F - Le serveur des thèses en ligne de l`INSA de Toulouse

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Institut National des Sciences Appliquées
de Toulouse (INSA Toulouse)
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Ingénieries microbienne
et enzymatique
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Florence฀ Bordes
฀ lundi 29 septembre 2008
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INGENIERIE DU SYSTEME D’EXPRESSION YARROWIA LIPOLYTICA POUR
L’EVOLUTION DIRIGEE ET L’ETUDE STRUCTURALE
DE LA LIPASE LIP2 DE
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YARROWIA LIPOLYTICA
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฀ Université de La Rochelle - Rapporteur
Marianne GRABER - Maître De Conférences,
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Jürgen PLEISS - Professeur, Université
de Stuttgart- Rapporteur
Jean-Marc NICAUD - Directeur de recherche CNRS, INRA de Grignon - Examinateur
Samuel TRANIER- Maître De Conférences, Université Paul Sabatier, Toulouse - Examinateur
Pierre MONSAN - Professeur, INSA Toulouse - Président
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Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB)
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Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes฀ Biologiques et des Procédés (LISBP)
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Alain Marty - Professeur, INSA Toulouse
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Marianne GRABER
Jürgen PLEISS
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Institut National des Sciences Appliquées
de Toulouse (INSA Toulouse)
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Ingénieries microbienne
et enzymatique
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Florence฀ Bordes
฀ lundi 29 septembre 2008
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INGENIERIE DU SYSTEME D’EXPRESSION YARROWIA LIPOLYTICA POUR
L’EVOLUTION DIRIGEE ET L’ETUDE STRUCTURALE
DE LA LIPASE LIP2 DE
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YARROWIA LIPOLYTICA
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฀ Université de La Rochelle - Rapporteur
Marianne GRABER - Maître De Conférences,
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Jürgen PLEISS - Professeur, Université
de Stuttgart- Rapporteur
Jean-Marc NICAUD - Directeur de recherche CNRS, INRA de Grignon - Examinateur
Samuel TRANIER- Maître De Conférences, Université Paul Sabatier, Toulouse - Examinateur
Pierre MONSAN - Professeur, INSA Toulouse - Président
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Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB)
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Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes฀ Biologiques et des Procédés (LISBP)
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Alain Marty - Professeur, INSA Toulouse
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Marianne GRABER
Jürgen PLEISS
NOM : BORDES
Prénom : Florence
Titre : Ingénierie du système d’expression Yarrowia lipolytica pour l’évolution dirigée et l’étude
structurale de la lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica
Spécialité: Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries, Filière : Microbiologie et
Biocatalyse industrielle
Année : 2008
Lieu : INSA de Toulouse
RESUME :
La lipase Lip2 de Y. lipolytica est un biocatalyseur prometteur d’un point de vue biotechnologique.
Elle est déjà utilisée dans l’industrie pour sa capacité à hydrolyser les lipides et présente d’autre part
une sélectivité intéressante envers différents types de substrats (résolution de mélanges racémiques,
ester de DHA, …). Cependant, du fait de sa faible thermostabilité et d’une sélectivité encore
insuffisante, les applications industrielles ne sont pas encore développées pour ses capacités de
bioconversion à forte valeur ajoutée. Dans le but d’améliorer les propriétés de cette lipase, nous avons
développé au cours de ce travail de thèse deux outils permettant de faire évoluer ce biocatalyseur
d’intérêt par évolution dirigée d’une part et par évolution rationnelle d’autre part.
La première partie de la thèse a donc consisté à mettre au point un système d’expression pour le
criblage haut débit d’activités enzymatiques chez la levure Yarrowia lipolytica. Le principal apport
réside dans la construction de la souche JMY1212, qui contient une plate-forme d’intégration
génomique où la cassette d’expression va s’intégrer de manière ciblée. Ainsi, les taux de
transformation, le niveau d’expression, et la répétabilité du système ont été rendus compatibles avec le
criblage haut-débit. La reproductibilité du système a également été assurée par l’utilisation d’outils
robotisés et l’optimisation de la croissance et de l’expression protéique en microplaque. Ces travaux
ont permis d’obtenir le premier système d’expression eucaryote dédié à l’évolution dirigée d’enzymes.
Ce système d’expression a été utilisé pour construire une banque de variants de la lipase Lip2. Un
crible sur la thermostabilité a permis d’obtenir un variant de thermostabilité améliorée. Les temps de
demi-vie ont été améliorés d’un facteur 21 à 127 selon les températures. Cette caractérisation a permis
de mettre en évidence que l’agrégation de l’enzyme et l’interchange des ponts disulfures étaient les
principaux mécanismes impliqués dans la dénaturation thermique de Lip2.
L’étude des relations structure-fonction d’une enzyme passe par la connaissance de sa structure. Des
essais de cristallisation de l’enzyme ont donc été initiés. L’obtention de cristaux utilisables pour la
détermination de la structure 3D a nécessité la déglycosylation de l’enzyme par voie enzymatique.
Plusieurs conditions de cristallisation ont été obtenues. L’une d’entre elle a permis l’enregistrement
d’un jeu de données à 1,7 Å. Différentes méthodes pour recouvrer l’information de phase ont été
expérimentées. Le phasage des données par remplacement moléculaire n’a pas permis de donner de
solution. Les techniques de phasage ab initio (remplacement isomorphe ou MAD) sont en cours ; à ce
jour cependant aucun des métaux lourds testés n’est fixé dans l’édifice cristallin. La méthode de
bioincorporation de sélénométhionines directement dans la lipase, qui paraît la plus prometteuse, a été
initiée. Ce type de production n’a encore jamais été réalisé chez Y. lipolytica et les premiers résultats,
bien qu’encourageants, demandent encore des mises au point. Par ailleurs, un modèle de la structure
3D a pu être généré par homologie avec des enzymes de structure tridimensionnelle connue. Celui-ci a
permis de cibler avec succès des acides aminés à modifier pour améliorer la résolution de mélanges
racémiques d’intérêt pharmaceutiques.
MOTS CLES :
Lipase, Yarrowia lipolytica, évolution dirigée, système d’expression, mutagenèse, criblage à haut-débit,
thermostabilité, agrégation, études cristallographiques, modélisation moléculaire.
Cette thèse a été préparée au laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (UMR CNRS
5504, UMR INRA 792) de l'INSA de Toulouse
7
SUMMARY:
Yarrowia lipolytica Lip 2 lipase is a promising lipase from a biotechnological point of view. It
has already been used in industrial applications for its ability to hydrolyse lipids and because
of its interesting selectivity towards different types of substrates (racemic mixtures resolution,
DHA ester, … ). However, the low thermostability and insufficient selectivity of this enzyme
have prevented the development of industrial applications for high value added bioconversion
products. In order to improve its properties, we have followed a double approach to engineer
this enzyme using directed evolution and rational design.
The first part of the work describes the set up of an expression system for the high throughput
screening of enzymatic activities in the yeast Yarrowia lipolytica. The main novelty of this
method lies in the use of JMY1212 strain which was constructed on purpose. It contains a
genomic docking platform, in which the insertion of the expression cassette was done in a
targeted way. Thus, transformation efficiency, expression level, and reproductibility of the
full process were then compatible with high-throughput screening in the yeast Yarrowia
lipolytica. Furthermore, the reproducibily of the full process was ensured by using robots and
optimizing growth and protein expression in 96-well microplates. This work led to the
obtention of the first eukaryotic expression system devoted to directed evolution.
This expression system was used to create a library of Lip2 variants which was subsequently
screened on thermostability to isolate a variant with improved thermostability. Mutant’s halflives were 21 to 127 times higher than wild type lipase depending on the temperature. The
characterisation of this variant required the optimisation of the expression system and the set
up of the lipase purification method. The variant characterisation permitted to reveal that
aggregation and disulfide interchange were the main mechanisms involved in Lip 2 thermal
denaturation.
To gain a deeper insight of structure-activity relationships, crystallographic studies have been
undertaken. Crystallisation trials have been set up using the deglycosylated enzyme. Crystals
obtained led the recording of a 1.7 Å data set. Different methods have been attempted to
retrieve the phase information without success. Data phasing by molecular replacement failed
to resolve the structure. Although ab initio phasing by isomorphous replacement is still in
progress, none of the heavy metals tested has been fixed in crystals to date. The method of
selenomethionine bio-incorporation directly into the lipase for Multiple Anomalous
Diffraction (MAD) phasing, has been initiated. This kind of production in Y. lipolytica has
never been reported yet. It gave some promising preliminary results although, it still requires
adjustments. A 3D model of Lip2 has also been generated by homology with enzymes of
known structure. This model allowed the identification of amino acids which were changed
sucessfully to improve the racemic resolution of important class of pharmaceuticals.
9
Publications
A new recombinant protein expression system for high-throughput screening in the
yeast Yarrowia lipolytica.
Bordes F., Fudalej F., Dossat V., Nicaud J.M., Marty A. (2007). Journal of Microbiological
Methods, 70 : 493-502.
Analysis of Yarrowia lipolytica extracellular lipase Lip2p glycosylation.
Jolivet P., Bordes F., Fudalej F., Cancino M., Vignaud C., Dossat V., Burghoffer C., Marty
A., Chardot T., Nicaud J.M. (2007). FEMS Yeast Research, 7 : 1317-27
Improvement of Yarrowia lipolytica lipase enantioselectivity by site-directed mutagenesis
targeted at the substrate binding site
Bordes F., Letisse V., Cancino, M., André, I., Croux, C., Nicaud, J.M., Marty A. Soumise à
ChemBioChem
Communications par affiche
Evolution of the lipase from Yarrowia lipolytica for resolution of 2-substituted carboxylic
esters. BIOTRANS 2005, Delft, Pays Bas : Bordes F., Cancino M., Roncalli L., Fudalej F.,
Dossat V., Nicaud J.M., Marty A.
Un nouveau système d’expression de protéines recombinantes pour le criblage à haut
débit chez la levure Yarrowia lipolytica. GENOTOUL 2006, Toulouse, France : Bordes F.,
Cancino M., Roncalli L., Fudalej F., Dossat V., Nicaud J.M. et Marty A.
Yarrowia lipolytica, a complete expression system : From high throughput screening at
the microscale to enzyme production by fermentation. BIOCAT 2006, Hambourg,
Allemagne : Bordes F., Cancino M., Roncalli L., Fudalej F., Dossat V., Nicaud J.M., Marty
A.
Evolution of the lipase from Yarrowia lipolytica for resolution of 2-substituted carboxylic
esters. CBSO 2006, Ax-Les-Thermes, France : Bordes F., Cancino M., Roncalli L., Fudalej
F., Dossat V.,. Nicaud J.M, Marty A.
Optimization of wheat straw pre-treatment via directed evolution of hemicellulases.
Workshop 2008 "Directed Evolution Approaches in Structural Biology" Grenoble, France :
Fabre E., Bordes F., Marmuse L., Harisson D., Bozonnet S., Driguez H., Nicaud J.M., Marty
A., O’Donohue M.
11
« En science, la phrase la plus excitante que l'on peut entendre,
celle qui annonce des nouvelles découvertes,
ce n'est pas "Eurêka" mais c'est "drôle".»
Isaac Asimov
13
Remerciements
Il est venu le temps des remerciements. C’est une tâche délicate, car il est difficile
de trouver les mots justes pour dire merci à toutes les personnes qui ont contribué
de plus ou moins près à l’élaboration de cette thèse. Pour commencer, ces quatre
années de thèse ont été une de mes plus belles aventures tant sur le plan
scientifique que humain, tant sur le plan professionnel que personnel.
Je tiens en premier lieu à remercier mon directeur de thèse, Alain Marty. Merci
Alain, tout d’abord, pour m’avoir donné la chance de travailler sur un sujet aussi
fascinant et pour m’avoir communiqué ta passion pour l’ingénierie des protéines.
Merci ensuite de m’avoir laissé prendre petit à petit possession du sujet, tout en
recadrant. Finalement, merci pour ta confiance sans cesse renouvelée.
Merci ensuite à tous les membres de la grande EAD1. Si, ça a été un plaisir de venir
travailler (presque) tous les matins c’est un peu grâce à chacun d’entre vous.
Merci d’abord aux chefs : Pierre et Magalie. Merci pour votre ouverture scientifique
qui fait de l’équipe CIMES une équipe passionnante et toujours novatrice d’un
point de vue scientifique.
Un grand merci à Valérie (Dossat) pour son aide au début de cette thèse. Merci
pour ton enthousiasme communicatif et ton organisation carrée. Tu m’as convertie
aux « plan de manip ».
Merci Etienne et Olivier (les Mc Gyver du labo lipase) pour votre esprit pratique et
vos toujours innovantes et étonnantes solutions techniques ; merci pour vos
« coups de mains » (ou de tournevis) au quotidien.
Merci Ann pour ton immense gentillesse, ta douceur et tes petites attentions qui
regonflent le moral dans les moments difficiles.
Merci Miguel : mon co-thésard, pour ta gentillesse et ta bonne humeur.
Merci à Elise et Stéphane d’avoir souvent été mes compagnons du soir et pour les
discussions scientifiques (ou pas) que nous avons partagées.
Merci ensuite à tous mes collègues de paillasse, de couloirs et de cafet’ : Emeline,
Claire, Gaetan, Sandra, Laurence, Péco, Sophie(s), Yoan, Vincent, Marine, Romain,
Faten, Nelly, Manue, Mathieu … (J’en oublie forcément, vous êtes tellement
nombreux).
Merci également à tous ceux qui de près ou de loin m’ont donné l’opportunité de
découvrir le monde merveilleux de l’enseignement avec en particulier un immense
merci à Claude. Merci également à tous les enseignants du GBA. Merci pour tous
vos conseils ; enseigner à vos côtés a été non seulement très formateur mais aussi
un plaisir. Je n’oublie pas non plus Yves, Sylvie et Eugénie pour leur organisation
15
sans faille. Enfin, un grand merci tout à Sandrine qui m’a donné l’opportunité
d’encadrer avec elle un groupe de norvégiens « autrement ».
Merci également à tous les membres du LISBP croisés dans les couloirs, à la cafet,
ou dans les labos avec qui j’ai partagé un café, échangé des idées ou même juste un
regard plein de compassion après une longue journée.
Merci ensuite à Jean-Marc Nicaud et Samuel Tranier pour avoir accepté d’être les
examinateurs de cette thèse. Merci pour tout ce que j’ai pu apprendre en travaillant
à vos côtés dans des domaines très différents. Jean-Marc, tes connaissances en ce
qui concerne Y. lipolytica ne semblent pas avoir de limites et tes idées pour l’adapter
à ce dont on a besoin non plus. Merci de m’avoir montré ô combien cette levure
était modulable et communiqué ta passion. Merci Samuel pour ta gentillesse et ta
disponibilité. Merci de m’avoir fait découvrir le merveilleux monde de la
cristallographie et d’avoir partagé mon intérêt pour cette protéine récalcitrante. Ca a
été (et c’est toujours) un plaisir de travailler avec toi. Merci également à toute
l’équipe de cristallographie de Lionel Mourey de l’IPBS pour leur vraie gentillesse et
leur disponibilité (Lionel, Valérie, Fred, Sylviane, Romain, Laurent et Jean-Denis).
Merci à Marianne Graber et Jurgen Pleiss d’avoir accepté d’être les rapporteurs de
cette thèse. Merci pour leur lecture attentive et l’intérêt minutieux qu’ils ont porté à
ce manuscrit ainsi que pour la discussion constructive qui a suivi le jour de la
soutenance.
Merci aussi à tous mes amis de l’impro (Estelle, Ramzy, Yves, Vincent, Nono,
Morad, …) qui m’ont régulièrement demandé des nouvelles de mon enzyme et de
mes cristaux … Merci surtout pour tout le reste, pour toutes ces histoires réelles ou
imaginaires que nous avons construites ensemble et pour celles que nous
construirons encore.
Finalement Merci papa, maman, Isabelle et Valérie. Merci d’avoir cherché des
solutions avec moi, même si vous n’y compreniez pas grand-chose. Merci d’avoir
toujours cru en moi et d’avoir été là tout le temps tout simplement.
Merci finalement à Sébastien. Merci pour tes « remontages » de moral en règle,
pour ton soutien dans les moments de doute, pour ton indéfectible confiance en
moi, et enfin, merci pour tous les bons petits plats qui m’ont permis de tenir la
distance avec plein d’énergie et de baume au cœur.
16
Sommaire
17
Sommaire
SOMMAIRE.............................................................................................................. 17
INTRODUCTION ...................................................................................................... 25
CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ........................................................... 31
Première partie - Yarrowia lipolytica : un système d’expression performant. .............................................. 33
1.
La levure non conventionnelle Yarrowia lipolytica................................................................................ 33
1.1.
Physiologie et caractéristiques de la levure Yarrowia lipolytica................................................... 33
1.1.1. Taxonomie................................................................................................................................ 33
1.1.2. Caractéristiques physiologiques ............................................................................................... 33
1.1.3. Caractéristiques génomiques .................................................................................................... 34
1.2.
Intérêt académique et industriel .................................................................................................... 35
1.2.1. Historique ................................................................................................................................. 35
1.2.2. Capacités de sécrétion .............................................................................................................. 35
1.2.3. Utilisations industrielles avérées ou potentielles ...................................................................... 36
1.3.
Outils génétiques ........................................................................................................................... 37
1.3.1. Vecteurs.................................................................................................................................... 37
1.3.2. Marqueurs de sélection............................................................................................................. 38
1.3.3. Des promoteurs forts ................................................................................................................ 39
1.3.4. Signaux d’adressage ................................................................................................................. 39
1.3.5. Systèmes d’amplification ......................................................................................................... 40
1.3.6. Les souches............................................................................................................................... 41
1.3.7. Le système cré-lox recombinase............................................................................................... 41
2.
Comparaison avec d’autres systèmes d’expression ................................................................................ 42
2.1.
Les levures comme système d’expression..................................................................................... 42
2.2.
Saccharomyces cerevisiae et les levures non conventionnelles - Description des systèmes
d’expression levures les plus utilisés ........................................................................................................... 44
2.3.
Quel système d’expression pour les glycoprotéines ? ................................................................... 47
2.3.1. Composition des chaînes de glycosylation des protéines ......................................................... 47
2.3.2. Importance de la glycosylation dans les protéines médicamenteuses....................................... 48
2.3.3. Quel système d’expression pour l’évolution dirigée ?.............................................................. 49
Deuxième partie - Améliorer la thermostabilité par ingénierie enzymatique : Approche rationnelle ou/et
évolution dirigée. ................................................................................................................................................. 51
1.
Définition de la thermostabilité : ............................................................................................................ 52
1.1.
Stabilité thermodynamique, cinétique et thermoactivité ............................................................... 52
1.1.1. Thermostabilité thermodynamique........................................................................................... 52
1.1.2. Thermostabilité cinétique ......................................................................................................... 53
1.2.
Comment détermine-t-on la thermostabilité ? ............................................................................... 55
2.
Comprendre pour améliorer ou ingénierie rationnelle ............................................................................ 55
2.1.
Apprendre des thermophiles.......................................................................................................... 56
2.1.1. Les thermophiles ...................................................................................................................... 56
2.1.2. Les bases moléculaires impliquées dans la stabilité des thermophiles ..................................... 56
2.2.
Améliorer la stabilité thermodynamique de protéines................................................................... 57
2.2.1. Réduire l’entropie de l’état dénaturé ........................................................................................ 58
2.2.2. Effet hydrophobe ...................................................................................................................... 59
2.2.3. Effet enthalpique : les interactions électrostatiques.................................................................. 61
2.2.4. Autres sources de thermostabilisation ...................................................................................... 64
2.2.5. Conclusion................................................................................................................................ 65
2.3.
Les mécanismes impliqués dans la dénaturation irréversible des protéines .................................. 66
2.3.1. L’agrégation ............................................................................................................................. 67
2.3.2. L’hydrolyse des liaisons peptidiques au niveau des résidus acides aspartiques ....................... 67
2.3.3. La déamidation des glutamines et des asparagines :................................................................. 67
2.3.4. La β-élimination des ponts disulfures, destruction des cystéines et interchange de ponts
disulfures ................................................................................................................................................ 68
2.3.5. Oxydation des cystéines : ......................................................................................................... 70
19
Sommaire
2.4.
Conclusion..................................................................................................................................... 71
Evolution dirigée .................................................................................................................................... 72
3.1.
Définition évolution dirigée .......................................................................................................... 72
3.2.
Les méthodes pour générer de la diversité génétique.................................................................... 74
3.2.1. Techniques de mutagenèse ....................................................................................................... 75
a)
PCR à erreurs............................................................................................................................ 75
b)
La mutagénèse de saturation..................................................................................................... 77
c)
Introduction de délétions et insertions au hasard (RID mutagenesis)....................................... 78
d)
Conclusion et synthèse des méthodes de mutations ponctuelles (cf. Tableau I-7) ................... 79
3.2.2. Techniques de recombinaison .................................................................................................. 80
a)
Techniques de recombinaison avec homologie ........................................................................ 80
b)
Recombinaison sans homologie ............................................................................................... 82
Conclusion .............................................................................................................................................. 84
3.2.3. CONCLUSION ........................................................................................................................ 84
3.3.
Le criblage de la thermostabilité ................................................................................................... 84
3.3.1. Criblage .................................................................................................................................... 85
3.3.2. Criblage facilité ........................................................................................................................ 86
3.3.3. Sélection ................................................................................................................................... 87
3.4.
Conclusion..................................................................................................................................... 89
4.
Lipases et thermostabilité : Exemples de lipases dont la thermostabilité a été améliorée ...................... 90
5.
CONCLUSION GENERALE THERMOSTABILITE........................................................................... 91
3.
Troisième partie - Les lipases : les bases structurales de leur selectivité........................................................ 93
1.
Généralité lipases.................................................................................................................................... 93
1.1.
Réactions catalysées par les lipases............................................................................................... 93
1.2.
Applications .................................................................................................................................. 95
2.
Structure.................................................................................................................................................. 96
2.1.
Le repliement α/β.......................................................................................................................... 97
2.2.
La triade catalytique ...................................................................................................................... 99
2.3.
Le volet amphiphile..................................................................................................................... 100
2.4.
Le trou oxyanion ......................................................................................................................... 102
2.5.
Mécanisme catalytique (cf. Figure I-19) ..................................................................................... 103
3.
Les bases structurales de leur sélectivité............................................................................................... 105
3.1.
La sélectivité des lipases : ........................................................................................................... 105
3.2.
Typosélectivité (sélectivité vis à vis des différents acides gras) et topologie du site actif .......... 106
3.3.
Régiosélectivité envers les triglycérides ..................................................................................... 108
3.4.
Enantiosélectivité : ...................................................................................................................... 110
3.4.1. Intérêt des réactions énantiosélectives.................................................................................... 110
3.4.2. Des règles empiriques............................................................................................................. 110
3.4.3. Structures cristallographiques................................................................................................. 111
3.4.4. Modélisation par mécanique moléculaire. .............................................................................. 111
4.
La lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica................................................................................................... 116
4.1.
Applications ................................................................................................................................ 116
4.2.
Systèmes de production............................................................................................................... 117
4.3.
Caractérisation............................................................................................................................. 118
4.4.
Conclusion : ................................................................................................................................ 119
Quatrième partie : Introduction à la résolution de la structure des protéines par cristallographie aux
rayons X. ............................................................................................................................................................ 121
1.
Description géométrique d’un cristal.................................................................................................... 122
1.1.
Description d’un cristal (voir figure I-29) ................................................................................... 122
1.2.
Equations de Laue et loi de Bragg : deux visions du phénomène de diffraction......................... 124
1.3.
Facteur de structure et densité électronique ................................................................................ 126
1.4.
Le problème des phases............................................................................................................... 127
1.5.
Périodicité et résolution cristallographique ................................................................................. 128
2.
Etapes dans l’obtention d’une structure tridimensionnelle par diffraction rayons X. ........................... 129
2.1.
Obtention d’un cristal.................................................................................................................. 129
2.2.
Acquisition et traitement de données de diffraction des rayons X par un cristal......................... 131
2.2.1. Collecte des données .............................................................................................................. 131
2.2.2. Traitement des données .......................................................................................................... 131
20
Sommaire
2.2.3. Evaluation de la qualité des données. ..................................................................................... 133
2.2.4. Calcul du facteur de structure ................................................................................................. 133
2.3.
Méthodes d’obtention des phases................................................................................................ 134
2.3.1. Remplacement isomorphe. ..................................................................................................... 134
2.3.2. MAD (Hendrickson et al., 1985; Karle, 1980) ....................................................................... 137
2.3.3. Le remplacement moléculaire ................................................................................................ 139
2.4.
Construction des premières cartes et amélioration de l’information de phases........................... 141
2.5.
Affinement cristallographique..................................................................................................... 141
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES .......................................................... 143
1.
Techniques microbiologiques ............................................................................................................... 145
1.1.
Souches ....................................................................................................................................... 145
1.2.
Plasmides..................................................................................................................................... 145
1.3.
Milieux de culture ....................................................................................................................... 147
1.3.1. Milieux de culture pour E.coli : milieu Luria Bertani ............................................................ 147
1.3.2. Milieux de culture pour Y. lipolytica ...................................................................................... 147
a)
Milieu riche YPD (préculture)................................................................................................ 147
b)
Milieux de sélection des transformants de Y. lipolytica ......................................................... 147
c)
Milieux riche de croissance et de production ......................................................................... 148
2.
Techniques de biologie moléculaire ..................................................................................................... 149
2.1.
Techniques de préparation et de manipulation des acides nucléiques......................................... 149
2.1.1. Préparation d’ADN plasmidique bactérien............................................................................. 149
2.1.2. Préparation d’ADN génomique de levure .............................................................................. 149
2.1.3. Amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ............................................. 150
2.1.4. Digestions enzymatiques ........................................................................................................ 152
2.1.5. Déphosphorylation de l’ADN................................................................................................. 152
2.1.6. Ligation de l’ADN.................................................................................................................. 152
2.1.7. Electrophorèse d’ADN ........................................................................................................... 153
2.1.8. Purification des fragments d’ADN ......................................................................................... 153
2.1.9. Southern-blot .......................................................................................................................... 153
2.2.
Techniques de transformation ..................................................................................................... 153
2.2.1. Transformation d’E. coli......................................................................................................... 153
2.2.2. Transformation Yarrowia lipolytica ....................................................................................... 154
2.3.
Construction de souches disruptées de la levure Y. lipolytica ..................................................... 154
3.
Production et conditionnement enzyme................................................................................................ 156
3.1.
Production de l’enzyme............................................................................................................... 156
3.1.1. Production en microplaque..................................................................................................... 156
3.1.2. Production en erlenmeyer ....................................................................................................... 156
3.1.3. Production en fermenteur ....................................................................................................... 156
3.1.4. Suivi de la croissance des levures........................................................................................... 157
3.2.
Conditionnement de l’enzyme..................................................................................................... 157
3.2.1. Récupération du surnageant.................................................................................................... 157
3.2.2. Concentration ......................................................................................................................... 158
3.3.
Purification de l’enzyme ............................................................................................................. 158
3.3.1. Purification par chromatographie d’échange d’anions sur colonne Q sepharose Fast Flow... 158
3.3.2. Purification par chromatographie d’interactions hydrophobes sur butyl sépharose ............... 158
3.4.
Déglycosylation enzymatique ..................................................................................................... 159
4.
Caractérisation de l’enzyme.................................................................................................................. 159
4.1.
Détermination de l’activité hydrolytique des lipases par spectrophotométrie............................. 159
4.2.
Thermostabilité : mesure de l’activité résiduelle......................................................................... 159
4.2.1. Crible microplaque ................................................................................................................. 159
4.2.2. Evaluation de la thermostabilité ............................................................................................. 160
4.3.
Dosage de protéines .................................................................................................................... 160
4.3.1. La méthode de Bradford (1976) ............................................................................................. 160
4.3.2. La méthode de Lowry (1951) ................................................................................................. 160
4.4.
Electrophorèse SDS-Page............................................................................................................ 161
4.4.1. Electrophorèse en conditions dénaturantes............................................................................. 161
4.4.2. Electrophorèse en conditions natives...................................................................................... 161
4.5.
Etat d’agrégation de la protéine................................................................................................... 161
4.5.1. Chromatographie de gel d’exclusion ...................................................................................... 161
21
Sommaire
4.5.2. DLS : dynamic light scattering ............................................................................................... 161
4.6.
Analyse protéomique................................................................................................................... 162
4.6.1. Analyse de la glycosylation de l’enzyme ............................................................................... 162
4.6.2. Analyse de l’incorporation de la sélénométhionine................................................................ 162
5.
Construction du modèle de la structure tridimensionnelle de la structure de la lipase de Y. lipolytica. 163
6.
Détermination de structure de protéine par cristallographie et diffraction aux rayons X ..................... 164
6.1.
Méthodes de cristallisation.......................................................................................................... 164
6.1.1. Méthode de cristallisation par diffusion de vapeur................................................................. 164
6.1.2. Criblage haut-débit des conditions de cristallisation. ............................................................. 164
6.1.3. Technique de l’ensemencement.............................................................................................. 165
6.1.4. Conditions de cristallisation de Lip2 ...................................................................................... 165
6.2.
Trempages ................................................................................................................................... 165
6.3.
Acquisition des données de diffraction ....................................................................................... 166
6.4.
Traitement des données de diffraction et phasage....................................................................... 166
CHAPITRE III : RESULTATS................................................................................. 167
Première partie : Développement d’un système d’expression pour criblage haut débit chez la levure
Yarrowia lipolytica. ............................................................................................................................................ 169
1.
Mise au point du système de criblage pour l’évolution dirigée d’enzyme............................................ 171
1.1.
Quantification de la reproductibilité du test enzymatique ........................................................... 171
1.2.
Optimisation de la croissance et de la production de protéines................................................... 172
1.2.1. Eviter les contaminations croisées.......................................................................................... 172
1.2.2. Optimisation de la croissance et de la production en microplaque......................................... 173
1.2.3. Optimisation du piquage des colonies .................................................................................... 173
1.2.4. Optimisation du milieu de production et de la conduite de production .................................. 174
1.3.
Optimisation de l’étape de transformation de la cassette d’expression ....................................... 175
1.3.1. Quantification de la variabilité apportée par la transformation de la souche JMY1165......... 176
1.3.2. Optimisation de l’intégration de la cassette d’expression....................................................... 178
a)
Obtention de la zone zéta par PCR (Figure III-5)................................................................... 178
b)
Obtention du plasmide KS LEU2 zéta tronqué permettant l’intégration de zéta dans le génome
de Yarrowia lipolytica...................................................................................................................... 179
c)
Obtention de la souche Zéta (Figure III-7) ............................................................................. 179
1.3.3. Optimisation de l’intégration de la cassette d’expression et quantification de la variabilité
apportée par la transformation dans la nouvelle souche JMY1212....................................................... 180
a)
Comparaison des taux de transformation des souches JMY1165 et JMY1212 ...................... 180
b)
Comparaison de la variabilité apportée par la transformation de la souche JMY1165 et
JMY1212.......................................................................................................................................... 182
c)
Analyse de l’intégration de la cassette d’expression par Southern blot.................................. 183
d)
Prédiction du nombre de faux positifs .................................................................................... 186
1.4.
Conclusion................................................................................................................................... 189
1.4.1. Synthèse des résultats obtenus................................................................................................ 189
1.4.2. Avantages de Y. lipolytica en tant que système d’expression pour l’évolution dirigée d’enzyme
par rapport aux autres systèmes d’expression levuriens existants ........................................................ 190
a)
Saccharomyces cerevisiae ...................................................................................................... 190
b)
Pichia pastoris........................................................................................................................ 191
c)
Hansenula polymorpha .......................................................................................................... 192
d)
Conclusion.............................................................................................................................. 192
1.4.3. Voies d’amélioration du système d’expression Y.lipolytica ................................................... 193
2.
Intérêt du système développé pour l’ingénierie rationnelle ou semi-rationnelle de la lipase Lip2 de Y.
lipolytica......................................................................................................................................................... 194
2.1.
Intérêt de la souche JMY1212 pour l’évolution rationnelle de la lipase Lip2 de Y. lipolytica .... 195
2.2.
Evolution semi-rationnelle de la lipase Lip2 de Y. lipolytica ...................................................... 199
2.3.
Conclusion................................................................................................................................... 201
Deuxième partie - Amélioration de la thermostabilité de la lipase Lip2 par évolution dirigée et mise en
évidence du mécanisme de dénaturation thermique. ..................................................................................... 203
1.
Evolution dirigée de la lipase Lip2 de Y. lipolytica .............................................................................. 204
1.1.
Stratégie d’obtention de la banque de mutants............................................................................ 204
1.2.
Premier tour de mutagenèse ........................................................................................................ 206
22
Sommaire
2.
3.
4.
5.
1.2.1. Obtention de la banque et crible ............................................................................................. 206
1.2.2. Résultat du premier tour d’évolution dirigée.......................................................................... 207
1.3.
Deuxième tour de mutagenèse .................................................................................................... 209
1.4.
Caractéristiques des banques criblées (tableau III-10) ................................................................ 210
Obtention d’une enzyme non agrégée pour sa caractérisation .............................................................. 211
2.1.
Problèmes de reproductibilité...................................................................................................... 211
2.2.
Mise en évidence du phénomène d’agrégation............................................................................ 212
2.2.1. Mise en évidence .................................................................................................................... 212
2.2.2. Phénomène d’agrégation des lipases en général et le cas de Lip2.......................................... 214
2.3.
Comment s’affranchir de l’agrégation ?...................................................................................... 217
2.3.1. Dissolution des agrégats par l’utilisation de détergents et alcools.......................................... 217
2.3.2. Ingénierie du système d’expression........................................................................................ 218
Caractérisation de la thermostabilité de Lip2 sauvage et du variant 244 A .......................................... 221
3.1.
Influence de la concentration en protéine.................................................................................... 221
3.2.
Purification de l’enzyme ............................................................................................................. 222
3.3.
Caractérisation de la thermostabilité de la lipase sauvage et du variant 244A. ........................... 223
Etude détaillée des mécanismes de dénaturation thermiques................................................................ 227
4.1.
Mutagenèse de saturation ............................................................................................................ 227
4.2.
Mise en évidence de l’agrégation et de l’échange des ponts disulfures. ..................................... 230
4.3.
Perspectives................................................................................................................................. 232
4.3.1. Discussion sur le système d’expression.................................................................................. 232
4.3.2. Discussion sur le réarrangement des ponts disulfures ............................................................ 234
Conclusion générale :............................................................................................................................ 238
Troisième partie : Vers la résolution de la structure tridimensionnelle de la lipase Lip2 .......................... 239
1.
De la production de la lipase aux premiers essais de cristallisation...................................................... 241
1.1.
Production d’enzyme utilisable pour les essais de cristallisation. ............................................... 241
1.1.1. Site de glycosylation et cystéine libre .................................................................................... 241
1.1.2. Développement d’un système d’expression pour produire de la lipase non agrégée.............. 245
1.1.3. Purification de l’enzyme......................................................................................................... 246
1.2.
Etude de cristallisation avec la lipase native ............................................................................... 246
1.2.1. Criblage automatisé des conditions de cristallisation ............................................................. 246
1.2.2. Affinement des conditions de cristallisation........................................................................... 248
1.2.3. Traitement des clichés de diffraction...................................................................................... 248
1.2.4. Tentatives d’amélioration de la structure des cristaux............................................................ 249
1.3.
Etude de cristallisation avec la lipase déglycosylée .................................................................... 252
1.3.1. Recherche des conditions optimales de cristallisation............................................................ 252
1.3.2. Enregistrement des données ................................................................................................... 253
2.
Résoudre le problème des phases pour résoudre la structure de Lip2................................................... 254
2.1.
Remplacement moléculaire ......................................................................................................... 255
2.1.1. Modèle de la structure tridimensionnelle de Lip2 .................................................................. 255
a)
Alignement avec des protéines de structure tridimensionnelle connues................................. 255
b)
Prédiction de la structure secondaire ...................................................................................... 257
c)
Identification des éléments structuraux .................................................................................. 259
d)
Construction du modèle.......................................................................................................... 263
e)
Description du site actif de la lipase Lip2............................................................................... 265
f)
Conclusion :............................................................................................................................ 266
2.1.2. Remplacement moléculaire avec le jeu de données à 1,7 Å. .................................................. 267
2.2.
Dérivés lourds et diffuseurs anomaux ......................................................................................... 269
2.3.
Protéine Sélénométhionylée ........................................................................................................ 273
2.3.1. Essai de production en fermenteur ......................................................................................... 274
2.3.2. Ingénierie de la voie métabolique de biosynthèse de la méthionine chez Y.lipolytica ........... 277
a)
Gène MET6 ............................................................................................................................ 277
b)
Gène MET2 ............................................................................................................................ 278
c)
Gène SAM .............................................................................................................................. 280
d)
Conclusion et Perspectives ..................................................................................................... 281
2.4.
Conclusion................................................................................................................................... 283
3.
Recherche conditions de cristallisation avec maille plus petite. ........................................................... 283
3.1.
Ancien crible ............................................................................................................................... 283
3.2.
Nouvelles pistes de cristallisation ............................................................................................... 284
23
Sommaire
4.
Conclusion : .......................................................................................................................................... 286
CONCLUSION GENERALE................................................................................... 287
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .................................................................. 295
ANNEXE ................................................................................................................319
Composition de kits de criblage commerciaux.
Abréviations utilisées
24
Introduction
25
Introduction
Introduction
Les biocatalyseurs interviennent depuis des millénaires dans la vie des hommes pour
améliorer leur quotidien. Les premiers biocatalyseurs utilisés avaient une vocation
alimentaire, puis peu à peu leur utilisation s’est étendue à de nombreux domaines de la vie
quotidienne (santé, environnement, … ). Parallèlement à la diversification de leur champ
d’application, les biologistes ont peu à peu appris la maîtrise de ces outils moléculaires. Ils ont
d’abord appris à les identifier et à les caractériser, puis à les produire soit de manière
homologue, soit avec des systèmes d’expression hétérologues spécialement mis au point
pour leur production. Enfin, de par la compréhension de leur mode de fonctionnement, ils
ont appris à maximiser leurs performances en jouant sur leurs conditions d’utilisation. La
dernière étape dans la maîtrise des biocatalyseurs réside dans la compréhension fine des
mécanismes se déroulant au niveau moléculaire, et se situe donc au niveau de la structure
même de ces outils moléculaires. L’amélioration de leurs propriétés passe alors par
l’ingénierie enzymatique c’est à dire la modulation de la structure de ces biocatalyseurs. Les
améliorations peuvent se baser sur une approche rationnelle à travers l’étude des relations
structure-fonction du biocatalyseur d’intérêt ou sur une approche par évolution dirigée qui
consiste à sélectionner un biocatalyseur aux propriétés améliorées dans un ensemble de
variants générés aléatoirement par génie génétique.
Ce projet de thèse s’inscrit modestement dans ce cadre d’étude et se propose d’étudier plus
particulièrement la lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica. Ce biocatalyseur produit de manière
recombinante par la levure Y. lipolytica présente de nombreux intérêts biotechnologiques. Sa
capacité à hydrolyser les triglycérides est déjà exploitée industriellement pour le traitement
d’effluents chargés en graisse. Sa résistance aux pH acides en fait également un substitut de
choix pour la lipase pancréatique humaine pour les malades atteints par cette déficience
(mucoviscidose entre autres) ; elle est actuellement en cours d’évaluation clinique pour ce
type d’application. Elle présente par ailleurs des sélectivités intéressantes envers des substrats
à forte valeur ajoutée aussi différents que les acides de types 2-bromo-arylacétiques
(précurseurs chiraux utilisés dans l’industrie pharmaceutique), les esters de DHA (acide gras
faisant partie de la famille des omégas 3) et les esters de 2-éthylhexanol (plastifiant,
lubrifiant…). Cependant sa faible thermostabilité et son manque de sélectivité font que
l’emploi de cette lipase dans le domaine des biotransformations n’est pas encore développé
sur un plan industriel. L’objectif de cette thèse était d’améliorer les propriétés de cette lipase
27
Introduction
par ingénierie enzymatique en utilisant, d’une part, les techniques d’évolution dirigée et,
d’autre part, l’évolution rationnelle et l’étude des relations structure-fonction de l’enzyme.
Mon travail de thèse s’est articulé autour de ces deux thématiques et a consisté à développer
les outils nécessaires à l’amélioration de ce biocatalyseur d’intérêt via ces deux approches.
Dans un premier temps, dans le cadre de l’évolution dirigée, une limitation provenait du fait
qu’aucun système d’expression levurien n’était disponible pour réaliser l’évolution
d’enzymes. Mon premier travail a donc été de développer un système d’expression chez la
levure Y. lipolytica, à partir duquel l’évolution dirigée d’enzyme pourrait être réalisé. Ce
système d’expression a été utilisé pour l’amélioration de la thermostabilité de la lipase Lip2
de Y. lipolytica. Dans un second temps, dans le cadre de l’évolution rationnelle de l’enzyme,
l’accès à la structure tridimensionnelle de l’enzyme est primordial ; la résolution de la
structure de la lipase Lip2 de Y. lipolytica a donc été envisagée par la méthode de
cristallisation et diffraction aux rayons X
Ce manuscrit de thèse s’organise en trois chapitres.
Le premier chapitre fait état des connaissances existantes concernant les divers domaines de
notre étude. Dans un premier temps, le système d’expression utilisé dans ces travaux : la
levure Yarrowia lipolytica, est examiné. Après un descriptif de cette levure et de ses
nombreux outils génétiques disponibles, ce système d’expression est comparé sur divers
aspects aux autres systèmes d’expression levuriens les plus utilisés pour la production
recombinante d’enzymes. Dans un deuxième temps, les bases de la thermostabilité des
enzymes sont étudiées et les méthodes d’évolution rationnelle et dirigée sont décrites. La
troisième partie de ce chapitre traite des lipases et se focalise plus particulièrement sur les
relations entre la spécificité et la structure tridimensionnelle de ces biocatalyseurs. Une
dernière partie détaille le principe de la résolution de structure par cristallographie aux rayons
X.
Le chapitre deux présente l’ensemble des méthodes mises en œuvre au cours de ces travaux
de thèse comprenant les techniques microbiologiques, les techniques de biologie moléculaire,
les techniques de production, purification et caractérisation de la lipase étudiée, les techniques
de bioinformatique et les techniques de cristallographie aux rayons X.
Le chapitre trois retrace les résultats obtenus au cours de cette étude. La première partie est
composée de trois sous-parties. La première détaille la construction et la validation du
28
Introduction
système d’expression pour l’évolution dirigée d’enzymes chez la levure Y. lipolytica. La
deuxième traite des avantages de ce système d’expression à travers d’autres applications
possibles. La troisième illustre l’utilisation de ce système d’expression à travers
l’amélioration de la thermostabilité de la lipase Lip2 de Y. lipolytica via l’évolution dirigée.
La seconde partie quant à elle est focalisée sur la détermination de la structure
tridimensionnelle de la lipase de Y. lipolytica par cristallographie aux rayons X. Elle traite des
divers aspects, de la préparation de l’enzyme pour les essais de cristallisation, jusqu’aux
tentatives de résolution des phases.
Bonne lecture
29
Chapitre I : Etude bibliographique
31
Première partie
- Yarrowia lipolytica : un système
d’expression performant.
1. La levure non conventionnelle Yarrowia lipolytica
1.1. Physiologie et caractéristiques de la levure Yarrowia lipolytica
La levure Yarrowia lipolytica (anciennement Candida, Mycotorula, Endomycopsis ou
Saccharomyces lipolytica) est une levure non conventionnelle des plus étudiées. C’est une
levure non pathogène (Holzschu, et al., 1979) qui a été approuvée dans plusieurs procédés
industriels GRAS (Generally Recognized As Safe ; FDA). Elle est retrouvée naturellement
dans les produits riches en lipides comme les fromages, les produits laitiers, les huiles
végétales ainsi que dans les eaux d’égouts.
1.1.1.
Taxonomie
Yarrowia lipolytica est un ascomycète de la famille des Saccharomycetaceae (sous famille des
Saccharomycetoideae). Elle a d’abord été classée comme Candida lipolytica, jusqu’à ce que
la forme parfaite soit identifiée à la fin des années soixante par Wickerman. Elle a été
reclassée comme Endomycopsis lipolytica (Wickerham, et al., 1970) puis comme
Saccharomycopsis lipolytica, (Yarrow, 1972) et finalement Yarrowia lipolytica (van der Walt
and von Arx, 1980). Deux types sexuels ont été identifiés chez cette levure : le type A et le
type B (MAT A et MAT B), mais la plupart des isolats sont haploïdes. La fusion entre deux
cellules haploïdes de type différent conduit à la formation d’un zygote diploïde se
développant sous forme de mycélium et aboutissant à la formation d’ascospores haploïdes.
Chez cette levure, la reproduction sexuée est limitée du fait de grandes divergences
chromosomiques entre les souches.
1.1.2.
Caractéristiques physiologiques
Yarrowia lipolytica est une levure dimorphique (voir Figure I-1) qui existe sous forme de
cellules bourgeonnantes, d’hyphes ou de pseudo-hyphes selon différents facteurs du milieu de
culture. Les colonies sur milieu solide peuvent avoir différents aspects, allant de la colonie
lisse et brillante à des colonies plissées et mates. C’est une levure aérobie stricte qui pousse à
des températures allant de 5°C à 30°C et qui n’est pas capable de croître à des températures
supérieures à 37°C (Kreger van Rij, 1984). Y. lipolytica présente la particularité de pouvoir
pousser sur des substrats hydrophobes comme les acides gras et les triglycérides (Kreger Van
33
Rij , 1984)., les alcanes et les 1-alcènes (Klug and Markovetz, 1967). Elle est aussi capable de
croître sur des sucres comme le glucose, mais pas sur saccharose car elle ne possède pas
d’invertase ; elle pousse également sur l’acétate. Yarrowia lipolytica ne produit pas d’éthanol
mais peut utiliser celui-ci ainsi que d’autres alcools comme source de carbone grâce à des
alcool déshydrogénases (Barth and Kunkel, 1979) jusqu’à des concentrations ne dépassant pas
les 3%.
Figure I-1 : Levure Yarrowia lipolytica, forme bourgeonnante à gauche – forme mycélium à
droite
1.1.3.
Caractéristiques génomiques
Le génome de la souche E150 de la levure Yarrowia lipolytica a été séquencé lors du
consortium génolevures en 2000 (Casaregola, et al., 2000; Dujon, et al., 2004). Le choix de
cette levure a été basé sur le fait qu’elle est taxonomiquement éloignée de Saccaromyces
cerevisiae, qu’elle a développé un métabolisme lipidique original et qu’elle présente de fortes
capacités de sécrétion. Le génome de cette levure s’organise en six chromosomes qui
totalisent 20,5 Mb (bien plus que celui de Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces
pombe avec 13 Mb). La taille des chromosomes varie entre 2,6 et 4,9 Mb. Aucun ADN de
type plasmidique extrachromosomique n’a été identifié. Plusieurs observations suggèrent que
Y. lipolytica a divergé considérablement par rapport aux autres levures ascomycètes : (1) son
contenu en GC élevé (environ 50 % contre environ 38 % pour les autres ascomycètes) (2) sa
densité de gène (un pour 3,3 kb pour Y. lipolytica contre un pour 2 kb pour S. cerevisiae) (3)
sa haute fréquence en introns (13 % des gènes ont au moins un intron contre 4,8 % chez
Saccharomyces cerevisiae) (4) la répartition de son ADN ribosomique (ADNr) dans sept loci
situés dans les régions subtélomériques (contre un seul locus chez Saccharomyces cerevisiae)
(5) le faible niveau de similarité de ses gènes avec les autres levures (6) un nombre
particulièrement élevé d’ARN de transfert (ARNt) : 510 avec certaines classes typiquement
eucaryotes qui sont absentes chez les autres levures hémiascomycètes (Marck, et al., 2006).
34
D’autre part, on retrouve chez cette levure une augmentation des familles protéiques
impliquées dans l’utilisation des substrats hydrophobes (De Hertogh, et al., 2006; Theveniau,
2006), ainsi qu’une grande diversité dans les éléments transposables (Neuveglise, et al., 2005;
Neuveglise, et al., 2002).
Par ailleurs, de nombreuses différences ont été observées entre les souches ; elle diffèrent par
la taille des chromosomes, (Casaregola, et al., 1997), le nombre de répétitions des ADN
ribosomiques (Fournier, et al., 1986) et la présence du rétrotransposon Ylt1 présent dans la
souche américaine CBS6142-2 mais absent dans les souches françaises W29 et allemande
H222 (Schmid-Berger, et al., 1994).
1.2. Intérêt académique et industriel
1.2.1.
Historique
C’est une levure qui a été utilisée largement dans les années soixante pour sa capacité de
production de « single cell protein » (protéines issues d’organismes unicellulaires) et de
sécrétion d’acides organiques (acide citrique en particulier) à partir d’alcanes comme seule
source de carbone. Par la suite, elle a été étudiée pour sa capacité à sécréter de nombreuses
protéines avec une grande efficacité et pour la régulation de la sécrétion de ces protéines (voir
partie suivante), pour la biogenèse des péroxisomes (Titorenko, et al., 2000), pour l’étude du
contrôle de la transition dimorphique (Dominguez, et al., 2000), et pour la biogenèse des
complexes I mitochondriaux (Kerscher, et al., 2002).
Cette levure est actuellement étudiée comme organisme modèle dans le métabolisme des
alcanes et des acides gras (Fickers, et al., 2005a; Thevenieau, et al., 2007). L’étude de ces
mécanismes, chez cette levure, est facilitée par la récente mise sur le marché d’une puce à
ADN commercialisée par Eurogentec.
1.2.2.
Capacités de sécrétion
Yarrowia lipolytica se distingue par sa capacité à sécréter, spécifiquement selon le milieu de
culture, diverses protéines hydrolytiques, certaines au niveau du g/L. Ces protéines incluent
deux protéases l’une induite dans des conditions alcalines (Ogrydziak and Mortimer, 1977),
l’autre à pH acide (Yamada and Ogrydziak, 1983), une RNase (Cheng and Ogrydziak, 1986),
une phosphatase (Moran, et al., 1989), et plusieurs lipases (Peters and Nelson, 1948a; Peters
and Nelson, 1948b). D’autre part, elle secrète aussi de nombreux métabolites à de très fortes
concentrations (l’acide citrique, l’α-kétoglutarate, lysine). Il est à noter que la voie de
sécrétion des protéines utilisées chez Y. lipolytica est une voie de translocation co35
traductionnelle (et non post-traductionnelle) qui est plus proche de la voie utilisée par des
eucaryotes supérieurs (Boisrame, et al., 1998).
1.2.3.
Utilisations industrielles avérées ou potentielles
La levure Y. lipolytica, d’abord utilisée pour la production de protéines issues d’organismes
unicellulaires à partir d’alcanes, a depuis été utilisée pour diverses applications industrielles.
Nous avons essayé de les synthétiser dans le tableau I-1.
Utilisation
Rôle prouvé dans la maturation de
mombreux produits laitiers et l'industrie
agroalimentaire.
Auteurs
Guerzoni et al., 1993 - Carreira et al., 1998,
2001, 2002 - Suzzi et al., 2001 - Ferreira et
Viljoen - 2003 Patrignani et al., 2006 ...
Applications industrielles
Maturation de nombreux
fromages et produits laitiers.
Production de protéines issues
d’organismes unicellulaires à partir
d'alcanes (single cell protein).
Barth et Gaillardin, 1996
Commercialisation d'un
complément alimentaire
Toprina.
Scioli et Vollaro, 1997- Oswald et al., 2002 Lanciotti et al., 2005 - Papanikolaou et al.,
2007
Commercialisation par
Artechno d'un mélange
composé de cellules
lyophilisées de Y. lipolytica et
de lipase extracellulaire.
Glazunova et al.,1973 - Illarionova et al., 1975 Franke-Rinker et al., 1983 - Arzumanov et al.,
2000 - Il'chenko et al., 2003 - Crolla et al.,
2004 - Venter et al., 2004 - Lanciotti et al.,
2005 - Forster et al., 2007 -Papanikolaou et
al., 2007
Production d'acide citrique par
Yarrowia lipolytica à partir
d'huile de colza par la société
Archer Daniels Midland.
Production d'huiles issues d’organismes
unicellulaires (single cell oils) alternatives
aux sources agricoles et animales.
Procédés de dépollution (déchets d'huiles
végétales).
Bioconversion
Production d'acides organiques (acide
citrique, acide isocitrique, acide alpha kétoglutarique) à partir de sources de carbone
peu coûteuses (alcanes, huiles végétales,
graisses, éthanol, molasses, hydrolysats
d'amidon, glycérol).
Production de lactones (composé
aromatique aux odeurs de pêche, noix de
coco, champignon).
Révisé dans Wache et al., 2003
Production d'acides dicarboxyliques
(Plastifiants, lubrifiants, polyamides,
polyesters, résines, …).
Théveniau et al., 2006
Brevet déposé par l'Institut
Français du Pétrole : Nicaud et
al., 2006.
Production d'acides gras spéfiques
(dochexanoique, arachidonique,
écosapenténoique).
Guo et al., 1999 - Guo et Ota, 2000
Brevets déposés par Du Pont
de Nemours : Damude et al.,
2006a,b, et c.
Chimie fine
Résolution de cétones et alcools à partir
de différentes souches de Y. lipolytica .
Fantin et al., 1996, 2000
Résolution d'ester à partir de différentes
souches de Y. lipolytica ou de la lipase
extracellulaire.
Fantin et al., 2001- Guieysse et al., 2004
Résolution d'époxydes à partir de souches
de Y. lipolytica exprimant des époxydes
hydrolases d'autres organismes (d'origine
fongiques, végétales ou animales).
Labuschagne et Albertyn, 2007
Tableau I-1 : Applications industrielles de la levure Y. lipolytica
36
Souches de Y. lipolytica
exploitées par la société
Oxyrane pour l'expression de
diverses époxydes hydrolases
Brevets : Botes et al., 2005a, b
et c, 2007a et b.
Yarrowia lipolytica est donc une levure ascomycète atypique qui partage des caractéristiques
communes avec les champignons filamenteux et présente certaines caractéristiques proches de
celles des eucaryotes supérieurs (la dispersion à travers le génome de clusters d’ADNr et des
gènes codant pour l’ARN 5S, le procédé de sécrétion de protéines). D’autre part, ses capacités
de sécrétion importantes en ont fait rapidement un organisme de choix pour la production de
protéines recombinantes. Dans le prochain chapitre nous détaillerons les outils génétiques
développés chez cette levure pour en faire un système d’expression perfectionné.
1.3. Outils génétiques
De nombreux outils génétiques ont été mis au point chez cette levure pour l’expression de
protéines homologues et hétérologues (Barth and Gaillardin, 1996; Barth and Gaillardin,
1997). Une technique de transformation par la méthode à l’acétate de lithium (Xuan, et al.,
1988) permet d’obtenir une bonne efficacité de transformation.
1.3.1.
Vecteurs
Les vecteurs utilisés sont des vecteurs navettes permettant à la fois une réplication chez la
bactérie et une expression chez la levure. Pour le passage chez la bactérie, ils possèdent un
gène de résistance à la kanamycine, l’ampicilline ou à la tétracycline. Pour l’expression chez
Y. lipolytica, ils contiennent un marqueur de sélection (détaillé au paragraphe 1.3.2), la
cassette d’expression (promoteur - séquence d’adressage - gène - région terminatrice) et les
éléments nécessaires à la maintenance dans la levure. La liste de ces éléments a été
récapitulée dans le Tableau I-2 d’après une revue (Madzak, et al., 2004).
Deux grands types de vecteurs peuvent être utilisés :
- des vecteurs réplicatifs : Les souches de Y. lipolytica ne contiennent pas de plasmides
réplicatifs naturels. Des vecteurs synthétiques réplicatifs ont pu être construits pour cette
levure, ils nécessitent à la fois une origine de réplication et un centromère (Fournier, et al.,
1993; Vernis, et al., 1997). Malheureusement, le nombre de vecteurs par cellule est limité (1 à
3) et leur maintien nécessite une pression de sélection, ce qui limite leur utilisation.
- des vecteurs intégratifs. L’intégration peut-être réalisée :
de manière homologue par insertion à un locus cible par simple crossing-over
(au site LEU2, URA3, dans l’ADN ribosomique ou dans une plate-forme d’intégration
chromosomique comme pBR322 ou la LTR de Ylt1 zéta). Les souches obtenues présentent
37
l’avantage d’être stables sur au moins 100 générations sans avoir besoin d’une pression de
sélection (Hamsa and Chattoo, 1994).
par insertion au hasard dans le génome de manière non homologue et
dispersée. Les zones zéta qui bordent la cassette d’expression permettent l’intégration non
homologue de cette dernière de manière dispersée dans la levure. Cette méthode permet de se
débarrasser de la partie bactérienne du plasmide et d’obtenir des vecteurs dits « autoclonants »
(Nicaud, et al., 1998; Pignede, et al., 2000b).
Tableau I-2 : Tableau représentant les différents composants existants chez Yarrowia lipolytica
pour l’expression de protéines recombinantes d’après (Madzak, et al., 2004)
1.3.2.
Marqueurs de sélection
La levure Yarrowia lipolytica est sensible à quelques rares antibiotiques comme ceux du
groupe de la bléomycine/phléomycine (Gaillardin and Ribet, 1987) et à l’hygromycine B
(Cordero Otero and Gaillardin, 1996). Les systèmes de sélection reposant sur la
complémentation d’auxotrophie (LEU2 et URA3 majoritairement) restent les plus utilisés
(Barth and Gaillardin, 1996). Très récemment deux autres marqueurs de sélections GUT2 et
38
ADE2 ont été développés au laboratoire de microbiologie de Grignon, pour compléter la
batterie d’outils disponibles chez Y. lipolytica.
1.3.3.
Des promoteurs forts
Historiquement, c’est le promoteur fort du gène XPR2 codant pour la protéase alcaline
extracellulaire de Yarrowia lipolytica qui a été le plus utilisé, mais sa régulation complexe
(pH>6, présence obligatoire de peptones dans le milieu…) rend son utilisation industrielle
compliquée. D’autre part, à partir d’une séquence activatrice (UAS1) (Blanchin-Roland, et al.,
1994) faiblement affectée par les conditions du milieu, un promoteur hybride a été obtenu :
hp4d (hybrid promot 4 direct repeat) qui correspond à 4 copies UAS1 en tandem direct
(Madzak, et al., 2000). Ce promoteur est considéré comme semi-constitutif, car son induction
est dépendante de la phase de croissance, mais les éléments régulant cette expression n’ont
pas encore été déterminés. Deux autres promoteurs constitutifs forts : TEF (translation
elongation factor-1 alpha) et RPS7 (protéine ribosomale S7) ont été décrits par Muller et al.
(1998), le promoteur TEF étant le plus actif. Des promoteurs inductibles et forts sont aussi
utilisés : il s’agit des promoteurs des gènes POX2 (gène codant pour l’acyl-CoA-oxydase 2)
(Pignede, et al., 2000b), ICL1 (Isocitrate lyase) (Juretzek, et al., 2001) et POT1 (3-oxo-acylCoA thiolase). Ces promoteurs sont issus d’enzymes intervenant dans le métabolisme des
substrats hydrophobes de Y. lipolytica et sont donc inductibles par les alcanes et les acides
gras. Ceci peut poser des problèmes dans les étapes de purification de l’enzyme.
1.3.4.
Signaux d’adressage
Parmi les signaux d’adressage utilisés chez Y. lipolytica on retrouve les signaux de sécrétion
des principales protéines sécrétées par les souches sauvages. Les séquences signal les plus
utilisées sont les régions prépro du gène XPR2 codant pour la protéase alcaline
extracellulaire, et la régio prépro du gène LIP2 (les régions pré ou pro pouvant également être
utilisées séparément). Quelquefois les propres signaux de sécrétion des protéines d’intérêt
sont utilisés avec succès. C’est le cas pour les six protéines fongiques exprimées dans l’étude
de Muller et al. (1998) mais aussi pour des protéines d’autres origines comme l’α- amylase de
riz (Park, et al., 1997), où la sécrétion et la maturation sont plus précises avec sa propre
séquence signal qu’avec les signaux d’adressage de Y. lipolytica. Aucune règle générale ne
permet à ce jour de prédire quelle séquence signal doit être utilisée pour une protéine donnée.
39
1.3.5.
Systèmes d’amplification
Des systèmes d’amplification ont été mis au point chez Y. lipolytica. Ceux-ci se basent sur
l’utilisation d’un marqueur de sélection défectif, un allèle muté du gène URA3 dont une partie
du promoteur a été délétée : ura3d4 (Le Dall, et al., 1994). Pour complémenter l’auxotrophie à
l’uracile celui-ci devra être présent en plusieurs copies. Deux stratégies majeures
d’amplification sont utilisées chez Yarrowia lipolytica :
- L’intégration homologue multiple : Des séquences répétées peuvent être ciblées comme les
clusters d’ADN ribosomique ou les zones zéta (Juretzek, et al., 2001). Les zones zéta sont les
LTR (Long Terminal Repeats) du rétrotransposon Ylt1 (Schmid-Berger, et al., 1994) et sont
présentes en plusieurs copies chez certaines souches. Des séquences uniques peuvent aussi
être ciblées comme XPR2. Dans tous les cas, une intégration en tandem des cassettes
d’expression et un grand nombre d’intégrations sont observées (60-100 copies). Cependant,
de nombreuses copies sont perdues en conditions d’induction et le nombre de copies se
stabilise autour de 10 à 13 copies ura3d4 (Le Dall, et al., 1994).
- L’intégration non homologue : Quand les zones zétas sont utilisées pour l’intégration dans
des souches ne possédant pas les zones zétas, on observe une recombinaison non homologue,
multiple et dispersée. Ce type d’intégration même s’il ne permet pas un aussi grand nombre
de copies, évite la formation en tandem et permet d’avoir des souches très stables. Des
souches avec 16 copies et stables sur 120 générations ont été observées (Pignede, et al.,
2000b).
D’autres voies ont été développées pour améliorer la production des protéines. Des souches
surproductrices obtenues par mutagenèse chimique ont aussi été isolées et peuvent servir
d’hôte pour la production de protéines hétérologues (Fickers, et al., 2005d; Fickers, et al.,
2003b). Par ailleurs, une stratégie originale a été développée pour améliorer la production de
protéines. La levure Y. lipolytica étant aérobie stricte, sa croissance peut être limitée par
l’apport en oxygène, notamment dans les cas de productions de protéines recombinantes
lorsque les densités cellulaires sont importantes. Ainsi, Bhave et Chattoo, (2003) ont exprimé
une hémoglobine de Vitreoscilla chez Y. lipolytica ; celle-ci permet une meilleure utilisation
de l’oxygène, une meilleure croissance et une augmentation de la quantité de protéines
extracellulaires sécrétées. Ces caractéristiques rendent cette souche intéressante pour la
production de protéines recombinantes.
40
1.3.6.
Les souches
La souche utilisée peut être un élément important dans le niveau de sécrétion des protéines
recombinantes : De Baetselier et al. (1991) ont reporté des niveaux de sécrétion différents
(pouvant aller jusqu’à un facteur 100) pour l’expression d’une glucose oxydase d’Aspergillus
niger selon la souche de S. cerevisiae utilisée. Ces différences n’ont pu être expliquées par
aucun marqueur génétique particulier. Chez Yarrowia lipolytica aucune étude n’a été réalisée
sur les différences de sécrétion entre les souches, cependant divers éléments doivent être pris
en compte dans le choix de la souche utilisée.
La présence des zones zéta (LTR du rétrotransposon Ylt1) dans les différentes souches
permettra deux types d’intégration différents lorsque la cassette d’expression est bordée par
ces mêmes zones zéta : une intégration homologue et multicopies dans la souche américaine
CBS6142-2 possédant les zones zéta en grand nombre ou une intégration non homologue
pour les souches française W29 et allemande H222 qui ne possèdent pas de zones zéta
(Schmid-Berger, et al., 1994).
La souche po1d (dérivé de la souche française W29) présente certaines caractéristiques
intéressantes pour la production de protéines recombinantes :
-
elle permet de hauts niveaux de sécrétion de protéines
-
la protéase extracellulaire alcaline (AEP) a été délétée pour éviter l’hydrolyse des
protéines d’intérêt sécrétées.
-
une invertase a été ajoutée, ce qui permet à la levure de pousser sur saccharose et sur
des substrats abondants et peu onéreux comme les mélasses (Nicaud, et al., 1989).
1.3.7.
Le système cré-lox recombinase
Le système cré-lox recombinase (Sauer, 1987) permet la réutilisation des marqueurs de
sélection chez Yarrowia lipolytica. Les régions lox (Lox P et Lox r) doivent être situées de
part et d’autre du marqueur de sélection, ces zones sont reconnues par la recombinase Cré.
L’expression de cette recombinase (dans un vecteur réplicatif) permet l’excision du marqueur
par recombinaison aux sites lox avec une fréquence de 98%. Le marqueur peut donc être
réutilisé pour d’autres sélections. Ce système est utilisé pour la délétion de gènes chez
Yarrowia lipolytica (Fickers, et al., 2003a). Récemment ce système a été mis en œuvre pour la
délétion de familles multigéniques et leur analyse fonctionnelle dans le but de réaliser
l’ingénierie métabolique des acides dicarboxyliques chez cette levure (Theveniau, 2006).
41
2. Comparaison avec d’autres systèmes d’expression
2.1. Les levures comme système d’expression
Une protéine recombinante est une protéine produite par des cellules dont l’ADN a été
modifié par génie génétique. Depuis l’obtention de la première protéine recombinante en
1977 (la somatostatine produite dans la bactérie Escherichia coli), (Itakura, et al., 1977),
l’utilisation des protéines recombinantes en biotechnologie n’a cessé de croître. Actuellement,
pour caractériser une protéine (fonction / propriétés physiques / structure), la protéine sera
presque toujours exprimée de façon recombinante. De même, aujourd’hui, la plupart des
protéines mises sur le marché (protéines médicamenteuses / enzymes) sont produites de
manière recombinante. Les protéines peuvent être produites de manière homologue (dans leur
organisme d’origine) ou hétérologue (dans un autre organisme). La quantité de protéines
nécessaire dépendra de l’application de celle-ci, et peut aller de quelques milligrammes de
protéines pour une caractérisation fonctionnelle ou structurale jusqu’au kilogramme pour des
applications pharmaceutiques. Ainsi, de nombreux systèmes d’expression ont été développés
pour obtenir une production de protéines suffisante pour l’application désirée.
De par sa facilité d’utilisation, son faible coût de production et la disponibilité de nombreux
vecteurs commerciaux, E .coli est devenu l’hôte le plus utilisé pour la production de protéines
recombinantes. Cependant, cette bactérie présente des limitations importantes quant à la
qualité des protéines obtenues, et notamment lorsqu’il s’agit de protéines d’origine eucaryote.
En effet, à cause des différences entre la machinerie cellulaire procaryote et eucaryote, les
protéines produites peuvent présenter certaines différences notamment au niveau des
modifications post-traductionnelles (pont disulfures et glycosylation majoritairement); de
telles différences peuvent conduire à une modification de l’activité biologique de la protéine
considérée. D’autre part, les protéines sont souvent produites sous forme de corps d’inclusion
et sont rarement excrétées ce qui complique leur purification. Le développement de systèmes
de production eucaryotes (levures, champignons, système bacullovirus/cellules d’insectes,
cellules de mammifères, plantes et animaux transgéniques) permet de pallier ces limitations
(dans une certaine mesure). Cependant plus les cellules sont « évoluées » plus le procédé sera
coûteux et difficile à mettre en œuvre (Tableau I-3).
42
Tableau I-3 : Principaux avantages et inconvénients des différents systèmes de production de
protéines recombinantes (Fernandez and Hoeffler, 1999)
Complexité et coût du procédé
Rapidité et facilité de mise en œuvre du procédé
Système d'expression
Rapide
Cellules
d'insectes
Lente
Cellules de
mammifères
Lente
Simple
Simple
Complexe
Complexe
Faible
Faible
Haut
Haut
Haut
Faible à Haut
Faible à Haut
Faible à modéré
Non. Sécrétion
périplasmique
Renaturation
usuellement
requise
Sécrétion dans
le milieu
Sécrétion dans
le milieu
Sécrétion dans
le milieu
Caractéristiques
Bactéries
Levures
Croissance cellulaire
Complexité du milieu
de croissance
Coût du milieu de
croissance
Rapide
Niveau d'expression
Sécrétion
Repliement de la
protéine
Renaturation
Repliement
rarement requise correct
Repliement
correct
Modifications posttraductionelles
N-glycosylation
Aucune
Hautement
manosylée
Simple, pas
d'acide sialique
Complexe
O-glycosylation
Phosphorylation
Acétylation
Acylation
γ-Carboxylation
non
non
non
non
non
oui
oui
oui
oui
non
oui
oui
oui
oui
non
oui
oui
oui
oui
oui
Le choix d’un système d’expression dépendra donc du cahier des charges pour l’utilisation de
la protéine que l’on veut avoir et se basera, par conséquent, sur différents paramètres :
- le niveau de production nécessaire
- la qualité de la protéine nécessaire (présence de modifications post-traductionnelles et leur
influence sur les propriétés de la protéine)
- la facilité et le coût de mise en œuvre du procédé.
Dans ce cadre, les levures présentent un intérêt majeur car elles possèdent à la fois les
avantages des bactéries en terme de facilité de mise en œuvre et de coût de production, et les
avantages des cellules eucaryotes en terme de qualité de protéine (nombreuses modifications
43
post-traductionnelles) et de sécrétion de la protéine d’intérêt. En outre, de nombreuses levures
sont classées GRAS (Generally recognised as safe) par la Food and Drug Administration, et
leur utilisation permet d’éviter toute sorte de contamination par des virus issus de cellules de
mammifères. Toutes ces caractéristiques permettent une utilisation industrielle sans
encombre. Dans le chapitre suivant nous détaillerons l’utilisation des levures comme système
de production de protéines recombinantes.
2.2. Saccharomyces cerevisiae et les levures non conventionnelles Description des systèmes d’expression levures les plus utilisés
La levure Saccharomyces cerevisiae, la mieux connue car utilisée depuis des siècles pour des
applications biotechnologiques, a été le premier système eucaryote à être utilisé. En 1984,
cette levure a permis de produire le premier vaccin recombinant contre le virus de l'hépatite B
(McAleer, et al., 1984). Cependant, cette levure présente elle aussi des limitations : la protéine
est produite à des niveaux généralement faibles et pas toujours sécrétée et une
hyperglycosylation des protéines est souvent observée. De ce fait, l’utilisation de levures non
conventionnelles s’est fortement développée, les plus utilisées étant Pichia pastoris,
Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha et Yarrowia lipolytica (Dominguez, et al.,
1998). Toutes ces levures possèdent des vecteurs épisomiques, des vecteurs intégratifs, des
promoteurs forts constitutifs et régulés, des signaux de sécrétion favorisant la sécrétion dans
le milieu de culture. Néanmoins chacun de ces systèmes d’expression présente des
particularités. Rapidement nous allons essayer de voir ce qui différencie ces levures, leurs
atouts et leurs limitations.
Levures méthylotrophes : Pichia pastoris et Hansenula polymorpha
Ces levures sont capables de pousser sur méthanol comme seule source de carbone et
possèdent un métabolisme permettant l’utilisation du méthanol et faisant intervenir des
enzymes comme une alcool ou méthanol oxydase. La régulation de ces enzymes fait
intervenir des promoteurs forts finement régulés (promoteur du gène AOX1 pour l’alcool
oxydase chez Pichia pastoris et promoteur du gène MOX pour la méthanol oxydase de
Hansenula polymorpha) qui peuvent induire des productions en protéines allant jusqu’à 30 %
des protéines totales. Hansenula polymorpha est très utilisée dans l’industrie car le procédé de
fermentation ne nécessite pas de méthanol (MOX est dérépressible par le glycérol) et cet
organisme est plus thermotolérant que la levure Pichia pastoris (30-43°C contre 30°C pour la
levure Pichia Pastoris). Le système d’expression dans Pichia pastoris quant à lui, a été
initialement développé par la société Phillips Petroleum pour la production de protéines issues
44
d’organismes unicellulaires sur méthanol. Aujourd’hui c’est la levure non conventionnelle la
plus largement utilisée par la communauté scientifique car un kit d’expression est disponible
chez la société Invitrogen.
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces lactis est classée GRAS (Generally recognised as safe) par la FDA (Food ans
drug administration). Elle est actuellement utilisée dans plusieurs pays (États-Unis, GrandeBretagne, Japon...) pour produire industriellement et de manière hétérologue de la chymosine
A (un des composants actifs de la présure de veau utilisée en fromagerie) et ainsi résoudre le
problème de pénurie de présure de veau (van den Berg, et al., 1990). Aujourd’hui plus de 40
protéines de diverses origines ont été exprimées avec succès dans cet hôte (révisé dans (van
Ooyen, et al., 2006)). Une des particularités de Kluyveromyces lactis réside dans le fait que
cette levure est capable de sécréter des protéines de hauts poids moléculaires (WesolowskiLouvel, et al., 1996). Une autre de ses caractéristiques est l’utilisation d’un système de
sélection original qui permet d’enlever le marqueur de sélection une fois le gène introduit, il
peut ainsi être réutilisé pour d’autres gènes (Selten, et al., 1995). D’autre part, il existe chez
K. lactis de nombreux mutants qui présentent une sécrétion améliorée (Bartkeviciute and
Sasnauskas, 2003; Bartkeviciute and Sasnauskas, 2004; Donnini, et al., 2004; Uccelletti, et
al., 2004). L’amélioration de la sécrétion a aussi été envisagée dans une étude alliant
protéomique et génomique (van Ooyen, et al., 2006). Dans cette étude, les protéines
cellulaires produites par une souche produisant une protéine chymotrypsisne hétérologue et
celles de la souche native ont été comparées par gel de protéine bidimentionnel. Ceci a permis
d’identifier les goulots d’étranglement de la sécrétion de protéines hétérologues chez cette
levure. A partir de cette première identification, l’amélioration de la sécrétion des protéines
recombinantes peut être envisagée par des techniques génétiques variées. Un kit pour
l’expression de protéines est commercialisé par New England Biolabs.
Yarrowia lipolytica
Nous avons décrit précédemment les nombreux outils génétiques qui ont été développés chez
la levure Yarrowia lipolytica. Plus de quarante protéines de diverses origines (révisé dans
Madzak et coll, 2004) ont été exprimées avec succès chez cette levure. Soulignons que la
surexpression des protéines peut se faire par un système original basé sur l’intégration non
homologue des zones zéta à l’intérieur du génome, ceci conduisant, dans le cas d’une
intégration multicopie, à une dispersion des copies à l’intérieur du génome et à une meilleure
stabilité des souches obtenues. De plus, comme pour la levure K. lactis, le système cré-lox
45
recombinase permet la réutilisation des marqueurs de sélection. D’autre part, l’intégration
homologue chez Yarrowia lipolytica offre de sérieux avantages par rapport aux autres
systèmes d’expression comme Pichia pastoris, notamment une très forte efficacité de
transformation et une intégration ciblée du gène intégré dans le génome (Gellissen, et al.,
2005), ainsi, seulement un petit nombre de transformant est nécessaire pour sélectionner un
mutant avec une intégration correcte. Un kit commercial pour l’expression de protéines a été
mis sur le marché récemment par la société Yeastern biotech.
Peu d’études permettent de comparer les systèmes d’expression ; une étude cependant a
permis de comparer différentes levures alternatives à la levure S. cerevisiae (Muller, et al.,
1998). La comparaison a été effectuée sur 6 enzymes différentes et cinq hôtes d’expression
(Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia
lipolytica et Saccharromyces cerevisiae) et se base sur différents critères : la quantité
d’enzyme sécrétée, le profil de glycosylation, l’efficacité de transformation, et la stabilité du
plasmide. Y. lipolytica possède à la fois une bonne efficacité de transformation, des plasmides
stables et une croissance correcte. Par ailleurs, elle ne présente pas de problèmes
d’hyperglycosylation (Tableau I-4). Toutes les levures testées présentent une meilleure
sécrétion que S .cerevisiae et Y. lipolytica a été jugée particulièrement intéressante pour ses
capacités de sécrétion. (Figure I-2 A et B).
Tableau I-4 : Comparaison des levures comme hôte d’expression. L’efficacité de transformation
sont illustrées par des + où + est le minimum relatif et + + + + + le maximum relatif (d’après Muller et
al., 1998).
S. cerevisiae
S. pombe
K. lactis
H. polymorpha
Y. lipolytica
Efficacité de transformation
+++++
+
++++
+++
+++
Problèmes de glycosylation
Apparemment
aucun
Apparemment
aucun
Apparemment
aucun
Augmentation de
plus de 20 kDa
Apparemment
aucun
Stabilité des plasmides
Satisfaisante
Satisfaisante
Satisfaisante
Satisfaisante
Satisfaisante
+++
+
+++
+++++
+++
Croissance
46
Figure I-2 : Activité relative par volume et par rapport à la biomasse (divisée par la DO 600 nm
de la culture de levure correspondante) pour cinq levures exprimant 6 enzymes (d’après Muller
et al., 1998). Les échantillons pour la mesure d’activité enzymatique ont été pris au maximum
d’activité enzymatique par volume. Pour tous les transformants, ce maximum a été atteint dans la
phase stationnaire de croissance. Pour chaque enzyme, les plus hautes activités obtenues par volume
(A) ou par unité de DO (B) ont été portées à 100. Cel I cellulase d’Aspergillus aculeatus, Cel II :
cellulase d’Humicola insolens, Gal I : galactanase d’Aspergillus aculeatus, Xyl I : xylanase
d’Humicola insolens , PG I : polygalacturonase d’Aspergillus aculeatus, Lip I : lipase d’Humicola
lanuginosa.
