factor ii (prothrombin) g20210a kit

FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A KIT
À utiliser avec l’instrument LightCycler® 2.0
REF
03 610 195 001
Kit prévu pour 32 réactions pour un maximum de 30 échantillons
Réservé au diagnostic in vitro.
REMARQUE IMPORTANTE :
LES INFORMATIONS SPÉCIFIQUES AU LOT DU KIT FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A SONT FOURNIES AU DOS DE CETTE
NOTICE SOUS FORME DE CODE À BARRES OU SOUS FORME ALPHANUMÉRIQUE. CES INFORMATIONS SPÉCIFIQUES AU LOT
DOIVENT ÊTRE SAISIES DANS LE LOGICIEL DE L’INSTRUMENT LIGHTCYCLER® 2.0, SOIT MANUELLEMENT, SOIT EN SCANNANT LE
CODE À BARRES DURANT LES PROCÉDURES DE TRAVAIL. IL EST IMPORTANT DE S’ASSURER QUE LE NUMÉRO DU LOT AU DOS DE
CETTE NOTICE ET LE NUMÉRO DU LOT SUR LE CARTON DU KIT SONT IDENTIQUES AVANT DE SAISIR LES INFORMATIONS.
USAGE PRÉVU
Le kit Factor II (Prothrombin) G20210A permet de détecter et de définir le génotype d’une mutation ponctuelle (G à A en position 20210) du gène du
facteur II humain à partir d’ADN provenant de sang périphérique total humain. Le test est réalisé sur l’instrument LightCycler® 2.0 en recourant à un
procédé d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) de l’ADN du facteur II issu d’échantillons cliniques, puis à une hybridation fluorigène
spécifiquement ciblée, afin de détecter et de définir le génotype de l’ADN amplifié du facteur II.
Le test Factor II (Prothrombin) G20210A est un test de diagnostic in vitro permettant de détecter et d’établir le génotype de la mutation G20210A du
facteur II (Prothrombine). Ce test constitue une aide au diagnostic en cas de suspicion de thrombophilie. Le test est destiné à être utilisé avec
l’instrument LightCycler® 2.0 et le logiciel LightCycler® 4.05 ou 4.1. Les échantillons doivent être préparés selon les procédures décrites ci-après.
EXPLICATION DU TEST
La thrombophilie héréditaire prédispose le sujet atteint à des événements thrombotiques comme la thrombose veineuse, troisième affection
cardiovasculaire la plus répandue (1). La résistance à la protéine C activée (PCA) est considérée comme l’anomalie de la coagulation associée à la
thrombose veineuse la plus fréquente (1,2). Les patients diagnostiqués comme positifs à la résistance à la PCA ou à la mutation Leiden du facteur V
doivent être soumis à des tests de génétique moléculaire afin de rechercher les autres thrombophilies avec phénotype chevauchant les plus
fréquentes, pour lesquelles un dépistage existe actuellement [c.-à-d., la variante G20210A du facteur II (prothrombine)] (2). Cette résistance existe
chez 1 à 2 % de la population générale et son rôle dans la survenue de thromboses veineuses a été largement démontré (2).
PRINCIPE DU TEST / RÉSUMÉ
Préparation des échantillons
Les échantillons peuvent être préparés manuellement ou de manière automatique à l’aide du kit High Pure PCR Template Preparation ou de l’instrument
MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0, utilisant le kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I. Il s'agit des seules méthodes de purification validées pour être
utilisées avec le test Factor II Prothrombin.
Détection
1. Un fragment de 165 bp du gène du facteur II est amplifié à partir d’ADN génomique humain, à l’aide d’amorces spécifiques.
2. L’amplicon est détecté par fluorescence à l’aide de deux sondes H spécifiques. Ces sondes H sont constituées de deux
oligonucléotides distincts qui s’hybrident à une séquence interne du fragment amplifié lors de la phase d’annelage du cycle de PCR. L’une des
sondes est marquée au niveau de l’extrémité 5' avec l’ester N-hydroxy-succinimide Red 640 (ester NHS Red 640) LightCycler® et l’extrémité 3'
est modifiée par phosphorylation afin d’éviter son extension. La deuxième sonde est marquée à la fluorescéine au niveau de l’extrémité 3'.
3. C’est uniquement après hybridation à l’ADN matrice que les deux sondes se trouvent à proximité l’une de l’autre et donnent naissance à un
transfert d’énergie de fluorescence par résonance (FRET) entre les deux fluorophores. Au cours du FRET, la fluorescéine, le fluorophore
donneur, est excitée par la source lumineuse de l’instrument LightCycler® 2.0 et une partie de l’énergie d’excitation est transférée vers l’ester
NHS Red 640 LightCycler®, le fluorophore accepteur.
4. La fluorescence émise par l’ester NHS Red 640 LightCycler® est alors mesurée par l’instrument LightCycler® 2.0.
Définition du génotype
Les sondes H sont également utilisées pour définir le génotype, grâce à une analyse de la courbe de fusion à la fin des cycles
d’amplification et lorsque la concentration de l’amplicon a augmenté.
• La sonde H marquée au Red 640 s’hybride à une partie de la séquence cible qui n’est pas mutée et fonctionne comme une sonde
d’ancrage.
• La sonde H marquée à la fluorescéine se lie au site de mutation (sonde de mutation).
Lors de l’analyse de la courbe de fusion, l’augmentation de la température entraîne une diminution de la fluorescence en raison de la dissociation de la
sonde la plus courte (sonde de mutation) entraînant l’éloignement des deux colorants fluorescents. En présence de la mutation G20210A du facteur II
(Prothrombine), la discordance entre la sonde de mutation et la cible déstabilise l’hybride entraînant la diminution de la fluorescence à une
température moins élevée. Aucune discordance n’est observée avec le génotype sauvage et par conséquent, la température de fusion (Tm) de l’ADN
double brin hétérologue est plus élevée. Le génotype hétérozygote présente une combinaison de propriétés distincte.
