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Kapitel 8 118 Anhang 8.1 Geräte Gerät Typ Absauganlage Analysenwaage Autoklav BIAcore-Gerät Brutschrank Elektrophoresekammern (manuell) Sartorius AE 163 Mettler Vapoclav 500 D Sterico BIACORE X Biacore B 5042 Heraeus Agagel Mini Biometra Mini-Sub Cell GT Bio Rad Mini-Protean II Bio Rad BIOTRAP Schleicher & Schuell Gel Doc 2000 Biorad Beta A mit Heraeus Christ Speed Vac Concentator Savant Mididry Biometra Thermomixer 5436 Eppendorf Modell G25 New Brunswick Scientific IKA Combimag RCT Janke & Kunkel ER-7720DC Toshiba ECPS 3000/150 Pharmacia 761 Calimatic Knick Storm 840 Molecular Dynamics Pipetman P2, 10, 20, 100, 200, Gilson 1000 Milli-Q Millipore JA-14, JA-17 Beckman Snapscan 1212U Agfa Vortex-Genie 2 Bender & Hobein Celloshaker Variospeed Chemetron UV-260 Shimadzu Schleicher & Schuell LS 6000 SC Beckman PCT-100 MJ Research, Inc. PCR Sprint Hybaid Sonorex RK 102 Bandelin Reprostar II Camag 1401 MP8 Satorius 1002 GFL Mikrocentrifuge Stratagene 5415 C Eppendorf Biofuge A Heraeus Christ J2-21 Beckman Optima TL Ultracentrifuge Beckman Elektroseparationssystem Geldokumentationsanlage Gefriertrockner Geltrockner Inkubationsschüttler Magnetrührer Mikrowellenofen Netzgerät pH-Meter Phosphorimager mit Zubehör Pipetten Reinstwasseranlage Rotoren Scanner Schüttler Spektralphotometer Sterilfiltrationsanlage Szintillationszähler Thermocycler für PCR Ultraschallbad UV-Transilluminator Waage Wasserbäder Zentrifugen 8.2 Hersteller Chemikalien, Biochemica, Lösungsmittel Aceton Acrylamid 30% (Acrylamid/Bisacrylamid=30/0,8) Agar Agarose für die Gelelektrophorese L-Aminosäuren Ammoniumchlorid Ammoniumperoxodisulfat (APS) Merck Roth, Serva Gibco Gibco, Biozym Amersham Merck Merck 119 Anhang _________________________________________________________________________________________________________________ Ampicillin Natriumsalz Biotin Borsäure Bromphenolblau Calciumchlorid Caseinhydrolysat (Pepton No. 5) Caseinhydrolysat (Pepton No. 140) Chloroform Coomassie brilliant blue R250 α-35 S-Cytosin-5‘-triphosphat Desoxyribonukleosid-5‘-triphosphate (dNTPs) Dithioerythritol (DTE) Dithiothreitol (DTT) Essigsäure Ethanol Ethidiumbromid (EtBr) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 10-Formyltetrahydrofolat Glucose Glycerin Glycin Glycogen Harnstoff Hefeextrakt Heparin Natriumsalz Kaliumacetat Kaliumhydroxid 14 C-Leucin Magnesiumacetat Magnesiumchlorid 2-Mercaptoethanol 2-mercaptoethansulfonsäure (MESNA) Methanol N, N‘-Methylen-bisacrylamid 3-N-(Morpholino)propansulfonsäure (MOPS) N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin (TEMED) N‘-2-Hydroxyethylpiperazin-2-ethansulfonsäure (HEPES) Natriumacetat Natriumazid Natriumchlorid Natriumdodecylsulfat (SDS) Natriumhydroxid Natriumpyrophosphat Nickelchlorid Nickelsulfat Phenol Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1) Phosphoenolpyruvat (PEP) Polyethylenglycol 2000 (PEG) 2-Propanol Ribonukleosid-5‘-triphosphate Ribonukleosid-Vanadyl-Komplex (RVC) Rifampicin Salzsäure Spermidin Stickstoff (flüssig) Szintillationsflüssigkeit (ready protein) Trichloressigsäure (TCA) Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) Triton