator superfamily
(MFS) zurückgeführt, für den mef (A) Gene (macrolide-specific efflux) kodieren. Von diesem
Effluxmechanismus sind lediglich die Makrolide mit 14- und 15-gliedrigem Laktonring betroffen,
nicht dagegen Makrolide mit 16-gliedrigem Ring, Ketolide, Lincosamide und Streptogramine der
Gruppe B. Der resultierende Resistenz-Phänotyp wird daher als M-Phänotyp bezeichnet, er geht in
der Regel mit einer Low-level-Resistenz gegenüber Makroliden einher (Appelbaum 2002).
Enzymatische Inaktivierung
Die enzymatische Inaktivierung von MLS-Antibiotika spielt bisher keine wesentliche Rolle. In einer
Häufigkeit von < 1% bei S. aureus und 1-7% bei Koagulase-negativen Staphylokken tritt eine
Lincosamid-Nukleotidyltransferase auf, die von lnu (A) und lnu (B) kodiert wird und zu einer
Resistenz gegenüber Lincomycin, nicht aber gegenüber Clindamycin führt. Die Detektion dieses
Resistenzmechanismus ist daher nur bei Testung von Lincomycin möglich. Bei den von diesem
Resistenzmechanismus betroffenen Stämmen geht allerdings die ohnehin nur schwache bakterizide
Wirkung von Clindamycin vollständig verloren (Leclercq et al. 1987).
16
EPIDEMIOLOGIE
Bei S. pneumoniae und in geringerem Ausmaß auch bei S. pyogenes ist es in den letzten Jahren
weltweit zu einem erheblichen Anstieg der Makrolid-Resistenz gekommen (Appelbaum 2002). In
Deutschland liegt die Prävalenz bei S. pneumoniae z. Zt. zwischen 15 und 25%, bei S. pyogenes bei
etwa 14% (Reinert et al. 2003). Während in einzelnen Ländern wie Frankreich, Spanien und Ungarn
der erm (B) Resistenzmechanismus und damit der MLSB-Phänotyp bei S. pneumoniae mit über
95% bei weitem überwiegt, sind in Deutschland erm (B)- und mef (A)-Resistenz (M-Phänotyp)
etwa gleich häufig nachzuweisen. In den USA dagegen dominiert die mef (A)-bedingte Resistenz
(M-Phänotyp) mit einem Anteil von über 60% (Farell et al. 2002). Diese regional unterschiedliche
Prävalenz der verschiedenen Resistenzmechanismen bei S. pneumoniae muß bei der empirischen
Therapie von ambulant erworbenen Atemwegsinfektionen, insbesondere der ambulant erworbenen
Pneumonie, bei denen Pneumokokken eine entscheidende Rolle spielen, berücksichtigt werden, da
bei überwiegend Efflux-bedingter Low-level-Resistenz Makrolide noch eine gewisse Bedeutung
haben können, während bei Vorherrschen der erm bedingten MLSB-Resistenz der empirische
Einsatz von Makroliden zunehmend hinterfragt werden muss.
Die Prävalenz der MLSB-Resistenz bei S. aureus korreliert eng mit der MRSA-Prävalenz, d.h. bei
MRSA-Stämmen liegt in über 80% der Fälle gleichzeitig eine in der Regel konstitutive erm (A)bedingte MLSB-Resistenz vor. Eine Efflux-bedingte Makrolid-Resistenz ist bei MRSA dagegen
äußerst selten (Schmitz et al. 2000). Bei MSSA-Stämmen liegt die Resistenzhäufigkeit gegenüber
Makroliden in Deutschland aktuell bei 14% und gegenüber Clindamycin bei etwa 3% (PEG-Studie
2001. M. Kresken, Bonn, persönliche Mitteilung). In einer europäischen Studie betrug die Prävalenz
des MLS B-Phänotyps bei Makrolid-resistenten MSSA Stämmen 82% (bei etwa gleich häufigem
Auftreten des konstitutiven und des induzierbaren Resistenzphänotyps) gegenüber einer Prävalenz
der Efflux-bedingten Resistenz (MSB-Phänotyp) von nur 13% (Schmitz et al. 2000).
