IGF-Vordruck der AiF [4.1.5]

Zwischenergebnisse 2014
Mitoskopie: Mitochondriales Monitoring von Stoffwechseländerungen bei neurologischen
Erkrankungen mittels optischer Systeme (18239 N)
Projektziel
Ziel dieses interdisziplinären Verbundprojektes, welches von den beiden Forschungsstellen
Core Facility für konfokale und Multiphotonen Mikroskopie der Universität Ulm und der
Abteilung Neurologie des Universitätsklinikums Ulm gemeinsam durchgeführt wird, ist das in
vitro und in vivo Monitoring von mitochondrialen Stoffwechselveränderungen in Zell- und
Tiermodellen für neurodegenerative Erkrankungen. Dem zu Grunde liegt die Arbeitshypothese, dass die parallele optische Messung mehrerer Stoffwechselparameter zur
verbesserten Analyse in der Diagnostik und Therapie einer Vielzahl volkswirtschaftlich
relevanter Erkrankungen beitragen kann. Das übergeordnete Ziel ist die Evaluation eines in
vivo FLIM/PLIM Systems, das das Monitoring verschiedener Aspekte des mitochondrialen
Stoffwechsels sowohl im Zellmodell, in murinen ex vivo Hirn-Schnitten als auch in vivo durch
ein Glasfenster im Schädelknochen (cranial window) in transgenen Tieren ermöglicht. Das
angestrebte Produkt leistet einen innovativen Beitrag zur Erforschung der Krankheit AD und
anderen neurodegenerativen Erkrankungen und eignet sich zur Entwicklung neuer
Therapeutika. Als Ergebnis soll ein in vivo Imaging System mit hoher zeitlicher und räumlicher
Auflösung entstehen, das die Analyse mitochondrialer Stoffwechsel-Marker sowohl im
Zellmodell, in primären hippokampalen Neuronen, als auch letztendlich in transgenen Tieren
einfach und zuverlässig ermöglicht. Dadurch wird die Möglichkeit geschaffen, durch ein in
vivo Screening System neue potentielle Medikamente (wie z. B. Methylenblau) gegen
mitochondriale Störungen zu testen, was von hoher klinischer und auch wirtschaftlicher
Relevanz ist.
Ergebnisse
Zu Beginn des Projektes sollten die optimalen Parameter für FLIM von NADH und FAD+ in
Monolayer-Zellkulturen neuronalen Ursprungs (Neuro2a (murin) und HEK293 (human))
getestet und mit den bisherigen Ergebnissen aus Karzinom- und Plattenepithelzellen
vergleichend evaluiert werden. Als Anregungsquelle diente ein Mai Tai® Ti:Sapphire Laser von
Spectra-Physics. Im ersten Schritt wurden verschiedene Anregungswellenlängen miteinander
verglichen. Den besten Kompromiss aus Fluoreszenzintensität und "Signal to Noise ratio"
liefert die Anregung mit 730 nm für NADH, welche in den nachfolgenden Messungen
verwendet wird.
Da für gebundenes (Emission: 436 nm) und freies (Emission: 470 nm) NADH unterschiedliche
Emissionsmaxima beschrieben sind, wurden zusätzlich verschiedene Bandpass-Filter (436/20,
470/20, 460/60) zur Detektion des NADH-Signals miteinander verglichen. Die Intensität des
NADH Signals ist bei Verwendung des 460/60 Filters am größten. Um auszuschließen, dass
durch die Breite des Bandpassfilters außer NADH andere Fluoreszenz-Signale mit detektiert
werden, wurde ein NADH-Spektrum aufgenommen. Dabei wurden neben unbehandelten
Zellen auch mit 1 mM Rotenon behandelte HEK293 Zellen gemessen. Da Rotenon den
Komplex 1 der Atmungskette inhibiert, erwartet man in diesen Zellen einen Anstieg der
IGF-Projekt Mitoskopie (18239 N)
Zwischenergebnisse 2014
1/5
Glykolyse und dadurch eine Zunahme von freiem NADH. Eine Zunahme von freiem NADH
führt zu einem Anstieg der Fluoreszenzintensität. Die Gabe führt von Rotenon zu dem
erwarteten Intensitätsanstieg. Da die Spektren abgesehen von der Intensität identisch sind,
konnte eine Detektion von nicht NADH-Fluoreszenz-Signalen ausgeschlossen werden.
Zur weiteren Optimierung der FLIM-Messungen wurde der Einfluss der Laserleistung und der
Aufnahmezeit auf das NADH-Fluoreszenzsignal untersucht. Eine Erhöhung der Laserleistung
führt bei konstanter Aufnahmezeit zu einer erhöhten Abnahme der NADHFluoreszenzintensität. Eine Verlängerung der Aufnahmezeit bei konstanter Laserleistung
hingegen verringert den Intensitätsverlust. Daher empfiehlt sich zur Verbesserung der
Signalstärke eine verlängerte Aufnahmezeit anstatt einer Erhöhung der Laserleistung.