X-100 Xylencyanolblau Roche Sigma Aldrich Merck Merck Merck Gibco Gibco Roth Serva Amersham Roche Merck Merck Roth Roth Gibco Merck Merck Merck Merck Merck Roche Merck Gibco Roth Merck Merck Amersham Merck Merck Merck Sigma Aldrich Roth Serva Merck Serva Biomol Merck Merck Merck Fluka Merck Merck Sigma Aldrich Merck Roth Roth Roche Merck Roth Roche NEB Roche Merck Serva Linde Beckman Roth Merck Roche Serva 120 Anhang _________________________________________________________________________________________________________________ 8.3 Enzyme, Proteine, Nukleinsäuren Alkalische Phosphatase (CIP) Anorganische Pyrophosphatase Aprotinin Bulk-tRNA DNA-Längenstandards: 10 bp-Leiter 100 bp-Leiter 500 bp-Leiter DNA-Oligomere Dnase I (RNase frei) Klenow-Polymerase Leupeptin M-MLV Reverse Transkriptase (RNase H minus) Pepstatin Plasmide pHMFA pSEL2 Proteinase K Protein-Molekulargewichtstandards No.5 (6,5 – 29 kDa) LMW-6 (14,4 – 94 kDa) 14 C-Marker (2,5 – 30 kDa) Pwo DNA-Polymerase Pyruvatkinase Restriktionsendonukleasen Ribonuklease-Inhibitor aus humaner Plazenta Rinderserum Albumin Streptavidin Superscript II Reverse Transkriptase (RNase H minus) T4 DNA-Ligase T4-Polynukleotidkinase T7 RNA-Polymerase Taq DNA-polymerase tRNA aus E. coli MRE600 8.4 Serva Pharmacia Amersham Roche Roche NEB, Roche, Gibco, Promega MBI Fermentas Promega Roche Sigma Aldrich Gibco Stratagene, MBI Fermentas NEB Stratagene Gibco Roche Kits ‘High Pure PCR Product Purification Kit’ JET-Sorb Gel Extraction Kit JET-Star Plasmidprep Kit (Mini, Midi und Maxi) ‘High Pure RNA Purification Kit’ Qiagen Plasmidprep Kit (Mega und Giga) Strep-tag Starter-Kit Wizard PlusMinipreps 8.5 NEB, Roche Sigma Aldrich Roche Roche Gibco Gibco, Roche Roche IBA, TIB Molbiol Roche Promega Roche Promega Roche Dr. Helmut Merk Dr. Michael Gerrits Gibco Roche Genomed Genomed Roche Qiagen IBA, Göttingen Promega Sonstiges Aktivkohlebeutel Einmal-Filterhalter Filterpapier Glasfilter Membranfilter Minisäulen mit Fritten NAP-Säulen Quarzküvette Streptavidin-Sepharose Szintillationsvials Zentrifugierbare Filtereinheit Destaining Bags 0,2 µm, FP 030/3 3MM GF/C ME 24 Mobicols NAP-5 und 10 Column 104-QS 5 mg/ml Minis 2000 YM-3 Amresco Schleicher & Schuell Whatman Whatman Schleicher & Schuell MoBiTec, Göttingen Pharmacia Hellma IBA, Göttingen Zinsser Analytik Millipore Anhang 121 _________________________________________________________________________________________________________________ Bakterienstämme 8.6 Escherichia coli D10 relA1, spoT1, metB1, RnaseIEscherichia coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985) rec A1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, (rK -, mK -), supE44, relA1, ∆(lacproAB), [F‘, traD36, proAB, lacIq , lacZ∆M15] Verwendete Oligonukleotide Oligonukleotide für Klonierungen lpp1 lpp2 5‘-GCTGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGGAATTCACCTTTAAGCAGCTCG-3‘ 5‘-GATCCGAGCTGCTTAAAGGTGAATTCCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCAGCTGCA-3‘ NSt1 5‘-CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGGCGC3‘ NSt2 5‘-CATGGCGCCTTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCACATGGTATATCTCCTTCTTAAATTAAACAAAATTATTT-3‘ FAHisN 5'-CGCGCGCCATGGTGCATCATCATCATCATCATGTGGACGCCTTCGTGGGTACC-3' lpp 5'-GGATCCGAGCTGCTTAAAGGTGAATTCCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGG-3' C-tag1 5‘-GGCCTTCCGCTCGAGGGCGCCCTTACCATCGATTAACCGTGGATCCACCTGATCTTCGCTAGCTAATGCATGTGGGC-3‘ C-tag2 5‘-GCCCACATGCATTAGCTAGC-3‘ Linker1 5‘-GTGGGCGCTAGCGCTGCA-3‘ Linker2 5‘-GCGCTAGCGCCCACCTGC-3‘ FALink1 5‘-GGCACTGCAGTTTGCACTCGTACTTACGAGAAACAGGCAGGCGGGGGTGGCAGCGGTGGCGGGGGATCAGGCGGGGGTGGCAGCGGTGGCGGGGGATCAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGGAATTCACC-3‘ FALink2 5‘-GCGGGATCCGAGCTGCTTAAAGGTGAATTCCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGG-3’ SELx1 5’-GGACGCGGTCCTCGAGNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSTAATGCATGCACCGGCAGAACTATG-3' SELx2 5’-CATAGTTCTGCCGGTGCATGCATTA-3’ FAx1 5'-GAAGGAGATATACCATGGNNNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSGTGGGTACCTGGAAGTTAGTGG-3' 5’-CCACTAACTTCCAGGTACCCAC-3’ FAx2 SELHisF 5‘-ATACTGCAGTTCATCACCATCATCACCATTGACCTGCCCTCTCCTCCCACTG-3‘ SELHisR 5‘-GCAGCCGGATCCAGGCTGC-3‘ T7 5‘-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAG-3‘ SELx1 SELx2 SELx3 5‘-AATTCTGCAGTTGGAACATCTACGACTACCGG-3‘ 5‘-AATTCTGCAGTTGTCAGTAACTGGCTTTCACC-3‘ 5‘-AATTCTGCAGTGCCACCTTCCTGCTGCGCTTTG-3‘ UniF 5‘-GCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3' FAHisR 5‘-AGCCGGATCCATCAATGGTGATGATGGTGATGTGCCTGTTTCTCGTAAGTACGAGTGC-3‘ Anhang 122 _________________________________________________________________________________________________________________ Oligonukleotide für die reverse Transkription, PCR, Sequenzierung, etc. AS-Oligo 5’-TTAAGCTGCTAAAGCGTAGTTTTCGTCGTTTGCGACTA-3’ RT-Primer 5‘-CCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCAGCTGCAGTGCCGTGGGTGAGTGTCAGAATGAGTTTCCCGTCAACCATCTCCCG-3' T7 5‘-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAG-3‘ lpp 5‘-GGATCCGAGCTGCTTAAAGGTGAATTCCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGG-3' UniR 5‘-GCCGGATCCGAGCTGCTTAAAGGTG-3‘ UniF 5‘-GCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3' 8.7 Konstruierte Plasmide zur Generierung der Bibliotheken Plasmidsequenz pFALinklpp (3954 bp): § § § § § § § § § § § Transkriptionspromotor (‘T7 gene 10’): 618-634 Transkriptionsstart: 635 5‘ stem-loop: 635-655 Ribosomenbindungsstelle (Shine-Dalgarno Sequenz) 684-689 Startcodon: 697-699 FABP kodierende Sequenz: 700-1095 (Gly4 Ser)4 -Linker: 1096-1155 Modifizierter Lipoproteinterminator: 1156-1200 Transkriptionsterminator (‘T7 gene 10’): 1277-1317 β-Lactamase kodierende Sequenz: 2894-3754 Wichtige Schnittstellen: Hind III 399, 1687; Xba I 656; Nco I 695; Kpn I 719; Pst I 1065; Bam HI 1206 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 10 20 30 40 50 60 | | | | | | TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC AAGGAGATGG CGCCCAACAG TCCCCCGGCC ACGGGGCCTG CCACCATACC CACGCCGAAA CAAGCGCTCA TGAGCCCGAA GTGGCGAGCC CGATCTTCCC CATCGGTGAT GTCGGCGATA TAGGCGCCAG CAACCGCACC TGTGGCGCCG GTGATGCCGG CCACGATGCG TCCGGCGTAG AGGATCGAGA TCTCGATCCC GCGAAATTAA TACGACTCAC TATAGGGAGA CCACAACGGT TTCCCTCTAG AAATAATTTT GTTTAACTTT AAGAAGGAGA TATACCATGG TGGACGCCTT CGTGGGTACC TGGAAGTTAG TGGACAGCAA GAATTTCGAT GACTACATGA AGTCACTCGG