DIAGNOSTIK
Der Nachweis der Makrolid-Resistenz mit den üblichen Methoden der Resistenzbestimmung –
Agardiffusion, Agardilution, Mikroboullion-Dilution, etc. – unter Verwendung der anerkannten
Grenzwerte für Hemmhofdurchmesser bzw. MHK ist unproblematisch. Aufgrund der immer
vorhandenen Kreuzresistenz innerhalb der Makrolide mit 14- und 15-gliedrigem Laktonring ist es
zweckmäßig, Erythromycin stellvertretend für die ganze Gruppe zu testen, stellvertretend für die
Gruppe der Lincosamide wird üblicherweise Clindamycin verwendet.
Problematischer dagegen ist der phänotypische Nachweis der einzelnen Resistenz-Mechanismen,
welche ja eine erhebliche Auswirkung auf die Wirksamkeit der anderen Antibiotika aus der Gruppe
der MLS-Antibiotika, insbesondere Clindamycin, Streptogramine und Ketolide haben. Der
einfachste und zuverlässigste phänotypische Test zum Nachweis einer erm-bedingten induzierbaren
oder konstitutiven MLSB-Resistenz ist der Agardiffusionstest in Form des DoppeldiskAnnäherungstests (DD-Test), bei dem man ein Erythromycin-(15 µg)-Testplättchen sowie ein
Clindamycin-(2 µg)-Testplättchen in einem Abstand von ca. 25 mm auf die Agarplatte aufbringt
(Waites et al. 2000, Montanari et al. 2001). Am einfachsten ordnet man hierzu die beiden
Antibiotika-Testplättchen im routinemäßig verwendeten Agardiffusionstest nebeneinander an.
17
Die konstitutive MLSB-Resistenz ist durch eine Resistenz gegenüber Erythromycin und Clindamycin
gekennzeichet, während die induzierbare MLSB-Resistenz durch einen Antagonismus zwischen
Erythromycin und Clindamycin nachweisbar ist, der durch Ausbildung einer D-förmigen
Wachstumszone innerhalb eines großen Clindamycin-Hemmhofs in dem Bereich, der dem
Erythromycin-Testblättchen benachbart ist, erkennbar wird (positiver DD-Test als Zeichen der
Resistenz-Induktion, Abb. 1). Ein negativer DD-Test spricht bei nachgewiesener ErythromycinResistenz dagegen für eine Efflux-bedingte Makrolid-Resistenz, also einen MSB-Phänotyp bei
Staphylokokken (Abb. 2) bzw. einen
M-Phänotyp bei S. pneumoniae und anderen
Streptokokken.
In der Regel sind die MHK-Werte von Erythromycin bei S. pneumoniae bei erm-bedingter MLSBResistenz mit einer MHK90 von ≥ 128 µg/mL höher als bei Efflux-bedingter Makrolid-Resistenz mit
einer MHK90 von 16 µg/mL (range 0.5-64 µg/mL) (Farrell et al. 2002). Dennoch ist aufgrund der
erheblichen Überschneidung der MHK-Werte, die bei Makrolid-resistenten S. aureus und S.
pneumoniae Stämmen mit erm-bedingter versus Efflux-bedingter Makrolid-Resistenz beobachtet
wurden, eine sichere Abgrenzung der beiden wichtigsten Resistenzmechanismen insbesondere im
Bereich mittlerer MHK-Werte, für Erythromycin also im Bereich von 4-32 µg/mL, nicht möglich.
Besonders problematisch sind hier automatisierte Resistenzbestimmungssysteme, die nur mit der
Breakpointmethode arbeiten oder bei denen die Erythromycin-MHK nur bis zu einem MHK-Wert
von 8 µg/mL angegeben wird.
Ein endgültiger Nachweis des jeweiligen Resistenzmechanismus lässt sich nur mit
molekularbiologischen Methoden, z.B. mittels PCR-Amplifikation der entsprechenden ResistenzGene erreichen (Farell et al. 2001).
