Bactériologie cutanée

19/01/2015
DU Cicatrisation des plaies,
brûlures et nécroses
Bactériologie cutanée
Dr Laurent Raskine
Service de Bactériologie-Virologie
Bactériologie clinique
Champs d’applications multiples
Mise en évidence des bactéries responsables
d’infections
Surveillance et étude de bactéries émergentes
origine environnementale, animale, humaine
Dépistage et surveillance des bactéries
multirésistances impliquées ou non dans les
infections acquises à l’hôpital
Bactériologie clinique
Distinguer la « bonne » bactérie
de la « mauvaise »
Les Bactéries
Traite des interactions entre les
micro-organismes et l’être humain
Biomasse Bactérienne
Les surprises du classement
Habitat
Nombre de
cellules
% du total
1030
66
Sous-sol terrestre
1,4 x 1030
26
Sol émergé
2,6 x 1029
4,8
Eau de mer
1,2 x 1029
2,2
Eau douce et Lacs salés
2,3 x 1026
0,00043
Animaux domestiques
4,3 x 1024
0,000080
Glace polaire
4,0 x 1024
0,000074
Termites
6,5 x 1023
0,000012
Humains
3,9 x 1023
0,0000072
Oiseaux domestiques
2,4 x 1021
0,000000044
Sous-sol marin
3,6 x
Les bactéries
Procaryotes
(absence de noyau)
Effectuent pour leur compte les
synthèses cellulaires nécessaires à leur
croissance et à leur multiplication
Développement intra-cellulaire éventuel
Métabolisme reste indépendant de celui
de l’hôte contrairement aux virus
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Structure de la bactérie
Structure de la bactérie
Résistance aux antibiotiques
Chromosome
Plasmide
(Résistance naturelle)
(Résistance acquise)
Gène de résistance
Transfert vertical
(dans la descendance)
Transfert horizontal
(intra ou inter espèce)
Transmission possible d’un patient à l’autre
via les mains du personnel ou d’autres sources
Relation entre hôtes et
bactéries
Taxonomie et
classification
 Bactéries saprophytes de l’environnement présence
transitoire et sans danger
 Bactéries commensales au contact des muqueuses (E. coli )
ou de la peau (S. epidermidis)
 Bactéries opportunistes Bacille pyocyanique
 Bactéries pathogènes M.tuberculosis
C. diphteriae, Legionella, S. typhi
Bien identifier pour définir et classer
Classification en Famille, Genre, Espèce
 Famille: Enterobacteriaceae,
 Genre: Escherichia,
 Espèce: coli
Aspect des bactéries
au Gram
Paroi bactérienne
Bactéries à Gram positif
Bactéries à Gram négatif
Mycobactéries
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Staphylocoques blancs et
dorés
aspect en culture
Staphylococcus aureus
Streptocoque
S. aureus
S. auricularis
S. capitis
S. caprae
S. cohnii
S. condimenti
S. epidermidis
S. equorum
S. haemolyticus
S. hominis
S. intermedius
S. lugdunensis
S. pasteuri
S.piscifermentans
Staphylocoques
Aspect des bactéries
au Gram
S. saccharolyticus
S. saprophyticus
S. schleiferi
S. sciuri
S. simulans
S. warneri
S. xylosus
Corynébactéries
Aspect des bactéries
au Gram
Propionibacterium
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Entérobactéries
Entérobactéries
C. freundii
E. aerogenes
E. cloacae
E. gergoviae
E. coli
E. hermanni
E. asburiae
L. adecarboxylata
P. agglomerans
Aspect des bactéries
au Gram
P. mirabilis
P. vulgaris
P. rettgeri
S. marcescens
K. pneumoniae
K. ascorbata
S. marcescens
S. typhimurium
Shigella flexneri
Pyocyanique
Acinetobacter
Fusobactéries et
spirochettes
Spores bactériennes
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Mycobacterium
tuberculosis
Rapidly growing mycobacteria
Slowly growing
mycobacteria
Bactéries planctoniques
Biofilm
Mise en place et organisation
d’une communauté bactérienne
adhérant à une surface et enrobée d’une
matrice d’exopolysaccharide
Biofilm bactérien
Biofilm
Modèle de formation d’un biofilm
par Pseudomonas aeruginosa.
