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C Frere PTT et ADAMS 13
PTT & ADAMTS 13 Dr Corinne FRERE Laboratoire d’Hématologie, CHU Timone UMR 626, Université Aix-Marseille 2 Introduction Microangiopathies thrombotiques (MAT) Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT) Syndrome Hémolytique et Urémique (SHU) MAT : SYMMERS ; Thrombotic microangiopathic haemolytic anemia ; Br Med J 1952 SHU : GASSER ; Hamolytytish-uramische syndromes bilaterale nierenrindennekrosen bei akuten erworbenchen hamolytischen anamien ; 1955 PTT : MOSCHOWITZ ; Acute febrile pleichromic anemia with hyaline thrombosis of a terminal arterioles and capillaries : An undescribed disease ; 1925 Microangiopathies thrombotiques •Anémie hémolytique mécanique (Hb < 12 g/dL) •Thrombopénie périphérique (< 150 x 109/L) •Défaillance d’organe de sévérité variable PTT •Héréditaire •Acquis SHU •Héréditaire •Acquis Autres entités •SAPL •TIH 2 •HELLP Mécanisme de la microangiopathie HELIU ENDOT M Multimères de vWF Hémolyse Anémie Schizocytes Thrombus hyalin Thrombopénie Mécanisme de la microangiopathie Signes clinico-biologiques des MAT • Début brutal • Fièvre • Signes neurologiques +/- (céphalées, troubles de la conscience, dysarthrie, déficit sensitivo-moteur, convulsions…) • Insuffisance rénale +/• Signes hématologiques : thrombopénie périphérique hémolyse intravasculaire mécanique anémie schizocytes +++ LDH augmentés PTT/SHU-MAT SHU PTT Atteinte neuro +++ Atteinte rénale +++ Atteinte rénale Fièvre Anémie Hémolytique Thrombopénie Microthrombi Plasmathérapie +++ Atteinte neuro Fièvre Anémie Hémolytique Thrombopénie Microthrombi Plasmathérapie+++ PTT et SHU : même entité à expression clinique variable ? Symmers, 1952; Remuzzi, 1987 Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT) PTT Entité hétérogène Formes « idiopathiques » Sporadiques Héréditaires Intermittentes Infections : facteurs déclenchants Pathologies associées •Infections VIH •Greffes •Cancer •Maladies autoimmunes •Médicaments – cyclosporine A – antiagrégants – quinine.. PTT : Données épidémiologiques Sexe (Femmes/Hommes)a,c ≈3/2 Âge (décennie)a 35-45 Incidence annuelle ≈4.5 par million par an a Rock et al, New Eng J Med 1991; 325: 393-397 et al, Semin Hematol 2004; 41: 60-67 c Terrell et al, J Thromb Haemost 2005; 3: 1432-1436 b George PTT : Diagnostic • Femme jeune (< 35 ans) • Début brutal • Fièvre • Signes neurologiques à l’emporte-pièce ++ (céphalées, troubles de la conscience, dysarthie, déficit sensitivo-moteur, convulsions…) • Insuffisance rénale modérée • Thrombopénie périphérique sévère < 30 giga/l • Anémie profonde, hémolyse marquée, schizocytose PTT : Clinique 19251964a 19641980b 19821989c % % % Fièvre 98 59 24 Atteinte neurologique 92 84 63 Insuffisance rénale 88 76 59 Signes cliniques a Amorosi & Ultmann, 1966 (271 patients) & Bell, 1981 (258 patients) c Rock et al, 1991 (102 patients) b Ridolfi PTT : Biologie Signes biologiques Moyenne ± SD Plaquettes (x 109/L) Hémoglobine (g/dL) Créatinine (µM) LDH (U/L) TQ (sec) TCAT (sec) 22 ± 13 8.8 ± 1.9 124 ± 103 1400 ± 900 11.6 ± 1.1 30.3 ± 10.3 Valeurs Normales 150-400 12-17.5 40-110 100-225 10.5-12.5 20-35 Rock et al, New Eng J Med 1991; 325: 393-397 PTT : historique 1924 : 1er cas décrit par Moschowitz chez une jeune fille de 16 ans PTT : description initiale E. Moschcowitz, 1924 • Jeune fille de 16 ans • Tableau clinique : Fièvre, troubles neurologiques • Tableau biologique : Anémie, insuffisance rénal • Complications : Défaillance