Abb. 1: Nachweis der induzierbaren MLSb
Resistenz von S. aureus durch einen positiven
Doppeldisk-Annäherungstest (DD-Test):
Resistenz gegenüber Erythromycin (E),
Empfindlichkeit gegenüber Clindamycin (DA),
jedoch mit Ausbildung einer D-förmigen
Wachstumszone innerhalb des ClindamycinHemmhofs, Empfindlichkeit gegenüber
Quinopristin/Dalfopristin (QD).
Abb. 2: Nachweis der konstitutiven MLSb
Resistenz von S. aureus im DD-Test:
Resistenz gegenüber Erythromycin (E) und
Clindamycin (DA), Empfindlichkeit gegenüber
Quinopristin/Dalfopristin (QD).
BEFUNDINTERPRETATION
18
Staphylokokken (Tab. 4)
Bei Nachweis des konstitutiven MLSB-Phänotyps (erm-Genotyp) besteht eine Resistenz gegenüber
sämtlichen Makroliden, Lincosamiden, Telithromycin und Streptogramin B-Antibiotika, nicht aber
gegenüber Streptograminen der Gruppe A. Das aus einem Streptogramin der Gruppe A und einem
Streptogramin der Gruppe B bestehende Kombinationspräparat Quinupristin/Dalfopristin ist daher
bei erhaltener Empfindlichkeit gegenüber Dalfopristin (ein Streptogramin der Gruppe A) durch die
Resistenz gegenüber Quinupristin (ein Streptogramin der Gruppe B) zwar noch wirksam gegen S.
aureus und andere Staphylokokken, seine für die Kombination nachgewiesene bakterizide Wirkung
geht jedoch verloren (Cocito et al. 1997). Dies ist bedeutsam z.B. bei der Therapie von MRSAInfektionen, insbesondere wenn - wie bei der Endokarditis - eine Therapie mit einem bakterizid
wirkenden Antibiotikum erforderlich ist.
Bei Nachweis einer induzierbaren MLSB-Resistenz bleiben Clindamycin, Telithromycin und
Streptogramine wirksam, allerdings sollte Clindamycin und Telithromycin insbesondere bei der
Behandlung schwerer Staphylokokkeninfektionen nicht eingesetzt werden, da unter dieser Therapie
eine Selektion von Mutanten mit konstitutiver MLSB-Resistenz auftreten kann und ein
Therapieversagen unter Clindamycin wiederholt beschrieben ist (Watanakunakorn 1976, Panagea et
al. 1999, Drincovic et al. 2001). Bei induzierbarer MLS B-Resistenz bleibt die bakterizide Wirkung
von Quinupristin/Dalfopristin erhalten, da Streptogramine der Gruppe B keine Induktoren der
MLSB-Resistenz sind.
Bei Nachweis des MSB-Resistenzphänotyps (msr (A)-Genotyp) ist der therapeutische Einsatz von
Clindamycin, ebenso wie der des Ketolids Telithromycin unbedenklich.
Tab. 4: MLS-Resistenz bei Staphylokokken
Resistenz-Testung
Phänotyp
Abgeleiteter
Genotyp
erm
Ery-R, Cli-R, Teli-R
MLSB konstitutiv
Ery-R, Cli-S, Teli-S
Positiver DD-Test
Negativer DD-Test
MLSB induzierbar
erm
MSB
msr
Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-R, TeliR, QD-S (nicht bakterizid)
Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-R, TeliR, QD-S (bakterizid)
Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-S, TeliS, QD-S (nicht bakterizid)
Ery - Erythromycin, Clari - Clarithromycin, Azi - Azithromycin, Cli - Clindamycin, Teli - Telithromycin, QD Quinupristin/Dalfopristin, DD-Test - Double-disk-Test
Streptokokken (Tab. 5)
Konstitutive MLSB-Resistenz bedeutet wiederum vollständige Kreuzresistenz zwischen allen
Makroliden, Lincosamiden und Streptogramin B-Antibiotika. Die Aktivität von Telithromycin bleibt
bei Streptokokken dagegen weitgehend erhalten, eine Selektion resistenter Mutanten erfolgt nicht
(Felmingham 2001). Gleichermaßen wie bei Staphylokken sollten auch bei Streptokokken mit
induzierbarer MLSB-Resistenz weder Makrolide noch Clindamycin in der Therapie eingesetzt
19
werden.
