1 Il est possible de connaitre la structure d`une protéine par analyse

Il est possible de connaitre la structure d’une protéine par analyse cristallographique (diffraction des
rayons X). Mais pour cela une étape préalable est indispensable : la cristallogenèse.
Cette technique consiste à faire des cristaux de protéine à partir de protéine soluble. A la différence
des cristaux plus communs comme le sel où l’arrangement cristallin se fait au niveau atomique, le
cristal de protéine est un arrangement d’ordre moléculaire. L’empilement, ordonné de façon
périodique et régulier dans les trois directions de l’espace, des protéines donne naissance au cristal.
Schémas de cristal de sel NaCl qui est un arrangement des
atomes de sodium et de calcium.
Schémas d’un cristal de protéine, l’arrangement n’est plus
d’ordre atomique mais moléculaire.
Pour obtenir des cristaux de protéine, nous devons trouver les conditions physico-chimiques qui font
passer la protéine de l’état soluble à un état solide cristallin, sans faire précipiter (le cristal se
différencie d’un précipité par son caractère ordonné). Pour cela, nous cherchons la zone de sur
saturation pour différents agents chimiques et physiques.
Diagramme de phase
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Pour faire de la cristallogenèse, nous travaillons avec des conditions très exigeantes :
-La protéine doit être PURE et EXTREMEMENT CONCENTREE (10mg/mL)
- nous travaillons avec une GAMME DE PH RESTREINTE : 4.5<pH<9.5
- nous travaillons à des TEMPERATURES COMPRISES ENTRE 4 ET 37°C
LE PRINCIPE DE LA CRISTALLOGENESE DE PROTEINE
La diffusion en phase vapeur est la technique la plus employée au laboratoire. Elle consiste à mettre
en contact une goutte de mélange de « protéine - solution de cristallisation » avec un volume de
solution de cristallisation dans un environnement hermétique.
La concentration en solution de cristallisation
de la goutte est inférieure à celle du réservoir,
naturellement la concentration de chacune
des deux solutions va tendre à s’équilibrer
leurs concentrations par échange gazeux. Cet
échange va engendrer une dynamique dans la
goutte contenant la protéine et provoquer un
réagencement des molécules qui la compose.
Avec du temps et les bonnes conditions de
cristallisations, nous obtiendrons des cristaux
de protéine.
La goutte est limpide, les composants
sont complètements dissous et le
mélange est homogène.
La dynamique engendre un
agencement des molécules entre elles,
la goutte se trouble.
Les protéines s’associent de manière
ordonnée en trois dimensions, le
cristal est apparu.
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LES DIFFERENTES ETAPES DE CRISTALLOGENESE
1- RECHERCHE DES CONDITIONS DE CRISTALLISATION
Au laboratoire, pour trouver des conditions de
cristallisation, nous testons un maximum de
conditions au hasard à l’aide d’un robot nanogouttes Cartesien. Ce robot permet à l’aide de
kits commerciaux de tester un maximum de
conditions de cristallisation en goutte assise
(96 par criblage) tout en consommant un
minimum de protéine (60µL par criblage). En
général nous testons deux types de criblage
soit 192 conditions.
Une fois les criblages réalisés, nous attendons une nuit et nous observons les gouttes afin de relever
les conditions de cristallisations.
Que peut-on observer dans les gouttes ?
Autre que des cristaux :
Goutte limpide
Précipité léger
Fort précipité
Goutte gel
Peau de précipitant
Peau de précipitant
Des éléments trompeurs :
Poussière
Fragment de verre
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Des éléments intéressants :
Goutte sphérolite
Goutte sphérolite
Goutte de déphasage
Première pistes :
Cristaux en cheveux ou
oursin
Cristaux en aiguilles
Plaquette
Cubique
Plaquette
Aiguille
Oursin
Carré
Plaquette
Plaquette maclées
Des cristaux:
Perle
Ballon de rugby
2- REPRODUCTION DES CONDITIONS DE CRISTALLISATION
Quand nous obtenons quelques cristaux, nous relevons les conditions en nous référant aux données
du kit. Nous les reproduisons en faisant légèrement varier un ou deux facteurs.
Par exemple : nous avons des cristaux dans la condition A1 du criblage JCSG+ :0.2M Lithium sulfate /
0.1M Sodium acétate pH 4.5 / 50% PEG 400, nous allons reproduire les conditions 0.1-0.2M Lithium
sulfate / 0.1M Sodium acétate pH 4.5 / 40-45-50-55% PEG 400.
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Quand nous obtenons de nombreux cristaux, nous relevons les conditions en nous référant aux
données du kit. Nous cherchons une tendance (pH commun ou proche, même type de précipitant,
même additif…). Nous mutualisons les conditions et les reproduisons en faisant légèrement varier un
ou deux facteurs comme ci-dessus.
2- OPTIMISATION DES CRISTAUX
Une fois les cristaux reproduits, nous allons optimiser les conditions d’obtention afin d’obtenir des
cristaux isolés, de bonne taille.
Pour cela nous faisons varier finement les conditions de cristallisation qui ont été reproduites. Nous
procédons par des cribles en deux dimensions ce qui nous permet d’observer des tendances.
Par exemple : nous avons reproduit les cristaux dans la condition A1 du criblage JCSG+. Les plus
intéressants sont en présence de 0.1M Lithium sulfate / 0.1M Sodium acétate pH 4.5 / 40% PEG 400.
Nous allons faire varier finement le lithium sulfate et le PEG 400.
Nous pouvons faire varier les conditions chimiques en ajoutant des additifs chimiques pour jouer sur
la viscosité du milieu (glycérol, MPD, isopropanol).
Nous pouvons aussi faire varier les conditions physiques en faisant varier la température (4 ; 12 ; 18
ou 20°C), la taille de la goutte, le volume du puits.
Pour finir nous pouvons jouer sur la vitesse de diffusion, en réalisant des gouttes en gel, batch …
LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE CRISTALLOGENESE
1-CLASSIQUE : LA GOUTTE SUSPENDUE ET ASSISE
Gouttes suspendues, le mélange est suspendu au dessus
de la solution de cristallisation.
Gouttes assises, le mélange est déposé sur un pont au
dessus de la solution de cristallisation.
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2-BATCH
Dans une solution lipidique, on dépose distinctement une goutte de solution de cristallisation et une
goutte de protéine.
2-DIALYSE
La protéine est déposée dans un pont recouvert d’une membrane de dialyse, le tout est placé dans la
solution de cristallisation.
2-SANS CONTACT PHYSIQUE
Le mélange est déposé entre deux phases lipidiques de différente densité.
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