2.3. Quel système d’expression pour les glycoprotéines ?
2.3.1.
Composition des chaînes de glycosylation des protéines
Chez tous les êtres vivants, les chaînes glycosylées sont composées de deux parties :
- un cœur interne dont la structure oligosaccharidique est commune à tous les êtres vivants
(Figure I-3)
- une ou plusieurs ramifications attachées à ce cœur interne dont la composition varie
(Montreuil, 1980). Les chaînes glycosylées sont composées de quatre classes de sucre : les
47
oses (D-galactose, D-mannose, D-glucose, D-xylose), les déoxyoses (L-fucose), les
hexosamines (o-galactosamine and o-glucosamine) et les acides sialiques (acides Nacétylneuraminique et N-glycolylneuraminique).
Figure I-3 : Structure du cœur interne des chaînes glycosylées des protéines chez tous les êtres
vivants (Montreuil, 1980)
2.3.2.
Importance de la glycosylation dans les protéines médicamenteuses
En 2006, 165 protéines étaient approuvées par la FDA et l’EMEA (Agence européenne pour
l’évaluation des médicaments) en tant que médicaments (Walsh, 2006) ; ces protéines
représentaient en 2004 un marché de 33 milliards de dollars. Les principaux systèmes de
production sont E. coli et les cellules de mammifères, et environ un sixième des protéines
médicamenteuses sont exprimées chez les levures. Environ 60 % des protéines thérapeutiques
sont des protéines glycosylées (Gerngross, 2004). Pour que ces protéines puissent être
utilisées en tant que médicament, la FDA demande maintenant à ce que les protéines soient
parfaitement caractérisées du point de vue de leur glycosylation (Liu, 1992). En effet, la
glycosylation des glycoprotéines peut affecter leur solubilité, leur repliement, la
reconnaissance et la liaison aux ligands, la stabilité à la protéolyse et à la thermo-inactivation,
ainsi que l’activité biologique, l’antigénicité et le temps de demi-vie des protéines concernées
(révisé dans (Walsh and Jefferis, 2006)). Seuls les systèmes d’expression eucaryotes seront
capables de réaliser la glycosylation, cependant, les motifs de glycosylation sont différents
selon le système d’expression utilisé. Ainsi, chez les mammifères, les oligosaccharides de la
chaîne de glycosylation sont composés d’une grande variété de sucres N-acétylgalactosamine,
galactose et acide sialique (leur composition pouvant varier selon le type de cellules utilisées).
Les cellules d’insectes infectées par les bacullovirus sont incapables d’ajouter des acides
sialiques, alors que chez les levures, les oligosaccharides sont seulement composés de
mannoses. Le nombre de mannoses par chaîne et le type de liaisons dépendront de la levure
utilisée (révisé dans Dominguez et coll, 1998). Lorsqu’elle produit des protéines hétérologues,
la levure S. cerevisiae a souvent tendance à produire des protéines hyperglycosylées, alors que
les levures P. pastoris et H. polymorpha sont moins sujettes à l’hyperglycosylation. La chaîne
glycosylée des protéines produites dans ces hôtes comprend environ 8 à 14 unités de mannose
(contre 50 à 100 chez S. cerevisiae). La levure Y. lipolytica quant à elle, semble ajouter en
48
moyenne seulement 8-10 unités, cependant de l’hyperglycosylation peut parfois avoir lieu
(Madzak, et al., 2005).
A ce jour, toutes les glycoprotéines thérapeutiques sont donc produites par des cellules de
mammifères, ce qui implique de faibles taux de production à des coûts élevés et le risque de
contaminations virales. L’utilisation de levures en tant que système de production peut
s’envisager dans le cadre de l’ingénierie des voies de glycosylation chez ces organismes. Les
premières
tentatives
ont permis d’éliminer l’hyper-glycosylation, et la sécrétion
d’intermédiaires de glycosylation humains Man8GlcNac2 a pu être obtenue (NakanishiShindo, et al., 1993; Nakayama, et al., 1992). Mais, c’est l’équipe de Gerngoss en 2003, qui a
humanisé la voie de glycosylation chez la levure P. pastoris en éliminant la voie de
glycosylation endogène à la levure, et en exprimant différentes protéines eucaryotes de
glycosylation (Choi, et al., 2003; Hamilton, et al., 2003). Ceci a permis l’introduction de
sucres divers comme les galactoses (Bobrowicz, et al., 2004) et les acides sialiques
(Hamilton, et al., 2006). Un des avantages majeurs de ce nouveau système d’expression réside
dans l’uniformité des glycanes synthéthisés par les levures (contrairement au mélange de
glycoformes obtenu lorsque les protéines sont synthétisées par les cellules de mammifères).
Chez la levure Yarrowia lipolytica, l’étude des voies de glycosylation (Barnay-Verdier, et al.,
2004; Jaafar, et al., 2003) a permis le début de l’ingénierie métabolique de ces voies (Song, et
al., 2007).
2.3.3.
Quel système d’expression pour l’évolution dirigée ?
Un système d’expression pour le criblage haut-débit pour l’évolution dirigée doit satisfaire
plusieurs points :
-
les taux de transformation doivent être suffisamment élevés pour pouvoir réaliser des
banques.
-
le criblage de l’activité enzymatique doit pouvoir être rapidement mesuré.
-
la croissance des variants et l’expression protéique doivent être identiques entre les
variants de façon à identifier rapidement les protéines sortant du lot.
Aujourd’hui, bien que de nombreuses limitations existent, l’hôte d’expression le plus utilisé
est E. coli. Cependant, la protéine à faire évoluer n’est pas toujours fonctionnelle lorsqu’elle
est exprimée chez les procaryotes et est exprimée de manière intra-cellulaire ; ensuite, même
si l’efficacité de transformation est élevée chez cet hôte, les obstacles majeurs pour obtenir un
nombre suffisant de transformants par plaque sont l’efficacité de l’étape de ligation et le faible
taux de transformation des produits ligués (généralement 10 à 1000 fois moins de
49
transformants obtenus qu’avec un plasmide super enroulé). Là encore, les levures semblent
être des hôtes alternatifs intéressants pour ce type d’application. En effet, elles possèdent les
avantages d’E. coli en terme de facilité d’utilisation (culture rapide et facile à mettre en
œuvre, milieu simple et peu coûteux), d’efficacité de transformation, et de nombreux outils
génétiques sont disponibles. Par ailleurs, elles présentent l’avantage des eucaryotes en termes
de modifications post-traductionnelles et peuvent souvent sécréter les protéines. Au début de
cette thèse, seules les levures, S. cerevisiae (Bulter and Alcalde, 2003; Cherry, et al., 1999), P.
pastoris (Boettner, et al., 2002; Weis, et al., 2004) avaient été utilisées pour faire évoluer des
enzymes. Notons aussi une unique tentative avec la levure Hansenula polymorpha (Kim, et
al., 2003). Saccharomyces cerevisiae présente une efficacité de transformation élevée (jusqu’à
1013 transformants par microgramme d’ADN) ; mais elle a tendance à hyperglycosyler les
protéines (risque de non-fonctionnalité) et présente souvent des problèmes de sécrétion. P.
pastoris présente plusieurs désavantages, une faible efficacité de transformation, un fort taux
de conversion du marqueur de sélection sans intégration de la cassette d’expression (ainsi 10 à
50 % des transformants n’exprimeront pas la protéine d’intérêt à cause de la recombinaison
du marqueur de sélection seul) et un nombre de copies variable. D’autre part, la culture en
microplaque nécessite de fortes concentrations en oxygène (utilisation de microplaques à
puits profonds) et des mécanismes d’apoptose engendrent une faible reproductibilité entre les
différents puits (Weis, et al., 2004).
Un autre avantage des levures, en ce qui concerne l’évolution dirigée, est la possibilité
d’introduire de la diversité génétique directement lors des événements de recombinaison « in
vivo ». (Abecassis, et al., 2000; Cherry, et al., 1999; Pompon and Nicolas, 1989).
Conclusion :
Yarrowia lipolytica est une levure atypique. Elle présente naturellement des capacités de
sécrétion élevées et de nombreux outils génétiques sont disponibles pour l’expression de
protéines recombinantes. Ces caractéristiques en font un hôte de choix avéré dans la
production de protéines recombinantes. Cependant, à ce jour, cette levure n’a jamais été
utilisée pour réaliser de l’évolution dirigée sur une protéine. Le développement de ce système
d’expression (miniaturisation des cultures et de la production d’enzyme et optimisation de la
reproductibilité du système) sera le premier objectif de notre étude.
50
Deuxième partie
- Améliorer la thermostabilité par
ingénierie enzymatique : Approche rationnelle ou/et
évolution dirigée.
Dans les procédés industriels la thermostabilité est considérée comme un avantage sinon
comme une condition sine qua none pour qu’un procédé soit considéré comme
économiquement rentable. En effet, d’une part, en utilisant des enzymes thermostables on
réduit le « turn over – roulement » d’enzyme à utiliser permettant d’importantes économies.
D’autre part, l’utilisation d’enzymes thermostables permet de travailler à haute température et
ainsi d’augmenter la vitesse de réaction des enzymes (selon la loi d’Arrhenius la vitesse d’une
réaction est approximativement doublée par tranche de 10°C). Les hautes températures
permettent aussi d’avoir un effet bénéfique sur la viscosité, sur la solubilité des réactifs et
permettent donc de travailler à des concentrations plus élevées. De plus, le risque de
contamination biologique se trouve diminué. D’autre part, la thermostabilité s’accompagne
souvent d’une stabilité plus globale aux agents chimiques, aux oxydants ou aux solvants
organiques.
Cependant, les conditions industrielles dans lesquelles sont utilisées les enzymes sont souvent
très différentes de l’environnement dans lequel leur fonction a évolué ; une limitation majeure
de l’utilisation des enzymes dans des procédés industriels provient donc de leur faible
stabilité. De nombreuses voies ont donc été étudiées pour améliorer la thermostabilité des
enzymes, parmi elles nous citerons :
•
l’utilisation d’additifs comme des polyols (Noel, et al., 2005), des sucres (tréhalose,
saccharose, maltose…), des espèces ioniques (Ca2+, Cu2+…) ou des polymères.
Certains surfactants ont aussi des propriétés de thermostabilisation.
•
les modifications chimiques des enzymes (Longo and Combes, 1997).
•
l’immobilisation d’enzyme (Klibanov, 1989). Sur un point de vue industriel, le
bénéfice est double, l’enzyme est plus stable et peut être facilement récupérée pour
être réutilisée.
Ainsi, même si de nombreuses méthodes permettent d’avoir des effets stabilisateurs, aucune
n’a un rôle de stabilisateur universel et la stabilisation dépend d’interactions spécifiques entre
un couple enzyme/additif et doit être étudiée au cas par cas.
51
Au cours de la dernière décennie, une méthode de choix est venue compléter ce panel :
l’ingénierie enzymatique. Ce type d’approche consiste à créer des variants plus stables de
l’enzyme en utilisant les techniques du génie génétique et de la biologie moléculaire. Dans les
paragraphes suivants, nous nous bornerons à l’étude de l’ingénierie des protéines pour
améliorer les enzymes. On distingue deux grands courants dans cette approche. Le premier est
l’ingénierie des protéines par évolution rationnelle. Les modifications introduites sont ciblées
et raisonnées et se basent sur la connaissance de la structure de l’enzyme et des mécanismes
de dénaturation de celle-ci. Le deuxième est l’évolution dirigée. Cette méthode se base sur des
techniques de mutations aléatoires et de recombinaison au hasard pour créer de la diversité,
s’ensuit un crible sur la propriété à améliorer.
Avant de déterminer les paramètres responsables de la stabilité des protéines, il faut définir ce
que l’on entend exactement par thermostabilité. Ce sera l’objet du premier chapitre de cette
partie. Dans le second chapitre, nous nous intéresserons plus en détail aux bases structurales
de la stabilité des protéines et à la compréhension des mécanismes de dénaturation des
enzymes. Ceci ayant pour objectif de pouvoir améliorer par ingénierie rationnelle la
thermostabilité des protéines. Par la suite dans le dernier chapitre, nous aborderons une autre
stratégie pour améliorer la thermostabilité des enzymes: celle de l’évolution dirigée.
1. Définition de la thermostabilité :
1.1. Stabilité thermodynamique, cinétique et thermoactivité
1.1.1.
Thermostabilité thermodynamique
Lors du chauffage d’une enzyme, l’agitation des molécules et le gain d’entropie provoqué par
le chauffage conduisent à la perte d’une partie de la structure tertiaire et même secondaire de
la protéine. Les interactions non covalentes (liaisons hydrogène, interactions hydrophobes et
ioniques et les forces de van der Walls) qui maintiennent la structure native de la protéine sont
d’abord affaiblies puis cassées, détruites par l’augmentation de la température (Creighton,
1983) ; l’enzyme est alors dénaturée au moins partiellement. Les modifications au niveau du
site actif de l’enzyme qui accompagnent cette étape provoquent une inactivation de l’enzyme
(Figure I-4).
52
k1
k-1
N
U
Figure I-4 : Représentation schématique de l’inactivation réversible (première étape de
l’inactivation irréversible) d’une enzyme. La région enflée, gonflée en gras représente le site actif de
l’enzyme d’après Volkin et Klibanov (1989)
Ce processus est totalement réversible : après un refroidissement rapide de l’enzyme,
l’activité enzymatique ainsi que la conformation native de celle-ci sont totalement restaurées.
Cette dénaturation réversible est la première étape dans le processus d’inactivation. On parle
de thermostabilité thermodynamique, plus la protéine sera stable thermodynamiquement plus
il faudra des conditions drastiques (temps- température) pour que celle-ci passe à l’état déplié.
Par la suite pour qualifier une protéine réversiblement dénaturée, nous emploierons le terme
protéine ou enzyme dépliée.
La stabilité thermodynamique d’une protéine est mesurée par la variation d’énergie libre de
Gibbs entre la forme native et la forme dépliée (∆GU). Plus ∆GU est grand plus la protéine
sera stable thermodynamiquement. En outre, ∆GU = -RT ln KU avec KU= k-1/k1 la constante
d’inactivation globale caractérisée par les constantes de vitesse de dépliement k1 et de
repliement k-1. La stabilité thermodynamique d’une protéine dépendra donc des constantes de
dépliement et de repliement de la protéine. D’autre part ∆G = ∆H -T∆S ou ∆H est la variation
d’enthalpie et ∆S la variation d’entropie entre les états natifs et dénaturés de la protéine. La
stabilité thermodynamique d’une protéine est donc mesurée à la fois par des contributions
enthalpiques et par des contributions entropiques.
1.1.2.
Thermostabilité cinétique
Si le chauffage de l’enzyme est prolongé, une fraction de l’activité enzymatique n’est pas
restaurée après refroidissement indiquant qu’un autre processus, irréversible celui-ci, a eu
lieu. Ainsi le phénomène global d’inactivation peut se décrire selon le schéma classique de
Lumry et Eyring (1954) :
k1
N
k2
U
I
k-1
53
où N est l’enzyme native catalytiquement active, U la forme réversiblement dénaturée
(enzyme dépliée) et I la forme dénaturée irréversiblement. Il est à noter que par des étapes de
renaturation (hautes concentrations en dénaturant comme urée et guanidine et dans le cas
d’échange de ponts disulfure étapes de réductions puis d’oxydation), il est souvent possible
(mais pas toujours) de restaurer l’activité catalytique d’une enzyme. Ce type de dénaturation
est tout de même par définition une dénaturation irréversible car le refroidissement seul de
l’enzyme ne permet pas de retrouver une activité catalytique (Ahern and Klibanov, 1988).
Les mécanismes intervenant dans la dénaturation irréversible sont présentés de façon
schématique dans la Figure I-5 et seront approfondis dans le paragraphe 2.3 de cette partie.
Agrégation
Modifications irréversibles
de l’enzyme
Renaturation possible
N
Echange de ponts
disulfures
intermoléculaires
Modifications structurales non
covalentes de l’enzyme
Modifications covalentes échange de
ponts disulfures de l’enzyme
U
Modifications irréversibles
de l’enzyme
Renaturation impossible
Enzyme coupée ou dont les
acides aminés ont été modifiés
Figure I-5 : Mécanismes intervenant dans la dénaturation irréversible des protéines
d’après Ahern et Klibanov (1988).
Pour la plupart des enzymes industrielles le seul paramètre pertinent et évaluable est la
thermostabilité cinétique (Eijsink, et al., 2004), c’est à dire que l’enzyme doit avoir une durée
de vie assez longue pour réaliser la réaction voulue dans un environnement donné. Mais
seulement 6 % des études sur la stabilité des protéines mesurent cette thermostabilité
cinétique (Polizzi, et al., 2007).
La relation entre thermostabilité et activité à haute température est une autre question
intéressante. Beaucoup d’enzymes stabilisées par évolution dirigée ont un optimum de
température amélioré mais pas toutes. Donc améliorer la stabilité n’est pas une garantie pour
améliorer la thermoactivité d’une enzyme même si c’est un pré-requis.
54
1.2. Comment détermine-t-on la thermostabilité ?
La dénaturation réversible caractéristique de la thermostabilité thermodynamique peut être
mesurée par :
- l’énergie libre de Gibbs de dénaturation (∆GU) et les facteurs enthalpiques et entropiques
qui la composent : ∆GU = ∆HU -T∆SU
- une constante d’inactivation d’équilibre KU caractérisée par les constante de vitesse de
dénaturation k1 et de renaturation k-1 avec KU = k-1/k1 et ∆G = -RTln KU
- la température de fusion de la protéine Tm (∆G = 0)
Les méthodes pour mesurer la thermostabilité thermodynamique sont la calorimétrie
différentielle à balayage, le dichroïsme circulaire, la fluorescence des tryptophanes ou des
changements dans l’absorbance des tyrosines. Les méthodes spectrales permettent une
caractérisation plus fine des modifications qui ont lieu au niveau de la perte de structure.
La stabilité cinétique mesure la dénaturation irréversible des protéines, elle est fonction du
temps où une protéine reste active jusqu’à ce qu’elle se dénature irréversiblement. Les
paramètres servant à quantifier la thermostabilité cinétique, sont :
- le temps de demi-vie de l’enzyme à une température donnée (le temps nécessaire à ce que
l’activité de l’enzyme soit divisée par deux à température donnée).
- une constante de vitesse d’inactivation kdobs qui mesure l’inactivation totale de la protéine
observée :
N
I
- la température de demi -vie T50 à laquelle pour un temps donné l’activité de l’enzyme est
divisée par deux.
Les mesures de stabilité cinétique sont souvent basées sur des mesures de l’activité
enzymatique.
2. Comprendre pour améliorer ou ingénierie rationnelle
Nous avons vu dans le chapitre précédent deux types de thermostabilité, la thermostabilité
thermodynamique et la thermostabilité cinétique. Nous verrons comment rationnellement, à
partir de la connaissance de la structure de l’enzyme et des mécanismes de dénaturation de
55
celle-ci, on peut améliorer ces deux types de thermostabilité. Les processus de dénaturation
ont souvent un caractère local. De ce fait les modifications introduites n’amélioreront la
thermostabilité que si elles affectent les régions des protéines qui sont soumises à ces
processus de dénaturation. Pour notre étude, nous nous baserons sur les mécanismes de
dénaturation décrits dans le précédent chapitre ainsi que sur les caractéristiques structurales
d’enzyme issues des organismes thermophiles. Cette dernière approche est très largement
décrite dans la littérature pour déterminer les caractéristiques structurales qui expliquent la
thermostabilité de ces protéines.
2.1. Apprendre des thermophiles
2.1.1.
Les thermophiles
Les enzymes issues d’organismes thermophiles (ou hyperthermophiles) sont plus stables que
les protéines thermophiles à haute température, c’est à dire moins susceptibles de se déplier,
plus résistantes à l’inactivation irréversible, et plus actives à hautes températures. Leur
stabilité est à la fois thermodynamique et cinétique
2.1.2.
Les bases moléculaires impliquées dans la stabilité des thermophiles
Les bases de la thermostabilité des protéines thermophiles sont variées et dépendent de
l’enzyme étudiée. Cependant des caractéristiques structurales communes ont été identifiées
pour expliquer la thermostabilité des thermophiles (revu dans Sterner et Liebl 2001 et Vieille
et Zeikus, 2001). Parmi elles, on retrouve presque toujours la stabilisation des α-hélices,
l’augmentation du nombre de prolines et d’acides aminés β branchés (diminuant l’entropie de
l’état déplié), une diminution dans le nombre de résidu polaire non chargé : Gln- Asn- ThrSer (évitant la dégradation de la chaîne polypeptidique à haute température), un nombre plus
élevé d’interactions électrostatiques et leur optimisation (pont salin) ceci allant de pair avec
une augmentation des acides aminés Glu-Lys-Arg. D’autres explications comme
l’augmentation du nombre de liaisons hydrogène, des interactions hydrophobes améliorées,
des surfaces améliorées, de plus petits volumes, un raccourcissement de la chaîne
polypeptidique, de plus petites cavités avec une meilleure compacité « packing », un état
d’oligomérisation plus élevé ont aussi été avancées, mais ces caractéristiques ne sont pas
uniformément retrouvées au sein des différentes familles de thermophiles.
56
Nous noterons tout de même, que chaque organisme thermophile possède des stratégies de
stabilisation qui lui sont propres et que souvent plusieurs stratégies sont utilisées au sein d’une
même protéine. On peut aussi souligner que les organismes thermophiles possèdent des
systèmes de réparations de protéines plus développés que les organismes mésophiles
(chaperonnes – enzyme de réparation) qui engendrent une plus grande thermostabilité. Nous
ne nous intéressons pas à cet aspect de la thermostabilité car celui-ci ne présente aucun intérêt
pour la stabilité intrinsèque des protéines.
Dans le prochain chapitre, nous tenterons de comprendre comment ces particularités
structurales stabilisent les protéines. Nous ne dresserons pas une liste exhaustive des stratégies
utilisées mais nous détaillerons les stratégies de stabilisation les plus fréquemment retrouvées
dans la littérature. Nous diviserons notre étude en deux parties, les modifications structurales
améliorant la stabilité thermodynamique de l’enzyme et celles liées aux altérations chimiques
irréversibles intervenant dans la dénaturation des protéines.
2.2. Améliorer la stabilité thermodynamique de protéines
k1
Rappelons le modèle :
N
U
k-1
Ainsi pour stabiliser (thermodynamiquement) une enzyme on pourra stabiliser l’état natif,
déstabiliser l’état déplié (∆GU sera augmenté) ou jouer sur les cinétiques de dépliement
repliement k1 et k-1. Les formes natives des protéines sont généralement plus stables de
seulement 5 à 10 kcal/mol par rapport aux protéines dépliées. Ce faible gain de stabilité est le
résultat d’importantes forces de stabilisation et de déstabilisation des protéines. La plus
grande force déstabilisatrice étant l’entropie conformationnelle.
La stabilité dépendant des contributions enthalpiques et entropiques (∆GU = ∆HU-T∆SU), il
y a donc 2 façons pour stabiliser une protéine par voie enthalpique (augmenter ∆HU) ou/et par
voie entropique (diminuer ∆SU). Pour schématiser, la stabilisation par voie entropique jouera
sur la structure conformationnelle de la protéine (rigidification) et sur l’effet hydrophobe. La
stabilisation par voie enthalpique (ce qui correspond aux énergies de liaisons) consiste à
ajouter des interactions favorables contribuant à la stabilité de la protéine comme des liaisons
hydrogène, des interactions électrostatiques et de van der Walls (cf. Figure I-6).
57
Figure I-6 : Quelques déterminants moléculaires impliqués dans la stabilisation des
protéines
Il faut garder en mémoire cependant que toute modification de la structure de l’enzyme aura
des répercussions à la fois sur l’entropie et sur l’enthalpie de la protéine (native mais aussi
dépliée). Ainsi le gain en stabilité met en jeu un équilibre complexe entre les forces de
stabilisation et de déstabilisation enthalpiques et entropiques amenées par la modification de
structure à la fois dans l’état natif mais aussi dans l’état déplié de la protéine.
2.2.1.
Réduire l’entropie de l’état dénaturé
Glycine et proline
Lorsque la protéine est dépliée, la glycine (Gly), qui ne possède pas de carbone β, est l’acide
aminé qui a la plus forte entropie : dans le processus de repliement de la protéine, il faut plus
d’énergie pour restreindre la configuration de Gly que pour aucun autre résidu. Au contraire la
proline (Pro) est l’acide aminé qui a l’entropie la plus faible : avec son cycle pyrolidine, cet
acide aminé peut seulement adopter un nombre limité de conformations. De ce fait les
mutations Gly → X et X →Pro (X étant n’importe quel acide aminé) diminuent l’entropie de
la forme dépliée de la protéine et diminuent ∆SU. Cette diminution va de pair avec une
augmentation de la thermostabilité (augmentation de ∆GU). Il faut cependant vérifier que les
mutations introduites n’introduisent pas de contraintes stériques nouvelles à la protéine. Cette
technique a été utilisée pour améliorer la thermostabilité de nombreuses protéines. Ainsi, les
mutants G77A et A82P du lyzosyme t4 présentent une thermostabilité améliorée par rapport à
l’enzyme sauvage (Matthews, et al., 1987) De même, chez une oligo-1,6 glycosidase de
58
Bacillus cereus 9 résidus ont été remplacés par des prolines, pour chaque proline ajoutée la
thermostabilité a été améliorée, et les mutations ont eu un effet additif sur la thermostabilité.
(Watanabe, et al., 1994).
Ponts disulfures
L’introduction des ponts disulfures dans la protéine a très souvent un effet positif sur la
thermostabilité de la protéine par un effet entropique. En effet, lors de la dénaturation
thermique les ponts disulfures diminuent l’entropie de l’état dénaturé. De très nombreux
exemples existent dans la littérature (Li, et al., 1998; Matsumura, et al., 1989; Yang, et al.,
2007). Ainsi le Tm de la lipase de Penicillium camembertii a été amélioré de 12°C par
introduction d’un pont disulfure. Le positionnement du pont disulfure a été déterminé par
homologie avec la lipase thermostable de Thermomyces lanuginosa (Yamaguchi, et al., 1996)
(voir Figure I-7). Nous verrons dans le chapitre suivant que les ponts disulfures, sont aussi
largement impliqués dans la stabilité cinétique des enzymes.
Figure I-7: Représentation schématique en ruban des lipases de P. camembertii (A) et
H. lanuginosa (B). d’après Yamaguchi et al. (1996) Les résidus du site actif et les ponts disulfures
sont identifiés et schématisés par des balles.
2.2.2.
Effet hydrophobe
Hydrophobicité et hydratation de la protéine.
Une molécule hydrophobe est non polaire et est incapable de réaliser des liaisons hydrogène,
notamment avec l’eau. Ainsi, lorsqu’un acide aminé hydrophobe entre dans le réseau de
liaisons hydrogène de l'eau, elle va le rompre localement. Ce réseau va se reconstituer en se
59
séparant des molécules hydrophobes qui vont avoir tendance à se regrouper entre elles pour
diminuer la surface de contact avec l’eau : c'est l'interaction hydrophobe. Les molécules
hydrophobes, formeront alors une phase distincte de l’eau. Ce phénomène est responsable de
la structure globulaire des protéines solubles. Ainsi, lors du repliement des protéines, les
acides aminés hydrophobes ont tendance à éviter l'eau et à se regrouper entre eux au centre de
la molécule, formant un cœur hydrophobe. Inversement les résidus polaires vont chercher à
réaliser des interactions avec le solvant aqueux et resteront en surface. L’effet hydrophobe est
donc un des moteurs dans le repliement des protéines et l’acquisition de leur structure 3D
mais c’est aussi un des éléments déterminant dans la stabilité des enzymes (Pack and Yoo,
2005). Pour améliorer la stabilité via l’effet hydrophobe, deux grandes stratégies sont
possibles : dans tous les cas, il s’agit de diminuer les surfaces de contact entre l’eau et les
résidus hydrophobes.
-diminuer l’hydrophobicité à l’extérieur de la molécule : La diminution des surfaces
hydrophobes accessibles au solvant est la base de la thermostabilité de certains organismes
thermophiles. Ainsi, Delbonni et al. ont comparé la structure d’une triosephosphate isomerase
de Bacillus stearothermophilus (thermophile) à six autres structures de triosephosphate
isomerase (Delboni, et al., 1995). Parmi les différents facteurs structuraux mis en jeu, le gain
de thermostabilité le plus important est attribué à la stabilisation hydrophobe réalisée par la
formation d’un dimère qui enfouit la plus grande partie de la surface hydrophobe accessible
au solvant. Ainsi, la dimérisation est une voie de thermostabilisation suivie par d’autres
enzymes thermophiles (Byun, et al., 2007).
-augmenter l’hydrophobicité à l’intérieur de la molécule : L’hydrophobicité d’une
protéine est exprimée comme le ratio de la surface enfouie non polaire sur la surface totale
non polaire de la protéine. Ainsi, un lien direct entre thermostabilité et hydrophobicité a été
mis en évidence (Pace, 1992) : pour chaque groupe méthyle introduit dans une protéine le
gain en stabilité est de 1,3 (+/- 0,5) kcal/mol en moyenne. Souvent, cependant, le gain en
thermostabilité peut être moindre si les résidus insérés introduisent aussi des contraintes
stériques qui ont un effet négatif sur la thermostabilité (Eijsink, et al., 1992).
L’augmentation de la densité hydrophobe « hydrophobic packing » au cœur de la protéine,
passe aussi par la suppression de cavités non nécessaires à l’activité enzymatique dans la
protéine qui s’accompagne d’une disparition des molécules d’eau, et d’une augmentation des
interactions hydrophobes, ainsi, la stabilité des protéines est améliorée. A partir de la structure
de la protéine, il est possible de localiser la présence de ces cavités et de les modifier par
60
mutagenèse dirigée (Vriend, et al., 1991). Ainsi, le Tm de 2 mutants de la ribonucléase HI de
E.coli a ainsi été amélioré de 2,1°C (mutant V74L) et 3,7°C (mutant V74I) par remplissage
des cavités avec des résidus hydrophobes (Ishikawa, et al., 1993)
Entropie , hydratation et effet hydrophobe
Pour comprendre comment l’effet hydrophobe peut influencer la stabilité d’une protéine, il
faut tenir compte d’un facteur souvent oublié, l’hydratation de la protéine. D’un point de vue
thermodynamique, la variation d’entropie totale ∆S, lors de la dénaturation est en fait la
résultante de l’entropie dite conformationnelle ∆Sconf et de l’entropie d’hydratation de la
molécule ∆S hydr. (Makhatadze and Privalov, 1996). Lors d’une dénaturation réversible,
l’entropie conformationnelle de l’état déplié est plus grande que celle de l’état natif de la
protéine plus compact et qui possède un espace conformationnel restreint. ∆Sconf est donc
positif et stabilise l’état déplié. Par contre l’entropie d’hydratation stabilise l’état natif. En
effet, ne pouvant former de liaisons hydrogène avec les résidus hydrophobes, les molécules
d’eau s’organisent autour des groupements hydrophobes pour former des cages de solvatation
(structures en clathrate). Cette organisation réduit le désordre. Ces interactions sont bien plus
fortes dans l’état déplié de la protéine (entropie plus faible) car les groupements hydrophobes
sont exposés. Ainsi, si on mute un résidu en remplaçant une molécule d’eau par un résidu
hydrophobe, la disparition des molécules d’eau (organisées) dans les cavités des protéines, ou
à l’interface de la protéine (par diminution surfaces hydrophobes accessibles au solvant)
conduit donc à une augmentation de l’entropie de la structure native et une stabilisation de la
protéine (∆GU). Ce qui a pour conséquence, en l’absence de toute autre contribution d’origine
enthalpique, d’augmenter la stabilité de la protéine. La stabilisation des protéines via l’effet
hydrophobe est donc principalement d’origine entropique. Le rôle de l’eau dans ce cadre est
donc un élément primordial dans la stabilité des protéines (Pechkova, et al., 2007; Vriend, et
al., 1991).
2.2.3.
Effet enthalpique : les interactions électrostatiques
Parmi les différents facteurs établis par Querol et al. (1996) pour expliquer les gains de
thermostabilité thermodynamique des protéines, Vogt et al. (1997) mettent en évidence que la
majorité d’entre elles sont dues au moins en partie à des interactions électrostatiques (liaisons
hydrogène, ponts salins…) (cf. Tableau I-5)
61
Tableau I-5 : Explications trouvées dans la littérature pour l’augmentation de la
thermostabilité de différentes protéines d’après Vogt et al (1997)
Il existe 3 grands types d’interactions électrostatiques qui peuvent contribuer à la stabilité de
la structure de la protéine :
-
Les interactions charge-charge sont des interactions longue distance qui ont lieu entre
des groupes chargés de charges inverses (Lys Arg NH3+ / Asp Glu COO-) même si ils
sont distants de plusieurs angströms. Ce type d’interaction est appelé pont salin.
-
Les interactions charge-dipôle quand un résidu chargé interagit avec un dipôle comme
celui d’une molécule d’eau.
-
Les interactions dipôle-dipôle : interaction entre un hydrogène et des atomes
électronégatifs comme O ou N. Ce type d’interaction est appelée liaison hydrogène.
Nous détaillerons plus particulièrement l’étude des liaisons hydrogène et des ponts salins car
ces 2 types d’interactions sont bien connus pour stabiliser la structure des protéines.
Liaisons hydrogène
Il s’agit d’une interaction électrostatique particulière (interaction dipôle-dipôle) entre
l’hydrogène et un atome électronégatif. Dans les protéines, les atomes les plus électronégatifs
sont l’azote N et l’oxygène O et les liaisons hydrogène de la plus grande importance sont
celles qui se forment entre les oxygènes des chaînes carbonées et les hydrogènes des fonctions
amides. Elles représentent 68 % des liaisons hydrogène qui sont présentes dans les protéines
62
globulaires (Stickle, et al., 1992). Dans l’état déplié, toutes les liaisons hydrogène potentielles
de la chaîne polypeptidique peuvent être satisfaites avec l’eau du solvant environnant, ce qui a
un effet stabilisateur sur la forme dépliée de la protéine. Quand la protéine est native par
contre, beaucoup de liaisons hydrogène ne sont pas satisfaites. McDonald et Thornton (1994)
ont montré que 1,3 % des groupes N-H et 1,8 % des groupes C=O, n’établissent pas de
liaisons hydrogène (sans aucune interaction pour compenser) et que 80 % des groupes
carbonyles n’établissaient pas de deuxième liaison hydrogène. Ces liaisons hydrogène non
satisfaites déstabilisent la forme native de la protéine et ainsi, toute mutation permettant
d’introduire des liaisons hydrogène aux endroits où celles-ci ne sont pas satisfaites stabilisera
la protéine. Dans cette optique, Pace et al 1996 ont tenté d’évaluer la contribution des liaisons
H à la stabilisation des protéines. Ils ont établi que chaque liaison H participait pour environ
0,6 kcal/mol à la stabilisation de la RNase T1. Cette étude prend en compte que chaque
liaison hydrogène est aussi responsable d’un enfouissement de groupes peptidiques et polaires
à l’intérieur de la protéine ce qui a un effet déstabilisateur.
Pour expliquer la thermostabilité des thermophiles, l’augmentation du nombre de liaisons
hydrogène est un facteur abondamment retrouvé dans la littérature (Pack and Yoo, 2004;
Vogt, et al., 1997). Vogt et al. (1997) ont comparé 16 familles de protéines (chaque famille
contenant des enzymes avec des stabilités différentes). Dans 80% des familles un lien a été
trouvé entre l’amélioration de la thermostabilité et le nombre de liaisons hydrogène. D’autre
part, la thermostabilité a aussi été corrélée avec une augmentation de la surface polaire de la
protéine ; ceci s’explique par une stabilisation par des liaisons hydrogène supplémentaires
avec le solvant environnant, l’eau. Ainsi, une étude récente a permis d’améliorer la
thermostabilité de la phytase d’Aspergillus niger en ajoutant des liaisons hydrogène
supplémentaires présentes chez une phytase homologue thermophile (Zhang, et al., 2007).
Les ponts salins
Dès 1975, Perutz et Raidt suggèrent que la thermostabilité des protéines peut être due à des
ponts salins à la surface des protéines. Depuis, de nombreuses études ont mis en évidence une
augmentation du nombre des ponts salins dans les protéines thermophiles par rapport à leurs
homologues mésophiles et les invoquent comme base structurale à la thermostabilité des
protéines thermophiles et hyperthermophiles (Hennig, et al., 1995; Jaenicke, 1996). Certains
auteurs soulignent l’importance du positionnement du pont salin dans la protéine : les ponts
salins situés à la surface de la protéine stabiliseraient mieux (Pack and Yoo, 2004). L’énergie
électrostatique fournie par le pont salin explique le gain de stabilité : à haute température cette
63
énergie électrostatique est plus importante que l’effet défavorable dû à la désolvatation des
résidus chargés (de Bakker, et al., 1999; Elcock, 1998). D’autre part les réseaux de ponts
salins sont énergétiquement plus favorables qu’un même nombre de ponts salins isolés. En
effet, l’énergie de désolvatation pour réaliser ces 2 ponts salins sera diminuée de moitié si un
résidu chargé participe à 2 ponts (un seul résidu ne pourra pas réaliser d’interaction avec
l’eau). Ainsi l’utilisation de réseau de pont salin est une stratégie de stabilisation des protéines
thermophiles. Un des exemples les plus marquants concerne les réseaux de ponts salins
existants chez la glutamate déhydrogénase du thermophile Pyrococcus fusorius, alors que ces
réseaux sont absents ou de moindre ampleur chez ses homologues mésophiles (Rice, et al.,
1996; Yip, et al., 1998).
2.2.4.
Autres sources de thermostabilisation
Structures secondaires
Les structures secondaires (hélices α et les brins β) stabilisent les protéines car elles sont une
mine d’interactions entre les acides aminés de la protéine ; par exemple, la majorité des
liaisons hydrogène à l’intérieur de la protéine sont satisfaites par la formation de structures
secondaires. Facchiano et al (1998) ont mis en évidence 10 facteurs de stabilisation apportés
par les hélices α dans les protéines thermophiles. L’absence de résidus β branchés (val, thr,
Ile) déstabilisant les hélices α, est le facteur communément retrouvé pour toutes les protéines
thermophiles. Les hélices α sont aussi stabilisées par l’orientation dans le même sens des
dipôles de la liaison peptidique (Richardson et Richardson 1988). Ce moment dipôlaire peut
être stabilisé par des résidus chargés négativement à l’extrémité N-terminale (Glu) de l’α
hélice et par des résidus chargés positivement (Lys) à son extrémité C terminale. Les hélices
présentant ce type de stabilisation sont retrouvées plus fréquemment chez les protéines
thermophiles par comparaison à leurs homologues mésophiles (Hennig, et al., 1995). Ainsi, il
est possible par évolution rationnelle, de jouer sur ces facteurs de stabilisation. Eijsink et al
(1992b) ont amélioré la thermostabilité d’une protéase en remplaçant des lysines
(déstabilisants) à l’extrémité N-terminale de deux hélices α par des sérines.
Stabilisation des boucles et des parties N et C terminales
Les boucles ainsi que les extrémités N et C terminales sont souvent les régions possédant les
plus hauts facteurs d’agitation thermique dans une structure. Ce sont donc les structures qui
vont se déplier en premier lors la dénaturation. Chez les protéines issues d’organismes
64
thermophiles, elles sont souvent raccourcies ou mieux ancrées au reste de la protéine et
considérées comme étant une des bases de leur thermostabilité (Van Boxstael, et al., 2003;
Yamagata, et al., 2001). Ainsi on peut améliorer la thermostabilité des protéines, en
raccourcissant des boucles flexibles (Pan, et al., 2006), la protéine (Mandrich, et al., 2005) ou
en ancrant mieux les boucles et les parties N et C terminales au reste de la protéine (Goihberg,
et al., 2007; Nagao, et al., 2000).
Thermostabilité dépendante des cations
Les métaux et le calcium sont connus pour améliorer la stabilité des enzymes possédant un
site de liaison à ces cations (Kojoh, et al., 1999; Smith, et al., 1999). Ainsi, l’introduction de
nouveaux sites de liaison ou l’amélioration des forces de liaisons existantes peut être un
moyen d’augmenter la stabilité d’enzyme. La localisation des sites à introduire est déterminée
par comparaison à des homologues de stabilité plus élevée.
Modifications post-traductionnelles
Depuis longtemps, les protéines glycosylées sont connues pour être plus solubles et plus
résistantes à la température que la forme déglycosylée (Chu, et al., 1978). En général la
glycosylation confère à la protéine une rigidité et limite la flexibilité du squelette carboné et
ce sur de larges régions (Joao and Dwek, 1993). En plus de cet effet stabilisateur, la
glycosylation peut éviter l’agrégation des protéines dépliées (dénaturation irréversible).
Aucun exemple d’amélioration de la thermostabilité par l’introduction de site de
glycosylation n’a été référencé, cependant ce phénomène a été largement vérifié par
modifications chimiques covalentes des enzymes.
2.2.5.
Conclusion
La stabilité d’une protéine résulte donc d’un équilibre complexe et délicat entre différentes
forces de stabilisation et de déstabilisation. Les incohérences que l’on peut relever dans la
littérature sur le rôle et l’importance des différents facteurs impliqués dans la thermostabilité
des protéines soulignent le fait que la stabilité résulte d’une combinaison de différentes
interactions moléculaires qui sont dosées différemment dans chaque cas étudié. Toute
modification sur la structure d’une enzyme pourra avoir des effets (positifs ou négatifs) sur
plusieurs facteurs de stabilisation à la fois ; ces effets pouvant, stabiliser ou déstabiliser la
65
protéine, s’additionner ou se contrebalancer. De ce fait il n’existe pas de mécanisme de
stabilisation universel des protéines, il faut considérer la protéine dans son ensemble.
Malgré cette complexité, on peut dégager certains traits généraux quant à la
thermostabilisation des enzymes, l’amélioration de la thermostabilité passe souvent par une
augmentation des interactions entre les résidus (liaisons hydrogène, interactions,
électrostatiques, interactions hydrophobes, liaison à des métaux ou à des cations) et par
l’acquisition d’une structure conformationnelle supérieure (plus rigide, entropie de
dénaturation diminuée, diminutions de cavités, diminution des contraintes conformationnelles,
stabilisation des hélices alpha, des boucles et des parties N et C terminales… ). Les deux
forces principales régissant la stabilité des protéines étant principalement l’effet hydrophobe
(essentiellement d’origine entropique) et les interactions électrostatiques (essentiellement
d’origine enthalpiques).
2.3. Les mécanismes impliqués dans la dénaturation irréversible des
protéines
En 1985, Ahern et Klibanov (Ahern and Klibanov, 1985) mettent en évidence certains
mécanismes de la dénaturation irréversible du lysozyme de blanc d’œuf : la déamidation des
résidus asparagine et/ou glutamine, l’hydrolyse des liaisons peptidiques au niveau des
résidus acide aspartique, la destruction des ponts disulfures et la formation de structures
incorrectes (« scrambled » ou « mélangées »). Leurs contributions relatives dépendent du pH
et de la protéine (Tableau I-6). De même en 1986, une étude similaire est réalisée par la même
équipe sur la ribonucléase pancréatique bovine pour vérifier si les mécanismes identifiés
étaient généralisables à d’autres enzymes (Zale and Klibanov, 1986). Les mêmes mécanismes
sont responsables de la dénaturation irréversible de ces deux enzymes. Dans les prochains
paragraphes, nous caractériserons plus en détail ces mécanismes ainsi qu’un autre mécanisme
très important dans la dénaturation irréversible : l’agrégation.
D’autres types de réactions irréversibles moins courantes peuvent avoir lieu dans les
protéines. Nous ne les détaillerons pas mais en voici une liste. Les méthionines peuvent être
oxydées en sulfoxide et certains résidus (Asp et Ser en particulier) peuvent être racémisés en
leur forme D. La lysine, si elle est chauffée en présence de sucres réducteurs, peut réagir via
des réactions de Maillard.
66
Tableau I-6 : Mécanismes intervenant dans la thermoinactivation irréversible de deux enzymes
(Volkin and Klibanov, 1992).
-1
Inactivation thermique irréversible de 2 protéines modèles
Mesure directe du processus entier :
Lysozyme de
Mécanismes individuels:
blanc d’œuf de
-Déamidation des résidus Asn/Gln
poule 100°C
-Hydrolyse de la liaison peptidique Asp-X
(Ahern et
-Destruction des résidus cystéines
Klibanov, 1985)
-Formation de structure incorrectes
Mesure directe du processus entier :
Ribonucléase
Mécanismes individuels:
pancréatique
-Déamidation des résidus Asn/Gln
bovine 90°C
-Hydrolyse de la liaison peptidique Asp-X
(Zale et
-Destruction des résidus cystéines
Klibanov, 1986)
-Formation de structure incorrectes (interchange ponts disulfures)
2.3.1.
Vitesses (h )
pH4
pH6
pH8
0,49
4,1
50
0,45
0,12
4,1
18
6
32
0,13
0,56
23,4
0,02
0,10
0,15
0,8
0,05
0,31
2,8
19,4
L’agrégation
L’agrégation est un terme qui regroupe plusieurs types d’interaction. Les agrégats proviennent
de différents mécanismes de dénaturation et sont de natures diverses (covalents ou non
covalents, solubles ou non solubles). Lorsque les protéines sont chauffées, elles commencent
par se déplier. Les résidus hydrophobes normalement enfouis sont alors exposés au solvant
aqueux. Pour minimiser cette exposition défavorable des résidus hydrophobes avec l’eau, les
régions hydrophobes ont tendance à se regrouper, à s’agréger. Une fois agrégée si le
chauffage continue, d’autres réactions chimiques peuvent avoir lieu, comme l’échange de
ponts disulfures intermoléculaires.
2.3.2.
L’hydrolyse des liaisons peptidiques au niveau des résidus acides
aspartiques
L’hydrolyse des liaisons peptidiques, a lieu le plus souvent du côté N terminal de l’acide
aspartique, la liaison Asp-Pro étant particulièrement labile (Marcus, 1985). Le remplacement
des résidus acides aspartique par mutagenèse dirigée est une stratégie employée pour
améliorer la stabilité des protéines(George-Nascimento, et al., 1990).
2.3.3.
La déamidation des glutamines et des asparagines :
De nombreuses études mettent en évidence la déamidation des résidus asparagine et
glutamine dans les protéines. Ce phénomène est quantifié par le dosage de l’ammoniac libéré.
Il est à noter que deux études comparant la composition en acides aminés de protéines
mésophiles et thermophiles mettent en évidence la plus faible proportion de glutamine et
67
d’asparagines dans les protéines issues d’organismes thermophiles (Haney, et al., 1999;
Vieille and Zeikus, 2001). Ce mécanisme est connu depuis longtemps. Dès la fin des années
1980, des expériences de mutagenèse dirigée (Ahern, et al., 1987; Ahern and Klibanov, 1988;
Casal, et al., 1987) visant au remplacement de deux asparagines dans la triosephosphate de
Saccharromyces cerevisiae ont permis de doubler le temps de demi-vie de cette enzyme à
100°C.
2.3.4.
La β-élimination des ponts disulfures, destruction des cystéines et
interchange de ponts disulfures
β-élimination et destruction des résidus cystéines
La réaction (catalysée par une base) consiste en l’enlèvement d’un proton en position β par
rapport à une liaison S-S et conduit au clivage du pont disulfure et à la formation de
dehydroalanine et de thiocystéine. La déhydroalanine peut alors réagir avec le groupement
amine d’une lysine pour former la lysinoalanine avec un nouveau pont intramoléculaire. La
thiocystéine relativement instable peut continuer à se dégrader pour former des ions
hydrosulfides (HS-) et du souffre, (Florence, 1980; Whitaker and Feeney, 1983). Ces
mécanismes sont responsables de la destruction des résidus cystéine au sein de la protéine (cf.
Figure I-8)
Figure I-8 : β -élimination catalysée par une base d’après Volkin et al. (1997)
Interchange de ponts disulfures
Les nouveaux thiols générés par ce procédé favorisent l’interchange de ponts disulfures (cf.
Figure I-9). Dès 1955, Ryle et Sanger découvrent que à pH neutre et alcalin, à 35°C, de petits
68
peptides peuvent réaliser des échanges de ponts disulfure, cette réaction étant catalysée par
des thiols (Ryle and Sanger, 1955). D’autre part, les protéines peuvent aussi contenir des
groupements sulfhydryl (cystéine libre) qui lors de la dénaturation thermique peuvent devenir
réactifs.
Figure I-9 : Interchange de pont disulfure catalysé par un thiol d’après Volkin et al. (1997)
Cette réaction est initiée par une attaque nucléophile d’un ion thiolate sur une liaison S-S
existante et conduit au ré-arrangement des ponts disulfures au sein de la protéine. Ainsi cette
réaction est rapide à pH alcalin (car le pKa du thiol des cystéines dans les protéines est
d’environ 8 à 9,5) et n’existe pratiquement plus à pH acide (le temps de demi-destruction des
ponts disulfures à 100°C sont de 5,6 et 6,1 jours pour la ribonucléase et l’inuline à pH 4).
Volkin et Klibanov (1987) ont analysé 12 protéines différentes et ont montré que tous les
ponts disulfures de toutes les protéines analysées présentent la même stabilité quant à ce
processus de destruction des cystéines.
Thiol acide et pKa (Gilbert, 1990)
Effet sur le nucléophile
Le pKa des groupements thiols libres des cystéines se situe généralement entre 8 et 9,5, il
dépend cependant de l’environnement local du thiol dans la structure de la protéine, et si des
charges positives à proximité viennent stabiliser le thiolate il peut atteindre des valeurs très
basses jusqu’à 5,5 pour le thiol de la lipoamide dehydrogénase (Matthews and Williams,
1976). L’effet du changement de pKa sur la concentration de l’ion thiolate et sur la réactivité
de celui-ci a des effets opposés. En effet plus le pKa de l’ion thiolate sera petit, plus la
proportion d’ion thiolate sera importante à pH acide. Cependant un pKa plus faible signifie
aussi un thiol moins basique donc moins nucléophile et moins réactif.
Effet sur le groupe partant
Autant une diminution du pKa aura un effet limité sur l’augmentation de la réactivité du thiol
en tant que nucléophile, autant cette diminution aura un plus large effet sur le groupe partant
lors des réarrangements des ponts disulfures et des groupements thiols. Quand un thiolate
69
attaque un pont disulfure, le thiol qui reste libre est celui avec le pKa le plus bas (le meilleur
groupement partant).
A partir de ces observations des tentatives de remplacement des cystéines libres ont été
menées afin d’améliorer la thermostabilité des protéines (Amaki, et al., 1994). Ainsi en
mutant les deux cystéines libres de deux enzymes, deux superoxydes dismutases (humaines et
bovines) (Lepock, et al., 1990) la thermostabilité de ces enzymes est améliorée et ce malgré
une diminution de la thermostabilité conformationnelle de la protéine. A noter tout de même
que les deux cystéines n’ont pas le même effet sur la thermostabilité cinétique, cela
impliquant que l’une d’entre elle est plus réactive.
Conclusion
La destruction des cystéines passe donc par deux mécanismes différents : d’abord une
β élimination et un interchange de ponts disulfures catalysé par les thiols issus de la β
élimination. On peut noter aussi que ce type de dégradation enzymatique peut avoir lieu avec
des éléments autres que la protéine native. Dans ce cas on parlera de ponts disulfures
mélangés. In vivo ce type de réaction peut être responsable de lésions. Ainsi, la formation de
ponts disulfures mélangés avec du glutathion entre les protéines du cristallin et le glutathion
est à l’origine de la cataracte humaine (Lou, 2000; Lou, 2003). Et l’interchange des ponts
disulfures entre les protéines pourrait être une des bases de la conversion de la forme normale
du prion PrPC à la forme aberrante scrapie (Welker, et al., 2001).
Ainsi, la thermostabilisation des enzymes via l’introduction de nouveaux ponts disulfures
demande à être raisonnée car même si ceux-ci améliorent la stabilité, ils peuvent aussi être la
source de réactions de type irréversible. La nature ne s’y est pas trompée, ainsi, aucune étude
n’a montré à ce jour l’utilisation des ponts disulfures comme une stratégie générale pour la
thermostabilisation des protéines thermophiles. De même, le remplacement de cystéines libres
dans de nombreuses protéines conduit à une amélioration de leur thermostabilité (Amaki, et
al., 1994; Jayat, et al., 2004).
2.3.5.
Oxydation des cystéines :
Les cystéines sont les acides aminés les plus réactifs dans les protéines. Leur autooxydation
est généralement catalysée par des ions métalliques (généralement le cuivre) qui conduit à la
formation de ponts disulfures intra ou inter moléculaires ou des produits d’oxydation (cf.
Figure I-10) comme l’acide sulfénique (R-SOH), l’acide sulfinique (R-SO2H) et l’acide
70
sulfonique (R-SO3H). Elles peuvent aussi catalyser l’interchange de ponts disulfures
conduisant à la redistribution des ponts disulfures et à d’importantes variations structurales.
Ainsi, l’inactivation irréversible de l’α-amylase est partiellement due à l’autooxydation de la
cystéine libre, cette réaction conduisant à 30% d’acide sulfénique et 70% de pont disulfures
intramoléculaires (Tomazic and Klibanov, 1988).
Figure I-10 : Conversion de la cystéine en cystine, acide sulfénique, acide sulfonique (ou acide
cystéique) d’après Volkin et al.(1997)
Il est intéressant de noter à nouveau le rôle de l’eau dans les processus de dénaturation
irréversibles. Celle-ci intervient en tant que réactif dans l’hydrolyse des liaisons peptidiques et
la déamidation, elle est aussi le médiateur de la destruction alcaline des cystines et cystéines.
De ce fait, il n’est pas étonnant que l’utilisation de solvants autre que l’eau, des solvants
organiques par exemple, et d’enzymes lyophilisées réduisent les réactions irréversibles
(Gupta, 1992). Non seulement l’absence d’eau va jouer sur la thermostabilité cinétique mais
nous avons aussi vu dans le chapitre précédent l’influence de l’eau sur la thermostabilité
thermodynamique. Ceci explique le fait que des lipases lyophilisées soient actives à 100°C
lorsqu’elles réagissent en solvant organique (Zaks and Klibanov, 1984).
2.4. Conclusion
L’évolution rationnelle a donné de bons résultats pour l’amélioration de la thermostabilité ;
dans un grand nombre de cas, la comparaison entre des enzymes thermophiles et leurs
homologues mésophiles a permis de dégager des caractéristiques structurales responsables de
la thermostabilité (plus particulièrement la thermostabilité dynamique) et de les modifier chez
les protéines mésophiles. Cependant, il est important de noter que la stabilité d’une protéine
71
est multi-factorielle, la séparation des différentes composantes est pratiquement impossible
puisque le changement d’un paramètre, fait varier invariablement les conditions pour un autre.
Ainsi, toute modification de la structure doit s’envisager comme un tout et non par petits
morceaux considérés isolément. D’autre part, les prédictions par comparaison avec des
homologues thermophiles ne sont pas toujours vérifiées expérimentalement et peu de données
existent dans la littérature lorsque ces stratégies ont échoué. De plus, même si le caractère
désiré est amélioré, on ne peut pas prédire le coût sur d’autres propriétés de l’enzyme comme
son activité ou sa sélectivité (Santarossa, et al., 2005). Ainsi, même si de nombreuses enzymes
ont pu être améliorées par l’introduction de 1 ou 2 mutations, et malgré de nombreux efforts
pour comprendre les mécanismes de stabilisation des enzymes, il n’existe pas aujourd’hui de
stratégie rationnelle universelle pour stabiliser les protéines.
Une autre stratégie pour améliorer les propriétés des enzymes est l’évolution dirigée. Cette
stratégie devient même la seule envisageable lorsqu’aucune information structurale n’est
disponible. Dans le chapitre suivant nous commencerons par introduire la notion d’évolution
dirigée et relaterons les premières expériences dans ce domaine. Puis nous nous intéresserons
aux différentes techniques pour créer de la diversité génétique et au criblage de la
thermostabilité.
3. Evolution dirigée
3.1. Définition évolution dirigée
Il est communément admis que le mécanisme de base de l’évolution des espèces est la
sélection naturelle : la sélection d’un caractère au sein d’une population est accomplie en
réponse à une pression de sélection. Pour un ensemble d’organismes présentant une diversité
génétique, celui qui possède un caractère avantageux (dans des conditions données) aura alors
plus de probabilité de survivre et donc de se reproduire (transmette le caractère). Dans la
nature, la diversité génétique passe par des mutations spontanées ou des événements de
recombinaison. L’objectif de l’évolution dirigée est de mimer le processus d’évolution
naturelle en créant de la diversité génétique dans un premier temps puis en sélectionnant les
mutants intéressants sur le caractère à améliorer.
72
Historiquement, le terme évolution dirigée a été introduit pour la première fois en 1972 par
Hansche (Francis and Hansche, 1972) qui a criblé 109 mutants spontanés d’une phosphatase
sur 100 générations de manière continue pour améliorer l’activité enzymatique. Malgré
quelques autres tentatives jusqu’au milieu des années 1980 (Matsumura and Aiba, 1985)
l’évolution dirigée n’a vraiment pris son essor que lorsque les techniques de la biologie
moléculaire et du génie génétique ont été utilisées pour créer de la diversité génétique et que
le procédé de sélection a été réalisé de manière itérative. Les pionniers dans ce domaine sont
l’équipe de F. Arnold qui a utilisé plusieurs « tours » de mutagenèse aléatoire pour améliorer
l’activité enzymatique de la subtilisine en présence de diméthylformamide (Chen and Arnold,
1993), et l’équipe de Stemmer (Stemmer, 1994) qui a introduit de la diversité à travers la
recombinaison d’enzymes améliorées par mutagénèse aléatoire .
La première étape d’une stratégie d’évolution dirigée, consiste à générer une librairie de
mutants par des méthodes de mutations ponctuelles et / ou de recombinaison génétique. Le
point essentiel ici est que la librairie de variants doit être de taille importante et que la
diversité génétique introduite doit être la plus grande et la moins biaisée possible. La
deuxième étape consiste, par des techniques à haut débit, à cribler ou sélectionner les mutants
possédant la propriété désirée. Un pré-requis à cela sera la nécessité de posséder un système
d’expression compatible (taux de transformation élevé – activité reproductible dans les
conditions du criblage- activité suffisante) : cet aspect a été traité dans la première partie. La
puissance d’une telle technique repose sur le fait que le processus est itératif, la répétition de
plusieurs tours à partir des mutants sélectionnés permettra d’améliorer à chaque tour, la
propriété de l’enzyme à faire évoluer (voir figure I-11). D’autre part, l’évolution dirigée
présente l’avantage qu’aucune connaissance de la structure ou du fonctionnement de l’enzyme
n’est nécessaire pour améliorer celle-ci.
Nous nous attacherons dans le paragraphe suivant à référencer les techniques les plus
couramment utilisées pour créer de la diversité génétique. Puis, dans une troisième partie,
nous aborderons les techniques de criblage et de sélection. Dans les deux cas nous donnerons
des exemples d’amélioration de la thermostabilité des enzymes et plus particulièrement des
lipases lorsque cela sera possible.
73
1) Génération de diversité génétique
Mutagenèse
aléatoire
Gènes parentaux
4) Itération du
processus à partir
du meilleur variant
Identification
d’un variant sur
une propriété
améliorée
Recombinaison
3) Crible
Sélection
2) Expression du
gène d’intérêt dans
un hôte approprié
Criblage
facilité
Criblage
Mise en culture,
expression et test
d’activité miniaturisés
Figure I-11 : Schéma du principe général de l’évolution dirigée
3.2. Les méthodes pour générer de la diversité génétique
Les premières méthodes utilisées pour générer de la diversité génétique consistaient à utiliser
des souches mutagènes d’E. coli (Bornscheuer, et al., 1998; Coia, et al., 2001; Henke and
Bornscheuer, 1999; Lu, et al., 2001; Selifonova, et al., 2001) ou bien d’endommager l’ADN
en l’exposant aux UV ou à des agents chimiques mutagènes (hydroxylamine, acide nitreux,
sodium bisulfite, …) (Botstein and Shortle, 1985; Shortle and Botstein, 1983). Ces techniques
sont encore utilisées mais comme il n’est pas facile de contrôler de tels processus,
aujourd’hui, on a majoritairement recours aux techniques de biologie moléculaire. Parmi les
techniques génétiques modernes pour générer de la diversité, on peut discerner 2 grands types
de méthodes. Premièrement, il existe des méthodes basées sur des mutations ponctuelles, des
insertions ou des délétions (les mutations pouvant se faire au hasard ou être ciblées sur des
régions précises du gène d’intérêt), et celles basées sur la recombinaison génétique (avec ou
74
sans homologie de séquence). Ces méthodes sont largement décrites dans la littérature et la
figure I-12 donne un aperçu des différentes techniques existantes.
Mutagénèse aléatoire
Recombinaison
Homologue
• Mutagénèse chimique
Non Homologue
• Irradiation UV
• DNA shuffling
•Souche mutagène
• Familly shuffling
• ITCHY
thioITCHY
SCRATCHY
• Error prone PCR
• RACHITT
• SHIPREC
• RID
• RPR
• Mutagénèse de saturation
• StEp
Figure I-12 : Schéma récapitulant les techniques décrites dans ce manuscrit pour introduire de
la diversité génétique.
3.2.1.
a)
Techniques de mutagenèse
PCR à erreurs
Leung et al., en 1989, ont développé une méthode pour la mutagenèse d’un fragment d’ADN
par PCR (Polymérase Chain Reaction). Cette méthode nommée PCR à erreurs a été par la
suite améliorée par Cadwell et Joyce (Cadwell and Joyce, 1992). La technique consiste à
réaliser une PCR sur le gène d’intérêt en utilisant une polymérase peu fidèle. Pour augmenter
le taux d’erreur des polymérases, une des méthodes consiste à ajouter de petites quantités de
MnCl2 et d’augmenter la concentration en MgCl2 (stabilise les bases non complémentaires) et
d’introduire les dNTP en proportions différentes. Communément la Taq polymérase est
utilisée à cause de son fort taux d’erreur naturel. Cette technique est l’une des plus utilisées
car facile à mettre en œuvre. Des kits commerciaux existent (Diversify PCR random
mutagenesis kit de chez Clontech et GeneMorph system de chez Stratagène). Sa limitation
principale réside dans le fait qu’il n’est pas possible d’obtenir une librairie idéale avec cette
75
méthode : c'est-à-dire une librairie où toutes les mutations possibles seraient représentées de
manière égale car de nombreux biais sont introduits :
- un biais introduit par la polymérase : Selon la polymérase utilisée certains types d’erreurs
seront plus probables que d’autres (caractéristiques inhérentes à la polymérase) ce qui va
causer un biais dans la composition de la librairie. Par exemple, la Taq polymérase introduira
préférentiellement des mutations des bases A et T, plutôt que les bases G et C. D’autre part,
les mutations les plus souvent observées sont des transitions et non des transversions. Les
conditions d’utilisation des polymérases auront aussi une influence sur le biais introduit
(Cadwell and Joyce, 1992). Ainsi en jouant sur les conditions d’utilisation et en combinant
différentes polymérases, on peut essayer d’amenuiser ce type de biais. Par exemple le kit
Genemorph 2 de chez Statagène utilise la combinaison de 2 enzymes : un mutant de la Taq
polymérase moins fidèle que la Taq native et Mutazyme une polymérase présentant un biais
inverse à celui de la taq (G et C plutôt que A et T)
- un biais introduit par l’amplification : Ce biais de mutation apparaît lorsqu’on utilise
l’amplification de l’ADN par PCR. Si une mutation se produit dans les premiers cycles
d’amplification alors elle sera sur-représentée dans le mélange final. Un des moyens pour
diminuer ce biais est de réaliser plusieurs PCR indépendantes sur le même fragment d’ADN
et de les mélanger pour construire la librairie finale, de diminuer le nombre de cycles par PCR
et de jouer sur la concentration de la matrice initiale.
- un biais dit biais de codon dû à la nature du code génétique : Il existe un deuxième biais
introduit par les codons qui découle du code génétique. En effet à partir d’un acide aminé
codé par un codon, il est peu probable d’obtenir tous les autres acides aminés. Ainsi, pour une
alanine codée par GCC, avec une mutation sur le codon à n’importe quelle position on pourra
obtenir seulement 6 acides aminés différents (Thr, Ser, Pro, Asp, Val, Gly). Pour que tous les
acides aminés soient représentés, il faudrait que 2 (Phe, Leu, Ile, Tyr, His, Asn, Glu, Cys,
Arg) ou même 3 (Tryp, Met, Lys, Gln) mutations ponctuelles aient lieu sur le même codon
(probabilité quasi nulle). S’il est possible de jouer sur le biais introduit par les polymérases et
sur celui introduit par l’amplification, il n’est en revanche pas possible de moduler celuiinhérent au code génétique. Ainsi, l’obtention d’une librairie idéale où toutes les mutations
potentielles seraient également représentées est impossible.
Autant les biais introduits par la polymérase et par le système d’amplification par PCR
peuvent être diminués par les techniques que nous venons de décrire, autant, il n’est pas
76
possible en utilisant la PCR à erreurs de diminuer le biais dû au code génétique. Pour avoir
accès au 20 acides aminés à une position donnée : la mutagénèse de saturation sera utilisée.
Malgré cela la PCR à erreurs reste une technique de choix pour faire évoluer les enzymes,
nous citerons le cas de la lipase de Bacillus subtilis qui, après deux tours d’évolution dirigée
et trois mutations ponctuelles a vu sa demi-vie multipliée 300 fois par rapport à l’enzyme
sauvage (Acharya, et al., 2004).
b)
La mutagénèse de saturation
Cette technique consiste à amplifier le gène d’intérêt à partir d’un oligonucléotide contenant
un codon dégénéré à une position déterminée. L’ADN synthétique est randomisé à certaines
positions et est ensuite incorporé au gène cible (Myers, et al., 1985; Wells, et al., 1985). Deux
éléments sont à prendre en compte dans cette technique : premièrement la randomisation de la
séquence et deuxièmement la méthode d’insertion de l’oligonucléotide synthétique.
Synthèse d’oligonucléotide : La synthèse d’oligonucléotide dégénéré peut être commandée à
de nombreux fournisseurs. On notera que si un codon est totalement randomisé, certains
acides aminés seront sur-représentés : on aura un total de 64 séquences pour 20 acides aminés,
ce qui introduira un biais. Des techniques existent pour limiter ce biais (voir Figure I-13)
A
B
3’
A, T, C, G
N
A, T, C, G
NN
A, T, C, G
NNN
C
3’
G, T
3’
Ala
Cys
Asp
.
.
.
Trp
G/T
A, T, C, G
NG/T
Ala
Cys
Asp
A, T, C, G
Trp
NNG/T
.
.
.
64 séquences
32 séquences
20 séquences
20 acides aminés
20 acides aminés
20 acides aminés
3 codons STOP
1 codon STOP
Pas de codon STOP
Figure I-13 : Méthodes pour randomiser l’ADN synthétique d’après revue de Neylon (2004) A)
Ajout à l’extrémité 3’ des 4 oligonucléotides aux 3 positions. NNN ; B) Ajout à l’extrémité 3’ des
nucléotides G et T en position 3’ puis les 4 autres nucléotides aux 2 autres positions : NNG/T C)
Utilisation d’un mélange de chacun des codons codant pour chaque acide aminé.
Introduction de l’ADN : L’utilisation d’ADN synthétique comme oligonucléotide requiert
un passage par une amplification, le problème du biais d’amplification se pose donc aussi.
Mais, un autre problème de biais vient s’ajouter : les séquences qui ressembleront le plus à
77
l’ADN matrice s’hybrideront plus facilement limitant ainsi la diversité introduite par cette
méthode. L’utilisation d’oligonucléotide qui possède une taille suffisante d’hybridation
complète à ses extrémités, ou l’utilisation de nucléotide de composition particulière
(Airaksinen and Hovi, 1998) peut réduire cet effet. L’introduction d’une seule région où
l’ADN est randomisé, ne pose pas de problème particulier. Des techniques classiques de
mutagenèse dirigée peuvent être utilisées. Par contre, introduire plusieurs zones ou l’ADN est
randomisé est plus complexe. Des méthodologies basées sur l’amplification de fragments
(présentant une zone d’hybridation commune) avec des amorces dégénérées puis de
reconstruction du gène entier par PCR de fusion ou la construction de mégaprimers dégénérés
sont les techniques les plus couramment utilisées (Tseng, et al., 2008).
c)
Introduction de délétions et insertions au hasard (RID mutagenesis).
L’introduction de mutations par PCR à erreurs est efficace pour convertir un nucléotide en un
autre. Cependant l’introduction d’insertions ou de délétions dans le gène d’intérêt permet une
exploration des séquences différente de celle obtenue par la PCR à erreurs et peut aboutir à
des propriétés améliorées. Dans le passé, les insertions au hasard se faisaient en utilisant les
transposons disponibles dans la nature (Hallet, et al., 1997; Kang, et al., 2004) ou bien par
mutagenèse d’élongation au hasard (des queues peptidiques étaient fusionnées à un gène)
(Matsuura, et al., 1999). L’introduction d’insertions ou de délétions dans la séquence du gène
se faisant au hasard, de nombreuses protéines non fonctionnelles sont obtenues à cause du
décalage du cadre de lecture.
Une nouvelle méthode développée par Murakami (Murakami, et al., 2002) permet à la fois
d’introduire des délétions et des insertions à une position aléatoire dans un gène. Elle permet
la délétion d’un nombre déterminé de bases (jusqu’à 16 bases) à des positions aléatoires et en
même temps l’introduction d’une séquence spécifique ou aléatoire à la même position. Une
telle méthode permet de définir le nombre de bases délétées et insérées et permet de
s’affranchir du nombre de protéines tronquées dues à un décalage du cadre de lecture. D’autre
part, elle permet d’obtenir des séquences qui n’auraient pas pu être obtenues par PCR à
erreurs à cause du biais de codon. Une limitation cependant réside dans la difficulté de mise
en œuvre d’une telle méthode et dans l’introduction de délétions supplémentaires non désirées
(qui conduisent à un décalage du cadre de lecture et à des protéines tronquées).
78
d)
Conclusion et synthèse des méthodes de mutations ponctuelles (cf. Tableau I-7)
Tableau I-7 : Tableau récapitulatif des avantages et inconvénients des différentes techniques de
mutagenèse ponctuelles.
Méthodes
Avantages
Inconvénients
Mutagénèse
chimique
Simplicité
Accumulation de mutations délétères
Faible niveau de mutation (≈ 1/1000 bases)
Substitution limitée des acides aminés
Difficulté à contrôler le taux de mutation
Souches
mutagènes
Simplicité
Faible niveau de mutation
Nécessité de transférer l’ADN dans une
nouvelle souche pour le criblage
Substitution limitée des acides aminés
Difficulté à contrôler le taux de mutation
PCR à erreurs
Simplicité
Contrôle du taux de
mutations
Accumulation de mutations délétères
Nombreux biais (Substitution limitée des
acides aminés, biais d’amplification biais
polymérase)
Méthodes basées
sur l’insertion
d’oligonucléotides
dans un gène
Simplicité (+/- selon
technique utilisée)
Mutation de site spécifique
Accès aux 20 acides aminés
Diversité générée limitée à des régions
spécifiques
Séquence du gène nécessaire
Possibilité de biais de codon
Délétion
insertion au
hasard
(RID)
Flexible
Insère ou enlève un nombre
déterminé d’acides aminés
au hasard
Accès aux 20 acides aminés
Pas de biais.
Mutations ponctuelles possibles
Techniques difficiles à mettre en oeuvre
et peu rapides
La PCR à erreurs est une des techniques les plus utilisées pour générer des banques de
mutants pour l’évolution dirigée. La facilité de mise en œuvre en fait une méthode attractive
pour de nombreux laboratoires. Cependant l’espace des séquences n’est pas exploré
totalement du fait du biais introduit par les polymérases dans l’utilisation de certains
nucléotides, du biais d’amplification introduit par la technique d’amplification par PCR et du
biais introduit par le code génétique. Les méthodes basées sur l’introduction de nucléotides (la
mutagénèse de saturation étant la plus largement utilisée) permettent de s’affranchir presque
totalement de ce type de biais mais se cantonnent à l’exploration de la diversité des acides
aminés à une/des positions spécifiques. La PCR à erreurs et la mutagénèse de saturation se
complètent donc efficacement. En pratique, des points chauds sont souvent préalablement
identifiés par PCR à erreurs, puis mutés à saturation pour tester l’effet des différents acides
79
aminés et leur combinaison entre eux (Miyazaki, et al., 2006). La méthodologie d’introduction
de délétions et insertions au hasard permet de s’affranchir de ce type de biais, d’accéder à
d’autres types de mutations comme les insertions et les délétions et en font une méthode
attractive bien que largement inexplorée ; une explication à cela est certainement la difficulté
à la mettre en œuvre.
3.2.2.
Techniques de recombinaison
Les techniques de recombinaison ne créent pas de diversité mais combinent la diversité
existante d’une manière nouvelle. Elles permettent d’associer des mutations avantageuses et
d’enlever les mutations délétères. On peut différencier deux types de recombinaison, les
recombinaisons basées sur l’homologie (dite recombinaison sexuelle) et les recombinaisons
sans homologie. Ces dernières méthodes sont souvent dépendantes d’une étape finale de
reconstruction par PCR qui peut être à erreurs et de nouvelles mutations ponctuelles sont
souvent produites par de tels processus. On notera aussi que l’on peut réaliser cette étape in
vivo en exploitant les mécanismes de recombinaison des levures (Abecassis, et al., 2000;
Cherry, et al., 1999; Pompon and Nicolas, 1989)
a)
Techniques de recombinaison avec homologie
La recombinaison homologue mime la recombinaison sexuelle qui a lieu lors du
réarrangement chromosomique dans les cellules sexuelles. Ces techniques permettent de
recombiner des gènes similaires de différentes origines ; ou de mélanger des mutations
ponctuelles sélectionnées dans de nouvelles combinaisons. Les principales techniques, leurs
avantages et leurs inconvénients sont récapitulés dans le tableau I-8. Pour recombiner les
mutations introduites par des techniques de mutation ponctuelles, ces techniques sont idéales.
Par contre pour réaliser du family shuffling (recombinaison entre plusieurs gènes issus
d’organismes différents), seules les régions où l’homologie de séquence est forte pourront être
recombinées, alors, toutes les recombinaisons possibles ne seront pas exploitées
80
Tableau I-8 : Récapitulatif des principales techniques de recombinaison par homologie : description- Avantages et Inconvénients
Technique
Description
Avantages
Désavantages
Référence
DNA Shuffling
Recombinaison homologue entre les mutants ponctuels
d'un même gène. Digestion des gènes par la DNase I Ré-assemblage des fragments obtenus par une PCR
sans amorces. L’hybridation des fragments les uns aux
autres est basée sur leur homologie de séquence
Méthode puissante permettant
de s'affranchir des mutations
neutres et négatives
Biais au niveau des sites de
digestion (recombinaison) dus
à la DNaseI
Stemmer,
1994
Family Shuffling
Recombinaison de gènes homologues issus d’une
même famille
Méthode puissante permettant
la recombinaison entre une
enzyme et ses homologues
thermophiles
70 % d'homologie nécessaire
pour réaliser la méthode.
Crameri et al.,
1998
Joern et al.,
2002
La recombinaison aura lieu
aux zones présentant la plus
forte homologie
RPR - Random
Priming in vitro
Recombination
Synthèse de courts fragment d'ADN à partir d'amorces
non spécifiques (Elimination des brins matrice) Réassamblage des fragments sur la base de leur
homologie et amplification par PCR
Shao et al,
1998
StEP - Staggered
Extension
Process
Hybridation d’amorces au début des séquences
parentales suivie de cycle rapide de dénaturation/
hybridation/élongation => Obtention de fragments de
petite taille pouvant s’hybrider sur d’autres séquences
parentales. Fin de processus lorsque des gènes de
taille parentales sont générés.
Zhao et al.,
1998
RACHITT
Random
Chimeragenesis
on Transient
Template
Création d’une matrice « transitoire » simple brin
contenant de l’uracile à partir d’un des brins parentaux.
Fragmentation des autres brins parentaux, hybridation
à la matrice transitoire et élongation par la polymérase.
Digestion de la matrice mère par PCR
Fort taux de recombinaison
avec une moyenne de 14
recombinaisons par gène
contre 1 à 4 avec les autres
techniques.
Technique délicate à mettre
en oeuvre
Coco, 2003
b)
Recombinaison sans homologie
Dans le cadre du family shuffling, les méthodes de recombinaison par homologie sont
limitées par la nécessité d’une forte identité de séquences entre les gènes à recombiner.
Cependant de nombreuses données structurales indiquent qu’il n’y a pas forcément besoin
d’une forte homologie de séquence pour que les structures soient homologues. Il peut donc
être intéressant de recombiner de telles protéines entre elles. Ceci a conduit à créer des
méthodes qui ne nécessitaient pas d’hybridation à une matrice. Les principales techniques
sont récapitulées dans le tableau I-9 et le détail des méthodes ITCHY et SHIPREC est illustré
dans la figure I-14. Ces techniques ne seront pas utilisées pour la recombinaison de mutations
ponctuelles car les matrices sont suffisamment homologues.