Bei Nachweis des M-Resistenzphänotyps (mef (A)-Genotyp) besteht Resistenz gegenüber allen
Makroliden mit 14- und 15-gliedrigem Laktonring; Makrolide mit 16-gliedrigem Laktonring,
Ketolide, Clindamycin und Streptogramine bleiben dagegen wirksam.
Tab. 5: MLS-Resistenz bei S. pneumoniae und anderen Streptokokken
Resistenztestung
Ery-R, Cli-I/R, Teli-S
Phänotyp
Abgeleiteter
Genotyp
MLSB konstitutiv erm
Positiver DD-Test
Negativer DD-Test
MLSB
induzierbar
M
erm
mef
Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-R, TeliS, QD-S (nicht bakterizid)
Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-R, TeliS, QD-S (bakterizid)
Ery-R, Clari-R, Azi-R, Cli-S, TeliS, QD-S (bakterizid)
Ery - Erythromycin, Clari - Clarithromycin, Azi - Azithromycin, Cli - Clindamycin, Teli - Telithromycin, QD Quinupristin/Dalfopristin, DD-Test - Double-disk-Test
EXTENDED-SPECTRUM ß-LAKTAMASEN
Die häufigste Ursache für ß-Laktamase-vermittelte Resistenz von Enterobakterien gegen
Cephalosporine der Gruppe 3 (z.B. Cefotaxim, Ceftriaxon, Ceftazidim) ist die Überproduktion von
chromosomal kodierten AmpC-ß-Laktamasen (auch Klasse C- oder Gruppe 1-ß-Laktamasen
genannt). Dieser Resistenztyp wurde ursprünglich bei Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii,
Serratia marcescens und dann bei Pseudomonas aeruginosa beschrieben, die damit resistent
gegen Cephalosporine der Oxyimino- (Cefotaxim- und Ceftazidim-) und Cefoxitin-Gruppe und
Monobactame sind.
Erstmals 1980, in den folgenden Jahren zunehmend häufiger, fand man Resistenzen gegen
Cephalosporine der Gruppe 3 bei Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis
und Salmonella enterica, die kein induzierbares AmpC Enzym aufwiesen. Diese Resistenz wurde
durch Plasmide übertragen, die für sogenannte Extended-spectrum ß-Laktamasen (ESBL) kodieren
(Stürenburg und Mack 2003). Diese Enzyme sind meist Abkömmlinge von TEM- oder SHV-ßLaktamasen und entstanden durch Punktmutationen in einzelnen Positionen, die zu
Aminosäureaustauschen führen. Das Resistenzspektrum der TEM-ß-Laktamasen umfasst die
Oxyimino-Cephalosporine und Monobactame, aber nicht die 7-?-Methoxy-Cephalosporine
(Cefoxitin). Ausserdem sind sie durch ß-Laktamaseinhibitoren hemmbar, die im allgemeinen nicht
wirksam gegen AmpC-ß-Laktamasen sind. Plasmide mit ESBL sind oft konjugativ auch über
Speziesgrenzen hinweg auf andere Enterobakterien übertragbar und fördern so eine rasche
horizontale Verbreitung dieses Resistenztyps.
20
Mit zunehmender Häufigkeit werden bei Enterobakterien auch ESBL vom CTX-M-Typ
nachgewiesen, während OXA- und PER-ESBL überwiegend bei Pseudomonas aeruginosa
auftreten. Inzwischen gibt es über 150 Varianten dieser Enzyme mit unterschiedlichen
phänotypischen Eigenschaften3.