Die Messung der Sauerstoffkonzentration über die Phosphoreszenzabklingzeit eines zur
Phosphoreszenz befähigten Markers (z. B. Pd oder Ru Komplexe) wurde zur direkten
Beobachtung des Zellmetabolismus ebenfalls zuerst isoliert für Plattenepithelkarzinom Zellen
optimiert und soll später auf neuronale Zellen angewendet werden. Des Weiteren erfolgte
die Evaluation neuer Anregungswellenlängen. Weitere technische Modifikationen zur
Anpassung von Hard- und Software an die Anforderungen neuronaler Zellen bei simultaner
Durchführung von FLIM- und PLIM-Messungen wurden durchgeführt. Dazu musste zunächst
das zwei-Kanal FLIM/PLIM System für die relevanten Fragestellungen optimiert und ein
entsprechender Phosphoreszenz Marker evaluiert werden. Letztendlich fiel die Wahl auf
einen Ruthenium Komplex, Ruthenium Tris-Bipyridyne Ru(bpy)32+. In Abb. 1 ist das Zwei-Kanal
FLIM/PLIM System schematisch skizziert. FLIM von NADH wird im Bereich 460/60 nm mit dem
Detektor HPM-100-40 detektiert, PLIM von Ru(bpy)32+ oberhalb von 615 nm mit dem
Detektor HPM-100-50.
Abb. 1: Schematische Darstellung des zwei-Kanal FLIM/PLIM Systems.
Die Darstellung von FLIM-NADH (links) und PLIM-Ru(bpy)32+ (rechts) in SCC4 Zellen ist in
Abb. 2 dargestellt und zwar unter normalen Sauerstoffbedingungen (oben) und erniedrigter
Sauerstoffkonzentration (unten). Die Zellen wurden mit 780 nm des Ti:Sa Lasers angeregt.
Wie zu erwarten wird die Phosphoreszenzabklingzeit bei niedriger Sauerstoffkonzentration
länger, im Gegensatz dazu wird die Fluoreszenzabklingzeit von NADH kürzer. Ob dies mit
einer erhöhten Glykolyse korreliert, muss noch geprüft werden.
IGF-Projekt Mitoskopie (18239 N)
Zwischenergebnisse 2014
2/5
Abb. 2: NADH-FLIM (links) und Ru(bpy)32+ -PLIM (rechts) in SCC4 Zelen bei normaler Sauerstoffkonzentration
(obern) und erniedrigter Sauerstoffkonzentration (unten).
Parallel zur Evaluierung und Anpassung des technischen Systems wurde durch Versuchsreihen
mit Sauerstoffänderung unter Hypoxiebedingungen zur Induktion der Glykolyse und durch
Experimente mit Substanzen zur Modulation der Atmungsketten-Leistung (Rotenon,
Antimycin A, FCCP) die Sensitivität der NADH, FAD+ und der O2-Verbrauchs- Messungen unter
definierten Bedingungen evaluiert. Auch hier wurden verschiedenen Zelllinien parallel
ausgetestet und die Bedingungen entsprechend angepasst. Ziel war die Optimierung der
Bedingungen zur vergleichenden Messung von oxidativer Phosphorylierung und Glykolyse.
Um Kontrollen für eine gesteigerte oxydative Phosphorylierung bzw. Glykolyse zu generieren,
wurden HEK293 Zellen mit Antimycin A bzw. Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP) behandelt und mit unbehandelten Zellen verglichen. Antimycin A
blockiert den Komplex 3 der Atmungskette und führt dadurch zum Anstieg der Glykolyse. Im
FLIM erwartet man daher einen Anstieg von freiem NADH und eine Intensitätszunahme der
NADH-Fluoreszenz bei gleichzeitiger Verkürzung der Fluoreszenzlebenszeit. FCCP hingegen
entkoppelt die Atmungskette und ermöglicht einen Transport von Protonen über die innere
Mitochondrienmembran. Dadurch, dass Protonen nicht mehr gegen einen elektrochemischen
Gradienten transloziert werden müssen, laufen die Oxidationsschritte in den Komplexen I bis
IV viel schneller ab. Dies führt zu einer Reduzierung von freiem NADH und gleichzeitig zu
einem erhöhten Sauerstoffverbrauch. Im FLIM sollte dies durch die Abnahme der
Fluoreszenzintensität bei gleichzeitiger Verlängerung der Fluoreszenzlebenszeit sichtbar sein.
Zur Bestimmung der optimalen Antimycin A und FCCP Konzentrationen wurde ein Oxygraph2K (Oroboros Instruments) verwendet.