1
RÉACTIFS – SOLUTIONS DE TRAVAIL
1. FIIG20210A MD Mix
• <0,01 % amorce sens et antisens FIIG20210A
• Brij 35
[Mélange de détection de la mutation G20210A du facteur II (Prothrombine)] • <0,01 % Sonde H Red 640 FIIG20210A
• MgCl2
1 × 78 µL
• <0,01 % FIIG20210A Sonde H Fluorescéine
2. FIIG20210A R Mix
[Mélange de réaction Facteur II (Prothrombine) G20210A]
1 × 78 µL
• Tampon Tris-HCl
• <0,01 % Taq ADN polymérase (wt)
• <0,07 % dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP
• Brij 35
• MgCl2
3. FIIG20210A CT
[Matrice contrôle Facteur II (Prothrombine) G20210A]
1 × 50 µL
<0,01 % ADN matrice contrôle
contient du plasmide : pF2 WT et pF2 MUT
4. FIIG20210A DIL
[Diluant Facteur II (Prothrombine) G20210A]
1 × 1 mL
H2O, qualité PCR (également utilisée comme contrôle négatif pour
l’amplification)
PRÉCAUTIONS D’EMPLOI ET MISES EN GARDE
Polymorphisme
Au sein du gène du facteur II, outre la mutation FIIG20210A, quatre mutations connues existent aux positions 20209, 20207, 20218 et 20221 (par ex., les
mutations C20209T, A20207C, A20218G et C20221T) et ces mutations supplémentaires sont couvertes par la sonde de mutation. Ces mutations rares
entraînent des résultats inconnus ou la détection d'un génotype sauvage après la définition du génotype.
Conditions de manipulation
• RÉSERVÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO. Seul un personnel formé aux techniques de PCR doit utiliser ce produit.
• Appliquer les précautions habituelles de manipulation de tous les réactifs de laboratoire.
• Ce test doit uniquement être utilisé avec du sang total humain recueilli sur EDTA ou anticoagulant citrate. L’héparine est susceptible d’interférer
avec la PCR et ne doit pas être utilisée pour cette procédure.
• Les procédures de travail du laboratoire doivent être conformes aux Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL) et doivent en outre être
unidirectionnelles (c.-à-d. que la préparation des échantillons, la mise en place de la PCR puis sa réalisation à l’aide de l’instrument LightCycler® 2.0
doivent être séparées physiquement).
• Ne pas mélanger de réactifs provenant de différents lots ou de différentes bouteilles d’un même lot. Refermer immédiatement toutes les bouteilles
après utilisation afin d’éviter toute fuite ou variation de concentration ou de conditions des tampons. Après ouverture, conserver toutes les bouteilles
et tous les flacons en position verticale.
• Ne pas mélanger de réactifs provenant de lots différents.
• Ne pas utiliser un kit après sa date de péremption.
• Éviter tout contact entre le tampon de lyse/tampon de liaison et le tampon de lavage I du kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I ou le tampon de
liaison et le tampon d’élimination inhibiteur du kit High Pure PCR Template Preparation et la peau, les yeux ou les muqueuses. En cas de contact,
rincer immédiatement et abondamment à l’eau. Il existe un risque de brûlures si la zone touchée n’est pas traitée. Si une quantité de réactif est
renversée, diluer avec de l’eau avant d’essuyer.
• Ne pas mettre en contact le tampon de lyse/de liaison du kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, contenant du thiocyanate de guanidine, avec une
solution d’hypochlorite de sodium (eau de javel) ou des solutions très acides. Le mélange peut produire des gaz extrêmement toxiques.
Procédures de laboratoire
• Tout le matériel d’origine humaine et les déchets en résultant doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Nettoyer et désinfecter
minutieusement toutes les surfaces de travail à l’aide de désinfectants recommandés par les autorités locales.
• Ne pas manger, boire ni fumer dans la zone de travail du laboratoire.
• Ne pas pipeter à la bouche.
• Porter des gants à usage unique, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection lors de la manipulation des échantillons et des réactifs du kit.
• Éviter toute contamination des réactifs par des microbes ou des nucléases lors du retrait des aliquotes des bouteilles de réactif. Il est recommandé
d’utiliser des pipettes stériles à usage unique.
• Bien se laver les mains après la manipulation des échantillons et des réactifs de test.
Élimination des déchets
• Éliminer les réactifs non utilisés et les déchets conformément à la réglementation locale, régionale, fédérale et nationale.
• Des fiches de données de sécurité des matériaux (MSDS) sont disponibles sur demande auprès du bureau local Roche.
Préparation des échantillons
• Consulter les instructions de sécurité figurant dans la notice du kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I ou du kit High Pure PCR Template
Preparation pour disposer d’informations sur la manipulation et l’élimination.
• Les kits MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I et High Pure PCR Template Preparation doivent être conservés à température ambiante (entre +15 °C et
+25 °C). Avant d’utiliser le tampon de lyse/de liaison du kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, l’agiter afin de dissoudre le précipité. Ne pas le
conserver à une température inférieure à la température ambiante indiquée ci-dessus.
• Utiliser uniquement des cuvettes à réactif de taille moyenne MagNA Pure LC Medium Reagent Tub 20 (n° de réf. 03 004 058 001) ou MagNA Pure
LC Reagent Tub (large) (n° de réf. 03 004 040 001) aux positions respectives indiquées par l’instrument MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0 pour
cette procédure.
Amplification et détection
• Consulter le manuel d’utilisation de l’instrument LightCycler® 2.0 pour utilisation in-vitro avant d’utiliser ce kit.
• Établir un document écrit en corrélation avec le numéro ID du carrousel LightCycler®. Le document doit contenir la position du carrousel à
échantillons LightCycler®, le nombre de tubes capillaires ainsi que le nom associé à chaque échantillon afin d’assurer l’identification correcte des
échantillons.
• Ne pas toucher la surface des tubes capillaires. Veiller à toujours porter des gants lors de la manipulation des tubes capillaires.
2
MANIPULATION DES RÉACTIFS
1. FIIG20210A MD Mix (bouchon jaune, flacon 1), prêt à l’emploi
•
•
•
•
•
2. FIIG20210A R Mix (bouchon rouge, flacon 2), prêt à l’emploi
3. FIIG20210A CT (bouchon violet, flacon 3), prêt à l’emploi
4. FIIG20210A DIL (bouchon incolore, flacon 4), prêt à l’emploi
Conserver entre -15 °C et -25 °C.
Conserver à l’abri de la lumière !
Conserver entre -15 °C et -25 °C.
Conserver entre -15 °C et -25 °C.
Conserver entre -15 °C et -25 °C.
CONSERVATION / STABILITÉ (RÉACTIFS)
• Le kit non ouvert doit être conservé entre -15 °C et -25 °C jusqu’à la date de péremption figurant sur l’étiquette.
• Conserver le réactif FIIG20210A MD Mix (flacon 1, bouchon jaune) à l’abri de la lumière !
• Décongeler les composants du kit Factor II (Prothrombin) G20210A, mélanger délicatement et conserver sur de la glace.
• Congeler immédiatement après utilisation.
• Les réactifs peuvent être congelés puis décongelés jusqu’à cinq fois.