Die phänotypische Ausprägung der Resistenz vom ESBL-Typ gegen Gruppe 3 Cephalosporine und
Monobactame ist äußerst variabel (Bradford 2001, Stürenburg und Mack 2003). So können
einzelne oder auch mehrere der Substanzen in der Resistenztestung intermediär oder sogar sensibel
erscheinen. Einen ESBL-Resistenzphänotyp zu erkennen, kann in der Routinediagnostik recht
schwierig sein, die Erkennung dieser Resistenz und die daraus abgeleitete interpretative Bewertung ist
allerdings von erheblicher klinischer Bedeutung, wie in mehreren klinischen Studien gezeigt werden
konnte (Kim et al. 2002, Paterson et al. 2001). Bei invasiven Infektionen mit Klebsiella spp. oder
E. coli mit ESBL kam es zu einem signifikant häufigeren Therapieversagen bei Einsatz von
Cephalosporinen, die in vitro als sensibel oder intermediär getestet wurden.
EPIDEMIOLOGIE
Am häufigsten werden ESBL bei E. coli, K. pneumoniae und K. oxytoca gefunden, aber auch bei
anderen Enterobacteriaceae wie z. B. Proteus spp., Citrobacter spp., Salmonella enterica,
Enterobacter spp. und Morganella morganii können ESBL vorkommen. Die Häufigkeit des
Auftretens von ESBL ist international sehr uneinheitlich. In süd- und westeuropäischen Ländern
werden Häufigkeiten von 20-50% gefunden, während in Ländern Mittel- und Nordeuropas wie
Finnland, Schweden und Deutschland aber auch in Spanien Stämme mit ESBL derzeit noch eher
selten sind (< 1-10%) (Babini und Livermore 2000). In der neuesten PEG-Resistenzstudie wurden
Erreger mit ESBL mit einer Prävalenz von 8,2% bei Klebsiella pneumoniae, 1,3% bei Klebsiella
oxytoca und 0,8% bei Escherichia coli gefunden (PEG-Resistenzdaten: http://www.antiinfectivesintelligence.de/peg/ag_resistenz/main.htm). Es muß aber betont werden, daß die Prävalenz von
ESBL in ähnlicher Weise wie bei MRSA lokal sehr unterschiedlich sein kann.
DIAGNOSTIK
Für die Empfindlichkeitstestung im diagnostischen Labor gilt, dass es kein Verfahren gibt, das mit
100%iger Sensitivität den Nachweis von ESBL ermöglicht. Bei allen Verfahren (Agardiffusion,
Bouillon-Dilutionsverfahren, E-Test) muss im Sinne einer Stufendiagnostik zunächst ein ScreeningTest durchgeführt und bei Hinweis auf ESBL-positive Isolate ein Bestätigungstest angeschlossen
werden. Dies gilt auch für automatisierte Verfahren, die in ihrer Sensitivität und Spezifität erheblich
variieren.
Zum Screening auf das Vorliegen von ESBL werden Cephalosporine der Gruppe 3 (Cefotaxim,
Ceftriaxon, Ceftazidim, Cefpodoxim) und ein Monobactam (Aztreonam) empfohlen. Vom
amerikanischen NCCLS wurden Grenzwerte für das ESBL-Screening sowohl für die MHKBestimmung als auch für den Agardiffusionstest festgelegt (Tab. 6). Bemerkenswerterweise liegen
diese Grenzwerte für alle Antibiotika mit Ausnahme von Cefpodoxim noch im sensiblen Bereich. Die
ursprünglichen Grenzwerte für Cefpodoxim wurden kürzlich revidiert, da diese häufig zu falschpositivem ESBL-Verdacht geführt hatten (Gibb und Crichton 2000). Allerdings sinkt mit den neuen
3
(http://www.lahey.org/studies/webt.stm#SHV)
21
Grenzwerten die Sensitivität von Cefpodoxim als Screeningparameter deutlich (Carter et al. 2000).