Résistance aux traitements antibiotiques
Amplification et synchronisation de la
virulence à l’ensemble de la population
bactérienne
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Biofilm
Les biofilms
pourraient
représenter le
mode de vie
normale des
bactéries
N’étudier que les bactéries
planctoniques (forme libre) laisse de
coté un pan énorme de la physiologie
bactérienne
Interaction Mycobacterium xenopi
et amibes
EM observation of M. xenopi phagocytosis into the A. polyphaga amoeba.
(a) Engulfment of mycobacteria 5 min after inoculation;
(b) Intra-amoebal mycobacteria observed 24 h postinoculation
(c) Dividing intra-amoebal mycobacteria six days postinoculation
Journal of Hospital Infection Volume 65, Issue 2 2007 138 - 142
L’homme est un hybride
primate-microbes
Les Flores
 Le corps humain est un écosystème
pour des milliards de bactéries qui cohabitent
naturellement,
notamment sur la peau et dans le tube digestif
 Nous hébergeons dix fois plus de bactéries
que nous ne possédons de cellules somatiques
et germinales.
L’homme est un hybride
primate-microbes
 L’extrapolation des résultats
d’identification moléculaire indique que
nous hébergerions de
L’homme est un hybride
primate-microbes
la séquence complète de ces microbiomes,
représente probablement un pool de gènes
100 fois supérieur au génome humain.
15 à 30 000 espèces bactériennes
différentes.
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L’homme est un hybride
primate-microbes
L’homme est un hybride
primate-microbes
 Le microbiote varie
d’un individu à l’autre,
d’une région à l’autre,
d’un site anatomique à l’autre
«Human Microbiome Project»
Comparer les flores bactériennes de volontaires sains à celle
de patients atteints d'infections aiguës ou de pathologies
de type psoriasis ou syndrome du côlon irritable.
Flores commensales
Flores microbiennes
 Flore commensales ou résidentes :
Flore cutanée (peau, conjonctive, nez)
Une flore commensale vit en harmonie
avec son hôte
Tant qu’elle ne change pas
de compartiment
Flore bucco-dentaire, oropharynx
Flore digestive
Flore vaginale
Colon
Urine
Peau
Sang
 Sites stériles :
Sang, urine, lcr, liquide articulaire
Flores commensales
Flore digestive
Les germes commensaux
ne provoquent pas
d’infections.
 Abondante :
Toutefois, ils compliquent les
démarches d'identification des bactéries
dans les prélèvements polymicrobiens
(cent milliards de bactéries par gramme de selles).
Expertise bactériologique pour
distinguer les pathogènes des germes
banaux
10 à 100 fois les cellules de notre corps
le tractus intestinal héberge le chiffre
astronomique de 1014 bactéries
1 kg de bactéries dans un intestin humain adulte
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Flore digestive
Flore digestive
 Diversifiée:
1000 espèces de bactéries représentent 90% de
la population totale
« Le métagénome intestinal » - l’ensemble des
bactéries cohabitant dans notre tube digestif - est
aujourd’hui considéré comme un organe à part
entière.
Flore cutanée
La peau n’est pas un site
stérile
Ecosystème
complexe
La peau n’est pas un site stérile
Rôle de défense non spécifique contre
les microorganismes « pathogènes »
Flore résidente
 102 à 105 bactéries par cm2 selon les zones
 Epiderme barrière physique
 Flore (microbiote) cutané
 Ph
 Basse température
 Desquamation
 Majorité de bactéries à Gram positif
 Staphylocoques
 Corynébactérie
 Peptostreptococcus
 Propionibacterium
 Anaérobies
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Staphylocoque
Propionibacterium
La peau n’est pas un site stérile
Flore transitoire
Flore de contamination
 Composée de cocci Gram positif
Corynébactéries
Staphylococcus aureus (20% de porteurs sains)
 Composée de bacilles Gram négatif
Entérobactérie (E.coli, Proteus sp)
Pyocyanique, Acinetobacter
Représentation schématique des zones de
très forte densité bactérienne de l’épiderme
Variation des populations bactériennes en
fonction des zones cutanées
 Une aisselle peut se comparer à une forêt tropicale en
terme de diversité
 Une peau sèche dans l'intérieur de l'avant-bras est un
vrai désert.
 Derrière l'oreille, 19 espèces bactériennes différentes en
moyenne, 44 sur l'avant-bras.