Figure I-14 : d’après Lutz et Benkovic (2002) Techniques de permutations de fragments
indépendantes de l’homologie. Méthodes ITCHY et SHIPREC A) ITCHY : les 2 gènes parentaux
sont tronqués indépendamment ce qui crée deux banques distinctes qui correspondent aux fragments N
et C terminaux. La ligation de ces deux banques génère des séquences hybrides et B) SHIPREC : la
partie N terminale d’un gène est fusionnée avec la partie C terminale d’un autre, un site de restriction
unique est inséré à ce domaine de liaison. Une digestion limitée par la DNase I permet d’obtenir des
séquences de tailles diverses qui son circularisées puis re-linéarisées au site de restriction introduit.
82
Tableau I-9 : Récapitulatif des principales techniques de recombinaison sans homologie : Description- Avantages et Inconvénients
Technique
Description
ITCHY
Incremental
truncation for
the creation of
hybrid enzyme
librairies.
Troncature de 2 gènes parentaux par
l’exonucléase III initialement par les bouts
opposés puis ligation des fragments des
deux populations. Comme il n’est pas
possible de prédire la position la plus
favorable du site de recombinaison des deux
protéines, il est nécessaire d’obtenir des
fragments de toute taille ce qui requiert un
contrôle fin de l’activité de digestion de
l’exonucléase III.
thio-ITCHY
Il s’agit d’introduire le long des gènes
parentaux des liaisons phophothioates
résistantes à la nucléase.
Avantages
Désavantages
Référence
Etape de digestion à l'endonucléase Ostermeier et
délicate à mettre en œuvre
al., 1999
Gènes de toute taille, recombinés
en tout endroit et souvent avec des
cadres de lectures décalés.
Très peu de recombinaisons ont lieu
à des endroits structuralement
apparentés
Un seul évènement de
recombinaison à chaque fois
La digestion par l’endonucléase est
moins délicate et non dépendante
du temps d’action de l’enzyme
Lutz et al.,
2001
Seules les séquences hybrides de la
taille parentale sont sélectionnées
SCRATCHY
Le shuffling de deux banques ITCHY .
Cette technique permet de générer
des hybrides avec plus d’un
événement de recombinaison
SHIPREC
Sequence
Homology
Independant
Protein
Recombination
Fusion de deux gènes parentaux avec un
unique site de restriction au niveau de leur
liaison et digestion par la DNase I =>
obtention de fragments de tailles différentes
et digestion à la nucléase S1 (obtention de
bouts francs). Circularisation par ligation, et
relinéarisation au site de restriction unique
introduit précédemment.
Sélectionner les chimères pour
qu’elles aient la taille parentale
Probabilité de créer des hybrides
avec un alignement de séquences
conservé (et donc de recombiner
des zones structuralement
apparentées) est améliorée
Lutz et
Ostermeier,
2003
Un seul évènement de
recombinaison à chaque fois
Sieber et al.,
2001
Conclusion
Depuis la description du shuffling par Stemmer de nombreuses techniques ont été
développées pour recombiner diverses séquences. Le DNA shuflling même s’il n’est pas
totalement aléatoire (la recombinaison n’aura lieu que dans les zones présentant une forte
homologie et la DNAse aura des sites de digestion préférentiels) reste la technique la plus
populaire. Il est surtout utilisé pour recombiner les mutations ponctuelles sélectionnées lors
d’un ou plusieurs tours de mutagenèse aléatoire. Dans ce cas, la nécessité d’une grande
homologie n’est pas limitante et il permet non seulement d’associer les mutations
avantageuses entre elles, mais aussi de se débarrasser des mutations délétères ou neutres. Les
nouvelles techniques dérivées du shuffling ou basées sur des recombinaisons sans homologie
sont plus délicates à mettre en œuvre.
3.2.3.
CONCLUSION
La stratégie la plus communément utilisée pour l’évolution dirigée est la combinaison de la
PCR à erreurs suivie par une recombinaison des mutations ponctuelles par DNA shuffling.
Souvent aussi, la mutagénèse de saturation est réalisée sur les cibles identifiées par PCR à
erreurs. Citons pour exemple l’amélioration de la thermostabilité d’une xylanase de Bacillus
subtilis qui est passée par la combinaison de mutations aléatoires ponctuelles, de mutagénèse
de saturation et de DNA shuffling pour améliorer la température optimale de l’enzyme de
10°C (Miyazaki, et al., 2006). Malgré les biais introduits, ces trois techniques sont largement
utilisées et ont souvent été appliquées avec succès pour l’optimisation de diverses propriétés
des enzymes (stabilité, sélectivité). D’autres techniques ont été développées qui diminuent ces
biais cependant elles sont moins utilisées car plus complexes à mettre en œuvre. Elles sont
tout de même utilisées là où les techniques « faciles » ont échoué.
3.3. Le criblage de la thermostabilité
L’étape cruciale lors d’un processus d’évolution dirigée réside dans l’identification du ou des
variant(s) possédant les propriétés désirées. Celle-ci se fait par 2 techniques souvent
confondues : le criblage et la sélection. D’autre part, il est important que la pression de
sélection qui est appliquée sur la banque de mutants à tester reflète les propriétés que l’on
veut faire évoluer. En particulier lorsque l’on parle de stabilité des enzymes, il faut savoir ce
que l’on cherche à améliorer : est-ce seulement la stabilité ? c’est à dire leur résistance à des
84
passages à haute température ou bien leur activité à haute température ? Ces deux propriétés
nécessitent des protocoles de criblage différents. Dans de nombreux cas cependant, nous
verrons que le criblage se base sur la mesure de l’activité résiduelle après passage à haute
température.
3.3.1.
Criblage
Le criblage consiste à tester tous les mutants individuellement sur la propriété recherchée
pour pouvoir les différencier. La plupart des tests de criblage impliquent les transferts de
colonies dans des microplaques contenant le milieu de culture, puis une induction de
l’expression de la protéine. Si celle-ci est intracellulaire, alors une étape de lyse sera
nécessaire, et les débris cellulaires devront être éliminés. Puis l’activité enzymatique
recherchée sera testée. Les tests sont presque toujours basés sur des dosages colorimétriques
ou fluorométriques rapides et faciles à mettre en œuvre avec un lecteur de microplaque. Ce
criblage est le moins performant en termes de débit (la taille de la librairie testée sera limitée).
L’augmentation du débit de criblage passe par une miniaturisation des étapes de celui-ci
(culture des hôtes, expression protéique, détermination d’activité…) en microplaque 96 puits.
De plus en plus, le criblage est réalisé en microplaque 384 puits voire 1024 puits pour
augmenter la capacité de criblage.
La majorité des criblages de stabilité d’enzymes sont basés sur la mesure de l’activité
résiduelle après un temps de dénaturation à une température donnée. Comme la propriété
criblée est l’activité résiduelle, cette technique ne permettra pas forcément d’isoler des
mutants actifs à haute température. Pour être sûr d’obtenir des mutants avec une température
optimale plus haute, il faudrait cribler l’activité à haute température. La mise en œuvre d’un
tel crible est cependant limitée par des considérations d’ordre pratique. En effet, les lecteurs
de microplaques actuels ne fonctionnent qu’à des températures maximales de l’ordre de 50°C.
Chauffer pendant la réaction, expose aussi aux problèmes de l’instabilité des substrats à haute
température.
Quelques cas existent tout de même, où l’activité à haute température et non l’activité
résiduelle est criblée. Berk et Lebbink (2003) ont mis un protocole au point pour des plaques
384 puits : les mutants de l’alpha amylase réagissent avec de l’amidon à 129°C pendant 10
minutes. Après refroidissement, un dosage colorimétrique des sucres réducteurs libérés est
réalisé.
85
3.3.2.
Criblage facilité
Un criblage dit facilité sera possible lorsque les mutants possédant la propriété à améliorer
seront différentiables directement sur le milieu solide par un phénotype particulier et par
simple visualisation (souvent cette technique est utilisée comme une pré-identification et
permet de diminuer le nombre de clones à tester avec un criblage plus fin classique). Dans ce
cas un test colorimétrique suffisamment sensible devra être disponible ou développé.
Tests sur milieu solide
Comme nous l’avons vu précédemment, si les mutants possédant la propriété à améliorer
peuvent être sélectionnés sur leur aspect phénotypique, l’étape de criblage sera facilitée. Dès
1986 (Bryan, et al., 1986), un criblage sur milieu solide a permis d’isoler un mutant
thermostable de la subtilisine de Bacillus amyloliquefaciens. La procédure consiste à cribler
l’activité estérase transférée sur membrane de nitrocellulose après incubation à des
températures élevées. D’autres cribles sur boîtes ont été développés pour différentes activités
enzymatiques. Toutes discriminent sur l’activité résiduelle (Hild, et al., 2007; Minagawa, et
al., 2007). Par exemple, la lipase de R. niveus a vu son optimum de température amélioré de
15°C grâce à un criblage facilité sur milieu solide à 55°C. (Kohno, et al., 2001). Quelquefois
aussi, si aucun test sur milieu solide n’est possible pour améliorer la thermostabilité, une
simple sélection des variants actifs sur milieu solide permet de diminuer la taille de la banque
à cribler. On notera que pour les enzymes de type estérolytique, les réactions d’hydrolyse
d’esters conduisent à la formation d’un acide. L’utilisation d’indicateurs colorés sensibles au
pH représente un test d’activité universel pour ce type d’enzyme.
Utilisation de phages et thermostabilité.
La technique du phage display, consiste à utiliser un phage qui va présenter à sa surface la
protéine correspondant à l’ADN introduit (Smith, 1985). Le phénotype et le génotype sont
donc reliés physiquement. Cette technique est utilisée majoritairement pour cribler la
sélectivité ou l’affinité d’une enzyme envers un substrat. Cependant, l’utilisation de phages
pour réaliser un crible sur la thermostabilité a été développée (Martin, et al., 2001) et se
nomme Proside (Protein stability increased by directed evolution.). Le principe de base de
cette méthode est que l’amélioration de la stabilité va de pair avec une plus grande résistance
à la protéolyse. L’infection d’E. coli par le phage est dépendante de la protéine g3p et plus
particulièrement du lien entre les domaines de la protéine g3p. Le gène de la protéine d’intérêt
86
est introduit entre les domaines N2 et C de la protéine g3p. Le lien entre N2 et C est possible
seulement lorsque la protéine reste intacte en présence de protéase (stable). Les phages qui
portent des protéines non fonctionnelles (qui ne se plient pas correctement) ne se propagent
pas (ne sont pas infectieux). Après traitement à la protéase les phages contenant une protéine
dépliée à cause du traitement seront détruits. Une pression de sélection supplémentaire
(exposition à des températures élevées) peut être appliquée avant le traitement à la protéase.
Cette méthode est limitée car elle prend comme postulat que la stabilité/rigidité d’une enzyme
est liée à sa sensibilité à la protéolyse. Ce n’est pas toujours le cas (Pedersen, et al., 2002).
D’autre part, les températures maximales qui peuvent être appliquées doivent être compatibles
avec la survie des phages : 60°C (Martin, et al., 2003).
Une étude intéressante a été réalisée par cette méthode (Martin, et al., 2001). Elle a permis
d’identifier des variants thermostables d’une « cold shock » protéine issue de Bacillus subtilis.
Le crible a été réalisé de deux manières différentes. Dans les 2 cas, des protéines plus stables
ont été obtenues chacune utilisant une voie de thermostabilisation différente. Lorsque le crible
a été réalisé dans un dénaturant ionique non polaire, les interactions de surface ont été
améliorées. Lorsque le crible a été réalisé à haute température, ce sont les interactions
électrostatiques qui ont permis de stabiliser la protéine. La thermostabilisation sera fortement
dépendante des conditions de criblage utilisées (de la pression de sélection imposée). Cela
illustre l’importance du choix du crible utilisé et montre aussi qu’il est parfois difficile de
rationaliser la thermostabilisation des protéines puisque plusieurs voies de stabilisation
peuvent exister.
3.3.3.
Sélection
Dans le cas de la sélection, seuls les mutants possédant la propriété voulue survivront. Il est
donc nécessaire que l’activité de l’enzyme à améliorer soit vitale pour le développement de
l’organisme qui l’exprime. Comme les variants inintéressants ne seront jamais vus, cette
technique permet d’augmenter la taille des librairies testées et par conséquent le débit de
criblage.
Pour pouvoir réaliser une sélection basée sur l’acquisition d’une plus grande thermostabilité,
il est nécessaire que le système d’expression soit adapté aux températures élevées. Ainsi,
l’utilisation d’E. coli comme système d’expression (dont la température maximale de
développement est 50°C), nivellera le maximum de thermostabilité que l’on pourra atteindre.
Ainsi, si une sélection sur l’amélioration de la thermostabilité doit être réalisée pour des
87
température supérieures à 50°C, il faudra utiliser un système d’expression permettant de
produire les protéines d’intérêt à haute température : les organismes thermophiles (et
notamment Thermus thermophilus (Tamakoshi, et al., 1995) apparaissent dans ce cas comme
des hôtes particulièrement adaptés.
Ainsi, la thermostabilité de la 3-isopropylmalate déshydrogénase de Bacillus subtilis a été
améliorée en introduisant le gène leuB codant cette enzyme dans l’hôte thermophile Thermus
thermophilus, auxotrophe pour la leucine. En l’absence de leucine, la souche transformée
pousse à 56°C mais pas à 61°C (température restrictive pour l’activité de la 3-isopropylmalate
déshydrogénase et la biosynthèse de leucine). En étalant 107 cellules de cette souche à 61°C,
des colonies capables de pousser à 61°C mais pas à 66°C on été obtenues. L’apparition de
mutations spontanées et l’introduction d’une pression de sélection a suffi pour faire apparaître
des mutants améliorés. L’opération a été répétée une 2ème fois à 66°C et une 3ème fois à 70°C
avec les colonies obtenues au tour précédent (Akanuma, et al., 1998)
On notera tout de même que cette technique de sélection avait été réalisée plus de 10 ans plus
tôt dans le thermophile Bacillus stearothermophilus pour améliorer la thermostabilité d’une
kanamycine nucléotidyl transférase, soit par mutagenèse chimique (Matsumura and Aiba,
1985), soit en introduisant le gène au préalable dans une souche mutagène (Liao, et al., 1986).
De fait, l’utilisation des méthodes vues précédemment pour créer de la diversité génétique
pourrait largement améliorer le procédé, permettre une évolution plus rapide de l’enzyme
(introduction de plus d’une mutation par tour) et d’introduire une diversité non explorée dans
ce cas (méthode RID, méthodes de familly shuffling …). Une des limitations cependant est
l’efficacité de transformation des hôtes thermophiles. Pour Thermus thermophilus, de forts
taux de transformation peuvent être obtenus mais c’est une opération délicate qui nécessite de
l’expertise. La société Biotool a développé à cet effet deux kits (THERMOTOOLS cloning kit
et THERMOTOOLS cloning kit - HB27::nar strain) permettant la sélection directe des
mutants thermostables dans cet hôte.
La sélection dans ce cas ne se fait pas sur l’activité résiduelle mais sur l’activité de l’enzyme à
haute température. Cette technique permet donc de sélectionner des enzymes dont la
température optimale est plus haute. Cependant, une limitation de ce système de sélection
provient du fait que Thermus thermophilus est un organisme procaryote et que par conséquent
il se limite à l’amélioration de protéines qui seront fonctionnelles avec ce système
d’expression.
88
3.4. Conclusion
Le succès d’une campagne d’évolution dirigée repose :
-
sur la qualité de la banque de mutants obtenue : une banque idéale sera une banque où
toutes les mutations ou combinaisons sont possibles et équiprobables. Nous avons
détaillé dans le chapitre précédent les techniques de mutagenèse ponctuelle et de
recombinaison permettant de générer de la diversité génétique ainsi que les biais
introduits par ces différentes techniques. L’objectif est d’explorer un maximum de la
diversité des séquences possibles pour un gène d’intérêt donné en essayant de réduire
au maximum les biais. Les techniques les plus utilisées (souvent en combinaison) sont
la PCR à erreurs, le DNA shuffling et la mutagenèse de saturation
-
sur la taille de la banque : plus le nombre de mutants obtenu est grand plus la chance
de trouver un variant avec la propriété désirée est grande aussi. La taille de cette
banque sera limitée à la fois par l’efficacité de transformation de l’hôte considéré et la
capacité de criblage. Des méthodes de criblage haut débit appropriées doivent être
développées pour la propriété à améliorer. Les techniques de criblage facilité ou de
sélection doivent être mises en œuvre quand cela est possible car cela permet
d’augmenter de manière importante le débit du criblage.
Finalement, le succès dépend aussi grandement de la pression de sélection appliquée à
l’enzyme à faire évoluer ; celle-ci doit être en adéquation avec la ou les propriétés que l’on
souhaite améliorer. La phrase « you get what you screen for » illustre parfaitement cette idée.
Pour ce qui est de l’évolution de la thermostabilité, nous avons vu que la thermostabilité
d’une enzyme était presque toujours évaluée à partir de l’activité résiduelle après passage à
haute température. Cette approche est utile dans le cas ou on veut augmenter la stabilité des
enzymes sur des temps longs de stockage. Par contre, dans le cas où on veut améliorer
l’activité à haute température d’une enzyme, un tel crible n’est pas le plus approprié.
L’utilisation de cribles plus appropriés est limitée par des problèmes d’ordre technique.
Cependant des enzymes à la fois stabilisées et dans certains cas plus actives à hautes
températures ont été obtenues par cette voie. D’autre part, réaliser plusieurs tours d’évolution
est primordial et présente un double avantage : non seulement on augmente le nombre de
mutants criblés mais de plus chaque nouvelle banque créée est réalisée à partir des mutants les
plus performants identifiés au tour d’avant.
89
4. Lipases et thermostabilité : Exemples de lipases dont la
thermostabilité a été améliorée
Le tableau I-10 donne un récapitulatif d’exemples où la thermostabilité de lipase a été
améliorée.
Tableau I-10 : Exemples d’amélioration de la thermostabilité de lipases
Evolution dirigée
Evolution rationnelle
Origine lipase
Voies de stabilisation et amélioration
Références
Humicola lanuginosa
Introduction de Proline => Amélioration Tm de 2°C
Svedsen et al., 1992
Pseudomonas fragi
Des mutations dans la paupière de la lipase conduisent non
seulement à un changement de spécificité de l'enzyme
mais à aussi une amélioration de la thermostabilité
Santarossa et al., 2005
Pennicillium camembertii
Introduction de ponts disulfures par homologie avec la
lipase de H. lanuginosa => Topt améliorée de 10°C
Yamaguchi et al.,
1996
Fusarium heterosporum
Ingénierie de la partie C- terminale et de ses interactions
avec la partie N-Terminale
Nagao et al., 1998 et
2000.
Candida antartica
Mutations à l'intérieur de la séquence consensus GXSXT
=> Amélioration de 4°C de la thermostabilité mais
diminution de moitié de l'activité spécifique
Partkar et al., 1998
Bacillus subtilis
Mutagénèse de saturation itérative sur les zones présentant
le plus haut facteur d'agitation thermique => Température
de demi-vie améliorée de 45°C
Reetz et al., 2007.
Pseudomonas aeruginosa
PCR à erreurs => Amélioration de la température de demivie de 3°C
Shinkai et al., 1996
Candida antartica (lipase B)
DNA shuffling avec deux homologue thermophiles =>
temps de demi-vie multiplié par 11 à 45°C et son Tm
augmenté de 6,4°C
Suen et al., 2004
Bacillus subtilis
PCR à erreurs => Temps de dénaturation multiplié par 300
Acharya et al. 2004
Rhizopus niveus
PCR à erreurs => T opt améliorée de 15°C
Kohno et al., 2001
Si on regarde plus en détail l’évolution de la thermostabilité chez les lipases, on notera :
-
l’introduction d’un pont disulfure chez la lipase de P. camembertii a permis
d’améliorer l’optimum de 10°C. Ce pont disulfure a été construit par homologie avec
la lipase de Humicola lanuginosa et a permis de relier entre elles les parties N et C
terminales (Yamaguchi, et al., 1996).
-
Chez la lipase de Fusarium heterosporum, la partie C-terminale de la lipase semble
avoir un rôle majeur dans la thermostabilité (Nagao, et al., 1998). La thermostabilité
90
ici encore est due à des interactions ioniques entre les parties N et C-terminales
(Nagao, et al., 2000).
-
Un mutant amélioré par évolution dirigée de la lipase de Rhizopus niveus (Kohno, et
al., 2001) a permis d’augmenter la température de l’enzyme de 15°C. Parmi les deux
hypothèses avancées par les auteurs pour expliquer l’amélioration de la
thermostabilité, l’un est la stabilisation de la partie C-terminale de l’enzyme.
-
Le mutant de la lipase de Bacillus subtilis présente plusieurs mutations, l’une d’entre
elle est responsable de l’amélioration d’un facteur trois cent du temps de dénaturation
de l’enzyme à cause d’un meilleur ancrage de la partie N-terminale de la lipase A de
B. subtilis (Acharya, et al., 2004).
Sur 10 exemples d’amélioration de la thermostabilité des lipases par ingénierie enzymatique
la thermostabilisation, la moitié a lieu via une stabilisation des parties N et C terminales des
lipases. D’autre part, en ce qui concerne les estérases thermophiles (des enzymes possédant
des similarités structurales importantes avec les lipases mais qui hydrolysent seulement les
esters à courte chaîne carbonée) la partie N-terminale semble aussi jouer un rôle important
dans leur stabilité par rapport à leurs homologues mésophiles (Mandrich, et al., 2005).
D’autre part, une pNP estérase dont la thermostabilité a été améliorée par 6 tours d’évolution
dirigée présente toutes ses mutations localisés dans la partie C-terminale de la protéine (Giver,
et al., 1998). On peut se demander si le point faible de la thermostabilité des lipases n’est pas
une instabilité dans l’ancrage des parties N et C terminales. Faut-il y voir une stratégie de
stabilisation à utiliser préférentiellement chez les lipases ?
5. CONCLUSION GENERALE THERMOSTABILITE
L’ingénierie de la thermostabilité d’une enzyme peut être réalisée par ingénierie rationnelle
ou par évolution dirigée. La voie de l’ingénierie rationnelle, pour qu’elle réussisse, doit aller
de pair avec une connaissance approfondie de la structure de l’enzyme et de la comparaison
de celle-ci avec celle de ses homologues thermophiles, des mécanismes de stabilisation et des
processus impliqués dans la dénaturation de l’enzyme. De nombreux exemples de réussite de
cette voie ont été donnés dans le chapitre correspondant. Malgré tout, des échecs ont été
enregistrés, car trop souvent la structure de l’enzyme est envisagée par « petits morceaux »
indépendants et non comme un tout. D’autre part, cette voie nécessite une connaissance de la
structure de l’enzyme, ce qui n’est pas toujours le cas. Dans ces cas, la voie de l’évolution
dirigée est la voie privilégiée. Celle-ci consiste à explorer la diversité génétique du gène
91
d’intérêt par les techniques de mutagenèse ponctuelle et/ou de recombinaison et de
sélectionner les enzymes obtenues en appliquant une pression de sélection appropriée. Le
processus étant répété à partir des meilleurs mutants sélectionnés à chaque tour jusqu’à
obtention de la propriété désirée. Le succès d’une campagne d’évolution rationnelle dépend
de la qualité de la banque créée, de la taille de la banque criblée et de la pression de sélection
appliquée. Souvent les stratégies de stabilisation les plus réussies sont une combinaison entre
évolution rationnelle et évolution dirigée. Citons l’exemple de la lipase A de B. subtilis (Reetz
and Carballeira, 2007) : 10 acides aminés ciblés en fonction de leur facteur d’agitation
thermique (approche dirigée) ont été modifiés en même temps par une technique de
mutagenèse de saturation itérative. Le criblage de seulement 8000 transformants a permis
d’améliorer la température de demi-vie de la lipase de 45°C. D’autre part, les études
d’évolution dirigée et rationnelle ont montré que les mutations avaient tendance à se grouper
dans des zones spécifiques des enzymes, ces zones devant être impliquées dans le démarrage
des processus qui mènent à la dénaturation thermique (Giver, et al., 1998; Palackal, et al.,
2004). L’identification de tels clusters peut être utilisée pour réduire l’espace des séquences
explorées par évolution dirigée.
92
Troisième partie - Les lipases : les bases structurales de
leur selectivité
1. Généralité lipases
Les lipases sont des enzymes ubiquitaires, distribuées très largement dans la nature aussi bien
chez les végétaux que chez les animaux ou les microorganismes. Selon la nomenclature
internationale, les lipases (E.C 3.1.1.3 ou triacylglycérol acylhydrolases) sont des hydrolases
capables d’hydrolyser une liaison ester dans un triglycéride. Elles réalisent des réactions
d’hydrolyse sur une large gamme de substrats, pouvant être très différents de leurs substrats
naturels : les triglycérides. Mises dans des conditions thermodynamiques favorables, elles
sont également capables de réaliser des réactions de synthèse telles que des estérifications,
transestérifications, amidations, et sont donc très largement utilisées en synthèse organique....
Elles représentent à ce jour les enzymes les plus étudiées avec des milliers d’articles chaque
année décrivant leur structure, leur réactivité, et leur spécificité. D’autre part, de nombreux
auteurs se sont intéressés à l’ingénierie de ces enzymes, c'est-à-dire à l’optimisation de ces
catalyseurs, en jouant directement sur celles-ci par ingénierie génétique, ou bien en optimisant
leurs conditions de mise en œuvre. Cette première partie bibliographique a pour objet de faire
une synthèse de cette « iconographie» pléthorique.
1.1. Réactions catalysées par les lipases
- Les réactions d’hydrolyse :
Les substrats naturels des lipases sont donc les triacylglycérols, cependant d’autres esters de
glycérol ou d’alcool peuvent être aussi hydrolysés par ces enzymes. Elles catalysent
préférentiellement l’hydrolyse d’esters insolubles à longue chaîne carbonée (C>10, l’acide
oléique C18 :1 étant la référence). Cette spécificité pour les esters à longue chaîne est ce qui
les différencie des estérases qui agissent sur les esters solubles à courte chaîne carbonée
(C<10, la tributyrine C4 étant la référence). Cependant, les lipases sont aussi capables
d’hydrolyser les substrats solubles des estérases (l’inverse n’étant pas vrai), mais souvent de
manière moins efficace. Les substrats à longue chaîne carbonée des lipases sont le plus
souvent insolubles, ce qui fait des lipases des enzymes particulières, capables d’agir en milieu
biphasique, à l’interface entre les substrats hydrophobes et le milieu aqueux.
93
-Les réactions de synthèse :
Lorsque les lipases sont mises en œuvre dans des milieux à faible activité de l’eau et en
présence des substrats appropriés, elles réalisent des réactions de synthèse (Zaks and
Klibanov, 1985) :
- des estérifications. De telles réactions libèreront de l’eau qu’il faudra piéger pour éviter
qu’un équilibre se mette en place avec la réaction d’hydrolyse correspondante.
- des transestérifications, (Alcoolyse, Acidolyse, Interestérification), des aminolyses, des
thiotransestérifications.
La mise en œuvre de réactions de synthèse nécessite un solvant anhydre : un solvant
organique par exemple. Les avantages de la catalyse enzymatique en milieu organique ont été
largement décrits dans la littérature (Zaks and Klibanov, 1985) :
- le déplacement de l’équilibre réactionnel dans le sens de la synthèse et la diminution des
réactions secondaires
- augmentation de la stabilité thermique des enzymes (Zaks and Klibanov, 1984)
- amélioration (ou du moins le changement) de sélectivité de l’enzyme qui est fortement lié à
la nature du solvant utilisé (Zaks and Klibanov, 1984)
- récupération aisée de l’enzyme insoluble
- facilité de récupération des produits formés par simple évaporation du solvant, celui-ci ayant
souvent une température d’ébullition inférieure à celle de l’eau.
- augmentation de la solubilité des substrats et produits organiques apolaires
- limitation des contaminations microbiennes
Les solvants organiques présentent cependant des désavantages comme leur inflammabilité et
leur toxicité. D’autre part, ceux-ci peuvent dénaturer l’enzyme, notamment si l’activité de
l’eau est trop faible et que l’eau liée à l’enzyme n’est pas maintenue.
Pour mettre en œuvre ces enzymes, d’autres types de milieux originaux ont donc été
développés :
- les liquides ioniques (pour une revue, voir van Rantwijk et al., 2003). Les avantages de la
catalyse en milieu non aqueux sont gardés, mais ces solvants sont moins toxiques et
inflammables que les solvants organiques. Cependant leur utilisation industrielle reste limitée
de par leur coût et les difficultés à récupérer les produits et l’enzyme.
- les milieux gazeux où les substrats se trouvent en phase gazeuse (Graber, et al., 2003;
Letisse, et al., 2003)
94
- les fluides supercritiques qui présentent des caractéristiques de viscosité, de densité et de
diffusivité intéressantes car intermédiaires entre les fluides et les gaz (Ikushima, 1997)
- les milieux biphasiques
- les micelles inverses
1.2. Applications
Les lipases (et principalement les lipases microbiennes) présentent de nombreux avantages
sur un plan biotechnologique. Elles 1) sont stables dans les solvants organiques 2) ne
nécessitent pas de cofacteur 3) possèdent une large gamme de spécificité de substrats 4)
montrent une grande sélectivité dans les réactions mises en œuvre. Ces caractéristiques en
font des biocatalyseurs particulièrement intéressants pour des applications industrielles. Voici
quelques-unes de leurs plus importantes applications (Pandey, et al., 1999) :
- dans l’industrie des détergents, comme additifs dans les lessives. Les lipases utilisées
doivent être à la fois actives et stables à hautes températures et à pH alcalin et en présence des
autres composants de la lessive. Depuis les premières lipases (lipolase- Novozyme)
commercialisées, des enzymes plus performantes ont été mises sur le marché (lipexNovozyme).
- dans l’industrie alimentaire. Dans l’industrie des produits laitiers, elles servent à augmenter
la note aromatique des fromages, et à accélérer leur maturation. Dans la fabrication du pain,
elles sont utilisées comme émulsifiant de la pâte à pain (lipopan F -Novozyme).
- dans l’industrie du papier pour enlever les triglycérides et les cires de la pulpe.
- dans l’industrie du cuir, pour enlever les graisses sous cutanées.
- dans des procédés environnementaux, pour traiter les boues de stations d’épuration ou des
déchets riches en huiles.
- dans l’industrie des parfums et des cosmétiques : les lipases sont utilisées dans deux
applications majeures : la production de surfactant (avec les mono- et di-acylglycérols
produits de réaction des lipases) et la production d’arômes.
- dans les industries chimiques, pour obtenir des composés purs optiquement actifs
(notamment dans l’industrie pharmaceutique et la production de pesticides). Ainsi, de
nombreuses molécules chirales médicamenteuses sont synthétisées avec des lipases à partir de
mélanges racémiques. C’est le cas des prostaglandines, des céphalosporines, des antiinflammatoires non stéroïdiens (naproxène, ibuprofène, kétoprofène), des hydantoïnes, et des
pénicillines.
95
- dans le domaine de l’énergie, elles sont utilisées pour l’obtention de bio-diesel à partir de
ressources renouvelables comme les huiles végétales.
2. Structure
La suite de notre étude concernera la structure tridimensionnelle des lipases. Au cours de
notre étude, nous nous intéresserons donc aux motifs structuraux caractéristiques des lipases
et plus particulièrement aux lipases d’origine fongiques de la famille de Rhizomucor miehei.
En effet, la lipase de Yarrowia lipolytica à laquelle nous nous intéressons fait partie de cette
famille. De plus, de nombreuses structures de lipases ont été résolues dans cette famille. Les
données structurales existant à ce jour pour ces différentes lipases sont récapitulées dans le
tableau I-11.
Tableau I-11: Données structurales existantes pour les lipases fongiques.
Lipase
Rhizomucor miehei
Auteurs
Résolution
code PDB
Substrat/inhibiteur
Brady et al., 1990
1,90 Å
(Cα seulement)
1TGL
fermée
Brady et al., 1992
1,90 Å
3TGL
fermée
Derewenda et al., 1992a
2,60 Å
4TGL
ouverte + diethyl
phosphonate
3,00 Å
(Cα seulement)
5 TGL
ouverte
+
n-hexylphosphonate éthyl
ester
1,84 Å
1TIB
fermée
2,60 Å
1 DT3
2,35 Å
1DTE
3,00 Å
1EIN
2,50 Å
1DU4
2,40 Å
1DT5
2,20 Å
1GT6
2,60 Å
(Cα seulement)
TIC
2,20 Å
1LGY
2,10 Å
(Cα seulement)
1TIA
Brzozowski et al., 1991
Derewenda et al., 1994b
Humicola (Thermomyces) Brzozowski et al., 2000
lanuginosa
Yapoudjan et al., 2002
Rhizopus delemar (oryzae,
niveus)
Kohno et al., 1996
Penicillium camembertii
Di-undecylphosphatidyl
choline
ouverte + Acide oléique
(sérine catalytique
mutée)
1 forme fermée + 1
forme ouverte dans le
même cristal
Les premières structures de lipases ont été élucidées au début des années 1990. Il s’agissait de
la lipase de Rhizomucor miehei (Brady, et al., 1990) et de la lipase pancréatique humaine
96
(Winkler, et al., 1990). Par la suite, de nombreuses autres lipases ont été cristallisées. Dès
l’apparition des premières structures, une organisation structurale est mise en évidence et
notamment un repliement de type α/β (Brady, et al., 1990).
2.1. Le repliement α/β
β
Le repliement α/β a été mis en évidence pour la première fois par Ollis et al. en 1992 (cf.
Figure I-5). C’est un motif qui est commun à de nombreuses enzymes hydrolytiques
(protéases à sérines et à cystéines, subtilisine, et les hydrolases à repliement α/β). Il se
compose d’un feuillet β central à 8 brins majoritairement parallèles avec le brin β 2
antiparallèle. Ces brins sont connectés par 6 hélices α (A à F) de part et d’autre de ce feuillet
β. Les hélices A et F sont positionnées du côté concave du feuillet, les autres du côté convexe.
Les enzymes possédant ce type de repliement ont toutes une triade catalytique de type :
nucléophile – histidine – acide, les résidus catalytiques étant les éléments structuraux les
mieux conservés (Ollis, et al., 1992).
Figure I-15 : Image simplifiée du repliement 3D des hydrolases d’après le schéma de Jaeger et
al., (1999). Les hélices α sont représentées par des cylindres, les brins β sont indiqués par des flèches
grisées. La position des résidus du site actif est représentée par un point noir, la serine catalytique est
positionnée après le brin 5, le résidu Asp/Glu après le brin 7, et l’histidine est dans la boucle entre le
brin 8 et l’hélice αF.
Les lipases possèdent un repliement α/β. Le motif minimum de cette structure commun à
toutes les lipases est composé de 5 brins β parallèles dans le feuillet β central et deux hélices
α (B et C) (Schrag and Cygler, 1997) mais il y a des variations structurales au sein des
différentes familles de lipases (voir Figure I-16 ci-après).
97
a
b
c
d
e
Figure I-16 : Schéma d’après Schrag et Cygler (1997) du repliement α/β
β et de la structure de
quatre lipases représentatives de quatre familles de lipases. La numérotation des hélices et brin
béta est conforme à celle de Ollis et al. (1992) Sur la gauche, représentation schématique du
repliement. Les résidus de la triade catalytique sont représentés par des lettres S (pour sérine), H (pour
histidine) et D ou E (pour acide aspartique ou glutamique). A droite, une représentation de la structure
tridimensionnelle. Seuls les brins β appartenant au repliement α/β classique sont montrés sur cette
représentation. Une lettre jouxte les hélices α appartenant au repliement α/β classique. On notera que
le brin β10 présent chez la lipase de Thermomyces lanuginosa, n’est pas présent dans toutes les lipases
de cette famille (lipases de R. miehei par exemple).
98
La topologie des lipases de type R. miehei (R. delemar et H. lanuginosa, P. camembertii)
présente des variations par rapport au repliement α/β des autres lipases (Schrag and Cygler,
1997):
- Le feuillet β est toujours composé de 9 brins et si on se réfère à la nomenclature du
repliement α/β proposé par Ollis, le brin β4 n’est pas présent chez ce type de lipases.
- Les hélices B, C et D sont conservées mais il leur manque l’équivalent des hélices A, E et F.
Normalement, les hélices A et F sont situées sur la même face du feuillet. Il semble dans ces
lipases que ces hélices aient été remplacées par une longue hélice placée de ce même côté du
feuillet avec l’axe de l’hélice presque perpendiculaire au feuillet.
- L’histidine catalytique n’est pas placée directement après le brin β8 mais après un brin β9
antiparallèle.
2.2. La triade catalytique
La triade catalytique est un élément très conservé dans la structure des lipases. Elle a été mise
en évidence lorsque la première structure de lipase a été résolue en 1990 (Brady, et al., 1990).
Elle est invariablement composée d’une sérine, d’un acide aspartique (ou plus rarement chez
Géotrichum candidum et Candida rugosa d’un acide glutamique) et d’une histidine dans cet
ordre dans la séquence primaire de la protéine. Dans le repliement α/β, la sérine catalytique
est placée après le brin β5, l’histidine après β8 et l’acide après β7. Cependant, de légères
variations peuvent être observées selon les enzymes. La sérine catalytique est localisée dans
un motif structural appelé coude nucléophile (un γ like turn) et se trouve dans une séquence
consensus Gly-x-Ser-x-Gly (Ollis et al., 1992). Cette structure permet à la sérine d’être d’une
part proche de l’histidine catalytique, et d’autre part bien positionnée pour l’attaque
nucléophile du substrat. Il est à noter cependant que récemment une autre famille de lipases a
été mise en évidence : la famille « GDSL », chez qui la sérine catalytique est placée dans une
séquence consensus GDSL (Akoh, et al., 2004) (c’est par exemple le cas des lipases d’
Aeromonas hydrophilia, Xenorhabdus luminescens et Streptmyces rimosus).
Cette triade catalytique avait déjà été mise en évidence chez d’autres enzymes : les protéases à
sérine. Cependant, contrairement à ces dernières, le site actif de l’enzyme n’est pas en surface
mais enfoui et couvert par des boucles qui le rendent inaccessible au substrat.
Les éléments structuraux communs à toutes les lipases sont :
-
une triade catalytique Ser-Asp/Glu-His (linéaire dans la séquence).
la sérine catalytique est placée dans un coude nucléophile après le brin β5.
au moins 5 brins β parallèles dans le feuillet β central.
99
2.3. Le volet amphiphile.
En 1990, lorsque les premières structures de lipases ont été élucidées (Brady, et al., 1990;
Winkler, et al., 1990), il est immédiatement observé qu’une boucle couvre le site actif. Cette
boucle amphiphile est appelée paupière ou volet amphiphile. Il est alors supposé que le
contact avec le substrat permet un changement conformationnel qui va permettre à cette
paupière de découvrir le site actif pour laisser entrer le substrat. Le mouvement de la paupière
est clairement mis en évidence lorsque les lipases sont cristallisées en présence d’inhibiteurs
mimant les substrats à l’intérieur du site actif (Brzozowski, et al., 1991; Derewenda, et al.,
1992b). On distingue donc deux isomères conformationnels des lipases : une forme ouverte et
une forme fermée. Le mouvement de la paupière ne fait pas qu’ouvrir le site actif, il
s’accompagne aussi d’une augmentation de la surface hydrophobe et d’une diminution de la
surface hydrophile autour du site actif de l’enzyme. Chez la lipase de Rhizomucor miehei,
l’augmentation de la surface hydrophobe est de 700 Å2 (Derewenda, et al., 1992a) soit 7 % de
la surface totale et une diminution de 450 Å2 de la surface hydrophile.
Paupière et activation interfaciale
Le phénomène d’activation interfaciale des lipases a été observé pour la première fois en 1936
(Holwerda, et al., 1936) puis en 1945 (Schonheyder and Volqvartz, 1945): l’activité des
lipases est augmentée quand celles-ci agissent à une interface, c'est-à-dire sur le substrat
insoluble (émulsion) plutôt que sur le même substrat en-dessous de sa limite de solubilité. En
1958, Sarda et Desnuelles (Sarda and Desnuelle, 1958) définissent une lipase en terme
cinétique sur la base de ce phénomène d’activation interfaciale (voir Figure I-17). En effet, les
estérases ne présentent pas cette particularité.
Figure I-17 : Graphique d’après Sarda et Desnuelle représentant le taux d’hydrolyse en fonction
d’un ester partiellement soluble dans l’eau. Les lignes verticales en pointillés représentent la limite
de solubilité de l’ester utilisé. De telles cinétiques ont été utilisées pour discriminer les estérases (à
gauche) des lipases (à droite)
100
La découverte de la paupière donne les bases structurales à l’explication de ce phénomène.
Lorsque les substrats sont sous forme soluble, la paupière est refermée et l’enzyme est peu
active. Lorsqu’une interface est présente, la paupière est ouverte et cela augmente alors
brutalement l’activité de l’enzyme. Toutes les lipases ne présentent pas ce phénomène. Par
exemple la lipase B de Candida antarctica ne possède pas de paupière et ne présente pas
d’activation interfaciale (Martinelle, et al., 1995).
Par la suite, cependant, il a été prouvé que la présence d’une paupière n’était pas
nécessairement corrélée avec le phénomène d’activation interfaciale. En effet, malgré la
présence d’une paupière amphiphile recouvrant leur site actif, certaines lipases : les lipases de
Pseudomonas glumae, Pseudomonas aeruginosa (Jaeger, et al., 1993), et une lipase
pancréatique de ragondin et de cobaye (présence d’une mini paupière) (Thirstrup, et al., 1994)
ne montrent pas d’activation interfaciale. D’autre part, la phospholipase pancréatique A2 ne
possède pas de paupière (van den Berg, et al., 1995) mais présente un haut degré d’activation
interfaciale avec la di-heptanoylphophatidyl-choline comme substrat (Pieterson, et al., 1974).
L’activation interfaciale n’est donc pas présente chez toutes les lipases (Martinelle, et al.,
1995; Thirstrup, et al., 1994) et ce phénomène est substrat-dépendant. Cela remet en cause la
définition des lipases en terme cinétique introduite par Sarda et Desnuelles (1958). Une lipase
ne peut donc se définir que par les substrats qu’elle est capable d’hydrolyser : les triglycérides
et esters à longues chaînes (Ferrato, et al., 1997).
La paupière dans les structures cristallographiques
La structure des lipases obtenue peut donc être ouverte, fermée, ou dans un état intermédiaire.
Lorsque qu’un substrat ou un inhibiteur est présent dans le site actif des lipases, elles sont
cristallisées sous forme ouverte. De même, dans le cristal de la lipase de Rhizopus delemar
(Derewenda, et al., 1994b), il y a deux molécules d’enzyme par unité asymétrique : l’une sous
forme fermée l’autre sous forme partiellement ouverte. Un détergent utilisé dans la solution
de cristallisation (le N, N diméthyl-octadecylamine N oxyde) est responsable de cette seconde
forme. Cependant, il existe des cas où des lipases sont cristallisées sous forme ouverte sans
substrat ou inhibiteur. Ainsi, chez la lipase de Thermomyces lanuginosa (Derewenda, et al.,
1994b), la paupière présente un fort degré de mobilité (cristal sans contrainte sur la paupière) :
la labilité conformationnelle de la paupière est une propriété intrinsèque de la protéine. De
même, la lipase de Pseudomonas cepacia a été cristallisée sous forme ouverte alors qu’aucun
inhibiteur suicide n’était présent dans le site actif (Schrag, et al., 1997). Les auteurs supposent
101
que la conformation de la protéine serait déterminée par les conditions de cristallisation
(présence d’isopropanol) et notamment par la constante diélectrique. Le rôle prédominant de
la force ionique et de la constante diélectrique est mis en évidence par d’autres auteurs
(Brzozowski, et al., 2000) qui ont cristallisé la lipase de Thermomyces lanuginosa dans
différentes conditions de cristallisation et qui ont obtenu trois formes différentes : une forme
« faiblement activée », une forme activée, et une forme pleinement active. Les différences
entre ces formes se situent au niveau du positionnement de la paupière. En effet, depuis,
d’autres structures ouvertes ont été obtenues sans inhibiteur et la majorité a été obtenue en
présence de solvant organique (Cygler and Schrag, 1997). Cette structure ouverte de la
paupière en présence de solvants organiques est à mettre en relation avec le fait que les lipases
sont des enzymes très actives en solvant organique.
2.4. Le trou oxyanion
L’intermédiaire tétraédrique formé au cours de la réaction catalytique (voir partie 2.5
mécanisme catalytique) est stabilisé par au moins deux liaisons hydrogène formées avec les
groupes amides de la chaîne carbonée. Ces deux acides aminés participant à la stabilisation de
l’intermédiaire tétraédrique forment le trou oxyanion.
Le premier résidu du trou oxyanion est situé dans la région N-terminale des lipases et est bien
conservé à l’intérieur des différentes familles de lipases. Il est situé dans une boucle entre le
brin β3 et l’hélice αA. Pleiss et al. (2000a) ont identifié deux types de trou oxyanion GX et
GGGX (représentés en Figure I-18). Le type de trou oxyanion semble être corrélé avec la
spécificité de substrats des lipases : les lipases de type GX auront une spécificité marquée
pour les substrats à longues chaînes carbonées alors que les trous oxyanion de type GGGX
seront plutôt retrouvés chez les carboxylestérases et les lipases spécifiques des courtes chaînes
carbonées. Les lipases de types fongiques ont un trou oxyanion de type GX (X étant une
sérine ou une thréonine), la chaîne latérale participant peut être à une troisième liaison
hydrogène stabilisant l’intermédiaire tétraédrique. L’équipe de Pleiss a aussi mis en évidence,
chez les lipases de type GX un résidu d’amarrage qui interagit avec la chaîne latérale du
résidu du trou oxyanion, chez les lipases de type fongique il s’agit d’un résidu généralement
hydrophile (acide aspartique ou asparagine).
102
Le deuxième résidu du trou oxyanion est le résidu X2 de la séquence consensus G-X1-S-X2G, où se trouve la sérine catalytique. Pour les lipases de type R. miehei dont la séquence
consensus est GHSLG, il s’agit donc d’une leucine. Elle est positionnée dans le coude
nucléophile et sa position est par conséquent très conservée chez les lipases.
Figure I-18 : Illustration des deux types de trous oxyanions retrouvés chez les lipases, (a) type
GX dans la lipase de R. miehei : Stabilisation d’un analogue de substrat (diethylphosphonate) par une
liaison hydrogène avec le X du premier résidu du trou oxyanion (S82), et stabilisation de ce résidu par
le résidu « ancre » D91. (b) Type GGGX dans la lipase de C. rugosa. Stabilisation d’un analogue de
substrat (1R-menthyl-hexyl phosphonate) par le G du premier résidu du trou oxyanion (G124),
stabilisation par blocage de la chaîne latérale de l’autre résidu du trou oxyanion (A210) entre G et la
chaîne latérale de X (F125)
Interaction entre paupière et trou oxyanion
Le trou oxyanion peut être déjà formé dans la forme fermée de la lipase (chez Candida
rugosa, (Grochulski, et al., 1994) ou peut se former parallèlement à l’ouverture du volet
(Pseudomonas cepacia. Schrag et al., 1997). Pour les lipases de type R. miehei, le trou
oxyanion est pré-formé dans la forme fermée mais l’interaction avec le résidu d’amarrage qui
stabilise le trou oxyanion n’a pas lieu, cette interaction n’étant possible que lorsque la lipase
est sous forme ouverte (Pleiss, et al., 2000a).
2.5. Mécanisme catalytique (cf. Figure I-19)
Le mécanisme catalytique des lipases (Cygler, et al., 1994) est semblable à celui observé chez
les protéases à sérine. La première étape est une étape d’acylation. Le transfert de proton
entre l’acide aspartique (ou acide glutamique), l’histidine et la sérine catalytique, entraîne
103
l’attaque nucléophile de l’hydroxyle de la sérine sur le carbonyle du substrat. Un premier
intermédiaire tétraédrique est alors formé qui porte une charge négative sur l’oxygène de
l’ex-fonction carbonyle. L’intermédiaire tétraédrique est stabilisé par 5 liaisons hydrogène
dont au moins deux entre l’oxygène chargé négativement (l’oxyanion) et les groupes amides
NH du trou oxyanion de la chaîne principale. Par retour du doublet de l’oxygène et le transfert
de proton de l’histidine, une molécule d’eau (R’= H) ou d’alcool est libérée. Le complexe
covalent enzyme-substrat formé est appelé acyl-enzyme. La deuxième étape est une étape de
dé-acylation et fait intervenir une attaque nucléophile qui peut être exercée par une molécule
d’eau (hydrolyse) ou par un alcool (synthèse – estérification) sur le carbonyle de l’acylenzyme. Un deuxième intermédiaire tétraédrique est formé selon un processus analogue à
celui de l’étape d’acylation et conduit à la formation du second produit de la réaction (acide
carboxylique ou ester) avec régénération de l’enzyme native.
His
His
Ser
Ser
H-N
N
-O
+
N-H --
O ---- H-N
H-O
-
Asp
---
O-
O
Asp
R'-O
O
R
R'
Intermédiaire tétraédrique
O
His
----
O
R
O----
- NH
NH
His
Ser
Ser
R''-OH
O
O-
H-N
O
N
O-
R
Asp
NH
N
R
H O
O
R''
oxyanion
O-
----
- NH trou
----
+ R'-OH
H-N
Asp
O ---
O
trou
oxyanion
--NH
NH
Acyl-enzyme
trou
oxyanion
His
His
Ser
Ser
+
---
O ---- H-N
O
-N-H -O
Asp
R''
Intermédiaire tétraédrique
R
O----
----
O
O-
NH
Asp
- NH
O
R''-O
R
trou
oxyanion
O
Figure I-19 : Mécanisme catalytique des lipases
104
H-N
N
H-O
3. Les bases structurales de leur sélectivité
3.1. La sélectivité des lipases :
La sélectivité des lipases comprend plusieurs types de sélectivités différentes :
-
la sélectivité par rapport à la position préférentielle d’hydrolyse sur les triglycérides ou
régiosélectivité (positions sn1, sn2 et sn3)
-
la sélectivité vis-à-vis du substrat (mono-di-triglycérides)
-
la sélectivité vis-à-vis des acides gras (par rapport à la longueur de la chaîne carbonée, de
ses substituants et du degré d’insaturation) ou typosélectivité ,
-
la stéréosélectivité (sélectivité entre deux énantiomères ou deux molécules prochirales)
Les bases de ces sélectivités ont (presque) toujours été reliées à un positionnement
préférentiel du substrat (énergétiquement - stériquement) au niveau du site actif des enzymes.
Ce positionnement préférentiel est déterminé par deux grands types d’approches :
- la co-cristallisation de la lipase avec des analogues de substrat. Ces analogues sont le plus
souvent des phosphonates ou des sulfonates qui se lient covalemment avec la sérine
catalytique de l’enzyme et qui miment l’intermédiaire tétraédrique de l’état de transition. Le
positionnement de ce substrat dans le site actif de l’enzyme permet de déterminer les
paramètres structuraux intervenant dans la sélectivité. Cette méthode n’est pas la plus
couramment utilisée car elle nécessite de passer par une étape de cristallisation souvent
difficile. Cette méthode est la méthode de choix pour ce qui est de la compréhension de la
sélectivité des substrats. Cependant, dans le cas de la co-cristallisation d’un mutant inactif de
la lipase de Thermomyces lanuginosa (sérine catalytique mutée) avec de l’acide oléique, il a
été montré que la mutation de la sérine catalytique en alanine permettait un positionnement de
l’acide oléique impossible dans le cas où l’hydroxyle de la sérine était présent (Yapoudjian, et
al., 2002).
- la modélisation moléculaire : Cette méthode consiste à déterminer la structure d’une
molécule dont la probabilité d’existence est déterminée selon un critère énergétique. Plus
l’énergie d’une conformation sera faible, plus la conformation sera considérée comme stable
et probable. Il existe deux catégories de méthodes de modélisation moléculaire :
- les méthodes quantiques : Ces méthodes sont basées sur la distribution des électrons (en
orbitales moléculaires). Leur complexité augmente rapidement avec le nombre d'électrons et
105
ces méthodes sont donc peu utilisées pour les protéines car limitées par la puissance actuelle
des ordinateurs.
- la mécanique moléculaire : la modélisation moléculaire est une méthode empirique
modélisant les intéractions répulsives et attractives entre atomes par un système purement
mécanique de forces, sans prendre en compte la nature quantique des interactions entre les
électrons et les noyaux. La structure moléculaire est alors représentée par des sphères (les
atomes) reliées entre elles par des ressorts (liaisons). L’énergie potentielle est décomposée en
la somme des énergies de déformation des liaisons (torsion, tension et flexion principalement)
et des énergies dues aux interactions entre atomes (énergie de van der Walls et énergie
électrostatique).
E = E liaison + E torsion + E déformation + E van der walls+ E électrostatique
Chacun de ces termes ayant une valeur d’équilibre préférentielle (longueur de liaison, angle
de liaison, …), l’énergie minimale sera recherchée par optimisation de la géométrie de la
structure. Pour étudier la sélectivité dans ce cadre, la structure de l’enzyme doit être connue
(structure cristallographique/RMN ou modèle in silico par homologie). La mécanique
moléculaire peut servir à l’affinement des modèles de structure d’enzyme construite par
homologie (lorsqu’aucune structure n’est disponible) et/ou à positionner les substrats dans les
sites actifs d’enzyme.
Dans le prochain chapitre, nous nous intéresserons à déterminer les éléments structuraux
responsables des différents types de sélectivité des lipases.
3.2. Typosélectivité (sélectivité vis à vis des différents acides gras) et
topologie du site actif
Pour comprendre les bases moléculaires de la spécificité de substrat des lipases vis-à-vis de la
longueur de la chaîne carbonée, Pleiss et al., (1998) ont comparé la géométrie et les sites de
fixation de la partie alcool et acide des esters. Les auteurs ont ainsi classé les lipases en trois
groupes en fonction de la topologie de leur site actif (cf. Figure I-20) :
-
celles avec une cavité hydrophobe proche de la surface. Les lipases fongiques de type
Rhizomucor miehei font partie de cette famille.
-
celles avec un site actif situé au fond d’un entonnoir (les lipases de Candida
antacrtica, Pseudomonas, la lipase pancréatique et la cutinase de mammifères)
-
celles avec un site actif en forme de tunnel (lipase de Candida rugosa)
106
La spécificité de longueur de chaîne est attribuée à la longueur et aux propriétés du site de
fixation de la partie acyle.
Figure I-20 : Représentation schématique des sites actifs des lipases de Candida antarctica (CALB), de Burkholderia cepacia (BCL=PCL), de Rhizomucor miehei (RML), et de Candida rugosa
(CRL). (a) la direction des vues est indiquée par une flèche. D, Asp; H, His; S, Ser représentent les
acides aminés de la triade catalytique. (b-e) Représentations des sites actifs : vue de côté, de face et de
dessus (Pleiss, et al., 1998). Les nombres indiquent la longueur des acides gras qui peuvent lier
complètement à l’intérieur du site actif.
107
3.3. Régiosélectivité envers les triglycérides
La cristallisation de la lipase de Bulkolderia cepacia (Lang, et al., 1998) révèle la présence de
quatre poches ou cavités, l’une étant celle du trou oxyanion, les trois autres accueillant les
chaînes carbonées des acides gras en position sn1, sn2 et sn3 (voir Figure I-21). La sérine
catalytique se trouve au niveau de la poche où se positionne la chaîne sn3. Les différences de
taille et d’hydrophobicité entre les différents sites d’arrimage, déterminent la régiosélectivité
de la lipase. Les interactions les plus étroites entre l’enzyme et le substrat ont lieu au niveau
de la chaîne en position sn2 et de l’histidine catalytique ce qui laisse supposer que cette cavité
est un déterminant clef de la stéréopréférence de la lipase.
Figure I-21 : Site actif de la lipase de Bulkholderia cepacia d’après Jaeger et al. (1999). Les
poches où se lient les groupements sn1, sn2 et sn3 sont indiquées ainsi que les acides aminés bordant
ces poches.
Une étude portant sur quatre lipases (celles de Rhizopus oryzae, Rhizomucor miehei, Candida
rugosa, et la lipase B de Candida antarctica) met en évidence l’importance de l’histidine
catalytique et de la position sn2 du triglycéride dans la stéréosélectivité des lipases (Pleiss, et
al., 2000b). La majorité des lipases présentent une stéréosélectivité de type sn1 ou sn3. Les
auteurs mettent en évidence un motif structural appelé « fossé histidine » formé par l’histidine
catalytique et un autre acide aminé qui diffère selon la classe de lipase utilisée. La
stéréosélectivité des quatre lipases a pu s’expliquer par la forme de ce motif et la flexibilité du
substrat. Le substituant sn2 vient se positionner dans le fossé histidine et est directement en
contact avec cet acide aminé. Plus les interactions stériques seront fortes, plus la sélectivité
sera orientée vers la position sn3. Ainsi, la stéréosélectivité pourra être affectée soit par la
108
rigidité du substituant sn2 soit par la forme du fossé histidine. Un fossé histidine étroit
implique une stéréopréférence sn3 pour tous les types de substrats (Figure I-22B) ; un fossé
histidine de taille moyenne implique une stéréopréférence sn1 pour les substrats flexibles et
sn3 pour les substrats rigides (Figure I-22A) ; un fossé histidine large implique une
stéréopréférence de type sn1 (Figure I-22C) pour tous les substrats. La forme du site actif et
notamment le positionnement de certaines boucles aura aussi un rôle dans la stéréopréférence.
Lipase de C. rugosa (gris clair) en complexe avec la
trioctanoïne en orientation sn1. Le fossé histidine est
large, les interactions stériques entre le substituant en
sn2 et la phénylalanine 344 sont faibles. La position
sn1 sera préférentiellement hydrolysée.
.
Lipase B de C. antarctica (gris clair) en complexe
avec la trioctanoïne en orientation sn1. Le fossé
histidine étroit entraîne des interactions stériques très
importantes entre le substituant en sn2 et l’isoleucine
189. La position sn3 sera préférentiellement
hydrolysée.
Lipase de R. miehei (gris clair) et R. oryzae en
complexe avec la trioctanoine en orientation sn1. Des
contraintes stériques existent entre le groupement
fonctionnel de la position sn2 et la leucine 258. La
lipase de R. miehei favorisera la position sn1 quelque
soit le substrat utilisé. Par contre la lipase de R.
oryzae favorisera la position sn1 si le substituant
porté par la position sn2 est flexible et sn3 si celui-ci
est rigide
Figure I-22 : Représentation des différents types de fossés histidine d’après Pleiss et al., 2000b
109
3.4. Enantiosélectivité :
3.4.1.
Intérêt des réactions énantiosélectives
L’obtention de molécules chirales pour l’industrie pharmarceutique représentait un marché de
225 milliards d’euros en 2005, soit 37 % des ventes totales de médicaments. C’est un marché
en constante évolution (11 % par an entre 2000 et 2005) (Erb, 2006). Dans ce cadre, les
lipases sont utilisées dans l’industrie pharmaceutique et dans l’industrie des pesticides pour
réaliser la résolution de mélanges racémiques. L’énantiosélectivité peut être mesurée par le
ratio énantiomérique E qui représente le rapport des vitesses initiales de conversion des deux
énantiomères. Pour une application pharmaceutique, le ratio doit être supérieur à 200 pour
une séparation efficace de deux énantiomères ce qui signifie que l’un des énantiomères réagit
200 fois plus vite que l’autre.
3.4.2.
Des règles empiriques
Avant la connaissance de la structure des lipases, des règles empiriques prédisaient
l’énantiosélectivité en fonction de la géométrie des substrats. Ces règles se basaient sur des
criblages systématiques de nombreux substrats. Les plus usitées étaient connues sous le nom
de « règles de Kazlaukas », et prédisaient quel énantiomère d’un alcool secondaire réagirait
préférentiellement (Kazlauskas, et al., 1991). Cette règle est représentée sur la figure I-23 et
est applicable à des réactions d’hydrolyse (le substrat étant un ester) et de transestérification
(le substrat étant l’alcool) pour de nombreuses hydrolases. Elle suppose que la base de
l’énantiosélectivité repose sur la différence de taille entre les deux substituants d’un alcool
secondaire. Cette règle présume des poches de tailles différentes autour du site actif de
l’enzyme où vont se loger les différents substituants de l’alcool secondaire.
Figure I-23 : Régle de Kaslauskas présant la sélectivité des lipasespour les alcools secondaires.
Quand l’alcool est dessiné avec le groupe hydroxyle pointant vers l’avant, M représentant un
substituant de taille moyenne et L un substituant de taille large, alors, l’énantiomère préférentiel est
celui possédant le substituant large vers la droite.
110
3.4.3.
Structures cristallographiques
La résolution des structures cristallographiques de diverses lipases en présence des
énantiomères a permis de mieux comprendre la sélectivité des lipases. Ainsi, la cristallisation
de la lipase de Candida rugosa en présence d’homologues de substrats pour chacun des deux
énantiomères, révèle deux poches qui ressemblent à celles prédites par les règles empiriques
de Kaslauskas : l’une hydrophobe et de taille large, et l’autre plus petite qui peut acueillir le
substituant de taille moyenne. Cependant, les seules interactions stériques (forme des poches)
ne suffisent pas pour quantifier la sélectivité. Celle-ci est basée sur d’autre types
d’interactions moléculaires entre l’enzyme et chacun des énantiomères. Une comparaison des
modes de liaison des intermédiaires tétraédriques pour chacun des énantiomères, montre que
la discrimination entre les deux énantiomères semble se faire via une liaison hydrogène
supplémentaire pour l’énantiomère préférentiel (Cygler, et al., 1994).
3.4.4.
Modélisation par mécanique moléculaire.
Si la co-cristallisation de l’enzyme et de son substrat n’est pas disponible (ce qui est souvent
le cas), on a recours à la mécanique moléculaire pour placer le substrat à l’intérieur de
l’enzyme dans la position la plus énergétiquement probable. La connaissance de la structure
de l’enzyme est indispensable (structure cristallographique ou modèle in silico réalisée par
homologie avec les structures déjà existantes). Deux types d’approches sont communément
utilisés : la modélisation de l’état de transition, et le simple docking du substrat à l’intérieur
du site actif de l’enzyme. Ces deux approches sont basées sur des calculs d’optimisation de la
conformation par minimisation d’énergie et peuvent être accompagnées de procédures de
dynamique moléculaire.
La modélisation de l’état de transition.
L’état de transition est modélisé pour chacun des deux énantiomères, l’intermédiaire
tétraédrique étant considéré comme le meilleur modèle de l’état de transition (Warshel, et al.,
1989). Le positionnement initial des intermédiaires tétraédriques dans le site actif de l’enzyme
est guidé par les structures de lipases complexées avec les analogues de substrats (si elles
existent), de manière à ce qu’ils soient placés dans une position catalytiquement active
(liaisons hydrogène essentielles établies). L’énergie des intermédiaires tétraédriques est alors
minimisée pour chacun des deux énantiomères et l’intermédiaire tétraédrique possédant
l’énergie la plus faible, c’est-à-dire le plus stable, sera l’énantiomère préférentiel (voir schéma
Figure I-24).
111
[ER]#
+R
[ER]
E+PR
[ES]#
E
+S
[ES]
E+PS
E+ R ou S
E+PR
E+P S
Figure I-24 : E enzyme, R et S substrats énantiomériques, PR et PS produits énantiomériques,
[ER] et [ES], le sigle # représente l’état de transition, ∆∆G≠ la différence d’énergie libre entre les
états de transition des deux énantiomères.
La théorie des états de transition donne une relation entre l’énantiosélectivité et l’énergie libre
de gibbs des états de transition des énantiomères.
∆∆G# R-S = ∆G#R- ∆G#S= -RT lnE avec ∆G# = ∆H#-T ∆S#.
Pour les calculs de modélisation moléculaire, l’entropie est négligée et la différence d’énergie
potentielle entre les états de transition des deux énantiomères (∆Ep#) est approximée par la
relation suivante : ∆Ep# ≈ ∆∆G#R-S ≈ ∆∆H#R-S ≈ - RTln E
Ce type de calcul a permis d’évaluer l’énantiosélectivité de nombreuses lipases (Norin, et al.,
1994). Il est à noter que dans les réactions de transestérification, les étapes d’acylation et de
dé-acylation peuvent conduire à la formation d’un intermédiaire tétraédrique chacun pouvant
contribuer à l’énantiosélectivité de la lipase.
Docking
Des manipulations qui ne modélisent pas l’état de transition mais qui regardent seulement le
positionnement des deux énantiomères dans le site actif de la lipase ont aussi permis
d’expliquer l’énantiosélectivité de nombreuses lipases. Citons l’exemple de la lipase de
Thermomyces lanuginosa dont l’énantiosélectivité a été expliquée par différents modes
d’arrimage des substrats étudiés dans le site actif de l’enzyme (Berglund, et al., 1999). Les
substrats étudiés sont des esters d’acide 2-phénoxyalcanoïques présentant une chaîne alkyle
plus ou moins longue. La partie alcool des substrats (éthyl) est de petite taille et se place sans
difficulté dans la poche alcool de l’enzyme. La partie acyle du substrat est composée de trois
groupements, un hydrogène, un groupe phénoxy et une chaîne carbonée alkyle qui peut être
plus ou moins longue. Le site actif de la lipase est en forme de crevasse. Le fond de la
crevasse étant trop étroit pour accueillir un autre substituant que l’hydrogène, celui-ci pointera
toujours vers le fond de la crevasse, les groupements phénoxy et alkyle se logeront dans la
crevasse. Ceci conduit à quatre positionnements théoriquement possibles dans le site actif de
la lipase. Ces quatre positionnements sont illustrés dans la figure I-25.
112
Figure I-25 : Les quatre positionnements théoriquement possibles des substrats (esters d’acide 2phénoxyalcanoiques) à l’intérieur du site actif de la lipase de Thermomyces lanuginosa
(Berglund, 2001). Les positionnements non possibles sont barrés avec des pointillés.
Ce nombre est restreint à deux positionnements possibles Rdown et Sup car la conformation du
site actif rend le positionnement du substrat S impossible en position down ; et le
positionnement Rup conduit à la formation d’une liaison hydrogène non favorable avec
l’histidine catalytique. La différence d’énantiosélectivité observée avec les différents substrats
s’explique par l’utilisation optimale de l’énergie de liaison avec la crevasse. Si le substrat de
la chaîne alkyle est de petite taille alors, le groupement phénoxy se placera préférentiellement
dans la crevasse impliquant une énantiosélectivité de type R (Rdown) ; si la chaîne alkyle est de
longue taille, c’est elle qui se positionnera dans la crevasse, l’énergie d’interaction entre la
chaîne alkyle et la crevasse sera mieux utilisée. Cette théorie est vérifiée par des calculs
d’énergie potentielle avec les différents substrats.
Introduction de la composante entropique dans l’énantiosélectivité
Nous avons vu précédemment que l’énantiosélectivité était reliée à la différence d’énergie
libre entre les états de transition des deux énantiomères par la relation.
∆∆G#R-S = ∆∆H#R-S -T ∆∆S#R = RTln E
Théoriquement pour améliorer l’énantiosélectivité, augmenter∆∆G#R-S, il faut augmenter
∆∆H#R-S ou diminuer T ∆∆S#R. (Figure I-26).
Figure I-26 : Profils énergétiques pour la catalyse enzymatique d’un substrat chiral dont les
énantiomères sont R et S d’après Ottosson (2001). G : énergie de Gibbs, H entalpie et S entropie
113
Les calculs de modélisation moléculaire considèrent la différence d’entropie entre les états de
transition des deux énantiomères comme négligeable devant l’effet enthalpique et
approximent donc l’énergie potentielle à la seule composante enthalpique. Cependant,
certaines
études
montrent
que
l’entropie
contribue
de
manière
significative
à
l’énantiosélectivité (Overbeeke, et al., 2000; Raza, et al., 2001).
Une étude portant sur l’effet de l’entropie du substrat dans l’énantiosélectivité de la lipase B
de C. antartica (Ottosson, et al., 2002a) montre que la composante entropique représente
environ 25 à 60% de la composante enthalpique. Celle-ci ne peut donc être négligée. Les
expériences de modélisation moléculaire ne prenant pas en compte ce facteur sont donc
incomplètes. D’autre part, les auteurs soulignent que les facteurs stériques seuls ne suffisent
pas à expliquer la contribution de l’entropie à l’énantiosélectivité. La composante entropique
peut se représenter par un nombre plus ou moins élevé de conformations possibles pour l’état
de transition.
Une autre étude montre que l’état de solvatation de l’enzyme et des substrats dans leur état de
transition a aussi une influence non négligeable sur l’entropie et l’énantiosélectivité de
l’enzyme (Ottosson, et al., 2002b). Ces études définissent la composante entropique comme
une composante du degré de liberté du substrat dans le site actif de l’enzyme, du degré de
liberté des chaînes latérales des acides aminés du site actif, et de la différence de solvatation
entre les deux énantiomères. Une étude récente sur cette même lipase (Leonard, et al., 2007)
montre comment l’activité de l’eau peut modifier l’énantiosélectivité : le positionnement
d’une molécule d’eau dans le site actif de l’enzyme est responsable d’une stabilisation
entropique du substrat et améliore l’énantiosélectivité.
Nouvelles approches
Nous avons vu que couramment, l’étude de l’énantiosélectivité se fait par des approches de
docking ou de différence d’énergie entre les états de transition des deux énantiomères.
Cependant, ce type d’approche ne permet pas toujours d’expliquer l’énantiosélectivité.
Une approche originale a été développée par Guieysse et al. pour les lipases à tunnel
(Guieysse, et al., 2003). Cette approche se base sur les trajets des énantiomères dans le tunnel
d’accès au site actif. Les auteurs ont tenté d’élucider les bases de l’énantiosélectivité de la
lipase de Pseudomonas cepacia présentant une forte énantiosélectivité pour les esters d’acide
2-bromophenyl acétique (E=57). En effet, la première approche basée sur le calcul des
énergies d’interaction entre les intermédiaires tétraédriques et le site actif de la lipase ne
permet pas d’expliquer l’énantiosélectivité observée : l’énergie potentielle est la même pour
114
les deux énantiomères. La deuxième approche est basée sur la pseudo dynamique en
environnement contraint et mime le trajet de chacun des énantiomères dans le tunnel d’accès
au site actif. Par cette méthode, l’énergie d’interaction du substrat avec l’enzyme est toujours
la plus faible pour l’énantiomère préférentiel. D’autre part, cette méthode permet d’identifier
les résidus qui vont perturber le trajet dans le site actif de l’enzyme et ainsi, la mutation de ces
résidus clefs permettra de moduler l’énantiosélectivité de la lipase.
Cette approche étant coûteuse en temps de calcul, une autre méthode basée cette fois-ci non
pas sur de la pseudo-dynamique moléculaire mais sur de la robotique (le substrat étant un
robot qui explore l’espace géométrique du tunnel du site actif) donne des résultats similaires.
(Cortes, et al., 2005; Guieysse, et al., 2003). Dans cette approche robotique, les atomes du
substrat et de l’enzyme sont représentés par des sphères reliées. Le substrat est considéré
comme un robot articulé se déplaçant dans un environnement également articulé : le site actif
de la protéine. Un algorithme de planification de mouvements permet de prendre en compte la
flexibilité du substrat et la plasticité de l’enzyme (Cortes, et al., 2005). La recherche des
trajectoires du substrat dans le site actif de l’enzyme se fait de façon aléatoire. L’algorithme
construit par incrémentation une structure arborescente qui étend ses branches vers des
régions inconnues de l’espace de recherche. Ceci permet une exploration complète de l’espace
géométrique contraint et enfoui du site actif (figure I-27), tout en réduisant les temps de calcul
à seulement quelques minutes. Le rapport de temps de calcul moyen nécessaire pour obtenir
50 trajectoires avec les énantiomères (R) et (S) a pu être corrélé avec la valeur expérimentale
de l’énantiosélectivité (Eexp) (Cortés et coll., 2005). De plus, l’utilisation d’un détecteur de
collisions ((Ruiz de Angulo, et al., 2005)), intégré à l’algorithme de planification de
mouvements, peut permettre d’identifier les acides aminés contraignant le déplacement des
énantiomères le long du site actif de la lipase.
Figure I-27 : Représentation schématique de l’exploration complète de l’espace géométrique du
site actif de BCL via l’algorithme de planification de mouvements.
115
Conclusion : Les bases structurales de la sélectivité des lipases sont intimement liées à leur
structure et à l’adéquation qui existe entre le site actif de l’enzyme et son substrat. Les études
structurales menées à ce jour ont permis d’identifier plusieurs « poches » où viennent se
positionner les différents substituant des substrats. Leur forme, leur positionnement, leur
hydrophobicité et leur adéquation avec le substrat sont les déterminants de la sélectivité des
lipases. L’approche de la co-cristallisation est la méthode permettant le mieux de comprendre
les bases de la sélectivité. Cependant, si aucune structure de l’enzyme co-cristallisée avec son
substrat n’est disponible, les expériences de modélisation moléculaire (modélisation de
l’intermédiaire tétraédrique ou simple docking) permettent de comprendre l’adéquation entre
le substrat et le site actif de l’enzyme. Ces techniques sont cependant parfois limitées, car la
sélectivité ne dépend pas seulement du positionnement du substrat dans le site actif de
l’enzyme (Cortes, et al., 2005; Guieysse, et al., 2008; Guieysse, et al., 2003), mais dépend
aussi de facteurs entropiques souvent ignorés dans les calculs de minimisation d’énergie.
4. La lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica
Depuis longtemps, la levure Yarrowia lipolytica est étudiée pour son activité lipase
extracellulaire (Peters and Nelson, 1948a; Peters and Nelson, 1948b). La lipase responsable
de cette activité, la lipase Lip2, a été depuis caractérisée plus finement par différentes équipes
(Aloulou, et al., 2007b; Pignede, et al., 2000a; Yu, et al., 2007a; Yu, et al., 2007b). Il est à
noter que la lipase de Candida sp 99-125 et lipase Lip2 de Y. lipolytica ne font qu’une et
même lipase car cette espèce appartient en fait au genre Y. lipolytica.
4.1. Applications
La lipase de Yarrowia lipolytica présente de nombreux intérêts industriels (tableau I-12). Une
application particulièrement prometteuse réside dans sa capacité à résoudre des mélanges
racémiques d’acides carboxyliques 2-substitués. C’est dans ce cadre que nous nous
intéressons à la lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica. Il a récemment été montré que la lipase de
Yarrowia lipolytica présentait une activité et une énantiosélectivité supérieures aux lipases
testées précédemment pour la résolution de dérivés d'acides 2-bromo-arylacétiques (Guieysse,
et al., 2004). Ces composés présentent un grand intérêt pour l’industrie pharmaceutique car ils
sont utilisés comme base pour la synthèse de médicaments (précurseurs d’analgésiques, de
116
prostaglandines et de pénicillines semi-synthétiques). Cependant, à l’origine de ce travail,
l’énantiosélectivité n’était pas encore suffisante pour une application pharmaceutique.
Tableau I-12 : Applications industrielles et potentielles de la lipase Lip2 de Y. lipolytica
APPLICATIONS INDUSTRIELLES EN COURS
Domaine
d'application
Utilisation
Exploitant
Pharmacie
Traitement de l'insuffisance pancréatique Substitution de la lipase pancréatique humaine
Essais cliniques Laboratoire Mayoli Spindler
Nutraceutique
Complément alimentaires dans le but de réduire
les quantités de graisses assimilées
Commercialisé par la société
Artechno
Environnement Traitement d'effluents chargés en matière grasse
Commercialisé par la société
Artechno
APPLICATIONS POTENTIELLES
Domaine
d'application
Energétique
Utilisation
Auteurs
Production de Biodiesel (ester méthyliques) à partir Nie et al., 2006 ; Lu et al.,
de triglycérides(huiles) ou d'acide gras.
2007 ; Li Deng et al., 2003
Chimie fine
Résolution d'esters d'acides 2-bromo-arylacétiques Guieysse et al., 2004
(importants intermédiaires dans l'industrie
Cancino et al., 2008
pharmaceutique)
Chimie fine
Synthèse d'acides gras de 2-ethylhexanol (esters) : He etal., 2002 ; Tan et al.,
plastifiants, lubrifiants... utilisés dans les industries 2006
cosmétique, pharmaceutique, chimique et
alimentaire.
Pharmacie
Concentration du DHA éthyl ester à partir d'huile de Marty communication
thon
personnelle
4.2. Systèmes de production
L’intérêt industriel qu’elle offre (tableau I-12) explique les différentes tentatives pour la
surproduire par des systèmes d’amplification géniques (Pignede, et al., 2000b), d’ingénierie
de la souche (Fickers, et al., 2005d; Fickers, et al., 2003b; Tan, et al., 2003), d’expression par
d’autres organismes, ou d’optimisation du milieu et de la conduite de production (Destain,
1998; Destain, et al., 2005; Faure, 2002; Fickers, et al., 2005b; Fickers, et al., 2004; Peters
and Nelson, 1948a; Peters and Nelson, 1951; Tan, et al., 2003)
La lipase est conventionnellement produite de façon homologue dans des souches des Y.
lipolytica modifiées pour améliorer la production (Fickers, et al., 2003b; Pignede, et al.,
2000b). Dans la souche sauvage, la lipase est sécrétée dans des milieux nécessitant une huile
(huile d’olive- trioléine) ou un acide gras (acide oléique). La souche LGx 64,81 mise au point
117
par mutagenèse chimique sur la souche sauvage dans l’équipe du professeur Thonart est
capable de produire de grandes quantités de lipase sur milieu sans huile contenant du glucose.