Wie in Abb. 3 dargestellt, führt die Behandlung mit Antimycin A im Vergleich zur Kontrolle
zum Anstieg der NADH Fluoreszenzintensität bei gleichzeitiger Verkürzung der Fluoreszenzlebenszeit, während FCCP Gabe die NADH-Fluoreszenzintensität bei gleichzeitiger
Verlängerung der Fluoreszenzlebenszeit reduziert. Die Veränderungen der Fluoreszenzlebenszeit und -intensität von NADH nach Behandlung mit Substanzen zur Modifikation der
zellulären Atmung sind vor allem in den Bereichen der Zellen zu finden, in denen
Mitochondrien angereichert sind während sich Änderungen der Glykolyse im Zellkern und im
Zytoplasma zeigen.
IGF-Projekt Mitoskopie (18239 N)
Zwischenergebnisse 2014
3/5
Abb. 3: A-C: NADH-Fluoreszenzintensität nimmt bei Blockade der oxydativen Phosphorylierung (Antimycin A) [a]
im Vergleich zur Kontrolle [b] zu, während eine Entkopplung der Atmungskette (FCCP) [c] eine Reduktion der
Intensität bewirkt. D-F: Antimycin A Behandlung [d] erhöht die Level von freiem NADH und bewirkt dadurch eine
verkürzte Fluoreszenzlebenszeit im Vergleich zur Kontrolle [e]. Eine Behandlung mit FCCP [f] hat den
gegenteiligen Effekt. G+H: Veränderungen von NADH Intensität und Lebenszeit durch Gabe von Antimycin A und
FCCP sind am deutlichsten in Zellarealen mit hoher Mitochondrien-Konzentration.
Zusätzlich zur Optimierung der Messmethoden erfolgte die Anpassung der bei uns bereits
etablierten FLIM/PLIM-Analyse-Softwaremethoden. Eine Implementierung zuverlässiger
Auswertealgorithmen erfolgt durch vergleichende Analyse zwischen B&H-Software
(SPCImage) und Phasor-Methode.
Für die Optimierung der Auswertung des NADH FLIM mittels SPCImage, wurde zunächst eine
Konzentrationsreihe von freiem NADH in Lösung (Sigma-Aldrich) vermessen. Mit SPCImage
kann die NADH Fluoreszenzintensität linear zur Konzentrationen von freiem NADH bis in den
mMol Bereich detektiert werden. Zur weiteren Optimierung der Auswertung wurden unter
Verwendung der NADH Standard-Lösung verschiedene Parameter der SPCImage Software
getestet. Es wurden monoexponentielle und biexponentielle Anpassungen verglichen.
Außerdem wurden verschiedene "Binning" und "Threshold" Einstellungen getestet.
IGF-Projekt Mitoskopie (18239 N)
Zwischenergebnisse 2014
4/5
Als beste Einstellung für die nachfolgenden Experimente erweist sich eine biexponentielle
Anpassung mit fixiertem t1 und t2, die eine Messung von NADH-Fluoreszenzlebenszeiten
schon bei geringen NADH Konzentrationen und Intensitäten ermöglicht. Auch in
Experimenten mit HEK293 Zellen ist mit den gewählten Einstellungen ein NADH-FLIM schon
bei geringer Intensität möglich.
Am Beispiel der Alzheimer Erkrankung soll mittels dieses Verfahrens die gleichzeitige optische
Erfassung veränderter Parameter des zellulären Energiestoffwechsels (NADH, FAD+ und pO2)
durch parallele FLIM/PLIM Messungen in neuronalen Zellkulturlinien (SH-SY5Y, Neuro-2a,
HEK) durchgeführt werden.
Es wurden zunächst die im Labor bereits vorhandenen Vektoren von APP und BACE1 in
neuronalen Zellkulturlinien (Neuro-2a, HEK293) exprimiert. Zur Messung des oxidativen
Stoffwechsels wurde eine hochauflösende Respirometrie mittels eines Oroboros Oxygraph-2K
durchgeführt. Dabei zeigte sich sowohl bei APP transfizierten N2A als auch HEK293 Zellen
eine Abnahme der Routineatmung als auch der maximalen Kapazität der Elektronentransportkette. Die Expression von BACE1 hingegen zeigte in keiner der Zelllinien eine
Veränderung des mitochondrialen Stoffwechsels.
In folgenden Experimenten sollen die Veränderungen in der Atmung durch APP Expression in
FLIM Analysen untersucht werden.
In einem weiteren Versuchsschritt erfolgt die Präparation verschiedener, extrazellulärer Aβ
Spezies, die im Rahmen einer gemeinsamen Publikation mit Böhringer Ingelheim etabliert
und charakterisiert wurden (Monomere, Oligomere, Fibrillen). Damit soll die Behandlung der
Zelllinien erfolgen und anschließend Änderungen des oxidativen Stoffwechsels gemessen
werden.
IGF-Projekt Mitoskopie (18239 N)
Zwischenergebnisse 2014
5/5