RECUEIL, PRÉPARATION ET STABILITÉ DES ÉCHANTILLONS
Pour préparer l’ADN génomique de sang humain, effectuer la purification de l’acide nucléique en utilisant le kit High Pure PCR Template Preparation
(n° de réf. 11 796 828 001) ou le kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (n° de réf. 03 003 990 001) en association avec l’instrument MagNA Pure LC
(n° de réf. 12 236 931 001) ou l'instrument MagNA Pure LC 2.0 (n° de réf. 05 197 686 001) comme décrit ci-dessous.
• Le sang périphérique humain anticoagulé à l’EDTA ou au citrate est stable pendant au moins 7 jours s’il est conservé entre +2 °C et +8 °C. Il
peut être congelé et conservé à -20 °C pendant 12 mois au maximum et décongelé une fois.
• L’ADN élué peut être conservé dans une cartouche à échantillons hermétiquement fermée ou dans un tube Sarstedt à bouchon vissé entre
+2 °C et +8 °C pendant 7 jours au maximum. Il est stable pendant une période prolongée (environ 3 semaines) entre -15 °C et -25 °C. L’ADN
élué peut être congelé et décongelé jusqu’à trois fois.
MATÉRIEL FOURNI
Consulter le paragraphe « Réactifs – solutions de travail » page 2.
MATÉRIEL ET DISPOSITIFS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS
• Instrument LightCycler® 2.0 (n° de réf. 03 531 414 201)
Remarque : Pour les États-Unis, des numéros de référence
différents s'appliquent. Contacter l'agence commerciale
américaine pour de plus amples informations.
(Les appareils avec numéro de série 1415001 et supérieur sont
homologués pour être utilisés avec le logiciel IVD et ce kit. Les
appareils dont le numéro de série est inférieur à 1415001 sont
également homologués pour être utilisés avec ce kit une fois
qu'ils ont été homologués pour être utilisés avec le logiciel IVD
via une procédure de mise à niveau spéciale. Veuillez contacter
votre service local d'assistance clientèle pour obtenir des
informations détaillées sur la procédure de mise à niveau.)
• Logiciel LightCycler® 4.05 (n° de réf. 04 717 392 001)
ou 4.1 (n° de réf. 04 898 915 001)
• Tubes capillaires LightCycler® (20 µL)
(n° de réf. 04 929 292 001)
• Kit High Pure PCR Template Preparation
(n° de réf. 11 796 828 001)
• Tubes pour microcentrifugeuse, 1,5 mL, stérile, sans
nucléase
• Adaptateurs pour centrifugeuse LightCycler®
(n° de réf. 11 909 312 001)
• Lecteur de codes à barres (n° de réf. 04 557 174 001)
MATÉRIEL EN OPTION
• CD Thrombophilia Post-Elution Protocols
(n° de réf. 04 378 784 001)
• Imprimante de codes à barres MagNA Pure LC TLP 2844
(n° de réf. 03 576 094 001)
• Étiquettes de codes à barres MagNA Pure LC
(n° de réf. 03 531 520 001)
• Macro Factor II (Prothrombin) G20210A
(n° de réf. 04 586 930 001)
Éthanol p.a.
Isopropanol p.a.
H2O, bi-distillée, stérile, sans nucléase
Instrument MagNA Pure LC (n° de réf. 12 236 931 001) avec le logiciel
MagNA Pure LC 3.011 ou supérieur, ou
Instrument MagNA Pure LC 2.0 (n° de réf. 05 197 686 001) quelle que soit la
configuration logicielle
• Kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (n° de réf. 03 003 990 001)
• Centrifugeuse de carrousel LC 2.0 plus adaptateurs de rotor [n° de réf.
03 709 582 001 (230 V) ou n° de réf. 03 709 507 001 (115 V)]. Si vous avez déjà
acquis une centrifugeuse de carrousel LC [n° de réf. 12 189 682 001 (230 V)
ou n° de réf. 03 030 512 001 (115 V)], un kit rotor de centrifugeuse de carrousel
LightCycler® 2.0 (n° de réf. 03 724 697 001)* est également exigé.
• Tubes Sarstedt à bouchon vissé, 1,5 mL, stérile
* Consulter le manuel d’utilisation de l’instrument LightCycler® 2.0, version
logicielle 4.05 ou 4.1 pour diagnostic in vitro, ou contactez le support technique
pour connaître les spécifications d’une centrifugeuse équivalente si la
centrifugeuse de carrousel LC n’est pas disponible. Dans ce cas, des
adaptateurs de centrifugeuse LightCycler® sont également requis (n° de réf.
11 909 312 001).
•
•
•
•
• Ruban d’imprimante de codes à barres MagNA Pure LC
(n° de réf. 03 531 538 001)
• Bloc de refroidissement MagNA Pure LC, carrousel à échantillons LC
(n° de réf. 12 189 704 001)
• Dispositif de pose de bouchon LightCycler® (Capping Tool)
(n° de réf. 03 357 317 001)
• Équipement général de laboratoire
MODALITÉS DE L’ESSAI
REMARQUE IMPORTANTE :
LES INFORMATIONS SPÉCIFIQUES AU LOT DU KIT FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A SONT FOURNIES AU DOS DE CETTE
NOTICE SOUS FORME DE CODE À BARRES OU SOUS FORME ALPHANUMÉRIQUE. CES INFORMATIONS SPÉCIFIQUES AU LOT
DOIVENT ÊTRE SAISIES DANS LE LOGICIEL DE L’INSTRUMENT LIGHTCYCLER® 2.0, SOIT MANUELLEMENT, SOIT EN SCANNANT LE
CODE À BARRES DURANT LES PROCÉDURES DE TRAVAIL. IL EST IMPORTANT DE S’ASSURER QUE LE NUMÉRO DU LOT AU DOS DE
CETTE NOTICE ET LE NUMÉRO DU LOT SUR LE CARTON DU KIT SONT IDENTIQUES AVANT DE SAISIR LES INFORMATIONS.
3
➀
A.
Procédure de préparation automatisée des échantillons pour 15 à 30 échantillons à l’aide du kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I
(n° de réf. 03 003 990 001) en association avec l’instrument MagNA Pure LC (n° de réf. 12 236 931 001) ou l’instrument MagNA
Pure LC 2.0 (n° de réf. 05 197 686 001)
PURIFICATION
Avant de commencer
Commencer le refroidissement préalable du bloc de refroidissement MagNA Pure LC et du carrousel à échantillons LC (n° de réf. 12 189 704 001)
dans un réfrigérateur entre +2 °C et +8°C (pendant au moins 2 heures).