Dans ce cas, le système de régulation de la lipase semble avoir été modifié (Fickers, et al.,
2005e). Dans les souches recombinantes, la production de lipase est dépendante du promoteur
utilisé. Le promoteur POX2 permet de fortes productions de lipase et est le plus utilisé, c’est
dans ce cas la présence d’acide oléique ou même de méthyl oléate (Fickers, et al., 2005b) qui
induira la production de lipase. On notera aussi que récemment, la lipase de Y. lipolytica a été
produite de manière hétérologue dans la levure Pichia pastoris (Aloulou, et al., 2007a; Yu, et
al., 2007a). En effet, la lipase produite par Y. lipolytica se présentait de manière agrégée avec
des lipides (Aloulou, et al., 2007b) car l’acide oléique était utilisé comme source de carbone
pour la croissance de la souche et pour l’induction de la lipase.
4.3. Caractérisation
La lipase Lip2 mature est une protéine glycosylée de 38 kDa codée par le gène LIP2 de
Yarrowia lipolytica (301 acides aminés). La protéine est d’abord produite sous forme d’une
pré-pro-enzyme de 334 acides aminés qui présente une séquence signal avec quatre motifs XAla, X-Pro (substrats d’une diaminopeptidase), une région Pro de 12 acides aminés et un site
Lys-Arg (substrat de l’endoprotéase codée par le gène XPR6). Certains auteurs notent la
présence de différentes isoformes. Ainsi, trois à quatre isoformes présentant des points
isolélectriques allant de 5,0 à 5,4 ont été identifiées par IEF (Aloulou, et al., 2007b; Destain,
et al., 1997), ces isoformes étant probablement des isoformes de glycosylation (Aloulou, et
al., 2007b).
L’enzyme a été caractérisée par de nombreuses équipes sur sa thermostabilité et sa gamme de
résistance au pH, (Aloulou, et al., 2007b; Destain, et al., 1997; Peters and Nelson, 1948b; Yu,
et al., 2007b). La lipase est active à basse température (jusqu’à 5°C) et est rapidement
inactivée au delà de 50°C, l’optimum de température se situe entre 30°C et 40°C selon les
auteurs. Elle est active dans une gamme de pH allant de 4,0 à 8,0 avec un optimum donné
entre pH 6.0 et 8.0 selon les substrats. La comparaison récente à la lipase de Thermomyces
lanuginosa (Aloulou, et al., 2007a) a mis en évidence que Lip2 présentait une trop faible
thermostabilité pour des applications industrielles à haute température. Les auteurs
recommandent son utilisation comme substitut à la lipase pancréatique humaine (activité à la
température de 37°C - activité sur les triglycérides à longues chaînes carbonées à pH acide)
118
4.4. Conclusion :
La lipase de Yarrowia lipolytica présente des propriétés intéressantes pour de nombreux types
d’applications (Tableau I-12). Cependant, malgré ses spécificités, un biocatalyseur n’est
jamais parfaitement adapté à un procédé industriel (spécificité insuffisante, faible
thermostabilité). Dans le cadre de la résolution de mélange racémique d'acides 2-bromoarylacétiques par exemple, l’énantiosélectivité (bien que supérieure à celle des autres lipases
existantes) n’est pas suffisante pour une application industrielle. Une autre limitation de
l’enzyme est sa faible thermostabilité (Aloulou, et al., 2007a).
119
Quatrième partie : Introduction à la résolution de la
structure des protéines par cristallographie aux rayons X.
Introduction
Pour avoir accès à la structure de macromolécules par un système optique avec une résolution
atomique, il est nécessaire de disposer d’une source de rayonnement de longueur d’onde
compatible avec les dimensions de l’objet à observer. Les distances inter-atomiques étant de
l’ordre de l’angström, le rayonnement le plus approprié est le rayonnement X (0,1 à 100 Å).
Plusieurs problèmes se posent alors. Premièrement, l’interaction entre le rayonnement X et
une macromolécule isolée est trop faible pour pouvoir être mesurée, il faut donc qu’un grand
nombre de molécules diffusent les rayons X pour pouvoir additionner leurs contributions.
Pour avoir une diffusion cohérente de toutes les molécules dans l’espace, celles-ci doivent
être organisées de façon périodique dans l’espace. Ceci correspond à la définition d’un cristal,
c’est pourquoi la première étape consiste en l’obtention de cristaux de protéines
(cristallogenèse). Cette étape est souvent l’étape limitante car les conditions conduisant à
l’obtention de cristaux ne peuvent être déterminées qu’empiriquement.
Les protéines organisées en cristal seront alors soumises à un rayonnement X. L’interaction
entre les électrons de la matière (organisés de façon périodique dans le cristal) et le
rayonnement X (onde électromagnétique caractérisée par son amplitude et par sa phase)
donnera lieu à un phénomène de diffraction des rayons X. Cependant, aucune lentille n’est
appropriée à cette source de rayonnement. En effet lorsqu’un objet est soumis à un
rayonnement, l’interaction entre la lumière et l’objet peut se comparer à la transformée de
Fourier de l’objet. Pour reconstituer l’image, une lentille est nécessaire pour réaliser la
transformée de Fourier inverse (c’est le rôle de notre œil), comme aucun type de lentille n’est
adapté à ce type de rayonnement, c’est à partir des images de diffraction et de calculs que
l’image de la molécule ou plus exactement de sa densité électronique pourra être reconstituée.
C’est là que se pose le second problème, le calcul de la densité électronique de l’objet
nécessite deux types d’informations. La permière est une information relative à l’amplitude de
l’onde diffractée (proportionnelle à l’intensité des taches de diffraction) ; celle-ci est
directement accessible expérimentalement. La seconde est une information dite de phase
correspondant au déphasage de l’onde diffractée par rapport à l’onde incidente. C’est dans la
121
détermination de cette phase que réside le second problème. Cette partie vise donc à
introduire les notions nécessaires à la compréhension des résultats obtenus au cours de ces
travaux. Dans un premier temps nous introduirons des notions géométriques concernant
l’organisation d’un cristal et le principe de la diffraction des rayons X par un cristal organisé.
Dans un second temps nous détaillerons les étapes nécessaires à la résolution de la structure
tridimensionnelle des protéines, de la cristallisation au traitement des données, et jusqu’à
l’affinement de la structure.
h,k,l
λ RX
x,y,z
Cristal
Pas de lentille RX
⇒ pas de refocalisation possible
⇒ calcul de l’image par
Transformée de Fourier inverse
ρ ( x, y , z ) =
∞
1
∞
∞
∑ ∑ ∑mF
hkl
maille h = −∞ k = −∞ l = −∞
V
hkl
eiφhkl e − 2iπ ( hx + ky +lz )
Module du facteur de structure : relié à amplitude des intensités mesurées
Information de phase perdue
Figure I-28 : Représentation schématique des deux principaux problèmes rencontrés dans une
expérience de diffraction d’un cristal de protéine aux rayons X (les explications quant aux termes
de l’équation sont fournies par la suite)
1. Description géométrique d’un cristal
Par convention dans la suite de cet exposé, les vecteurs seront écrits en gras.
1.1. Description d’un cristal (voir figure I-29)
Un cristal est un arrangement périodique d’un motif dans les trois directions de l’espace,
c’est-à-dire disposé selon un réseau. Le réseau ponctuel est construit à partir des 3 vecteurs
de base a, b, c. Ces trois vecteurs définissent la maille (plus petit élément permettant la
reconstruction du cristal par les translations du réseau), le motif de chaque maille étant
identique. Un motif peut être composé d’un arrangement d’éléments plus petits. Ainsi, l’unité
122
asymétrique est le plus petit élément permettant de générer tout le cristal par les opérations
de symétrie du cristal.
Opérations du
groupe ponctuel
unité
asymétrique
Plus petit élément
permettant la
reconstruction de la
maille par les
symétries du cristal
Translations
du réseau
maille
Plus petit élément
permettant la
reconstruction du
cristal par les
translations du réseau
.
.
.
.
➙
b
a➙
.
.
.
.
.
.
.
.
cristal
.
.
.
.
Répétition d’une maille :
un motif à chaque nœud du réseau
Figure I-29 : Représentation des éléments constitutifs d’un empilement cristallin
Cette maille élémentaire est caractérisée par six valeurs : la longueur des vecteurs a, b, et c et
trois angles uniques α, β, et γ (angles respectivement formés par les vecteur b et c, a et c et a
et b). Les caractéristiques de ces six paramètres permettent de décrire sept systèmes cristallins
différents (Figure I-30). D’autre part, l’arrangement des nœuds à l’intérieur de ces systèmes
cristallins peut se faire selon quatre types de réseaux : de type primitif (P), faces centrées (F),
corps centré (I) ou bases centrées (C). L’ensemble des combinaisons « types de réseau » « système cristallin » possible est représenté par 14 réseaux appelés réseaux de Bravais
(Figure I-30).
Un empilement 3D périodique est décrit par un groupe d’espace. Il existe 230 façons
périodiques d’empiler des objets en 3D c’est à dire 230 groupes d’espace. Chaque groupe
d’espace décrit :
- la géométrie de la maille
- les éléments de symétrie dans la maille (nature et positions)
On en déduit l’organisation des molécules dans la maille et donc dans le cristal. Du fait de la
nature chirale des protéines, toutes les opérations de symétrie qui entraînent une inversion de
la chiralité ne seront pas applicables (miroir, plan de glissement et centre de symétrie), ce qui
123
réduit le nombre de groupes d’espace à 65. On parle alors de groupes d’espace
énantiomorphes.
Cubique
a= b=c
α = β = γ = 90°
Quadratique (tétragonal)
a= b
P
α = β = γ = 90°
Orthorhombique
α = β = γ = 90°
P
Hexagonal/trigonal
a= b
α = β = 90°
γ = 120°
P
Triclinique
P
F
I
P
4 types de réseau (P,I,F,C)
7 systèmes cristallins
= 14 réseaux de BRAVAIS
I
C
I
Rhomboèdrique
a= b=c
F
P
Monoclinique
α = γ = 90°
P
C
Figure I-30 : Représentation des 14 réseaux de Bravais P : Primitif – F : Faces centrées – I :
centré – C : Bases centrées.
1.2. Equations de Laue et loi de Bragg : deux visions du phénomène
de diffraction
Lorsqu’un cristal est illuminé par un faisceau de rayons X, il se produit un phénomène de
diffraction : les interférences des ondes diffusées ne seront constructives que sous certaines
conditions et par conséquent les ondes diffractées ne seront visibles que dans certaines
directions de l’espace. Les équations de Laue définissent dans quelles directions de l’espace le
phénomène de diffraction sera visible.
Soit u0 le vecteur d’onde incident et u le vecteur d’onde diffusé. L’angle que fait u avec u0 est
de 2θ. Le vecteur de diffusion est défini comme S=u-u0. La diffraction par un réseau dont les
vecteurs de base sont a, b, et c ne sera observée que dans les directions de l’espace vérifiant
les équation de Laue.
a.S = h (⇔ tous les plans de type h seront orthogonaux à a et équidistants de 1/a)
124
b.S = k (⇔ tous les plans de type k seront orthogonaux à b et équidistants de 1/b)
c.S = l (⇔ tous les plans de type l seront orthogonaux à c et équidistants de 1/c)
où h, k et l sont des entiers
Les plans réticulaires h, k et l définissent alors le réseau réciproque. Ainsi, plus les paramètres
de maille (définis par les vecteurs a, b, et c) seront grands, plus les plans réticulaires h, k et l
formeront un réseau réciproque dense (car les plans de type h distants de 1/a seront d’autant
plus rapprochés que a est grand).
La loi de Bragg formule de manière différente les conditions de Laue mais permet
d’introduire la construction d’Ewald qui permet de schématiser de manière pratique les
conditions de diffraction. Les taches de diffraction sont souvent appelées réflexions car tout se
passe comme si le cristal était formé d’une multitude de miroirs (nommés plans de « Bragg »)
réfléchissant les rayons X. Soit d la distance entre deux plans réticulaires, alors, les conditions
de diffraction dans ce cas sont vérifiées pour l’équation suivante : 2d sin (θ) = nλ, où λ est la
longueur d’onde incidente. Seuls les nœuds du réseau réciproque qui vérifieront la relation de
Bragg seront sur la sphère dite d’Ewald (Figure I-31), une sphère ayant pour centre l’origine
du réseau direct et pour rayon 1/λ, et seront en condition de diffraction. Pour une orientation
donnée du cristal, il n’y a que certains nœuds du réseau réciproque qui se trouvent sur la
surface de la sphère d’Ewald.
u1 S
Faisceau
incident
θ
u0
O
r =1/λ
Réseau
réciproque
Cristal au centre de la sphère de rayon 1/λ
u0 : rayons X incidents
u1 : faisceau diffracté
O : origine du réseau réciproque
Distance cristal détecteur
Figure I-31 : Construction de la sphère d’Ewald.
125
1.3. Facteur de structure et densité électronique
Le facteur de structure représente l’onde diffractée résultant de l’interaction entre l’onde
incidente et le cristal ce qui signifie que c’est une grandeur complexe qui peut être
caractérisée par son amplitude et par sa phase. Pour un atome à une position r : le facteur de
structure est défini par F(S) = f(S) e(2iπ
r.S)
avec f(S) représentant le facteur de diffusion
atomique (dépend du nombre d’électrons de l’atome et de l’angle de diffusion θ).
Pour une molécule contenant plusieurs atomes le facteur de structure F(S) sera défini par la
somme des facteurs de diffusion atomique de chacun des atomes contenus dans la maille,
pondérés par leur position dans cette dernière, c’est à dire:
F(S) =
∑
fj e(2iπ r.S)
j =1, n
Il est alors possible d’écrire de deux manières l’onde diffractée :
-
somme des contribution électroniques des n atomes de coordonnées fractionnaires
(xj,yj,zj)
F ( h, k , l ) =
∑f
j =1, N
-
j
e
2 iπ ( hx j + ky j + lz j )
sommes des densités électroniques sur l’ensemble du volume de la maille (V)
F (h,k,l) =
∫ρ
V
(2iπ hx+ky+lz)
(x,y,z) e
.dV
avec ρ (x,y,z) la densité électronique au point (x,y,z)
Cette relation est intéressante puisqu’elle permet de relier la densité électronique en tout point
de la maille avec le facteur de structure par une relation bien connue des mathématiciens, la
transformée de Fourier.
ρ ( x, y , z ) =
1
∞
∞
∞
∑ ∑ ∑ Fm
Vmaille h = −∞
k = −∞ l = −∞
hkl
e − 2iπ ( hx+ ky +lz )
126
1.4. Le problème des phases
Les protéines organisées en cristal vont entraîner la diffraction des rayons X dans des
directions particulières de l’espace, l’analyse des données se fera donc à partir des
diffractogrammes obtenus. L'objet (le cristal) peut être représenté comme le produit de
convolution d'un motif (la macromolécule ou une association de macromolécules) par un
réseau (caractérisé par la maille et le groupe d'espace du cristal). Le cliché de diffraction est
la transformée de Fourier de la densité électronique de l'objet : ρ (x,y,z) et est donc le
produit des transformées de Fourier du motif par celle du réseau. La transformée de Fourier
du réseau est un réseau, le réseau réciproque. Il vient donc que le cliché de diffraction
représente la transformée de Fourier de la densité électronique échantillonnée aux nœuds du
réseau réciproque. (cf. Figure I-32).
Amplitude = saturation
Phase = couleur
•
*
=
TF-1
TF
x
=
Figure I-32 : Transformées de Fourier d’un motif d’un réseau et d’un cristal
La densité électronique de l’objet peut être reconstituée à partir des taches de diffraction selon
la formule suivante :
ρ ( x, y , z ) =
1
∞
∞
∞
∑ ∑ ∑ Fm
Vmaille h = −∞
k = −∞ l = −∞
hkl
e − 2iπ ( hx+ ky +lz )
Rappelons que le facteur de structure Fhkl est le vecteur caractérisant chacune des ondes
diffractées (taches de diffraction) ; c’est une grandeur complexe caractérisée par son
module│Fhkl│ et sa phase Ф.
ρ ( x, y , z ) =
1
∞
∞
∞
∑ ∑ ∑mF
hkl
maille h = −∞ k = −∞ l = −∞
V
127
hkl
e iφhkl e − 2iπ ( hx + ky +lz )
Chaque tache de diffraction contient donc plusieurs informations nécessaires au calcul de la
densité électronique :
-
sa position traduite par les indices de Miller (h, k, l) dans le réseau réciproque
-
Le module du facteur de structure │Fhkl│, celui-ci peut être relié à l’intensité (Ihkl) de
la tache mesurée par la relation Fhkl = I hkl
-
sa phase Ф (la lumière étant une onde électromagnétique toutes les taches arriveront sur
le détecteur avec un certain déphasage).
Et c’est ici que se pose le problème du cristallographe, le calcul de la densité électronique en
tout point de la maille ne peut se faire que si l’on a accès à ces trois données. Or l’information
de phase est perdue lors de l’acquisition des diffractogrammes (seules les intensités des ondes
diffractées sont mesurées et l’information de déphasage des ondes entre elles est perdue).
Il est toutefois possible de retrouver cette information de manière indirecte. Il existe deux
grandes méthodes pour retrouver cette information :
-
le remplacement moléculaire : cette méthode consiste à appliquer les phases obtenues
pour les structures de protéines homologues déjà identifiées
-
le phasage ab initio : La phase doit être déterminée expérimentalement en utilisant des
méthodes basées sur la détermination des positions d’atomes spéciaux : des atomes
riches en électrons (atomes lourds).
La détermination de la phase reste une étape déterminante dans la résolution de structures par
diffraction aux rayons X. Grâce à cette information, la carte de densité électronique peut être
calculée. A partir de cette carte, la construction du modèle initial pourra être réalisée. Il sera
ensuite affiné et complété de manière à traduire au mieux les données expérimentales.
1.5. Périodicité et résolution cristallographique
La résolution traduit la précision avec laquelle la densité électronique sera observée. Plus le
cristal sera périodique à longue distance (plus il sera parfait) et plus la résolution sera
importante (valeur algébrique faible) (Figure I-33).
128
4,0 Å
Difficile de
construire le
modèle
3,0 Å
On commence a
reconnaitre les
acides aminés
2,0 Å
A cette résolution
on peut voir les
molécules d’eau
1,0 Å
Résolution atomique
On voit chaque
atome séparément
Figure I-33 : Résolution cristallographique et enregistrement de jeu de données
2. Etapes
dans
l’obtention
d’une
structure
tridimensionnelle par diffraction rayons X.
2.1. Obtention d’un cristal
Pour cristalliser une protéine, la concentration en protéine en solution doit dépasser son seuil
de solubilité et atteindre un état de sursaturation métastable sans pour autant précipiter.
(Voir figure I-34). Cet état peut être atteint par « concentration » progressive de la protéine
dans la solution de cristallisation par différentes méthodes (méthode de diffusion de vapeur,
méthode de diffusion de liquide, …). De même l’agent précipitant contenu dans la solution de
cristallisation a pour rôle de diminuer la solubilité de la protéine.
Pour la méthode de diffusion de vapeur, le système est clos hermétiquement, et c’est la
composition du réservoir contenant la solution de cristallisation (dont le volume est considéré
comme infini par rapport à celui de la goutte) qui impose les conditions d’équilibre.. Ainsi,
une partie de l’eau contenue dans la goutte s’évapore vers le réservoir de façon à ce que les
activités thermodynamiques soient les mêmes dans la goutte et dans le réservoir. Ainsi la
129
concentration en protéine et la concentration en agent précipitant dans la goutte vont peu à
peu augmenter jusqu’à atteindre la zone de nucléation. De petits cristaux apparaissent, ceci a
pour effet de diminuer la concentration en protéine localement et d’atteindre la zone de
croissance cristalline. A mesure que le cristal croît, la concentration en protéine diminue. La
croissance cristalline est arrêtée lorsque la concentration en protéine atteint la phase de soussaturation ou lorsque des irrégularités apparaissent sur les faces du cristal. Du choix du
précipitant (sels, polyéthylène glycols, solvant organique) et des conditions physicochimiques (pH, température, additifs…) de cristallisation dépendra la réussite de l’étape de
cristallogenèse.
A
B
Technique de la
goutte suspendue
Technique de la
goutte assise
Solution protéique + Solution de cristallisation
Joint hermétique
C
Réservoir : Solution de cristallisation
Figure I-34: Principe de cristallogenèse. A) Diagramme de phase. B) Méthode de cristallisation par
diffusion de vapeur : technique de la goutte suspendue et de la goutte assise- Schéma des dispositifs
expérimentaux– C) Exemple de plaques dans lesquelles sont réalisés les essais.
Un volume de solution protéique est mélangé avec un volume de solution de cristallisation contenue
dans le réservoir. Dans le cas de la technique de la goutte suspendue, les gouttes sont déposées sur une
lamelle de verre rendue hydrophobe par silanisation, la lamelle est alors retournée au dessus du
réservoir, l’étanchéité du système est assurée par un joint de graisse. Dans le cas de la technique de la
goutte assise, la goutte est déposée sur un promontoire et le système est rendu hermétique par un film
plastique étanche.
130
2.2. Acquisition et traitement de données de diffraction des rayons
X par un cristal.
2.2.1.
Collecte des données
Des rayons X monochromatiques frappent le cristal et sont diffractés en un ensemble de
taches uniques appelées réflexions. Chaque réflexion est caractérisée par les trois indices de
Miller h, k, et l. Leur détermination nécessite de déterminer avec exactitude l’orientation du
cristal, le mouvement du cristal lors de l’expérience et l’angle de Bragg (2θ) associé à chaque
réflexion. L’intensité et la localisation des réflexions sont enregistrées par des détecteurs CCD
(Charged Coupled Device). Pour amener les différents nœuds du réseau réciproque en
condition de réflexion (à traverser la sphère d’Ewald) une méthode consiste à faire tourner le
cristal (et donc le réseau réciproque) suivant un axe perpendiculaire au faisceau de rayons X
incident. La rotation du cristal est assurée par un goniomètre (permettant au cristal de décrire
des oscillations avec une précision de 0,01°). La rotation du cristal et l’enregistrement des
données est poursuivi jusqu’à ce que toutes les réflexions aient été enregistrées (l’espace
angulaire à explorer dépend des symétries du cristal). Dans le cas des macromolécules
biologiques, de par la taille des molécules, les paramètres de mailles des cristaux sont grands :
de ce fait les plans réticulaires h, k et l forment un réseau réciproque dense et le nombre de
réflexions à enregistrer est grand. De plus, les intensités à mesurer sont soumises à des
imprécisions expérimentales et sont souvent faibles. Il est donc nécessaire d’enregistrer
plusieurs fois la même réflexion. Cependant les cristaux sont généralement sensibles aux
dommages radiatifs provoqués par les rayons X (formation de radicaux libres + effets
thermiques). Même si la collecte des données se fait dans des conditions cryogéniques
(réduisant les dommages dus aux rayons X) et améliore grandement la qualité de
l’enregistrement, il s’agit de trouver le meilleurs compromis entre temps d’exposition réduit
et qualité optimale du jeu de données (intensité des taches de diffraction et multiplicité des
enregistrements des taches équivalentes).
2.2.2.
Traitement des données
A l’issue de l’enregistrement, nous disposons d’un ensemble de clichés de diffraction sous
forme d’images bidimensionnelles digitalisées. Une valeur numérique proportionnelle au
nombre de photons enregistrés est associée à chaque pixel. Le traitement des données
s’effectue en trois étapes, qui sont l’indexation, l’intégration et la mise à l’échelle du jeu de
131
données. Ces trois étapes ont pour but final de déterminer avec précision le module du facteur
de structure (paragraphe1-3) correspondant à chaque tache observée.
Indexation
L’indexation correspond à la localisation précise des taches de diffraction et à l’attribution
d’un triplet h,k,l représentant la position d’un nœud correspondant du réseau réciproque. Un
programme d’auto-indexation détermine les paramètres de maille du cristal et attribue un
score pour chacun des 14 réseaux de Bravais (par comparaison entre les taches prédites et les
taches réelles), orientant ainsi l’expérimentateur vers le choix du réseau de Bravais du cristal.
La discrimination entre les groupes d’espace ne pourra se faire que par la suite lors de la mise
à l’échelle. Cette première étape peut se faire à partir de seulement un cliché de diffraction.
Les données sont alors indexées image par image, les profils de diffraction prédits sont ajustés
aux taches observées en affinant un certain nombre de paramètres liés au cristal (l’orientation
du cristal, les paramètres de maille, la mosaïcité), ou aux conditions expérimentales
d’enregistrement des données (distance cristal-détecteur, la position du centre du
détecteur…). Un index h, k, l est alors attribué à chacune des taches.
Intégration
L’intégration consiste à mesurer l’intensité de chaque réflexion. La première étape consiste à
définir une boîte de mesure placée à la position de chaque tache. La zone centrale de cette
boîte doit contenir les pixels constituant la tache à intégrer, la zone périphérique servira à
évaluer le bruit de fond autour de la tache. L’intensité intégrée peut alors être calculée par
sommation de tous les pixels de la zone centrale à laquelle est retranchée une estimation du
bruit de fond de la zone périphérique.
Mise à l’échelle et réduction du jeu de données
La dernière étape du traitement des données expérimentales consiste à réduire l’ensemble des
données mesurées à un jeu de réflexions indépendantes. Ceci consiste à moyenner toutes les
observations d’une même réflexion ou de ses réflexions équivalentes par les symétries
cristallographiques. Une étape préalable à ceci est la mise à l’échelle des données enregistrées
sur les différents clichés. En effet, au cours d’un enregistrement chaque image diffère par la
dose de rayons X reçue (variation de l’intensité du faisceau incident), et un affaiblissement du
signal dû à la baisse du pouvoir de diffraction du cristal (dommages radiatifs) est souvent
132
observé. Les réflexions équivalentes mises à l’échelle sont analysées, les mesures suspectes
rejetées et les réflexions équivalentes restantes sont alors moyennées.
2.2.3.
Evaluation de la qualité des données.
Plusieurs paramètres servent à déterminer la qualité du jeu de données.
- La multiplicité des données (nombre de fois ou chaque réflexion indépendante a été
mesurée) : plus cette valeur est élevée, et meilleure est l’estimation de l’intensité Ihkl et de
l’erreur systématique associée σhkl.
- La complétude : ce n’est pas à proprement parler un indice de la qualité des données mais
elle constitue néanmoins un critère important. Elle exprime les rapports entre le nombre de
réflexions indépendantes mesurées et le nombre total théorique. Elle doit être aussi élevée que
possible car chaque réflexion manquante est un terme omis dans la synthèse de Fourier qui
sert à calculer les cartes de densité électronique et ceci peut entraîner des distorsions plus ou
moins importantes dans ces dernières.
La valeur moyenne I/σ (rapport signal/bruit) permet d’estimer la qualité des mesures par
rapport au bruit statistique.
Le Rsym aussi appelé Rmerge dans le cas de l’utilisation de plusieurs cristaux est défini par :
∑∑ I (hkl ) − I (hkl )
Rsym =
∑ I (hkl
i
hkl
i
hkl
où Ii(hkl) est la i-ème mesure et <I(hkl)> la moyenne pondérée de toutes les mesures Ii(hkl)
des réflexions équivalentes. Cet indicateur représente la dispersion entre les différentes
observations pour une réflexion indépendante.
2.2.4.
Calcul du facteur de structure
Comme nous l’avons déjà expliqué le calcul de la densité électronique se fait à partir du
facteur de structure qui est un vecteur caractérisant les ondes diffractées. Ce vecteur peut être
assimilé à un nombre complexe de module Fhkl et de phase φ
hkl.
Le module du facteur de
structure a pu être calculé à partir des intensités mesurées, Fhkl = I hkl par contre, l’obtention
de la phase est problématique car cette information de déphasage des ondes les unes par
rapport aux autres est perdue lors de l’enregistrement des données. Dans le chapitre suivant
nous détaillerons le principe des trois grandes familles de méthodes permettant d’accéder à
l’acquisition de phase : le remplacement moléculaire, le remplacement isomorphe et la
diffusion anomale multi-longueur d’onde (MAD).
133
2.3. Méthodes d’obtention des phases
Toutes ces méthodes utilisent la fonction de Patterson définie par l’équation ci dessous.
P(u) = ∫ ρ(r) x ρ(r + u) dV =
∑| F
hkl
| 2 exp 2πi u·S
hkl
avec u vecteur interatomique
Cette fonction est essentielle puis qu’à partir des intensités des taches diffractées seulement,
elle est capable de déterminer tous les vecteurs interatomiques. S’il y a N atomes dans la
maille, il y aura N2 pics dans la fonction de Patterson. Elle permet d’orienter le modèle dans
la maille dans le cas du remplacement moléculaire, et, dans le cas des méthodes de phasage
expérimentales, d’identifier la position des atomes lourds ou de diffuseurs anomaux
2.3.1.
Remplacement isomorphe.
SIR et MIR
Le remplacement isomorphe consiste à ajouter de manière isomorphe (sans perturber l’édifice
cristallin) un atome lourd dans le cristal. Dans ces conditions, les seules différences observées
au niveau des intensités seront dues à la présence d’atomes lourds. Dans les cas où le cristal
natif et le cristal dérivé sont isomorphes, la relation vectorielle suivante entre les facteurs de
structure est :
FPH = FP + FH
où FPH représente les facteurs de structure du cristal dérivé, FP les facteurs de structure du
cristal natif et FH les facteurs de structure de l’atome lourd.
Les amplitudes de |FPH|, |FP| sont directement accessibles expérimentalement. Grâce à la
fonction de Patterson, on peut retrouver la position de l’atome lourd dans la maille et avoir
accès au facteur de structure FH. On aura alors accès à deux valeurs de phases possibles pour
FP qui satisfont la relation FH = FPH – FP (voir construction géométrique figure III-35). Ainsi,
un remplacement isomorphe avec un seul dérivé contenant un atome lourd (SIR : Single
Isomorphous Replacement) donnera deux valeurs de phase possibles (définies par les
intersections des cercles de rayon FP et de rayon FPH en A et B) dont une seule est juste et cela
pour toutes les réflexions du jeu de données (de l’ordre de la dizaine de milliers). Le
remplacement isomorphe SIR ne suffira donc pas pour déterminer la valeur de phase de
l’onde diffractée de la protéine native. Il est nécessaire pour cela de réaliser au moins un
deuxième dérivé lourd (dont le facteur de structure sera FPH2 et le facteur de structure de
l’atome lourd associé FH2), qui permettra de discriminer entre les deux phases possibles (en
134
B). La méthode utilisée est alors appelée remplacement isomorphe multiple (MIR : Multiple
Isomorphous Replacement).
FPH(hkl)
(hkl) = FP(hkl)
(hkl) + FH(hkl)
(hkl)
B
FPH
FPH
FH
A
FP
FPH2(hkl) = FP(hkl)
(hkl) + FH(hkl)
(hkl)
FPH 2
FP
FPH et FP sont mesurés, FH est calculé
FH2
Figure I-35 : Détermination de la phase par remplacement isomorphe multiple- Construction du
triangle des phases. Si l'on connaît vectoriellement FH, on peut tracer à partir du vecteur FH le cercle
de rayon |FPH|. Le cercle centré à l'origine et de rayon |FP| le coupe en deux points donnant deux
valeurs possibles au vecteur FP. Avec un deuxième dérivé, un autre cercle de rayon |FPH2| peut être
tracé sur le même diagramme, levant alors l'indétermination sur FP.
Les dérivés lourds sont classiquement obtenus par trempage dans des solutions d’atomes
lourds. Pour que les techniques de remplacement isomorphes puissent être réalisées, il faut
que les atomes lourds diffusent dans le cristal et aillent se positionner sur des sites précis et
donc périodiques de la protéine. En pratique les mesures d’intensités sont entachées
d’erreurs : il existe des défauts d’isomorphisme et les atomes lourds ne sont pas toujours
parfaitement positionnés. Ceci aboutit à des défauts de fermeture de triangle des phases
entraînant une erreur sur la valeur de la phase.
SIRAS et MIRAS
Les propriétés de diffusion anomale de certains atomes peuvent être utilisées pour résoudre
plus facilement le problème de phase. La diffusion anomale c’est la diffusion d’un atome
lorsque la radiation incidente est d’énergie suffisante pour entraîner une transition
électronique : cet atome diffusera les photons “anomalement”. (Figure I-36). Son facteur de
structure s’en trouvera alors modifié. En effet, le facteur de structure est défini par la somme
des facteurs de diffusion atomique de chacun des atomes contenus dans la maille, pondérés
par leur position dans la maille. Puisque le facteur de structure de l’atome lourd FH n’est lié
qu’à la contribution d’un type d’atome (l’atome lourd), une autre façon d’écrire le facteur de
structure FH est donc :
FH=[facteur de diffusion atomique] e2πi(hxH+kyH+lzH)
135
A cause de l’absorption d’énergie et de sa réémission sous forme de fluorescence par le
diffuseur anomal, la valeur du facteur de diffusion atomique (et par conséquent celle du
facteur de structure) est modifiée et peut s’écrire de la sorte :
f = fo + ∆f’(λ) + i∆f”(λ)
où f’ et f’’ représentent respectivement les composantes réelles et imaginaires de la dispersion
anomale et sont dépendantes de la longueur d’onde du faisceau incident.
∆f”
imaginaire
fo
∆f’
φH(hkl)
réel
φH (-h-k-l)
fo
∆f”
∆f’
FH(hkl)
FH(-h-k-l)
FH(hkl)=[fo + ∆f’(λ
λ) + i∆
∆f”(λ
λ)] e2ππi(+hxH+kyH+lzH)
FH(-h-k-l)=[fo + ∆f’(λ
λ) + i∆
∆f”(λ
λ)] e2ππi(-hxH-kyH-lzH)
φH(hkl) ≠ -φ
φH(-h-k-l)
Figure I-36 : Effet de la diffusion anomale sur les facteurs de structure de deux réflexions en
h, k, l et -h, -k, -l
La diffusion anomale entraîne des différences d’intensité, faibles mais mesurables, entre les
réflexions h,k,l et -h,-k,-l normalement équivalentes. Dans la gamme d’énergie des rayons X,
seuls quelques rares atomes présenteront cette particularité de diffusion anomale, et pour des
longueurs d’ondes bien particulières. Le jeu de données enregistré avec un diffuseur anomal
sera en fait composé de deux jeux de données l’un contenant les données h,k,l et l’autre
contenant les données -h,-k,-l. Ainsi, si le jeu de donnée correspondant au cristal natif a été
enregistré, on dispose des modules des facteurs de structures |FP|, |FPH(hkl)| et |FPH(-h-k-l)|. Les
amplitudes et les phases des facteurs de structure FH(hkl) et FH(-h-k-l) peuvent être calculées à
136
partir de la fonction de Patterson et de l’estimation de |FH| ≈ |FPH|-|FP|, ce qui permet d’avoir
comme dans le cas du MIR, un triangle de phase permettant le calcul de du facteur de
structure de la protéine native FP.
)
FPH(hkl
hkl)) = FP(hkl
hkl)) + FH(hkl
hkl))
(H
K
| FP(HKL) |
FPH(-h-k- l)* = FP(hkl
hkl)) + FH(-h-k- l) *
FH
L)
FH(-H-K-L
|FPH(-h-k-l)|
|FPH(hkl)|
Figure I-37 : Détermination de la phase par remplacement isomorphe et diffusion anomale:
construction du triangle des phases. Si on connaît vectoriellement FH (h,k,l) on peut tracer à partir du
vecteur FH le cercle de rayon |FPH (h,k,l)|. Le cercle centré à l'origine et de rayon |FP| le coupe en deux
points donnant deux valeurs possibles au vecteur FP. Avec les réflexions non équivalentes FH (-h ,-k,-l)*,
un autre cercle de rayon |FPH (-h,-k,-l)| peut être tracé sur le même diagramme, levant alors
l'indétermination sur FP.
2.3.2.
MAD (Hendrickson et al., 1985; Karle, 1980)
Le problème du remplacement isomorphe réside dans la nécessité de travailler sur des cristaux
parfaitement isomorphes de la protéine native et d’un ou plusieurs dérivés lourds et sur
plusieurs jeux de données enregistrés dans des conditions différentes. En utilisant les
intensités diffractées mesurées sur un même cristal avec un diffuseur anomal à plusieurs
longueurs d’onde autour du seuil d’absorption (là où les différences seront les plus marquées
cf. Figure III-38-C), il sera alors possible de déterminer la position de l’atome lourd puis la
phase de chaque réflexion (Figure I-39). La position du pic est déterminée à partir d’un
spectre de fluorescence (figure I-38-A) (réalisé avec une précision au 1/1000ème d’Angström).
La figure I-38-B représente les variations des coefficients f' et f'' pour un diffuseur anomal en
fonction de la longueur d’onde. Les variations de f' et f'' sont brutales au niveau du seuil
d’absorption situé autour de 1,00 Å.
137
Spectre de
fluorescence
3
Fluorescence
A
4
2
1
E
B
5
∆f”
2.5
Déconvolution
du Spectre de
fluorescence
0
∆f’
-2.5
-5
-7.5
2.8
2.5
2.2
1.9
FH(hkl)=[fo + ∆f’(λ
λ)
C
1
Effet sur le
facteur de
structure
FH (low remote)
1.3
1
fo
0.7
H
2
FH
∆ f”
fo ∆ f’
1.6
0.4
0.1
Longueur d'onde (Å)
+ i∆
∆f”(λ
λ)] e2ππ i(+hx +ky +lz )
∆ f”
∆ f’
H
3
4
FH (high remote)
FH
fo
H
∆ f”
∆ f’
fo
∆ f”
∆ f’
Figure I-38 : A) Spectre de fluorescence d’une protéine contenant un diffuseur anomal
B) Composantes f' et f'' du coefficient de diffusion atomique en fonction de la longueur
d’onde C) Effet de la longueur d’onde sur le facteur de structure FH(h,k,l).
Trois longueurs d'onde sont utilisées pour maximiser les différences dans les valeurs de f' et
de f'': la longueur d’onde où f' est minimum, celle où f'' est maximum et une longueur d'onde
de référence éloignée de ce seuil. Pour chaque longueur d’onde le facteur de structure FH est
différent (et par conséquent le facteur de structure FPH l’est aussi). On pourra alors facilement
retrouver l’information de phase d’après la construction ci-après (Figure I-39).
Comme la diffusion anomale est modifiée par l'environnement chimique du diffuseur, les
valeurs de f' et f'' autour du seuil d'absorption doivent être déterminées au préalable à partir
d'un spectre de fluorescence X. Les différences anomales entre les réflexions hkl et -h-k-l
peuvent aussi être estimées et utilisées comme cercles de phase additionnels. En principe, on
peut obtenir 2 triangles de phases pour chaque longueur d’onde utilisée. La mise à l'échelle
entre les jeux de données reste une étape délicate du fait de la perte du signal due à la
dégradation du cristal.
138
Axe imaginaire
Axe réel
FPH(λl) = FP + FH (λl)
FPH(λ2) = FP + FH (λ2)
FPH(λ3) = FP + FH (λ3)
Figure I-39 : Détermination de la phase par la méthode MAD. On connaît
vectoriellement FH (λi) pour chaque longueur d’onde et les modules des facteurs de structures
|FPH (λi)| sont connus. A partir du vecteur FH (λi), on trace le rayon de cercle |FPH (λi)|. A partir de
l’intersection des différents cercles correspondant aux différentes longueurs d’ondes et de l’origine on
peut calculer FP.
Si on connaît vectoriellement FH (h,k,l) on peut tracer à partir du vecteur FH le cercle de rayon |FPH
(h,k,l)|. Le cercle centré à l'origine et de rayon |FP| le coupe en deux points donnant deux valeurs
possibles au vecteur FP. Avec les réflexions non équivalentes FH (-h ,-k,-l)*, un autre cercle de rayon |FPH
(-h,-k,-l)| peut être tracé sur le même diagramme, levant alors l'indétermination sur FP.
2.3.3.
Le remplacement moléculaire
Le problème des phases peut être en général, facilement résolu si on dispose de la structure
tridimensionnelle d’une protéine homologue. Si l'identité de séquence est supérieure à 30% on
peut supposer que les 2 structures auront un repliement similaire. Connaissant la position des
atomes, il est possible de calculer un jeu de données de diffraction théorique. Le
remplacement moléculaire consiste à placer la molécule modèle dans la maille expérimentale.
Dans cette approche “simpliste”, le remplacement moléculaire correspond à une recherche à 6
dimensions (3 rotations et 3 translations). Cette recherche est décomposée en deux opérations
successives à 3 paramètres : le modèle est dans un premier temps orienté dans la maille par
une fonction de rotation puis positionné dans un deuxième temps dans la maille par une
fonction de translation (Lattman, 1985). La fonction de Patterson (représentant les vecteurs
interatomiques) est calculée pour la protéine modèle et pour la protéine de structure
indéterminée. Le but étant d’obtenir des fonctions de Patterson observée et calculée
similaires, ce qui est le cas lorsque le modèle est correctement orienté et placé à la bonne
position dans la maille cristalline.
139
Dans la fonction de Patterson on pourra discriminer en fonction des distances interatomiques :
- les vecteurs intramoléculaires : ils ne sont sensibles qu’à l'orientation de la molécule dans
la maille c’est donc à partir d’eux que l’on cherchera l’orientation de la protéine dans le
cristal. Ceci se fera avec la fonction de rotation. Pour plusieurs orientations possibles du
modèle, la fonction de rotation évalue l'accord entre les fonctions de Patterson du modèle et
de la structure à déterminer en fonction de leur orientation l'une par rapport à l'autre.
Normalement la rotation qui a la meilleure corrélation donne l'orientation du modèle dans la
maille.
- Les vecteurs intermoléculaires : ils ne sont sensibles qu’à la position de la molécule dans
la maille sans tenir compte de leurs orientations c’est donc à partir d’eux que l’on déterminera
la position du modèle dans la maille du cristal. La fonction de translation teste différentes
positions du modèle dans la maille et retient celle qui présente le maximum de corrélation
entre les fonctions de Patterson expérimentales et calculées.
La qualité de la solution de remplacement moléculaire est évaluée par deux paramètres
∑ F −k F
R=
∑F
obs
• Le facteur R :
calc
hkl
obs
hkl
avec Fobs : facteur de structure observé et Fcalc : Facteur de structure calculé à partir du modèle
correctement orienté dans la maille
Celui ci doit être minimisé c’est à dire que les facteurs de structures calculés doivent être
aussi proche que possible des facteurs de structures expérimentaux. Des valeurs de R
inférieures à 55 % sont usuellement considérées comme correctes.
∑  F
obs
Le coefficient de Corrélation C
C=
hkl
2
2
2
2
− Fobs  ×  Fcalc − Fcalc 
 

 F 2 − F 2
∑
obs
 obs

hkl
2
 F 2 − F 2
∑
calc
 calc

hkl
2
Celui-ci doit être maximisé c’est à dire que lorsque Fobs est beaucoup plus grand que la
moyenne, Fcalc doit aussi être beaucoup plus grand que la moyenne. Les valeurs de C sont
usuellement considérées correctes pour C supérieur à 30 %.
140
2.4. Construction des premières cartes et amélioration de
l’information de phases
Le calcul des phases de chaque réflexion étant résolu par l'une des méthodes précédentes, il
est possible de calculer une première carte de densité électronique. Dans la plupart des cas, du
fait de l’imprécision de l’information de phase, ces cartes sont de faible qualité. Pour
améliorer les cartes de densité électroniques, il faut donc diminuer l'erreur commise sur
chaque phase. C’est en imposant à la densité électronique des contraintes physico-chimiques
(comme le nivellement de solvant, la positivité de la densité électronique, sa connectivité, les
histogrammes de densité, la symétrie non cristallographique) que les cartes sont peu à peu
améliorées. L'utilisation de ces contraintes sur la densité est réalisée par un processus itératif
jusqu'à ce que la convergence soit atteinte. A l’issue de cette étape, on peut construire le
modèle c’est-à-dire placer la chaîne polypeptidique principale, puis les chaînes latérales dans
la densité électronique obtenue.
2.5. Affinement cristallographique
L’objectif de l’affinement cristallographique est de modifier le modèle pour améliorer
l’accord entre les amplitudes calculées à partir de celui-ci et les amplitudes expérimentales
tout en minimisant l’énergie de la molécule (lui assurer une stéréochimie correcte). Le
problème n’est pas simple car chaque atome est décrit par au moins quatre paramètres :
- les paramètres x, y, z, déterminent la position de l’atome,
- le facteur d’agitation thermique B qui représente un paramètre de déplacement atomique.
Dans certains cas, le nombre d’amplitudes observées lors de la diffraction n’est pas suffisant
pour affiner tous ces paramètres. Afin de contourner le problème du manque d’observations
par rapport au nombre de paramètres, une solution est, soit d’augmenter le nombre
d’observations, soit de diminuer le nombre de paramètres. La première méthode ajoute des
restrictions en apportant une information externe de stéréochimie. Les angles et les longueurs
de liaison standards sont connus pour les petites molécules. Ces valeurs standards seront
imposées au modèle, en définissant une valeur idéale pour un paramètre avec une certaine
déviation standard. Ces informations supplémentaires permettront de compléter le nombre
d’observations. La seconde méthode diminue le nombre de paramètres en imposant des
141
contraintes géométriques. Par exemple les longueurs de liaison et les angles de valence sont
imposés ce qui permet d’affiner les angles de torsion.
La validation de l’affinement
La précision du modèle peut être évaluée par le facteur R et le facteur R libre
∑ F −k F
R=
∑F
obs
calc
hkl
obs
hkl
Le facteur R n’est cependant pas complètement objectif car il fait partie de la fonction à
minimiser, sa valeur diminuera donc au cours de l’affinement. En revanche l’utilisation du
facteur Rlibre permet d’avoir une évaluation plus objective du protocole d’affinement. En effet,
ce facteur est calculé à partir d’observation Fobs non intégrées dans la procédure d’affinement.
La diminution concomitante du R et du Rlibre valide donc le protocole d’affinement.
D'autre part, les paramètres stéréochimiques non restreints/contraints dans l’affinement seront
également un critère validant la qualité de l'affinement. Par exemple la distribution des angles
dièdres dans le diagramme de Ramachandran donnera un critère supplémentaire de qualité du
modèle affiné. Ce diagramme dont les axes représentent les angles dièdres Φ et Ψ de part et
d’autre d’un carbone α (figure I-40) permet de définir des zones autorisées et des zones non
autorisées pour ces angles. Ces zones ont été définies à partir de l’analyse conformationnelle
de nombreuses protéines : un classement des conformations les plus stables pour les angles
dièdres Φ et Ψ de la chaîne principale a été réalisé.
Figure I-40 : Représentation des angles dièdres Φ et Ψ pour une liaison peptidique
142
Chapitre II : Matériel et méthodes
143
1. Techniques microbiologiques
1.1. Souches
Les différentes souches d’E. coli et de Y. lipolytica utilisées dans cette étude sont présentées
dans le tableau II-1.
Tableau II-1 : Souches d’E. coli et de Y. lipolytica utilisées pour l’étude
Souche
Référence ou
source
Génotype
Souches E. coli
F80dlac Z∆m15, rec A1, end A1, gyr A96, thi -1, hsd R17 (rk-, mk+), sup E44, rel A1,
DH5α
deo R, ∆(lac ZYA-arg F)U169
Souches Y. lipolytica
MTLY60
MatA, ura 3-302, leu 2-270, xpr 2-322, ∆ lip2 ∆ lip7 ∆ lip8
-
-
Souche délétée pour les lipases extracellulaires Leu , Ura .
JMY1165
MatA ,ura 3-302, leu 2-270, xpr 2-322, lip2 ::LEU2, ∆ lip2 ∆ lip7 ∆ lip8
+
Souche délétée pour les lipases extracellulaires Leu , Ura
-
Invitrogen
(Fickers et al.,
2005c)
(Fickers et al.,
2005c)
(Barth et
Gaillardin, 1996)
Po1d
MatA ura 3-302 leu 2-270 xpr 2-322
JMY1212
MatA ,ura 3-302, leu 2-270-LEU2 -zeta, xpr 2-322, lip2 ::LEU2, ∆ lip2 ∆ lip7 ∆ lip8
+
Souche délétée pour les lipases extracellulaires Leu , Ura
Ces travaux
-
1.2. Plasmides
Le plasmide pCR®4-TOPO® (Invitrogen) a été utilisé pour réaliser le clonage de fragments
PCR. Il contient à la fois les gènes de résistance à l’ampicilline et à la kanamycine. La
sélection directe des plasmides recombinants est assurée par la disruption du gène ccdB lors
du clonage, ce gène étant létal pour E. coli.
Les vecteurs navettes, JMP8, JMP60 et JMP61 sont des vecteurs navettes entre E. coli et
Y. lipolytica. Ils contiennent, l’origine de réplication Col E1 de E. coli, et le gène de résistance
à la kanamycine. Ce sont des vecteurs de type intégratif, comportant les séquences zéta, le
marqueur d’auxotrophie URA3d1 et la lipase Lip2 sous contrôle de promoteurs différents :
POX2 pour JMP8, hp4d pour JMP60 et Tef pour JMP61. Les cartes de restriction de ces
plasmides sont présentées dans la figure II-1.
145
HindIII (7522)
hp4d
Ura3d1
Ura3d1
HindIII (557)
pPOX2 entier
LIP2
zéta
HindIII (1494)
NotI (5843)
JMP8
JMP60
jmp60
lip2
zéta
5934 bp
7 528 bp
NotI (4245)
EcoRI (1637)
HindIII (2155)
zéta
LIP2
KanR
NotI (2035)
EcoRI (3235)
Kan R
zéta
NotI (3633)
TEF
AmpR
I-SceI (3941 )
Ura3d1
LoxR
LIP2
EcoRI (3886)
pKS LPR Hygro rc
jmp61
JMP61
zéta
4651 bp
5898 bp
HygR
zéta
NotI (4204)
NotI (1994)
I-SceI (2239)
KanR
LoxP
EcoRI (2283)
AmpR
SacII
SacII
AmpR
LoxP
LoxP
Zéta
BamHI
KS LPR LEU2corrigé
KS-LEU2-zétatronque
4830 bp
51 36 bp
BamHI
HincII
LEU2
LEU2
tronqué
,
StuI
,
LoxR
LoxR
,
StuI
Figure II-1 : Schéma des différents vecteurs (réplicatifs et d’expression) utilisés au cours de
l’étude
Le vecteur pKS LPR hygro Rc est un vecteur de type réplicatif excisable. Il contient l’origine
de réplication Col E1 de E. coli et le gène de résistance à l’ampicilline, le gène de résistance à
l’hygromycine et les séquences lox. Sa carte de restriction est présentée figure II-I.
146
Les plasmides KS LPR LEU2 corrigé et KS LPR LEU2 zéta tronqué (construit pendant
l’étude) sont des vecteurs de type réplicatif excisables. Ils contiennent l’origine de réplication
Col E1 de E. coli et le gène de résistance à l’ampicilline, ainsi que les séquences lox qui
bordent le gène LEU2 pour le plasmide KS LPR LEU2 corrigé et le gène LEU2 tronqué + la
zone zéta pour le plasmide KS LPR LEU2 zétatronqué. Leurs cartes de restriction sont
présentées figure II-1.
1.3. Milieux de culture
Les milieux de culture sont stérilisés 20 minutes à 121°C. Les milieux décrits sont des milieux
liquides. Pour obtenir des milieux solides de l’agar à 15 g/L est ajouté.
1.3.1.
Milieux de culture pour E.coli : milieu Luria Bertani
-
10 g/L de Bactériotryptone.
-
5 g/L d’extrait de levure.
-
10 g/L de NaCl.
Pour la sélection des transformants 40 µg/mL de kanamycine ou ampicilline (100 µg/mL)
sont ajoutés.
1.3.2.
a)
b)
Milieux de culture pour Y. lipolytica
Milieu riche YPD (préculture)
-
10 g/L de Bactopeptone
-
10 g/L extrait de levure
-
10 g/L glucose
Milieux de sélection des transformants de Y. lipolytica
YNBcasa : milieu permettant de cribler les souches Ura +
-
Yeast Nitrogen Base sans acides aminés ni sulfate d’ammonium : 1,7 g/L (stérilisé
par filtration)
-
Glucose : 10 g/L
-
NH4Cl : 5 g/L
-
Tampon phosphate Na-K pH=6,8 50 mM
-
Casamino acids 2 g/L (stérilisé par filtration)
YPD Hyg : milieu permettant de cribler les souche Hyg+
Milieu riche YPD auquel est ajouté de l’hygromycine (0,2 g/L)
147
c)
Milieux riche de croissance et de production
Par convention un milieu de type YT2 sera un milieu contenant de l’extrait de levure (10
g/L), de la Tryptone (20 g/L)et du tampon phosphate Na-K pH=6,8 50 mM. Il pourra lui être
ajouté de l’acide oléique (à partir d’une solution mère à 200 g/L) ou du glucose (à partir d’une
solution mère à 500 g/L). L’émulsion mère d’acide oléique est réalisée par sonication (trois
fois une minute) avec 0,5 % de Tween 40.
- Milieu de production en erlenmeyer YT2O2 lorsque l’enzyme est sous contrôle du
promoteur POX2 : Milieu YT2 + Emulsion d’acide oléique 20 g/L
- Milieu de production en erlenmeyer YT2D5 lorsque l’enzyme est sous contrôle du
promoteur TEF : Milieu YT2 + Glucose 50 g/L
- Milieu de croissance en microplaque YT2D0,25 : Milieu YT2 + Glucose 2,5 g/L
- Milieu de production en microplaque YTO0,125 : Milieu YT2 + Acide oléique 1,25 g/L
- Milieu minimum de production :
− Sels principaux :
− Complément azoté :
KH2PO4 :
(NH4)2SO4 :
Na2HPO4, 12H2O :
MgSO4, 7H2O:
Glutamate de sodium :
3,0 g/L
3,0 g/L
3,0 g/L
2,0 g/L
1,0 g/L
Le pH est ajusté à 4,5 avec de l’acide orthophosphorique avant stérilisation. Après
stérilisation le pH est réajusté à 6 avec de l’ammoniaque à 14 %.
− Oligo-éléments :
ZnSO4, 7H2O:
MnSO4, H2O:
CoCl2, 6H2O:
CuSO4, 5H2O:
Na2MoSO4, 2H2O:
CaCl2, 2H2O:
(NH4)2Fe(SO4)6, 6H2O:
H3BO3 :
− Vitamines :
4,0.10-2 g/L
3,8.10-3 g/L
5,0.10-4 g/L
9,0.10-4 g/L
6,0.10-5 g/L
2,3.10-2 g/L
2,3.10-2 g/L
3,0.10-3 g/L
Acide pantothénique :
5,0.10-3 g/L
Acide nicotinique :
5,0.10-3 g/L
Mésoinositol :
125,0.10-3 g/L
Thiamine :
5,0.10-3 g/L
Pyridoxine :
5,0.10-3 g/L
Acide para-aminobenzoïque : 1,0.10-3 g/L
Biotine :
1,2.10-5 g/L
Les oligo-éléments et les vitamines sont stérilisés par filtration.
148
Du glucose est additionné (10 à 100 g/L) pour les phases de production de biomasse ou de
lipase (lorsque le gène de celle-ci est sous contrôle du promoteur TEF). De l’acide oléique (10
à 40 g/L) est ajouté pour la production de lipase (lorsque celle-ci est sous contrôle du
promoteur POX2). A 5 g/L de biomasse on ajoute 5 mL/L de sels, et tous les 20 g/L, 1 mL de
solution de vitamines par litre est ajoutée.
2. Techniques de biologie moléculaire
2.1. Techniques de préparation et de manipulation des acides
nucléiques
2.1.1.
Préparation d’ADN plasmidique bactérien
L’extraction et la purification des plasmides sont réalisées en utilisant le kit QIAprep
commercialisé par Qiagen en suivant le protocole fourni par Qiagen. La méthode est basée sur
la méthode de la lyse alcaline (Sambrook et al., 1989).
2.1.2.
Préparation d’ADN génomique de levure
Un culot de culture cellulaire de levure (24 à 48 heures de culture dans 3 mL YPD) est remis
en suspension dans 500 µL de tampon sorbitol (Sorbitol 1M - Tris-HCl 0,1 M pH 8 -EDTA
0,1M). 50 µl de zymolyase 100 T (3 mg/mL) et 50 µL de β-mercaptoéthanol 0,28 M sont
ajoutés. Le mélange est incubé 1 h à 37°C. Après centrifugation 5 minutes à 13 000 rpm, le
culot est remis en suspension dans 500 µL de TE et 50 µL de SDS 10% sont ajoutés. Après
une incubation de 20 min à 65°C, 200 µL d’acétate de potassium 5 M sont ajoutés et le
mélange est laissé 30 min dans la glace. Le surnageant est récupéré et 700 µL d’isopropanol
sont ajoutés ; après 10 minutes le mélange est centrifugé et le culot est lavé avec 500 µL
d’éthanol 70%, puis séché partiellement, et ensuite repris dans 400 µL de TE-RNAse A
(100 µg/mL) et incubé 1 h à 37°C. Après ajout de 40 µL d’acétate de sodium 2,5 M pH 5,2,
l’ADN est précipité avec 1 mL d’éthanol absolu puis lavé avec 700 µL d’éthanol 70%. Après
centrifugation, le culot d’ADN est repris dans 100 µL d’eau.
149
2.1.3.
Amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
Le principe de la PCR consiste à amplifier de manière exponentielle un fragment d’ADN en
utilisant une ADN polymérase. La PCR se déroule en plusieurs cycles successifs de
température (environ 25) au cours desquels la quantité d’ADN est doublée à chaque cycle.
Chaque cycle comprend :
-
une étape de dénaturation de l’ADN : 30 s à 95°C
-
une étape d’hybridation des oligonucléotides : 30 s à la température d’hybridation de
l’amorce
-
une étape d’élongation, dont la durée dépend de la polymérase utilisée et de la taille du
fragment à amplifier.
Le milieu réactionnel d’un volume final de 50µl comprend :
-
5 à 50 ng d’ADN parental
-
l’enzyme en quantité suffisante (voir tableau II-2 pour le choix de la polymérase)
-
les oligonucléotides 100 pmol (la liste de toutes les amorces utilisées est fournie dans
le tableau II-3)
-
des désoxyribonucléotides (dNTP) : 250 µM chacun
-
le tampon correspondant à l’enzyme commerciale dans les proportions recommandées
par le fournisseur
Pour la PCR à erreurs, 2 µl d’un mélange contenant 8 mM dTTP, 8 mM dCTP, 96 mM
MgCl2, 10 mM MnCl2 est ajouté à la PCR, pour favoriser les erreurs de la Taq polymérase.
Tableau II-2 : Polymérases utilisées pour les amplifications par PCR - Conditions d’utilisation
Enzyme
Fournisseur Quantité Vitesse
Utilisation et remarques
0,5 U
0,5 kb/min polymérase peu fidèle utilisée pour la PCR à erreurs
Taq polymérase Biolabs
pfu turbo
Stratagène
2,5 U
1 kb/min
polymérase fidèle utilisée pour les amplifications fidèles de l’ADN
Expand high
fidelity
Roche
Boehringer
Mannheim
2,5 U
(0,7µl)
1 kb/min
polymérase fidèle utilisée pour réaliser des PCR chevauchantes.
Température d'élongation 68°C pour les fragments <3 kb et 72°C
pour les fragments > 3 kb
150
Tableau II-3 : Liste des amorces utilisées pour les amplifications d’ADN par PCR au cours de
l’étude – Séquence et température d’hybridation
Amorces
Séquence 5' =>3'
Température
d’hybridation
Lip amont
CCCCAGAGTATACTTATATACCAAAGGG
55°C
Lip aval
CGGATGACTAACTCTCCAGAGCG
55°C
Tef amont
CCACCGTCCCCGAATTACCTTTCC
55°C
C30A
CTCGCAAACATTGGATATGCTGTTGGTCCCGGC
55°C
C299A
CCGAGGGTGTCGCTGGTATCTAAGC
50°C
C244A
GGTTACCAGCACGCCTCTGGTGAGGTC
55°C
244 Sat
GGTTACCAGCACNNCTCTGGTGAGGTC
55°C
115V
GCTGCTAACATCGTCTCTACTGCTACTTGTG
55°C
N134Q
GGCTTCATCCAGTCCTACCAGAACACC
50°C
T136V
GTCCTACAACAACGTCTACAATCAGATCGG
50°C
PCR1d
GATCCCCACCGGAATTGC
50°C
PCR1rT
GGAGAACTGCGGCCTCAGAAGGAGTGATGG
50°C
PCR2dT
CCATCACTCCTTCTGAGGCCGCAGTTCTCC
50°C
PCR2r
GGAGTTCTTCGCCCACCC
50°C
PCR1dL
CCGCTGTCGGGAACCGCGTTCAGGTGGAACAGGACACC
68°C
ZetaF1
AATTCCGCGGGTAACACTCGCTCTGGAGAGTTAG
ZetaF2
AAAGCCCTCAGTGCGGCCGCTGTCGGGAACCGCG
ZetaR1
ZetaR2
P1 Met6
GGTCCCGACAGCGGCCGCACTGAGGGCTTTGTG
CCTGGATCCAGCAAAGTGCTTTGTGCGTACC
GGAGACGTTGAGCACGGACTCC
55°C
P2 Met6
CGATTACCCTGTTATCCCTACCCTCTACATGCGTACTCGGATTTCACG
55°C
T1 Met6
GGTAGGGATAACAGGGTAATCGGCCGTTAGATCTTCATGCAGCGC
55°C
T2 Met6
GCTGATATCCACGCAGAGACACG
55°C
Ver1 Met6
GGTGGGATCCTTTTCACCCCAGCTTCAATGG
60°C
Ver2 Met6
CGTGTAACTGCAGGTGTGGCTCCTGTGG
60°C
P1 Met2
GCATCTCGTCTGAAGGAGTCTTCG
55°C
P2 Met2
CGATTACCCTGTTATCCCTACCGGTTTACCAGTGGAGAATAACAGATGACC
55°C
T1 Met2
GGTAGGGATAACAGGGTAATCGCGTGACTTGCATGAGGCCAACTAATTGG
55°C
T2 Met2
CCATAGGCTGAAGTGGTATCAGTAGC
55°C
Ver1 Met2
GGTACTGGTAGCTACAAGTGCGAGTACAAGAAATTATTCG
60°C
Ver2 Met2
CGTCTCAGTCTTTCGATGATTGACCTCGAGAGC
60°C
P1 Met2
CGTTCATAGTTGCAACTCTTCGGTGC
55°C
P2 Met2
CGATTACCCTGTTATCCCTACCCCAAATCAAGGTCTCCCTATGCTTTTACG
55°C
T1 Met2
55°C
T2 Met2
GGTAGGGATAACAGGGTAATCGCGATTTGGAACACTTGACTGGATCC
CCACAATGCTCCCATGAGACACG
Ver1 Met2
CGTTATTTCCACACCCGCCGGAGATCC
60°C
Ver2 Met2
CCACGCATATTCGAAACCAAGCCTCCAGG
60°C
Pour
séquençage
Pour
mutagenèse
dirigée
Pour PCR à
erreurs
Pour la
construction
de la souche
JMY1212
Pour
construction
de la
cassette de
délétion d'un
gène
55°C
Mutagenèse dirigée.
Le plasmide (JMP8 ou JMP60), est amplifié avec des amorces complémentaires reverses
contenant la mutation à introduire. Après digestion par DPN1 (pour se débarrasser des
plasmides initiaux), le plasmide amplifié est transformé dans E. coli. Le plasmide utilisé pour
réaliser la transformation chez Y. lipolytica est vérifié par séquençage (Cogenics) avec les
amorces lip_amont (dans POX2) ou Tef_amont (dans TEF) et lip_aval (dans la deuxième
zone zéta).
151
Mutagenèse aléatoire du gène LIP2
Pour la mutagenèse aléatoire sur le gène LIP2, la stratégie mise au point consiste à amplifier
la cassette d’expression par PCR, et à transformer directement celle-ci chez la levure. Une
première étape consiste à amplifier d’une part le gène de la lipase LIP2 et la deuxième zone
zéta (avec les amorces PCR2_dT et PCR2_r) par PCR à erreurs avec la Taq polymérase dans
des conditions destinées à favoriser les erreurs, et, d’autre part, le reste de la cassette
d’expression (zone zéta + marqueur Ura3 + promoteur POX avec les amorces PCR1_d et
PCR1_rT), par une polymérase fidèle : la pfu turbo (Stratagène). Les deux fragments obtenus
comprennent une région d’homologie et une fusion est réalisée par PCR chevauchante avec
l’Expand High fidelity(Roche). Une première étape consiste à réaliser 10 cycles de PCR sans
amorces à la température d’hybridation de la zone de recouvrement des deux fragments. Par la
suite, les amorces des extrémités (PCR1_dL et PCR2_dL) sont ajoutées, et 15 cycles PCR
supplémentaires sont réalisés à la température d’hybridation des amorces.
Pour vérifier la séquence des transformants obtenus chez Y. lipolytica, l’ADN génomique du
clone d’intérêt est extrait de la levure. A partir de celui-ci le gène de la lipase est amplifié par
PCR avec les amorces lip amont (dans POX2) ou Tef amont (dans TEF) et lip aval (dans la
deuxième zone zéta). Ce fragment PCR est vérifié par séquençage (Cogenics).
2.1.4.
Digestions enzymatiques
Les digestions sont réalisées par des enzymes de restriction selon les recommandations des
fournisseurs (New England Biolabs).
2.1.5.
Déphosphorylation de l’ADN
Lors des étapes d’insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur linéaire, pour éviter la
recircularisation de celui-ci, il est recommandé de déphosphoryler les extrémités 5’ de celuici. La phosphatase alcaline intestinale de veau (CIP : New England Biolabs) est utilisée pour
la déphosphorylation à raison de 1 unité pour 10 µg de vecteur. Après 45 minutes à 37°C, la
phosphatase est inactivée par un chauffage de 10 minutes à 75°C en présence de 5 mM
d’EDTA. L’ADN est purifié sur colonne avant ligation.
2.1.6.
Ligation de l’ADN
La ligation de fragments d’ADN à bouts cohésifs s’effectue sur la nuit à 16°C en présence de
400 unités de T4 DNA ligase (Biolabs) dans le tampon préconisé par le fournisseur.
Généralement, l’insert est ajouté dans des concentrations molaires 3 à 5 fois supérieures au
vecteur.
152
2.1.7.
Electrophorèse d’ADN
La séparation des fragments d’ADN est effectuée par électrophorèse (migration 30 minutes –
135V) sur gel d’agarose (0,8 % m/v pour une séparation de fragments >1 kb ou 3 % pour des
fragments < 1kb) dans du tampon TAE (Tris acétate 40 mM – EDTA 1 mM pH 8,0). Le
tampon de charge est ajouté aux échantillons avant leur dépôt. Le marqueur de taille utilisé est
le marqueur 1kb (New England Biolabs). Les fragments d’ADN sont visualisés aux
ultraviolets (λ=254 nm) après une incubation de 15 minutes dans une solution de bromure
d’éthidium (0,5 µg/mL).
La composition du tampon de charge (6X) est la suivante :
- 15 g de glycérol à 98%
- 125 mg de bleu de bromophénol
- 125 mg de xylène cyanol
- Qsp 50 mL d'eau.
2.1.8.
Purification des fragments d’ADN
Après migration sur gel d’agarose, les fragments issus des restrictions enzymatiques sont
purifiés selon leur taille à l’aide du kit Qiaquick gel extraction kit (Qiagen). Pour la
visualisation des fragments, le bromure d’éthidium n’est pas utilisé, mais du Sybr safe
(Invitrogen) est inséré directement dans le gel d’agarose. Ceci permet une révélation des
fragments directement sous un transilluminateur en lumière bleue (Safe imager Invitrogen) et
non sous UV pour éviter d’endommager l’ADN.
2.1.9.
Southern-blot
L’ADN génomique de la souche est digéré par PvuI puis soumis à une migration sur gel
d’agarose 0,8 %. Après transfert sur membrane de nitrocellulose, (Hybond-N) l’hybridation
est réalisée avec une sonde obtenue par amplification PCR de la zone zéta marquée à l’α-P32
dCTP (kit Megaprime –Amersham).
2.2. Techniques de transformation
2.2.1.
Transformation d’E. coli
Les cellules DH5α sont achetées chimiocompétentes (Invitrogen) et transformées par choc
thermique. Pour 10 à 15 µL d’ADN, 50 à 100 µL de bactéries compétentes sont ajoutées.
Après 30 minutes à 4°C, un choc thermique d’une minute à 42°C est réalisé suivi de 5
153
minutes à 4°C. Sont alors ajoutés, 900 µL de milieu SOC et les cellules sont incubées 1 heure
à 37°C et étalées sur milieu sélectif.
2.2.2.
Transformation Yarrowia lipolytica
Préparation de cellules compétentes
A partir d’une pré-culture de Y. lipolytica en YPD + 50 mM citrate pH 4 sur la journée, deux
cultures sont ensemencées à 1.105 et 5.105 cellules/mL dans ce même milieu et cultivées à
28°C. Lorsqu’une culture atteint une concentration cellulaire comprise entre 8.107 et 1,5.108
cellules/mL (12 à 16 h), elle est centrifugée 5 minutes à 5000 rpm. Les cellules sont lavées
deux fois avec 10 mL de TE (Tris 50 mM-EDTA 5mM pH 8) et la compétence est acquise par
incubation à 28°C des cellules dans 20 mL d’acétate de lithium (LiAc) 0,1 M pH 6. La
solution est alors centrifugée 2 minutes à 2000 rpm et le culot est doucement re-suspendu
dans du LiAc pour avoir 5.108 cellules/mL.
Transformation
Dans un tube stérile, on mélange 5 µL d’ADN entraîneur (ADN de saumon soniqué à
5 mg/ml dans du TE), 1 à 10 µL d’ADN à transformer (1 µg) et 100 µL de cellules
compétentes. Le mélange est incubé 15 minutes à 28°C au bain-marie sans agitation, puis
700 µL de PEG 4000 (40% dans LiAc 0,1 M pH 6,0) sont ajoutés. Le mélange est agité à
200 rpm à 28°C pendant 1 heure. 80 µL de DMSO (diméthyl-sulfoxyde – 10 % final) peuvent
être ajoutés dans le cas d’une recombinaison non homologue et un choc thermique est réalisé
10 minutes à 39°C. Après ajout de 1,2 ml de LiAc, les cellules sont étalées sur le milieu de
sélection.
2.3. Construction de souches disruptées de la levure Y. lipolytica
La cassette PT (promoteur terminateur) est obtenue par deux étapes d’amplification PCR. Elle
est schématisée dans la figure II-2. Le promoteur et le terminateur sont situés respectivement
en amont et aval de l’ORF du gène d’intérêt. Ces deux régions sont amplifiées à partir de
l’ADN génomique de la souche Po1d de Y. lipolytica, avec respectivement les amorces P1/P2
(fragment P) et T1/T2 (fragment T). Les amorces P2 et T1 sont des amorces à queue
flanquante contenant le site rare de reconnaissance de la méganucléase I-SceI. Une PCR de
fusion est alors réalisée à partir des fragments P et T avec les amorces P1 et T2 dans la
deuxième phase d’amplification. Cette cassette est ensuite clonée dans le vecteur pCR®4-
154
TOPO® (Invitrogen) et l’intégration est vérifiée par PCR avec les amorces P1 et T2. Ce
plasmide et le plasmide portant le marqueur de résistance à l’hygromycine (pKS LPR hygro
Rc) sont alors digérés par I-SceI. Après déphosphorylation du produit de digestion du
plasmide PT, une ligation entre celui-ci et le marqueur de sélection est réalisée. Le plasmide
résultant P-hph-T est vérifié par restriction enzymatique à l’aide de l’enzyme EcoRI. La
cassette de disruption est alors générée par amplification PCR avec les amorces P1 et T2, et
est ensuite transformée dans la souche à disrupter. Pour vérifier la disruption, une
amplification est réalisée avec des amorces en amont et aval de la cassette de délétion (Ver2
et Ver1).
P1
CDS
P2
T2
I-SceI
PCR
amorces T1 T2
PCR
amorces P1 P2
I-SceI
P
I-SceI
T
PCR
amorces P1 T2
P
T
Intégration dans plasmide pCR4-TOPO
plasmide PT
I-SceI
Digestion du plasmide PT par I-SceI et ligation avec
le module hph du plasmide pKS LPR hygro Rc
P
ADN génomique
Transformation :
Recombinaison par
double crossing over
CDS
ADN génomique
Ver1
T
hph
GENE DISRUPTE
P
T
hph
Ver2
Vérification par
amplification avec
Ver1 et Ver2
Figure II-2 : Technique de disruption d’un gène chez Y. lipolytica. Les séquences en amont et en
aval du gène d’intérêt sont amplifiées par PCR. Les fragments PCR P et T obtenus présentent un site
de restriction rare (I-SceI) et sont fusionnés par PCR. Le fragment PT obtenu est cloné dans le
plasmide PCR4 TOPO. Le plasmide PT obtenu est digéré par I-SceI afin d’y introduire le marqueur de
sélection hph (obtenu par digestion du vecteur pKS LPR hygro Rc par la même enzyme). La cassette
ainsi obtenue est utilisée pour la disruption du gène d’intérêt. Celle-ci est vérifiée par PCR.
155
3. Production et conditionnement enzyme
3.1. Production de l’enzyme
3.1.1.
Production en microplaque
L’inoculation se fait par le robot de piquage des colonies (Qpix), avec des aiguilles de type
cuillère à miel dans des microplaques contenant 200 µL de milieu YT2D0,25. Après 24 heures
d’incubation à 28°C sous agitation horizontale (200 rpm), les levures sont transférées dans un
milieu de production YT2O0,125 avec la même tête de piquage et remises à incuber 24 heures à
28°C sous agitation horizontale (200 rpm). Après centrifugation des microplaques de culture
(3500 rpm 10 minutes), le surnageant peut être prélevé pour la lecture d’activité lipase.
3.1.2.
Production en erlenmeyer
Les cultures sont ensemencées au 1/10ème à partir d’une pré-culture en tube en milieu YPD.
Elles sont réalisées dans des erlenmeyers bafflés remplis au maximum au 1/5ème de leur
volume total avec un milieu de production. Ils sont placés sous agitation à 28°C jusqu’à
consommation totale de l’acide oléique ou du glucose. Une centrifugation (5 minutes 5000
rpm) permet de récupérer le surnageant de culture.
Production en fermenteur
Arrivée d’air
Entrée pour inoculation
Prise d’échantillon
Agitation
Moteur
Condensateur
3.1.3.
Entrées
Sondes
Température
pH
Acide
PO2
Base
Niveau de mousse
Anti-mousse
Acide oléique
Eau de
refroidissement
Système d’acquisition et de
traitement des données
Figure II-3 : Représentation schématique de l’unité de fermentation utilisée
156
Les fermentations ont été réalisées dans un fermenteur de paillasse stérilisable BIOSTAT®
Bplus (Sartorius) de 5L permettant un contrôle automatique de la température, du pH du
milieu, du niveau de mousse et de la pression en oxygène (voir schéma Figure II-3).
L’antimousse utilisé est le Struktol J673 (des esters d’acides gras d’origine végétale), le pH
est régulé à l’aide d’acide orthophosphorique 20 %, et d’ammoniaque à 14 %. La PO2 est
régulée par l’agitation (agitation maximale de 1000 rpm), le débit d’air, et l’ajout d’oxygène
pur.
La culture est conduite en réacteur alimenté, avec une première phase de croissance des
levures sur glucose (100 g/l initial), puis une phase d’expression sur acide oléique.
3.1.4.
Suivi de la croissance des levures
Turbidimétrie
La concentration en biomasse est déterminée par mesure de l’absorbance à 600 nm du milieu
de culture. L’absorbance et la concentration en biomasse suivent une relation linéaire pour les
valeurs d’absorbances comprises entre 0 et 0,8 unités d’absorbance. Des dilutions sont
réalisées pour rester dans cette zone de linéarité. Un étalonnage DO-fonction de la masse
sèche a été réalisé.
Dosage du glucose résiduel au DNS
L’acide–3,5-dinitrosalycilique (DNS) permet de doser les sucres réducteurs (Sumner et
Howell, 1935) en milieu alcalin et à chaud. Un volume d’échantillon est mélangé à un volume
de réactif (voir composition). Après 5 minutes à 95°C, 10 volumes d’eau sont ajoutés et
l’absorbance est lue à 540 nm. La gamme étalon de glucose est comprise entre 0 et 2 g/L.
Le réactif du dosage au DNS (à conserver à l’abri de la lumière) est réalisé comme suit :
-
acide-3,5-dinitrosalycilique : 10 g/L
-
tartrate double de sodium et potassium : 300 g/L
-
NaOH : 16 g/L
3.2. Conditionnement de l’enzyme
3.2.1.
Récupération du surnageant
Le surnageant de culture contenant la lipase est récupéré par centrifugation. Pour des
conservations longues durées, il est filtré sur filtre 0,2µm.
157
3.2.2.
Concentration
La concentration de l’enzyme est réalisée sur membrane 10 kDa :
-
avec des unités d’ultrafiltration par centrifugation type Amicon (Millipore) pour les
volumes inférieurs à 500 mL.
-
avec une unité d’ultrafiltration sous vide type Filtron (Pall) pour les volumes supérieurs à
500 mL.
3.3. Purification de l’enzyme
L’enzyme est purifiée par deux étapes de chromatographie.
3.3.1.
Purification par chromatographie d’échange d’anions sur colonne
Q sepharose Fast Flow.