TGTCGGTTTT GCTACCAGGC AGGTGGGCAA TATGACCAAG CCTACCACAA TCATCGAAGT GAATGGGGAC ACAGTCATCA TAAAAACACA AAGCACCTTC AAGAACACAG AGATCAGCTT CAAGCTGGGA GTCGAGTTCG ATGAGACCAC AGCAGATGAC AGGAAAGTCA AGTCCATCGT GACGCTGGAT GGCGGCAAAC TTGTCCACGT GCAGAAGTGG AATGGACAAG AGACATCACT TGTGCGGGAG ATGGTTGACG GGAAACTCAT TCTGACACTC ACCCACGGCA CTGCAGTTTG CACTCGTACT TACGAGAAAC AGGCAGGCGG GGGTGGCAGC GGTGGCGGGG GATCAGGCGG GGGTGGCAGC GGTGGCGGGG GATCAGACCC GTTTAGAGGC CCCAAGGGGT TATGGAATTC ACCTTTAAGC AGCTCGGATC CGGCTGCTAA CAAAGCCCGA AAGGAAGCTG AGTTGGCTGC TGCCACCGCT 123 Anhang _________________________________________________________________________________________________________________ 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 GAGCAATAAC AAAGGAGGAA GATAGTGGCT TGCTCCGAGA ATAGTGACTG CATAACCAAG ATTGTTAGAT GCATTAAAGC TGTTTCCTGT TAAAGTGTAA CACTGCCCGC GCGCGGGGAG TGCGCTCGGT TATCCACAGA CCAGGAACCG AGCATCACAA ACCAGGCGTT CCGGATACCT GTAGGTATCT CCGTTCAGCC GACACGACTT TAGGCGGTGC TATTTGGTAT GATCCGGCAA CGCGCAGAAA AGTGGAACGA CCTAGATCCT CTTGGTCTGA TTCGTTCATC TACCATCTGG TATCAGCAAT CCGCCTCCAT ATAGTTTGCG GTATGGCTTC TGTGCAAAAA CAGTGTTATC TAAGATGCTT GGCGACCGAG CTTTAAAAGT CGCTGTTGAG TTACTTTCAC GAATAAGGGC GCATTTATCA AACAAATAGG TTATTATCAT TAGCATAACC CTATATCCGG CCAAGTAGCG ACGGGTGCGC GCGATGCTGT CCTATGCCTA TTCATACACG TTATCGATGA GTGAAATTGT AGCCTGGGGT TTTCCAGTCG AGGCGGTTTG CGTTCGGCTG ATCAGGGGAT TAAAAAGGCC AAATCGACGC TCCCCCTGGA GTCCGCCTTT CAGTTCGGTG CGACCGCTGC ATCGCCACTG TACAGAGTTC CTGCGCTCTG ACAAACCACC AAAAGGATCT AAACTCACGT TTTAAATTAA CAGTTACCAA CATAGTTGCC CCCCAGTGCT AAACCAGCCA CCAGTCTATT CAACGTTGTT ATTCAGCTCC AGCGGTTAGC ACTCATGGTT TTCTGTGACT TTGCTCTTGC GCTCATCATT ATCCAGTTCG CAGCGTTTCT GACACGGAAA GGGTTATTGT GGTTCCGCGC GACATTAACC CCTTGGGGCC ATATCCACAG AAGCGAGCAG ATAGAAATTG CGGAATGGAC CAGCATCCAG GTGCCTGACT TAAGCTGTCA TATCCGCTCA GCCTAATGAG GGAAACCTGT CGTATTGGGC CGGCGAGCGG AACGCAGGAA GCGTTGCTGG TCAAGTCAGA AGCTCCCTCG CTCCCTTCGG TAGGTCGTTC GCCTTATCCG GCAGCAGCCA TTGAAGTGGT CTGAAGCCAG GCTGGTAGCG CAAGAAGATC TAAGGGATTT AAATGAAGTT TGCTTAATCA TGACTCCCCG GCAATGATAC GCCGGAAGGG AATTGTTGCC GCCATTGCTA GGTTCCCAAC TCCTTCGGTC ATGGCAGCAC GGTGAGTACT CCGGCGTCAA GGAAAACGTT ATGTAACCCA GGGTGAGCAA TGTTGAATAC CTCATGAGCG ACATTTCCCC TATAAAAATA TCTAAACGGG GACGGGTGTG GACTGGGCGG CATCAACGCA GATATCCCGC GGTGACGGTG GCGTTAGCAA AACATGAGAA CAATTCCACA TGAGCTAACT CGTGCCAGCT GCTCTTCCGC TATCAGCTCA AGAACATGTG CGTTTTTCCA GGTGGCGAAA TGCGCTCTCC GAAGCGTGGC GCTCCAAGCT GTAACTATCG CTGGTAACAG GGCCTAACTA TTACCTTCGG GTGGTTTTTT CTTTGATCTT TGGTCATGAG TTAAATCAAT GTGAGGCACC TCGTGTAGAT CGCGAGACCC CCGAGCGCAG GGGAAGCTAG CAGGCATCGT GATCAAGGCG CTCCGATCGT TGCATAATTC CAACCAAGTC TACGGGATAA CTTCGGGGCG CTCGTGCACC AAACAGGAAG TCATACTCTT GATACATATT GAAAAGTGCC GGCGTATCAC TCTTGAGGGG GTCGCCATGA CGGCCAAAGC TATAGCGCTA AAGAGGCCCG CCGAGGATGA TTTAACTGTG TTCGTAATCA CAACATACGA CACATTAATT GCATTAATGA TTCCTCGCTC CTCAAAGGCG AGCAAAAGGC TAGGCTCCGC CCCGACAGGA TGTTCCGACC GCTTTCTCAT GGGCTGTGTG TCTTGAGTCC GATTAGCAGA CGGCTACACT AAAAAGAGTT TGTTTGCAAG TTCTACGGGG ATTATCAAAA CTAAAGTATA TATCTCAGCG AACTACGATA ACGCTCACCG AAGTGGTCCT AGTAAGTAGT GGTGTCACGC AGTTACATGA TGTCAGAAGT TCTTACTGTC ATTCTGAGAA TACCGCGCCA AAAACTCTCA CAACTGATCT GCAAAATGCC CCTTTTTCAA