Démarrage de l'instrument et du logiciel MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0
1. Mettre l’instrument MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0 sous tension puis démarrer l’ordinateur.
2. Pour le logiciel MagNA Pure LC : Démarrer le logiciel MagNA Pure LC puis sur l’écran Main Menu, cliquer sur le bouton Sample
Ordering.
Pour le logiciel MagNA Pure LC 2.0 : ouvrir l'onglet Workplace et sélectionner le sous-onglet Ordering.
3. Pour le logiciel MagNA Pure LC : sur l’écran Sample Ordering, sélectionner le protocole intitulé DNA I Blood Cells Fast, puis saisir les
numéros de lot des kits MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (n° de réf. 03 003 990 001) et Factor II (Prothrombin) G20210A et l’ID du
carrousel LightCycler® (ne pas modifier d’autres paramètres).
Pour MagNA Pure LC 2.0 : dans le sous-onglet Ordering, sélectionner le protocole intitulé DNA I Blood Cells Fast, puis saisir les numéros
de lot des kits MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (n° de réf. 03 003 990 001) et Factor II (Prothrombin) G20210A et l’ID du carrousel
LightCycler® (ne pas modifier d’autres paramètres).
4. Entrer le contrôle négatif (FIIG20210A DIL, flacon 4, bouchon incolore) dans la rangée 1 du tableau d’ordre des échantillons (position A1) en
saisissant « Contrôle négatif ». Saisir 50 µL comme volume d’échantillon et 0 µL comme volume de dilution (prédéfini). Le volume d’élution
est prédéfini sur 100 µL.
5. En commençant à la rangée 1 (position B1), saisir le nom des échantillons ou utiliser le lecteur de codes à barres MagNA Pure LC
(en option). Saisir 50 µL comme volume d’échantillon et 0 µL comme volume de dilution (prédéfini). Le volume d’élution est prédéfini sur
100 µL.
6. Enregistrer et imprimer les informations du fichier d’ordre des échantillons.
7. Utiliser la fonction Print Sample Names pour imprimer une liste contenant le nom des échantillons et leur position adéquate dans la
cartouche d’échantillons (en option).
8. Imprimer les étiquettes Cartridge Barcode en trois exemplaires (en option).
9. Placer ces étiquettes sur la cartouche d’échantillons (pour l’élution) et les documents imprimés (en option).
10. Cliquer sur Stage Setup.
Préparation de la solution de Protéinase K
(quantité suffisante pour 32 échantillons)
1. Ajouter 3 mL de tampon d’élution (flacon 6, bouchon jaune) dans un flacon de protéinase K lyophilisée (flacon 4, bouchon rose). Après
dissolution complète de la protéinase K, ajouter 2 mL supplémentaires de tampon d’élution afin d’obtenir un volume final de 5 mL.
2. Fermer le flacon et bien mélanger.
Remarque : si la solution reconstituée n’est pas utilisée le jour même, la conserver entre +2 °C et +8 °C dans le flacon 4 (pendant
4 semaines au maximum).
Tous les autres réactifs sont prêts à l’emploi.
Chargement des réactifs et éléments à usage unique en plastique
Remarque : • Ne pas utiliser de cuvettes à réactif MagNA Pure LC Tub 30. Utiliser uniquement des cuvettes MagNA Pure LC Medium
Reagent Tub 20 (n°de réf. 03 004 058 001) ou MagNA Pure LC Reagent Tub (large) (n° de réf. 03 004 040 001) aux positions
indiquées par l’instrument MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0 avec cette procédure.
• L’état de l’unité Heat Unit et des unités Cool Units 1 & 2 doit indiquer PASS avant de remplir les cuvettes à réactif
correspondantes de suspension MGP (Magnetic Glass Particles : particules de verre magnétique).
1. Remplir manuellement les cuvettes à réactifs (à l'extérieur de l'instrument MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0) en respectant les volumes
indiqués dans l'écran Start Information (instrument MagNA Pure LC) ou dans le sous-onglet Stage Setup (instrument MagNA Pure
LC 2.0) (comme indiqué dans le graphique Stage Layout) puis les refermer à l'aide des couvercles et des joints correspondants. Placer les
cuvettes à réactif remplies dans le portoir réservoir de réactifs aux positions indiquées dans l'écran Start Information (instrument MagNA
Pure LC) ou dans le sous-onglet Stage Setup (instrument MagNA Pure LC 2.0) (à l'exception de la suspension MGP, voir étape 4).
2. Placer les éléments à usage unique en plastique requis (comme indiqué) et le portoir réservoir d'échantillons sur l'étage réactifs/
échantillons en suivant les indications données dans l'écran Start Information (instrument MagNA Pure LC) ou le sous-onglet Stage
Setup (instrument MagNA Pure LC 2.0).
3. Transvaser manuellement 50 µL de sang périphérique total humain anticoagulé à l’EDTA ou au citrate directement dans la cartouche
d’échantillons (à l’extérieur de l’instrument MagNA Pure LC) conformément à la liste d’ordre d’échantillons.
4. Juste avant de lancer le cycle, passer soigneusement au vortex le flacon en verre contenant la suspsension MGP, remplir une cuvette à réactif
de suspension MGP, la fermer à l'aide du couvercle correspondant et la placer sur l'étage Réactif/Échantillon de l'instrument à la position
indiquée dans l'écran Start Information (instrument MagNA Pure LC) ou le sous-onglet Stage Setup (instrument MagNA Pure LC 2.0).
5. Placer la cartouche d’échantillons dans l’instrument MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0.
Cycle de purification
1. Confirmer chaque position chargée sur l'instrument MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0 en cliquant avec la souris sur l'écran Start
Information (instrument MagNA Pure LC) ou sur le sous-onglet Stage Setup (instrument MagNA Pure LC 2.0). Après avoir confirmé
tous les éléments, le bouton OK (instrument MagNA Pure LC) ou Start (instrument MagNA Pure LC 2.0) apparaît.
2. Retirer les joints de couvercle des cuvettes puis fermer la porte et le verrou de l’instrument MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0.
3. Cliquer sur le bouton OK (instrument MagNA Pure LC) ou Start (instrument MagNA Pure LC 2.0) pour lancer le cycle. L'écran Batch
Status (instrument MagNA Pure LC) ou l'écran Run Status (instrument MagNA Pure LC 2.0) apparaît et une ligne violette progressant
de gauche à droite indique l'avancement de la procédure d'isolation.
4
4. Pour l'instrument MagNA Pure LC : l’écran Result apparaît à la fin du cycle.
Pour l'instrument MagNA Pure LC 2.0 : les résultats du cycle de purification s'affichent dans le sous-onglet Batch Results.