La première étape est une purification par chromatographie d’échange d’ions. La phase
stationnaire utilisée (Q sépharose fast flow) est chargée positivement et pourra fixer toutes les
molécules de charge opposée. Dans un premier temps, le débit est fixé à 8 mL/min et la résine
est équilibrée dans un tampon Tris 20mM pH 7,8. A ce pH, l’enzyme est chargée
négativement et se fixe sur la résine. La résine est alors lavée avec ce même tampon et toutes
les protéines et molécules non chargées ou chargées positivement sont éluées. Ensuite, les
molécules fixées sur la résine sont éluées en fonction de leur charge, en modifiant la force
ionique de la phase mobile par paliers. Le débit est alors de 13 mL/min. Un premier palier, à
50 mM de NaCl, est réalisé pour décrocher un premier lot de molécules. Le second palier, à
150 mM de NaCl, permet de récupérer la fraction contenant l’activité enzymatique.
Finalement, le reste des protéines est décroché avec un dernier palier à 1 M de NaCl.
3.3.2.
Purification par chromatographie d’interactions hydrophobes sur
butyl sépharose
La fraction contenant l’activité lipase est concentrée et reprise dans un tampon Tris 20 mM
pH 7,8 + 1 M de sulfate d’ammonium. Le débit est fixé à 0,5 mL/min et la lipase est injectée
sur la colonne de butyl sépharose préalablement équilibrée dans un tampon Tris 20mM pH
7.8 + sulfate d’ammonium 1M. A cette force ionique, les interactions hydrophobes sont
favorisées et les protéines se fixent sur la phase stationnaire. La désorption des protéines est
réalisée en diminuant l'interaction protéine/support par un gradient de force ionique
158
décroissant. Celui-ci est réalisé sur cinq volumes de colonne en faisant passer la concentration
en sulfate d’ammonium de 1 M à 0 M. La lipase étant de nature très hydrophobe, elle est
éluée tardivement.
3.4. Déglycosylation enzymatique
La déglycosylation enzymatique s’effectue à 30°C sur 36 heures à partir de 5 mg de lipase
purifiée à 15 g/L avec 5000 unités d’endoglycosydase Hf (New England Biolabs). L’enzyme
est utilisée en excès car les conditions d’activité de l’enzyme ne sont pas optimales.
L’endo Hf contenant un tag MBP (maltose binding protein) est facilement enlevée sur résine
d’amylose (New England Biolabs).
4. Caractérisation de l’enzyme
4.1. Détermination de l’activité hydrolytique des lipases par
spectrophotométrie
Le principe de la mesure repose sur le suivi par spectrophotométrie à 405 nm de l’apparition
du para-nitrophénol (pNP), produit de l’hydrolyse du para-nitrophényl butyrate (pNPB) sous
l’action de la lipase (Quinn, et al., 1982). Le milieu réactionnel est composé de 20 µL de
solution enzymatique additionné de 175 µL de tampon d’activité (100 mM Tampon phosphate
de sodium + 100 mM NaCl pH 7,2) et de 5µL d’une solution de pNPB à 40mM dans du 2méthyl-2-butanol (2M2B). La réaction est réalisée sous agitation à 30°C pendant 10 minutes.
L’activité (µmoL de pNP libéré par minute) est déterminée par suivi de l’absorbance à
405 nm avec un spectrophotomètre microplaque (Versamax). La gamme étalon du pNP est
réalisée entre 0 et 2,5 mM.
4.2. Thermostabilité : mesure de l’activité résiduelle
4.2.1.
Crible microplaque
Le crible se déroule de la façon suivante : une microplaque est centrifugée, 20 µL de son
surnageant est prélevé pour une lecture d’activité pNPB. Cette même microplaque est mise à
incuber dans un bain marie. Le temps et la température du crible ont été préalablement ajustés
pour que la lipase à faire évoluer garde environ 20% de son activité résiduelle. Le criblage du
premier tour d’évolution dirigé a été effectué à 60°C pendant 7,5 minutes. Le criblage du
159
second tour a été effectué à 90°C pendant 20 minutes. 20µL de surnageant de culture sont
alors prélevés pour une nouvelle lecture d’activité. Le rapport activité résiduelle/activité
initiale est calculé.
4.2.2.
Evaluation de la thermostabilité
L’enzyme à tester est incubée à différentes températures et, à intervalles de temps déterminés.
Des échantillons sont prélevés et testés sur leur activité lipase (à 30°C).
4.3. Dosage de protéines
Le dosage des protéines a été effectué selon 2 méthodes :
4.3.1.
La méthode de Bradford (1976)
Le principe du dosage des protéines par le bleu de Coomassie repose sur une absorption
différentielle de ce colorant selon qu’il est lié ou pas aux protéines (liaisons aux acides aminés
basiques et aromatiques des protéines). Le test dit du micro-Bradford est utilisé. Le milieu
réactionnel comprend 0,4 mL d’échantillon à doser et 0,1 mL de réactif de Bradford (Biorad).
L’absorbance est lue à 595 nm. La gamme étalon est composée d’albumine bovine sérique
(BSA) entre 0 et 25 mg/L.
4.3.2.
La méthode de Lowry (1951)
Le principe du dosage des protéines par la méthode de Lowry repose sur l’apparition d’une
coloration bleue du réactif de Folin-Ciocalteu lorsqu’il réagit avec les tyrosines et les
tryptophanes des protéines. Le milieu réactionnel est composé de 1 mL de solution à doser et
3 ml de réactif A+B (obtenu en mélangeant 50 ml de réactif A avec 1 ml de réactif B) et est
laissé 10 minutes à obscurité. Un volume de 0,3 mL de réactif de Folin et Ciocalteu (dilué 2
fois) est ajouté, et le mélange est laissé 30 minutes à l’obscurité. L’absorbance à 750 nm est
lue. La gamme étalon est composée d’albumine bovine sérique BSA entre 0 et 100 mg/L.
Réactif A : 2 g de Na2CO3 + 0,02g de sodium tartrate double (Na/K) dans 100 mL de soude
0,1 M
Réactif B : 0,5g de CuSO4, 5H2O, H2SO4 (une goutte) dans 100 mL d’eau
Réactif de Folin et Ciocalteu : Préparation commerciale à diluer 2 fois avant utilisation
160
4.4. Electrophorèse SDS-Page
4.4.1.
Electrophorèse en conditions dénaturantes
Les protéines sont dénaturées (10 minutes à 70°C en présence de LDS et d’agent réducteur) et
sont analysées par une électrophorèse SDS-Page sur un gel à 10 % d’acrylamide (Gel 10%
bis-tris NuPAGE®). La migration se fait dans du tampon MOPS, à 200 V, pendant 50
minutes. Après migration des protéines, le gel est coloré selon le protocole de coloration au
bleu colloïdal (NuPAGE®- Invitrogen) ou au nitrate d’Argent (SilverXpress Silver Staining
Kit- Invitrogen).
4.4.2.
Electrophorèse en conditions natives
Les électrophorèses en condition native ont été réalisées avec le système PHAST
(Pharmacia). La migration est réalisée à 400V pendant 30 minutes avec des gels de type
PHAST (20% homogeneous).
4.5. Etat d’agrégation de la protéine
4.5.1.
Chromatographie de gel d’exclusion
La chromatographie d’exclusion stérique permet de séparer les molécules selon leur taille.
Elle peut servir de technique de purification, mais dans notre cas, nous l’utilisons comme
vérification de l’état d’agrégation de la lipase. L’appareil utilisé est un système FPLC de type
ÄKTA purifier. La colonne de perméation de gel utilisée est une Superdex 200 (24 mL) dont
la gamme de séparation s’étend de 10 à 600 kDa. Le tampon d’élution se compose d’une
solution de Tris à 20 mM additionnée de 500 mM de NaCl. Le débit est fixé à 0,5 mL/min.
Un volume de 0,5 mL de solution protéique est injecté. Des fractions de 1 mL sont collectées.
La gamme étalon est réalisée avec des protéines globulaires de tailles différentes :
chymotrypsinogen A (25 kDa) ovalbumin (43 kDa), albumin (67kDa), aldolase (158 kDa)
thyroglobulin (669 kDa).
4.5.2.
DLS : dynamic light scattering
Les expériences de DLS ont été réalisées sur un Dynapro Titan (Wyatt Technology, France).
Environ 20 µL d’échantillon sont placés dans une microcuve en quartz et sont soumis à un
rayonnement laser (825,7 nm puissance réglable de 0 à 50 W). Les variations d’intensité de la
lumière diffusée au cours du temps ont été enregistrées 20 fois sur des temps d’acquisition de
161
10 secondes, pour un angle de diffusion de 90°. A partir de la fonction d’auto-corrélation, le
rayon hydrodynamique moyen des protéines en solution a été déterminé à l’aide du logiciel
Dynamics.
4.6. Analyse protéomique
4.6.1.
Analyse de la glycosylation de l’enzyme
L’analyse de la glycosylation de l’enzyme a été réalisée par chromatographie liquide couplée
à la spectrométrie de masse (electrospray ionization MS).
Un aliquot 1 mg de lipase est dissous 30 min à 37°C dans un tampon contenant 0,2 M TrisHCl, 6 M chlorure de guanidine, et 2 mM EDTA à pH 8,5. L’échantillon peut être réduit en
présence de 0,06M de dithiothréitol (DTT) à l’obscurité. Des réactions d’alkylation des
cystéines ont lieu avec 0,18 M de vinyl pyridine (90 min) à 37 °C dans le noir. Ces réactions
sont stoppées par acidification à pH 2 avec de l’acide formique. L’échantillon est alors dialysé
avec 0,1 M HCOOH. Après séchage sous vide, l’échantillon est dissous dans 0,2 M de
tampon NH4HCO3 (pH 8,7) pour la digestion par la trypsine ou l’endoprotéase Asp-N (Roche
Diagnostics, Meylan, France). Les digestions se font soit avec 2 mg de trypsine, soit avec
0,8 mg endoprotéase Asp-N à 37°C sur la nuit. Après séchage sous vide, les échantillons sont
dissous dans 5% d’acétonitrile (v/v) contenant 0,1% d’acide formique pour une analyse en
chromatographie liquide.
Des volumes de 10 µL sont chargés sur une colonne phase inverse Vydac C18 (3,2 x 250 mm,
taille des pores 30 nm, épaissuer des billes de silice 5 mm). L’élution est réalisée à
température ambiante, avec 5% de solvant B (acétonitrile + 0.1% HCOOH) dans A
(H2O+0.1% HCOOH), pendant 2 minutes. Ensuite un gradient linéaire de B dans A de 5% à
45% est réalisé sur 40 minutes, puis de 45% à 90% sur 5 minutes avant ré-équilibration. Le
débit est fixé à 0,5 mL/min. Après élution dans la colonne, une partie (1/5ème) est introduite
dans la source ESI de la trappe ionique à un débit de 100 µL/min.
4.6.2.
Analyse de l’incorporation de la sélénométhionine
Pour analyser l’incorporation de sélénométhionine dans la protéine Lip2, une analyse par
spectrométrie de masse a été réalisée par NanoElectrospray-MS (Q-Star). L’enzyme a été
préalablement précipitée au TCA (acide trichloroacétique) et dissoute dans un mélange
H2O/Méthanol/Acide formique (50:50:1),
162
5. Construction du modèle de la structure tridimensionnelle
de la structure de la lipase de Y. lipolytica.
Les alignements de structure primaire ont été réalisés avec le logiciel PSI-BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) contre les protéines de la PDB. Les éléments de
structure secondaire ont été prédits à l’aide du logiciel PSIPRED, disponible gratuitement sur
Internet (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) (McGuffin, et al., 2000).
Le modèle de la structure tridimensionnelle de Lip2 a été construit avec le logiciel Modeler
disponible dans le module HOMOLOGY du logiciel Insight II (Accelrys, USA) avec les
alignements de séquences réalisés précédemment. L’affinement de la structure de plus basse
énergie a été réalisé en utilisant le champ de force CFF91 disponible dans le module
DISCOVER du logiciel insight II (Accelrys, USA). Pour la minimisation, les termes croisés
du champ de force CFF91, un potentiel de liaison harmonique, et une constante diélectrique
de 1,0 ont été utilisés. Une première minimisation avec une contrainte sur les carbones α a été
réalisée en utilisant un algorithme de type plus grande descente, suivi par des étapes de
minimisation par gradient conjugué, jusqu'à ce que le RMS maximum soit inférieur à 0,5.
L’étape suivante a consisté à relâcher complètement le système. Ces calculs ont été réalisés
sur une station de modélisation de type Silicon Graphic O2.
Le modèle ainsi réalisé a été vérifié à l’aide du logiciel PROCHEK, disponible sur la plateforme Biotech de validation des structures protéiques. Ce logiciel permet de vérifier la qualité
stéréochimique du modèle. Ainsi, plusieurs paramètres stéréochimiques ont été examinés : les
angles Φ et Ψ de la chaîne principale, la planarité des chaînes latérales, les longueurs et les
angles de liaisons. Il a été vérifié que les valeurs étaient dans la gamme des valeurs standards
attendues. Le logiciel WHATIF quant à lui, disponible sur la plate-forme biotech de
validation des structures protéiques, a permis de vérifier les rotamères.
163
6. Détermination
de
structure
de
protéine
par
cristallographie et diffraction aux rayons X
6.1. Méthodes de cristallisation
6.1.1.
Méthode de cristallisation par diffusion de vapeur
La méthode de cristallisation par diffusion de vapeur a été utilisée selon 2 variantes : la
technique de la goutte assise a été utilisée pour le criblage à haut débit de conditions de
cristallisation sur plaques 96 puits, et la technique de la goutte suspendue a été utilisée pour
l’affinement des conditions de cristallisation retenues en plaque 24 puits.
6.1.2.
Criblage haut-débit des conditions de cristallisation.
Les tests de criblage haut débit sont réalisés avec un robot de type Nanodrop ExtY
(Innovadyne), sur des plaques de marque Greiner. Des volumes de 0,1 µL de solution
protéique et de 0,1 µL de réservoir sont distribués automatiquement dans des cupules. Le
volume du réservoir est de 80 µL. Plusieurs screens commerciaux ont été utilisés (voir liste
tableau II-4). Le suivi de la cristallisation est assuré par la prise de vue à intervalles de temps
réguliers de chacune des gouttes de cristallisation par un robot de type CrystalPro (Tritek).
Tableau II-4 : Liste des Kits de criblage commerciaux de solution de cristallisation
Nom du screen
Fournisseur
Classics Suite
Qiagen
PEG suite
Qiagen
PEG II suite
Qiagen
AmSO4 suite
Qiagen
pH clear suite
Qiagen
pH clear II suite
Qiagen
Low Ionic Strength Kit
Sigma Aldrich
JCSG Core Suite I
Qiagen
JCSG Core Suite II
Qiagen
JCSG Core Suite III
Qiagen
JCSG Core Suite IV
Qiagen
164
6.1.3.
Technique de l’ensemencement
Cette technique a été employée pour tenter d’améliorer la qualité de cristaux en évitant la
polynucléation. Elle consiste à travailler à une concentration inférieure à la concentration de
nucléation mais permettant quand même la croissance cristalline, et à ensemencer avec des
microcristaux déjà obtenus dans ces mêmes conditions. Les cristaux sont prélevés et
distribués avec une moustache de chat dans les gouttes.
6.1.4.
Conditions de cristallisation de Lip2
Les conditions de cristallisation étudiées sont récapitulées dans le tableau II-5
Tableau II-5 : Différentes conditions de cristallisation de la lipase Lip2 de Y. lipolytica.
Conditions de cristallisation
Forme de la lipase
Concentration de la
lipase
Conditionnement
de la lipase
Solution de
cristallisation
native
déglycosylée
déglycosylée
15 g/l
14 g/L
14 g/L
Tris 20 mM pH7,8
+ 500 mM NaCl
27-28 % PEG 3350
0,1M HEPES pH 7-7,5
Tris 20 mM pH7,8
Tris 20 mM pH7,8
4 M formate
Forme cristaux
Triangles très fins
Formation en feuillets
29-32% MPD
100 mM MES pH 5,5
20 mM CaCl2
200 mM NaCl
Petits rectangles ou
bipyramides
Cryoprotection
Glycérol 15%
Aucune
Ovales
Glycérol 15%
6.2. Trempages
Pour permettre l’intégration de métaux lourds dans le système cristallin, des trempages des
cristaux sont réalisés dans la solution de cristallisation additionnée du métal lourd à une
concentration de 10 mM. La fixation des métaux lourds dans le cristal entraîne souvent une
dégradation du cristal. Le compromis entre la meilleure fixation possible et un état du cristal
suffisamment bon pour pouvoir enregistrer des diffractogrammes de qualité doit être trouvé
en jouant sur les temps d’incubation et la concentration en métal lourd.
165
6.3. Acquisition des données de diffraction
Les cristaux sont prélevés dans la solution de cristallisation à l’aide d’une boucle de nylon.
Les premiers tests de diffraction ont été réalisés au laboratoire de l’IPBS avec un appareil de
type Xcalibur Nova (Oxford diffraction) pour l’analyse des cristaux montés sur boucle de
nylon. L’enregistrement se fait à une température de 100°K. La source de rayonnement X est
un tube scellé avec une anode en cuivre. La longueur d’onde sélectionnée est la raie Kα du
cuivre à 1,54 Å. Les données sont collectées sur un détecteur CDD (Controlled Drift
Detector) de type Onyx. Les données sont traitées avec le logiciel CrysAlis.
Les jeux de données finaux sont collectés à l’ESRF de Grenoble, sur les lignes id14 ou id23.
L’enregistrement des données de diffraction a été réalisé selon la méthode du cristal tournant
en mode oscillation.
6.4. Traitement des données de diffraction et phasage
Tous les programmes ayant servi au traitement des données de diffraction sont listés dans le
tableau II-6. L’ensemble de ces programmes (à l’exception de MOSFLM) est disponible
gratuitement sur le web (www.ccp4.ac.uk), et fourni par CCP4 (Collaborative Computational
Project Number 4) suite de logiciels dédiés à la cristallographie des macromolécules aux
rayons X (CCP4, 1994).
Tableau II-6 : Liste et fonction des logiciels utilisés pour le traitement des données
cristallographiques
Programme
Fonction
MOSFLM
Indexation et intégration des intensités diffractées
SCALA
Mise à l'echelle des différentes images d'un jeu de données
SCALEIT
Mise à l'echelle des données entre différents jeux de données
MLPHARE
Cacule les phases et affine les paramètres des atomes lourds
AMORE,
MOLREP et
PHASER
POINTLESS
Matthews coef
Programmes de remplacement moleculaire.
(Phaser est basé sur le maximum de vraisemblance)
Détermine le groupe d'espace à partir d'un jeu de données
Estime le nombre de molecule dans l'unité asymétrique à
partir du calcul du Coefficient de Matthews
166
Chapitre III : Résultats
167
Première
partie :
Développement
d’un
système
d’expression pour criblage haut débit chez la levure
Yarrowia lipolytica.
Nous avons vu dans la partie bibliographique l’intérêt biotechnologique de la lipase Lip2 de
Yarrowia lipolytica. Son utilisation à l’échelle industrielle reste cependant limitée, car comme
tout biocatalyseur, elle n’est pas forcément totalement adaptée aux conditions d’utilisations
industrielles. Une des voies pour adapter l’enzyme à des procédés industriels est la voie de
l’évolution moléculaire dirigée. Une telle voie nécessite plusieurs pré-requis, l’un d’entre eux,
est la nécessité d’avoir un système d’expression compatible avec un criblage haut débit de
l’enzyme. Un tel système doit satisfaire plusieurs critères :
-
un nombre de transformants suffisant doit pouvoir être obtenu facilement ;
-
l’activité de la protéine désirée doit pouvoir être facilement mesurée ;
-
la croissance des variants et l’expression protéique doivent être identiques entre les
variants de façon à rapidement voir si une protéine a des propriétés améliorées.
Aujourd’hui, la grande majorité des améliorations d’enzyme par évolution dirigée ont été
obtenues avec E. coli comme système d’expression. Cependant, ce système d’expression
procaryote, malgré sa facilité de mise en œuvre présente des limites, notamment lorsqu’il
s’agit de l’expression de protéines d’origine eucaryote. En effet, les bactéries ne possèdent pas
l’artillerie enzymatique pour réaliser les modifications post-traductionnelles nécessaires au
bon repliement et à l’activité de certaines enzymes eucaryotes. Entre autres, elles ne sont pas
capables de réaliser la glycosylation parfois nécessaire à l’activité de certaines protéines, ni de
former correctement les ponts disulfures, surtout s’ils sont présents en grande quantité dans
les protéines. D’autre part, les protéines sont rarement sécrétées et souvent exprimées de
manière inactive sous forme de corps d’inclusion.
La lipase Lip2 qui nous intéresse est une protéine eucaryote possédant 4 ponts disulfures ; par
conséquent, une expression dans un système procaryote pour réaliser l’évolution de cette
enzyme ne paraît pas être un bon choix. Actuellement, cependant, peu de systèmes
d’expression eucaryotes sont disponibles pour l’évolution moléculaire des enzymes. Dans ce
cadre, les systèmes d’expression levuriens, en particulier les levures Saccharomyces
cerevisiae et Pichia pastoris sont prometteurs, de par leur simplicité d’utilisation, leur rapidité
de croissance, et les nombreux outils génétiques développés. Ce sont déjà des outils efficaces
169
en ce qui concerne l’expression de protéines hétérologues, malgré les problèmes classiques
d’expression hétérologue de protéines (par exemple, chez Saccharomyces cerevisiae,
l’hyperglycosylation peut être à l’origine d’une production d’enzyme non active). Cependant,
en ce qui concerne l’utilisation de ces hôtes en vue de l’évolution dirigée des protéines, ils
sont encore peu développés et présentent de nombreuses limitations. Ainsi, la miniaturisation
des conditions de culture et d’expression protéique peuvent poser des problèmes, comme c’est
le cas pour la levure Pichia pastoris, pour laquelle, la composition du milieu de culture en
microplaque doit être finement optimisée pour éviter le phénomène de mort cellulaire
(Boettner, et al., 2002; Weis, et al., 2004). Par ailleurs des problèmes de standardisation de
l’expression protéique se posent souvent. Ils se traduisent par l’identification de nombreux
faux positifs pour la levure Saccharomyces cerevisiae (Butler, et al., 2003; Festa, et al., 2008).
En outre, chez la levure Pichia pastoris, le taux transformant n’ayant pas intégré la cassette
d’expression (recombinaison du marqueur de sélection seul) est souvent assez élevé et peut
aller au delà de 50%.
Parmi les levures, un autre candidat : la levure Yarrowia lipolytica pourrait être une
alternative intéressante. Cette levure est déjà un hôte reconnu pour l’expression hétérologue
de protéines. De nombreuses protéines (plus de quarante à ce jour) issues de différents types
d’organismes (virus, bactéries, levures, homme) et de tailles variables (de 6 à 116 kDa) ont
ainsi été exprimées avec succès chez cette levure (Madzak, et al., 2004). De plus, celle-ci est
souvent appréciée dans le cadre de la production de protéines recombinantes pour des
capacités de sécrétion importantes et les outils génétiques sont bien développés. D’autre part,
l’hyperglycosylation est modérée chez cette levure (Muller, et al., 1998). Tous ces avantages
nous ont conduit à tenter de développer un système permettant d’utiliser cette levure
comme plate-forme d’expression pour l’évolution dirigée d’enzymes. Nous avons choisi
comme protéine rapporteur la lipase Lip2 de Y. lipolytica. Cette lipase d’intérêt
biotechnologique présente aussi l’avantage d’être sécrétée dans le milieu de culture, ce qui
permet un criblage facilité de l’activité enzymatique.
Pour ce faire, les variabilités de chaque étape du criblage ont été quantifiées et optimisées
séparément. Notre analyse s’est donc d’abord basée sur la quantification de la reproductibilité
du test d’activité enzymatique, puis sur l’optimisation des conditions de croissance et de
production de protéines, et, dans un dernier temps, nous nous sommes intéressés à la
variabilité apportée par l’étape de transformation.
170
1. Mise au point du système de criblage pour l’évolution
dirigée d’enzyme
1.1. Quantification de la reproductibilité du test enzymatique
Une étape préliminaire de production en microplaque de la lipase Lip2 par Y. lipolytica a
permis de vérifier que le niveau de production était suffisamment élevé pour un dosage
enzymatique direct du surnageant de culture par la méthode du pNPB et sans dilution
préalable.
Une quantification de la reproductibilité du test d’activité enzymatique a été réalisée dans les
conditions prévues pour le criblage haut débit des variants de l’enzyme. Le remplissage des
microplaques (20 µL de surnageant de culture +175 µL de tampon d’activité + 5 µL de pNPB
à 40 mM dans du 2M2B) est réalisé par un robot TECAN (liquid handling station) à partir
d’un surnageant de culture de la lipase native produite en erlenmeyer et correctement dilué.
Le pNPB a priori peut sembler un mauvais choix de substrat pour les lipases, qui sont plus
spécifiques des longues chaînes carbonées. Cependant, elles sont aussi capables d’hydrolyser
les substrats à courtes chaînes carbonées. L’avantage d’utiliser ce type de substrat dans ce cas
réside dans sa solubilité plus grande en phase aqueuse, ce qui permet une émulsion fine et
augmente la reproductibilité du test enzymatique. Le choix du 2-méthyl-2-butanol (2M2B)
comme solvant pour la solution stock de pNPB a été basé sur la stabilité de celle-ci. En effet,
avec d’autres solvants comme l’acétonitrile, l'hydrolyse spontanée de la solution stock a lieu
après seulement quelques heures, et, lors d'une cinétique, l'eau utilisé comme blanc hydrolyse
le pNPB dans l’acétonitrile en quelques minutes (Sandoval, 2002). Avec le 2M2B,
l’hydrolyse spontanée du pNPB est négligeable par rapport à l’activité de la lipase sauvage
(environ 2%).
L’analyse statistique de la reproductibilité du test enzymatique a été réalisée à partir de deux
microplaques (192 puits). L’activité lipase des 192 puits présente une distribution gaussienne
avec une activité moyenne de 1,19 +/- 0,14 U/mL (voir figure III-1), c'est-à-dire un
coefficient de variation de 11,7% pour le test enzymatique.
171
B
60
Activité lipase U/mL
Nombre de puits
A
50
40
30
20
10
0
0.8
1.0
1.2
1.4
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1.6
0
25
Activité Lipase (U/mL)
50
75
100 125 150 175 200
Numéro
Nombre de
de puits
puits
Figure III-1 : Reproductibilité du test d’activité lipase. La distribution (A) représente le nombre de
puits présentant une activité donnée. La dispersion (B) représente l’activité lipase pour chaque puits ;
l’activité lipase ayant été triée par ordre croissant.
1.2. Optimisation de la croissance et de la production de protéines.
Pour étudier la reproductibilité de la production de protéines pour un même clone dans les
conditions du criblage, la souche JMY1165 a été transformée par le plasmide JMP8 digéré par
NotI. Un clone (JMY1165-JMP8-1) a été cultivé, puis dilué correctement pour obtenir des
colonies isolées sur milieu solide. C’est à partir de cet unique clone que la variance de la
production de protéines a pu être évaluée. Les clones sont visualisés, puis piqués et transférés
dans des microplaques préalablement remplies de milieu de production (YPDO de manière
automatique par un robot (QPix). De même, le remplissage des microplaques avec du milieu
de production est réalisé par un robot (TECAN).
L’utilisation d’automates engendre non seulement à un gain de temps nécessaire pour réaliser
le criblage haut-débit des variants de l’enzyme (par exemple, 1000 colonies pourront ainsi
être mises en culture en moins de ½ heure), mais permet d’autre part d’augmenter la
reproductibilité du système en s’affranchissant des variations dues à des interventions
humaines.
1.2.1.
Eviter les contaminations croisées
Le premier travail a consisté à éviter les contaminations croisées (un variant par puits
seulement). De telles contaminations peuvent avoir lieu lors de la culture en microplaque des
levures (lors de débordements de puits par exemple) ou être dues à un mauvais nettoyage de
172
la tête de piquage. Un mode de culture et une procédure de nettoyage de la tête de piquage ont
donc été développés pour éviter ces problèmes. Le mode de culture retenu est une agitation
horizontale des microplaques de cultures contenant 200 µL de milieu de culture.
L’ensemencement d’une ligne sur deux a permis de vérifier qu’il n’existait pas de
contaminations croisées entre les puits. La procédure de nettoyage mise au point consiste en
une première étape de nettoyage de la tête de piquage dans un bain de détergent contenant une
brosse pour se débarrasser des levures résiduelles, suivie d’une étape de rinçage dans un bac
contenant de l’eau et une brosse, puis d’une dernière étape consistant en un trempage dans
l’éthanol qui permet le séchage rapide de la tête par passage sous un flux d’air stérile.
L’ensemencement d’une microplaque sur deux et leur mise en culture a permis de montrer
que cette procédure évite toute contamination croisée entre deux microplaques.
1.2.2.
Optimisation de la croissance et de la production en microplaque
Les premières tentatives d’inoculation des colonies par le robot et de production de lipase en
milieu YPDO se sont soldées par des échecs : une inoculation et une croissance non
homogènes étaient observées et de acide oléique résiduel était présent dans le surnageant de
culture (+/- selon les puits). Ces problèmes conduisaient à un haut coefficient de variation
(30%) pour l’ensemble du procédé (croissance et expression protéique + test d’activité
lipase). L’inoculation ainsi que le milieu de production ont donc dû être améliorés pour
diminuer la variance de cette étape.
1.2.3.
Optimisation du piquage des colonies
En utilisant des aiguilles d’inoculation standards, aucune croissance n’est observée dans
environ 10 % des puits et la consommation d’acide oléique est différente selon les puits, ce
qui traduit une inoculation non homogène. Différents types d’aiguilles ont donc été testés
pour tenter d’améliorer l’inoculation : des aiguilles spécialement adaptées aux levures et des
aiguilles de type « cuillère à miel ». Ce sont ces dernières qui ont été retenues car elles
permettent d’obtenir une inoculation reproductible.
173
1.2.4.
Optimisation du milieu de production et de la conduite de
production
Dans un premier temps, l’inoculation des levures a été directement réalisée dans un milieu
YPDO (glucose et acide oléique à 10 g/L) mais de l’acide oléique résiduel était présent dans
les puits en fin de culture, ce qui était dommageable pour le test spectrophotométrique
d’activité lipase. Ce type de milieu n’est pas le plus adapté pour la production de lipase en
microplaque. En effet, le gène LIP2 est sous contrôle du promoteur POX2, ce promoteur est
inductible à l’acide oléique mais est aussi réprimé par le glucose. Pour améliorer la
reproductibilité de l’expression protéique nous avons décidé :
- d’adapter les concentrations en glucose et acide oléique à une culture microplaque en
les diminuant.
- de réaliser une première étape de croissance des levures sur glucose puis une deuxième
étape d’expression des protéines (sur acide oléique) à partir de cet inoculum standardisé. De
cette manière le glucose ne peut pas réprimer l’expression de la lipase.
Une première phase de croissance a donc été réalisée en présence de glucose (2,5 g/L) pour
assurer une croissance homogène. L’inoculation de la seconde microplaque pour la phase
d’expression des protéines a d’abord été réalisée par un ensemencement au 1/10ème avec la
microplaque de croissance avec un automate de transfert de liquides en conditions stériles
(Biomek 2000, Beckman). Cette méthode a permis d’obtenir une bonne reproductibilité, mais
a été écartée pour des raisons économiques (1 cône utilisé par variant). L’ensemencement par
trempage de la tête de piquage de la plaque mère à la plaque fille conduit à d’aussi bons
résultats et a donc été la méthode retenue.
La concentration d’acide oléique a été optimisée en testant différentes concentrations entre
0,16 et 10 g/L ; 48 puits ont été testés pour chaque concentration. Après 20 heures d’induction
à 28°C, l’activité lipase et le coefficient de variance ont été déterminés pour chaque
concentration. Une courbe en cloche concave est obtenue en ce qui concerne le coefficient de
variation et les meilleures activités sont obtenues pour des concentrations d’acide oléique
comprises entre 0,625 et 2,5 g/L (Figure III-2). Le meilleur compromis entre activité et
coefficient de variation consiste en une concentration de 1,25 g/L d’acide oléique pour la
phase d’expression des protéines. D’autre part, aucune trace d’acide oléique résiduel n’est
présente dans ces conditions après les 20 heures de culture.
174
Activité lipase (U/mL)
A
B
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.16 0.31 0.62 1.25 2.5
5
10
Coefficient de variance(%)
30
25
20
15
10
5
0
0.16 0.31 0.62 1.25 2.5
5
10
Concentration en acide oléique (g/L)
Concentration en acide oléique (g/L)
Figure III-2 : Effet de la concentration d’acide oléique sur l’activité lipase et le coefficient de
variation. Des clones de la souche JMY1165-JMP8-1 sont transférés à partir de plaque YTD (glucose
2,5 g/L) mère avec la tête de piquage, puis cultivées 20 heures à 28°C avec différentes concentration
d’acide oléique (entre 0,16 et 10 g/L). Après centrifugation des microplaques, le surnageant de culture
est testé (48 puits testés par concentration d’acide oléique). L’activité lipase (A) et le coefficient de
variance (B) sont représentés en fonction de la concentration en acide oléique.
En utilisant les conditions définies pour standardiser l’expression protéique : 1) inoculation
avec tête de piquage type « cuillère à miel », 2) standardisation de l’inoculum (par une phase
de croissance sur glucose à 2,5 g/L) 3) phase de production sur acide oléique de concentration
optimisée à 1,25 g/L, nous avons évalué la reproductibilité de l’expression protéique à partir
de 4 microplaques (384 puits). Une activité de 0,863 +/-0,112 U/mL a été obtenue, ce qui
correspond à un coefficient de variance de 13% pour le procédé entier. Si on prend en
compte que le test d’activité lipase représente à lui seul 11,7% de variabilité, cela indique que
l’étape correspondant au piquage, à la croissance des levures et à l’expression protéique
représente une variabilité de seulement 1,3%, ce qui est un excellent résultat.
1.3. Optimisation de l’étape de transformation de la cassette
d’expression
La souche utilisée au laboratoire pour la production recombinante de la lipase de Y. lipolytica
est issue de la souche française W29 ; elle ne possède pas le transposon Ytl1, ni les zones
zétas (Long Terminal Repeat) qui lui sont associées (Schmid-Berger, et al., 1994). Par ailleurs
la protéase extracellulaire alcaline a été délétée, ainsi que trois autres lipases. En effet, le
séquençage du génome de Y. lipolytica a mis en évidence de grandes familles de gènes codant
pour l’utilisation des substrats hydrophobes, et 16 gènes codent potentiellement pour des
lipases (et 2 pour des estérases lip1 et lip3). Pignède et al. (2000a) ont mis en évidence qu’au
175
moins 95 % de l’activité lipase extracellulaire était due à Lip2, les 5 % restant étant dus aux
lipases Lip7 et Lip8 : lipases partiellement extracellulaires et certainement liées à la paroi de
la levure (Fickers, et al., 2005c). La souche utilisée est une souche délétée pour ces trois
lipases ; aussi aucune activité lipase n’est-elle détectée dans le surnageant de culture
1.3.1.
Quantification de la variabilité apportée par la transformation de
la souche JMY1165
La cassette d’expression contenant le gène LIP2 est bordée par les zones zéta. Ces zones
permettent une intégration au hasard dans une souche dépourvue deYlt1 (Mauersberger, et al.,
2001). La transformation de la souche JMY1165 avec le plasmide JPM8 digéré par NotI avec
50 ou 250 ng d’ADN a été réalisée en présence de DMSO. Il favorise la recombinaison non
homologue et permet d’augmenter le taux de transformation d’un facteur 4,6 ce qui permet
d’atteindre environ 4000 transformants par µg d’ADN (contre 850 sans DMSO). L’activité
lipase et le coefficient de variance ont été mesurés sur 384 transformants. Une activité
moyenne de 1U/ml et un coefficient de variance de 36,3 % ont été obtenus. La figure III-3
Activité lipase Normalisée
permet de visualiser la variabilité introduite par l’étape de transformation.
2.5
2
2
1.5
1
0.5
1
0
0
100
200
300
400
Numéro de puits
Nombre de puits
Figure III-3 : Comparaison de la dispersion pour les transformants de la souche JMY1165 et
pour la variabilité de l’expression protéique pour un même clone. L’activité lipase a été mesurée
pour 384 transformants individuels en utilisant les conditions optimales mises au point (inoculation,
croissance en YTD et expression en YTO). La dispersion de l’activité lipase pour chaque transformant
est comparée à la dispersion de l’activité lipase pour l’étape consistant à l’expression de la lipase.
Environ 8% des transformants (30 des 384 transformants) présentent moins de 50% de
l’activité moyenne et 22 clones présentent une activité nulle (partie 1 de la Figure III-3). Ils
représentent des clones avec une conversion du gène URA3 ou des clones ayant intégré la
cassette d’expression à des locus faiblement exprimés. D’autre part, 10 clones présentent une
176
activité deux fois supérieure à la moyenne, ce qui peut correspondre à des clones ayant inséré
deux copies de la cassette d’expression, et 40 clones (11%) présentent des activités 1,3 fois
supérieures à la moyenne. Ce sont probablement des clones ayant inséré la cassette
d’expression à des locus hautement exprimés. Seulement 38% des clones présentent une
activité variant autour de +/-10% par rapport à la moyenne. Cette forte variabilité est un
inconvénient majeur pour le criblage de mutants avec une haute probabilité de sélectionner
des faux positifs (lipase peu active insérée en plusieurs copies ou à un hot spot) et des faux
négatifs (lipase très active peu ou pas exprimée). Ainsi, cette souche ne peut être utilisée pour
le criblage haut débit d’activités enzymatiques améliorées.
Ainsi, en supposant que les données suivent une répartition gaussienne (Figure III-4), le taux
de faux positifs est déterminé par l’équation suivante :
Taux de faux positif = 1 –F[(x-x0)/(moyenne . CV)]
où le taux de faux positifs est dépendant de la valeur moyenne de l’activité pour la population
sauvage(x0), du coefficient de variation CV, de la loi normale F qui représente la probabilité
de trouver une valeur de x inférieure ou égale à x0 (Salazar and Sun, 2003). Le taux de faux
positifs dépendra du coefficient de variance et du niveau d’amélioration décidé par
l’expérimentateur. Ainsi pour un niveau d’amélioration déterminé, plus le coefficient de
variance sera élevé, plus le taux de faux positif sera important (tableau III-1).
Tableau III-1 : Nombre théorique de faux positifs obtenus pour une distribution gaussienne des
activités lipases pour 10 000 clones testés selon le coefficient de variation de la population initiale
et le niveau d’amélioration recherché
CV
Nombre de faux positifs
pour une amélioration de
1,5 fois la moyenne
Nombre de faux positifs
pour une amélioration de 2
fois la moyenne
0,1
0
0
0,15
4
0
0,189
41
0
0,2
62
0
0,25
228
0
0,3
478
4
0,363
842
29
Ainsi, si l’objectif est d’isoler un mutant avec une activité 50 % supérieure à l’activité
moyenne de la population de la lipase sauvage (dans ce cas le niveau d’amélioration à
atteindre est x =1,5 x0) avec un coefficient de variance de 36,3 %, et si 10 000 clones sont
testés, alors, 842 faux positifs peuvent être attendus ! De même si le but est d’isoler un mutant
avec une activité deux fois supérieure à la lipase sauvage, cela conduira à 29 faux positifs.
177
1,2
probabilité
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,5
1
1,5
2
Activité
Figure III-4 : Répartition gaussienne de l’activité enzymatique pour une activité moyenne de
1 U/mL et un coefficient de variation de 36,3%. Les faux positifs identifiés lors d’une recherche
d’activité enzymatique améliorée de 1,5 fois sont hachurés
1.3.2.
Optimisation de l’intégration de la cassette d’expression
Le fort coefficient de variation observé précédemment s’explique par une intégration de la
cassette d’expression à différents locii (locii fortement ou faiblement exprimés), ainsi que par
des conversions du gène URA3 ou à une multi intégration du gène dans le génome de
Y. lipolytica. Pour favoriser l’intégration du gène à un locus donné, et s’affranchir des
problèmes dus à la variation d’expression en fonction du site d’insertion, la stratégie suivie
sera d’intégrer une région zéta dans le génome de Yarrowia lipolytica. Les cassettes
d’expression (contenant le gène d’intérêt bordé par deux régions zétas) s’intégreront alors
préférentiellement à ce site zéta par recombinaison homologue. Les paragraphes suivants
s’attachent à décrire la construction de cette souche.
a)
Obtention de la zone zéta par PCR (Figure III-5)
Quatre amorces ont été utilisées pour amplifier les zones zéta par PCR à partir du plasmide
JMP8 :
zétaF1 AATTCCGCGGGTAACACTCGCTCTGGAGAGTTAG introduction d’un site
de restriction Sac II
zétaF2 AAAGCCCTCAGTGCGGCCGCTGTCGGGAACCGCG site Not I présent
zétaR1 GGTCCCGACAGCGGCCGCACTGAGGGCTTTGTG site Not I présent
zétaR2 CCTGGATCCAGCAAAGTGCTTTGTGCGTACC introduction d’un site de
restriction BamHI.
Avec Zéta F2 et ZétaR1 : amorces complémentaires réverses.
Les zones Zéta1 (amorces ZétaF1/ZétaR1) et Zéta2 (amorces ZétaF2/ZétaR2) sont amplifiées
par PCR et deux fragments de 400 bp et 320 bp sont obtenus. A partir de ces deux fragments
178
(Zéta1 et Zéta 2) purifiés sur colonne, une autre PCR est réalisée (PCR de fusion) avec les
amorces zétaF1 et zétaR2 : un fragment de 720 bp correspondant à la fusion de Zéta 1 et
Zéta 2 est obtenue. Ce fragment est digéré par Sac II et BamHI.
SacII
zétaF1
Zéta1
zétaR1
zétaF2
Zéta2
zétaR2
BamHI
SacII
zétaF1
Zéta1
Zéta2
zétaR2
BamHI
Zéta
Figure III-5 : Obtention de la zone Zéta. Le fragment Zéta est obtenu en deux étapes de PCR. La
première étape consiste à obtenir les fragments Zéta 1 (Amorces ZétaF1/ZétaR1) et Zéta 2 (Amorces
zétaF2/zétaR2) en utilisant le plasmide JMP8 comme matrice. La seconde étape est une PCR de fusion
entre les fragments Zéta1 et Zéta 2 (amorces zétaF1/zétaR2)
b)
Obtention du plasmide KS LEU2 zéta tronqué permettant l’intégration de zéta
dans le génome de Yarrowia lipolytica
Une ligation est réalisée entre le plasmide KS LPR LEU2 corrigé et la bande Zéta (tous deux
ayant été digérés par Sac II et BamHI) : le plasmide KS-LEU2-zeta tronqué est obtenu, il
possède la zone Zéta et un gène LEU2 tronqué (Figure III-6).
AmpR
SacII
SacII
AmpR
LoxP
LoxP
Zéta
BamHI
KS LPR LEU2corrigé
KS-LEU2-zétatronque
4830 b p
51 36 bp
BamHI
HincII
LEU2
LEU2
tronqué
,
StuI
,
LoxR
LoxR
,
StuI
Figure III-6 : Représentation des plasmides KS LPR LEU2 corrigé et KS-LEU2-zéta tronqué
,
c)
Obtention de la souche Zéta (Figure III-7)
La souche MTLY60 est rendue LEU- par transformation avec un plasmide contenant un gène
LEU2 inactif digéré par StuI (délétion StuI) (recombinaison homologue). La souche
JMY1165 est alors transformée par le plasmide KS-LEU2-zétatronqué digéré par HincII ; les
179
transformants sont LEU+ et contiennent la zone Zéta. Cette nouvelle souche contenant une
zone Zéta et un gène LEU2 reconstitué au locus leu2-270 est vérifiée par Southern blot et
appelée JMY1212
JMY1165
locus LEU2
HincII
leu2-t
JMY1212
Zéta
Leu-2-270-t
Zéta
LEU2
Figure III-7 : Représentation schématique de l’obtention de la souche JMY1212 à partir de la
souche MTLY60 et du plasmide KS-LEU2-zéta tronqué
1.3.3.
Optimisation de l’intégration de la cassette d’expression et
quantification de la variabilité apportée par la transformation dans la nouvelle souche
JMY1212
a)
Comparaison des taux de transformation des souches JMY1165 et JMY1212
Pour comparer l’efficacité de transformation des souches JMY1165 et JM1212, une
manipulation de vérification de la transformabilité des cellules compétentes est préalablement
réalisée. Pour cela, une transformation avec le plasmide JMP8 digéré par BSPEII (site unique
situé dans le gène POX2) a été réalisée avec les deux souches. La transformation avec cette
cassette d’expression permettra une intégration homologue au même site d’intégration POX2
pour les deux souches. Les transformations ont été réalisées avec 250 ng d’ADN en l’absence
de DMSO pour favoriser l’intégration homologue. Des taux de transformation équivalents ont
été obtenus pour les deux souches : environ 8000 transformants par µg d’ADN. Cette étape
préliminaire permet de vérifier que les deux souches utilisées ont le même taux de
compétence et que leur taux de transformation pourra être comparé avec certitude.
La cassette d’expression contenant LIP2 (digestion du plasmide JMP8 par NotI) est
transformée dans cette nouvelle souche en l’absence de DMSO pour favoriser l’intégration
homologue à la plateforme Zéta. Les transformants Ura+ sont sélectionnés sur milieu
YNBcasa. Les taux de transformation, l’activité lipase et le coefficient de variation sont
présentés sur le tableau III-2. Quelle que soit la quantité d’ADN utilisée (entre 50 et 500 ng
180
d’ADN), les taux de transformation restent les mêmes, c’est à dire environ 8000
transformants / µg d’ADN,
et sont identiques à ceux de la manipulation précédente
(intégration homologue). Cette efficacité de transformation est deux fois supérieure à celle
obtenue pour la transformation avec la souche JMY1165 en présence de DMSO.
Tableau III-2 : Efficacité de transformation, activité lipase, coefficient de variance, nombre de
clones sans activité selon la souche receveuse.
Souche
ADN
(ng)
50
Clones /
µg ADN
4640
Clones
testés
192
Activité
(U/mL)
0,90
avec DMSO
250
3328
192
1,00
36%
11
JMY1212
50
8440
192
1,12
18%
1
125
8000
192
1,15
20%
0
250
6224
288
1,10
17%
1
500
7984
192
0,89
21%
0
JMY1165
Coefficient Clones sans
de variance
activité
34%
11
La recombinaison homologue par simple crossing over est donc plus efficace que la double
recombinaison non homologue, d’un facteur deux si on utilise du DMSO pour favoriser
l’intégration non homologue. Cependant dans le cas où le DMSO n’est pas utilisé, les taux de
transformation de la souche par double recombinaison non homologue sont encore plus
faibles (850 transformants par µg d’ADN). Ainsi entre la recombinaison homologue et la
double recombinaison non homologue réalisées dans les mêmes conditions (sans DMSO), le
facteur d’amélioration est de 10. Les taux de transformation sont cependant plus faibles que
ceux qui peuvent être obtenus chez E.coli. Les auteurs s’accordent à dire que généralement,
un taux de 106 transformants est nécessaire pour obtenir un nombre suffisant de transformants
(Tobias, 2003). Néanmoins, si ce taux de transformation doit être si élevé c’est parce que chez
E. coli, les obstacles majeurs pour obtenir un nombre suffisant de transformants par plaque
sont l’efficacité de l’étape de ligation et le faible taux de transformation des produits ligués
(généralement 10 à 1000 X moins de transformants obtenus qu’avec un plasmide super
enroulé). Pour le système d’expression développé avec Y. lipolytica aucune étape de ligation
n’est nécessaire (voir partie obtention des banques) ce qui permet de travailler avec des taux
de transformation plus faibles. Ces efficacités de transformations sont compatibles avec la
construction d’une banque de mutants et une banque de 100 000 transformants pourra être
obtenue facilement. En effet sur une boîte de Pétri de taille 20 cm X 20 cm, 5000 clones
181
peuvent être facilement obtenus (ce qui est un maximum pour la résolution de la caméra de
picking du robot), 20 boîtes sont alors nécessaires.
b)
Comparaison de la variabilité apportée par la transformation de la souche
JMY1165 et JMY1212
La comparaison de l’activité lipase pour 384 transformants de chacune des deux souches est
Activité lipase Normalisée
représentée sur la figure III-8.
2.5
2
2
1.5
1
0.5
1
0
0
100
200
300
400
Nombre
de transformants
Numéro
de puits
Figure III-8 : Comparaison de la dispersion de l’activité lipase pour les transformants de la
souche JMY1165 (intégration au hasard carré blanc) et de la souche JMY1212 (intégration à la
plateforme d’intégration zéta- triangle noir). La cassette d’expression contenant LIP2 est introduite par
transformation dans les souches JMY1165 et JMY1212
Cette représentation permet de mettre en évidence que le nombre de transformants avec une
faible activité est considérablement diminué (région 1 Figure III-8) et n’est pas dépendant de
la quantité d’ADN utilisée pour la transformation. Sur toutes les transformations réalisées
avec la souche JMY1212, seulement 0,23 % des transformants ne présentent pas d’activité (2
sur 864) contre 5,8 % pour la souche JMY1165. Cela correspond à une augmentation de
l’intégration de la cassette d’expression au locus zéta par rapport aux conversions du gène
URA3. D’autre part, le nombre de transformants de la souche JMY1212 avec une forte
activité est lui aussi considérablement diminué par rapport à ceux de la souche JMY1165
(région 2 Figure III-8). Avec la nouvelle souche, 62% des transformants se trouvent à +/- 10%
de l’activité lipase moyenne (contre seulement 38% avec la souche JMY1165). Le coefficient
de variation pour le procédé total (transformation + expression protéique + test
d’activité) s’élève à 18,9 %, c’est à dire deux fois plus faible que les 36,3% obtenus pour la
souche JMY1165.
182
Ainsi, si on cherche un mutant avec une activité 50% supérieure à la lipase sauvage, en
criblant 10 000 mutants, seulement 41 faux positifs seront détectés (contre 842 avec la souche
JMY1165) et aucun si on cherche une lipase avec une activité deux fois supérieure à celle de
la lipase sauvage (Figure III-9 et Tableau III-1).
2,5
CV = 18,9%
probabilité
2
1,5
CV = 36,3%
1
0,5
0
0
0,5
1
1,5
2
Activité
Figure III-9 : Représentation gaussienne de la distribution des activités enzymatiques obtenues
pour les transformants issus de la souche JMY1165 (noir CV = 36,3 %) et pour les transformants
obtenus avec la souche JMY1212 (gris CV =18,9 %). Les faux positifs identifiés lors d’une
recherche d’activité enzymatique améliorée 1,5 fois sont hachurés
c)
Analyse de l’intégration de la cassette d’expression par Southern blot.
L’ADN génomique de 12 transformants pris au hasard a été analysé par Southern Blot avec
des sondes radioactives au 32P de la région zéta après digestion par PvuI. Ce site de
restriction est aussi un site unique de la cassette d’expression (Figure III-10). On pourra ainsi
voir à quel évènement génétique correspondent les transformants Ura + obtenus avec la
souche JMY1212 et si l’intégration de la cassette d’expression est réalisée au locus voulu.
Trois événements génétiques sont susceptibles de se produire avec pour chacun un profil
caractéristique détaillé sur la figure III-10 :
- une conversion du gène ura3-302 en URA3. Dans ces cas une seule bande de 1828 bp est
attendue correspondant à la zone zéta non modifiée dans la souche JMY1212. Aucune bande
supplémentaire (correspondant à l’intégration des zones zéta avec la cassette d’expression ne
sera attendue). Ce type de profil est obtenu pour le clone 2 (Figure III-10 B).
- l’insertion de la cassette d’expression à la plate-forme d’intégration Zéta. Deux bandes l’une
à 4961 bp, l’autre à 2242 bp sont attendues. Ce type de profil est obtenu pour tous les clones
sauf le 2 et le 10 (Figure III-10 B).
- l’intégration au hasard de la cassette d’expression dans le génome. Dans ce cas trois bandes
seront attendues, une première de 1828 bp correspondant à la plate-forme zéta non modifiée et
deux autres bandes de tailles supérieures à 3,6 kb et 1,7 kb. Ce type de profil est obtenu pour
le clone 10 (Figure III-10 B).
183
A
B
1 : locus zéta
1828 bp
PvuII
PvuII
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Z2 Z1
4961 bp
> 3.6 kb
and
> 1.7 kb
2 : Intégration à la plate-forme Zéta
LIP2
pPOX2
ura3d1
Z2 Z1
Z2 Z1
PvuII
PvuII
PvuII
4961 bp
2242 bp
1828 bp
2242 bp
3 : Intégration au hasard
LIP2
Z1
PvuII
pPOX2
ura3d1
Z2
PvuII
PvuII
> 3.6 kb
> 1.7 kb
Figure III-10. Analyse de l’intégration de la cassette d’expression dans les transformants issus de
la souche JMY1212 par Southern Blot. A) Cartes génomiques schématiques de l’intégration au
locus Zéta (A1) pour la souche JMY1212 ou pour les transformants correspondant à des conversions
du gène ura3-302 en URA3 (1 seule bande à 1828 bp), (A2) pour l’intégration de la cassette
d’expression à la plate-forme Zéta par recombinaison homologue (2 bandes à 2242 bp et 4961 bp),
(A3) pour une intégration de la cassette d’expression au hasard dans le génome. La bande
correspondant à la zone zéta chromosomique est détectée à 1828 bp ainsi que deux autres bandes
supplémentaires de tailles supérieures à 1,7 et 3,6 kb. B) Southern blot de 12 transformants de la
souche JMY1212. L’ADN génomique a été digéré par PvuII et hybridé avec la région Zéta marquée
au 32P. La taille des bandes est indiquée sur la droite. Trois profils sont obtenus : un profil à une bande
(1828 bp), un profil à deux bandes (2242 bp et 4961 bp) et un profil à trois bandes (1828 bp, 3,6 kb
and 4,5 kb).
Une analyse complémentaire par Southern Blot a été réalisée sur 26 transformants ayant une
activité supérieure à la moyenne (clones 1 à 26), et 9 transformants ayant une activité
inférieure à la moyenne (clones 27 à 36). Ceux-ci ont été choisis à partir de 864 transformants
(dont font partie les 384 transformants précédemment testés). Les résultats de leur activité par
rapport à la moyenne et l’analyse du Southern Blot est donné dans le tableau III-3 et la figure
III-11. Le coefficient de variation de ces 864 transformants est de 18,5 % ce qui correspond
au coefficient de variation calculé pour le procédé entier pour les 384 transformants analysés
précédemment.
184
PM1 1 2 3
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 PM2
PM1 19 20 21 22 23 24 25 26 PM2 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
21.2
8.4
7.2
6.3
5.7
4.8
4.3
3.6
5.1
4.2
2.3
2.1
1.9
1.9
1.6
1.3
1.2
Figure III-11. Analyse par Southern Blot de l’intégration de la cassette d’expression dans les
transformants issus de la souche JMY1212 possédant des activités initiales significativement
différentes de la moyenne. Les profils obtenus sont détaillés dans le tableau III-3
Tableau III-3. Analyse de l’intégration de la cassette d’expression dans les transformants issus
de la souche JMY1212 par Southern Blot. Les clones avec intégration unique à la zone zéta sont en
blanc les autres sont en grisés
n°
Locus d'intégration
25 Intégration unique à la zone zéta
Clones ayant
une activité
supérieure à la
moyenne
1,9
15 Pas d'intégration à la zone zéta + une copie supplémentaire
1,8
1,7
1,7
1,7
22 intégration à la zone zéta + 1 copie supplémentaire
1,6
1,6
1,6
1,5
1,5
12 Pas d'intégration à la zone zéta + deux copies supplémentaires
1,5
1,5
1,5
23 Pas d'intégration à la zone zéta + deux copies supplémentaires
1,5
1,4
1,4
1,4
1,4
1,4
1,4
1,3
1,3
1,3
6 Intégrationà la zone zéta + 1 copie supplémentaire
1,3
1,2
1,1
30 intégration à la zone zéta + 1 copie supplémentaire ?
Clones ayant
une activité
inférieure à la
moyenne
Activité clone /
Activité moyenne
0,7
0,6
31 Pas d'intégration dans la zone zéta et une copie supplémentaire
0,3
35 Pas d'intégration dans la zone zéta et deux copies
0,2
34 Pas d'intégration dans la zone zéta et une copie supplémentaire
0,2
27 Pas d'intégration dans la zone zéta
0,1
28 Pas d'intégration dans la zone zéta et pas de copie
0,0
0,0
0,0
185
Parmi les 26 transformants présentant une activité supérieure à la moyenne seulement sept
n’ont pas le profil attendu et sont le résultat d’intégrations aléatoires de la cassette
d’expression dans le génome en une ou plusieurs copies. Leurs activités sont plus
particulièrement distribuées parmi les plus fortes activités enzymatiques mais on retrouve
aussi certains transformants avec une intégration correcte dans ces gammes d’activités. Parmi
les transformants possédant une activité lipase faible, 4 ont une activité nulle (27-28-32-33),
ils correspondent à des conversions du gène Ura 3 puisque qu’aucune intégration n’est
observée dans le génome. Parmi les autres transformants possédant une activité enzymatique
faible seul un (le 29) a une intégration correcte de la cassette d’expression
d)
Prédiction du nombre de faux positifs
Sur les 864 clones testés, 12 ont une activité supérieure à 1,5 fois la moyenne. Ce résultat
semble en contradiction avec les 4 transformants que nous devrions obtenir si la répartition
des activités suivait une loi gaussienne. Cependant ce n’est pas le cas (voir figure III-12 A).
En effet la majorité des activités des transformants semblent plutôt se répartir selon une loi
gaussienne d’écart type 13 % (Figure III-12 B), cet écart type correspond à la variabilité pour
l’expression enzymatique et pour le test d’activité lipase. Les transformants présentant des
activités extrêmes font monter l’écart type global à 18,5%. En effet, bien que le locus
d’insertion soit préférentiellement ciblé, ces transformants correspondent à de rares
événements d’intégration à d’autres locus, des intégrations multicopies et des conversions du
marqueur de sélection. Cependant, ce type de distribution n’explique pas du tout les 12 faux
positifs puisque la loi gaussienne théorique d’écart type 13 % ne prédit aucun clone d’activité
supérieure à 1,5 fois l’activité moyenne.
Pour essayer de mieux prédire le nombre de faux positifs attendus, nous avons essayé de
modéliser la répartition des transformants selon une somme de deux lois gaussiennes
pondérées. En effet, si tous les transformants issus de la transformation avec la souche
JMY1212 étaient identiques (intégration unique au locus zéta) alors l’écart type obtenu pour
l’ensemble du processus de criblage serait de 13,0 %. Or une partie des transformants ont une
intégration aléatoire de la cassette d’expression comme dans le cas de la souche JMY1165, et
nous avons vu que l’écart type obtenu pour l’ensemble du processus de criblage serait alors de
36,3 % si tous les transformants avaient une intégration aléatoire. Comme l’écart type obtenu
pour l’ensemble du processus de criblage est de 18,3 % et représente à la fois l’ensemble des
clones ayant eu une intégration à la zone zéta et ceux ayant eu une intégration aléatoire, on
186
peut donc prédire le taux de transformants qui ont eu une intégration ciblée (x %) et ceux qui
ont
eu
une
intégration
aléatoire
(1-x%)
à
partir
de
l’équation
suivante :
0,13 x + 0,363(1 − x) = 0,185 . On trouve alors que 77,3 % ont une intégration unique à la zone
zéta et que 22,7 % sont issus d’autres types d’événements de recombinaison. On peut donc
alors modéliser la répartition des transformants selon une somme de deux lois gaussiennes
l’une comptant pour 77,3 % des transformants avec pour écart type 13%, et l’autre comptant
pour 22,7% des transformants et d’écart type 36,3% (Figure III-12 C). Dans ce cas, le nombre
de faux positifs prédits est de 18 (contre 12 observés réellement).
On notera que nous avons pris pour hypothèse que les événements de recombinaison étaient
aléatoires comme dans le cas de la souche JMY1165, cependant, en réalité les événements ne
sont pas aléatoires de la même façon dans la souche JMY1212 et dans la souche JMY1165. en
effet, dans la souche JMY1212, on a vu que les événements de recombinaison peuvent être de
type intégration à la zone zéta avec une copie supplémentaire.
En observant plus attentivement la distribution de nos données, il apparaît clairement que leur
répartition est dissymétrique (peu de transformants avec une faible activité et beaucoup de
transformants avec une forte activité). Peu de lois mathématiques permettent de modéliser ce
type de comportement. La loi de Gumbel de paramètres µ et β (avec moyenne = µ+ βγ = 1 et
γ = constante d’Euler-Mascheroni = 0,57721 et écart type = πβ/6) le permet. Nous avons donc
essayé de voir si nos données suivaient une loi de Gumbel de paramètres µ =0,918 et β =0,143
(Figure III-12 D). Même si le nombre de faux positifs est prédit avec plus de précision (14
faux positifs prédits contre 12 réellement observés), cette loi ne semble pas convenir pour la
description des données dans leur totalité. En effet, les transformants ne possédant pas
d’activité de sont pas prédits et un décalage entre nos données et la loi est observé (Figure III12 D).
Conclusion
Les deux dernières lois (somme de deux gaussiennes pondérées et loi de Gumbel) prédisent
avec plus de fiabilité le nombre de faux positifs, cependant nos données ne suivent aucune de
ces deux lois. En effet un décalage important existe entre les données observées et la loi. Ceci
a été vérifié mathématiquement par un test d’hypothèse de Kolmogorov-Smirnov, l’hypothèse
étant H0 : les données suivent une loi de répartition donnée (de Gumbell ou la somme de deux
gaussiennes). Ce test qui permet de vérifier si des données suivent une loi de répartition
donnée à conduit à rejeter H0 dans les deux cas avec 5 % comme valeur de risque de première
espèce α (risque de rejeter H0, H0 étant vrai).
187
A
Nombre de transformants
250
Gaussienne
4 faux positifs
CV = 18,5%
prédits
200
150
Gaussienne
CV = 18,5 %
100
50
0
9
1,
81, 8
1,
71, 7
1,
61, 6
1,
51, 5
1,
41, 4
1,
31, 3
1,
21, 2
1,
11, 1
1,
01, 0
1,
90, 9
0,
80, 8
0,
70, 7
0,
60, 6
0,
50, 5
0,
40, 4
0,
30, 3
0,
20, 2
0,
10,
1
0,
0-
B
Activité centrée
250
Gaussienne
Aucun faux
CV = 13,0%
positif prédit
200
150
100
50
0
9
1,
81, 8
1,
71, 7
1,
61, 6
1,
51, 5
1,
41, 4
1,
31, 3
1,
21, 2
1,
11, 1
1,
01, 0
1,
90, 9
0,
80, 8
0,
70, 7
0,
60, 6
0,
50, 5
0,
40, 4
0,
30, 3
0,
20, 2
0,
10,
1
0,
0-
C
Activité centrée
250
Somme de deux
Somme de deux
gaussiennes
gaussiennes
18 faux positifs
d’écart type
d’écart type
prédits
13,0% et 36,3%
18,5% et 36,3%
200
150
100
50
0
1
2,
02, 0
2,
91, 9
1,
81, 8
1,
71, 7
1,
61, 6
1,
51, 5
1,
41, 4
1,
31, 3
1,
21, 2
1,
11, 1
1,
01, 0
1,
90, 9
0,
80, 8
0,
70, 7
0,
60, 6
0,
50, 5
0,
40, 4
0,
30, 3
0,
20, 2
0,
10, 1
0,
0250
D
Activité centrée
Gumbell
Loi de Gumbell
(paramètres
14 faux positifs
µ =0,918 et
prédits
β =0,143)
200
150
100
50
0
9
1,
81, 8
1,
71, 7
1,
61, ,6
1
51, 5
1,
41, 4
1,
31, ,3
1
21, 2
1,
11, 1
1,
01, ,0
1
90, 9
0,
80, 8
0,
70, ,7
0
60, 6
0,
50, 5
0,
40, ,4
0
30, 3
0,
20, 2
0,
10,
1
0,
0-
Activité centrée
Figure III-12 : Répartition de l’activité des 864 transformants issus de la transformation de la
cassette d’expression dans la souche JMY1212 sous forme d’histogramme (le nombre de
188
transformants par tranche d'activité a été cumulé) et représentation de différentes lois théoriques
(trait plein). A) Représentation de loi gaussienne théorique de moyenne 1 et d’écart type 18,5% B)
Représentation de loi gaussienne théorique de moyenne 1 et d’écart type 13,0% C) Représentation de
la somme de deux lois gaussiennes(trait plein) l’une comptant pour 77,3 % des transformants et
d’écart type 13% l’autre comptant pour 22,7% des transformants et d’écart type 36,3%. Dans ce cas le
nombre de faux positifs prédits est de 17 contre 12 réellement observés. D) Représentation d’une loi
de Gumbel. Dans ce cas le nombre de faux positifs prédits est de 17 contre 12 réellement observés.
1.4. Conclusion
1.4.1.
Synthèse des résultats obtenus
Nous avons présenté ici l’analyse de la variabilité apportée par chaque étape d’un criblage
haut débit d’activité lipase pour deux souches différentes de Y. lipolytica et tenté d’optimiser
celle-ci. Finalement nous avons obtenu un coefficient de variance de 11,7 % pour le test
d’activité enzymatique, une variabilité de 13 % pour les étapes d’expression enzymatique et la
lecture de l’activité et une variabilité pour le procédé entier (transformation + expression
enzymatique + lecture d’activité) de 36,3 % avec la souche JMY1165 et 18,9 % avec la
souche JMY1212. L’utilisation de cette nouvelle souche permet de minimiser les taux de faux
positifs et la variabilité est alors compatible avec le criblage d’une banque de variants de la
lipase (Figure III-13).
Obtention de la
banque
Intégration dans un
système d’expression
Expression enzymatique
Cro issance
cellu laire
Exp ression
protéique
Dosage
d’activité
11,7 %
13,0 %
18,9 %
Figure III-13 : Récapitulatif de la variabilité apportée par chaque étape d’un criblage haut débit
en utilisant Y. lipolytica (souche JMY1212) comme système d’expression après optimisation de
chacune des étapes individuellement.
189
La variabilité apportée par le test enzymatique en lui-même est très élevée (11,7% sur les
18,9% du procédé entier) et représente près des 2/3 de la variabilité du procédé total. Cette
forte variabilité est intrinsèque à l’activité enzymatique testée : l’activité lipase. En effet,
les lipases sont des enzymes qui catalysent des réactions aux interfaces : un milieu biphasique
est donc nécessaire pour réaliser de telles réactions. Cependant, la qualité et la reproductibilité
d’une émulsion sont des paramètres difficiles à maîtriser. Ici, nous avons tenté d’améliorer
celle-ci en utilisant un solvant organique : le 2M2B pour favoriser la dissolution du substrat et
en utilisant un substrat peu hydrophobe (le pNP-butyrate). Cependant, la variabilité reste
élevée. Il est à noter que si ce système d’expression est utilisé pour tester d’autres activités
enzymatiques, alors la variabilité apportée par le test d’activité sera en général beaucoup plus
faible et le criblage haut débit plus performant.
La variabilité pour l’expression enzymatique a pu être minimisée par l’amélioration des
conditions repiquage et l’optimisation de la concentration en glucose pour la phase de
croissance et de la concentration en acide oléique pour l’induction. Après optimisation, elle ne
représente plus que 1,3 % de la variabilité totale.
Nous avons montré que la variabilité apportée par l’étape de transformation était
fortement dépendante de la méthode d’intégration de la cassette d’expression dans le génome.
C’est ici que nos travaux apportent un gain notable par rapport aux autres systèmes
d’expression levuriens. Des travaux antérieurs montraient que l’intégration homologue
améliorait à la fois l’intégration à un locus donné et le taux de transformation (Barth and
Gaillardin, 1996; Barth and Gaillardin, 1997). Ainsi, en utilisant Y. lipolytica comme système
d’expression et en construisant une nouvelle souche : JMY1212 contenant une plate-forme
d’intégration nous avons pu minimiser la variabilité introduite par l’étape de transformation.
Celle-ci est passée de 23,3% à 5,9% en utilisant cette nouvelle souche.
1.4.2.
Avantages de Y. lipolytica en tant que système d’expression pour
l’évolution dirigée d’enzyme par rapport aux autres systèmes d’expression levuriens
existants
a)
Saccharomyces cerevisiae
L’utilisation de levures comme système d’expression pour le criblage haut débit d’activité
enzymatiques reste peu utilisée. Peu de références en font état dans la littérature. S. cerevisiae
reste la levure la plus utilisée pour ce type d’applications (Bulter, et al., 2003; Cherry, et al.,
1999; Morawski, et al., 2001). Cependant aucune étude quantifiant la reproductibilité du
190
procédé entier de criblage n’existe pour cette levure. Morawski et al. (2001) font état d’une
variance de 14 à 17 % pour le système d’expression d’une péroxidase mais sans prendre en
compte la variabilité apportée par l’étape de transformation des levures. Butler et al. (2003) et
Alcalde et al., (2005) ont utilisé S. cerevisiae pour faire évoluer une laccase. Ils avancent un
coefficient de variation de 10 % pour le test d’activité, mentionnent une croissance homogène
mais ne quantifient pas la reproductibilité du procédé dans son ensemble. Cependant, ils
précisent aussi la nécessité de deux re-criblages pour éviter les faux positifs, le deuxième
nécessitant l’extraction du plasmide, son amplification dans E. coli et sa re-transformation
dans S. cerevisiae. En effet, l’ADN est porté par un plasmide dans la levure, et certains
transformants peuvent présenter plusieurs copies. Au final, si, pour cette levure, on prend en
compte l’apparition lente des transformants, la durée des temps de culture (au moins 3 jours)
et les étapes supplémentaires dues à la vérification des mutants sélectionnés (extraction ADN
plasmidique levurien, retransformation chez E. coli, retransformation chez la levure), la
procédure est longue (jusqu’à plus de 15 jours pour l’évolution sur la laccase) et lourde à
mettre en œuvre et diminue le débit de la capacité de criblage. Le système développé chez la
levure Y. lipolytica, est quant à lui, beaucoup moins long à mettre en œuvre. Un exemple
d’évolution chez la levure S. cerevisiae est également décrit dans la littérature (Festa et al.,
2008). Il fait état d’un fort taux de faux positifs (31 mutants sur 38 sélectionnés sur leur
activité améliorée et cela bien que l’intégration soit chromosomique). Chez Y. lipolytica, en
travaillant avec une intégration génomique ciblée de la cassette d’expression, on s’affranchit
des problèmes dus aux intégrations multicopie. En outre, cette levure a une croissance rapide,
les transformants sont obtenus en moins de 36 heures et les étapes de croissance et
d’expression de la protéine ne durent que 24 heures chacune. En 5 jours, une banque peut être
construite et criblée.
b)
Pichia pastoris
Pour ce qui est des levures non conventionnelles, des essais ont été réalisés avec la levure
Pichia pastoris (Boettner, et al., 2002; Weis, et al., 2004). Cependant deux limitations
majeures existent pour cette levure. La première est le phénomène de mort cellulaire de la
levure en conditions de cultures en microplaque. Ces auteurs ont pu le minimiser en jouant sur
la concentration en glucose lors de la culture de la levure. Ce phénomène n’a pas été observé
chez la levure Y. lipolytica. La deuxième est le phénomène de conversion du marqueur de
sélection. En effet, lors de la transformation des levures, certains transformants peuvent ne
posséder que le marqueur de sélection sans avoir introduit la cassette d’expression et le gène
191
d’intérêt. Ceci s’explique par l’homologie existant entre le marqueur de sélection utilisé dans
la cassette d’expression et le marqueur de sélection délété présent dans l’hôte d’origine. Chez
P. pastoris le nombre de conversions est très élevé et représente environ 10 à 50 % des
transformants (Boettner, et al., 2002; Weis, et al., 2004). Ainsi, une étape de criblage par PCR
sur colonie est nécessaire pour sélectionner les transformants ayant intégré la cassette
d’expression. Chez Y. lipolytica une telle étape de sélection n’est pas nécessaire en effet, dans
la souche JMY1165 seul 5,3% des clones ne présentent pas d’activité (représentant la somme
de conversion et d’insertion de la cassette d’expression à un locus non exprimé). Ce chiffre
est diminué à 0,23 % lorsque la souche JMY1212 est utilisée. Ce faible taux de conversion
chez la levure Y. lipolytica s’explique par le fait que l’allèle de délétion ura3-302 présent dans
la levure présente seulement un faible taux d’homologie avec le marqueur URA3 présent dans
la cassette d’expression (Mauersberger, et al., 2001).
Un autre système d’expression basé sur un vecteur épisomique chez P. pastoris (Lee, et al.,
2005) permet d’éviter les problèmes de conversion de marqueur et a permis de cribler une
banque de xylanase et obtenir des mutants avec une activité améliorée. Bien que cette
approche ait donné des résultats positifs, aucune étude de la variabilité n’a été réalisée et les
faux positifs (multiple intégration) n’ont pas été mentionnés.
c)
Hansenula polymorpha
Chez la levure Hansenula polymorpha, un système d’expression original a été développé
(Kim, et al., 2003), qui combine la recombinaison in vivo avec l’intégration de la cassette
d’expression dans le génome. Les zones télomériques sont visées, cependant l’intégration
peut avoir lieu sur n’importe quel chromosome. Les auteurs mettent en évidence une
intégration en simple copie de la cassette d’expression à l’extrémité des chromosomes par
Southern blot mais leur analyse de la reproductibilité du système est succincte car basée sur la
taille des halos obtenus en milieu solide. La même équipe a amélioré l’activité de la lipase B
de Candida antarctica par un système d’expression de type surface display chez cette même
levure (Kim, et al., 2007).
d)
Conclusion
Le contrôle de l’intégration de la cassette d’expression dans la souche JMY1212 fait de
Y. lipolytica un système d’expression très avantageux pour l’évolution moléculaire dirigée car
la reproductibilité de l’expression des différents transformants permet d’éviter les faux
positifs. De plus, l’utilisation de cette souche a permis d’améliorer les taux de transformation
192
des cellules (8000 transformants/µg d’ADN) compatibles avec l’obtention d’une banque.
D’autre part, ce système d’expression présente de nombreux autres avantages pour ce type
d’application :
-
C’est un système d’expression eucaryote qui peut s’accommoder de protéines
d’origines diverses
-
Il présente de fortes capacités de sécrétion permettant un criblage facilité de l’activité
enzymatique.
-
Il n’y a pas de nécessité d’étape de clonage (voir partie création des banques)
-
La procédure est très rapide, les transformants apparaissent en 36 heures et les cultures
durent 24 heures chacune. Les tests d’activité lipase en microplaques durent à peine 10
minutes pour mesurer l’activité de 96 clones. Au final en 5 jours, le procédé total est
terminé et environ 400 clones peuvent être criblés en moins d’une heure (soit près de
10 000 clones par jour).
L’ensemble de ces travaux a donné lieu à publication dans Journal of Microbiological
Methods sous le titre de « A new recombinant protein expression system for highthroughput screening in the yeast Yarrowia lipolytica. ».
1.4.3.
Voies d’amélioration du système d’expression Y.lipolytica
Une des voies d’amélioration possible pour augmenter le débit du criblage chez cette levure
serait de pouvoir réaliser une sélection ou un criblage facilité permettant de sélectionner
directement sur milieu solide, seulement les transformants ayant une activité lipase suffisante.
Pour le crible de l’activité lipase cette technique n’a pas été envisagée car Y. lipolytica
possède un arsenal d’enzymes pour dégrader les lipides (dont 15 lipases) qui permettent à la
souche JMY1212 non transformée avec la lipase de pousser quand même sur milieu contenant
un triglycéride comme seule source de carbone (sélection impossible). Un criblage facilité
pose les mêmes problèmes car cette même souche réceptrice produit des halos d’hydrolyse
lorsqu’elle pousse sur ce type de milieux. Pour pouvoir réaliser ce type de pré-sélection, il
faudrait déléter les 16 lipases du génome de Y. lipolytica. Par contre, un système de sélection
ou de criblage facilité peut être envisageable sur d’autres types d’activités enzymatiques.
De même, si d’autres types d’activités enzymatiques étaient testés, la variabilité sur le test
enzymatique en milieu liquide serait alors beaucoup plus faible. En effet, nous avons vu que
comme le test enzymatique était hétérogène (substrats des lipases non miscibles à l’eau) la
variabilité du test enzymatique était importante. Comme celui-ci représente près des 2/3 de la
193
variabilité du système de criblage total, la reproductibilité du criblage dans son ensemble s’en
trouverait alors également améliorée.