TGAATGTATT ACCTGACGTC GAGGCCCTTT TTTTTTGCTG TCGCGTAGTC GGTCGGACAG GCAGCACGCC GCAGTACCGG CGATGAGCGC ATAAACTACC TGGTCATAGC GCCGGAAGCA GCGTTGCGCT ATCGGCCAAC ACTGACTCGC GTAATACGGT CAGCAAAAGG CCCCCTGACG CTATAAAGAT CTGCCGCTTA AGCTCACGCT CACGAACCCC AACCCGGTAA GCGAGGTATG AGAAGGACAG GGTAGCTCTT CAGCAGATTA TCTGACGCTC AGGATCTTCA TATGAGTAAA ATCTGTCTAT CGGGAGGGCT GCTCCAGATT GCAACTTTAT TCGCCAGTTA TCGTCGTTTG TCCCCCATGT AAGTTGGCCG ATGCCATCCG TAGTGTATGC CATAGCAGAA AGGATCTTAC TCAGCATCTT GCAAAAAAGG TATTATTGAA TAGAAAAATA TAAGAAACCA CGTC 124 Anhang _________________________________________________________________________________________________________________ Plasmidsequenz pSEL4 (3810 bp): § § § § § § § § § § § § Transkriptionspromotor (‘T7 gene 10’): Transkriptionsstart: 5‘ stem-loop: Ribosomenbindungsstelle (Shine-Dalgarno Sequenz) Startcodon: CI 2 kodierende Sequenz: Loopstruktur: (Gly4 Ser)-Linker: Modifizierter Lipoproteinterminator: Transkriptionsterminator (‘T7 gene 10’): β-Lactamase kodierende Sequenz: Wichtige Schnittstellen: Hind III 399, 1543; Xba I 656; Nco I 695; Bam HI 834, 1062; Pst I 1065 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 618-634 635 635-655 684-689 697-699 706-936 808-870 937-1011 1012-1056 1133-1173 2750-3610 Nsi I 813; Xho I 865; 10 20 30 40 50 60 | | | | | | TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC AAGGAGATGG CGCCCAACAG TCCCCCGGCC ACGGGGCCTG CCACCATACC CACGCCGAAA CAAGCGCTCA TGAGCCCGAA GTGGCGAGCC CGATCTTCCC CATCGGTGAT GTCGGCGATA TAGGCGCCAG CAACCGCACC TGTGGCGCCG GTGATGCCGG CCACGATGCG TCCGGCGTAG AGGATCGAGA TCTCGATCCC GCGAAATTAA TACGACTCAC TATAGGGAGA CCACAACGGT TTCCCTCTAG AAATAATTTT GTTTAACTTT AAGAAGGAGA TATACCATGG GTACCCTGAA GACAGAGTGG CCAGAGTTGG TGGGGAAATC GGTGGAGGAG GCCAAGAAGG TGATTCTCCA GGACAAGCCA GAGGCGCAAA TCATAGTTCT GCCGGTGCAT GCATTAGCTA GCGAAGATCA GGTGGATCCA CGGTTAATCG ATGGTAAGGG CGCCCTCGAG GACCGCGTCC GCCTCTTTGT CGATAAACTC GACAACATTG CCCAGGTCCC CAGGGTCGGC ACGCGTGGCG GGGGCGGTAG CGGCGGTGGC GGGTCGGGCG GTGGCGGATC GACCAGGCAG GTGGGCGCTA GCGCTGCAGC TGACCCGTTT AGAGGCCCCA AGGGGTTATG GAATTCACCT TTAAGCAGCT CGGATCCGGC TGCTAACAAA GCCCGAAAGG AAGCTGAGTT GGCTGCTGCC ACCGCTGAGC AATAACTAGC ATAACCCCTT GGGGCCTCTA AACGGGTCTT GAGGGGTTTT TTGCTGAAAG GAGGAACTAT ATCCGGATAT CCACAGGACG GGTGTGGTCG CCATGATCGC GTAGTCGATA GTGGCTCCAA GTAGCGAAGC GAGCAGGACT GGGCGGCGGC CAAAGCGGTC GGACAGTGCT CCGAGAACGG GTGCGCATAG AAATTGCATC AACGCATATA GCGCTAGCAG CACGCCATAG TGACTGGCGA TGCTGTCGGA ATGGACGATA TCCCGCAAGA GGCCCGGCAG TACCGGCATA ACCAAGCCTA TGCCTACAGC ATCCAGGGTG ACGGTGCCGA GGATGACGAT GAGCGCATTG TTAGATTTCA TACACGGTGC CTGACTGCGT TAGCAATTTA ACTGTGATAA ACTACCGCAT TAAAGCTTAT CGATGATAAG CTGTCAAACA TGAGAATTCG TAATCATGGT CATAGCTGTT TCCTGTGTGA AATTGTTATC CGCTCACAAT TCCACACAAC ATACGAGCCG GAAGCATAAA GTGTAAAGCC TGGGGTGCCT AATGAGTGAG CTAACTCACA TTAATTGCGT TGCGCTCACT GCCCGCTTTC CAGTCGGGAA ACCTGTCGTG CCAGCTGCAT TAATGAATCG GCCAACGCGC GGGGAGAGGC GGTTTGCGTA TTGGGCGCTC TTCCGCTTCC TCGCTCACTG ACTCGCTGCG CTCGGTCGTT CGGCTGCGGC GAGCGGTATC AGCTCACTCA AAGGCGGTAA TACGGTTATC CACAGAATCA GGGGATAACG CAGGAAAGAA CATGTGAGCA AAAGGCCAGC AAAAGGCCAG GAACCGTAAA AAGGCCGCGT TGCTGGCGTT TTTCCATAGG CTCCGCCCCC CTGACGAGCA TCACAAAAAT CGACGCTCAA GTCAGAGGTG