cardiaque • Issue fatale en deux semaines • Autopsie : thrombi avec dépots hyalins au niveau des artérioles et des capillaires de la majorité des organes PTT : historique 1924 : 1er cas décrit par Moschowitz chez une jeune fille de 16 ans 1936 : 4 cas similaires décrits par Baehr. Rôle de l ’aggrégation des plaquettes dans la pathogénie de la maladie 1947 : Singer introduit le terme de PTT 1982: Moake met en avant le rôle des multimères du vWF Rôle des THPM de FvW ? Sporadic TTP Relapse Remission Chronic TTP Normal Plasma “Ultralarge” Multimers 10,000 kDa 500 kDa Failure to cleave ultralarge VWF causes TTP? Moake et al, N Engl J Med 1982; 307: 1432-1435 Rôle des THPM de FvW ? HELIU ENDOT M al m r o N FvW de BPM P TT FvW de THPM ? Hyperagrégabilité plaquettaire Moake et al, N Engl J Med 1982; 307: 1432-1435 PTT : historique 1924 : 1er cas décrit par Moschowitz chez une jeune fille de 16 ans 1936 : 4 cas similaires décrits par Baehr. Rôle de l ’aggrégation des plaquettes dans la pathogénie de la maladie 1947 : Singer introduit le terme de PTT 1982: Moake met en avant le rôle des multimères du vWF 1996 : Furlan, rôle de la métalloprotéase clivant le vWF Rôle de la protéase du FvW FvW Protéase du FvW Protéase du FvW FvW de THPM Sujet normal Sujet PTT Furlan et al, N Engl J Med 1998 PTT : historique 1924 : 1er cas décrit par Moschowitz chez une jeune fille de 16 ans 1936 : 4 cas similaires décrits par Baehr. Rôle de l ’aggrégation des plaquettes dans la pathogénie de la maladie 1947 : Singer introduit le terme de PTT 1982: Moake met en avant le rôle des multimères du vWF 1996 : Furlan, rôle de la métalloprotéase clivant le vWF 1998 : Furlan et Tsaï découvrent que tous les patients atteints d ’un PTT ont un déficit sévère en protéase (NEJM, 1998) PTT & protéase du FvW Le PTT est associé à un déficit sévère en protéase du FvW 20 cas: déficit sévère 24 cas non familiaux (20/24: inhibiteur IgG) 4 cas: déficit modéré 30 PTT 6 cas familiaux 6 cas: déficit sans inhibiteur 13 cas non familiaux 11 cas: activité normale 2 cas: déficit 10 cas familiaux 10 cas: activité normale 53 cas de MAT 23 SHU Furlan et al., N Engl J Med 1998 - Tsaï et al., N Engl J Med 1998 - Veyradier et al., Blood 2001 PTT : historique 1924 : 1er cas décrit par Moschowitz chez une jeune fille de 16 ans 1936 : 4 cas similaires décrits par Baehr. Rôle de l ’aggrégation des plaquettes dans la pathogénie de la maladie 1947 : Singer introduit le terme de PTT 1982: Moake met en avant le rôle des multimères du vWF 1996 : Furlan, rôle de la métalloprotéase clivant le vWF 1998 : Furlan et Tsaï découvrent que tous les patients atteints d ’un PTT ont un déficit sévère en protéase (NEJM, 1998) 2001 : Zheng, ADAMTS 13 pour A Desintégrin And Metalloprotease with ThromboSpondin I motif (J Biol Chem, 2001) Caractéristiques de la protéase du FvW • Purification par chromatographie (à partir de plasma humain et de concentrés de FVIII/FvW) • Glycoprotéine monocaténaire de 150/190 kDa (1427 aa) • Métalloprotéase, famille des ADAMTS : ADAMTS 13 • Gene: chromosome 9q34 / cDNA 4,6 kb (Epissage alternatif : au moins 7 variants) • Synthèse hépatique sous forme de proenzyme, activation intracellulaire (furine ?) • Clivage par la plasmine et la thrombine Zheng et al, J Biol Chem 2001 Fujikawa et al, Blood 2001 Gerritsen et al, Blood 2001 Levy et al, Nature 2001 VWF Cleaving Protease (ADAMTS13) Metalloprotease SP M D 1 Thrombospondin 1 Cys Spacer 2 3 4 5 6 7 8 CUB CUB Disintegrin A Disintegrin-like And