Aus diesem Grund gibt es keine einzelne Substanz, die alle ESBLs mit höchster Sensitivität anzeigt
und es sollten für das Screening prinzipiell mehrere dieser Substanzen herangezogen werden.
Tabelle 6: Kriterien für Verdachtsdiagnose ESBL (nach NCCLS)
Cefotaxim
Ceftazidim
Cefpodoxim
Ceftriaxon
Aztreonam
MHK-Bestimmung
≥ 2 µg/ml (Sensibel ≤ 8 µg/ml)
Agardiffusionstest
≤ 27 mm (Sensibel ≥ 23 mm)
Als Bestätigungstests werden für die Routinediagnostik
•
der Doppeldisk- (DD) Synergietest,
•
der Doppeldisk- (DD) Annäherungstest,
•
der MHK-Differenztest sowie
• der E-Test ESBL (AB Biodisk)
empfohlen.
•
Beim DD-Synergietest wird die Differenz der Hemmhofdurchmesser von Cefotaxim (30 µg)
bzw. Cefotaxim/Clavulansäure (30/10 µg) und Ceftazidim (30 µg) bzw.
Ceftazidim/Clavulansäure (30/10 µg) bestimmt (Abb. 3), wobei beide Paare parallel untersucht
werden müssen. Eine Differenz von ≥ 5 mm bzw. ein Verhältnis der Hemmhofdurchmesser von
≥ 1,5 bei mindestens einer der beiden Kombinationen weist auf eine ESBL hin (Mzali et al.
2000). Gleiches gilt für Cefpodoxim (10 µg) und Cefpodoxim/Clavulansäure (10/1 µg) (Carter et
al. 2000). Die entsprechenden Testplättchen sind kommerziell erhältlich.
22
Abb. 3: Doppeldisk-Synergietest zur Bestätigung von ESBL am Beispiel von Cefotaxim-M-1 und
TEM-52. Hemmhofdurchmesserdifferenzen von ≥ 5 mm zwischen der Clavulansäure-geschützten und
der nicht geschützten Substanz bestätigen eine ESBL. Bei Cefotaxim-M-1 sieht man exemplarisch an
Ceftazidim, daß nicht jede Substanz gleichermaßen für die Bestätigung von ESBL geeignet ist.
•
Beim DD-Annäherungstest wird um ein zentrales Amoxicillin/Clavulansäure Plättchen mit
einem Abstand von 20-30 mm (gemessen von den Mittelpunkten der Plättchen) Cefotaxim,
Ceftazidim, Cefpodoxim, Cefepim oder andere geeignete Antibiotika gelegt. Eine positiver
Synergieeffekt, der zu einer Verformung der Hemmhöfe führt, zeigt eine ESBL an (Abb. 4). Vor
allem bei Kombination mehrerer Antibiotika erreicht auch dieser Test eine hohe Sensitivität.
Abb. 4: Doppeldisk-Annäherungstest zur Bestätigung von ESBL am Beispiel von SHV-5 und SHV-2.
Die Verformung der Hemmhofe durch synergistische Wirkung von Clavulansäure weist auf eine ESBL
hin. Nicht jedes Antibiotikum ist bei jeder ESBL geeignet. Dieser Test erfordert Erfahrung beim
Anwender.
23
•
Bei der MHK-Bestimmung weist ein Unterschied von ≥ 3 Verdünnungsstufen beim Vergleich
von Cefotaxim und Ceftazidim mit den jeweils mit 4 µg/ml Clavulansäure supplementierten
Antibiotika auf eine ESBL hin (NCCLS 2000).
•
Eine alternative MHK-Bestimmung dieser Kombinationen bietet der E-Test ESBL (AB
Biodisk). Auf einem E-Teststreifen sind jeweils die Antibiotikagradienten von Cefotaxim und
Cefotaxim/Clavulansäure bzw. Ceftazidim und Ceftazidim/Clavulansäure aufgebracht. Auf den
beiden Skalen kann die entsprechende MHK abgelesen werden. Es müssen beide Teststreifen
parallel verwendet werden. Als bestätigend für eine ESBL gilt ein MHK-Unterschied von ≥ 3
Verdünnungsstufen bei mindestens einer der beiden Kombinationen (Abb. 5). Durch Diffusion
der Clavulansäure kann es zu Verformungen der Hemmhofellipsen von Cefotaxim bzw.