D’autre part la variabilité apportée par l’étape de transformation (5,3%) pourrait être encore
diminuée. Celle-ci est due à des conversions du marqueur de sélection (seulement 0,8 % des
transformants) et à des intégrations de la cassette d’expression à d’autres locii d’insertion. Les
intégrations non ciblées pourraient probablement être diminuées en utilisant d’autres zones
que les zones zéta comme plate-forme d’intégration. En effet, ces zones sont les parties
terminales de retrotransposon et favorisent la recombinaison non homologue. Ainsi avec une
quelconque autre plate-forme d’intégration on pourrait certainement s’affranchir de ces
intégrations multiples ou à des locii non ciblés. D’autre part, nous avons vu précédemment
que la transformation par recombinaison homologue était aussi efficace avec ces zones zéta
qu’avec une recombinaison au niveau du promoteur POX2. On ne peut cependant pas
envisager directement cette technique dans le cas de l’obtention d’une banque. En effet, en
utilisant le système mis au point la cassette d’expression peut être directement intégrée dans le
génome sans étape de clonage, alors que si on utilise le promoteur POX2 comme plate-forme
d’intégration, cela suppose une étape de clonage supplémentaire pour intégrer le gène muté
dans le vecteur JMP8. Les étapes de clonages sont souvent limitantes dans l’obtention des
banques. Ainsi, une solution intéressante serait de combiner les deux approches et de
construire un nouveau plasmide qui posséderait aux extrémités de la cassette d’expression une
région quelconque autre que zéta qui pourrait être insérée dans le génome de la même façon
que la zone zéta y a été insérée. Dans tous les cas, l’amélioration apportée ne serait pas
spectaculaire car la variabilité imputable à l’étape de transformation est déjà très faible
(5,3 %)
2. Intérêt
du
système
développé
pour
l’ingénierie
rationnelle ou semi-rationnelle de la lipase Lip2 de Y. lipolytica
La souche JMY1212 développée présente un avantage non négligeable, elle permet la
reproductibilité de l’expression d’un clone à l’autre. Cet avantage peut être exploité dans le
cadre de l’ingénierie rationnelle ou semi-rationnelle d’enzymes exprimées chez Y. lipolytica.
Nous nous en sommes servis pour l’évolution rationnelle de la lipase Lip2. Les
transformations de variants de la lipase Lip2 de Y. lipolytica étaient jusque là réalisées dans la
194
souche JMY1165 et donnaient lieu à un criblage d’une dizaine de transformants avant de
sélectionner le transformant possédant la plus forte activité ; ceci conduisant quelquefois à la
sélection de mutants double copies. Au vu de la variabilité obtenue avec la souche JMY1165,
la comparaison directe de l’activité spécifique d’un variant par rapport à lipase sauvage ou de
deux variants entre eux ne peut être réalisée.
2.1. Intérêt de la souche JMY1212 pour l’évolution rationnelle de la
lipase Lip2 de Y. lipolytica
Nous avons transformé la souche JMY1212 et la souche JMY1165 avec le plasmide JMP8
contenant la lipase Lip2 portant la mutation T88S (une mutation de la thréonine du trou
oxyanion en sérine). L’activité des transformants a été analysée selon le protocole en
microplaque mis au point précédemment sur 48 transformants par souche et en erlenmeyer en
présence de 20 g/L d’acide oléique sur 8 transformants par souche. Les résultats sont
consignés dans la figure III-14 pour l’analyse en microplaque et dans les tableaux III-4 et III-5
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Activité (U/mL)
Activité (U/mL)
pour l’analyse en erlenmeyer.
0
10
20
30
40
50
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
10
20
30
40
Nombre
transformants
Numéro
du transformant
Nombre
transformants
Numéro du
transformant
JMY1212
JMY1165
moyenne (U/mL)
0,535
moyenne (U/mL)
0,495
écart type
0,096
écart type
0,183
CV %
18,0%
CV %
37,1%
Figure III-14 : Représentation de la dispersion de l’activité pour 48 transformants de la lipase
Lip2-88S cultivés en microplaque A) dans la souche JMY1212 B) dans la souche JMY1165. Sous
les graphes, un tableau récapitule la moyenne et la variabilité de l’activité lipase.
L’analyse en microplaque 96 puits de 48 mutants de chacune des deux souches a permis de
confirmer l’analyse de la reproductibilité effectuée précédemment (Figure III-14). Les
transformants issus de la souche JMY1212 présentent une activité moyenne de 0,535 U/mL
avec un coefficient de variabilité de 18,0 % proche de celui déjà déterminé pour ce type de
195
50
crible. Les transformants issus de la souche MTLY60 présentent une activité moyenne du
même ordre de grandeur d’environ 0,495 U/mL avec un coefficient de variabilité important de
37,1 % similaire à celui déjà observé pour cette souche. On retrouve à la fois des mutants
n’ayant pas d’activité (trois), ainsi que des mutants semblant posséder une activité bien
supérieure à l’activité moyenne (deux).
L’analyse des activités obtenues lors des cultures en erlemeyers pour 8 transformants pour
chaque souche est donnée dans le tableau III-4 pour la souche JMY1212 et dans le tableau III5 pour la souche JMY1165. Chaque transformant a été cultivé en erlenmeyer en présence de
20 g/L d’acide oléique. Trois répétitions de lecture pour chaque culture ont été réalisées à
partir de trois dilutions différentes. La variabilité observée pour un même mutant correspond
donc à la variabilité du test enzymatique. La moyenne de cette variabilité (5,4 %) est
inférieure de 6,3 % à celle observée lors du criblage réalisé avec les robots (11,7 %). Ceci
tient au matériel utilisé. En effet, lors du criblage par les robots, le volume minimal que
l’appareil est capable de dispenser est de 5 µL. Ainsi, lorsque les 5 µL de pNPB sont rajoutés,
la précision n’est pas optimale. Par contre, dans le cas des cultures en erlenmeyer, le pNPB a
été rajouté avec une pipette de volume nominal de 10 µL, l’erreur sur les 5 µL distribués est
donc moins importante. Pour augmenter la reproductibilité du test enzymatique dans les
conditions de criblage haut débit, il pourrait paraître ingénieux de travailler avec de plus
grands volumes de solution stock de pNPB (solution à 40 mM dans 2M2B soit 2,5 % de
2M2B final). Cependant, en plus d’être confronté à des problèmes de solubilité, on observe
alors une importante perte d’activité de l’enzyme (Figure III-15) à mettre en relation avec une
dénaturation partielle de l’enzyme par le solvant.
Tableau III-4 : Tableau des activités (U/mL) d’hydrolyse du pNPB des transformants de la
souche JMY1212 avec le plasmide JMP8-T88S cultivés en erlenmeyer en présence de 20 g/L
d’acide oléique.
Variabilité sur le test d'activité
répétition1
répétition2
répétition3
Moyenne
CV par ligne
mutant 1
23,4
22,6
24,6
23,5
4,4%
mutant 2
18,9
20,5
21,3
20,2
6,2%
mutant 3
23,0
22,4
23,8
23,0
3,0%
mutant 4
20,6
24,7
22,6
22,6
9,1%
mutant 5
23,3
28,5
25,4
25,7
10,1%
mutant 6
27,1
27,6
29,5
28,1
4,6%
mutant 7
27,0
26,8
28,7
27,5
3,8%
mutant 8
23,9
24,1
23,4
23,8
1,6%
Moyenne
23,4
24,6
24,9
CV par colonne
12,0%
11,4%
11,6%
CV TOTAL
11,5%
196
Moyenne CV
5,3%
Tableau III-5 : Tableau des activités (U/mL) d’hydrolyse du pNPB des transformants de la
souche JMY1165 avec le plasmide JMP8-T88S cultivés en erlenmeyer en présence de 20 g/L
d’acide oléique.
Variabilité sur le test d'activité
répétition1
répétition2
répétition3
Moyenne
CV par ligne
mutant 1
24,3
23,4
26,0
24,6
5,4%
mutant 2
20,1
20,3
19,1
19,8
3,2%
mutant 3
28,3
30,0
32,0
30,1
6,2%
mutant 4
38,5
41,8
40,7
40,3
4,2%
mutant 5
25,0
22,2
23,0
23,4
6,2%
mutant 6
23,0
19,6
19,0
20,5
10,5%
mutant 7
22,9
23,8
23,4
23,4
1,9%
mutant 8
24,1
24,8
22,3
23,7
5,4%
Moyenne
25,8
25,7
25,7
CV par colonne
21,9%
28,1%
28,6%
Moyenne CV
5,4%
25,2%
% activité résiduelle
CV TOTAL
100%
80%
60%
40%
20%
0%
2,5
5
7,5
% 2M2B
Figure III-15 : Activité de l’enzyme en fonction du % de 2M2B. La concentration finale de pNPB
n’a pas variée au cours de l’expérience.
La variabilité entre les différents transformants pour la souche JMY1212 est de 11,5 % alors
que la variabilité pour la souche JMY1165 est de 25,2 %. La variabilité apportée par la
transformation dans la souche réceptrice + la variabilité sur la croissance et l’expression
protéique est globalement la même que celle obtenue avec le procédé de criblage microplaque
pour la souche JMY1212 : 7,2 % pour le procédé de criblage microplaque contre 6,4 % pour
les productions en erlenmeyer (tableau III-6). Pour la souche JMY1165, la variabilité
apportée par la transformation dans la souche réceptrice + la variabilité sur la croissance et
l’expression protéique semble plus faible lors du crible en erlenmeyer : 19,8 % contre 24,6 %
pour le crible microplaque, mais cela est dû au fait que seulement 8 transformants ont été
197
criblés. Ainsi, par exemple, aucun transformant avec une faible activité n’est observée. Dans
les deux types de cribles cependant, la variabilité apportée par l’étape de transformation est
bien plus importante pour la souche JMY1165 que pour la souche JMY1212. On notera tout
de même que le crible, lorsqu’il n’est pas réalisé à haut débit avec les robots, est bien plus
reproductible à cause du type d’appareillage plus adapté. Cette amélioration dans la
reproductibilité permet d’avoir une variabilité totale de l’ordre de 11,5 % ce qui permet une
comparaison plus fine des activités spécifiques des mutants entre eux.
Tableau III-6 : Comparaison des variabilités apportées par la transformation dans la souche
réceptrice + la variabilité sur la croissance et l’expression protéique pour les souches JMY1212
et JMY1165 dans le cas d’un criblage haut débit microplaque et dans le cas d’un criblage en
erlenmeyer
Souche JMY1212
Souche JMY1165
Microplaque
18,9 % - 11,7 % = 7,2 %
18,3 % - 11,7 % = 24,6 %
Erlenmeyer
11,5 % - 5,4 % = 6,4 %
25,2 % - 5,4 % =19,8 %
Pour vérifier que la souche zéta permettait une comparaison fiable de l’activité spécifique de
différents mutants de la lipase Lip2 de Y. lipolytica dans des conditions de production
standard, des transformations ont été réalisées avec cinq mutants différents (232M, 232Y,
232S, 232P, 232I) de la lipase dans la souche JMY1212. Trois transformants pour chaque
mutant ont été sélectionnés au hasard et mis en culture en erlenmeyer en présence de 20 g/L
d’acide oléique. Les lectures d’activités ont ensuite été réalisées, les résultats sont synthétisés
dans le tableau III-7.
Tableau III-7 : Activités spécifiques de 5 variants de la lipase Lip2 de Y. lipolytica transformés
dans la souche JMY1212 cultivés en erlenmeyer en présence de 20 g/L d’acide oléique.
232M
232Y
232S
232P
232I
Répétition culture n°1
12,8
13,8
8,2
3,4
30,3
13,8
12,8
8,6
2,1
30,1
14,1
13,4
8,2
2,6
31,4
Activité moyenne
13,5
13,3
8,3
2,7
30,6
CV %
5,1%
4,0%
2,4%
24,2%
2,3%
Les valeurs de variabilité obtenues pour les différents transformants d’un même mutant sont
particulièrement basses (beaucoup plus que les 11,5 % précédemment identifiés pour les 8
mutants testés et même plus basses que le test d’activité en lui même). Ceci signifie que la
variabilité apportée par l’étape de transformation et par les étapes de culture et d’expression
198
protéique est quasi nulle. En réalité ce n’est pas étonnant, car sur trois mutants testés, la
probabilité d’en avoir un qui n’a pas intégré la cassette d’expression à la plate-forme zéta est
très faible. Ainsi, c’est comme si nous avions testé trois fois le même clone. On notera tout de
même, que pour le variant 232P, une variabilité très importante est obtenue : 24 %, ceci est
due au fait que sur les trois transformants testés, l’un possède une activité 1,5 fois supérieure
aux deux autres. Ce transformant a certainement une intégration de la cassette d’expression
particulière (locus fortement exprimé, plusieurs copies…).
Auparavant, pour les transformations réalisées avec la souche JMY1165, environ une dizaine
de transformants étaient criblés sur leur activité et celui présentant la plus forte activité était
retenu. Comme l’intégration de la cassette d’expression est réalisée au hasard dans le génome,
la variabilité de l’expression de la lipase ne permettait pas une comparaison des activités
spécifiques des différents mutants obtenus directement après production. L’utilisation de la
souche JMY1212 permet de pallier ces problèmes. Ainsi, là où avec la souche JMY1165, le
criblage d’environ 10 transformants était réalisé sans possibilité de comparaison directe des
activités spécifiques, la souche JMY1212 permet après un criblage rapide de seulement 3
transformants la comparaison de l’activité spécifique de différents variants.
2.2. Evolution semi-rationnelle de la lipase Lip2 de Y. lipolytica
La valine 232 s’est avéré être une position clef dans la discrimination énantiomérique de la
lipase Lip2 de Y. lipolytica envers les esters d’acides α bromo-acétiques (Cancino, et al.,
2008). Pour étudier totalement le champ de toutes les mutations possibles, la méthode de
mutagenèse de saturation a été réalisée sur ces deux positions. Le plasmide JMP8 portant la
lipase Lip2 a été amplifié par PCR avec des amorces dégénérées sur la position 232. Après
digestion par dPNI, les produits PCR ont été transformés dans E. coli. Tous les transformants
(>200) ont été rassemblés et une extraction plasmidique a été réalisée. Après digestion par
NotI, l’ADN a été transformé dans la souche JMY1212. La production de lipase des
transformants obtenus a été réalisée en microplaque selon le protocole précédemment mis au
point. Le dosage de l’activité lipase a été réalisé avec le robot. Une extraction génomique de
transformants choisis au hasard a été réalisée pour procéder au séquençage.
Sur les 27 mutants séquencés (tableau III-8), 9 acides aminés différents ont été obtenus.
Certains acides aminés ont été retrouvés une seule fois, comme l’isoleucine, la méthionine et,
la cystéine, d’autres l’ont été plusieurs fois : c’est le cas de la valine (3 transformants),
199
l’alanine (2 transformants), l’arginine (6 transformants), l’acide aspartique (2 transformants),
la glycine (2 transformants) et de la thréonine (9 transformants). A cause du trop faible
nombre de transformants, la variabilité de l’activité pour un même acide aminé n’est pas
significative. En effet, ceci peut conduire à une sous-estimation de la variabilité réelle
(comme c’est le cas pour l’alanine et la glycine) ou à une surestimation (pour l’acide
aspartique). Les variabilités mesurées restent cependant compatibles avec les 18,9 % obtenus
lors d’un criblage microplaque avec robots sauf pour les cas de la mutation 232T. Ceci
s’explique probablement par le mutant 232T le plus actif, celui-ci est vraisemblablement issu
d’une intégration en plusieurs copies. Il présente en effet une activité 2,1 fois supérieure à la
moyenne des autres mutants. S’il n’était pas présent, on obtiendrait une variabilité de 20 %
pour l’activité des autres variants portant cette mutation.
Tableau III-8 : Récapitulatif des mutations obtenues pour le séquençage des 27 mutants issus de
la mutagenèse de saturation de la position 232
Acide aminé
Ala
Ala
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Asp
Asp
Gly
Gly
Thr
Thr
Thr
Thr
Thr
Thr
Thr
Thr
Thr
Val
Val
Val
Ile
Met
Cys
codon
GCC
GCC
AGG
CGG
AGG
CGC
CGG
CGG
GAC
GAC
GGG
GGG
ACC
ACC
ACC
ACC
ACG
ACC
ACG
ACC
ACG
GTC
GTC
GTC
ATC
ATG
TGC
200
Activité U/mL
0,051
0,049
0,041
0,039
0,034
0,033
0,028
0,026
0,051
0,036
0,074
0,064
0,249
0,169
0,128
0,118
0,115
0,108
0,107
0,098
0,097
0,354
0,285
0,259
0,162
0,154
0,034
CV
2%
18%
24%
10%
37%
16%
Les avantages déjà mis en évidence pour la mutagenèse dirigée ont donc été confirmés, ainsi
le séquençage de plusieurs variants a mis en évidence que les transformants portant les mêmes
mutations avaient la même activité.
2.3. Conclusion
Nous avons construit la souche JMY1212 dans le but de disposer d’un système d’expression
eucaryote pour l’évolution dirigée d’enzyme. Dans la première partie de cette étude nous
avons présenté l’intérêt de cette souche dans le cadre de l’évolution dirigée. La variabilité de
18,9 % obtenue sur l’ensemble du procédé de criblage est compatible avec une campagne de
criblage et fait de Yarrowia lipolytica un organisme de choix pour l’expression d’enzyme
dans un but l’évolution dirigée.
Dans la seconde partie, nous avons montré l’intérêt que présente une telle souche pour la
mutagenèse dirigée et l’évolution semi rationnelle. Elle permet en effet une comparaison
rapide des activités enzymatiques de différents variants d’une même enzyme. Les avantages
que présentent la souche zéta en termes de reproductibilité de l’expression protéique permet
donc de l’utiliser aussi bien dans des études d’évolution dirigée que dans des études
d’évolution rationnelle ou semi-rationnelle. Cette souche est actuellement la souche dans
laquelle se font toutes les transformations du gène Lip2. Seules les constructions des souches
multicopies qui requièrent des mécanismes de recombinaison non homologue nécessitent
l’utilisation de la souche JM1165.
201
Deuxième partie - Amélioration de la thermostabilité de la
lipase Lip2 par évolution dirigée et mise en évidence du
mécanisme de dénaturation thermique.
De nombreux brevets et publications relatent pour la lipase Lip2 de Y. lipolytica des
propriétés intéressantes dans divers domaines. A ce jour, elle n’est commercialisée que pour
des procédés l’employant dans des conditions d’utilisations douces (traitement d’effluents,
complément alimentaire…). Malgré un potentiel intéressant, aucune de ses applications
industrielles actuelles ne concerne ses capacités de biotransformation (voir tableau Tableau I12) pour l’obtention de molécules à forte valeur ajoutée. En effet, cette lipase possède un
inconvénient majeur pour être utilisée dans de tels procédés : sa faible thermostabilité. En
effet, elle est stable plusieurs mois à 4°C, plusieurs semaines à température ambiante et sur 48
heures à 40°C. Au-delà de cette température, Lip2 perd très rapidement toute son activité
Activité résiduelle %
(Figure III-16).
100%
80%
60%
40%
20%
0%
0
25
50
75
100
125
Temps inactivation (min)
40°C
50°C
60°C
Figure III-16 : Courbes de dénaturation thermique de la lipase Lip2 de Y. lipolytica à différentes
températures
En deux heures à 50°C, elle perd toute son activité alors que la lipase de Thermomyces
lanuginosa conserve la sienne totalement (Aloulou, et al., 2007a). Cette faible thermostabilité
est un inconvénient majeur pour son utilisation industrielle.
203
Pour améliorer cette propriété nous avons appliqué une stratégie d’évolution dirigée. C’est
l’objet de la première partie de ce chapitre. L’identification d’un variant amélioré a permis de
mieux comprendre les mécanismes de dénaturation de cette lipase et ouvre la voie à d’autres
améliorations par ingénierie rationnelle.
1. Evolution dirigée de la lipase Lip2 de Y. lipolytica
1.1. Stratégie d’obtention de la banque de mutants
La transformation de Y. lipolytica se fait par l’intégration d’une cassette d’expression
contenant :
- Les zones zéta (à chacune des extrémités de la cassette d’expression) qui permettent
l’intégration de la cassette d’expression. Cette intégration se fera de manière ciblée si la
cassette d’expression est intégrée dans la souche JMY1212 spécialement construite pour
l’évolution d’enzyme.
- Le marqueur de sélection ura3d1 qui permet de sélectionner les transformants ayant intégré
la cassette d’expression.
- Le promoteur POX2 inductible à l’acide oléique.
- Le gène de la lipase Lip2 à faire évoluer.
Cette cassette d’expression est présente dans le plasmide Jmp8, qui peut être amplifié dans
E. coli. Classiquement, la cassette d’expression est libérée par digestion par NotI et la
transformation est réalisée chez Y. lipolytica.
Pour l’obtention de la banque par PCR à erreurs, une première solution serait de réaliser une
PCR à erreurs sur le gène Lip2, de le réintégrer par ligation dans le plasmide Jmp8, de
transformer E. coli avec celui-ci, de récupérer les transformants et d’extraire le plasmide puis
de le digérer par NotI et finalement de transformer la cassette d’expression ainsi libérée chez
Y. lipolytica. Un tel protocole présente des désavantages, il est non seulement long à mettre en
œuvre, mais fait intervenir, en plus, une étape de ligation qui est limitante dans l’obtention
d’un grand nombre de transformants chez E. coli. Or, la taille de la banque criblée est une des
clefs de la réussite d’une campagne d’évolution dirigée.
204
Une autre stratégie a donc été envisagée. Elle consiste à amplifier la cassette d’expression par
PCR et à transformer directement celle-ci chez la levure. Une telle étape ne peut cependant
pas se réaliser en une seule fois, car si la PCR à erreurs doit être réalisée sur le gène Lip2,
aucune mutation ne doit intervenir sur le marqueur de sélection ura3d1 ni sur le promoteur
POX2. En effet, si l’un de ces deux éléments était muté, ceci pourrait se traduire dans le cas
du promoteur POX2 par une expression différentielle selon les transformants, et, dans le cas
du promoteur ura3d1 par des problèmes de croissance sur milieu de sélection (qui pourraient
conduire à passer à côté de transformants ne poussant pas ou peu). Ainsi, la stratégie mise au
point (Figure III-17) consiste à amplifier d’une part le gène LIP2 avec la deuxième zone zéta
(Fragment PCR2 1,5 kb) par PCR à erreurs avec les amorces PCR2_dT et PCR2_r
(température d’hybridration 50°C), et d’autre part le reste de la cassette d’expression
contenant la première zone zéta, le marqueur de sélection ura3d1 et le promoteur POX2
(Fragment PCR1 3,9 kb) par PCR fidèle avec les amorces PCR1_d et PCR1_rT (température
d’hybridation 50°C). Une zone de recouvrement entre les deux fragments est assurée par
l’utilisation d’amorces complémentaires reverses (PCR1_rT et PCR2_dT). A partir des deux
fragments, une PCR de fusion est réalisée en deux étapes. Une première étape consiste à
réaliser 10 cycles de PCR sans amorces à la température d’hybridation de la zone de
recouvrement des deux fragments. Par la suite les amorces des extrémités PCR1_dL et
PCR2_dL sont ajoutées et 15 cycles PCR supplémentaires sont réalisés à la température
d’hybridation des amorces. Comme ces amorces sont plus longues, leur température
d’hybridation est plus élevée 68°C et on évite ainsi la ré-amplification des fragments PCR1 et
PCR2. La cassette d’expression ainsi reconstituée est prête à être transformée dans la souche
JMY1212 chez Y. lipolytica. Une telle méthode permet de réduire grandement le temps
d’obtention de la banque et évite l’étape de ligation souvent limitante pour l’obtention d’un
grand nombre de clones chez E. coli.
205
zeta 1
ura3d1
pPOX2
LIP2
zeta 2
PCR fidèle
PCR à erreurs
Fragment PCR1
Fragment PCR2
PCR1_rT
PCR2_r
PCR1_d
PCR2_dT
PCR1_dL
PCR de
fusion
PCR2_rL
Souche JMY1212 : plate-forme d’intégration zéta
Figure III-17 : Stratégie pour la construction par PCR de la cassette d’expression avec la lipase
Lip2 mutée par mutagenèse aléatoire.
1.2. Premier tour de mutagenèse
1.2.1.
Obtention de la banque et crible
Pour l’obtention du fragment PCR2, la Taq polymérase a été utilisée dans des conditions
destinées à accroître son taux d’erreurs en présence de 3,84 mM de MgCl2 (en plus des 2 mM
apportés par le tampon de la polymérase) et 400 µM de MnCl2. Les dNTP sont présents en
proportions non équivalentes dans les quantités suivantes : 250 µM dATP et dGTP, 570 µM
dCTP et dTTP. Une première banque de taille modeste, de 740 transformants, a été
entièrement traitée avec les robots de la plate-forme de criblage haut-débit, selon la méthode
mise au point précédemment (partie 1 du chapitre résultat).
Le criblage des variants sur leur thermostabilité a été réalisé sur le ratio activité
initiale/activité résiduelle après passage à haute température. La condition retenue pour le
crible est une incubation de 7,5 min à 60°C. Dans ces conditions, sur 48 clones cultivés en
microplaque et produisant la lipase sauvage, l’activité initiale moyenne est de 0,882 U/mL
(CV = 17,3 %) et l’activité résiduelle mesurée a pour moyenne 0,040 U/mL (CV : 27,3%). La
lipase sauvage perd donc 83% de son activité avec une variabilité de 27,3% et aucun effet de
206
bord au sein des microplaques n’est observé (Figure III-18). Cette forte variabilité est due aux
très faibles niveaux d’activité résiduelle.
Activité lipase U/mL
1,4
1,2
1,0
Activité moyenne initiale : 0,882 U/mL
Ecart type 0,121 U/mL (13,7 %)
0,8
0,6
0,4
Activité moyenne résiduelle : 0,146 U/mL
Ecart type 0,040 U/mL (27,3 %)
0,2
0,0
0
10
20
30
40
50
Numéro du puits
Figure III-18 : Activité initiale (■) et activité résiduelle (□) après passage 7,5 minutes à 60°C sur
48 clones pour la mise au point du crible sur la thermostabilité.
1.2.2.
Résultat du premier tour d’évolution dirigée
Sur les 740 transformants, l’activité moyenne observée est de 0,61 U/mL (371 mU DO/min).
Cependant 72 % présentaient une activité lipase très faible (pente inférieure à 0,16 U/mL soit
moins de 20% de l’activité de la lipase sauvage), dont 47 % avec une activité quasi nulle
similaire à celle observée pour l’hydrolyse spontanée du pNPB (pente de 0 à
0,02 mUDO/min). La répartition de l’activité des 740 transformants et de leur activité
résiduelle (ratio activité après inactivation/ activité initiale) peut être visualisée sur la figure
III-19-A. L’activité résiduelle de ces mutants à faible activité initiale paraît élevée mais ce
n’est qu’une apparence. Ceci est dû à hydrolyse spontanée du pNPB (que nous n’avons pas
soustraite) qui donne une pente d’environ 9 mUDO/min. Ainsi, l’activité résiduelle d’un
mutant de faible activité initiale paraît très élevée par rapport à un mutant possédant une
activité normale. Si on écarte 72% de mutants à très faible activité, alors on observe une
répartition homogène de l’activité résiduelle (Figure III-19-B). Ainsi les 533 mutants
présentant une pente inférieure à 0,16 U/mL (100 mUDO/min) ont été écartés. Sur les 207
mutants restants, 8 ont été sélectionnés pour leur ratio activité résiduelle / activité initiale
supérieur à 25% (ratio compris entre 27 et 40 % -Figure III-19-C). La moyenne de ce ratio
chez les mutants actifs est de 10 % contre 17 % pour la lipase sauvage.
207
Pente (mU DO/min)
1400
250%
1200
200%
1000
800
150%
600
100%
400
50%
200
0
0
200
400
A
0%
800
600
B
Pente (mU DO/min)
1400
45%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
1200
1000
800
600
400
200
0
0
50
100
150
Numéro
transformant
Nombredu
transformants
200
Numéro
transformant
Nombredutransformants
% d'activité résiduelle
C
45%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
8 mutants sélectionnés
pour un criblage
complémentaire.
0
50
100
150
200
250
Numéro
dutransformants
transformant
Nombre
Figure III-19 : Répartition de l’activité initiale () et de l’activité résiduelle ( ) pour les
différents mutants obtenus. A) sur la totalité des 740 mutants de la banque, classés selon leur activité
initiale B) sur les 207 transformants possédant une activité initiale supérieure à 0,16 U/mL, classés
selon leur activité initiale C) sur les 207 transformants possédant une activité initiale supérieure à
0,16 U/mL, classés selon leur activité résiduelle.
Un criblage complémentaire a été effectué sur ces 8 mutants. Celui-ci a été réalisé dans les
mêmes conditions que le criblage de la banque, les mutants ont été cultivés en microplaques
et inactivés 7,5 min à 60°C. Bizarrement, presque tous (7 sur les 8) présentent une activité
résiduelle bien en-dessous des 25 % trouvés lors du premier crible et également en dessous de
l’activité résiduelle de la lipase sauvage (Tableau III-9). Seul le mutant n°3 garde une activité
résiduelle bien plus importante que la lipase sauvage, 63,2 % contre 10,4 %, et bien plus
208
importante que l’activité résiduelle mesurée lors du premier crible de 29,2%. Il présente une
activité identique à la lipase sauvage (environ 1,1 U/mL). Ce mutant a été séquencé et portait
la mutation C244 S.
Tableau III-9 : Criblage complémentaire des 8 mutants sélectionnés sur leur thermostabilité.
Mutants testés
Activité
Pente initiale
Activité
résiduelle
(mUDo/min) initiale (U/mL)
%
Lipase sauvage
678,5
1,11
10,4%
Mutant 1
574,0
0,94
3,4%
Mutant 2
512,5
0,84
5,7%
Mutant 3
663,7
1,09
63,2%
Mutant 4
177,7
0,29
9,2%
Mutant 5
336,7
0,55
5,1%
Mutant 6
540,6
0,89
4,4%
Mutant 7
702,6
1,15
7,7%
Mutant 8
587,1
0,96
9,0%
Nous possédions déjà dans la souchothèque des variants de Lip2, le plasmide Jmp8 portant la
lipase avec la mutation C244A sous contrôle du promoteur POX2 (voir troisième partie du
chapitre Résultats paragraphe 1.1.1) ainsi qu’une souche de Y. lipolytica produisant ce mutant.
L’activité de ce variant est du même ordre de grandeur que la lipase sauvage et des tests de
thermostabilité ont montré que ce variant présentait lui aussi une thermostabilité améliorée
identique à celle obtenue avec le mutant 244S. Nous sommes donc repartis de ce plasmide
Jmp8-244A déjà construit pour créer une nouvelle banque correspondant au deuxième tour de
mutagenèse dirigée.
1.3. Deuxième tour de mutagenèse
A partir de ce plasmide, un nouveau fragment PCR2 a été amplifié par PCR à erreurs et une
nouvelle cassette d’expression a été construite selon la même technique que précédemment et
transformée dans la souche JMY1212. Une banque de 5500 transformants a été criblée. Pour
les mêmes raisons que précédemment, les mutants possédant une activité inférieure à
0,164 U/mL ont été écartés car ils présentaient une activité lipase trop faible, soit 42 % des
mutants obtenus. Les conditions du criblage ont été adaptées et consistent en une inactivation
de 20 minutes à 90°C. Dans ces conditions le mutant 244A garde une activité résiduelle de
34% (avec un coefficient de variation de 22%). Un grand nombre de mutants paraissent avoir
une thermostabilité améliorée par rapport au mutant 244A de la lipase. En tout, 46 clones ont
209
été sélectionnés pour un second criblage. Pour les variants pré-sélectionnés, aucun clone n’a
finalement montré de thermostabilité améliorée par rapport au variant 244A. En effet, malgré
de nombreux tests complémentaires une grande variabilité est obtenue selon les essais.
1.4. Caractéristiques des banques criblées (tableau III-10)
Tableau III-10 : Récapitulatif des banques du premier et du deuxième tour d’évolution dirigée.
Banque 1ère
génération
Banque 2ème
génération
Nombre de mutants criblés
740
5500
% actifs (pente < 100 mUDO/min
28%
58%
Nombre de mutants séquencés
6
10
3,2
2,0
dont silencieuses
37%
25%
% Transition
74%
85%
% Transversion
26%
15%
Nombre de mutations /kb
La première banque obtenue de toute petite taille, contient un faible nombre de mutants actifs
(28%), signe que la mutagenèse aléatoire a fonctionné. Sur les 28% de transformants actifs, 6
d’entre eux ont été retenus pour un séquençage (dont 244S). Le taux de mutation est de 3,2
mutations par kb, il peut à première vue paraître assez faible compte tenu du nombre très
important de mutants inactif, cependant, il convient de souligner que seuls les mutants actifs
ont été séquencés, il est donc hautement probable que les mutant inactifs présente un taux de
mutation plus important et donc que le taux de mutation moyen soit également plus fort.
Comme on pouvait s’y attendre, l’utilisation de la Taq polymérase a favorisé les transitions
par rapport aux transversions (74% contre 26%). Malgré cela et malgré la taille de la banque
de mutants criblés, le mutant 244S de thermostabilité améliorée a pu être isolé avec succès de
ce premier tour de mutagenèse aléatoire.
La seconde banque de taille plus conséquente présente un plus faible taux de mutation et par
conséquent un plus grand nombre de mutants actifs. Malgré une première pré-selection de
clones sur leur thermostabilité, aucun mutant de thermostabilité améliorée n’a pu être identifié
clairement. Pour avoir une chance d’identifier un mutant de thermostabilité améliorée, et
avant de se lancer dans un criblage d’une banque de plus grande taille, il s’agit en premier lieu
de trouver une solution au problème du fort taux de faux positifs, car il s’accompagne d’une
importante perte de temps en criblages complémentaires.
210
2. Obtention
d’une
enzyme
non
agrégée
pour
sa
caractérisation
2.1. Problèmes de reproductibilité.
Comme nous l’avons vu un grand nombre de transformants ressortent lors du criblage hautdébit sur la thermostabilité, environ 1% des transformants semblent posséder une
thermostabilité améliorée. Cependant, si on soumet ces clones à un criblage complémentaire
(dans les mêmes conditions, en microplaque), ils ne tiennent pas toujours leurs promesses. On
pourrait penser que ceci vient d’un manque de reproductibilité du crible. Pourtant, ce n’est pas
le cas. En effet, comme on peut le voir sur le tableau III-11, le crible microplaque mis au
point est très reproductible. Sur une même microplaque, nous avons cultivé 48 clones de
lipase sauvage et 48 clones du variant 244A. Les étapes de croissance et d’expression
protéique ont été calquées sur celles utilisées pour la réalisation des cribles. Après lecture des
activités initiales, la microplaque a été inactivée 20 minutes à 70 °C. La lipase sauvage et son
variant ont la même activité initiale (environ 0,73 U/mL) avec un coefficient de variation de
15 %. Après inactivation la lipase sauvage ne conserve plus que 4% de son activité initiale
alors que le variant 244 A conserve 78% de son activité. Les coefficients de variation après
inactivation sont d’environ 10%. Ceci confirme la reproductibilité du crible mis au point ainsi
que la grande thermostabilité du variant 244A.
Tableau III-11 : Inactivation de la lipase native (rose) et du mutant 244A (vert) après 20 minutes
à 70°C lors d’un crible en microplaque. La ligne F n’a pas été représentée pour cause de mauvais
fonctionnement du robot lors de l’expérience.
lipase sauvage
Pente initiale (mUDO/min)
mutant 244 A
441
+/-15%
452
+/-15%
16
+/- 8%
353
+/- 11%
Pente après
inactivation
(mUDO/min)
% Activité résiduelle
4%
+/- 8% relatif
211
78%
+/- 11% relatif
Par contre, d’une culture à l’autre, une grande variabilité est obtenue sur la thermostabilité.
Ainsi, sur les résultats présentés dans ce manuscrit, le variant 244 A présente des activités
résiduelles variables selon le lot criblé : 29,2% d’activité résiduelle après passage 10 minutes
à 60°C pour le crible sur la banque, 63 % d’activité résiduelle pour le crible complémentaire
dans les mêmes conditions, et 78 % d’activité résiduelle après passage 20 minutes à 70°C. De
même, lors du changement d’échelle, lorsque le mutant 244A a été produit en plus grande
quantité pour une meilleure caractérisation, les mêmes problèmes de variabilité entre les lots
de production se sont posés. Comme la variabilité observée n’est pas dépendante de la
reproductibilité du crible (Tableau III-11), c’est au niveau des conditions de culture que la
variabilité doit être introduite. Un des acteurs dans ces problèmes de reproductibilité a
rapidement été identifié : l’acide oléique. En effet, de petites quantités d’acide oléique
résiduelles présentes (trouble visualisable à l’œil nu) en fin de culture ont un effet drastique
sur la thermostabilité. Cependant, ce n’est pas le seul ; il semble que la concentration en
protéines ait également son rôle à jouer, car la thermostabilité du mutant 244A semble bien
moins importante lorsque celui-ci est produit en grande quantité.
2.2. Mise en évidence du phénomène d’agrégation
2.2.1.
Mise en évidence
Deux types d’analyses complémentaires, la chromatographie d’exclusion stérique et l’analyse
par diffusion dynamique de la lumière (DLS : Dynamic Light Scattering), ont permis de
mettre en évidence que l’enzyme Lip2 n’était pas présente sous forme libre mais sous forme
d’agrégats. Ces formes de hauts poids moléculaires sont à la fois solubles et actives.
L’analyse par chromatographie d’exclusion stérique.
L’analyse d’un surnageant de culture brut par chromatographie d’exclusion stérique (Figure
III-20) montre un pic majoritaire présentant l’activité lipase, et un deuxième ensemble de pics
correspondant à tous les fragments peptidiques présents dans le milieu riche utilisé (peptones,
extrait de levure). Le pic contenant l’activité enzymatique sort dans le volume mort de la
colonne ; le volume d’élution correspondant à ce pic représente une taille de molécule de plus
de 1300 kDa. La masse des agrégats évaluée par la chromatographie d’exclusion stérique
représente donc plus de 35 fois la masse de la lipase libre. La colonne utilisée ici (une
Superdex S200) ne permet pas une caractérisation précise de la taille de ces formes de hauts
poids moléculaires. Une analyse complémentaire par DLS à donc été réalisée.
212
Composés
du milieu de
culture de
faibles poids
moléculaires
Activité lipase
Taille > 1300 kDa
Figure III-20 : Analyse par chromatographie d’exclusion stérique d’un surnageant de culture de
lipase produite en erlenmeyer en milieu riche en présence d’acide oléique.
L’analyse par DLS des tailles obtenues.
Des tests de DLS ont été réalisés à l’Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale de
Toulouse en collaboration avec le groupe de biophysique structurale dirigé par Lionel
Mourey. Cette technique consiste à étudier la diffusion émise par une solution contenant de
petites particules lorsqu’elle est soumise à une source de lumière monochromatique et
cohérente comme un laser. L’intensité diffusée fluctue sur des échelles de temps très courtes
(micro à milli seconde). Cette variation d’intensité est fonction de la taille des particules et
une information sur le rayon hydrodynamique des particules peut être obtenue. Pour vérifier
l’effet de la force ionique et du pH sur l’agrégation de l’enzyme, plusieurs conditionnements
de l’enzyme ont été testés, Ainsi, une solution à 1 mg/mL de lipase a été conditionnée dans
trois tampon différents à 50 mM : Acétate pH 4, MES pH 6, et Tris pH 8 et 2 forces ioniques
différentes ont été testées en additionnant du NaCl à 100 mM ou à 500 mM. Les résultats
obtenus révèlent la présence d’agrégats dont le rayon hydrodynamique est proche de 100 nm
alors que la lipase devrait avoir un rayon hydrodynamique proche de 2,5-3 nm. Dans aucune
des conditions de pH et de force ionique testées, on n’observe de dissolution des agrégats.
Cet état d’agrégation de la protéine (agrégat soluble) est un problème pour la caractérisation
de la thermostabilité, car un des mécanismes majeur dans la dénaturation thermique des
protéines est lié aux problèmes d’agrégation. Ainsi, si les protéines se trouvent déjà très
rapprochées les unes des autres dans des agrégats, ce mécanisme ne peut être qu’amplifié. Il
convient donc de s’affranchir de ce problème avant de pouvoir réaliser la caractérisation de la
thermostabilité de la lipase sauvage et du variant 244A. Pour solutionner un problème, il
convient d’abord d’en comprendre les raisons. C’est pourquoi la partie suivante s’attache à
décrire l’agrégation chez les lipases et chez la lipase Lip2 en particulier.
213
2.2.2. Phénomène d’agrégation des lipases en général et le cas de Lip2
Ce phénomène d’agrégation est bien connu chez les lipases. En effet, des agrégats de hauts
poids moléculaires ont été trouvés chez de nombreuses lipases produites en présence de
lipides, comme celles de Chromobacterium viscosum : 120 kDa (Taipa, et al., 1992), Bacillus
Thermocatenulatus : 295 kDa (Rua, et al., 1997) et Pseudomonas cepacia : plus de 1000 kDa
(Dünhaupt, et al., 1992). Dans certains cas, ce phénomène a été mieux caractérisé. Ainsi,
l’agrégation des lipases peut se faire via des complexes lipides-protéines (Roberts, et al.,
1984; Tyski, et al., 1983). Ces lipides (huile d’olive et acide oléique), proviennent souvent du
milieu de culture (Taipa, et al., 1992) car ces substrats sont utilisés pour induire la production
de lipase dans les organismes qui les produisent de manière homologue. Pour la lipase de
Y. lipolytica, c’est ce qui semble être le cas. L’équipe de F.Carrière (Aloulou, et al., 2007b) a
obtenu des résultats similaires en terme d’agrégation pour la production de cette même lipase
par Y. lipolytica. Cependant, dans leur cas, deux formes de lipases sont présentes dans le
milieu de culture, une lipase présente sous forme de composés de hauts poids moléculaires et
une lipase de poids moléculaire attendu. Ils reportent que plus la quantité d’enzyme produite
est importante, plus la proportion de lipase non agrégée augmente ; et concluent que la lipase
est produite de manière libre une fois que les lipides présents dans le milieu de culture sont
saturés avec la lipase, ainsi de la lipase libre peut être obtenue. Dans notre cas, nous n’avons
jamais observé ce phénomène lors de production de lipase de routine (en erlenmeyer).
Cependant, un extrait de lipase issue d’une production en fermenteur présentait les mêmes
caractéristiques que l’échantillon de l’équipe de Verger : deux formes de lipase étaient
présentes, l’une libre, l’autre agrégée (Figure III-21).
Activité lipase
Taille = 39 kDa
Composés
du milieu de
culture de
faibles poids
moléculaires
Activité lipase
Taille > 1300 kDa
Figure III-21 : Analyse par chromatographie d’exclusion stérique d’un surnageant de culture
issu d’une production de lipase produite en fermenteur en milieu minimum en présence d’acide
oléique.
214
De plus, la lipase issue de cette fermentation présentait un profil d’activité très inhabituel.
Ainsi, pour les lectures d’activité pNPB, les dilutions les plus concentrées présentaient une
faible pente, alors que plus on diluait la solution, plus la pente était élevée (Figure III-22-A).
Cette particularité s’accompagnait d’une pente non linéaire pour les concentrations les plus
élevées (voir figure III-22-B), et d’un trouble qui apparaissait à température de 4°C.
A
B
dilution
pur
profil des
profil
pentes
pente
(mUDO/min)
15
1/10
ème
77
1/50
ème
215
1/100
ème
290
Figure III-22 : Effet de l’antimousse sur l’activité lipase. A ) Profil d’activité obtenu à partir d’un
surnageant de culture de fermentation pour différentes dilutions. B) Profil d’activité zoomé obtenu
pour la dilution 1/10ème
Ce type de profil n’a jamais été obtenu pour une production en erlenmeyer, quel que soit le
milieu de production. Nous avons attribué ce comportement particulier au seul composé
intervenant uniquement pour la production en fermenteur : l’antimousse, le Struktol J673 (des
esters d’acides gras d’origine végétale). L’ajout d’antimousse est régulé automatiquement en
fonction du niveau de mousse dans le fermenteur. En effet, Y. lipolytica est une levure réputée
pour sa capacité à former de la mousse en fermenteur, un ajout d’antimousse est donc
nécessaire pour éviter les débordements. Ces composés hautement insolubles dans l’eau sont
des agents de surface qui font partie de la classe des détergents. Or, ce type de composé a un
effet reconnu sur l’activité enzymatique des lipases. En effet, les lipases étant des enzymes
interfaciales elles interagissent fortement avec ces composés d’interface. L’inhibition
enzymatique observée (Figure III-22) est d’autant plus faible que la dilution est élevée et donc
que la concentration du composé est faible. Cette observation est probablement à mettre en
relation avec la CMC (Concentration micellaire critique) du composé. A forte concentration,
le composé s’organise en micelles qui inactivent fortement l’enzyme. A faible concentration,
il est présent sous forme monodisperse et inactive peu ou pas l’enzyme. Comme l’ajout se fait
de manière automatique, les quantités d’antimousse ajoutées dans le fermenteur sont assez
importantes (de l’ordre de 10 à 20 mL). L’apparition d’un trouble à 4°C est également à
215
mettre en relation avec les grandes quantités d’antimousse ajoutées pendant la fermentation,
car le point de trouble ou température de trouble a été atteint. Un autre antimousse, le
polypropylèneglycol 2000 a été essayé comme substitut et le même effet a été observé. Ainsi
par la suite pour toute fermentation, les fermentations ont été réalisées avec un minimum
d’antimousse (ajout manuel et non pas automatique).
Comme on obtient de l’enzyme non agrégée seulement dans ces conditions, il se peut que ce
composé soit aussi à l’origine de la fraction non agrégée observée lors des productions en
fermenteur. Il se peut qu’il ait un effet sur la formation des complexes lipides-protéines ou
leur dissolution. On notera que l’enzyme non agrégée obtenue par l’équipe de F.Carrière avait
été produite avec le même antimousse, et bien qu’aucun effet sur l’activité n’ait été reporté, de
l’enzyme agrégée et non agrégée était produite dans ce cas. Si la lipase non agrégée est
récupérée après une étape de chromatographie d’exclusion stérique, alors, l’effet sur l’activité
reste le même ce qui suppose des interactions fortes entre le détergent et la lipase. Une
désagrégation de l’enzyme par cette voie ne sera donc pas retenue à cause des difficultés à se
débarrasser du détergent. En effet, il a visiblement un effet négatif sur l’activité de l’enzyme
et donc potentiellement sur sa structure tridimensionnelle. Ainsi, la caractérisation de la
thermostabilité en présence de ce détergent n’est pas envisageable.
Par chromatographie d’exclusion stérique nous avons montré que ce phénomène avait aussi
lieu dans le cas de production de lipase en microplaque avec de très faibles quantités d’acide
oléique et que même si aucun acide oléique résiduel ne semblait être présent, les complexes
étaient quand même formés. Ainsi, il est possible que, selon les lots de culture, la qualité de
l’émulsion d’acide oléique et la quantité de protéines formées soient différentes et que les
complexes formés n’aient pas exactement les mêmes caractéristiques (quantité de protéines,
arrangement des protéines entre elles et avec l’acide oléique résiduel…). Ceci explique
certainement les problèmes de reproductibilité observés. D’autre part, ces complexes lipidesprotéines favorisent la proximité des protéines entre elles, ce qui peut avoir un rôle sur la
dénaturation thermique où des phénomènes d’agrégation sont fréquemment observés. De plus,
l’acide oléique peut favoriser un dépliement des protéines, ce qui peut être un facteur de
déstabilisation de celles-ci (Sah, 1999). Comme il n’est pas possible de contrôler de tels
complexes (quantité de protéines, arrangement…), la caractérisation plus fine de la
thermostabilité de la lipase native et du mutant 244A ne peut se faire qu’avec de la
lipase non agrégée.
216
2.3. Comment s’affranchir de l’agrégation ?
2.3.1.
Dissolution des agrégats par l’utilisation de détergents et alcools
Dans de nombreux cas, des détergents comme le triton, ou des alcools comme l’isopropanol
sont utilisés pour désagréger ces complexes de hauts poids moléculaires retrouvés chez les
lipases. Nous venons de voir que le Struktol, (malgré certains effets négatifs qui se traduisent
par une inactivation de la lipase) a un effet notable sur l’état d’agrégation de Lip2. Une étude
concernant l’état d’agrégation de la lipase en présence de détergent et d’alcool a été réalisée.
A partir d’une production de lipase en erlenmeyer, l’étude de l’effet de différents composés
(voir liste tableau III-12) a été réalisée. Les composés solides ont été utilisés à une
concentration de 1% (P/V). L’isopropanol a été utilisé à une concentration finale de 10 %
(V/V). Après une nuit d’incubation sous agitation à température ambiante, les activités pNPB
ont été mesurées (avant et après dilution) et les échantillons ont été analysés par
chromatographie d’exclusion stérique. En sortie de chromatographie l’activité lipase a été
mesurée, ce qui permet de voir si l’enzyme reste active en fonction de son état d’agrégation.
Traitements
Aucun
Détergents
ioniques
Détergents
Non ioniques
Composés testés
Activité
résiduelle
Témoin
100%
Forme
agrégée
Non
Oui
CTAB
0%
Faible
Faible
SDS
0%
Non
Oui
Sodium cholate
81%
Non
Oui
Struktol
* 4%
Oui
Quasi nulle
Polypropylène glycol 2000
* 20 %
Oui
Quasi nulle
octyl alphaD glucopyranoside
208%
Oui (très faible) Oui
Triton 100 X
0%
Pas d'activité
Oui
Brij 30
0%
Pas d'activité
Oui
Brij 58
* 1%
Pas d'activité
Oui
Tween 20 (polyéthylène glycol
sorbitan monoléate)
136%
Non
Oui
Tween 40 ( Polyéthylène
sorbitan palmitate)
81%
Oui (faible)
Oui
Tween 85
252%
Non
Oui
140%
Non
Oui
100%
Non
Oui
Détergent
CHAPS
Zwitterionique
Alcool
Enzyme libre
Isopropanol
Tableau III-12 : Effets de différents détergents et d’un alcool sur l’activité et sur l’agrégation de
Lip2. Les effets négatifs sur l’activité résiduelle sont colorés en gris. Les effets positifs sur l’état
d’agrégation de l’enzyme sont mis en évidence en bleu. Les profils d’activité particuliers (inactivation
de l’enzyme à forte concentration) sont notés avec un astérisque.
217
Tous les composés n’ont pas le même effet sur l’activité enzymatique. Certains détergents
inactivent complètement l’enzyme, c’est le cas du CTAB, du triton 100X, des Brij 30 et du
SDS, alors que d’autres n’inactivent que partiellement l’enzyme, c’est le cas du Brij 58, du
PPG2000 et du Struktol. Pour ces trois composés, on retrouve une inhibition similaire à celle
observée précédemment pour l’activité lipase en sortie de fermentation (Figure III-22), le
PPG2000 est également un antimousse. Certains détergents, au contraire, permettent une
augmentation de l’activité enzymatique. (C’est le cas du CTAB, de l’octyl α-D
glucopyranoside et des Tween 20 et 85).
Pour ce qui est de la désagrégation de l’enzyme, de l’enzyme libre active est formée avec :
-
les deux antimousses testés : Struktol et PPG2000. Dans ce cas il ne reste plus de
lipase agrégée. Cependant, nous avons vu précédemment que ces deux composés
restaient fortement liés à l’enzyme même après une étape de chromatographie
d’exclusion stérique.
-
deux détergents non ioniques : l’octyl α-D glucopyranoside et le tween 40. Avec ces
deux détergents, on obtient à la fois de la lipase agrégée et de la lipase non agrégée.
Cependant les quantités d’enzyme libérée sont faibles. A cause de l’effet de traîne
toujours observé en chromatographie d’exclusion stérique une purification d’enzyme
en grande quantité n’est pas envisageable par cette méthode.
D’autres solutions doivent donc être trouvées.
2.3.2.
Ingénierie du système d’expression
Plutôt que d’envisager leur dissolution, il nous a paru judicieux d’empêcher la formation des
complexes lipides-protéines de hauts poids moléculaires. Ainsi, en n’utilisant pas (ou peu)
d’acide oléique pour produire la lipase, on pourrait peut-être éviter ce phénomène. Or, le
promoteur POX2 est inductible à l’acide oléique et les tentatives de diminution de l’acide
oléique dans le milieu de culture se sont soldées par une très faible production de lipase.
Ainsi, nous avons décidé de changer de promoteur et d’utiliser un promoteur non inductible à
l’acide oléique. Deux plasmides avec de nouveaux promoteurs forts et constitutifs (Figure III23) nous ont été fournis par l’équipe du Docteur Jean-Marc Nicaud de l’INRA de Grignon :
-
Le plasmide JMP60 contenant Lip2 sous contrôle du promoteur hp4d.
-
Le plasmide JMP61-TEF Lip2 contenant Lip2 sous contrôle du promoteur TEF.
218
hp4d
TEF
Ura3d1
Ura3d1
HindIII (557)
LIP2
LIP2
jmp60 lip2
zéta
jmp61
zéta
5934 bp
NotI (4245)
5898 bp
EcoRI (1637)
zéta
NotI (4204)
zéta
NotI (2035)
NotI (1994)
Kan R
KanR
Figure III-23 : Représentation des plasmides JMP60 contenant Lip2 sous contrôle du promoteur
hp4d et JMP61-TEF Lip2 contenant Lip2 sous contrôle du promoteur TEF.
La souche JMY1212 a été transformée avec ces deux plasmides digérés par NotI et les essais
de production de lipase sur YT2 contenant 50g/L de glucose sont représentés en figure III-24.
50
200
50
160
40
160
40
120
30
120
30
80
20
80
20
40
10
40
10
0
0
20
40
60
80
0
100
DO 600 nm
200
0
0
Tem ps culture (h)
20
40
60
80
0
100
Tem ps culture (h)
Figure III-24 : Suivi de la croissance () et de l’activité lipase () en milieu riche en présence de
glucose pour la souche exprimant Lip2 sous contrôle du promoteur hp4d (A) et pour la souche
exprimant Lip2 sous contrôle du promoteur TEF (B)
Aucune production de lipase n’a été obtenue lorsque Lip2 est sous contrôle du promoteur
hp4d. Lorsque la lipase est produite sur glucose sous contrôle du promoteur TEF, les mêmes
niveaux d’activités sont obtenus que lorsque celle-ci est produite sous contrôle du promoteur
POX2 et s’élèvent à environ 50 U/mL (Figures III-24-B et III-25). Le promoteur TEF semble
cependant induit par la présence d’acide oléique. En effet, lorsque le gène de la lipase est sous
contrôle du promoteur TEF et que celle-ci est produite en présence d’acide oléique, les
niveaux d’activité sont supérieurs à ceux obtenus lorsque la production a lieu en présence de
glucose, et dans ce cas, surpassent aussi les niveaux de production obtenus lorsque le gène de
la lipase se trouve sous contrôle du promoteur POX2. On obtient environ 2 fois plus d’activité
219
Activité (U/mL)
B
Activité (U/mL)
DO 600 nm
A
lipase dans ce cas (72 U/mL avec TEF contre environ 38 U/mL avec POX2). Bien que cela
n’ait pas d’intérêt dans le cadre de la production de lipase pour la caractérisation de la
thermostabilité, cette activité importante mérite d’être soulignée.
On notera qu’après avoir atteint un maximum d’activité (après 24 heures pour les productions
sur acide oléique 20 g/L et après 48 heures pour les productions sur 50 g/L), l’activité lipase
chute (données non montrées sur le graphique).
80
Activité U/ml
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
Tef sur glucose 50 g/L
20
30
Temps culture (heures)
Tef sur acide oléique 10 g/L
40
50
Pox sur acide oléique 10 g/L
Figure III-25 : Evolution de l’activité de la lipase Lip2 produite lorsque le gène LIP2 est sous
contrôle du promoteur TEF en milieu riche en présence de glucose () ou en présence d’acide
oléique ( ). Comparaison à la production de la lipase lorsque produite lorsque le gène LIP2 est
sous contrôle du promoteur POX2 () en présence d’acide oléique.
On notera cependant que toutes les tentatives pour produire la lipase en erlenmeyer sous
contrôle de ce promoteur en milieu minimum, n’ont pas permis de produire de lipase. Chez
Y. lipolytica, les promoteurs sont assez sensibles à la source d’azote utilisée. Le phénomène a
été bien caractérisé dans le cas du promoteur POX2 (Fickers, et al., 2004) et du promoteur
XPR2 (Blanchin-Roland, et al., 1994). Pour le promoteur TEF, un exemple dans la littérature
montre que celui-ci s’exprime parfaitement sur milieu synthétique composé d’acides aminés
(Muller, et al., 1998), cependant il se peut que l’environnement génétique de ce promoteur
joue un rôle sur ses conditions d’induction.
L’état d’agrégation de la lipase produite en milieu riche sous contrôle du promoteur TEF a été
contrôlé par chromatographie d’exclusion stérique (Figure III-26). Comme prévu, la lipase est
produite totalement sous forme non agrégée et peut être purifiée pour la caractérisation de la
thermostabilité.
220
Lip2 produite sous contrôle du
promoteur POX2 en présence
d’acide oléique
Lip2 produite sous
> 1200 kDa
contrôle du promoteur
TEF sans acide oléique
39 kDa
Figure III-26 : Contrôle de l’agrégation de la lipase produite avec (rouge) ou sans (bleu) acide
oléique par chromatographie d’exclusion stérique.
3. Caractérisation de la thermostabilité de Lip2 sauvage et
du variant 244 A
Le variant 244A a été construit par mutagenèse dirigée à partir du plasmide JMP60 Tef Lip2
transformé dans la souche JM1212. Le variant 244A présente un niveau d’activité légèrement
inférieur (76%) à celui de la lipase sauvage (Figure III-27).
Activité U/mL
60
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80
100
Temps culture (heures)
wt
244
Figure III-27 : Activité lipase au cours du temps de culture pour les souches exprimant le gène
de la lipase sauvage (wt) et du mutant 244A sous contrôle du promoteur TEF. Production en
milieu riche en présence de glucose 50 g/L.
3.1. Influence de la concentration en protéine
Les premiers tests réalisés avec l’enzyme en sortie de purification montrent une inactivation
drastique de la lipase sauvage et du mutant 244A. En effet, après seulement 10 minutes à
50°C, tous deux présentaient une activité résiduelle inférieure à 1%. Comme l’effet de la
concentration de l’enzyme sur la dénaturation thermique avait déjà été soupçonné lors des
changements d’échelle de production, des tests complémentaires ont été réalisés avec ces
221
mêmes enzymes diluées 50 fois. A cette concentration, proche de la concentration de
l’enzyme lors du criblage, l’activité résiduelle de la lipase sauvage est de 25% et le variant
244A garde 95% de son activité dans ces conditions. Ceci confirme l’amélioration de la
thermostabilité de ce variant et souligne l’importance de la concentration de l’enzyme dans la
dénaturation thermique. En outre, la production de la lipase sauvage et du variant 244A se
font en milieu riche ; dans ces conditions, étant donné les quantités d’extrait de levure et de
peptone présentes dans le milieu de culture (initialement 10 et 20 g/L), une quantification
fiable de la concentration de l’enzyme n’est pas possible, il est donc nécessaire de purifier et
de quantifier l’enzyme avant tout test de dénaturation.
3.2. Purification de l’enzyme
La purification de l’enzyme a été mise au point au laboratoire. Nous avons retenu une
purification en deux étapes : une étape de chromatographie ionique suivie d’une étape de
chromatographie d’interaction hydrophobe. La lipase produite de manière extracellulaire est
déjà très pure avant purification, sur le puits 1 du gel coloré au nitrate d’argent, on peut voir
que la lipase est majoritaire (bande à 37 kDa). Cependant, on note aussi la présence protéines
contaminantes entre 55,4 et 36,5 kDa ainsi que de protéines de tailles inférieures à 21,5 kDa.
La première étape de purification par chromatographie ionique permet de se débarrasser des
composés colorés qui sont sécrétés par la souche au cours de la fermentation. La deuxième
étape de purification quant à elle permet de ne récupérer que la lipase d’intérêt. A l’issue de
cette étape, la protéine est extrêmement pure et ne contient plus de contaminants comme
l’atteste le gel SDS PAGE coloré au nitrate d’argent montré sur la figure III-28.
Masse
moléculaire
(kDa)
1 2
3
97,4
66,3
55,4
36,5
31,0
21,5
14,4
Figure III-28 : Suivi de la purification sur Gel SDS PAGE colorés au nitrate d’argent. 1) lipase
avant purification 2) lipase après étape de purification d’interaction anionique 3) fractions récupérées
après l’étape de purification d’interaction hydrophobe.
La vérification de l’état d’agrégation a été réalisée par chromatographie d’exclusion stérique
(Figure III-29). Celle-ci confirme que l’enzyme est produite de façon non agrégée.
222
Lipase pure
39 kDa
Figure III-29 : Chromatographie d’exclusion stérique de la lipase Lip2 en sortie de purification
L’enzyme et son variant ont donc été purifiés par ces deux étapes de chromatographie, l’une
ionique, l’autre d’interaction hydrophobe et leur concentration a été ajustée à 750 mg/L dans
le tampon d’activité lipase (pH 7,2).
3.3. Caractérisation de la thermostabilité de la lipase sauvage et du
variant 244A.
Les tests de caractérisation ont été réalisés avec une faible concentration d’enzyme (15 mg/L
pour chaque enzyme) et ce afin de pouvoir suivre dans le temps l’activité résiduelle. A 30°C
et 40°C l’enzyme sauvage et son variant sont stables sur 48 heures. Les courbes de
dénaturation thermique obtenues à plusieurs températures (50°C, 60°C, 75°C et 90°C) sont
données sur la figure III-30. On notera que même si la lipase sauvage est très stable à 30°C et
40°C, passé 40°C, sa vitesse de dénaturation thermique est très rapide. Pour la lipase sauvage,
une perte d’activité très rapide (au moins 80%) a lieu dès les premières minutes pour toutes
les températures. Cette première étape de dénaturation est suivie d’une dénaturation plus lente
par la suite. Deux mécanismes semblent donc intervenir dans la dénaturation de la lipase
sauvage. Ceci est confirmé par la rupture de pente observée sur le tracé des courbes ln (%
Activité résiduelle) en fonction du temps (Figures III-31 et III-32). Cette première étape de
dénaturation très rapide n’est pas présente pour le mutant de thermostabilité améliorée. Si on
regarde les courbes ln (% Activité résiduelle) en fonction du temps, on observe une
dénaturation plus lente et d’ordre 1. D’autre part, la deuxième étape de dénaturation de
l’enzyme sauvage (l’étape lente), reste plus rapide que la dénaturation observée pour le
mutant 244A.
223
Activité résiduelle
50°C
100%
75%
50%
25%
0%
0
250
500
750
1000
1250
60°C
100%
75%
50%
25%
0%
0
250
500
750
1000
1250
200
250
80
100
75°C
100%
75%
50%
25%
0%
0
50
100
150
90°C
100%
75%
50%
25%
0%
0
20
40
60
Figure III-30 : Courbe de dénaturation thermique de la lipase sauvage
( ) à différentes températures 50°C, 60°C, 75°C et 90°C.
224
(
)
et du variant 244A
50°C
ln (%Activité
résiduelle)
0
-2
y = -0,0023x
-4
R2 = 0,9402
-6
-8
0
250
500
750
1000
1250
60°C
ln (% Activité
résiduelle)
0
-2
-4
y = -0,0036x
-6
R2 = 0,9839
-8
0
250
500
750
1000
1250
75°C
ln (% Activité
résiduelle)
0
y = -0,0193x
R2 = 0,9254
-2
-4
-6
-8
0
50
100
150
200
250
90°C
ln (% Activité
résiduelle)
0
-2
y = -0,0466x
R2 = 0,9926
-4
-6
-8
0
20
40
60
80
Figure III-31: Représentation de courbes ln (% activité résiduelle) en fonction du temps pour
différentes températures 50°C, 60°C, 75°C et 90°C pour la lipase sauvage () et le variant 244A
( ). Calcul de pentes pour le variant 244A.
225
50°C
ln (%Activité
résiduelle)
0
y = -0,1284x
-1
R2 = 0,9953
-2
-3
-4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
16
18
20
60°C
ln (% Activité
résiduelle)
0
-1
-2
y = -0,4948x
R2 = 0,9695
-3
-4
0
2
4
6
8
10
12
14
75°C
ln (% Activité
résiduelle)
0
-1
-2
y = -1,2168x
R2 = 0,9183
-3
-4
0
2
4
6
8
10
90°C
ln (Activité
résiduelle)
0
-1
y = -0,9607x
R2 = 0,9679
-2
-3
-4
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Figure III-32 : Représentation de courbes ln (% activité résiduelle) en fonction du temps pour
différentes températures 50°C, 60°C, 75°C et 90°C pour la lipase sauvage () et le variant 244A
( ). Calcul de pentes pour la lipase sauvage.
226
La constante de dénaturation kd a été obtenue à partir des pentes des courbes ln (% Activité
résiduelle) en fonction du temps (première partie de la courbe pour la lipase sauvage), et les
temps de demi-vie calculés (t1/2 = (ln 2) / kd) sont récapitulés dans le tableau III-13.
Tableau III-13: Temps de demi-vie de l’enzyme sauvage et du variant 244A à différentes
températures.
Température
t1/2 wt
t1/2 244
Facteur
d'amélioration
50°C
5,4 min
301 min
56
60°C
1,4 min
178 min
127
75°C
0,6 min
36 min
63
90°C
0,7 min
15 min
21
A toutes les températures, le temps de demi-vie du mutant 244 est grandement amélioré par
rapport au temps de demi-vie de la lipase sauvage. Le facteur d’amélioration est d’un à deux
ordres de grandeur. A 60°C, le facteur d’amélioration est le plus important (127) : le temps de
demi-vie pour la lipase sauvage de seulement 1,4 min passe à presque 3 heures pour le mutant
obtenu par évolution dirigée.
4. Etude
détaillée
des
mécanismes
de
dénaturation
thermiques
4.1. Mutagenèse de saturation
Le mutant 244S isolé lors du premier tour d’évolution dirigée ainsi que le mutant 244A
présentent tous deux des thermostabilités améliorées par rapport à la lipase sauvage. La
position 244 semble donc fortement impliquée dans la thermostabilité de Lip2. Pour
caractériser plus finement le phénomène mis en jeu, la technique de mutagenèse de saturation
a été utilisée sur la position 244 à partir du plasmide JMP8, portant le gène de la lipase
sauvage sous contrôle du promoteur POX2. Un crible sur la thermostabilité a été réalisé sur
288 transformants. Parmi eux, 60% sont actifs (pente supérieure à 85 mUDO/min). Après
passage à 60°C pendant 20 minutes, 55% présentent une activité résiduelle inférieure à 4%.
La répartition de l’activité initiale de tous les mutants et leur activité résiduelle sont montrées
sur la figure III-33A. Les mêmes informations sur les mutants actifs sont reportées sur les
figures III-33 B et C.
227
1000
100%
800
80%
600
60%
400
40%
200
20%
0
0
50
100
150
200
% Activité résiduelle
pente mUDO/min
0%
300
250
1000
50%
800
40%
600
30%
400
20%
200
10%
0
Pente mUDO/min
Nombre transformants
0%
0
40
80
120
160
1000
50%
800
40%
600
30%
400
20%
200
10%
0
Pente mUDO/min
0%
0
40
80
120
160
Figure III-33 : Répartition de l’activité initiale et de l’activité résiduelle après passage 20
minutes à 60°C des mutants obtenus par mutagenèse de saturation de la position 244. A) Tous les
mutants classés par activité initiale, B) Tous les mutants actifs classés par activité initiale C) Tous les
mutants actifs classés par activité résiduelle.
Parmi les mutants ne possédant pas de thermostabilité, 3 clones ont été choisis au hasard pour
un séquençage. Parmi les clones actifs présentant une thermostabilité importante, sept ont été
séquencés. Les résultats concernant l’activité initiale, la thermostabilité, et les mutations
introduites sont reportés dans le tableau III-14.
228
Mutant
Activité
% d'activité
initiale U/mL résiduelle
Mutation gène
Mutation protéine
sauvage
244 A
2,30
2,02
1%
35%
TGC
GCC
Cys
Ala
n°1
n°2
n°3
n°4
n°5
n°6
n°7
n°8
n°9
n°10
0,62
1,92
1,69
0,73
0,39
1,78
0,29
2,39
2,38
2,44
42%
41%
36%
34%
32%
26%
11%
3%
3%
3%
GAC
CCC
GTC
GAC
GAC
TAC
CTC
TGC
TGC
TGC
Asp
Pro
Val
Asp
Asp
Tyr
Leu
Cys
Cys
Cys
Tableau III-14 : Activité initiale et activité résiduelle en microplaque après 15 min à 60°C pour
10 mutants obtenus par mutagenèse de saturation sur la position 244.
Parmi les variants qui possèdent une bonne activité et une bonne thermostabilité, le variant
244A est celui possédant la plus forte activité après la lipase sauvage. On notera que les
variant 244V et 244P possèdent eux aussi à la fois une bonne thermostabilité et une bonne
activité. Les autres mutants séquencés présentent des activités variables. Par ailleurs, parmi
les mutants obtenus, 40% ne possèdent pas du tout d’activité. Ceci laisse penser que la
position 244 a un rôle important dans l’activité de la protéine.
Parmi les trois mutants sélectionnés ne présentant pas de thermostabilité, tous correspondent à
la lipase native, ce qui laisse supposer que c’est la cystéine qui est responsable de la faible
thermostabilité. Nous noterons tout de même que 55% des clones actifs ne présentent pas de
thermostabilité (soit 33% de la population totale), ceci signifierait donc une sur-représentation
de la cystéine dans cette banque de saturation sur la position 244. Ceci semble possible, en
effet, si on s’intéresse aux mutations introduites, on s’aperçoit que tous les mutants portent
une cytosine comme dernier codon (comme le codon de la matrice initiale), alors que la
position 244 était codée par un codon dégénéré de type NNS (S étant un C ou G). On aurait
donc dû obtenir autant de G que de C à cette position. Ainsi, on peut s’imaginer que les
amorces portant le codon d’origine se sont hybridées plus facilement. Une autre possibilité est
une digestion incomplète de la matrice initiale par Dpn1. Quoi qu’il en soit, sur 3 mutants
non thermostables séquencés tous portent une cystéine à la position 244, ce qui laisse
supposer un rôle de cet acide aminé dans le mécanisme de dénaturation thermique. Il est à
noter que les cystéines peuvent jouer un rôle dans l’agrégation des protéines par la formation
de ponts disulfures intermoléculaires. En effet, les cystéines sont des acides aminés très
réactifs dans les protéines. Leur auto-oxydation peut conduire à la formation de produits
229
d’oxydation comme l’acide sulfénique (R-SOH), l’acide sulfinique (R-SO2H) et l’acide
sulfonique (R-SO3H) ou à la formation de ponts disulfures intra ou inter moléculaires. Par
exemple, dans le cas de la dénaturation thermique de l’α-amylase, c’est l’autooxydation de la
cystéine libre en 30% d’acide sulfénique et 70% de pont disulfures intramoléculaires qui est
responsable de l’inactivation de la protéine (Tomazic and Klibanov, 1988).
4.2. Mise en évidence de l’agrégation et de l’échange des ponts
disulfures.
Pour vérifier si ce mécanisme intervient dans la dénaturation thermique de l’enzyme, la lipase
sauvage et le mutant 244A produits sous contrôle du promoteur TEF (non agrégés) en milieu
riche et purifiés ont été chauffés à 60°C. Des prélèvements ont été réalisés à différents temps
et analysés en chromatographie d’exclusion stérique (Figure III-34)
WT
244A
Lipase agrégée
Lipase agrégée
Temps d’incubation à
60°C
0 min
0,5 min
1 min
5 min
4h
Temps d’incubation à
60°C
Lipase
non
agrégée
0 min
0,5 min
1 min
5 min
4h
Lipase
non
agrégée
Figure III-34 : Profil d’agrégation de la lipase sauvage et du mutant 244A après
différents temps d’incubation à 60°C. Analyse par chromatographie d’exclusion stérique
Dès les premières minutes de chauffage, la lipase sauvage et le mutant 244A s’agrègent. On
notera que pour 1 minute de dénaturation, il reste encore de la lipase 244A non agrégée alors
que toute la lipase sauvage est agrégée. Il est cependant difficile de suivre précisément cette
cinétique d’agrégation, car la concentration d’enzyme inactivée n’est pas assez élevée pour
que les protéines soient détectées clairement en sortie de chromatographie d’exclusion
stérique. Deux principaux mécanismes sont responsables de l’agrégation observée lors de la
dénaturation thermique ; la cinétique et l’importance relative de chacun d’eux varient selon
les protéines et les conditions de dénaturation (force ionique, pH…). Le premier mécanisme
d’agrégation peut avoir lieu pour diminuer l’exposition des parties hydrophobes dues à la
perte de la conformation de la protéine. Dans un deuxième mécanisme, les cystéines (libres ou
impliquées dans un pont disulfure) qui ne sont pas accessibles dans la forme native de la
230
protéine peuvent devenir réactives suite à leur exposition due à la perte de la conformation de
la protéine, et ainsi des réarrangements de ponts disulfures peuvent avoir lieu.
Dans le but de mieux comprendre le mécanisme mis en jeu, les fractions agrégées ont été
récupérées en sortie de chromatographie d’exclusion stérique et des analyses ont été réalisées
par gel SDS page (Figure III-35), les échantillons ayant été préalablement traités avec ou sans
4h
WT
244A
5 min
1 min
4h
WT
244A
WT
244A
WT
244A
5 min
WT
244A
0 min
1 min
WT
244A
Masse
moléculaire
(kDa)
WT
244A
0 min
WT
244A
agent réducteur. La lipase non agrégée a aussi été déposée comme contrôle.
97,4
66,3
55,4
36,5
31,0
21,5
14,4
sans agent réducteur
avec agent réducteur
Figure III-35 : Gel SDS Page des fractions agrégées collectées sortie de chromatographie
d’exclusion stérique obtenues pour différents temps d’incubation à 60°C pour la lipase native et
le mutant 244A. La lipase non agrégée (0 minute) a aussi été déposée sur le gel pour contrôle. A
droite le gel des échantillons traités sans agent réducteur, à gauche le gel des échantillons traités avec
agent réducteur.
Si on ne met pas d’agent réducteur, la lipase non agrégée sort à la taille attendue, par contre la
lipase agrégée laisse un smear sur le gel et ne sort pas à la taille attendue mais sous différentes
formes de tailles supérieures. La lipase reste donc agrégée même après dénaturation en
présence de SDS. Ceci met en évidence que les agrégats sont reliés entre eux par des liaisons
covalentes ; en effet de simples interactions hydrophobes sont détruites par ce type de
dénaturant. Généralement, pour les gels SDS page, un agent réducteur est utilisé pour réduire
les ponts disulfures. Ici, l’utilisation d’un agent réducteur sur les fractions agrégées permet de
retrouver la taille attendue de la lipase. Ceci signifie donc que ces agrégats sont très
probablement reliés entre eux par des ponts disulfures intermoléculaires. Ceci n’exclue pas
pour autant d’autres interactions de type hydrophobe dans ces agrégats.
231
4.3. Perspectives
4.3.1.
Discussion sur le système d’expression
Le problème de l’acide oléique
Le système de criblage mis au point a permis d’identifier le mutant 244A comme ayant une
thermostabilité améliorée. Cependant, de nombreux faux positifs ont été obtenus, et les étapes
de vérification ont été coûteuses en temps, pour finalement ne pas réussir à identifier avec
certitude des variants améliorés de deuxième génération. De plus, la caractérisation du variant
isolé lors du premier tour d’évolution dirigée a nécessité le changement du système
d’expression. Ainsi, pour réaliser des banques destinées au criblage de la thermostabilité, le
système mis au point précédemment présente encore quelques inconvénients. L’acide oléique
utilisé pour l’induction de l’expression protéique est en grande partie à l’origine de ces
troubles car il semble être la source de la variabilité importante entre les cribles.
Deux solutions sont envisageables pour améliorer le système.
La première consisterait à utiliser TEF et non POX2 comme promoteur pour la réalisation de
la banque. Cependant les transformations réalisées avec TEF comme promoteur donnent des
transformants avec une grande hétérogénéité de tailles, ce qui semble signifier que
l’intégration n’a pas lieu (seulement) à la plate-forme d’intégration. Une explication possible
est qu’à proximité du promoteur TEF, l’expression du gène Ura3d1 ne soit pas très bonne.
Ceci conduit à des intégrations multicopies et explique la différence de taille entre les
transformants. Une vérification du nombre de copies par Southern sur différents transformants
pourrait être réalisée pour confirmer cette hypothèse. L’utilisation de ce promoteur rend donc
inefficaces les améliorations apportées par la souche zéta, car la reproductibilité de
l’expression n’est plus possible à cause de la variabilité génétique des transformants.
Cependant, une complémentation avec d’autres marqueurs de sélection qui ne seraient pas
affectés par la proximité du promoteur TEF reste tout à fait envisageable.
L’autre solution serait de continuer d’utiliser le système déjà en cours mais sans acide
oléique. A partir d’un clone possédant Lip2 sous contrôle du promoteur POX2, plusieurs
cultures ont été réalisées en microplaques dans des milieux différents avec ou sans acide
oléique et avec ou sans glucose (48 puits par conditions). Les résultats préliminaires sont
donnés dans le tableau III-5. Cette manipulation n’a pas été réalisée avec les robots de la
plate-forme de criblage.
232
Tableau III-15 : Activité et coefficient de variation obtenus pour 48 puits à partir du même clone
dans différents milieux de culture.
Milieux
pente
(mUDO/min)
CV %
YTO0,25
YTD0,025O0,25
YT
YTD0,1
333
319
301
103
14%
21%
6%
14%
L’activité la plus faible est mesurée pour les clones ayant poussé en présence de glucose à
1 g/L. Ceci confirme que le glucose a un effet répresseur sur le promoteur POX2. Les plus
fortes activités quant à elles sont trouvées pour les milieux contenant de l’acide oléique. La
présence de glucose ne semble pas avoir d’effet répresseur sur la quantité de lipase produite.