5. Enregistrer et imprimer l'écran Result/le sous-onglet Batch Results (facultatif).
6. Il est également possible de sélectionner la fonction Open Post-Elution dans le menu Action (instrument MagNA Pure LC) ou dans le
sous-onglet Post-Elution Edit (instrument MagNA Pure LC 2.0). Dans le cas contraire, passer à l’étape B du chapitre 2 (préparation
manuelle des échantillons) de la présente notice.
7. Si l’extraction MagNA Pure échoue pour un échantillon (indiqué sur l’écran Result/le sous-onglet Batch Results), l’échantillon concerné
doit à nouveau être extrait.
Si la fonction Post-Elution ne peut être exécutée, passer à l’étape B du chapitre 2 (préparation manuelle des échantillons) de la présente
notice et utiliser les échantillons qui ont été extraits dès le premier cycle ou qui ont été réextraits avec succès.
B.
POST-ÉLUTION (en option)
Procédure de post-élution (en option)
1. S’assurer que le bloc de refroidissement MagNA Pure LC, carrousel à échantillons LC est en place et a été préalablement refroidi
(par ex., par réfrigération entre +2 °C et +8 °C pendant au moins 2 heures).
2. Charger le protocole post-élution intitulé Thrombophilia 15 or 30 samples à partir du CD Thrombophilia Post-Elution Protocols (n° de réf.
04 378 784 001) (en option).
3. Préparation du mélange principal (uniquement pour la procédure de post-élution)
• Préparer uniquement la quantité requise juste avant utilisation.
• Décongeler les composants du kit Factor II (Prothrombin) G20210A, mélanger délicatement et conserver sur de la glace.
• Placer un tube capillaire LightCycler® par échantillon d’ADN et un tube pour chaque contrôle dans le carrousel LightCycler®, c.-à-d.
17 tubes capillaires pour 15 échantillons ou 32 tubes capillaires pour 30 échantillons.
• Préparer le mélange principal :
Étape
Action
1
Ajouter les composants suivants dans un tube Sarstedt à bouchon vissé de 1,5 mL, placé sur de la glace, en respectant l’ordre indiqué
ci-dessous (exemples donnés pour 15 ou 30 échantillons) :
Réactifs–solutions de travail
Volume* /
Volume* /
15 échantillons
30 échantillons
FIIG20210A DIL, flacon 4
209 µL
396 µL
FIIG20210A MD Mix, flacon 1
38 µL
72 µL
FIIG20210A R Mix, flacon 2
38 µL
72 µL
Volume total
285 µL
540 µL
* les volumes indiqués comprennent les marges liées aux contrôles et au pipetage
2
• Mélanger doucement.
• S’assurer qu’aucune bulle d’air ne reste au niveau de l’extrémité du tube.
3
Placer le tube contenant le mélange principal sur le bloc de refroidissement MagNA Pure LC en position 1. Retirer les joints de
couvercle.
4. Placer le carrousel LightCycler®, y compris les tubes capillaires indiqués par le protocole post-élution, dans le bloc de refroidissement
puis placer le nombre d’embouts de pipette requis indiqué sur l’écran sur l’étage de l’instrument MagNA Pure LC.
5. Ouvrir le réactif FIIG20210A CT (flacon 3, bouchon violet), pipeter 25 µL dans un autre tube Sarstedt à bouchon vissé de 1,5 mL puis le
placer dans le bloc de refroidissement MagNA Pure LC en position 16 comme l’indique le protocole post-élution.
Remarque :
• Centrifuger le flacon contenant le réactif FIIG20210A CT afin d’agiter le contenu avant de l’ouvrir.
• S’assurer qu’aucune bulle d’air ne reste au niveau de l’extrémité du tube.
• Changer de gants après la manipulation de la matrice contrôle.
6. Fermer l'instrument et cliquer sur Start (instrument MagNA Pure LC) ou Run (instrument MagNA Pure LC 2.0) puis sur OK pour lancer
le pipetage automatique. À la fin de la post-élution, l'écran Post-Elution Result (instrument MagNA Pure LC) apparaît ou ouvre le
sous-onglet Post-Elution results dans l'onglet Workplace (instrument MagNA Pure LC 2.0).
7. Imprimer le code à barres du bloc de refroidissement en trois exemplaires. (en option).
8. Enregistrer (Save) et imprimer (Print) le tableau de résultats Post-Elution (pour MagNA Pure LC) ou dans le sous-onglet Post-Elution
Results, utiliser le bouton général d'impression (instrument MagNA Pure LC 2.0) puis imprimer avec un code à barres du bloc de
refroidissement (en option).
9. Placer une étiquette comportant le nom du cycle de purification ou un code à barres de bloc de refroidissement sur une disquette vierge.
Créer un fichier SAM (fichier de gabarit d’échantillon) LightCycler® sur la disquette.
10. Fermer hermétiquement chaque tube capillaire en utilisant le dispositif de pose de bouchon LC Capping Tool (n° de réf. 03 357 317 001).
11. Placer une étiquette de code à barres de bloc de refroidissement sur le carrousel LightCycler® (en option).
12. Placer le carrousel LightCycler® dans le rotor de la centrifugeuse de carrousel LC.
13. Transférer le rotor, y compris le carrousel LightCycler®, vers la centrifugeuse de carrousel LC.
Remarque : si aucune centrifugeuse de carrousel LC n’est disponible, utiliser une centrifugeuse de paillasse (telle que le modèle
Biofuge® 13 fabriqué par Heraeus Instruments ou Kendro Laboratory Products) avec les adaptateurs pour centrifugeuse LightCycler® et
centrifuger à 735 × g pendant 30 secondes.
14. Appuyer sur Start pour lancer le cycle de la centrifugeuse de carrousel LC.
15. Après centrifugation, transférer le carrousel LightCycler® sur l’instrument LightCycler® 2.0.
Remarque : conserver l’ADN élué entre +2 °C et +8 °C pendant sept jours au maximum et entre -25 °C et -25 °C pour une période plus
longue (environ 3 semaines). Si le protocole post-élution n’est pas utilisé avec l'instrument MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0, passer
à l’étape B du chapitre 2 pour la préparation du mélange principal pour la PCR.
16. Si aucun autre cycle MagNA Pure ne doit être effectué, arrêter l’ordinateur MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0 et l’instrument MagNA
Pure LC/MagNA Pure LC 2.0.
5
C.