Ceftazidim kommen, so daß eine MHK nicht mehr abgelesen werden kann. Nach Angaben des
Herstellers gilt auch dieses Ergebnis als hinweisend für eine ESBL. Wenn die MHK-Werte
oberhalb oder unterhalb des Meßbereiches sind, ist der Phänotyp nicht bestimmbar (Florijn et al.
2002).
Abb. 5: E-Test ESBL am Beispiel von TEM-52 und SHV-5. MHK-Differenzen ≥ 3 Verdünnungstufen
bestätigen eine ESBL. Charakteristische Verformung der Hemmhofellipsen durch Clavulansäure gilt
gemäß Herstellerangaben auch als hinweisend für ESBL. Kann eine MHK nicht abgelesen werden,
gilt der Test als nicht determiniert.
•
Verschiedene automatisierte Resistenzbestimmungssysteme wie z.B. VITEK-2
(BioMérieux) oder PHOENIX (Becton Dickinson) weisen bei der Diagnostik von ESBLhaltigen E. coli und Klebsiella spp. eine ausreichend hohe Sensitivität und Spezifität auf.
Allerdings wurden in einer Untersuchung 5 von 34 molekular typisierten Isolaten mit ESBL nicht
vom Expertsystem des VITEK-2 erkannt, während die Rate der falsch-positiven Resultate beim
PHOENIX bei einer Sensitivität von 100% recht hoch war (Stürenburg et al. 2003). Dies mag
damit zusammenhängen, dass das System einen Algorithmus mit einem Grenzwert von 2 µg/ml
für Cefpodoxim verwendet.
24
Die Validierung der verschiedenen Screening- und Bestätigungsteste gelten im wesentlichen für E.
coli und Klebsiella spp.. Bei anderen Enterobakterien, die keine induzierbaren AmpC-ß Laktamasen besitzen, sind diese Tests vermutlich analog anwendbar. Probleme beim Nachweis von
ESBL können insbesondere auftreten bei Enterobacter spp., Serratia spp. und Citrobacter
freundii, die AmpC-ß-Laktamasen exprimieren, da es hier zur Überlagerung der verschiedenen
Resistenzphänotypen kommt. Da diese AmpC-ß-Laktamasen durch Clavulansäure nicht gehemmt
werden, kommt es bei den herkömmlichen ESBL-Bestätigungstests nicht zur Veränderung der MHK
bzw. Hemmhofdurchmesser. Hinweisend für das Vorliegen einer AmpC-ß-Laktamase ist die
Resistenz gegen Cefoxitin, ESBL-Bildner sind in der Regel empfindlich. Umgekehrt verhält es sich
mit den Cephalosporinen der Gruppe 4 (Cefepim und Cefpirom), sie weisen bei ESBL-Bildnern
häufig erhöhte MHK-Werte (mindestens im Intermediär-Bereich) auf und sind wirksam gegen
AmpC-positive Enterobakterien. Deshalb wurde zum Nachweis beim gleichzeitigen Vorliegen von
ESBL und AmpC die Kombinationstestung von Cefepim und Cefepim/Clavulansäure (E-Test
ESBL, AB Biodisk) bzw. von Cefpirom (30 µg) und Cepirom/Clavulansäure (30/7,5 µg)
(Agardiffusionstest, Oxoid) vorgeschlagen. Als positives Ergebnis gilt für den Cefepim E-Test ESBL
ein MHK-Unterschied ≥ 3 Verdünnungsstufen und für die Cefpiromplättchen eine
Hemmhofdurchmesser-Differenz von ≥ 4 mm. Die Validierung dieser Testverfahren steht allerdings
noch aus.