Ceci s’explique par le fait qu’il a été introduit dans des quantités très faibles (0,25 g/L) dans le
but d’aider au démarrage de la croissance. Pour le milieu ne contenant ni acide oléique, ni
glucose, une activité quasi identique aux activités obtenues en présence d’acide oléique est
observée. Ces résultats préliminaires permettent d’envisager une expression de lipase en
microplaque avec le promoteur POX2 sans l’utilisation d’acide oléique. Le système devra être
validé par une analyse statistique sur un plus grand nombre de clones. Les banques de mutants
ont été conservées et pourraient être soumises à ce système de criblage.
L’effet de la concentration en protéine
Nous venons de voir que la concentration en protéine était un facteur prépondérant dans
l’agrégation de Lip2 lors de sa dénaturation thermique. Ceci met en évidence l’intérêt du
système d’expression mis au point. En effet, la standardisation de l’expression protéique évite
l’apparition de faux positifs qui ressortiraient plus thermostables à cause d’un niveau
d’expression bas et donc d’une concentration plus faible en solution.
Cependant, une des limites de notre système de criblage repose sur la concentration de
protéine produite, bien plus faible que la concentration visée de l’enzyme. A de faibles
concentrations, la mutation de la cystéine libre a un effet sur la cinétique d’agrégation, et la
thermostabilité est largement améliorée, toutefois à des concentrations plus importantes,
l’amélioration de la thermostabilité est bien moindre. Cet inconvénient n’est pas spécifique au
système de criblage développé avec la levure Y. lipolytica, mais est retrouvé dans tous les
systèmes de criblage haut-débit qui nécessitent la miniaturisation des conditions de culture et
d’expression protéique. D’autre part, cet inconvénient ne sera un problème que si la
caractéristique à améliorer est dépendante de la concentration en protéine, comme dans notre
233
cas où la dénaturation thermique est dépendante de l’agrégation (donc de la concentration) des
protéines.
Conclusion
Le système de criblage mis au point présente des imperfections, notamment à cause de la
présence d’acide oléique ; nous avons discuté plusieurs méthodes pour remédier à ce
problème (changement du promoteur et du système de sélection et expression protéique sans
acide oléique avec le système existant). D’autre part, la miniaturisation de toutes les étapes
(croissance et expression protéique), nécessaire au maintien d’un haut débit de criblage, a
pour conséquence d’avoir une production faible de lipase et a conduit à isoler un mutant, qui
une fois exprimé à plus grande échelle, ne présentait pas l’amélioration de la thermostabilité
attendue. Ce type de problème n’est pas spécifique de l’expression des protéines dans la
levure de Y. lipolytica et s’applique à tous les systèmes de criblage où la miniaturisation est
nécessaire. En outre, il est spécifique de phénomènes où la concentration en protéine va
moduler la caractéristique à améliorer, c’est le cas des mécanismes d’agrégation intervenant
dans la dénaturation thermique des protéines. Dans notre cas, ce mécanisme de dénaturation
pourrait peut-être être atténué en travaillant à pH acide car le phénomène de réarrangement
des ponts disulfures à pH acide est de faible ampleur (voir partie suivante). Si l’agrégation par
ce biais peut être annihilée, alors un crible à pH acide permettant de mettre en évidence
d’autres moyens d’améliorer la thermostabilité de Lip2 peut être envisagé.
4.3.2.
Discussion sur le réarrangement des ponts disulfures
Nous avons montré que l’un des mécanismes prépondérants intervenant dans la dénaturation
de Lip2 était son agrégation rapide sous forme d’agrégats reliés entre eux par des ponts
disulfure intermoléculaires. Ce phénomène d’interchange des ponts disulfures est bien
documenté dans la littérature (Volkin and Klibanov, 1987). Ce mécanisme est initié par une
attaque nucléophile des ions thiolates sur un pont disulfure existant. Ainsi, la présence d’une
cystéine libre dans la protéine qui représente un groupement thiol potentiellement réactif peut
initier ce réarrangement des ponts disulfures. L’amélioration de la thermostabilité observée
lorsque la cystéine 244A est mutée par n’importe quel autre acide aminé va dans ce sens. Un
tel phénomène a déjà été observé dans la littérature. Ainsi, pour la β-lactoglobuline qui
contient une cystéine libre et deux ponts disulfures, si la cystéine libre est complexée avec du
N-éthylmaleimide (Kitabatake, et al., 2001), ou si elle est remplacée par une sérine (Jayat, et
al., 2004), alors, les phénomènes d’agrégation intermoléculaires qui ont lieu avec la protéine
234
native sont totalement annihilés. Dans notre cas, la mutation de la cystéine libre 244 a permis
de diminuer la rapidité de ce phénomène (aux faibles concentrations) sans pour autant le
stopper. En effet, des ions thiolates peuvent être générés sans qu’il y ait besoin d’avoir une
cystéine libre dans la protéine initiale, ils sont issus de la β-élimination des ponts disulfures et
catalysent le réarrangement des ponts disulfures. Ainsi, la réaction est rapide à pH basique
(car le pKa des thiols dans les protéines varie généralement entre 8 et 9,5 et que la βélimination est favorisée à ces pH) et quasi inexistante à pH acide. De la réactivité des
cystéines et des conditions de dénaturation (pH, force ionique, présence d’autres composés
dans le milieu) dépendra l’importance de ce mécanisme. Ce mécanisme d’interchanges de
ponts disulfures est exploité dans certains cas ; en effet le contrôle des conditions de
dénaturation peut aboutir à une polymérisation contrôlée pour la fabrication de gels
alimentaires aux propriétés rhéologiques intéressantes (Alting, et al., 2004).
Ce mécanisme est compatible avec le positionnement des cystéines dans le modèle de la
structure 3D de Lip2 (Figure III-36) dont la construction est détaillée dans la troisième partie
de ce manuscript, celles-ci sont reparties en deux groupes. Le premier groupe est composé par
les cystéines 30 et 299 d’une part, et les cystéines 43 et 47 d’autre part. Le deuxième groupe
est constitué par la cystéine 244 et les deux ponts disulfures restants Cys 120-123 et Cys 265273. Ce positionnement des cystéines à proximité les unes des autres rend possible les
mécanismes de réarrangement de ponts disulfures intramoléculaires. Par ailleurs, tous les
ponts disulfures se situent à la surface de la protéine, ce qui rend possible les réarrangements
intermoléculaires. On notera que même si la cystéine libre 244 est assez enfouie, cela
n’exclue pas le fait qu’elle soit capable de réaliser des ponts disulfures intermoléculaires, car
les premières étapes de la dénaturation thermique peuvent conduire à un dépliement de la
protéine qui peut rapprocher certaines zones a priori éloignées.
Cys 120-123
Cys 120-123
Cys 43-47
Cys 43-47
Cys 244
Cys 244
Cys 30-299
Cys 30-299
Cys 265-273
Cys 265-273
Figure III-36 : Modèle de la structure tridimensionnelle de la lipase Lip2. Les cystéines
impliquées dans des ponts disulfures sont colorées en vert, la cystéine libre 244 en rose. A) Forme
ruban. Les cystéines ont été représentées en mode CPK. B) Mode surface.
235
La compréhension de ce mécanisme de dénaturation ouvre la voie à de nombreuses
possibilités pour améliorer la thermostabilité de Lip2 et permet de comprendre des
phénomènes observés au cours de cette thèse :
•
Pour expliquer le rôle de l’acide oléique dans la thermostabilité de Lip2, on notera que la
présence d’une interface peut changer la structure tridimensionnelle de la protéine et
exposer les groupements sulfhydryl et les cystéines dans une conformation qui les rend
plus réactifs (Visschers and de Jongh, 2005). Ainsi, un groupement sulfhydryl est
responsable de la polymérisation de protéines en présence d’une interface eau/chlorure de
méthylène (Sah, 1999).
•
Comme le mécanisme d’interchange des ponts disulfures est quasi inexistant à pH acide,
une étude de la thermostabilité de Lip2 dans ces conditions serait intéressante ; jusque là
aucune étude n’a étudiée la thermostabilité de la lipase dans ces conditions. Or, Lip2 est
également étudiée pour sa stabilité à pH acide. On peut espérer une thermostabilité
améliorée si le phénomène d’agrégation était enrayé à ces pH acides. Rappelons que la
composante « interchange des ponts disulfures » n’est pas le seul phénomène impliqué
dans l’agrégation des protéines qui peuvent aussi s’agréger pour éviter l’exposition de
zones hydrophobes. De même, un crible de la thermostabilité dans des conditions de pH
acides sur les banques déjà obtenues permettrait peut être d’améliore, non pas la
thermostabilité cinétique de Lip2 (phénomène d’agrégation) mais la thermostabilité
thermodynamique de la lipase.
•
Nous avons vu que l’agrégation était responsable de la dénaturation thermique de Lip2.
Une des techniques pour éviter l’agrégation est d’immobiliser la lipase sur un support
inerte ainsi, le phénomène d’agrégation et la formation de ponts disulfures
intermoléculaires ne peuvent avoir lieu et la stabilité de la lipase s’en trouvera très
certainement améliorée. Une procédure d’immobilisation est actuellement en cours au
laboratoire. Cette immobilisation de l’enzyme permettrait par ailleurs de pouvoir
travailler dans des conditions non aqueuses (en solvant organique), ce qui a pour effet
empêcher les mécanismes de dénaturation liés à l’eau.
•
Si on s’intéresse maintenant aux autres lipases de la famille de Y. lipolytica et que l’on
considère l’hypothèse selon laquelle l’interchange de ponts disulfures est une cause
majeure dans la dénaturation thermique de Lip2, on s’aperçoit que la lipase Lip2 de
Y. lipolytica possède trois cystéines supplémentaires par rapport aux lipases homologues
236
et que la cystéine libre 244 n’est présente chez aucune de ses homologues (Figure III-37).
Cette représentation surnuméraire des cystéines (dont une cystéine libre) explique
probablement la sensibilité de Lip2 aux mécanismes de réarrangement de ponts
disulfures.
Lipase de
R. miehei
C30
C40 C43
C235 C244
C268
Lipase de
R. niveus
C29
C40 C43
C235 C244
C 268
Lipase de
T. lanuginosa
C22
C36 C41
C104 C107
Lipase de
Y. lipolytica
C30
C43 C47
C120 C123
C 268
C244
C265 C273
C 299
Figure III-37 : Arrangement des ponts disulfures chez la lipase Lip2 (prédictions) et chez les
lipases homologues de structures connues.
Une des voies pour améliorer la thermostabilité de cette lipase passe peut être par l’ingénierie
des ponts disulfures. Les ponts disulfures conservés pour toutes ces lipases sont les pont C4347 et C30-C299. La délétion de ce dernier chez la lipase de Y. lipolytica entraîne une lipase
très peu active (voir pagraphe 2.1.1.c de la troisème partie du chapitre résultat) et la
construction de ce pont dans la lipase de P. camembertii a pour effet d’améliorer la
thermostabilité de cette lipase. Par contre, les lipases homologues possèdent soit les
homologues des cystéines 120-123 (c’est le cas pour la lipase de T. lanuginosa), soit les
homologues des cystéines 265-273 (c’est le cas pour les lipases de R. miehei et R. niveus),
alors que la lipase Lip2 possède ces deux ponts disulfures. La délétion des ponts disulfures
120-123 et 265-273, qui ne sont pas unanimement conservés dans toutes les protéines
homologues nous semble une stratégie judicieuse et plus particulièrement, la délétion du pont
disulfure 265-273 car celui-ci est absent de la lipase de T. lanuginosa réputée pour sa
thermostabilité.
237
5. Conclusion générale :
Le système d’expression mis au point pour l’évolution dirigée d’enzymes chez la levure
Y. lipolytica a permis d’isoler un mutant thermostable. Ce mutant présente des temps de
demi-vie améliorés de un à deux ordres de grandeur par rapport à la lipase native. A 60°C le
temps de demi-vie du variant amélioré est 127 fois plus important que celui de la lipase
native !
La caractérisation de ce mutant a nécessité un changement de système d’expression. En
effet, le promoteur POX utilisé était induit par les acides gras, ce qui conduisait à la formation
de lipase dans des complexes lipides-enzymes de hauts poids moléculaires. Ceci nous a
amenés à utiliser et caractériser un promoteur rarement utilisé chez cette levure : le promoteur
TEF. Ce promoteur présente un avantage dans le cadre de notre étude car il est constitutif et
permet d’exprimer la lipase au fur et à mesure de la croissance en l’absence d’acide gras. La
lipase produite dans ces conditions est alors sous forme non agrégée. Par ailleurs, c’est un
promoteur fort qui permet en présence d’acide gras d’obtenir des productions d’enzyme deux
fois plus importantes qu’avec le promoteur POX. Pour la caractérisation de ce mutant, nous
avons été également amenés à développer un système efficace de purification de la lipase
Lip2 qui conduit à une monobande sur gel d’électrophorèse coloré au nitrate d’argent.
La caractérisation de la thermostabilité de ce mutant nous a par ailleurs permis de mettre en
évidence que les mécanismes prépondérants intervenant dans la dénaturation de Lip2
étaient l’agrégation et l’interchange de ponts disulfures. La compréhension fine de ce
mécanisme de dénaturation a permis de proposer des améliorations possibles de la
thermostabilité de Lip2, soit en jouant sur l’enzyme elle-même (ingénierie rationnelle des
ponts disulfures), soit en modulant les conditions de mise en œuvre (milieu à pH acide,
immobilisation de l’enzyme et mise en œuvre en solvants organiques). Ainsi, des tests
complémentaires restent à réaliser, non seulement pour continuer la caractérisation du variant
amélioré (et notamment étudier l’effet de la mutation sur l’optimum d’activité de l’enzyme)
mais aussi pour mieux comprendre les mécanismes de dénaturation de l’enzyme selon les
conditions d’utilisation (pH, milieux non aqueux…). En outre, le criblage de la banque des
5500 mutants de deuxième génération dans de nouvelles conditions (sans acide oléique ou à
pH acide) reste une voie de choix pour continuer d’améliorer la thermostabilité de Lip2.
238
Troisième partie : Vers la résolution de la structure
tridimensionnelle de la lipase Lip2
La lipase Lip2 a déjà de nombreuses applications sur un plan biotechnologique, elle est déjà
utilisée dans la dépollution des effluents chargés en matière grasse et le maintien de son
activité à pH acide sur les substrats à longue chaîne carbonée en font un candidat de choix
pour le traitement de l’insuffisance pancréatique exocrine humaine (Aloulou et al., 2007).
Cette maladie, due à une déficience en lipase pancréatique, se traduit par une incapacité à
digérer les lipides. La lipase Lip2 est actuellement en cours d’évaluation clinique pour son
utilisation en tant que substitut à la lipase pancréatique humaine, et pourrait donc être
prescrite auprès de patients souffrant de cette déficience (malades souffrant de la
mucoviscidose entre autres). Ce biocatalyseur possède par ailleurs des intérêts dans le
domaine des biotransformations de par sa sélectivité envers différentes classes de substrats
d’intérêt industriel (Tableau I-12).
Ainsi, la lipase Lip2 possède une énantiosélectivité envers les esters d’acides bromo-phénylacétiques (Figure III-38) (Guieysse, et al., 2004). Ces composés sont d’un grand intérêt dans
l’industrie pharmaceutique, car ce sont des précurseurs à de nombreuses classes de
médicaments comme la prostaglandine, la protacycline, les pénicillines semi-synthétiques, et
les sels de thiazolium. La lipase Lip2 présente notamment une énantiosélectivité très marquée
(et jusque là jamais observée pour les autres lipases énantiosélectives sur ce type de
composés) envers les esters d’acides bromo-phényl-acétiques substitués en position ortho par
un groupe méthyle. Ces composés interviennent dans la synthèse d’analgésiques et
d’antagonistes non peptidiques au récepteur II de l’angiotensine. Bien que la lipase Lip2
montre une énantiosélectivité plus importante que celles auparavant décrites dans la littérature
pour ce type de composés (E=27 en faveur du composé S contre E =11 pour la lipase de
R. miehei immobilisée sur polypropylène dans le cas d’une transestérification entre l’ester
éthylique de cet acide et l’octanol), l’énantiosélectivité obtenue reste insuffisante pour une
application pharmaceutique où une énantiosélectivité supérieure à 200 est requise.
239
Br
Br
O-Eth
O
CH3
Lipase
O
+ Octanol
R, S
Br
O-Oct
CH3
RS
O-Eth
+
O
CH3
+ Ethanol
SR
Figure III-38 : Exemple de réaction de transestérification entre un ester éthylique d’acide bromo
phényl acétique et l’octanol catalysé de manière énantiosélective par la lipase Lip2 de
Y. lipolytica.
La lipase Lip2 de Y. lipolytica présente par ailleurs une sélectivité intéressante envers le DHA
(l’Acide DocosaHexaènoïque voir figure III-39). Cet acide gras de la famille des Oméga 3 est
retrouvé dans les poissons gras (saumon, thon, hareng, sardine, maquereau…). Il possède un
grand nombre de vertus, il a notamment des effets bénéfiques sur la prévention des risques de
maladies cardiovasculaires, et joue un rôle important dans la vision, le système nerveux, le
cerveau. Ses propriétés nutraceutiques sont exploitées dans le cadre de commercialisation de
compléments alimentaires enrichis en DHA. Lip2 est capable de concentrer les esters
éthyliques de DHA à 85 % à partir d’un mélange d’esters éthyliques issus d’huile de thon
contenant 25% d’ester de DHA.
Figure III-39 : Molécule de DHA
Dans de nombreux cas, bien que la sélectivité de la lipase soit intéressante, elle n’est pas
suffisante pour une application industrielle et demande à être améliorée. La compréhension
des mécanismes de sélectivité de la lipase et l’étude des relations structure-fonction pourrait
permettre d’améliorer par évolution rationnelle la sélectivité de cette lipase envers les
différents substrats d’intérêt industriel. Cependant, pour que de telles études soient possibles,
il faut avoir accès à la structure tridimensionnelle de l’enzyme. A ce jour la structure de cette
lipase d’intérêt n’a pas été résolue C’est pourquoi nous nous sommes lancés dans l’étude
structurale de cette lipase d’intérêt. La méthode la plus utilisée pour la résolution de structure
des protéines est la méthode de cristallographie des protéines et la diffraction aux rayons X.
Pour ce type d’expérience, il est nécessaire de disposer d’enzyme purifiée en grande quantité.
Ce chapitre présentera donc les différentes étapes que nous avons suivies pour tenter de
résoudre la structure de cette lipase d’intérêt.
240
1. De la production de la lipase aux premiers essais de
cristallisation
1.1. Production d’enzyme utilisable pour les essais de cristallisation.
La lipase de Y. lipolytica est naturellement sécrétée par la levure sauvage. Cependant, les
souches sauvages ne sont pas adaptées pour la production de protéines notamment à cause de
la sécrétion de protéases. La lipase a donc été exprimée de manière homologue dans une
souche de Y. lipolytica modifiée, plus appropriée à la production de protéines recombinantes :
la souche JMY1165. Cette souche est issue de la souche po1d qui comme nous l’avons vu
dans le chapitre bibliographique présente de nombreux avantages ; elle permet notamment de
hauts niveaux de production de protéines et la protéase extracellulaire alcaline a été délétée.
Cette souche ne possède pas de zone Zéta. D’autre part, elle est auxotrophe à l’uracile et les
gènes de la lipase sauvage, ainsi que de deux autres lipases (Lip7 et Lip8) ont été délétés. Une
cassette d’expression contenant la lipase sous contrôle du promoteur POX2 inductible à
l’acide oléique a été insérée dans cette souche : la nouvelle souche est la souche que nous
avons communément utilisée pour produire la lipase. Pour produire la lipase dans ce système
d’expression, une première phase de croissance est réalisée sur glucose et une seconde phase
d’expression a lieu en présence d’acide oléique. Celui-ci joue à la fois le rôle d’inducteur et de
source de carbone. La production de lipase dans ces conditions conduit à la formation d’une
enzyme très pure comme on peut le voir par analyse SDS page (voir figure III-42) :
1.1.1.
Site de glycosylation et cystéine libre
Pour les essais de cristallogenèse, il a été décidé de réaliser les premiers tests avec l’enzyme
sauvage et plusieurs variants de l’enzyme.
Il a tout d’abord été décidé de travailler avec un variant non glycosylé de Lip2 car la
glycosylation des enzymes peut gêner leur cristallisation. En effet, même si certaines
protéines ont pu être cristallisées en présence d’une chaîne de glycosylation (Imberty and
Perez, 1995), il est communément admis que des cristaux de bonne qualité sont souvent
difficiles à obtenir à cause de l’hétérogénéité, la flexibilité, et la mobilité des chaînes de
glycosylation. Il est donc nécessaire d’étudier plus en détail la glycosylation de la lipase Lip2.
La N-glycosylation se fait au niveau des asparagines situées dans les séquences consensus
Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, où X est un acide aminé quelconque. On notera que la O241
glycosylation des protéines est aussi possible mais que, à ce jour, les déterminants de cette
glycosylation n’ont pas encore été totalement élucidés. La lipase Lip2 de Y. lipolytica est une
lipase glycosylée (Pignede, et al., 2000a). L’analyse de la séquence primaire de la lipase de
Y. lipolytica a permis d’identifier deux sites potentiels de N-glycosylation Asn113-Ile114Ser115 et Asn134-Asn135-Thr136. Pour vérifier ces prédictions, nous avons, en collaboration
avec l’INRA de Grignon (Laboratoire de Chimie Biologique et Laboratoire de Microbiologie
et Génétique Moléculaire), tenté d’analyser plus en détail la structure de la protéine par
Spectrométrie de masse couplée avec la chromatographie liquide.
Plusieurs analyses ont été réalisées. La protéine a été digérée par différentes protéases, la
trypsine qui coupe les protéines après une lysine (K) ou une arginine (R) ou l’endoprotéase
Asp-N qui coupe avant un acide aspartique (D). Après digestion de la protéine par les
protéases, les fragments sont alors séparés en fonction de leur masse par HPLC et leur masse
déterminée à l’aide d’un spectromètre de masse.
Ainsi l’analyse de la digestion trypsique de la protéine après réduction au DTT et alkylation
par la 4 vinyl pyridine des cystéines, permet de retrouver tous les fragments à la taille
attendue sauf le fragment correspondant au peptide Ile100-Lys143 (Figure III-40). Ce peptide
contient les deux sites de glycosylation potentiels. D’autre part des peptides de taille
moléculaire plus élevée sont observés. La lipase Lip2 est donc glycosylée sur au moins un des
deux sites. Pour affiner ce résultat et identifier précisément la position des sites de
glycosylation, la protéine réduite au DTT et alkylée par la 4 vinyl pyridine a été digérée par
l’endoprotéase Asp-N qui coupe entre les deux sites de glycosylation potentiels (Figure III41). A nouveau l’analyse HPLC/MS permet d’identifier tous les fragments à la taille attendue
sauf les deux fragments Leu110-Asp121 et Cys123-Asp245 contenant respectivement les sites
de glycosylation Asn113-Ile114-Ser115 et Asn134-Asn135-Thr136. De même, des peptides
de taille moléculaire plus élevée sont observés. De cette analyse, on déduit que la lipase Lip2
est glycosylée sur les deux sites de glycosylation. La déglycosylation de l’enzyme par
endoglycosydase endoHf (NEB), conduit à l’obtention des peptides de taille attendue et les
peptides de masse moléculaire plus élevée disparaissent.
242
18
FEK / YAR / LANIGYCVGPGTK / IFK / PFNCGLQCAHFPNVELIEEFHDPR / LIFDVSGYLAV 74
75
DHASK / QIYLVIR / GTHSLEDVITDIR / IMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPK / 143
144 LDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLK / VNGHDPLVVTLGQ 189
190 PIVGNAGFANWVDK / LFFGQENPDVSK / VSK / DR / K / LYR / ITHR / GDIVPQVPFWDGYQHCSGEV 248
249 FIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNK / QCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI 301
Figure III-40 : Profil de digestion de la lipase Lip2 de Y. lipolytica par la trypsine, (après les
résidus lysine et arginine). Si la digestion a lieu après réduction au DTT et alkylation par la 4 vinyl
pyridine des cystéines, tous les fragments sont à la taille attendue sauf le fragment Ile100-Lys143
(entouré en gras) contenant les deux sites potentiels de glycosylation (surlignés en gris).
18
FEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFH /DPRLIF / DVSGYLAV / DHASKQIYLVI 85
86
RGTHSLE / DVIT / DIRIMQAPLTNF / DLAANISSTATC / D / DCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKL / 144
145
DSVIEQYP /DYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGH / DPLVVTLGQ 189
190 PIVGNAGFANWV / DKLFFGQENP / DVSKVSK / DRKLYRITHRG / DIVPQVPFW / DGYQHCSGEV 248
249 FI / DWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI 301
Figure III-41 : Profil de digestion de la lipase Lip2 de Y. lipolytica par l’endoprotéase Asp-N,
(coupure avant les acides aspartiques). Si la digestion a lieu après réduction au DTT et alkylation par
la 4 vinyl pyridine des cystéines, tous les fragments sont à la taille attendue sauf les fragments
Leu110-Asp121 et Cys123-Asp245 (entouré en gras) contenant respectivement les sites de
glycosylation Asn113-Ile114-Ser115 et Asn134-Asn135-Thr136 glycosylation (surlignés en gris).
Comme la glycosylation peut être un frein à la cristallisation, nous avons décidé de déléter les
deux sites de glycosylation identifiés. La sérine 115 et la thréonine 136 ont été nos premières
cibles de mutagenèse dirigée, toutes deux ont été changées par une valine. Les deux variants
sont correctement excrétés chez Y. lipolytica (voir gel d’électrophorèse Figure III-42),
cependant, le variant T136V ne présente pas d’activité enzymatique (voir tableau III-16 pour
les activités pNPB mesurées pour la lipase sauvage et les mutants). La suppression de ce site
de glycosylation a donc été obtenue par la mutagenèse de l’asparagine 134 en glutamine.
Celui-ci présente une activité presque trois fois supérieure à la lipase sauvage. Le double
mutant 115-134 a aussi été construit et exprimé chez Y. lipolytica, la lipase sécrétée est active,
elle aussi présente une activité légèrement supérieure par rapport à la lipase sauvage. On
notera cependant que l’augmentation de l’activité hydrolytique par unité de volume des
variants est peut-être due à des quantités d’enzyme sécrétées plus ou moins importantes. En
243
effet, dans ce cas la lipase Lip2 et ses variants n’ont pas été construits dans la souche
JMY1212. Une analyse plus fine des activités ne peut se faire qu’à partir d’un dosage de
protéine et la détermination des activités spécifiques.
La différence de taille observée sur les gels d’électrophorèse (Figure III-42) entre la lipase
sauvage et les mutants de simple et double déglycosylation (Figure X), montre que les deux
sites précédemment identifiés sont effectivement glycosylés. Un traitement avec une
endoglycosidase permet d’atteindre la même taille que pour le double mutant déglycosylé.
Ainsi la lipase Lip2 possède deux sites de glycosylation en position 113 et 134, mais la
glycosylation n’est pas nécessaire pour le maintien de l’activité catalytique. De tels résultats
avaient déjà été obtenus par d’autres équipes (Aloulou, et al., 2007b; Pignede, et al., 2000a;
Yu, et al., 2007b), mais les mutants de glycosylation permettent de s’affranchir d’une étape
supplémentaire.
1
2
3 4
5
6 M2
Masse
moléculaire
(kDa)
100
75
50
37
25
20
15
Figure III-42 : Gel d’électrophorèse de Lip2 sauvage (puits 1) et des variants de glycosylation.
Lipase sauvage (puits 1), 115 V (puits2), 134Q (puits 3), 136V (puits 4), 115-134 (puits 5) et 115-136
(puits 6).
Tableau III-16 : Récapitulatif des activités pNPB de la lipase sauvage et des variants de
glycosylation.
Variant
Activité U/mL
Sauvage
21,6
115 V
36,1
134Q
58,9
136V
0,5
115V-134 Q
27,9
115V-136V
1,0
244A
18,2
115V-134Q-244A
11,0
244
Ces résultats ont donné lieu à une publication « Analysis of Yarrowia lipolytica
extracellular lipase Lip2p glycosylation » (2007) dans FEMS Yeast Reseach.
La présence de cystéine libre quant à elle, peut favoriser la formation de ponts disulfures
intermoléculaires, et être un inconvénient pour les expériences de cristallisation (Koch, et al.,
2006). D’après les conclusions concernant l’arrangement des ponts disulfures (paragraphe
2.1.1.c de cette partie), la lipase Lip2 de Y. lipolytica possède une cystéine libre en position
244. Cet acide aminé a donc été muté en alanine par mutagenèse dirigée et le triple mutant
115-134-244 a été construit.
1.1.2.
Développement d’un système d’expression pour produire de la
lipase non agrégée
Avant de se lancer dans des essais de cristallisation, plusieurs point doivent être vérifiés : la
protéine doit être pure (95% étant un minimum) et doit être sous forme monodisperse, c’est à
dire qu’elle doit exister sous une seule forme oligomérique, et pas sous forme agrégée. En
effet, il est généralement admis que l’homogénéité conformationnelle d’un échantillon
protéique lui donne de meilleures chances de former des cristaux qui diffractent bien (FerréD'Amaré and Burley, 1994).
Des résultats obtenus par ailleurs (paragraphe 2.2.2 de la première partie du chapitre
Résultats) montrent que la lipase Lip2 produite en présence d’acide oléique est formée sous
forme de complexes lipides-protéines. Deux types d’analyses complémentaires, la
chromatographie d’exclusion stérique, et l’analyse par diffusion dynamique de la lumière
(DLS : Dynamic Light Scattering), ont permis de vérifier que l’enzyme produite dans ces
conditions était formée sous forme de complexes lipides-protéines lorsqu’elle était produite
en présence d’acide oléique (Figure III 21). Un tel comportement peut être un frein pour des
expériences de cristallisation ; au vu de la taille des agrégats, il ne peut s’agir d’un état
oligomérique organisé car ces agrégats représentent plus de 35 fois la masse de la lipase. Par
conséquent, l’état agrégé de l’enzyme est un réel problème, aucun essai de cristallisation ne
peut être lancé avec de l’enzyme sous cette forme.
Ainsi tout comme pour la caractérisation de la thermostabilité, la production de lipase
utilisable pour des essais de cristallisation a nécessité une production de l’enzyme de manière
non agrégée. Pour produire la lipase de manière non agrégée, le gène de la lipase a été mis
sous contrôle d’un nouveau promoteur : le promoteur du gène TEF (facteur 1α d’élongation
245
de la traduction). Ce promoteur fort permet une expression constitutive de la lipase en milieu
riche et permet une production de lipase sans acide oléique. Dans ces conditions la lipase est
produite en présence de glucose et de manière non agrégée.
1.1.3.
Purification de l’enzyme
La purification de l’enzyme a été réalisée selon le protocole mis au point au laboratoire.
Celui-ci est composé de deux étapes : une étape de chromatographie ionique suivie d’une
étape de chromatographie d’interaction hydrophobe. En sortie de purification la lipase est très
pure comme l’atteste le gel SDS PAGE coloré au nitrate d’argent montré sur la figure III-28.
La vérification de l’état d’agrégation a été réalisée par chromatographie d’exclusion stérique
(Figure III-43) et des analyses complémentaires en DLS ont confirmé que l’enzyme était
produite de façon non agrégée (rayon hydrodynamique 3 Å) et avec une faible polydispersité
Lipase pure
39 kDa
Figure III-43 : Chromatographie d’exclusion stérique de la lipase Lip2 en sortie de purification
Nous possédons donc maintenant de l’enzyme pure sous forme monomérique et
monodisperse, à partir de laquelle des essais de cristallogenèse peuvent être envisagés.
1.2. Etude de cristallisation avec la lipase native
1.2.1.
Criblage automatisé des conditions de cristallisation
L’étape de cristallisation est souvent l’étape limitante dans l’obtention d’une structure
tridimensionnelle de protéine. En effet, la composition de la solution de cristallisation est
dépendante de la protéine étudiée mais ne peut être prédite a priori. C’est donc par
l’expérience et de nombreux essais que l’on peut se rapprocher des conditions optimales de
246
cristallisation. Cette étape nécessite de tester de nombreuses combinaisons entre les différents
composants de la solution de cristallisation, où vont intervenir la nature et la concentration de
l’agent précipitant, la nature, la concentration et le pH du tampon de cristallisation, la
présence d’additif, la température et la concentration en protéine.
Un premier criblage de conditions de cristallisation a été réalisé sur la plate-forme de biocristallisation de l’IPBS. Cette plate-forme permet de cribler rapidement un grand nombre de
conditions de cristallisation à partir de cribles commerciaux. La méthode de cristallisation
utilisée est la méthode par diffusion de vapeur en goutte assise. Un robot se charge de
dispenser la solution protéique et la solution de cristallisation. L’utilisation de cette plateforme a trois avantages majeurs :
-
Le nombre de conditions de cristallisation qui peuvent être testées : un crible
commercial correspond à 96 conditions de cristallisation différentes.
-
La rapidité avec laquelle sont réalisés les essais. En moins de 20 minutes, 96
conditions de cristallisation peuvent être réalisées.
-
La quantité de protéine nécessaire. En effet, l’utilisation de robot permet de dispenser
de très petits volumes de solution protéique (jusqu’à 0,1 µL) de façon reproductible.
Pour tester les 96 conditions de cristallisation d’un crible commercial moins de 15 µL
de solution protéique seront nécessaires (contre environ 100 µL pour des essais
manuels en plaque 24 puits).
Les premiers essais ont été réalisés à partir de 5 cribles commerciaux : Classic, PEG, PEG II,
sulfate d’ammonium (Qiagen) et Low ionic (Sigma Aldrich). Chaque crible comprend 96
conditions de cristallisations différentes (voir liste en annexe). L’utilisation de plaques de type
Greiner avec 3 puits a permis de tester 3 conditionnements différents pour la lipase :
-
Conditionnement à 11,7 g/L en Tris 20 mM pH 7,8
-
Conditionnement à 17,1 g/l en Tris 20 mM pH 7,8 + 500 mM NaCl
-
Conditionnement à 16,8 g/l en sortie de purification par interaction hydrophobe (Tris
20 mM pH 7,8 + ≈ 250 mM de sulfate d’ammonium).
Des images de chaque puits sont enregistrées par un robot de visualisation et analysées. Après
deux semaines, les premières formes cristallines apparaissent dans de nombreuses conditions.
Dans un premier temps les conditions contenant du CaCl2 ou du MgCl2 sont écartées, car des
cristaux inorganiques se forment assez facilement avec ces deux composés. Les conditions de
cristallisation les plus souvent observées contiennent soit du PEG 3350, soit du PEG MME
247
550 comme agents précipitants. Les formes cristallines sont loin d’être parfaites mais
constituent une bonne base de départ à améliorer. Un criblage en plaque 24 puits avec ces
deux précipitants est donc réalisé.
1.2.2.
Affinement des conditions de cristallisation
La concentration et le type d’agent précipitant (PEG 3350 20 à 35% p/v et PEG MME 550 25
à 35% p/v), le pH (4,6 à 9,0) et le tampon de cristallisation, ainsi que le conditionnement de la
protéine sont affinés par des criblages sur plaque 24 puits, par la méthode de diffusion de
vapeur en goutte suspendue. Les conditions de cristallisation retenues sont un mélange
volume à volume d’enzyme à 15 g/L conditionnée dans du tampon Tris 20 mM + 500 mM
NaCl avec une solution de cristallisation composée d’un tampon 100 mM HEPES pH 7,0 ou
pH 7,5 et de 27 % à 28 % p/v de PEG 3350.
Les cristaux obtenus apparaissent en moins d’une semaine, les plus gros mesurent 400 µm par
300 µm. Cependant, ils sont très fins (environ 10 à 20 µm), et présentent souvent des
irrégularités et une formation en feuillets. La structure en feuillet est problématique car il
s’agit d’une superposition de plusieurs structures cristallines qui peut rendre les clichés de
diffraction ininterprétables puisque les taches sont issues de la contribution de tous les
réseaux cristallins (Figure III-44).
100 µm
Figure III-44 : Photos de cristaux obtenus avec la lipase native – Cas extrêmes de structure en
feuillet et irrégularités.
1.2.3.
Traitement des clichés de diffraction.
Cependant, certains cristaux apparaissent comme étant monocristallins (ou les feuillets
n’apparaissaient pas à l’œil nu), et plusieurs clichés de diffraction ont été enregistrés à partir
de ces cristaux. Les plus intéressants présentent des taches de diffraction utilisables jusqu’à
3 Ǻ. Cependant l’indexation des données est impossible. Une inspection plus approfondie des
cristaux montre des irisations dans leur épaisseur prouvant l’existence d’une superposition de
réseaux avec des orientations différentes (structure en feuillet voir figure III-44). Le cliché ne
248
correspond donc pas à un seul cristal mais à plusieurs cristaux dans des orientations
différentes. L’indexation n’est pas possible car il est impossible de savoir quelle tache de
diffraction correspond à quel réseau cristallin. Notre travail suivant a donc consisté à
améliorer la qualité de ces cristaux.
1.2.4.
Tentatives d’amélioration de la structure des cristaux
La formation en feuillets des cristaux peut être due à plusieurs phénomènes :
-
Soit la cristallisation est trop rapide et se fait de manière désordonnée.
-
Soit la présence d’une cystéine libre en l’absence d’agent réducteur explique une
hétérogénéité dans l’empilement cristallin.
-
Soit la formation en feuillet est due à une hétérogénéité de glycosylation et empêche la
formation de monocristaux parfaits
Agir sur la concentration de la protéine.
Pour obtenir des cristaux plus épais et moins nombreux, une des techniques peut être de
diminuer la concentration de la protéine ; l’état de sursaturation est plus faible et plus
favorable pour l’obtention d’un empilement cristallin de meilleure qualité. Dans cette optique
deux techniques ont été employées
-
la diminution de la concentration d’enzyme. Des concentrations de 8, 10 et 12 g/L ont
été testées. Des cristaux apparaissent jusqu’à une concentration de 10 g/L, mais la
structure en feuillets est toujours présente.
-
la technique de l’ensemencement a été réalisée avec des concentrations d’enzyme
allant de 6 à 9 g/L pour éviter la formation de trop nombreux points de nucléation. Les
cristaux obtenus présentent à nouveau la structure en feuillets.
Agir sur la vitesse de cristallisation
Une autre façon d’améliorer la qualité des cristaux peut consister à jouer sur la vitesse de
cristallisation par :
-
la modification du rapport enzyme / solution de cristallisation dans la goutte de
cristallisation. Le volume de réservoir ajouté à la solution de protéine est augmenté
(rapport 1 volume de protéine pour 2 et 3 volumes de réservoir testé).
-
l’utilisation d’huile sur le réservoir : l’huile va freiner les échanges de vapeur entre la
goutte et le réservoir. L’équilibrage sera donc plus lent à s’établir.
Les cristaux obtenus dans ces deux cas présentent tout de même la structure en feuillets.
249
Ajout d’additifs pour favoriser une bonne cristallisation
De nombreux additifs ont été testés à une concentration de 3 % de façon à estimer leur impact
sur la cristallisation : l’éthylène glycol, le glycérol, le PEG 400, le DMSO, l’isopropanol, le
(±)-2-Méthyl-2,4-Pentanediol (MPD), l’éthanol et l’acétone. Des cristaux sont obtenus à
chaque fois mais aucun de ces composés ne permet d’éviter la formation en feuillets des
cristaux de la lipase. D’autre part un détergent souvent utilisé pour la cristallisation d’autres
lipases a été testé : le β-octyl glucopyranoside (BOG). Cependant lors de l’échange de tampon
sur centricon 10 kDa de la lipase purifiée avec du tampon contenant ce composé à 0,5 %, il
n’a pas été possible de récupérer l’enzyme. Celle-ci ayant précipité, les essais de
cristallisation n’ont donc pas donné de résultats.
Eviter l’oxydation de la cystéine libre
Pour éviter l’oxydation de la cystéine libre deux stratégies sont utilisées, la première consiste
à travailler avec un agent réducteur (nous avons utilisé le TCEP à une concentration de
1 mM), la deuxième consiste à utiliser un variant de l’enzyme : le mutant C244A, où la
cystéine libre a été changée en alanine. Dans les deux cas, des cristaux présentant une
structure en feuillet ont été obtenus.
Travailler avec l’enzyme déglycosylée
Les mutants de déglycosylation 115V-134Q et 115V-134Q-244A ont été construits sous
contrôle du promoteur TEF ainsi que le mutant 244A. Ces mutants avaient déjà été construits
par mutagenèse dirigée dans le plasmide JMP8, où le gène de la lipase était sous le contrôle
du promoteur POX2. Pour une obtention rapide de ces mutants, la lipase mutée a été
récupérée du plasmide JMP8 pour être clonée dans le vecteur JMP61-tef débarrassé de Lip2.
Le clonage est réalisé avec les enzymes HindIII et EcoRI, après purification sur gel des
fragments d’intérêt. Malheureusement, pour les mutants de glycosylation, les transformants
chez Y. lipolytica ne présentent qu’une très faible activité : la lipase non glycosylée est très
peu exprimée (voir figure III-45). Ce point reste à éclaircir car ces mêmes mutants sous
contrôle du promoteur POX2 produits en présence d’acide oléique permettaient d’obtenir des
niveaux d’activité comparables à ceux obtenus avec la lipase native (voir tableaux III-42 du
début) ; d’autant plus que le mutant 244A présente une activité similaire à la lipase sauvage et
présente le même niveau d’expression.
250
M
1
2
3
4
5
6
97,4
66,3
55,4
36,5
31,0
21,5
Figure III-45 : Production de différents mutants de la lipase Lip2 sous contrôle du promoteur
TEF. 1-lipase sauvage, 2-mutant 244A, 3-mutant 115-134, 4-mutant 115-134-244, 5-mutant 115-134
concentré 10 X, 6-mutant 115-134-244 concentré 10 X.
Même en concentrant 10 fois la protéine (gel figure III-45), les niveaux d’activité sont encore
loin de ceux obtenus avec la lipase native. Considérant ce faible taux d’expression, une
quantité d’enzyme suffisante ne peut donc être obtenue pour des essais de cristallisation. Par
conséquent une autre stratégie a été envisagée : la lipase native, produite sous contrôle du
promoteur TEF, et purifiée a été déglycosylée après purification par voie enzymatique avec
l’endo Hf. Cette enzyme possède un domaine de liaison au maltose et peut donc facilement
être éliminée sur colonne dans une dernière étape de purification (Figure III-46).
Masse
moléculaire
(kDa)
100
75
50
37
25
20
15
Figure III-46 : Gel électrophorèse de la lipase native purifiée (puits 1) et de la lipase déglycosylée
par l’endo Hf.
Après reprise dans du tampon de cristallisation, des tests de cristallisation ont été réalisés avec
de l’enzyme déglycosylée à 17 g/L. Ces essais de cristallisation n’ont conduit à la formation
d’aucun cristal. L’enzyme déglycosylée ne cristallise pas dans les conditions de cristallisation
de la lipase native. Ceci confirme que les chaînes de glycosylation interviennent dans le
maintien de l’édifice cristallin et leur hétérogénéité nuit à l’organisation du cristal.
Malgré les nombreuses tentatives pour obtenir des cristaux monocristallins, aucune n’a permis
de se débarrasser de la formation des feuillets. Par conséquent cette piste de cristallisation est
abandonnée. D’autre part, ces irrégularités sont probablement dues aux chaînes de
251
glycosylation de la chaîne polypeptidique, par conséquent, de nouveaux tests de recherche de
nouvelles conditions de cristallisation sont réalisés avec l’enzyme déglycosylée.
1.3. Etude de cristallisation avec la lipase déglycosylée
1.3.1.
Recherche des conditions optimales de cristallisation
Les premiers tests de cristallisation ont été réalisés sur la plate-forme de biocristallographie
avec les 6 screens commerciaux suivants : Classic, PEG, PEG II, pH clear I , pH clear II
(Qiagen) et Low ionic (Sigma Aldrich). De la lipase déglycosylée par voie enzymatique à une
concentration de 11 g/L a été testée avec trois conditionnements différents :
- Tris 20 mM pH 7,8
- Tris 20 mM pH 7,8 + Nacl 500 mM
-Tris 20 mM pH 7,8 + acide ortho-bromophényl acétique à 4 mM (dans DMSO 2,5% final).
Ce dernier conditionnement est réalisé avec l’un des substrats utilisé pour les réactions
d’intérêt (voir partie bibliographie) dans le but d’une co-cristallisation de l’enzyme avec son
substrat. Si ce substrat venait à co-cristalliser dans le site actif de l’enzyme, on serait assuré
d’avoir la structure de la forme ouverte de l’enzyme et les déterminants moléculaires de la
sélectivité de la lipase seraient plus facilement mis en évidence.
Après deux semaines, de jolis cristaux parallélépipédiques apparaissent dans les conditions
suivantes : 0,1 M acétate de sodium pH 4,6, 30% MPD et soit 20 mM de CaCl2, soit 200 mM
de NaCl. On notera que les cristaux ne sont obtenus que lorsque l’enzyme est conditionnée à
faible force ionique. Les cristaux obtenus avec l’acide ortho-bromophényl acétique sont plus
réguliers et de taille plus grosse que ceux observés sans le substrat. Ce qui laisse supposer une
stabilisation de la lipase par le composé (Figure III-47).
A
B
100 µm
100 µm
Figure III-47 : Images de cristaux obtenus lors du criblage haut débit des conditions de
cristallisation. Conditions de cristallisation : 0,1 M acétate de sodium, 30% MPD et 20 mM de CaCl2
A) lipase déglycosylée B) lipase déglycosylée + acide ortho-bromophényl acétique à 4 mM (dans
DMSO 2,5% final)
252
Des tests pour reproduire et améliorer les conditions de cristallisation en plaque 24 puits ont
été réalisés. De nombreux paramètres ont été optimisés :
-L’affinement des conditions de pH nous a amené à tester différents tampons et différents pH
(4,6 à 8,0). Le MES à pH 6,0 ayant donné les meilleurs résultats, nous avons ensuite affiné les
conditions de pH avec ce tampon. Parmi les trois pH testés (pH 5,5 pH 6,0 pH 6,5), c’est à pH
5,5 que les cristaux de plus grande taille sont obtenus.
- La concentration optimale en MPD a été recherchée, c’est autour de 30% (+/- 3%) que les
cristaux obtenus ont la taille la plus importante.
- Un affinement sur la concentration en NaCl et la concentration en CaCl2 a aussi été réalisé.
Les conditions optimales retenues sont 20 mM CaCl2 et 200 mM NaCl.
Les conditions finalement retenues sont un mélange volume à volume de lipase déglycosylée
à 12 g/L conditionnée en Tris 20 mM pH 7,8 en présence d’acide ortho-bromophényl acétique
8 mM dans 5% DMSO final, avec la solution de cristallisation composée de MPD à 30 %, de
CaCl2 à 20 mM et de NaCl à 200 mM dans du Tampon MES 0,1 M pH 5,5. La présence
d’acide ortho-bromophényl acétique semble améliorer la qualité des cristaux obtenus. Après
avoir vérifié que cet effet n’était pas dû au DMSO destiné à solubiliser le substrat, ceci laisse
espérer un positionnement du substrat dans le site actif de l’enzyme. Dans ces conditions des
cristaux parallélépipédiques de 200 x 80 x 50 µm sont obtenus. On notera que des cristaux de
forme bipyramidale apparaissent dans ces mêmes conditions (Figure 48).
100 µm
Figure III-48 : Image de cristaux de formes bipyramidales obtenus dans les conditions de
cristallisation optimisées.
1.3.2.
Enregistrement des données
Après des tests préliminaires avec la source de rayons X en tube scellé du laboratoire, un
cristal (parallélépipédique) a été sélectionné pour être irradié sur la ligne id14eh4 de l’ESRF
et a permis l’enregistrement d’un jeu de données à 1,7 Å. Le tableau III-17 récapitule les
données sur toute la gamme de résolution (20,0 -1,79 Å) et sur la dernière couronne de
résolution (1,79-1,70 Å). Certaines taches de diffraction ont été mesurées au-delà de 1,70 Å,
cependant elles ont été écartées à cause de leurs faibles intensités (rapport signal sur bruit
inférieur à 2). Ainsi, la qualité du jeu de données (estimée à partir des valeurs de multiplicité,
complétude et rapport signal sur bruit I /σ > 2) est correcte jusque dans la dernière couronne
de résolution ce qui permet d’affirmer que la résolution est effectivement de 1,7 Å
253
68,7-1,70 Å
1,79 -1,70 Å
Nombre d'observations
947008
139312
Nombre d'observations indépendantes
228475
33232
4,1
4,2
Complétude
99,5%
99,9%
R sym
7,3%
34,3%
6,7
2,2
Multiplicité
I/σ (signal sur bruit)
Tableau III-17 : Récapitulatif du jeu de données enregistré à 1,7 Å
Dans ce jeu de données les paramètres de maille sont a = 115 Å, b = 132 Å, c = 138,5 Å et
α = β= γ= 90°. Cependant la détermination du groupe d’espace est problématique. En effet,
d’après l’indexation, il s’agit d’un orthorhombique (α = β = γ = 90°) avec trois axes de
rotation de 90° selon les axes a, b, et c de la maille, ces axes de rotation pouvant être des axes
d’ordre 2 (rotation simple) ou d’ordre 21 (axe hélicoïdal). La présence d’axes hélicoïdaux se
traduit par des extinctions systématiques sur des plans particuliers (h,0,0), (0,k,0) et (0,0,l).
pour le jeu de données enregistré, des extinctions systématiques sont retrouvées sur les plans
(0,k,0) et (0,0,l), mais aucune donnée n’a été enregistrée sur le plan de type (h,0,0).
L’enregistrement d’autres jeux de données avec des dérivés lourds (Hg et Au) ont permis de
lever l’incertitude sur la symétrie selon l’axe a, il s’agit aussi d’un axe hélicoïdal. Le groupe
d’espace est donc un P212121. Le programme Pointless de la chaîne de programmes CCP4
destiné à la détermination des groupes d’espace a permis de confirmer cette analyse (Tableau
III-18). L’enregistrement d’un jeu de données sur des cristaux de forme bipyramidale a aussi
été réalisé. La structure cristalline des cristaux est la même.
.
Tableau III-18 : Probabilité d’existence de l’opération de symétrie selon les axes à, b, et c selon
différents jeux de données enregistrés d’après le programme Pointless
a
b
c
Pas de données
21 à 97%
21 à 98%
Dérivé Hg à 1,9 Å
21 à 87%
21 à 77%
21 à 90%
Dérivé Au à 2,3 Å
21 à 83%
21 à 89%
21 à 89%
Lipase native à 1,7 Å
2. Résoudre le problème des phases pour résoudre la
structure de Lip2
A partir de ce simple jeu de données la structure de la lipase Lip2 ne peut être directement
résolue. En effet, pour avoir accès à la densité électronique en tout point de la maille : ρ(x,y,z)
1 ∞ ∞ ∞
m Fhkl e iφhkl e − 2iπ ( hx + ky + lz ) ).
deux informations sont nécessaires (avec ρ ( x, y, z ) =
∑
∑
∑
hkl
Vmaille h = −∞ k = −∞ l = −∞
254
La première est le module du facteur de structure │Fhkl│qui peut être calculé à partir des
intensités mesurées des taches de diffraction : Fhkl = I hkl . La seconde est l’information de
phase Фhkl. La lumière étant une onde électromagnétique toutes les taches arriveront sur le
détecteur avec un certain déphasage. Cette information est perdue lors de l’enregistrement des
jeux de données. Pour résoudre la structure tridimensionnelle de la lipase Lip2 de
Y. lipolytica, l’information de phase doit donc être retrouvée.
2.1. Remplacement moléculaire
Une des méthodes permettant de résoudre la structure tridimensionnelle des protéines consiste
à appliquer à chaque tache de diffraction les phases obtenues à partir d’une structure modèle.
Le remplacement moléculaire consiste à placer la molécule modèle dans la maille du cristal
expérimental de façon à ce que le profil de diffraction de la protéine modèle concorde avec le
profil de diffraction enregistré. Plus les structures entre la protéine et son modèle sont
proches, plus les chances de trouver une solution de remplacement moléculaires sont grandes.
Ainsi, pour améliorer nos chances de trouver des solutions un modèle de la structure
tridimensionnelle de la lipase Lip2 a été généré in silico.
2.1.1.
a)
Modèle de la structure tridimensionnelle de Lip2
Alignement avec des protéines de structure tridimensionnelle connues
Le point crucial dans la construction d’un modèle par homologie de structure réside dans
l’identification de protéines homologues qui serviront de matrice et dont la structure est
disponible dans la PDB (Protein Data Bank). La séquence de la protéine Lip2 a été soumise à
un algorithme PSI-BLAST contre les protéines de la PDB. Trois lipases (de la famille des
lipases fongiques) et une féruloyl estérase de structures connues et ayant une homologie
significative (Tableau III-19) avec la lipase Lip2 ont été sélectionnées comme matrice pour la
construction du modèle.
Tableau III-19 : Résultats de la comparaison de la protéine Lip2 avec les protéines de la PDB.
Identité de
séquences
Homologie de
séquences
Gap
code PDB
Lipase de Rhizomucor miehei
29%
46%
16%
3TGL - 4TGL
Lipase de Rhizopus niveus
33%
47%
17%
1TIC
Lipase de Thermomyces lanuginosa
31%
47%
14%
1GT6
Féruloyl estérase d'Aspergillus Niger
30%
46%
10%
1USW
Origine
255
L’alignement de la séquence de Lip2 avec chacune de ces enzymes est présenté sur les figures
III-49 à III-52.
LIP2 : 16
R.m
: 15
LIP2 : 74
R.m
: 68
NFFEKYARLANIGYC--VGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFHDPRLIFDVSGYLA 73
N
Y L+
YC V PG
++C + C
++++I+ +
LI+D + +A
NELTYYTTLSANSYCRTVIPGAT----WDC-IHCDATEDLKIIKTWS--TLIYDTNAMVA 67
VDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSY 133
+ K IY+V RG+ S+ + I D+ +
S
VH GF+ SY
RGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPV------------SYPPVSGTKVHKGFLDSY 115
LIP2 : 134 NNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINL-----KVNGHDPLVVTLG 188
N++
+
+QYP Y++AVTGHSLGGA ALL ++L
++ + + T G
R.m : 116 GEVQNELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALDLYQREEGLSSSNLFLYTQG 175
LIP2 : 189 QPIVGNAGFANWVDKLFFGQENPDVSKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWD-GYQHCSGE 247
QP VGN FAN+V
VS
R + DIVP +P
G+ H
E
R.m : 176 QPRVGNPAFANYV--------------VSTGIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGSE 221
LIP2 : 248 VFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYF-VTEGVC
W
+ P + V
CS N+++
+V+ +HL YF + G+C
R.m : 222 Y---WITDNSPETVQVCTSDLETSDCS--NSIVPFTSVL-DHLSYFGINTGLC
299
268
Figure III-49 : Alignement de la séquence de Lip2 de Y. lipolytica avec celle de la lipase de
Rhizomucor miehei. Les 3 acides aminés catalytiques sont en rouge, les 2 acides aminés du trou
oxyanion sont en vert et les cystéines en violet.
LIP2 :10
T.l. :24
LIP2 :63
T.l.: 81
IDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIF----KPFNCGL-QCA-HFPNVE-LIEEFHDP 62
+ Q+ +N F +A+ +
YC
G
P
+ C
C
P VE + F D
VSQDLFNQFNLFAQYSAAAYC---GKNNDAPAGTNITCTGNACPEVEKADATFLYSFEDS 80
RLIFDVSGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDC 122
+ DV+G+LA+D+ +K I L RG+ S+E+ I ++
NFDL
C C
G-VGDVTGFLALDNTNKLIVLSFRGSRSIENWIGNL--------NFDLK---EINDICSGC 128
LIP2 :123 LVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGHDP 182
H+GF S+ + + + K++ + ++PDY++ TGHSLGGA A + G +L+ NG+D
T.l. :129 RGHDGFTSSWRSVADTLRQKVEDAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGADLRGNGYDI 188
LIP2 :183 LVVTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFGQENPDVSKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWD-GY 241
V + G P VGN FA ++
V
LYRITH DIVP++P + GY
T.l. :189 DVFSYGAPRVGNRAFAEFL-------------TVQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPREFGY 235
LIP2 :242 QHCSGEVFIDWPLIHPPLSN-VVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNV--IGNHLQYFVTEGVC 299
H S E +I
+ P
N +V +G
+ G
+ I HL YF
G C
T.l. :236 SHSSPEYWIKSGTLVPVTRNDIVKIEG---IDATGGN---NQPNIPDIPAHLWYFGLIGTC 290
Thermomyces lanuginosa. Les 3 acides aminés catalytiques sont en rouge, les 2 acides aminés du trou
256
LIP2 : 18
R.n. : 13
LIP2 : 75
R.n. : 66
FEKYARLANIGYC--VGPGTKIFKPFNCGLQCAHF-PNVELIEEFHDPRLIFDVSGYLAV 74
F KYA +A
YC V PG K
++C +QC + P+ ++I F
L+ D +GY+
FTKYAGIAATAYCRSVVPGNK----WDC-VQCQKWVPDGKIITTFTS--LLSDTNGYVLR 65
DHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYN 134
K IYLV RGT+S
ITDI
N S
VH GF+ SY
SDKQKTIYLVFRGTNSFRSAITDI------------VFNFSDYKPVKGAKVHAGFLSSYE 113
LIP2 : 135 NTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINL-----KVNGHDPLVVTLGQ 189
N
P +
+ +P Y++ VTGHSLGGA ALL G++L
+++ + + T+G
R.n. : 114 QVVNDYFPVVQEQLTAHPTYKVIVTGHSLGGAQALLAGMDLYQREPRLSPKNLSIFTVGG 173
LIP2 : 190 PIVGNAGFANWVDKLFFGQENPDVSKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWD-GYQHCSGEV 248
P VGN FA +V+
S
R H+ DIVP VP
G+ H
E
R.n. : 174 PRVGNPTFAYYVE--------------STGIPFQRTVHKRDIVPHVPPQSFGFLHPGVE- 218
LIP2 : 249 FIDWPLIHPPLSNVVMCQGQ-SNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYF-VTEGVC 299
W I
SNV +C +
K CS N+++
+++ +HL YF + EG C
R.n. : 219 --SW--IKSGTSNVQICTSEIETKDCS--NSIVPFTSIL-DHLSYFDINEGSC 264
Rhyzopus niveus. Les 3 acides aminés catalytiques sont en rouge, les 2 acides aminés du trou
LIP2 : 67 DVSGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVH 126
D++G++ D SK+I V RGT S ++ D
LT FD
+
C+DC VH
f.e. : 47 DINGWILRDDTSKEIITVFRGTGSDTNLQLDTNYT---LTPFD------TLPQCNDCEVH 97
LIP2 :127 NGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVT 186
G+
+ + +Q+
+
QYPDY + VTGHSLG + A L
L
+ + T
f.e. :98 GGYYIGWISVQDQVESLVKQQASQYPDYALTVTGHSLGASMAALTAAQLSATYDNVRLYT 157
LIP2 :187 LGQPIVGNAGFANWVDKLFFGQENPDVSKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWD-GYQHCS 245
G+P GN FA++++
F
+P+ +
+ +R+TH D +P +P D GY H
f.e. :158 FGEPRSGNQAFASYMNDA-FQVSSPETT------QYFRVTHSNDGIPNLPPADEGYAHGG 210
LIP2 :246 GEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYF-VTEGVC 299
E
W +
N +C G
+ C A
Q VN
H YF +T G C
f.e. :211 VEY---WSVDPYSAQNTFVCTGDEVQCCEAQGG--QGVN--DAHTTYFGMTSGAC 258
Figure III-52 : Alignement de la séquence de Lip de Y. lipolytica avec celle de la féruloyl estérase
d’Aspergillus niger. Les 3 acides aminés catalytiques sont en rouge, les 2 acides aminés du trou
b)
Prédiction de la structure secondaire
Dans un premier temps, les éléments de structure secondaire ont été prédits à l’aide du
logiciel PSIPRED disponible gratuitement sur Internet (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)
(McGuffin, et al., 2000). Le résultat est donné sur la figure III-53.
257
922454445588999999999999988753267877776303565557788722677412
CCCCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCEEEEEEC
VYTSTETSHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFH
552111340899997899989999833898788885222122666655576521455555
CCCCCCCCEEEEEEECCCCEEEEEEECCCCHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC
DPRLIFDVSGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATC
2
660220799999999999999999999974798279998406578999999986406888
CCCEEEHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCEEEEEEEECHHHHHHHHHHHHHCCCCC
DDCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGH
637998069986888999998752156432100124478738999868987564885346
CCEEEECCCCCCCCHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCCCEEEEECCCCCCCCCCCCCC
DPLVVTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFGQENPDVSKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDG
536632687558656888864689827888766654212456643566542220014557
CCCCCEEEEECCCCCCCCCCCEEEECCCCCCCCCCCCCCCCCCCCHHHHHHHHEECCCCC
YQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCG
Figure III-53 : Prédiction des éléments de structure secondaire de la lipase Lip2 de Y.lipolytica
obtenue avec le logiciel PSIPRED (H pour hélice α, E pour feuillet β, C pour boucle, la valeur
indique la confiance entre 0 et 9).
Par la suite, les structures secondaires des 4 protéines servant de matrice à la construction du
modèle ont été récupérées à la PDB et un alignement avec les structures secondaires prédites
pour Lip2 a pu être réalisé. Un exemple d’alignement avec la lipase de Rhizomucor Miehei est
montré sur la figure III-54.
LIP2
: 18
FEKYARLANIGYC—-VGPGTKIFKPFNCGLQCAHF-PNVELIEEFHDPRLIFDVSGYLAV 74
M.mie: 17
FTKYAGIAATAYCRSVVPGNK----WDC-VQCQKWVPDGKIITTF--TSLLSDTNGYVLR 69
LIP2
: 75
DHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYN 134
M.mie: 70
SDKQKTIYLVFRGTNSFRSAITDI------------VFNFSDYKPVKGAKVHAGFLSSYE 117
LIP2
: 135 NTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINL-----KVNGHDPLVVTLGQ 189
M.mie: 118 QVVNDYFPVVQEQLTAHPTYKVIVTGHSLGGAQALLAGMDLYQREPRLSPKNLSIFTVGG 177
LIP2
: 190 PIVGNAGFANWVDKLFFGQENPDVSKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWD-GYQHCSGEV 248
M.mie: 178 PRVGNPTFAYYVE--------------STGIPFQRTVHKRDIVPHVPPQSFGFLHPGVE- 222
LIP2
: 249 FIDWPLIHPPLSNVVMCQGQ-SNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYF-VTEGVC 299
M.mie: 223 --SW--IKSGTSNVQICTSEIETKDCS--NSIVPFTSIL-DHLSYFDINEGSC 268
Figure III-54 : Alignement des structures secondaires de la lipase Lip2 (prédites) et de la lipase
de Rhizomucor miehei (observées). Les feuillets β sont représentés en vert, les hélices α en rose, les
cystéines en bleu et les acides aminés de la triade catalytique en rouge. Les gaps qui brisent une
structure secondaire ont été entourés
258
La position des gap qui brisent des séquences secondaires ont été ajustés manuellement
(zones modifiées entourées). L’alignement optimisé est montré sur la figure III-55.
Y.l:
T.l:
R.m:
R.n:
USW
1
3
1
1
VYTSTETSHIDQESY-NFFEKYARLANIGY---C--VGPGTKIFKPFNC-GLQCAH--FPNVELIEEFHDPRLIF
SQDLFNQFNLFAQYSAAAY---CGKNNDAPAG-TNITCTGNACPEVEKADATFLYSFED-SGVG
SINGGIRAATSQEI-NELTYYTTLSANSY---CRTVIPGAT----WDC--IHCDA--TEDLKIIKTWST--LIY
SDGGKVVAATTAQI-QEFTKYAGIAATAY---CRSVVPGNK----WDC--VQCQKWVPDGKIITTFTS---LLS
ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPST--------IIKGEKIYNAQT-------------
66
61
60
60
46
Y.l:
T.l:
R.m:
R.n:
USW
1put
67
62
61
61
DVSGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTN--FDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYNNTYN
DVTGFLALDNTNKLIVLSFRGSRSIENWIGNLNFDLKEIND-------------ICSGCRGHDGFTSSWRSVAD
DTNAMVARGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPVSYPP--------------VSGTKVHKGFLDSYGEVQN
DTNGYVLRSDKQKTIYLVFRGTNSFRSAITDIVFNFSDYKP--------------VKGAKVHAGFLSSYEQVVN
DINGWILRDDTSKEIITVFRGTGSDTNLQLDTNYTLTPFDT-----------LPQCNDCEVHGGYYIGWISVQD
SKVVYVSHDGTRRQLDVADGVSLMQAAVSNGIYDIVGDCGGSASCATCHVY
138
122
120
121
Y.l:
T.l:
R.m:
R.n:
USW
139
123
121
122
QIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLK-----VNGHDPLVVTLGQPIVG
TLRQKVEDAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGADLR-----GNGYDIDVFSYYAPRVG
ELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALDLYQREEGLSSSNLFLYTQGQPRVG
DYFPVVQEQLTAHPTYKVIVTGHSLGGAQALLAGMDLYQREPRLSPKNLSIFTVGGPRVG
QVESLVKQQASQYPDYALTVTGHSLGASMAALTAAQLS--ATYD---NVRLYTFGEPRSG
Y.l:
T.l:
R.m:
R.n:
USW
194
178
181
182
NAGFANWVDKLFFGQENPDVSKVSKDRKLYRITHRGDIVPQV-PFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPP-LSNVVMCQ
NRAFAEFLTV-------------QTGGTLYRITHTNDIVPRLPPREFGYSHSSPEYWIKSGTLVPVTRNDIVKIE
NPAFANYVVST--------------GIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGSEYWITDN---SP--ETVQVCT
NPTFAYYVEST--------------GIPFQRTVHKRDIVPHVPPQSFGFLHPGVESWI---KSGTS---NVQICT
NQAFASYMNDAFQVSS-------PETTQYFRVTHSNDGIPNLPPADEGYAHGGVEYWSVD----PYSAQNTFVCT
Y.l :267
T.l: 240
R.m: 237
R.n: 240
USW
193
177
180
181
266
239
236
238
GQ-SNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYF-VTEGVC 299
GI-DATGGNNQPNI---PDIP-AHLWYFGL-IGTC 268
SDLETSDCS--NSIVPFTSVL-DHLSYFGINTGLC 268
SEIETKDCS--NSIVPFTSIL-DHLSYFDINEGSC 268
GD-EVQCCEAQGGQ---GVND-AHTTYFGMTSGACTW
Figure III-55 : Alignement optimisé entre la structure secondaire prédite pour la lipase Lip2 de
Y. lipolytica et les structures secondaires observées pour les lipases de T. lanuginosa, R. miehei,
R. niveus et la féruloyl estérase d’A. niger. Les feuillets β sont représentés en vert, les hélices α en
rose, les cystéines en bleu et les acides aminés de la triade catalytique en rouge et gras.
c)
Identification des éléments structuraux
Dans un premier temps, cet alignement montre que, malgré le faible pourcentage d’homologie
de séquence existant entre ces enzymes, les éléments de structures secondaires sont très
bien conservés. De plus, d’après les prédictions de ces mêmes éléments pour Lip2, ceux-ci
semblent très bien s’aligner avec les enzymes sélectionnées comme matrice. Cette première
observation laisse présager de la qualité du modèle. Notons tout de même que la lipase Lip2
semble différer des autres lipases en deux endroits : deux zones, l’une entre l’asparagine 107
et la thréonine 119, l’autre entre la phényalanine 207 et la valine 218 sont absentes des autres
lipases. Ces zones sont prédites comme étant des boucles et n’ont donc pas de repliement
facilement prédictible par le logiciel de modélisation. De ce fait, un fragment de la
putidarédoxine (1PUT) qui présente une homologie de séquence avec les acides aminés 107 à
119 a aussi été aligné avec cette zone de la lipase Lip2 pour permettre une meilleure
construction du modèle dans cette zone.
259
Conservation de la machinerie catalytique
Parmi les éléments parfaitement conservés, on retrouve les acides aminés de la triade
catalytique et ceux du trou oxyanion. Ceci permet d’identifier avec précision la position des
acides aminés catalytiques de la lipase Lip2 : la sérine 162, l’acide aspartique 230 et
l’histidine 289. Notons que la sérine catalytique est située dans la séquence consensus
GXSXG caractéristique des lipases (X étant un acide aminé quelconque). Dans le cas de Lip2,
la signature est GHSLG comme pour les lipases fongiques. La position des deux acides
aminés composant le trou oxyanion est également très conservée. Cela souligne l’importance
de cet élément structural dont le rôle est de stabiliser (via des liaisons hydrogène)
l’intermédiaire tétraédrique formé pendant la catalyse. Chez les lipases, le trou oxyanion est
composé de deux acides aminés. La position du premier résidu ne varie pas selon les lipases :
il s’agit de l’acide aminé situé juste après la sérine catalytique. Pour Lip2, comme pour les
lipases de type fongique il s’agit d’une leucine, la leucine 163. Le deuxième résidu formant le
trou oxyanion varie selon le type de lipases. L’équipe de Pleiss a classifié les lipases en deux
grandes familles selon ce critère et Lip2 appartient à la famille de lipases de type GX, X étant
le deuxième acide aminé composant le trou oxyanion (Pleiss, et al., 2000a). Chez les lipases
de type fongique, ce résidu est toujours un acide aminé hydrophile hydroxylé de type Sérine
ou Thréonine (Ser82, Ser83 et Thr82 chez R. miehei, T. lanuginosa et R. niveus
respectivement). La lipase Lip2 ne déroge pas à la règle, dans son cas il s’agit de la
Thréonine 88. Les lipases de type GX présentent une spécificité marquée pour les
substrats à longue chaîne carbonée, c’est effectivement le cas pour Lip2 (Guieysse, et al.,
2004). D’autre part, chez ce type de lipase, on retrouve un élément structural particulier
appelé : « résidu d’ancrage », qui interagit avec les chaînes latérales de l’acide aminé
hydrophile du trou oxyanion. Il est généralement situé à la fin de l’hélice α composant le volet
amphiphile de la lipase, pour Lip2, il s’agirait de l’acide aspartique 97.
La paupière
Dans la majorité des lipases, un élément mobile appelée paupière ou volet amphiphile peut
recouvrir le site actif. Cette paupière bloquant l’accès au site actif dans la conformation
fermée de l’enzyme peut s’écarter du site actif en présence d’une interface hydrophobe, pour
adopter une conformation ouverte où l’accès au site actif est libéré pour les substrats. Cet
élément structural est généralement composé d’une hélice α et a été identifié chez les trois
lipases : il s’agit des acides aminés Ile86-Leu93 pour la lipase de T. lanuginosa, Ile 85-Asp91
pour la lipase de R. miehei, et Phe85-Asp91 pour la lipase de R. niveus. D’après les
260
alignements de structure primaire et les prédictions de structures secondaires, il pourrait s’agir
des acides aminés Leu 91-Ile 100 pour la lipase de Y. lipolytica.
Les ponts disulfures
Vis à vis de l’alignement de séquence
Les ponts disulfures sont des éléments essentiels dans l’acquisition de la structure tertiaire des
protéines. Chez les protéines eucaryotes extracellulaires, ils sont souvent présents en grand
nombre. La lipase Lip2 est extracellulaire et contient 9 cystéines (Figure III-56). Il est donc
capital de déterminer les arrangements corrects des ponts disulfures chez la lipase Lip2. Parmi
les 9 cystéines :
- Les cystéines C30 et C299 sont retrouvées chez toutes les autres protéines matrices et dans
tous les cas forment un pont disulfure. On peut donc supposer que les cystéines 30 et 299
forment un premier pont disulfure chez la lipase de Y. lipolytica.
- Les cystéines C43 et C47 trouvent des homologues chez toutes les lipases mais pas chez la
ferruloyl estérase d’Aspergillus niger. Dans les enzymes où elles sont présentes elles forment
dans tous les cas un pont disulfure. On peut donc supposer que les cystéines 43 et 47 forment
un pont disulfure chez la lipase de Y. lipolytica.
- Les cystéines C120 et C123 trouvent des homologues chez la lipase de T. lanuginosa et chez
la ferruloyl estérase d’Aspergillus niger chez lesquels elles forment un pont disulfure. On peut
donc supposer que les cystéines 120 et 123 forment un pont disulfure chez la lipase de
Y. lipolytica.
- Les cystéines C265 et C273 trouvent des homologues chez toutes les enzymes ayant servi de
matrice sauf la lipase de T. lanuginosa, on retrouve dans toutes ces enzymes un pont disulfure
entre ces deux cystéines. On peut donc supposer que les cystéines 265 et 273 forment un
pont disulfure chez la lipase de Y. lipolytica.
L’alignement des séquences (Figure III-56) laisse à penser que quatre ponts disulfures:
C43-C47, C120-C123, C265-C273, C30-C299 et une cystéine libre C244 sont présents
dans la lipase Lip2 de Y. lipolytica. Nous noterons qu’aucune des enzymes matrice ne
possède un homologue de cette cystéine libre.
261
Lipase de
R. miehei
C30
C40 C43
C235 C244
C268
Lipase de
R. niveus
C29
C40 C43
C235 C244
C 268
Lipase de
T.lanuginosa
C22
C36 C41
Féruloyl estérase
d’A.niger
Lipase de
Y. lipolytica
C 268
C91 C94
C29
C30
C104 C107
C43 C47
C120 C123
C227 C234
C244
C265 C273
C 258
C 299
Figure III-56. Vue schématique des séquences protéiques alignées des lipases de T. lanuginosa,
R. miehei, R. niveus et la féruloyl estérase d’A. niger avec la lipase Lip2 de Y. lipolytica. Mise en
évidence de l’alignement des cystéines. Les ponts disulfures des protéines de structure connue sont
représentés par des traits pleins, l’arrangement des ponts disulfures de la lipase Lip2 de Y. lipolytica
déduit de cet alignement est représenté par des pointillés.
Analyse par mutagenèse dirigée
Pour vérifier en partie les hypothèses émises de par l’observation de l’alignement de
séquence, des expériences de mutagenèse dirigée ont été réalisées. La cystéine 244 a été
mutée en alanine pour vérifier qu’elle ne participait pas à un pont disulfure obligatoire pour le
bon repliement de l’enzyme. D’autre part, les homologues des cystéines 30 et 299 forment un
pont disulfure retrouvé dans toutes les enzymes homologues qui ont servi à réaliser le modèle.
Ce pont disulfure permet un ancrage des parties N et C terminales. Il est présent chez toutes
les lipases de la famille des lipases fongiques sauf la lipase de Pennicillium camembertii.
Cependant l’ajout de ce pont disulfure par mutagenèse dirigée chez cette lipase permet
d’améliorer sa stabilité (Yamaguchi, et al., 1996). Ces cystéines 30 et 299 ont donc également
été mutées en alanines.
Les activités des variants obtenus sont consignées dans le tableau III-20. Le variant C244A,
déjà etudié par ailleurs, présente une activité du même ordre de grandeur que la lipase
sauvage (environ 80% de l’activité de la lipase sauvage), elle n’est donc pas impliquée dans
262
un pont disulfure essentiel au bon repliement de l’enzyme. On notera par ailleurs que la levure
Y. lipolytica comporte dans son génome 15 autres gènes codant potentiellement pour des
lipases. Chez ces 15 lipases, les homologues de 8 cystéines sont retrouvées, la seule cystéine
non retrouvée (et également non retrouvée chez les autres lipases de la famille fongique) est la
cystéine 244. Si la cystéine 244 est impliquée dans un pont disulfure, alors, celui-ci ne semble
pas nécessaire au bon repliement de l’enzyme. Ces éléments vont dans le sens que cette
cystéine est une cystéine libre. Pour définitivement affirmer que cette cystéine était libre, il
aurait fallu réaliser un dosage des SH libres (réactif de Ellman) de la lipase sauvage et du
mutant C244A.
La mutation des cystéines Cys30 et Cys299 en alanine conduit à une inactivation totale de
l’activité enzymatique. Ceci conforte l’hypothèse d’un pont disulfure entre les cystéines
Cys30 et Cys299 comme le prédisaient les alignements de structure. Chez la lipase de
Y. lipolytica ce pont disulfure est indispensable à l’activité enzymatique et est probablement
impliqué dans le maintien d’une structure tridimensionnelle catalytiquement active.
Tableau III-20 : Activités de la lipase sauvage et des mutants cystéines.