AMPLIFICATION ET DÉTECTION
Instrument LightCycler® 2.0
Remarque : Avant de lancer la macro, se connecter à la base de données Exor DB avec une piste de contrôle. Si vous êtes connecté à la
base de données Exor DB avec une piste de contrôle, le mot « Traceable » s’affiche dans la barre d’état. Pour en savoir davantage sur le
mode de connexion au logiciel, consulter le manuel d’utilisation de l’instrument LightCycler® 2.0, version logicielle 4.05 ou 4.1 pour
diagnostic in vitro.
1. Si le carrousel LightCycler® a été précédemment étiqueté (étape B.11), retirer l’étiquette de code à barres (en option).
2. Placer le carrousel dans l’instrument LightCycler® 2.0.
3. Assurez-vous que la macro kit Factor II (Prothrombin) G20210A (n° de réf. 04 586 930 001) est installée. Vous n'avez besoin d'installer
cette macro qu'une seule fois : lors de l'exécution du test pour la première fois.
4. Lancez la macro en appuyant sur le bouton Roche et en saisissant le n° de réf. du kit, soit manuellement, soit en scannant le code à
barres. Voyez au dos de cette notice les informations spécifiques correctes du code à barres du kit.
Remarque : « Perform self test » peut ne pas être actif.
5. L’assistant du kit va vous guider à travers toute la procédure.
6. Saisissez les noms des échantillons dans l’écran Capillary View soit manuellement soit, s’il a été auparavant créé, à l’aide d’un fichier
SAM en appuyant sur « Import SAM ». Saisissez le numéro du lot du kit dans le champ adéquat sur l'écran Capillary View.
7. Cliquez sur le bouton « Start Run » dans l’assistant du kit.
8. Une fois le cycle terminé, l’instrument LightCycler® 2.0 détermine et affiche automatiquement le génotype en réalisant une analyse de la
courbe de fusion.
Remarque : le signal de fluorescence est mesuré dans le canal de 640 nm.
➁
A.
Procédure de préparation manuelle des échantillons pour un échantillon à l’aide du kit High Pure PCR Template Preparation
(n° de réf. 11 796 828 001)
PURIFICATION
Avant de commencer
Refroidir au préalable les adaptateurs de centrifugeuse LightCycler® dans un réfrigérateur entre +2 °C et +8 °C (pendant au moins 2 heures).
Préparation des solutions de travail
Réactif
Protéinase K
(flacon 3, bouchon rose)
Tampon d'élimination
inhibiteur
(flacon 4a, bouchon noir)
Tampon de lavage
(flacon 4, bouchon bleu)
Reconstitution/Préparation des solutions de travail
Dissoudre le réactif Proteinase K dans 4,5 mL d’eau bidistillée, en solution aliquote.
Ajouter 20 mL d’éthanol au tampon d’élimination inhibiteur.
Remarque : marquer et dater le flacon après avoir ajouté
l’éthanol.
Ajouter 80 mL d’éthanol au tampon de lavage.
Remarque : marquer et dater le flacon après avoir ajouté
l’éthanol.
Conservation et stabilité des solutions de travail
Conserver entre -15 °C et -25 °C. Stable pendant
12 mois
Conserver entre +15 °C et +25 °C. Stable jusqu’à la
date de péremption figurant sur l’étiquette du kit.
Conserver entre +15 °C et +25 °C. Stable jusqu’à la
date de péremption figurant sur l’étiquette du kit.
Procédure de purification
Remarque : veiller à suivre scrupuleusement la procédure décrite ci-dessous et non celle figurant dans la notice du kit High Pure PCR Template
Preparation.
1. Aliquoter 200 µL de tampon d’élution par échantillon dans un tube à essai stérile de 1,5 mL, fermer le tube puis le préchauffer à +70 °C.
2. Ajouter les éléments suivants à 200 µL de sang périphérique total humain en suspension anticoagulé à l’EDTA ou au citrate :
• 200 µL de tampon de liaison (bouchon vert)
• 40 µL de solution de protéinase K (reconstituée)
• Passer immédiatement le mélange au vortex et l’incuber à +70 °C pendant 10 minutes.
3. Ajouter 100 µL d’isopropanol et bien mélanger au vortex.
4. Pipeter le mélange dans le réservoir supérieur de l’assemblage tube de filtration High Pure – tube de recueil.
5. Centrifuger pendant 1 minute à 6000 × g dans une centrifugeuse de paillasse standard.
6. Éliminer la solution filtrée et le tube de recueil.
7. Associer le tube de filtration à un nouveau tube de recueil.
8. Ajouter 500 µL de tampon d’élimination inhibiteur (bouchon noir) au réservoir supérieur.
9. Centrifuger pendant 1 minute à 6000 × g.
10. Éliminer la solution filtrée et le tube de recueil.
11. Associer le tube de filtration à un nouveau tube de recueil.
12. Ajouter 500 µL de tampon de lavage (bouchon bleu) au réservoir supérieur.
13. Centrifuger pendant 1 minute à 6000 × g.
14. Éliminer la solution filtrée et le tube de recueil.
15. Associer le tube de filtration à un nouveau tube de recueil.
16. Ajouter 500 µL de tampon de lavage (bouchon bleu) au réservoir supérieur.
17. Centrifuger pendant 1 minute à 6000 × g.
18. Éliminer la solution filtrée.
19. Associer le tube de filtration au même tube de recueil.
20. Centrifuger pendant 10 secondes à vitesse maximum (13 000 × g ou plus) pour éliminer le tampon de lavage résiduel.
21. Éliminer le tube de recueil.
22. Insérer le tube de filtration dans un tube à essai propre de 1,5 mL.
23. Ajouter les 200 µL de tampon d’élution préchauffé (à +70 °C) dans le tube de filtration.
24. Centrifuger pendant 1 minute à 6000 × g.
Le tube microfuge contient l’ADN élué.
6
B.
PRÉPARATION DU MÉLANGE PRINCIPAL
1. Décongeler les composants du kit Factor II (Prothrombin) G20210A, mélanger délicatement et conserver sur de la glace.
2. Placer un tube capillaire LightCycler® par échantillon d’ADN et un tube pour chaque contrôle dans les adaptateurs de centrifugeuse
LightCycler® préalablement refroidis.
3. Préparer le mélange principal en multipliant le volume figurant dans la colonne « Volume/réaction » par le nombre de réactions à
effectuer (c.-à-d. les ADN d’échantillon, les contrôles négatif et positif), plus une réaction supplémentaire.
Procéder comme suit pour une réaction standard de 20 µL.
Étape
Action
1
Ajouter les composants suivants dans un tube à essai de 1,5 mL, placé sur de la glace, en respectant l’ordre indiqué ci-dessous :
Réactifs–solutions de travail
Volume / réaction
FIIG20210A DIL, flacon 4
11 µL
FIIG20210A MD Mix, flacon 1
2 µL
FIIG20210A R Mix, flacon 2
2 µL
Volume total
15 µL
2
• Mélanger doucement.