Für die Qualitätskontrolle der ESBL-Diagnostik wird der Stamm K. pneumoniae ATCC 700603
mit einer SHV-18 ESBL empfohlen. Die Hemmhöfe für die verschiedenen Screening-Antibiotika
sollen für Cefpodoxim 9-16 m, Ceftazidim 10-18 mm, Aztreonam 9-17 mm, Cefotaxim 17-25 mm
und Ceftriaxon 16-24 mm erreichen.
Die Differenz der Hemmhofdurchmesser im DD-Synergietest soll bei Cefpodoxim und Ceftazidim ≥
5 mm und bei Cefotaxim ≥ 3 mm betragen. Bei der MHK-Bestimmung müssen die für ESBL
definierten Standards erreicht werden (NCCLS 2002).
Ein definitiver Nachweis des Typs der ESBL läßt sich im Referenzlabor durch Bestimmung des
isoelektrischen Punktes der ESBL und durch PCR-Amplifikation der ESBL-Gene und
anschließende Nukleotid-Sequenzierung erreichen.
Wie bereits eingangs erwähnt, gibt es aufgrund der zunehmenden Vielfalt von ß-Laktamasen kein
einzelnes absolut zuverlässiges Testverfahren zum Nachweis von ESBL. Wichtigste Voraussetzung
zur Diagnostik ist die korrekte Erregeridentifizierung bis zur Speziesebene, da z.B. Klebsiella
pneumoniae und Klebsiella oxytoca unterschiedliche Resistenzmechanismen aufweisen können.
Mindestvoraussetzung für das Screening ist die Testung von Cefpodoxim, besser die Testung von
Ceftazidim (bester Indikator für TEM- und SHV-abgeleitete ESBL) und Cefotaxim (Indikator für
CTX-M). Jedes Isolat mit reduzierter Empfindlichkeit für eine dieser 3 Substanzen muss mit einem
Bestätigungstest überprüft werden.
Bei der Wahl des Bestätigungstests sind die Vor- und Nachteile der einzelnen Methoden abzuwägen:
am teuersten ist sicherlich der E-Test, hat aber den Vorteil der geringsten Beeinflussung durch
technische Fehler. Beim Doppeldisk-Annäherungstest ist z.B. die Einhaltung des vorgeschriebenen
Abstands zwischen den einzelnen Plättchen ein besonders kritischer Faktor.
Wird routinemäßig die Empfindlichkeitstestung mit einem automatisierten Verfahren durchgeführt, so
ist der Nachweis eines ESBL-Bildners auf jeden Fall mit einem zweiten Verfahren zu bestätigen.
25
BEFUNDINTERPRETATION
Bei Nachweis von ESBL sind alle nicht Inhibitor-geschützten Penicilline und Cephalosporine als
unempfindlich anzugeben. Bei E. coli oder Klebsiella spp. mit ESBL sollten alle nicht ßLaktamaseinhibitor-geschützten Penicilline und Cephalosporine als resistent interpretiert werden.
Piperacillin in Kombination mit ß-Laktamaseinhibitoren ist bei vielen E. coli und Klebsiella spp. mit
ESBL wirksam. Typisch für Klebsiellen oder E. coli mit ESBL ist die häufig noch erhaltene
Wirksamkeit von Cephamycinen (z.B. Cefoxitin). Carbapeneme (Imipenem, Meropenem und
Ertapenem) sind für die kalkulierte Therapie bei schweren Infektionen und ESBL-Verdacht Mittel
der Wahl, da sie fast immer aktiv sind. Als Alternative sind Fluorchinolone (z.B. Ciprofloxacin)
geeignet, jedoch muß man hier vor allem bei Klebsiella pneumoniae mit ESBL mit einer deutlich
erhöhten Parallelresistenz rechnen.
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. H. Geiss
Hygiene-Institut
Im Neuenheimer Feld 324
69120 Heidelberg
E-Mail: [email protected]
Prof. Dr. Dietrich Mack
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
Martinistr. 52
20246 Hamburg
Prof. Dr.Harald Seifert
der Universität zu Köln
Goldenfelsstr. 19- 21
50935 Köln
26
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