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microbiote et microbiome cutanés
Ecosystème
complexe
Intérêt et apport du microbiote et du
microbiome
 Mieux comprendre
l’écologie locale des plaies
chroniques et la diversité
microbienne
 Aide a la distinction
colonisation infection
 Prédiction évolutives des
plaies
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L'infection doit cependant être distinguée
de la colonisation bactérienne
L'infection doit cependant être distinguée
de la colonisation bactérienne
Colonisation
Normal
Peu virulent
Flore bactérienne résidente
(Flore commensale)
Flore bactérienne transitoire
Rupture de l’équilibre
Locaux
Lésions cutanées : plaies,
brûlures…
Mauvaise hygiène
Macération
Infection
Modification de flore
Germes virulents
Retard cicatrisation
Extension
L'infection doit cependant être distinguée
de la colonisation bactérienne
Généraux
Déficit immunitaire
Diabète sucré
Corticothérapie générale
Immunosuppresseurs
Corticothérapie locale
Classification de l’infection des plaies du pied
L'infection doit cependant être distinguée
de la colonisation bactérienne
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Les prélèvements bactériologiques ne sont
indiqués que
infection établie cliniquement.
[a part, recherche de BMR]
Objectif
 isolement et identification des bactéries
responsables de l’infection
 étudier la sensibilité aux antibiotiques
Débridement Mécanique
• Avant tout prélèvement, il faut PREPARER LA PLAIE.
– débridement mécanique (voire chirurgical) :
• curette ou scalpel stériles
– un nettoyage :
• gaze imbibée de sérum physiologique stérile
• NB : utilisation d’antiseptiques possible, mais à
éliminer par du sérum physiologique stérile avant de
réaliser le prélèvement.
Le Curetage-Ecouvillonnage :
• Débrider et nettoyer l’ulcère
• Prélèvement du tissu par grattage de la base de
l’ulcère au moyen d’une curette ou d’un scalpel
stériles
• Prélever en frottant avec un écouvillon la périphérie
du fond de l’ulcère
• Cette méthode est indiquée pour les prélèvements
superficiels et les plaies anfractueuses profondes
Méthodes de prélèvement microbiologique
Définir les objectifs de l’analyse,
– la manière de prélever selon les différentes
présentations cliniques,
– le matériel de prélèvement à utiliser,
– les conditions de transport,
– les techniques analytiques
– l’interprétation des résultats de la culture
Des protocoles conçus conjointement par les cliniciens et
les microbiologistes sont indispensables.
L’écouvillonnage simple
• Méthode la plus utilisée car la plus facile mais
A EVITER, car la moins fiable
• Peu adapté à la mise en évidence optimale des bactéries
réellement responsables de l’infection
• Recueil de la totalité de la flore aérobie colonisante si la
préparation n’est pas optimale
• Difficultés d’isoler les bactéries anaérobies
Le Curetage-Ecouvillonnage :
Plus spécifiques que l’écouvillonnage simple
moins de bactéries colonisantes identifiées
Seulement si débridement de bonne qualité
Recherche de bactéries anaérobies possible
Conditions:
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L’Aspiration à l’aiguille fine :
• Débrider et nettoyer
• Désinfecter la peau en périphérie (antiseptique)
• Ponctionner avec une seringue et une aiguille pour
IM ou SC :
La ponction doit être effectuée en passant par une
zone saine.
• Indiquée pour les plaies profondes collectées ou
anfractueuses lorsque les prélèvements par
écouvillons ne sont pas contributifs
La Biopsie tissulaire :
• La sévérité de la neuropathie autorise souvent une
biopsie au lit du patient sans préparation
particulière.
L’aspiration à l’aiguille fine
• En l’absence d’obtention de liquide, 1 à 2 ml de
sérum physiologique stérile peuvent être injectés
puis réaspirés immédiatement à l’aide d’une
seconde aiguille pour être analysés.
• La seringue ayant servi au prélèvement est envoyée
au laboratoire sans l’aiguille, purgée d’air et bouchée
hermétiquement et stérilement.
La biopsie osseuse
• La biopsie osseuse
est le moyen de diagnostic microbiologique le plus
fiable en cas d’atteinte osseuse
• Deux à trois fragments de tissu sont obtenus à partir
de plusieurs zones ; immédiatement déposés dans
un tube stérile additionné de quelques gouttes de
sérum physiologique pour éviter la dessiccation.
• Prélèvement de l’os par chirurgie ou par ponction
percutanée, peut être parfois guidé par
l’imagerie
• la biopsie est la méthode à privilégier chaque fois
que possible devant toute lésion tissulaire profonde.