Metalloprotease with ThromboSpondin-1 repeats Zheng et al, J Biol Chem 2001 Shear and VWF Proteolysis Tyr1605 – Met1606 A1 NH2 -ss140 kDa A2 A3 -ss176 kDa Proteolysis increased by: • Shear stress (aortic stenosis) • VWD type 2A mutations • Denaturants (urea, guanidine) COOH VWF, ADAMTS13 and Platelet Adhesion With ADAMTS13 Without ADAMTS13 Normal VWF Multimers Normal Hemostasis Ultralarge VWF Multimers Microvascular Thrombosis (TTP) Classification 1 Microangiopathies thrombotiques (MAT) ADAMTS 13 effondrée PTT ADAMTS 13 détectable SHU •Classique (idiopathique) post-diarrhéique •Atypique •Secondaire (VIH, lupus, médicament..) Apparentés HELLP, HTA maligne, SAPL, TIH Classification 2 PTT avec ADAMTS 13 effondrée HEREDITAIRE AUTOIMMUNE (Upshaw-Schulman) auto-anticorps mutation du gène anti-Adamts 13 SECONDAIRE Inhibiteurs induits par : •médicament (ticlid) •Infections •Grossesse •Maladies autoimmunes Classification 2 PTT avec ADAMTS 13 effondrée HEREDITAIRE AUTOIMMUNE (Upshaw-Schulman) auto-anticorps mutation du gène anti-Adamts 13 SECONDAIRE Inhibiteurs induits par : •médicament (ticlid) •Infections •Grossesse •Maladies autoimmunes PTT Héréditaires 5 12 3 4 6 Exons SP H96D 7 8 M T196I R102C 10 9 11 D 1 13 15 18 20 12 14 16 17 19 21 Cys Spacer R528G R398H 22 23 2 3 4 5 6 7 8 R692C C951G Splice Frameshift Site 25 27 24 26 28 29 CUB CUB C1213Y C1024G Frameshift 7 familles, 12 mutations 70 mutations Levy et al, Nature 2001; 413: 488-494 Classification 2 PTT avec ADAMTS 13 effondrée HEREDITAIRE AUTOIMMUNE (Upshaw-Schulman) auto-anticorps mutation du gène anti-Adamts 13 SECONDAIRE •Inhibiteurs induits •par médicament (ticlid) •Infections •Grossesse •Maladies autoimmunes PTT Autoimmun SP M D 1 Cys Spacer 2 3 4 5 6 7 8 CUB CUB • Les anticorps anti-ADAMTS 13 sont dirigées contre des domaines riches en CYS et Spacer • Mis en évidence par un test ELISA, puis par test fonctionnel d’inhibition • Mécanisme : – inhibition de l’activité enzymatique – autres : opsonisation ? catalyse ? Zheng et al, J Biol Chem 2001 Classification 2 PTT avec ADAMTS 13 effondrée HEREDITAIRE AUTOIMMUNE (Upshaw-Schulman) auto-anticorps mutation du gène anti-Adamts 13 SECONDAIRE •Inhibiteurs induits •par médicament (ticlid) •Infections •Grossesse •Maladies autoimmunes PTT secondaire Contexte Nouveau-né Enfant Diabète sucré Hépatite virale aiguë Hépatite virale chronique Béta-thalassémie majeure Varicelle Syndrome néphrotique Fièvre méditerranéenne familiale ADAMTS 13 50,5 ± 16,1 % 83,3 ± 16,3 % N 40,2 ± 27 % N N N N N N Kavakli et al., Pediatr Hematol Oncol 2002 PTT & ADAMTS 13 Déficit sévère en ADAMTS13 = Haute valeur prédictive positive pour le diagnostic de PTT Kavakli et al., Pediatr Hematol Oncol 2002 Dosage de l’activité ADAMTS 13 • Mesure de l’activité ADAMTS-13 : • Méthodes directes : mesure des produits de clivage du VWF • Méthodes indirectes : mesure du VWF résiduel • Techniques : • Electrophorèse sur gel, ELISA, FRET, Chambre de flux • Conditions Statiques ou non-statiques • Statiques • Non-statiques (conditions de flux, forces de cisaillement) Substrats utilisés • VWF : • Purifié, (Furlan, 1997), (Tsai, 1998), (Gerritsen, 1999) •Hautement purifié à partir de concentrés de FvW (Böhm, 2002) • Recombinant [rVWF] (Obert, 1999) & (Shenkman, 2006) • Protéines de Fusion : • rVWF-A2 domain with N-terminal 6xHis-tag (Cruz, 2003) • rVWF-A2 domain tagged with N-terminal 6xHis and C-terminal Tag-100 (Whitelock, 2004) • Recombinant 73 amino acid fragment of VWF-A2 domain [rVWF73] tagged with N-terminal GST and C-terminal 6xHis (Zhou, 2004), (Kokame, 2004) • Fluorogenic peptide, FRETS-VWF73, in which Q1599 is replaced with emitter A2pr Nma and N1610 is replaced with quencher A2pr Dnp (Kokame, 2005) Conclusions: Comparative analysis showed that functional assays employing modified von Willebrand factor peptides as substrate for ADAMTS-13 offer the best performance characteristics. New assays for ADAMTS-13 have the potential to make the investigation/management of patients with thrombotic microangiopathies much easier than in the past. Kit TEchnozyme ADAMTS 13 INH technoclone ImMUBIND® ADAMTS13 Autoantibody ELISA american diagnostc inc Kits commercialisés • FRET methodologies • American Diagnostica: Actifluor ADAMTS13™ (RUO) •FRET assay using a recombinant VWF86 peptidyl substrate (Q1599C/P1611C) in which the 2 substituted cysteine residues are coupled to Alexa488 flurochromes (Zhang, et al) • Kinetic reading for 10 minutes • GTI: ATS-13™ (RUO) • Peptidyl substrate is FRETS-VWF73 (Kokame, et al) • Non-kinetic reading after 30 minutes Principe du FRET Le peptide de synthèse contient : - Un fluorophore qui émet une fluorescence à 440-450 nm après excitation à 340-350 nm. - Un quencher (« extincteur ») qui éteint la fluorescence du fluorophore lorsque les 2 molécules sont liées. Principe du FRET La protéase ADAMTS-13 va cliver le peptide de synthèse libérant ainsi les 2 molécules Principe du FRET Une fois clivée, le fluorophore ne subira plus l’effet du quencher. La fluorescence détectée à 440-450 nm sera donc directement proportionnelle à l’activité de la protéase ADAMTS-13 Principe du FRET Recherche des anticorps anti ADAMTS 13 • Méthodes ELISA • Kits commercialisés : •TECHNOZYME ® ADAMTS 13 INH, Technoclone •IMMUBIND ® ADAMTS13 Autoantibody ELISA American Diagnostic inc Traitement de la poussée • Transfusion de plasma en grande quantité (> 40 ml/kg) • Le traitement de référence : échange plasmatique (Rock, NEJM 1991) effet transfusion : compensation du déficit en ADAMTS 13 effet soustraction : élimination des multimères FvW et des auto-anticorps Protocole empirique: grand volume : 60 ml/kg voire plus (1,5 masse plasmatique) quotidien, jusqu’ à normalisation des plaquettes puis espacement progressif Echanges plasmatiques EP Effet transfusion plasma Effet soustraction Diminution des multimères de FvW Diminution de l ’autoanticorps ADAMTS 13 Immunosuppresseurs Traitements associés • Antiagrégants plaquettaires dés que les plaquettes > 50 giga/l • Corticothérapie 1 mg/kg discutée • Transfusion de globules rouges : à éviter tant que le processus microangiopathique n ’est pas maîtrisé • A éviter Transfusion de plaquettes contre-indiquée +++ IgIV ? Traitements des formes résistantes • Définition : thrombopénie et anémie • persistantes après 5 à 7 jours (« résistance primaire ») • ou rechutant après 14 jours (« résistance secondaire ») d ’échanges quotidiens et de grand volume • Associer alors traitement immunosuppresseur : • ONCOVIN 1 à 2 mg en IVD hebdomadaire • Rituximab ++ • cyclophosphamide (ENDOXAN) ? • Echec persistant : discuter splénectomie ? Evolution • Avant les échanges plasmatiques : défavorable dans 90 % des cas. • Actuellement : 80 % de survie Le problème : les rechutes (30 % à 60% des cas) favorisées par grossesse, chirurgie, infection, médicaments Traitées par échanges plamatiques, de façon identique à l ’épisode initial Prévention des rechutes : corticoïdes au long court rituximab ++ splénectomie ?