• Pipeter 15 µL de mélange principal dans chaque tube capillaire LightCycler® préalablement refroidi.
• Vérifier l’exactitude de la liste d’échantillons (chapitre 1, A7, impression) avec la cartouche d’échantillons correspondante en comparant
les numéros de codes à barres (en option).
• Ajouter 5 µL d’ADN d’échantillon isolé ou 5 µL de réactif FIIG20210A CT (flacon 3, bouchon violet) comme contrôle positif ou 5 µL de
réactif FIIG20210A DIL (flacon 4, bouchon incolore) comme contrôle négatif.
3
Fermer hermétiquement chaque tube capillaire avec un bouchon en utilisant le dispositif de pose de bouchon LC Capping Tool (n° de réf.
03 357 317 001).
Étape
Action
4
En cas d’utilisation de la centrifugeuse de carrousel LC, passer à l’étape 5.
En cas d’utilisation d’une centrifugeuse de paillasse équivalente (tel que le modèle Biofuge 13 de Heraeus Instruments ou Kendro
Laboratory Products), placer chaque tube capillaire dans l’adaptateur de centrifugeuse LightCycler® correspondant et procéder aux étapes
suivantes :
• Placer les adaptateurs dans la centrifugeuse de paillasse
• Centrifuger à 735 × g pendant 30 secondes au max.
• Passer à l’étape 5.
5
Placer le tube capillaire contenant le contrôle négatif en position 1 et le tube capillaire contenant le contrôle positif en position 2 dans le
carrousel LightCycler®.
6
En commençant par la position 3, placer les tubes capillaires contenant l’ADN d’échantillon dans le carrousel LightCycler®.
7
Transférer le rotor, y compris le carrousel LightCycler®, vers la centrifugeuse de carrousel LC 2.0 ou la centrifugeuse de carrousel LC équipé
du kit rotor de centrifugeuse de carrousel LC 2.0.
8
Appuyer sur Start pour lancer le cycle de la centrifugeuse de carrousel LC.
9
Après centrifugation, transférer le carrousel LightCycler® sur l’instrument LightCycler® 2.0.
C.
AMPLIFICATION ET DÉTECTION
Instrument LightCycler® 2.0
Remarque : Avant de lancer la macro, se connecter à la base de données Exor (DB) avec une piste de contrôle. Si vous êtes connecté à la
base de données Exor DB avec une piste de contrôle, le mot « Traceable » s’affiche dans la barre d’état. Pour en savoir davantage sur le
mode de connexion au logiciel, consulter le manuel d’utilisation de l’instrument LightCycler® 2.0, version logicielle 4.05 ou 4.1 pour
diagnostic in vitro.
1. Placer le carrousel dans l’instrument LightCycler® 2.0.
2. Assurez-vous que la macro kit Factor II (Prothrombin) G20210A (n° de réf. 04 586 930 001) est installée. Vous n'avez besoin d'installer
cette macro qu'une seule fois : lors de l'exécution du test pour la première fois
3. Lancez la macro en appuyant sur le bouton Roche et en saisissant le n° de réf. du kit, soit manuellement, soit en scannant le code à
barres. Voyez au dos de cette notice les informations spécifiques correctes du code à barres du kit.
Remarque : « Perform self test » peut ne pas être actif.
4. L’assistant du kit va vous guider à travers toute la procédure.
5. Saisir le numéro de l’échantillon dans la section décompte d’échantillons et le nom des échantillons dans l’écran Capillary View,
conformément au schéma de chargement réel des échantillons. Saisissez le numéro du lot du kit dans le champ adéquat sur l'écran
Capillary View.
6. Cliquez sur le bouton « Start Run » dans l’assistant du kit.
7. Une fois le cycle terminé, l’instrument LightCycler® 2.0 détermine et affiche automatiquement le génotype en réalisant une analyse de la
courbe de fusion.
Remarque : le signal de fluorescence est mesuré dans le canal de 640 nm.
CALIBRATION DE L’INSTRUMENT
Aucune calibration n’est requise.
7
CONTRÔLE QUALITÉ
Les contrôles négatifs et positifs doivent être inclus dans chaque cycle PCR.
Contrôle négatif :
Le résultat de l’analyse pour le contrôle négatif FIIG20210A doit toujours être « négatif ». Si ce n’est pas le cas, tout le cycle est alors signalé comme
non valide. L’ensemble de la procédure (préparation des échantillons, amplification et détection) doit être répétée. Si le contrôle négatif donne
régulièrement un résultat non négatif, contacter votre représentant local Roche pour obtenir une assistance technique.
Contrôle positif :
Le résultat de l’analyse pour le FIIG20210A CT doit toujours être du génotype « het ».
Si cette consigne n'est pas respectée, tout le cycle sera invalide et la PCR devra être répétée.
Si le contrôle positif échoue régulièrement pour le génotype hétérozygote, contacter votre représentant local Roche pour obtenir une assistance
technique.
Résultat de l’échantillon :
Le résultat de l’analyse de l’ADN d’échantillon doit toujours afficher un profil de courbe de fusion pour le génotype homozygote sauvage, homozygote
mutant ou hétérozygote. Dans le cas contraire, le résultat pour l’échantillon n’est pas valable et toute la procédure (préparation des échantillons,
amplification et détection) doit être répétée.
LIMITES ET INTERFÉRENCES
Le réactif FIIG20210A MD Mix (flacon 1, bouchon jaune) est propre à la séquence pour le gène du facteur II humain. Une concentration élevée en
héparine est susceptible d’interférer avec la réaction en chaîne par polymérase. Les autres interférences possibles ne sont pas connues.
La macro Factor II (Prothrombin) G20210A (n° réf. 04 586 930 001) est conçue pour détecter la mutation G20210A du gène humain Factor II. Dans
certaines circonstances, la présence de mutations et de polymorphismes peut générer des courbes de fusion différentes du type sauvage,
hétérozygote G202210A ou mutant G202210A. Un examen subjectif de la courbe de fusion est vivement recommandé.
VALEURS ATTENDUES / INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
1. Assurez-vous de la validité des résultats du contrôle pour le cycle. Si le cycle est non valide, recommencer tout le cycle (préparation des
échantillons, amplification et détection).