• Passage en peau saine au moyen d'un trocart,
après désinfection la plus complète possible
pot stérile contenant du sérum physiologique
La biopsie osseuse
• La biopsie osseuse est la méthode de référence pour
le diagnostic d’ostéite : rapide, simple, sans effet
secondaire
• Rarement réalisée en dehors des centres spécialisés
• Prélèvement par chirurgie ou par ponction
percutanée, radio- ou écho-guidée
– passage en peau saine au moyen d'un trocart,
– après désinfection
– sans anesthésie locale (neuropathie sensitive)
– pot stérile contenant du sérum physiologique
Les hémocultures Aéro-Anaérobies
Notamment au cours
des bactériémie
secondaire à des ostéites
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Diagnostic microbiologique
Méthodes d’études
• Facile si
– Isolement d’une bactérie pathogène
– Hémocultures positives
– Lésion cutanée récente: trauma, inoculation,
Corps étranger
• Difficile si
– Plaie subaigue ou chronique
– Escarre, ulcères, brûlures
Examen Microscopique
Etape du diagnostic
conventionnel
Examen direct après coloration (Gram …)
 Méthode la plus facile, la plus rapide et la moins
coûteuse pour établir un diagnostic de présomption.
Echantillon biologique
 Examen direct
J0
 Culture et Identification
J24h
 Antibiogramme
J48h
Non spécifique d’espèce
Manque de sensibilité (>104 bacilles/ml)
 Permet aussi d’établir rapidement un diagnostic
pour les malades les plus contagieux (tuberculose)
Méthodes conventionnelles
Culture et Isolement
Identification
Milieux pour l’isolement et
la sélection des bactéries
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Culture d’E.coli
Nouvelle approche de
protéomique
Permet d’identifier les
bactéries par la comparaison
des profils protéiques
La spectrométrie devient un outil intéressant en
routine de microbiologie clinique
Culture de
Klebsiella
pneumoniae
Deux raisons essentiellement
Bactéries cultivables «entières»
Bases de données
Exemple de spectres obtenus
Méthodes
conventionnelles
Limite des méthodes phénotypiques
 Bactérie non cultivable ou de culture difficile
 Délais parfois importants de la réponse
 Facteurs de virulence et/ou mécanismes de
résistances
Tests rapides
Méthodes moléculaires
Amplification par PCR de
séquences cibles révélées par
diverses techniques
Immunochromatographique
L. pneumophila sérogroupe1
Steptoccocus pneumoniae
Clostridium difficile GDH
Gel
Hybridation
Séquence
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•
Méthodes moléculaires
Mise en place à différentes étapes
du diagnostic
Identifications (rpoB, hsp65, 16S)
Méthodes conventionnelles
Antibiogramme par diffusion
en milieu gélosé
Toxines (LPV, Tox A/B)
Gènes de résistance aux antibiotiques
on mesure les inhibitions de la
croissance autour des disques
d’ATB pour classer les
bactéries en S/I/R
Performance
Temps technique
Cout
Antibiogramme par
diffusion en milieu gélosé
K. pneumoniae
Souche sauvage
Mesure des CMI par E-Test
Souche productrice de Blse
Les bacilles à Gram négatif
• Les Entérobactéries :
– Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella sp.
– fréquemment en cas d’infections chroniques ou déjà
traitées ou en cas de stade avancé
Souche
productrice de
carbapenèmase
de type KPC
• Pseudomonas aeruginosa :
– après des hospitalisations de longue durée ou des bains de
pied, ou un traitement par des pansements humides, le
port de chaussures en caoutchouc
– isolés de plaies punctiformes situées en regard du
calcanéum et sont à l’origine d’ostéites
– rôle dans les plaies superficielles ??
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Interprétation des résultats : Principes
Interprétation des résultats : Principes
L’interprétation doit tenir compte :
– des conditions de recueil du prélèvement
Il n’existe à ce jour aucun moyen formel permettant de
différencier une colonisation d’une infection !!!
– du délai et des conditions de transport du
prélèvement au laboratoire
– du type de Bactéries isolées : staphylocoques,
bacilles à Gram négatif
Pas de moyens microbiologiques actuellement pour
distinguer pathogène de non pathogène
– du nombre de prélèvements où la même bactérie
est isolée (cas des germes commensaux)
Conclusion
La connaissance
Des critères d’infection des plaies
Des bactéries en cause
De leur sensibilité aux antibiotiques
est un pré-requis nécessaire pour une bonne
prescription
Conclusion
La qualité des prélèvements conditionne l’interprétation
des résultats
Des protocoles doivent donc être établis pour une prise en
charge optimale
Qui nécessite une coopération multi-diciplinaire entre les
différents acteurs intervenant dans ces pathologies
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