GCGAAACCCG ACAGGACTAT AAAGATACCA GGCGTTTCCC CCTGGAAGCT CCCTCGTGCG CTCTCCTGTT CCGACCCTGC CGCTTACCGG ATACCTGTCC GCCTTTCTCC CTTCGGGAAG CGTGGCGCTT TCTCATAGCT CACGCTGTAG GTATCTCAGT TCGGTGTAGG TCGTTCGCTC CAAGCTGGGC TGTGTGCACG AACCCCCCGT TCAGCCCGAC CGCTGCGCCT TATCCGGTAA CTATCGTCTT GAGTCCAACC CGGTAAGACA CGACTTATCG CCACTGGCAG CAGCCACTGG TAACAGGATT AGCAGAGCGA GGTATGTAGG CGGTGCTACA GAGTTCTTGA AGTGGTGGCC TAACTACGGC TACACTAGAA GGACAGTATT TGGTATCTGC GCTCTGCTGA AGCCAGTTAC CTTCGGAAAA AGAGTTGGTA GCTCTTGATC CGGCAAACAA ACCACCGCTG 125 Anhang _________________________________________________________________________________________________________________ 2521 GTAGCGGTGG TTTTTTTGTT TGCAAGCAGC 2581 AAGATCCTTT GATCTTTTCT ACGGGGTCTG 2641 GGATTTTGGT CATGAGATTA TCAAAAAGGA 2701 GAAGTTTTAA ATCAATCTAA AGTATATATG 2761 TAATCAGTGA GGCACCTATC TCAGCGATCT 2821 TCCCCGTCGT GTAGATAACT ACGATACGGG 2881 TGATACCGCG AGACCCACGC TCACCGGCTC 2941 GAAGGGCCGA GCGCAGAAGT GGTCCTGCAA 3001 GTTGCCGGGA AGCTAGAGTA AGTAGTTCGC 3061 TTGCTACAGG CATCGTGGTG TCACGCTCGT 3121 CCCAACGATC AAGGCGAGTT ACATGATCCC 3181 TCGGTCCTCC GATCGTTGTC AGAAGTAAGT 3241 CAGCACTGCA TAATTCTCTT ACTGTCATGC 3301 AGTACTCAAC CAAGTCATTC TGAGAATAGT 3361 CGTCAATACG GGATAATACC GCGCCACATA 3421 AACGTTCTTC GGGGCGAAAA CTCTCAAGGA 3481 AACCCACTCG TGCACCCAAC TGATCTTCAG 3541 GAGCAAAAAC AGGAAGGCAA AATGCCGCAA 3601 GAATACTCAT ACTCTTCCTT TTTCAATATT 3661 TGAGCGGATA CATATTTGAA TGTATTTAGA 3721 TTCCCCGAAA AGTGCCACCT GACGTCTAAG AAAATAGGCG TATCACGAGG CCCTTTCGTC 8.8 AGATTACGCG ACGCTCAGTG TCTTCACCTA AGTAAACTTG GTCTATTTCG AGGGCTTACC CAGATTTATC CTTTATCCGC CAGTTAATAG CGTTTGGTAT CCATGTTGTG TGGCCGCAGT CATCCGTAAG GTATGCGGCG GCAGAACTTT TCTTACCGCT CATCTTTTAC AAAAGGGAAT ATTGAAGCAT AAAATAAACA AAACCATTAT CAGAAAAAAA GAACGAAAAC GATCCTTTTA GTCTGACAGT TTCATCCATA ATCTGGCCCC AGCAATAAAC CTCCATCCAG TTTGCGCAAC GGCTTCATTC CAAAAAAGCG GTTATCACTC ATGCTTTTCT ACCGAGTTGC AAAAGTGCTC GTTGAGATCC TTTCACCAGC AAGGGCGACA TTATCAGGGT AATAGGGGTT TATCATGACA GGATCTCAAG TCACGTTAAG AATTAAAAAT TACCAATGCT GTTGCCTGAC AGTGCTGCAA CAGCCAGCCG TCTATTAATT GTTGTTGCCA AGCTCCGGTT GTTAGCTCCT ATGGTTATGG GTGACTGGTG TCTTGCCCGG ATCATTGGAA AGTTCGATGT GTTTCTGGGT CGGAAATGTT TATTGTCTCA CCGCGCACAT TTAACCTATA Abkürzungen A Adenosin dpm APS Ammoniumperoxodisulfat AS engl. Antisense engl. desintegrations per minute Zerfälle pro Minute DTE Dithioerythritol Dithiothreitol ATP Adenosin-5‘-triphosphat DTT bp Basenpaare E. coli Escherichia coli BPB Bromphenolblau EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Bq Bequerel (= 1 Zerfall pro sek) EF Elongationsfaktor BSA engl. bovine serum albumin et al. und andere Rinderserum Albumin C FABP engl. fatty acid binding protein Cytidin fettsäurebindendes Protein 6 Ci Curie (1 Ci = 3,7 × 10 Bq) g CIP engl. calf intestine phosphatase G Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm cpm engl. counts per minute gemessene Impulse pro Minute CTP Cytidin-5‘-triphosphat Da Dalton ddNTP 2´,3´Desoxyribonukleosidtriphosphat dNTP 2´-Desoxyribonukleosidtriphosphat DNA engl. deoxyribonucleic acid Desoxyribonukleinsäure Gramm Guanosin ×g Gravitation, Erdbeschleunigung GTP Guanosin-5‘-triphosphat h Stunde HABA Hydroxyazobenzoesäure HEPES