2. Pour un cycle valide, les résultats de l’échantillon s’affichent comme suit par le module d’analyse de définition de génotype du logiciel
LightCycler® :
het
mut
unknown
negative
Interprétation
génotype homozygote sauvage : l’échantillon est négatif pour la mutation Factor II (Prothrombin) G20210A (c’est-à-dire
qu’aucun alléle mutant n’est présent)
génotype hétérozygote : l’échantillon porte les deux allèles, l’un de type sauvant et l’autre mutant (Factor II (Prothrombin)
G20210A)
génotype homozygote mutant : l’échantillon est positif pour la mutation Factor II (Prothrombin) G20210A (c’est-à-dire que
deux allèles mutants sont présents)
• Le génotype ne peut être regroupé dans les normes de fusion prédéfinies.
• Recommencer la procédure d’analyse incluant la préparation des échantillons, l’amplification et la détection.
Si le résultat est de nouveau « unknown » (inconnu), contactez votre représentant Roche local pour obtenir une
assistance technique.
l’échantillon répond aux critères du logiciel pour un contrôle négatif
DONNÉES DE PERFORMANCE SPÉCIFIQUES
Spécificité analytique
L’utilisation d’oligonucléotides de synthèse comme amorces et sondes H,
montre que le logiciel LightCycler® 4.05 ou 4.1 (définition de génotype) identifie clairement
la mutation Factor II (Prothrombin) G20210A.
En appliquant une analyse séquentielle, il est apparu que les oligonucléotides de synthèse
sélectionnés utilisés comme amorces amplifient spécifiquement un fragment de 165 bp du
gène du facteur II contenant la séquence Factor II (Prothrombin) G20210A.
Sensibilité analytique
L’ADN humain purifié hétérozygote pour la mutation G20210A du facteur II (Prothrombine)
a été dilué au cours de quatre étapes de dilution en série. Chaque dilution a été analysée
six fois et une interprétation statistique des résultats a été effectuée. Un niveau de
détection minimum de 198 copies par réaction a été calculé pour le kit Factor II
(Prothrombin) G20210A.
8
0,7
0,6
–(d/dT) Fluorescence (640)
Résultat affiché
wt
hétérozygote
type sauvage (homozygote)
mutant (homozygote)
FI IG20210A DI L
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
40
45
50
55
Température [°C]
60
65
Sensibilité et spécificité diagnostiques
Lors d’une étude prospective portant sur des échantillons d’ADN humain fraîchement recueillis ou conservés, 522 échantillons provenant de patients
de type caucasien chez lesquels il existait une suspicion de thrombophilie ont été analysés à l’aide du kit Factor II (Prothrombin) G20210A et d’une
analyse séquentielle mono brin ou double brin effectuée sur un système MegaBACE 500 Sequencing System à l’aide du logiciel Cimarron Base Caller
SW 3.12. Les deux panels représentent la totalité des échantillons de routine de patients hospitalisés susceptibles d’être atteints de thrombophilie,
provenant d’un seul laboratoire hospitalier universitaire et recueillis sur une période définie. Le coefficient de corrélation entre le kit Factor II
(Prothrombin) G20210A et l’analyse séquentielle était de 98,9 % (516/522). Les données détaillées figurent dans le tableau ci-dessous.
Analyse
séquentielle
Tableau 1 : Kit Factor II (Prothrombin) G20210A versus Analyse séquentielle
Kit Factor II (Prothrombin) G20210A
sauvage (wt)
hétérozygote (het)
mutant (mut)
wt
476
0
–
het
–
40
–
mut
–
–
–
inconnu
5
1
–
Remarque : 41,0 % des échantillons d’ADN humain ont été recueillis auprès de patients présentant une suspicion d’accident thromboembolique
veineux conformément aux déclarations de consensus de l’American College of Medical Genetics (ACMG) ou du College of American Pathologists
(CAP), ou des deux (2,4), 38,0 % des échantillons de patients présentant des troubles artériels d’origine thrombotique (attaque par ex.), 18,0 % des
échantillons de patients adressés pour d’autres raisons mais avec une suspicion de thrombophilie et 3,0 % des échantillons de patients hospitalisés
pour une raison non précisée. Les génotypes de six échantillons n’ont pas pu être obtenus avec le kit Factor II (Prothrombin) G20210A.
9
NOTICE RÉSERVÉE À L’ACHETEUR
L’acquisition de ce produit autorise l’acheteur à l’utiliser pour l’amplification et la détection des séquences d’acides nucléiques pour le diagnostic in
vitro chez l’homme. Aucun brevet général ni aucune licence, de quelque type que ce soit, autre que le droit spécifique d’utilisation lié à cet achat,
n’est octroyé(e) par la présente.
RÉFÉRENCES
1 Ridker, PM, et al. (1997) Ethnic Distribution of Factor V Leiden in 4047 Men and Women: Implications for Venous Thromboembolism screening.
JAMA, 277, 1305-1307.
2 Ridker, PM, et al. (2001) American College of Medical Genetics Consensus Statement on Factor V Leiden Mutation Testing. Genetics in
Medicine, 3, Vol.2,139-148.
3 Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. NCCLS document EP5-A (ISBN 1-56238-368-X). NCCLS
940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pa 19087-1898, USA (1999).
4 Ridker, PM, et al. (2003) Clinical Utility of Factor V Leiden (R506Q) Testing for the Diagnosis and Management of Thromboembolic Disorders.
CAP Consensus Conference XXXVI: Diagnostic Issues in Thrombophilia.
©2012 Roche Molecular Systems, Inc.
La technologie employée pour l'instrument LightCycler® est brevetée par Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, États-Unis.
ROCHE, LIGHTCYCLER, HYBPROBE, MAGNA PURE, LC et HIGH PURE sont des marques commerciales de Roche.
Biofuge est une marque commerciale de Heraeus Instruments GmbH.
Brij est une marque commerciale déposée de ICI Americas, Inc., PA, États-Unis.
MegaBACE est une marque commerciale déposée de GE Healthcare Bio-Sciences Corp.
Cimarron est une marque commerciale de Cimarron Software, Inc., Salt Lake City, UT, États-Unis.
Les colorants de cyanine contenus dans ce produit sont soumis aux droits de brevets de GE Healthcare Bio-Sciences Corp. et de l'université
Carnegie Mellon et sont concédés sous licence à Roche uniquement dans le but d'être incorporés à des composants de recherche et kits de
diagnostic in vitro. Toute utilisation de ces kits dans un but autre que la recherche ou le diagnostic in vitro requiert la concession de sous-licences
par GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey, États-Unis et par l'université Carnegie Mellon, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis.
Fabriqué en Allemagne
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Allemagne
Pour les États-Unis :
Distribution aux États-Unis : Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, États-Unis
Assistance technique client États-Unis : 1-800-526-1247
09/2012
Doc Rev. 7.0
04536037001-07
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