N‘-2-Hydroxyethylpiperazin-2ethansulfonsäure IF Initiationsfaktor kb(p) Kilobasen(paare) Kd Dissoziationskonstante l Liter LB Luria-Bertani-(Medium) Anhang 126 _________________________________________________________________________________________________________________ M molar (mol/l) TE mA Milliampere TEMED N, N, N´, N´-Tetramethylethylendiamin min Minute Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan Mol 6,022 × 10 tRNA engl. transfer ribonucleic acid 23 Transfer-Ribonukleinsäure MOPS 3-N-(Morpholino)propansulfonsäure mRNA engl. messenger ribonucleic acid Boten-Ribonukleinsäure Tris/EDTA U Uridin U Unit, Einheit der Enzymaktivität UTP Uridin-5‘-triphosphat UTR engl. untranslated region MW Molekulargewicht N Nukleotid NTP Nukleosid-5‘-triphosphat UV ultraviolett PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese v/v Volumen pro Volumen, PCR w/v Gewicht pro Volumen, XCB Xylencyanolblau engl. polymerase chain reaction Polymerasekettenreaktion PEG Polyethylenglykol PEP Phosphoenolpyruvat Pi anorganisches Phosphat PPi Pyrophosphat Pwo Pyrococcus woesei RBS Ribosomenbindungsstelle RD ‘Ribosome Display’ RF engl. release factor Freisetzungsfaktor RNA engl. ribonucleic acid Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease rpm engl. rounds per minute Umdrehungen pro Minute rRNA ribosomale Ribonukleinsäure RT reverse Transkription RU engl. resonance units (Resonanzeinheiten) RVC Ribonukleosid-Vanadyl-Komplex SDS engl. sodium dodecyl sulfate Natriumdodecylsulfat sec Sekunde St 2 Strep-tag II T Thymidin Taq Thermus aquaticus TBE Tris/Borsäure/EDTA TCA Trichloressigsäure untranslatierter Bereich Anhang 127 _________________________________________________________________________________________________________________ Abkürzungen für Aminosäuren Aminosäure Dreibuchstabencode Einbuchstabencode Alanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Asparaginsäure (Aspartat) Asp D Cystein Cys C Glutamin Gln Q Glutaminsäure (Glutamat) Glu E Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptophan Trp W Tyrosin Tyr Y Valin Val V -15 Präfixe für Einheiten: f, Femto (10 ); p, Pico (10 -3 -12 -9 -6 ); n, Nano (10 ); µ, Mikro (10 ); 3 m, Milli (10 ); k, Kilo (10 ) Weiterhin wurden allgemein übliche Abkürzungen verwendet. Anhang 128 _________________________________________________________________________________________________________________ 8.9 Eigene Publikationen Originalarbeiten: Lamla, T. und Erdmann, V.A. (2001) In vitro selection of other proteins than antibodies by means of ribososme display. FEBS Lett. 502, 35-40. Lamla, T., Mammeri, K. und Erdmann, V.A. (2001) The cell-free protein biosynthesis-applications and analysis of the system. Acta Biochim. Pol. 48, 453-465. Lamla, T. und Erdmann, V.A. (2002) Improved batch translation system based on E. coli extract, in: Cell-free translation systems, pp. 23-39. Springer Verlag, ISBN 3-540-42050-9. Lamla, T. und Erdmann, V.A. (2002) An improved protein bioreactor: Efficient product isolation during in vitro protein biosynthesis via affinity tag. Molecular and Cellular Proteomics 1, 466-471. Lamla, T. und Erdmann, V.A. (2002) Searching sequence space for binding peptides using ribosome display. in Bearbeitung Patente: DE-Patentanmeldung Nr. 101 37 792 vom 06.08.2001 DE-Patentanmeldung Nr. 102 08 877 vom 01.03.2002 Poster: Lamla, T. und Erdmann, V.A. (2001) In vitro selection of other proteins than antibodies by means of ribosome display. GBM-Jagrestagung (52. Mosbacher Kolloquium), 5.-7. April, Mosbach. Lamla, T. und Erdmann, V.A. (2001) In vitro selection of proteins by means of ribosome display. Tag der Chemie, Freie Universität Berlin, 7. November, Berlin. Vorträge: Lamla, T. (1998) Aufreinigung in vitro synthetisierter Proteine. Arbeitstreffen des BMBF-Verbundprojekts „Proteine mit unnatürlichen Aminosäuren, Teilprojekt: Zellfreie Proteinsynthese“, 15.-16.Dezember, Potsdam. Lamla, T. (1999) Zellfreie Synthese von Strep-tag Fusionsproteinen und ihre Isolierung. 17. Rabensteiner Kolleg, 3.-5. Juni, Pottenstein. Lamla, T. (2000) In vitro Selektion von Proteinen mittels Ribosomendisplay. 18. Rabensteiner Kolleg, 22.-24. Juni, Pottenstein. Lamla, T. (2002) In vitro Selektion von Peptiden und Proteinen. Symposium des Netzwerkes „RNATechnologien“, 8.-9. März, Berlin. Lamla, T. (2002) In vitro selection of proteins based upon the cell-free translation. EFBIC workshop on cell-free protein factories, 11.-12. April, Chinese academy of science, Shanghai, China. Anhang 129 _________________________________________________________________________________________________________________ 8.10 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Volker A. Erdmann für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und für die Schaffung der optimalen materiellen und finanziellen Rahmenbedingungen, die ich während der Anfertigung der vorliegenden Arbeit nutzen durfte. Darüber hinaus bin ich Herrn Prof. Erdmann für seine Diskussionsbereitschaft, die mir überlassenen wissenschaftlichen Freiräume und die Schaffung eines vielversprechenden Folgeprojekts sehr dankbar. Mein herzlicher Dank gilt auch Herrn Dr. Wolfgang Stiege für die Bereitstellung dieser überaus interessanten Arbeit und die anfängliche Betreuung. Vor allem Dr. Michael Gerrits, Rouven Klug und Dr. Helmut Merk danke ich für die zahlreichen Tips und Tricks, sowie die unzähligen wissenschaftlichen Diskussionen. Der gesamten „in vitro Proteinbiosynthesegruppe“, Dr. Michael Gerrits, Kerstin Mammeri, Dr. Helmut Merk, Iris Reker, Angela Schreiber, Dr. Wolfgang Stiege, Anja Talke und Kathrin Tausch, danke ich für die ausgezeichnete Teamarbeit und Arbeitsatmosphäre. Anja Talke danke ich ganz herzlich für das gewissenhafte Korrekturlesen dieser Arbeit und Florian Töpert für die Unterstützung bei den Biacore-Messungen, sowie der Substitutionsanalyse. Bei allen weiteren Mitgliedern – und ehemaligen Mitgliedern – der Arbeitsgruppe möchte ich mich für die gute Zusammenarbeit und die angenehme Atmosphäre bedanken. Herrn Prof. Dr. Hans Lehrach möchte ich für die Bereitschaft, diese Dissertation zu begutachten, danken. Von ganzem Herzen möchte ich an dieser Stelle meiner Freundin Nora danken, die trotz der Distanz zum Thema immer ein offenes Ohr für meine Probleme hatte und gelegentlich eine Arbeitszeitverkürzung erzwang.