Enzyme
Activite pNPB
(µmole.min-1.ml-1)
Activité
résiduelle (%)
sauvage
15
100
Cys 30Ala
< 0,01
0
Cys244Ala
12,1
81
Cys299Ala
< 0,01
0
Conclusion : Les données que nous avons obtenues par mutagenèse dirigée concernant les
ponts disulfures sont en adéquation avec les alignements de structure. Ils permettent
d’affirmer que les cystéines 30 et 299 forment un pont disulfure nécessaire au maintien de
l’activité catalytique. D’après les informations retirées des alignements de séquence et de la
mutagenèse dirigée, il semble que la cystéine 244 soit une cystéine libre. Pour la construction
du modèle nous prendrons donc en compte les arrangements déterminés par les alignements
de structure et retiendrons donc les ponts disulfures suivants : Cys30-Cys299, Cys43-Cys47,
Cys120-Cys123 et Cys265-Cys273.
d)
Construction du modèle
Rapellons que les lipases peuvent exister sous deux formes : une forme ouverte et une forme
fermée selon le positionnemment du volet amphiphile : si cette hélice recouvre le site actif
alors la lipase sera sous forme fermée, si au contraire son positionnememnt libère l’accès au
263
site actif alors la lipase sera sous forme ouverte. Comme il n’est a priori pas possible de
prévoir si la lipase est sous forme ouverte ou sous forme fermée dans l’édifice cristallin dont
le jeu de données a été enregistré, il conviendra de ne pas tenir compte de cette zone lors du
remplacement moléculaire. Le modèle que nous allons construire pourra également servir de
première base pour l’étude des relations entre la structure de l’enzyme et sa sélectivité envers
les différents substrats. Il est donc nécessaire de disposer de la forme ouverte de la protéine
qui seule permet l’accès des substrats au site actif de l’enzyme. Par conséquent dans un
premier temps un modèle de la forme ouverte de la protéine a été réalisé. Seules les lipases de
R. miehei et de T. lanuginosa ont été cristallisées sous forme ouverte avec respectivement un
groupe diethylphosponate et de l’acide oléique dans leurs sites actifs. Ainsi, le modèle
tridimensionnel de la lipase de Y. lipolytica a été réalisé à partir des formes ouvertes de ces
deux lipases (code PDB 4TGL pour la lipase de R. miehei et 1GT6 pour la lipase de
T. lanuginosa).
Dix modèles ont été construits avec le logiciel MODELLER disponible sur la plateforme
INSIGHTII. Le modèle de plus basse énergie a été affiné avec le module DISCOVER
d’INSIGHTII en utilisant le champ de force CFF91. Dans un premier temps les carbones α de
tous les acides aminés ont été bloqués et seules les chaînes latérales ont été autorisées à
bouger, puis toute la protéine a été relâchée.
Le modèle prédit a ensuite été vérifié à l’aide du logiciel PROCHEK disponible sur la plateforme Biotech de validation des structures protéiques. Le diagramme de Ramachandran
montre que la majorité des résidus satisfont aux contraintes liées aux angles Φ et Ψ de la
chaîne principale ; en effet, 97% des résidus se trouvent dans les zones les plus favorables, les
3 % restants se partageant entre les zones additionnelles admises et les zones non autorisées.
Ces derniers résidus se trouvent dans les boucles n’ayant pas d’homologue dans les protéines
matrices ayant servi à la construction du modèle. Un affinement supplémentaire a donc été
réalisé spécifiquement dans ces régions et les angles Φ et Ψ des résidus (hors glycine) de ces
régions ont ainsi été corrigés. La planéité des chaînes latérales a été vérifiée à l’aide du
logiciel PROCHECK pour les groupes aromatiques (Phe, Tyr, Trp, His) et pour les
groupements terminaux plans (des acides aminés Arg, Asn, Asp, Gln, Glu). Les déviations au
sens des moindres carrés (RMSD : Root mean Square déviation) de la planéité ont été
calculées pour les atomes du modèle (par rapport aux valeurs idéales attendues). Les résidus
ayant des RMSD supérieurs à 0,03 Å pour les cycles aromatiques et à 0,02 Å pour les autres
groupes sont considérés comme hors gamme. Le modèle présente un nombre acceptable de
264
résidus hors gamme comparé aux structures des lipases de R. miehei, T. lanuginosa et
R. niveus. Les RMSD des longueurs et des angles de liaison ont également été calculés et sont
de 0,02 Å et 3,5° respectivement par rapport aux valeurs standards, ce qui indique des
paramètres structuraux corrects. Les rotamères ont été vérifiés à l’aide du logiciel WHATIF,
disponible sur la plate-forme biotech de validation des structures protéiques. Seuls deux
rotamères du modèle sont hors gamme selon cette étude.
Ces étapes de vérification des paramètres structuraux permettent de confirmer que la structure
tridimensionnelle est probablement correcte. A partir de ce modèle, une étude plus détaillée
des acides aminés impliqués dans la sélectivité va pouvoir être réalisée. Deux zones sont
cependant mal définies, il s’agit des boucles 108-120 et 207-220 qui sont des insertions non
présentes dans les structures de lipases homologues.
e)
Description du site actif de la lipase Lip2
Le repliement du modèle de la structure obtenue par homologie de Lip2 et des lipases de
T. lanuginosa et de R. miehei est très proche. Comme on peut le voir sur la figure III-57, les
éléments de structure secondaire (hélices α et brins β) sont très bien conservés. Les acides
aminés de la triade catalytique et du trou oxyanion sont parfaitement superposables (Figure
III-57). Les différences les plus marquées se trouvent au niveau des boucles de surface.
.
D230
S162
L163
T88
H289
Figure III-57 : Superposition de la structure de Lip2 (colorée en magenta), de la lipase de
R. miehei (colorée en vert) et de la lipase de T. lanuginosa.(colorée en gris). Les acides aminés de
la triade catalytique (Ser 162- Asp230- His289) et les acides aminés du trou oxyanion (Thr88 et
Leu163) impliqués dans la stabilisation de l’intermédiaire tétraédrique sont mis en évidence.
265
Le site actif se présente comme une crevasse hydrophobe avec une triade catalytique exposée
comme c’est le cas pour les lipases de la famille des lipases fongiques. Cette crevasse
hydrophobe est constituée des acides aminés suivants Thr88, Val94, Ile98, Ile100, Phe129,
Leu163, Pro190, Val232, Val235, Pro236 et Tyr241 correspondants aux acides aminés Ser82,
Trp88, Leu92, Phe94, Phe111, Leu145, Pro177, Val205, Leu208, Pro209 et Phe215 dans la
lipase de R. miehei. L’acide gras scissile d’un triglycéride est censé se positionner dans cette
crevasse hydrophobe, le substituant sn-2 vient se positionner sur le creux hydrophobe (dent)
composé par les acides aminés Ile204, Thr252, Val254 et Leu258 chez la lipase de R. miehei
correspondants aux acides aminés Ile231, Val283, Val285, Leu290 pour la lipase
Y. lipolytica.
f)
Conclusion :
A partir des alignements de structures primaire et secondaire, nous avons généré un modèle
de la structure de la lipase Lip2 de Y. lipolytica. Ce modèle a ensuite été affiné et ses
paramètres stéréochimiques vérifiés.
D’autre part, dans le cadre d’une autre thèse réalisée au laboratoire, il a permis de mieux
comprendre certains mécanismes impliqués dans la discrimination énantiomérique envers les
acides 2-bromo-arylacétiques. Des cibles de mutagenèse dirigée ont pu être déterminées.
Ainsi, il a notamment permis d’identifier 2 acides aminés : l’acide aspartique 97 et la valine
232 impliqués dans la reconnaissance et la discrimination énantiomérique des substrats
d’intérêt. Le mutant V232A montre une énantiosélectivité améliorée d’un ordre de grandeur
pour la résolution de l’ester éthylique de l’acide 2-bromo-phénylacétique (la valeur de E
passant de 5,5 pour la lipase sauvage à 59 pour le variant V232A). Pour la résolution de
l’ester éthylique de l’acide 2-bromo-o-tolylacetique, l’énantiosélectivité est améliorée d’un
facteur 4 (passant d’une valeur de E de 27 pour la lipase sauvage à une valeur de 111 pour le
variant V232A, voir Figure III-58). D’après le modèle, cette mutation permet un meilleur
placement du substrat S dans le site actif de l’enzyme, ce qui a pour effet d’améliorer à la fois
l’énantiosélectivité et la vitesse de la réaction (Cancino, et al., 2008).
Une publication afférente à la construction de ce modèle et à l’obtention de mutants
d’énantiosélectivité améliorée a été récemment soumise à ChemBioChem sous le titre
« Improvement of Yarrowia lipolytica lipase enantioselectivity by site-directed
mutagenesis targeted at the substrate binding site ».
266
Enantiomères R et S (mM)
30
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
Temps (h)
Figure III-58 : Cinétique d’hydrolyse des acides 2-bromo-o-tolylacetique (R et S) dans un milieu
biphasique (eau/décane v/v) à 25°C d’après Cancino et al. (2008). La concentration des substrats pour
la lipase sauvage S- () and R- ( ) et pour le variant V232A : S- (♦) and R- (•) a été reportée sur le
graphe pour différents temps de réaction. Les traits en gras représentent la vitesse initiale.
Ces résultats confirment la validité de notre modèle ; cependant, pour analyser plus finement
les mécanismes moléculaires qui interviennent dans la sélectivité de la lipase, ce seul modèle
ne suffit pas. Seule la résolution de la structure tridimensionnelle peut permettre d’avoir accès
à des informations plus fiables. Ainsi, ce modèle va pouvoir servir à réaliser le remplacement
moléculaire pour le jeu de données enregistré à 1,7 Å.
2.1.2.
Remplacement moléculaire avec le jeu de données à 1,7 Å.
Le remplacement moléculaire a donc été effectué dans un premier temps avec le programme
PHASER (du package ccp4) avec le modèle de la lipase réalisé précédemment pour tous les
groupes d’espaces probables. Aucune solution n’a cependant été trouvée. De nombreux essais
ont par la suite été réalisés avec ce même modèle mais tronqué :
-
sans la paupière
-
seules les structures secondaires ont été gardées sans les boucles
-
sous forme de squelette carboné de type polyalanine (toutes les chaînes latérales
tronquées).
Aucune des solutions trouvées par les programmes de remplacement moléculaire n’étaient de
bonne qualité. Doutant de la qualité de notre modèle, d’autres tentatives de remplacement
moléculaire ont été réalisées avec les lipases de structure homologue qui avaient servi à la
réalisation du modèle (dans ce cas aussi des essais avec seulement les structures secondaires,
le squelette polyalanine et sans le volet amphiphile ont été réalisées). Là encore, aucune
solution de remplacement moléculaire n’est satisfaisante. D’autres tentatives avec des
267
programmes de remplacement moléculaire différents (MOLREP, AMORE) n’ont pas donné
de meilleurs résultats. Ce résultat est quelque peu troublant car la lipase de Y. lipolytica
présente des taux d’homologie importants avec les autres lipases de la famille fongique. De
plus, l’alignement des structures tridimensionnelles de ces différentes lipases entre elles,
montre une très bonne conservation des structures secondaires. Trois causes ont été
potentiellement identifiées pour expliquer le fait que le remplacement moléculaire ne donne
pas de solutions :
-
La lipase de Y. lipolytica possède peut être une topologie quelque peu différente des
autres lipases. A ce stade seule la résolution expérimentale de la structure de Lip2
pourrait nous permettre de vérifier cette hypothèse.
-
Les cristaux ne sont peut être pas aussi bien organisés qu’il n’y paraît. Ainsi, des
cristaux apparemment monocristallins, mais présentant en réalité une superposition du
même système cristallin dans différentes orientations, peuvent être formés : dans ce
cas on parle de macles mérohédrales (Figure III-59)
Figure III-59 : Exemple de superposition de système cristallin
Dans notre cas une superposition parfaite ne sera pas possible car les paramètres de maille a, b
et c sont tous différents. Cependant comme deux paramètres sont proches (b = 132 Å et c =
138,5 Å), il est donc possible qu’une macle pseudo mérohédrale puisse avoir lieu. Des
programmes permettent de vérifier l’occurrence de macle de ce type. Nous avons donc soumis
notre jeu de données à une analyse sur un serveur disponible sur internet : The Merohedral
Crystal Twinning Server (http://nihserver.mbi.ucla.edu/Twinning/). Cette recherche a écarté
cette seconde hypothèse
Les paramètres de maille du cristal sont assez importants. En connaissant, le groupe d’espace,
le volume de la maille et en considérant que le taux de solvant habituellement retrouvé dans
les cristaux de protéines est aux alentours de 50 % (entre 20 et 70% selon les protéines), on
peut estimer le nombre de molécules de lipase présentes dans l’unité asymétrique. Dans notre
cas, ce nombre se situe entre 6 et 8 (nous l’appellerons x pour la suite de notre explication).
Ce grand nombre de molécules est peut être à l’origine des problèmes rencontrés. Ainsi lors
268
du remplacement moléculaire, les molécules du modèle sont placées une par une. La fonction
de rotation compare la fonction de Patterson pour une molécule du modèle avec la fonction de
Patterson calculée pour la structure à déterminer qui contient les x molécules et donc x
positionnements différents en termes de rotation. Ainsi même si une orientation correcte est
trouvée pour le modèle, elle ne représentera que 1/x ème du signal enregistré (et même moins
car de nombreuses parties du modèle ont été enlevées : les boucles, les chaînes latérales …).
De ce fait, la corrélation entre les deux fonctions de Patterson est moins apparente et les
solutions peuvent être noyées dans le bruit de fond. Si c’est bien le problème à l’origine de
l’échec du remplacement moléculaire, il faut changer de système cristallin et travailler avec
un système cristallin contenant moins de molécules dans l’unité asymétrique, c’est à dire
trouver de nouvelles conditions de cristallisation pour pouvoir résoudre le problème des
phases par cette méthode.
Malgré l’échec du remplacement moléculaire, d’autres outils sont à notre disposition pour
retrouver l’information de phase. Ainsi, l’introduction de dérivés lourds ou de diffuseurs
anomaux dans le cristal peut permettre de résoudre la structure tridimensionnelle de la lipase
par les méthodes de remplacement isomorphe multiple (avec ou sans diffusion anomale), ou
la technique MAD.
2.2. Dérivés lourds et diffuseurs anomaux
L’intégration d’atomes riches en électrons dans le cristal est réalisée par trempage. Les
composés diffusent dans l’édifice cristallin et vont se fixer à des endroits précis. Il n’y a
aucun moyen de prédire avec certitude quels sont les métaux lourds qui se fixeront le mieux
car l’obtention de dérivés dépend de l’exposition de groupements fonctionnels, de
l’environnement chimique local de l’état d’ionisation (autant de paramètres qui ne peuvent
être prédits sans la connaissance de la structure tridimensionnelle). Cependant, le choix des
dérivés lourds peut être quelque peu rationalisé en fonction des propriétés connues des
protéines et des ligands testés. Ainsi, les composés à base de mercure se fixent plus
particulièrement sur les groupements thiols libres et l’uranium va avoir tendance à aller se
fixer sur les parties acides des protéines.
Dans un premier temps, des trempages avec les métaux lourds suivants : HgCl2, K2PtCl4
KAu(CN)2, à 10 mM sont réalisés. Ces métaux lourds font partie des « sept magiques » avec
lesquels les chances de succès sont les plus importantes (Boggon and Shapiro, 2000). Aucune
dégradation des cristaux n’est observable, ce qui ne laisse pas beaucoup d’espoir quant à la
269
fixation de ces composés. L’enregistrement a été réalisé avec ces trois dérivés après des temps
de trempages de 17 heures. L’analyse de la fixation des métaux est réalisée à partir de la
comparaison des jeux de données du dérivé et de la lipase native. Les cartes de Patterson pour
chacun des jeux de données sont calculées et la différence entre la carte de Patterson du dérivé
et celle de la lipase native est réalisée. Si le dérivé a été fixé, alors des pics apparaîtront sur la
carte de Patterson différence. Aucun des dérivés n’a fixé d’atomes lourds.
D’autres trempages ont alors été réalisés avec de nombreux autres métaux lourds à une
concentration de 10 mM : le gadolinium sous forme Gd (CH3COO)3, le samarium sous forme
Sm(NO3)3, l’uranium sous forme K3UO2F5, l’osmium sous forme (NH4)2OsBr6, l’europium
sous forme EuCl3, l’iridium sous forme (NH4)5IrCl6, le plomb sous forme de penthamethyl
dithiocarbamate de Plomb, le tungstène sous forme NaWO4 , le cuivre sous forme de CuSO4,
le nickel sous forme NiCl2 et le zinc sous forme ZnCl2. Ces trois derniers métaux ont été
choisis pour leur effet sur l’activité de la lipase Lip2 de Y. lipolytica. Une étude montre en
effet, que la lipase est inactivée partiellement en présence de nickel ou de zinc, et totalement
en présence de cuivre (Yu, et al., 2007b). Ceci qui peut présager d’une fixation de ces métaux
sur la lipase.
Comme l’enregistrement des données dépend du temps de faisceau alloué au synchrotron,
tous les trempages n’ont pas encore pu être analysés. Le choix des trempages qui ont été
enregistrés (Tableau III-21) a été guidé par l’observation des cristaux au cours des trempages.
Dans le cas de l’osmium (composé coloré noir) un noircissement du cristal permet de se
rendre compte que le composé a pénétré dans le cristal. Cependant, pour les autres composés,
les cristaux supportent très bien jusqu’à plusieurs jours de trempages dans les solutions de
métaux lourds. Le choix des trempages qui ont été enregistrés s’est basé sur une méthode
développée par Boggon et Shapiro (2000) qui permet de prédire si une protéine et un métal
lourd auront des chances d’interagir. Elle consiste à incuber les deux composés pendant
quelques minutes et à réaliser une électrophorèse en conditions natives. Des différences dans
les profils de migration entre la protéine témoin et la protéine incubée avec un dérivé lourd
seront le témoin d’une interaction entre la protéine et les métaux lourds. Cette technique a été
réalisée pour cribler rapidement l’intérêt de plusieurs dérivés avec de l’enzyme à 1,5 g/L
(0,05 mM) et les composés à une concentration de 1 mM (Figure III-60).
Les seuls profils qui montrent des différences avec la lipase native sont ceux des incubations
avec l’osmium (puits 1), et le mercure (puits 8). Pour l’osmium, ceci confirme les
observations de noircissement du cristal déjà constatées pendant les trempages. Des cristaux
270
trempés en présence du HgCl2 avaient été précédemment testés et ne montraient aucune
fixation du mercure. Comme les interactions peuvent varier en fonction de la forme du
composé, d'autres dérivés de mercure ont été testés mais sous différentes formes : TAMM
(Tetrakis(acetoxymercuri)méthane), Phényl-Hg(CH3COO) et Hg(CH3COO)2.
N 1 2 3 4 5 N
6 7 8 9 10 11 12 N
Figure III-60 : Electrophorèse en conditions natives de l’enzyme Lip2 déglycosylée à 1,5 g/L
incubée avec différents métaux lourds à 1 mM (les métaux lourds sont marqués en gras). N native, 1-HgCl2, 2-Gd (CH3COO)3, 3-Sm (NO3)3, 4-K3UO2F5, 5- NaBr, 6-NiCl2, 7- NaWO4, 8(NH4)2OsBr6, 9-CuSO4, 10-EuCl3, 11-(NH4)5IrCl6, 12-penthamethyl dithiocarbamate de Plomb
Le récapitulatif des jeux de données enregistrés à l’ESRF est donné dans le tableau III-21. La
fixation des atomes lourds a été analysée par la carte de Patterson différence entre les jeux de
données de la lipase native et des dérivés enregistrés. Les résultats sont consignés dans le
tableau III-22.
Sur les 6 dérivés dont le diffractogramme a été enregistré, aucun pic significatif n’apparaît sur
les cartes de Patterson différence et ce, même avec l’osmium et les composés mercuriques
(HgCl2 et TAMM) qui présentaient des profils de migration particuliers sur les
électrophorèses en conditions natives. D’autres dérivés lourds restent à tester : en premier lieu
les dérivés à base de mercure seront enregistrés car il semble que le mercure se fixe à la lipase
Lip2 (Figure puits 1). Cette fixation est probablement liée à la présence de la cystéine libre
dans la lipase. L’absence de fixation des composés est peut être due à l’inaccessibilité du site
de fixation notamment pour l’osmium et le mercure qui semblaient interagir avec la protéine
en solution.
Cependant, cette étape reste assez longue avant de trouver un "bon" dérivé dans les bonnes
conditions de trempage. D'autres méthodes consistent à incorporer covalement un atome lourd
directement dans la chaîne polypeptidique. C'est le cas par exemple de la bioincorporation de
sélénométhionine. Des essais de bioincorporation de sélénométhionine dans la lipase produite
par la levure Y. lipolytica ont donc été initiés.
271
Native
Dérivé Hg
Dérivé Pt
Dérivé Au
Dérivé Os
Dérivé Sm
Dérivé TAMM
Ligne enregistrement
id14eh4
id23eh2
id23eh3
id23eh4
id14eh2
id14eh2
id14eh2
Résolution Å
68,7 - 1,7 Å
88,6 - 3,0 Å
88,7 - 3,5 Å
88,0 - 2,4 Å
95,0 - 3,9 Å
61,3 - 3,5 Å
73,3 -2,5 Å
947008
103119
77898
190277
61014
64345
273149
228475
42124
30877
77935
19188
26431
70999
Multiplicité
4,1
2,4
2,5
2,4
3,2
2,4
3,8
Complétude %
99,5% (99,9)
98,3% (98,3)
95,5% (96,4)
95,1% (86,8)
97,2% (98,2)
96,5% (98,4)
99,7% (99,7)
R sym %
7,3% (34,3)
10,5% (37,5)
12,7% (33,7)
6,7% (30,8)
8,3% (20,9)
5,5% (11,2)
6,5% (18,0)
6,7 (2,2)
6,1 (1,9)
4,4 (2,1)
12,1 (7,2)
2,3 (2,6)
4,9 (4,7)
7,8 (3,9)
Riso %
29,6%
27,5%
18,5%
36,3%
36,5%
9,7%
Rano %
7,7%
11,2%
4,0%
10,5%
5,7%
3,2%
Tableau III-21 : Récapitulatif des jeux de données enregistrés pour divers dérivés. Les paramètres enregistrés dans la dernière couronne de
résolution sont indiqués entre parenthèses Riso =
∑ | Fdérivé - Fnative |
∑ Fnative
hkl
hkl
et Rano =
∑
I+ − I−
∑( I
+
+ I−
)
Composé
testé
Temps de
trempage
Résolution
Fixation
HgCl2
17 heures
3,0 Å
Non
K2PtCl4
17 heures
3,5 Å
Non
KAu(CN)2
17 heures
2,4 Å
Non
(NH4)2OsBr6
4 jours
3,9 Å
Non
TAMM
3 jours
2,5 Å
Non
Sm(NO3)3
6 jours
3,5 Å
Non
Tableau III-22 : Analyse de la fixation des métaux lourds par la fonction de Patterson différence. Les composés ont été utilisés à une concentration de
10 mM.
2.3. Protéine Sélénométhionylée
Une des voies pour que le diffuseur anomal soit placé de manière reproductible dans le réseau
cristallin, consiste à produire une protéine ayant déjà intégré ce diffuseur anomal. Ainsi,
l’utilisation de protéines sélénométhyonylées comme outil de phasage a été rapportée pour la
première fois par Hendrickson et al. (1990) et est depuis une technique de choix pour
retrouver l’information de phase. La production de telles protéines se fait en remplaçant la
méthionine par de la sélénométhionine dans un milieu de culture minimum. Cependant, du
fait de la toxicité de ce composé, ceci peut conduire à une diminution de la production de
protéines. Dans le cas de protéines produites par la bactérie E. coli, les pourcentages
d’intégration avoisinent souvent les 100%, ce qui facilite le phasage. Dans le cas de la
production de protéines par les systèmes levuriens, peu de cas ont été référencés dans la
littérature (Tableau III-23), cependant le pourcentage d’intégration est souvent plus faible et
seuls quelques exemples montrent des taux d’incorporation proche de 100%.
Les deux cas où le taux d’incorporation de sélénométhionine est le plus important ont été
obtenus avec la levure S. cerevisiae. Dans le cas de la protéine QDE-1Deta N (Laurila, et al.,
2005), les auteurs attribuent leur succès au mode de production de l’enzyme, où la phase de
croissance de levure et d’expression de la protéine ont pu être découplées. Dans le cas de la
protéine Wrs 1 (Malkowski, et al., 2007), la production a été réalisée avec des souches
disruptées de S. cerevisiae. Les gènes SAM1 et SAM2 intervenant dans la conversion de la
méthionine en adenosylméthionine ont été délétés, ce qui empêche la conversion de la
sélénométhionine en un composé toxique (l’adénosyl-sélénométhionine), et favorise la
bioincorporation de sélénométhionine dans la protéine.
Tableau III-23: Récapitulatif des essais de production de protéines sélénométhionylées avec des
systèmes d’expression levuriens.
Enzyme
Hôte
d'expression
%
d'incorporation
Observations
Référence
ARN polymerase II
S. cerevisiae
65%
Insuffisant pour le phasage mais servent de
marqueur pour la construction du modèle
Bushnell et al.,2001
Dextranase
P.pastoris
50%
Résolution de la structure par la méthode
MAD
Larsson et al., 2001
b-mannanase Man5A
P.pastoris
40%
Pas de résolution
Xu et al., 2002
QDE-1 DeltaN
S. cerevisiae
98%
Pas de croissance en présence de
sélénométhionine mais expression de la
protéine d'intérêt.
Résolution de la structure tridimensionnelle
Laurilla et al., 2005
Wrs1
S. cerevisiae *
95%
Ingénierie de la souche - Résolution par la
méthode MAD
Malkowski et al., 2007
273
Pour que le pouvoir de phasage soit bon, il faut qu’il y ait environ une sélénométhionine pour
100 à 150 acides aminés. Si on envisage un phasage par la méthode MAD avec des
sélenométhionines pour la lipase de Y. lipolytica, il faut que l’incorporation de
sélénométhionine soit proche de 100%, car elle ne contient que deux méthionines pour 301
acides aminés.
2.3.1.
Essai de production en fermenteur
Un premier essai de production en fermenteur sur milieu minimum a été réalisé avec la
souche 329. Cette souche contient la lipase Lip2 en multicopie (16 copies) sous contrôle du
promoteur POX2. La quantité de lipase produite par cette souche est environ 10 fois plus
importante que pour une souche monocopie, ce qui permet de pallier la baisse de production
due à la toxicité de la sélénométhionine. D’autre part, la lipase est sous contrôle d’un
promoteur inductible, ainsi, la phase de croissance et la phase de production de lipase
pourront être découplées. Cette dernière phase est réalisée en présence de 0,1 g/L de
sélénométhionine. Il est à noter que le phénomène d’agrégation de la lipase qui avait été
observé systématiquement lors des deux premières années de cette étude lorsqu’elle était
produite en présence d’acide oléique n’a plus lieu depuis que le lot d’acide oléique a été
changé. Les causes de ce phénomène n’ont pas été explorées, mais sont peut-être à mettre en
relation avec un vieillissement de l’acide oléique.
Le suivi de l’activité lipase au cours de la fermentation est présenté sur la figure III-61.
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaPhase de
aaproduction de biomasse
aaa
sur glucose
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
Activité lipase (U/ml)
16
Phase de
production de
lipase sur acide
oléique en
présence de
sélénométhionine
12
8
4
0
0
5
10
15
Temps (heures)
Figure III-61 : Suivi de la production de lipase en cours de fermentation.
274
La moitié de la lipase est produite dans la phase de production de biomasse car le promoteur
POX2 n’est pas totalement réprimé en présence de glucose. Pour les productions habituelles
de lipases, la dé-répression du promoteur POX2 n’est pas un problème et l’ampleur du
phénomène est de moindre intensité car la production de lipase en présence d’acide oléique
est au moins 10 fois plus élevée si la production n’a pas lieu en présence de sélénométhionine.
Pour cette production, l’incorporation de sélénométhionine dans la souche ne pourra donc pas
être supérieure à 50 %. Une analyse en spectrométrie de masse (réalisée par la pate-forme
protéomique de l’IPBS) a tout de même été réalisée pour évaluer l’efficacité d’incorporation
de sélénométhionine. La lipase a préalablement été purifiée selon la procédure habituelle, puis
déglycosylée pour s’affranchir de la variabilité de masse générée par l’hétérogènéité de la
glycosylation et finalement une précipitation au TCA a été réalisée. Les spectres de masse de
la lipase native et de la lipase potentiellement sélénométhionylée sont montrés sur la figure
III-62.
La masse prédite de la lipase est de 33385,8 or, il y a deux sites de N glycosylation. Après
déglycosylation par l'endo hf (NEB), l'enzyme déglycosylée porte donc deux résidus GlcNac
(chacun de masse 200). Ce qui correspond à la masse moyenne de 33 785,5 observée pour la
lipase native déglycosylée. Les autres pics sont dus à des déglycosylation incomplètes
(résidus de mannose de masse molaire 163).
Lipase
native
+ 156 ?
+ 47
+ 163
+ 163
+ 47
+ 163
Figure III-62 : Spectres de masse de la lipase native et de la lipase potentiellement
sélénométhionylée. Toutes deux ont été préalablement déglycosylées.
275
Pour la lipase produite en présence de sélénométhionine, les pourcentages des différents
composés sont récapitulés dans le tableau III-4. La masse de la lipase native n’est pas
retrouvée, il y a un delta de 156 avec cette masse de Lip2 native. Cette lipase a été produite
avec une souche multicopie surproduisant Lip2 et correspond à la masse molaire d’une
arginine. Il s’agit peut être un clivage imparfait de la séquence d'adressage en effet, celle-ci
contient une arginine comme dernier acide aminé.
Tableau III-24 : Aires des pics obtenus pour le spectre de masse de la lipase potentiellement
sélénométhionylée.
n°
Forme
Masse moyenne
Aire
%
1
M LIP2 N + 156 (R)
33941,1
6664,1
42%
2
M LIP2 N + 156 (R) + 46
33987,2
6553,1
41%
3
M LIP2 N + 156 (R) + 46 + 47
34034,1
2809,1
18%
Les deux autres pics majoritaires obtenus présentent des delta de 46 et 47. Ces différences de
masses correspondent à la différence de masse entre un atome de soufre (32 g/mol) et un
atome de sélénium (79 g/mol). Le pic n°2 correspond donc à la forme de lipase portant une
seule sélénométhionine et représente 42 % des espèces en présence et le pic n°3 à la forme
avec 2 Séléno-Méthionines et ne représente que 18 % de la lipase produite. La lipase disélénométhionylée n’est donc pas la principale forme au sein de l’échantillon. Au final, le
taux d’incorporation de la sélénométhionine est de 38 %, même si ce taux est trop faible. Des
essais de cristallisation sont en cours avec cette lipase.
D’autre part, ce résultat préliminaire laisse penser que le pourcentage d’incorporation pouvait
être grandement amélioré juste en modulant la conduite du procédé. En effet, nous avons vu
qu’environ la moitié de la lipase native a été produite sans qu’il y ait présence de
sélénométhionine. Si on considère que les 42 % de lipase non sélénométhionylée ont été
obtenus dans la phase de croissance de la levure, alors, le taux d’incorporation de la lipase
pendant la phase de production s’élève à 65 %. Pour obtenir une lipase avec un maximum
d’incorporation de sélénométhionine, les phases de production et de croissance doivent être
totalement découplées. Comme la lipase Lip2 est extracellulaire, on peut envisager, une
première phase de production de biomasse en fermenteur sur glucose sans sélénométhionine,
la biomasse est alors récupérée et le surnageant de culture éliminé. La production de lipase est
alors effectuée avec cette biomasse dans un nouveau milieu de culture contenant de l’acide
oléique et de la sélénométhionine. Pour éviter la production de lipase avec une seule
sélénométhionine incorporée, on peut envisager de rajouter la sélénométhionine en fin de
production de biomasse.
276
2.3.2.
Ingénierie de la voie métabolique de biosynthèse de la méthionine
chez Y.lipolytica
Pour s’assurer que toutes les méthionines seront bien remplacées par des sélénométhionines,
il ne s’agit pas seulement de rajouter de la sélénométhionine, en effet, Y. lipolytica possède sa
propre voie de biosynthèse de la méthionine. Nous avons donc envisagé de réaliser
l’ingénierie de cette voie métabolique pour bloquer ou au moins diminuer cette voie de
biosynthèse. Pour cela, nous nous sommes appuyés sur les travaux de Landaux et al., (2007)
qui ont construit le cycle de biosynthèse des acides soufrés chez Y. lipolytica par comparaison
avec celui déjà connu de S. cerevisiae (Figure III-63).
a)
Gène MET6
La biosynthèse de méthionine est réalisée par le transfert d’un groupement méthyl sur une
homocystéine par une homocystéine méthyltransférase (ou méthionine synthase) (MET6 /
YALIB14509g). La délétion de ce gène a donc été réalisée par insertion d’une cassette de
délétion au locus du gène à déléter. La construction de cette cassette de délétion est détaillée
dans le chapitre matériel et méthode. Elle comprend, une zone de 900 bp comprenant la zone
amont du gène à déléter, un gène de sélection (de résistance à l’hygromycine) et la zone en
aval du gène à déléter (environ 1100 bp). Les transformations ont été réalisées sur un milieu
riche YPD hph complémenté avec différentes concentrations de méthionine (10 et 100 mg/L)
et complémenté avec les 19 autres acides aminés et en adénine (0 et 10 mg/L de chaque). Les
taux de transformation sont exceptionnellement bas et, après vérification par PCR, aucun des
transformants testés n’a intégré la cassette de délétion au locus voulu (certains l’ont intégrée à
des locus différents et d’autres sont des mutants spontanés de résistance à l’hygromycine).
L’hypothèse retenue pour expliquer ce phénomène est que la délétion du gène MET6 est
létale pour Y. lipolytica. Ainsi, tous les transformants qui ont inséré la cassette de délétion au
locus voulu n’ont pas été capables de croître.
Chez S. cerevisiae (Suliman, et al., 2005) et A. nidulans (Kacprzak, et al., 2003) la disruption
du gène MET6 est totalement complémentée par la supplémentation en méthionine. Mais ce
n’est pas le cas chez toutes les levures. Ainsi pour certaines levures, la complémentation en
méthionine seule ne suffit pas à rétablir le phénotype initial. C’est les cas pour les levures de
Cryptococcus neoformans et Schizosaccharomyces pombe. Chez Cryptococcus neoformans
l’auxotrophie à la méthionine est obtenue avec la délétion de ce gène mais la croissance n’est
pas optimale même en complémentant le milieu avec de la méthionine ; en outre, le
champignon est avirulent et plus sensible aux antifongiques (Pascon, et al., 2004). De même,
277
la disruption du gène de la méthionine synthase (met26) chez Schizosaccharomyces pombe
conduit à l’obtention de transformants nécessitant à la fois une complémentation en
méthionine et en adénine pour pousser (Fujita, et al., 2006).
Chez Y. lipolytica malgré la complémentation dans ces deux composés, aucun transformant
n’a pu être isolé. C’est aussi la cas pour la levure diploïde C. albicans (Suliman, et al., 2007)
chez qui l’obtention du double mutant met6/met6 n’a pu être obtenue. L’insuffisance en
méthionine n’est pas responsable puisque la levure possède une perméase active qui
transporte la méthionine (Kaur and Mishra, 1991), et que la croissance de mutants
auxotrophes pour la méthionine obtenus par ailleurs a pu être rétablie par une
complémentation en méthionine (Poulter, et al., 1982; Viaene, et al., 2000). Pour mieux
étudier le phénomène, le gène MET6 a été mis sous contrôle d’un promoteur inductible.
Ainsi, des mutants ont pu être obtenus dans des conditions d’induction. Une étude du mutant
lorsque le promoteur est réprimé, a montré une croissance possible en présence de
méthionine. La répression de l’expression de la méhionine synthase n’est cependant pas totale
ce qui permet le maintien en vie des levures.
La délétion du gène de la méthionine synthase entraîne probablement une accumulation de
d’homocystéine dans la cellule : pour les levures S. pombe (Fujita, et al., 2006) et
S. cerevisiae (Jakubowski, 1991), cette accumulation s’avère toxique. Dans le cas de
S. cerevisiae la présence de la voie de conversion de l’homocystéine en cystéine permet de
réguler les taux d’homocystéine dans la cellule et de limiter la toxicité (Jakubowski, 1991).
Malgré l’existence de cette voie chez Y. lipolytica, il semble que, comme pour C. albicans,
cette délétion soit létale pour la levure. Les mécanismes induisant la toxicité de
l’homocystéine ne sont pas encore clairement déterminés et semblent être dépendants de
l’organisme. Chez S. cerevisiae, l’accumulation d’homocystéine se traduit par un stress au
niveau du réticulum endoplasmique (Kumar, et al., 2006). D’autre part l’homocystéine
semble interférer avec la voie de biosynthèse des purines chez S. pombe (Fujita, et al., 2006)
et la voie de biosynthèse des stérols (Parks and Casey, 1995).
b)
Gène MET2
Pour éviter l’accumulation de ce composé dans le milieu, un autre gène a été ciblé, le gène
MET2 (YALIE00836g). Ce gène code pour une L-homoserine-O-acetyltransferase qui permet
la formation de O-acétylhomosérine à partir de laquelle l’homocystéine (puis la méthionine)
sont synthétisées. La cassette de délétion a été construite et la transformation, là encore, n’a
donné aucun disruptant.
278
YALI0B17930g
YALI024233g
YALI0B08184g
YALI0E00418g
YALI0B08140g
YALI0D11176g
YALI0E00836g
YALI0E16368g
YALI0D25168g
YALI0F11759g
YALI0D00605g YALI0D17402g
YALI0E30129g
YALI0B14509g
YALI0E09108g YALI0F05874g
YALI0E12683g
YALI0C17831g
Saccharomyces cerevisiae
Yarrowia lipolytica
Figure III-63 : Construction des voies métaboliques des acides aminés soufrés chez la levure Y. lipolytica par comparaison avec celle de S. cerevisiae.
(d’après Landaud et al., 2007). Mise en évidence des gènes ciblés pour l’ingénierie de la voie métabolique de biosynthèse de la méthionine.
279
La délétion de ce gène a été rapportée pour plusieurs levures : S. cerevisiae (Hansen and
Kielland-brandt, 1996; Ono, et al., 1991), S. pombe (Ma, et al., 2007), Cryptococcus
neoformans (Nazi, et al., 2007) et P. pastoris (Thor, et al., 2005). La disruption de ce gène
d’après la voie de biosynthèse (figure III-63) peut entraîner l’accumulation de sulfides. Ce
phénomène a été observé dans le cas de S. cerevisiae (Ono, et al., 1991). De même, une
accumulation de sulfites dans le milieu extracellulaire chez cette même levure a aussi été mise
en évidence (Hansen and Kielland-brandt, 1996) lors de la délétion de ce gène. Des
phénomènes de toxicité induits par les sulfites avaient été mis en évidence par ailleurs chez
cette même levure (Pilkington and Rose, 1988) sans pour autant que cela soit létal pour la
levure. La disruption de ce gène est par contre létal pour la levure Y. lipolytica ce qui laisse
supposer un métabolisme différent chez cette levure et peut être une sensibilité particulière à
ces deux types de composés. Cependant, la délétion du gène MET17 codant pour l’Oacetylhomosérine sulfhydrylase intervenant dans la transformation de l’O-acétylhomosérine
en l’homocystéine a déjà été réalisée chez Y. lipolytica. Les mutants obtenus ne sont pas
auxotrophes et aucun effet sur la croissance des transformants n’a pu être mesuré (Brzywczy
and Paszewski, 1993).
La disruption de ce gène peut aussi conduire à l’accumulation d’homosérine. Cependant, son
accumulation dans la cellule doit être de faible ampleur car celle-ci intervient aussi dans la
voie de biosynthèse de la thréonine, d’autre part aucune accumulation ou effet toxique de ce
composé n’ont jamais été rapporté dans la littérature.
c)
Gène SAM
Une voie originale a été développée pour améliorer l’incorporation de sélénométhionine dans
les protéines : elle consiste, non pas à empêcher la formation de méthionine, mais à couper la
voie de formation de la S-adenosyl-méthionine (Malkowski, et al., 2007). Les auteurs
formulent l’hypothèse que la toxicité de la sélénométhionine a pour origine sa conversion en
un dérivé séléno de la S-adenosylméthionine (S-AdoMet). La délétion des deux gènes codant
pour des S-Adénosylméthionine synthase SAM1 et SAM2 (permettant la conversion de
méthionine en S-AdoMet) entraîne une toxicité moindre de la sélénométhionine et permet une
meilleure incorporation de la sélénométhionine dans les protéines. Chez Y. lipolytica, une
seule copie de la S-Adenométhionine synthase est présente et est codée par le gène
YALIB14509g. La disruption de ce gène, là encore, n’a conduit à aucun disruptant et ce,
malgré la complémentation en S-Adomet dans le milieu de sélection. Ce résultat surprenant
nous a amenés à rechercher dans le génome de Y. lipolytica les perméases à la S-adénosyl
280
méthionine. Aucun gène codant pour une S-adenosylméthionine perméase n’est annoté dans
le génome de Y. lipolytica comme étant homologue à une S-adénosylméthionine perméase.
Un blast avec la S-adénosyl perméase (SAM3) de S. cerevisiae montre un faible pourcentage
d’homologie avec des protéines annotées comme homologues à GAP1 : une perméase non
spécifique des acides aminés de S. cerevisiae. On notera que 8 gènes dans le génome de
Y. lipolytica sont fortement homologues avec GAP1 : YALI0B16522g, YALI0C17237g,
YALI0B19800g, YALI0F19866g, YALI0B19492g, YALI0E10219g et YALI0C09889g.
Peut-être que l’un d’entre eux est responsable du transport de la S-adénosyl méthionine.
Cependant pour tous, l’homologie avec SAM3 est moindre qu’avec GAP1. Là encore, ceci
met en évidence les particularités du métabolisme des composés soufrés chez Y. lipolytica.
d)
Conclusion et Perspectives
D’autres possibilités restent encore à explorer dans l’ingénierie de la voie de biosynthèse de la
méthionine. La délétion des gènes MET13 et MET7 codant respectivement pour une
méthylènetétrahydrofolate réductase et une folylpolyglutamate synthétase reste envisageable.
En effet, le groupement méthyl qui permet la conversion de l’homocystéine en méthionine
provient du N5-methyltetrahydropteroyltri-L-glutamate. Celui-ci est issu de la conversion
N5,N10-methylenetetrahydrofolate par les enzymes codées par les gènes MET13 et MET7
chez S. cerevisiae. Chez Y. lipolytica, le gène YALI0E24497g est annoté comme étant
l’équivalent de Met7. Aucun gène n’est annoté comme étant l’équivalent de Met13. Un Blast
sur le génome a permis d’identifier le gène YALI0B00572g codant pour une
méthylènetétrahydrofolate réductase, cette enzyme joue peut être le rôle de MET13 dans
S. cerevisiae. En outre, comme la délétion des gènes a, à chaque fois, conduit à une mutation
létale, une stratégie plus judicieuse pourrait consister à une moduler leur activité (plutôt que
de les déléter), en délétant progressivement leur promoteur par exemple.
Il semble que chez Y. lipolytica la voie de biosynthèse de la méthionine soit assez
difficilement modifiable. En effet, sur les trois gènes ciblés pour délétion, aucun disruptant
n’a pu être obtenu. On notera que cette levure possède une très faible quantité de méthionine
comparée aux autres levures (Morzycka, et al., 1976) et que la voie de biosynthèse de
composés soufrés est particulièrement développée (Bonnarme, et al., 2001; Cholet, et al.,
2008) car c’est une levure intervenant dans la maturation des fromages. D’autre part, la
modification d’une voie métabolique n’est pas une chose aisée. En effet, nous avons pu voir
que dans certains cas la délétion d’un gène codant pouvait entraîner d’autres types
d’auxotrophies, sans que cela soit prédictible ou compréhensible même à posteriori. En effet,
281
les inter-connexions entre les voies métaboliques ne sont pas toutes connues, et de plus, elles
diffèrent selon les organismes considérés. Ici, cependant, les transformations ont été réalisées
sur un milieu riche, celui-ci a, en plus été complémenté en méthionine, et également avec les
19 autres acides aminés ainsi qu’en adénine. Par ailleurs, il convient de signaler que la
connaissance des voies métaboliques des acides aminés soufrés est limitée chez la levure Y.
lipolytica. Les gènes ont été ciblés par rapport à la voie de biosynthèse des acides aminés
soufrés chez S. cerevisiae. Au vu des résultats, ces voies métaboliques sont certainement
particulières et différentes chez Y. lipolytica. Ainsi, certains homologues n’ont peut être pas la
fonction prédite et il est bien évident que d’autres gènes non identifiés puissent intervenir
dans cette biosynthèse.
D’autres
stratégies
peuvent
être
envisagées
pour
améliorer
l’incorporation
de
sélénométhionine dans la lipase. La première pourrait consister à jouer sur les perméases
permettant le transport des acides aminés (et de leurs homologues toxiques) dans la cellule. Il
en existe de nombreuses qui peuvent être non spécifiques (Général Amino acid Perméase
GAP) ou spécifique d’un acide aminé particulier. Des perméases spécifiques des méthionines
ont déjà été identifiées chez les levures. Chez S. cerevisiae, une perméase MUP1 est
spécifique du transport de la méthionine et de certains de ses analogues comme la
sélénométhionine (Gits and Grenson, 1967). Chez Y. lipolytica, 5 gènes putatifs ont été
identifiés comme étant des homologues à cette perméase : YALI0D16137g, YALI0F03498g,
YALI0D1946g, YALI0F07018g, YALI0F25795g. On notera que cette redondance n’est pas
présente chez S. cerevisiae ni chez les autres levures intervenant dans la maturation des
fromages ce qui dénote un métabolisme particulier en ce qui concerne la méthionine.
Généralement, l’expression de ces perméases est réprimée par la présence de sources de
carbone (ammoniaque, glutamine…) dans le milieu de culture. Ainsi, le contrôle de
l’expression de ces perméases, en les mettant sous contrôle d’un promoteur fort, pourrait
faciliter l’entrée de la sélénométhionine dans la cellule et favoriser son incorporation dans les
protéines.
Une stratégie complémentaire pourrait être d’augmenter le nombre de méthionine dans la
lipase. En effet, nous avons vu que pour avoir un bon pouvoir de phasage, il était nécessaire
d’avoir au minimum une sélénométhionine pour 100 à 150 acides aminés et que la lipase Lip2
possédait seulement deux méthionines pour 301 acides aminés. Les acides aminés les plus
propices à changer sont la leucine et l’isoleucine et dans une moindre mesure la valine
(Leahy, et al., 1994).
282
2.4. Conclusion
Les essais de cristallisation avec la lipase déglycosylée ont permis d’obtenir des cristaux
monocristallins à partir desquels un jeu de données à 1,7Å a été enregistré. La méthode du
remplacement moléculaire, lorsqu’elle fonctionne, est la technique la plus rapide pour
résoudre la structure à partir d’un jeu de données. Dans notre cas, aucune solution n’a été
trouvée par cette méthode, probablement à cause d’un grand nombre de lipase dans l’unité
asymétrique. Les essais d’incorporation de métaux lourds dans l’édifice cristallin ont permis
d’identifier l’osmium et le mercure comme étant des atomes potentiellement intéressant pour
la résolution de la structure par remplacement isomorphe multiple. Une optimisation de la
fixation des ces métaux dans l’édifice cristallin est actuellement en cours. D’autre part, même
si les résultats préliminaires sont encourageants, la bioincorporation de sélénométhionine dans
la lipase est encore trop faible pour que le phasage par la méthode MAD soit réalisé.
Ce système cristallin contenant de nombreuses lipases dans l’unité asymétrique peut aussi
poser des problèmes dans le cas des méthodes expérimentales de phasage. En effet, les
fonctions de Patterson différences qui permettent la localisation des atomes lourds ou des
diffuseurs anomaux peuvent être difficilement exploitables dans le cas d’un grand nombre de
diffuseurs anomaux dans l’unité asymétrique. En parallèle des essais de production de lipase
sélénométhionylée et des essais de trempages dans des atomes lourds, il a donc été décidé de
trouver de nouvelles conditions de cristallisation aboutissant à un système cristallin avec
moins de lipases dans l’unité asymétrique.
3. Recherche conditions de cristallisation avec maille plus
petite.
3.1. Ancien crible
Les premiers cribles de cristallisation avaient permis d’identifier d’autres conditions de
cristallisation. Les cristaux obtenus en présence de 4M de formate de sodium sont de forme
oblongue (Figure III-64) et ont été reproduits en plaque 24 puits.
La diffraction de ces cristaux sur ligne synchrotron a permis d’enregistrer des clichés de
diffraction avec des taches de diffraction allant au mieux jusqu’à 3,5 Å. Cependant, le jeu de
données n’a pas été enregistré car une première indexation donnait un système cristallin de
283
type hexagonal et les paramètres de maille suivants α = β= 90° γ= 120° et a = b = 125 Å et c =
400 Å. Soit une maille plus de deux fois plus grande que la maille obtenue avec les premiers
cristaux et avec de 7 à 16 lipases dans l’unité asymétrique (d’après les prévisions du calcul du
coefficient de Matthews).
Figure III-64 : Cristaux de la lipase Lip2 déglycosylée obtenus en présence de formate.
3.2. Nouvelles pistes de cristallisation
De nouveaux criblages haut-débit de conditions de cristallisation ont donc été réalisés avec de
nouveaux screens commerciaux. La gamme des screens JCSG core (I, II, III et IV) a été
utilisée ainsi que le screen pH Clear Suite. Les plaques Greiner utilisées ont à nouveau permis
de tester trois conditionnements différents de la lipase. La cristallisation de la lipase
déglycosylée dans les essais précédents a toujours été obtenue pour les conditionnements avec
une faible force ionique, le conditionnement de la lipase dans 500 mM de NaCl n’a donc pas
été retenu. De plus les cristaux obtenus en présence de l’acide ortho bromo-phényl acétique
étaient mieux formés que ceux produits sans cet acide, il se peut que ce substrat stabilise la
lipase. De ce fait un autre acide : l’acide oléique a été testé. Le problème de la miscibilité de
l’acide oléique dans la phase aqueuse a été résolu en s’inspirant d’expériences antérieures sur
la cristallisation d’un mutant inactif de la lipase de T. lanuginosa en présence d’acide oléique
(Yapoudjian, et al., 2002).
Les trois conditionnements de la lipase sont donc :
-
Lip2 12 g/L dans Tris 20 mM pH 7,8
-
Lip2 13 g/L dans tris 20 mM pH 7,8 + l’acide ortho bromo-phényl acétique 8 mM
dans DMSO 5% final
-
Lip2 14 g/L dans tris 20 mM pH 7,8 + Acide oléique 10 mM + sodium
taurodéoxycholate (NaDTC) 10 mM dans isopropanol 5% final.
284
Des petits cristaux 50 x 100 x 40 nm apparaissent dans les conditions suivantes :
-
1,0 M tartrate Na/K
-
0,2 M lithium sulfate
-
0,1 M Tris pH 7,0
et seulement pour la lipase conditionnée en présence d’acide oléique. Ils ont été testés
directement sur la ligne de l’ESRF. L’indexation du jeu de données a mis en évidence qu’il
s’agissait d’un système cristallin quadratique (tétragonal) dont les paramètres de maille sont :
a = b = 162, c =173 et α = β = γ 90°. Le groupe d’espace est donc de type P4x2x2. L’examen
des extinctions systématiques a permis de lever l’indétermination sur l’axe d’ordre deux : il
s’agit d’un axe hélicoïdal, mais pas sur l’axe d’ordre quatre. Ainsi, quatre groupes d’espace
sont possibles : P4212, P41212, P42212 ou P43212.
Le groupe d’espace et les paramètres de maille ont pu être déterminés. Ce type de paramètres
correspond à une maille avec au minimum 8 lipases dans l’unité asymétrique (pour le groupe
d’espace. C’est beaucoup. L’enregistrement du jeu de données n’a pu se faire qu’à une
résolution de 4,0 Å (voir récapitulatif du jeu de données tableau III-25). Probablement que
l’obtention de cristaux de taille plus grande permettrait d’améliorer la diffraction. Ainsi, nous
sommes actuellement en train d’essayer d’optimiser la cristallogenèse de ce type de cristaux.
Pour le moment, nous n’avons pas réussi à les reproduire en plaques 24 puits.
12,65 - 4,0 Å
4,22 - 4,0 Å
120072
10784
18271
2232
6,5
4,8
Complétude
91,5%
79,5%
R sym
16,1%
39,5%
4,5
1,9
Muliplicité
Tableau III-25 : Récapitulatif du jeu de données enregistré à 4,0 Å
Le remplacement moléculaire a été lancé dans les différents groupes d’espaces probables.
Pour réaliser le modèle de départ, les enzymes homologues à Lip2 ont été alignées
structuralement (logiciel Swiss pdb Viewer) par minimisation du rmsd. Seuls les éléments de
structure secondaire qui se superposaient ont été conservés. Les calculs de remplacement
moléculaires ont été réalisés avec les squelettes polyalanines de ces éléments de structure
secondaire mais n’ont pas donné de résultats concluants.
285
4. Conclusion :
D’autres conditions de cristallisation donnent des cristaux intéressants, cependant il semble
que la lipase Lip2 ait tendance à cristalliser dans des mailles de tailles importantes, et que le
remplacement moléculaire ne soit pas adapté à la résolution de sa structure. Celle-ci doit donc
passer par les méthodes de phasages expérimentales. L’obtention de dérivés lourds par
trempage est une méthode qui peut être assez longue avant de trouver le ou les atomes lourds
qui vont se fixer dans le réseau cristallin. Ainsi, l’utilisation de protéine sélénométhionylée
nous paraît une méthode de choix. D’autre part, la sélénométhionine a une composante
anomale importante dans la gamme des rayons X qui permet d’envisager l’utilisation de la
méthode de phasage MAD. Cette méthode consiste à enregistrer plusieurs jeux de données à
des longueurs d’onde différentes sur un même cristal contenant un diffuseur anomal et permet
de s’affranchir des défauts d’isomorphismes rencontrés dans les méthodes de phasage utilisant
le remplacement isomorphe. D’autre part, nous avons vu que la bio-incorporation de
sélénométhionine dans les protéines produites par des systèmes d’expression levuriens était
loin d’être optimale à de rares exceptions près. A ce jour, aucun cas de production de
protéines sélénométhionylées produites par la levure Y. lipolytica n’a été référencée dans la
littérature. Les premiers résultats de bio-incorporation de sélénométhionine dans cette levure
se sont avérés être encourageants, mais demandent à être optimisés. Le développement d’un
tel système de production chez cette levure présenterait un grand intérêt et ajouterait une plus
value au système d’expression déjà complet « Yarrowia lipolytica ».
286
Conclusion générale
287
CONCLUSION
Durant ces quatre années de thèse mon travail s’est articulé autour de l’ingénierie de la lipase
Lip2 de Yarrowia lipolytica. Cette lipase présente de nombreuses applications sur un plan
biotechnologique (traitement de l’insuffisance pancréatique humaine, traitement d’effluents
chargés en matière grasse) ainsi qu’un intérêt croissant dans le domaine des
biotransformations : énantiosélectivité envers les esters d’acides 2-bromo-arylacétiques
(précurseurs à de nombreuses classes de médicaments), sélectivité vis-à-vis de la longueur de
chaine des acides gras en vue de la purification d’acides gras d’intérêt… Cependant, ces
dernières applications dans le domaine des biotransformations ne sont actuellement pas
développées à des échelles industrielles. Les limitations majeures à son utilisation résident
d’une part, dans sa faible thermostabilité, et d’autre part, dans une sélectivité
insuffisante en fonction des applications.
Dans le cadre de l’amélioration des propriétés de cette lipase, deux méthodes efficaces sont la
voie de l’évolution dirigée et celle de l’évolution rationnelle. Nous avons donc développé au
cours de ces travaux de thèse deux outils génériques permettant de réaliser l’amélioration de
la lipase Lip2 de Y. lipolytica : un système d’expression de protéines pour le criblage à hautdébit d’enzymes optimisées permettant son amélioration par évolution dirigée et un modèle
tridimensionnel de cette lipase permettant l’utilisation de la voie de l’évolution rationnelle et
l’étude des relations structure-fonction pour améliorer ses propriétés.
Le premier outil développé s’inscrit dans le cadre de l’amélioration des propriétés par
évolution dirigée. L’évolution dirigée d’enzyme nécessite de cribler de très nombreux variants
de l’enzyme afin d’en sélectionner un sur une propriété améliorée. Pour identifier clairement
les variants aux propriétés améliorées, le procédé de criblage doit être à la fois sensible et
robuste (avec une faible variabilité). Ceci évite la sélection de faux positifs et donc des étapes
de criblage complémentaires souvent coûteuses en temps. Au début de la thèse cependant,
aucun système d’expression eucaryote n’était approprié pour ce type d’application du fait de
la variabilité apportée par l’étape de transformation du gène chez les levures (intégration non
ciblée, intégration multicopies…). D’autre part, un système d’expression performant
eucaryote existait déjà pour la lipase Lip2 : elle est exprimée de manière recombinante, chez
son hôte naturel, la levure Yarrowia lipolytica. Cette levure alternative à Saccharomyces
cerevisiae est un système d’expression performant et avéré pour l’expression hétérologue de
protéines. La première partie de la thèse a été consacrée à la mise au point d’un système
289
d’expression eucaryote original pour l’évolution dirigée d’enzyme chez la levure Y.
lipolytica. Le succès d’une campagne d’évolution moléculaire dirigée repose sur le débit de
criblage : plus le nombre de transformants testés sera grand, et plus les chances d’en trouver
un avec une propriété améliorée seront importantes. Ainsi la première étape a consisté à
adapter les conditions de culture et d’expression de protéine en format microplaque 96 puits.
Toutes les étapes du criblage ont été analysées de manière statistique et optimisées une à une.
Le problème de la variabilité apportée par l’étape de transformation du gène chez les levures a
été solutionné en intégrant dans le génome de Y. lipolytica, une plate-forme d’intégration où
la cassette d’expression va s’intégrer de manière ciblée. De cette manière, une
reproductibilité compatible avec une campagne de criblage haut débit est atteinte. Avec
cette souche, la variabilité statistique est de 18,9% (contre 37 % avec la souche sauvage), ce
qui la rend compatible avec un criblage d’enzymes optimisées en minimisant le nombre de
faux positifs. Par ailleurs, le taux de transformation de cette souche a été multiplié par 10,
permettant d’atteindre 8000 transformants par µg d’ADN et d’obtenir sans difficulté 3 à 5
mille clones sur une boite de Pétri 20cms*20cms. On notera que la contribution de la
variabilité apportée par le test enzymatique de 11,7 % compte pour près des 2/3 à la variabilité
du procédé total (18,9 %). Cette forte variabilité est dépendante de l’activité enzymatique
testée : l’activité lipase. Il est probable que pour d’autres activités enzymatiques la variabilité
apportée par le test enzymatique soit améliorée et que la reproductibilité globale s’en trouve
améliorée. Notons aussi que l’utilisation d’une autre plate-forme que la zone zéta (favorisant
aussi la recombinaison non homologue) permettrait certainement de diminuer le taux de
transformants ayant intégré la cassette d’expression à un autre locus que le locus d’intégration
ciblé.
La souche développée pour le criblage haut débit d’activités enzymatiques présente des
avantages pour d’autres applications comme la création de mutants par mutagenèse dirigée.
Ainsi, comme l’expression protéique est reproductible d’un mutant à l’autre, l’activité
spécifique de deux variants peut être directement comparée. Aujourd’hui c’est la souche de
référence dans laquelle se font toutes les transformations par mutagenèse dirigée dans le
laboratoire. D’autre part, ce système d’expression n’est pas spécifique à la lipase Lip2 de
Y. lipolytica, c’est un système d’expression générique qui peut être utilisé pour l’évolution
dirigée d’autres enzymes. Actuellement, la féruloyl estérase d’Aspergillus niger est exprimée
chez Y. lipolytica à des fins d’évolution dirigée.
290
Grâce au système de criblage développé, des banques de mutants ont été obtenues par
mutagenèse aléatoire classique (PCR à erreurs) et un mutant thermostable de l’enzyme a
été identifié : le variant C244A.
Il a été mis en évidence qu’un phénomène d’agrégation des protéines était la cause majeure de
l’instabilité thermique de cette lipase. Lorsque le gène LIP2 est sous contrôle du promoteur
POX2, la production de l’enzyme est induite par l’acide oléique. Nous avons démontré que ce
dernier avait pour effet de complexer l’enzyme dans des complexes lipides–enzymes
indissociables. Pour résoudre ce problème, nous avons modifié le système d’expression en
utilisant un promoteur constitutif, le promoteur TEF, qui permet une production
d’enzyme sans acide oléique et donc non agrégée. Ainsi, après purification, la
thermostabilité de la lipase sauvage et du variant 244A a été caractérisée. Le variant 244A
présente une thermostabilité grandement améliorée par rapport à la lipase sauvage. Son
temps de demi-vie est multiplié par 127 à 60°C et par 21 à 90°C. Cependant, l’agrégation et
un mécanisme d’interchange des ponts disulfures restent prépondérants dans la dénaturation
thermique de Lip2 et la concentration en enzyme a un effet drastique sur la thermostabilité.
Ainsi, à de fortes concentrations, la thermostabilité de ce mutant n’est pas suffisante pour des
applications industrielles. La compréhension de ces mécanismes ouvre la voie à d’autres
améliorations possibles de la thermostabilité de l’enzyme par évolution rationnelle. Nous
pourrons par exemple, tenter d’agir sur le mécanisme d’interchange des ponts disulfure, en
réalisant l’ingénierie des ponts disulfure chez la lipase Lip2, ou en acidifiant le pH du milieu
car ce phénomène est quasi inexistant à pH acide. D’autre part, pour minimiser le phénomène
d’agrégation, la voie de l’immobilisation de l’enzyme paraît prometteuse car elle permettrait
non seulement d’éviter l’agrégation de l’enzyme, mais aussi de travailler en milieu non
aqueux, l’eau étant impliquée dans de nombreux mécanisme de dénaturation thermique.
La seconde partie de la thèse s’est articulée autour de l’évolution rationnelle de l’enzyme et la
compréhension des bases moléculaires régissant sa sélectivité. Cette étude nécessite d’avoir
accès à la structure tridimensionnelle de l’enzyme, ce qui n’est pas le cas pour Lip2. La
résolution de la structure tridimensionnelle des protéines passe aujourd’hui le plus souvent par
la cristallisation des protéines et la diffraction des cristaux aux rayons X. L’obtention de
protéine utilisable pour les essais de cristallographie est passée par l’utilisation du promoteur
TEF, qui permet la production d’enzyme non agrégée. Des essais de cristallogenèse ont été
entrepris en collaboration avec la plate-forme de biocristallographie de l’IPBS (Institut de
Pharmacobiologie et de Biologie Structurale) Cette plate-forme dispose d’une station
291
automatisée qui permet de cribler à haut débit de nombreuses conditions de cristallogenèse.
Les cristaux obtenus avec la forme glycosylée de l’enzyme présentent une formation en
feuillet liée probablement à la glycosylation de l’enzyme et les diffractogrammes enregistrés
sont donc ininterprétables. Nous avons donc travaillé avec l’enzyme déglycosylée par voie
enzymatique. Plusieurs conditions de cristallisation ont pu être identifiées et reproduites.
L’une d’entre elles a conduit à l’enregistrement d’un jeu de données à 1,7 Å sur ligne
synchrotron. Cependant, la résolution de la structure tridimensionnelle nécessite une
information complémentaire en plus de ce diffractogramme : l’information de phases.
Celle-ci peut être généralement obtenue par remplacement moléculaire à partir de
l’information de phase des enzymes homologues déjà cristallisées. A cet effet, un modèle de
la structure tridimensionnelle de l’enzyme par homologie avec d’autres enzymes a été mis au
point. Nous nous sommes basés sur l’alignement de séquences primaire et secondaire avec
quatre enzymes de structure connue (les lipases de Thermomyces lanuginosa, de Rhizomucor
miehei, de Rhizopus niveus et la féruloyl estérase d’Aspergillus niger) qui présentent toutes de
l’ordre de 45 % d’homologie avec la lipase Lip2. Cependant dans notre cas, que le
remplacement moléculaire soit réalisé avec le modèle ou directement avec les enzymes
homologues, et malgré de nombreux essais, la détermination des phases par cette technique
n’a pas pu être réalisée.
Nous nous sommes donc orientés vers les méthodes de phasage ab initio qui consistent à
intégrer un atome lourd (avec une densité en électrons importante) de manière périodique
dans l’édifice cristallin. Les différences entre les spectres enregistrés avec et sans cet atome
lourd permettent de retrouver l’information de phase. La première méthode consiste à essayer
d’incorporer des métaux lourds dans l’édifice cristallin par trempage du cristal dans des
solutions de dérivés lourds. Sur 17 composés testés, 6 ont donné lieu à l’enregistrement de
jeux de données (les autres attendent leur tour pour passage au synchrotron), cependant aucun
n’a intégré de métal ; la détermination des phases par cette méthode n’a donc pour le moment
pas donné de résultats. La seconde méthode consiste à intégrer directement dans la protéine
un métal lourd par la production d’une protéine sélénométhionylé. Autant, la bioincorporation de sélénométhionine dans les protéines est maîtrisée chez E. coli., autant elle
n’en est qu’aux balbutiements pour les systèmes levuriens eucaryotes. Les pourcentages de
bio-incorporation sont généralement assez faibles et ce type de production n’a jamais été
réalisé chez la levure Y. lipolytica. Les premiers essais de bio-incorporation de la
292
sélénométhionine à la place des méthionines dans la lipase Lip2 (environ 38 % des
méthionines) laissent penser que c’est possible. Pour s’assurer d’un marquage à 100 %, deux
voies sont en cours d’étude, la première est l’amélioration de la conduite du procédé de
fermentation, la seconde consiste à disrupter la voie de biosynthèse de la méthionine chez
Yarrowia lipolytica. Dans cette dernière voie, 3 gènes ont été ciblés et tous conduisent à des
mutations létales pour la souche. D’autres gènes ont été identifiés comme cibles potentielles
de disruption.
Si la détermination de la structure tridimensionnelle venait à échouer par la technique de
cristallisation et diffraction aux rayons X, la méthode de détermination par RMN pourrait être
envisageable. En effet, les progrès récents dans l’analyse permettent aujourd’hui la
détermination de structures protéiques de taille supérieure à 30 kDa.
Il convient de souligner que, même si la structure tridimensionnelle n’a pas encore été
résolue, le modèle créé pour le remplacement moléculaire peut servir de première base pour
l’étude des relations structure-fonction. En effet, ce modèle a permis d’identifier plusieurs
acides aminés clés pour
la sélectivité de substrats d’intérêt pharmaceutiques (les esters
d’acides 2-bromo-arylacétique, précurseurs d’analgésiques) : la valine 232 et l’acide
aspartique 97. Ces mutants ont été construits par ailleurs, et les deux acides aminés identifiés
montrent un effet important dans la stéréosélectivité de l’enzyme. Le variant 232A permet
notamment d’augmenter d’un ordre de grandeur l’énantiosélectivité de cette enzyme, tout en
améliorant les vitesses de réaction. Il permet d’atteindre des énantiosélectivités compatibles
avec une utilisation de l’enzyme dans des applications pharmaceutiques (E>200).
Au cours de cette thèse les améliorations apportées ont été de deux ordres : l’amélioration de
la lipase Lip2 de Y. lipolytica d’une part, et le développement d’outils performants pour
l’expression d’enzyme chez la levure Y. lipolytica, d’autre part. En ce qui concerne
l’amélioration de la lipase Lip2. ces travaux auront permis d’aboutir à :
-
la construction d’un outil d’analyse des relations structure-fonction de la lipase Lip2
de Y. lipolytica. Bien que la détermination de la structure de Lip2 par cristallisation et
diffraction aux rayons X n’ait pas encore abouti, le modèle de la structure
tridimensionnelle de la lipase Lip2, réalisé in silico, a été utilisé avec succès pour
identifier certains acides aminés impliqués dans l’énantiosélectivité de Lip2 envers les
293
esters d’acides 2-bromo-arylacétiques. Ce modèle peut donc servir de première base
pour l’étude des relations structure–fonction en attendant …
-
l’obtention d’un variant de la lipase Lip2 plus thermostable, permettant d’envisager
l’utilisation de cette enzyme dans des conditions industrielles.
En ce qui concerne le développement d’outils pour le système d’expression Y. lipolytica, cette
thèse aura permis :
-
-la construction d’un outil d’expression générique (la souche JMY1212) qui peut être
utilisé pour l’expression de n’importe quelle enzyme. Il permet de standardiser
l’expression
protéique
entre
différents
variants.
Ce
système
d’expression
particulièrement adapté pour l’évolution dirigée d’enzyme est le premier système
eucaryote à répondre aux exigences de standardisation de l’expression des protéines
imposées pour le criblage haut débit d’activités enzymatiques.
-
la caractérisation du promoteur TEF. Ce promoteur n’a été que peu documenté dans la
littérature. L’utilisation de ce promoteur sur un milieu sans acide oléique conduit à la
production d’enzyme non agrégée (nécessaire à la fois pour les essais de cristallisation
et pour la caractérisation de la thermostabilité de la lipase sauvage et du variant
thermostable). Par ailleurs, nous avons montré que lorsque celui-ci est utilisé en
présence d’acide oléique, il améliore d’un facteur deux la production de lipase par
rapport au promoteur POX2 utilisé dans les mêmes conditions. Ceci fait de ce
promoteur, un promoteur particulièrement adapté pour les fortes productions
d’enzyme.
La levure Yarrowia lipolytica est un nouvel outil à disposition des biologistes pour à la fois
construire des enzymes aux propriétés améliorées et pour les produire de manière efficace. Au
cours de ces quatre années de thèse, nous espérons avoir posé quelques pierres pour
développer ce système.
294
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324
Annexes
325
Annexes
Composition de la « classic suite » (Qiagen)
Number
1
2
3
4
Well
A1
A2
A3
A4
5
A5
6
A6
7
A7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
A8
A9
A10
A11
A12
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
D1
D2
D3
D4
D5
42
D6
43
44
45
D7
D8
D9
Salt
0.01 M Cobalt chloride
0.2 M Magnesium chloride
2.0 M Ammonium sulfate
Buffer
0.1 M Sodium acetate pH 4.6
0.1 M tri-Sodium citrate pH 5.6
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M HEPES sodium salt pH 7.5
0.2 M Calcium chloride
0.2 M tri-Sodium citrate
0.2 M Ammonium acetate
1.5 M Sodium chloride
0.1 M Sodium cacodylate pH 6.5
0.1 M TRIS.HCl pH 8.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.2 M Magnesium acetate
0.2 M Ammonium phosphate
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.2 M K/Na tartrate
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M MES pH 6.5
0.05 M Cadmium sulfate
0.1 M Imidazole pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Sodium phosphate + 0.1
0.1 M MES pH 6.5
M Potassium phosphate
0.1 M HEPES pH 7.5
46
D10
47
48
D11
D12
327
Precipitant
1.0 M 1,6-Hexanediol
5 %(v/v) Isopropanol
+ 20 %(w/v) PEG 4000
+ 20 %(w/v) PEG 4000
10 %(v/v) Ethanol
20 %(v/v) Ethanol
25 %(v/v) Ethylene glycol
30 %(v/v) MPD
30 %(v/v) MPD
30 %(v/v) MPD
30 %(v/v) MPD
30 %(v/v) MPD
30 %(v/v) MPD
50 %(v/v) MPD
70 %(v/v) MPD
25 %(v/v) tert-Butanol
35 %(v/v) tert-Butanol
2.0 M Ammonium formate
0.4 M K/Na tartrate
0.8 M K/Na tartrate
1.0 M Sodium acetate
0.8 M Sodium phosphate
+ 0.8 M Potassium phosphate
2.0 M Sodium formate
Annexes
Composition de la « classic suite » (Qiagen)
Number
Well
49
E1
Salt
Buffer
50
51
52
53
E2
E3
E4
E5
54
E6
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
E7
E8
E9
E10
E11
E12
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
F12
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
80
G8
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
G9
G10
G11
G12
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
93
H9
94
H10
95
H11
0.1 M HEPES pH 7.5
96
H12
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M BICINE pH 9.0
0.1 M MES pH 6.5
0.5 M Sodium chloride + 0.01
M Magnesium chloride
0.01 M Ferric chloride
0.1 M TRIS pH 8.5
0.01 M Nickel chloride
0.01 M CTAB
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M BICINE pH 9.0
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.5 M Lithium sulfate
0.2 M Zinc acetate
0.2 M Calcium acetate
0.05 M Potassium phosphate
0.1 M Cadmium chloride
0.01 M Zinc sulfate
Precipitant
2 %(v/v) Dioxane + 10 %(w/v)
PEG 20000
10 %(v/v) Dioxane
35 %(v/v) Dioxane
2 %(v/v) Ethylene imine polymer
12 %(v/v) Glycerol
0.1 M BICINE pH 9.0
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
328
10 %(v/v) Jeffamine M-600
20 %(v/v) Jeffamine M-600
0.2 M Magnesium formate
1.6 M Magnesium sulfate
8 %(w/v) PEG 8000
10 %(w/v) PEG 8000
15 %(w/v) PEG 8000
18 %(w/v) PEG 8000
18 %(w/v) PEG 8000
20 %(w/v) PEG 8000
20 %(w/v) PEG 8000
30 %(w/v) PEG 8000
30 %(w/v) PEG 8000
30 %(w/v) PEG 8000
2 %(v/v) PEG 400
28 %(v/v) PEG 400
30 %(v/v) PEG 400
30 %(v/v) PEG 400
30 %(v/v) PEG 400
20 %(w/v) PEG 550 MME
25 %(w/v) PEG 550 MME
10 %(w/v) PEG 1000
+ 10 %(w/v) PEG 8000
30 %(w/v) PEG 1500
20 %(w/v) PEG 2000 MME
30 %(w/v) PEG 2000 MME
8 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 5000 MME
10 %(w/v) PEG 6000
5 %(v/v) MPD
10 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 10000
+ 8 %(v/v) Ethylene glycol
12 %(w/v) PEG 20000
+
Annexes
Composition de la « JCSG Core Suite I » (Qiagen)
Solution
1
2
Well
A01
A02
3
A03
4
A04
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
A05
A06
A07
A08
A09
A10
A11
A12
B01
B02
B03
16
B04
17
B05
Salt
0.05 M Lithium sulfate + 0.05 M
Sodium sulfate
0.2 M Ammonium dihydrogen
phosphate
Buffer
0.1 M CHES pH 9.5
0.1 M Bicine pH 8.5
Precipitant
20 %(w/v) PEG 8000
20 %(w/v) PEG 6000
0.05 M Tris-HCl pH 8.5
30 %(w/v) PEG 400
0.1 M Tris pH 8.5
50 %(v/v) MPD
0.1 M Tris pH 8.5
0.1M Tris pH 8.5
0.2 M tri-Potassium citrate
0.2 M tri-Lithium citrate
0.2 M Potassium acetate
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
3.4 M 1,6 Hexanediol
40%(v/v) Ethanol
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20 %PEG 1000
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3000
20 %(w/v) PEG 8000
10 %(w/v) PEG 8000
26.6%(v/v) PEG 400
+ 5 %(v/v) Glycerol
20 %(w/v) PEG 4000
+ 10 %(v/v) Isopropanol
0.095 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
18
B06
19
20
21
B07
B08
B09
0.8 M di-Sodium hydrogen
phosphate/0.8 M di-Potassium
hydrogen phosphate
0.2 M di-Sodium tartrate
0.2 M Calcium acetate hydrate
0.2 M Potassium formate
22
B10
0.2 M Potassium Sodium tartrate
20%(w/v) PEG 3350
23
24
25
26
B11
B12
C01
C02
0.2 M Potassium fluoride
0.2 M Lithium nitrate
27
C03
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
C04
C05
C06
C07
C08
C09
C10
C11
C12
D01
D02
D03
D04
D05
D06
D07
D08
D09
46
D10
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
5%(w/v) PEG 8000 +
40%(v/v) MPD
10 %(w/v) PEG 8000
20 %(w/v) PEG 3000
20 %(w/v) PEG 2000 MME
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 6000
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
50%(v/v) PEG 200
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
10 %(w/v) PEG 6000
+ 5 %(v/v) MPD
47
48
D11
D12
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
0.1 M Tris pH 7.0
0.1 M Tris pH 7.0
0.1 M Tris pH 7.0
0.1 M Tris pH 7.0
0.2 M Potassium thiocyanate
0.1 M HEPES pH 7.0
0.2 M Potassium nitrate
0.2 M Sodium thiocyanate
0.2 M Sodium iodide
0.2 M Potassium chloride
0.2 M Potassium iodide
0.2 M Lithium chloride
0.2 M di-Ammonium tartrate
0.2 M Sodium sulfate
0.1M Sodium cacodylate pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
9,0
0.1 M HEPES pH 7.5
Final pH
1.6 M Sodium citrate pH 6.5
329
20 %(w/v) PEG 8000
7,0
Annexes
Composition de la « JCSG Core Suite I » (Qiagen)
Solution
49
50
51
52
53
Well
E01
E02
E03
E04
E05
Salt
0.2 M Ammonium nitrate
0.2 M Ammonium chloride
0.2 M Ammonium iodide
0.2 M Ammonium fluoride
Buffer
0.1M Sodium acetate pH 4.5
0.1M Phosphate-citrate pH 4.2
0.18 M tri-Ammonium citrate
Precipitant
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
10 %(w/v) PEG 8000
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
5%(w/v) PEG 3000 +
30%(v/v) PEG 200
20 %(w/v) PEG 8000
35 %(v/v) MPD
20%(w/v) PEG 3350
40 %(v/v) MPD
20 %(v/v) MPD
20 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
+ 19 %(w/v) PEG 4000
+ 5 %(v/v) Glycerol
+ 20 %(w/v) PEG 4000
20 %(w/v) PEG 3000
50%(v/v) PEG 200
5%(w/v) PEG 1000
+ 40% Ethanol
50%(v/v) PEG 400
40%(v/v) MPD
20%(w/v) PEG 3350
54
E06
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
E07
E08
E09
E10
E11
E12
F01
F02
F03
F04
F05
66
F06
67
F07
68
69
F08
F09
70
F10
71
72
73
F11
F12
G01
74
G02
20 %(v/v) MPD
75
76
77
78
G03
G04
G05
G06
0.1 M Citric Acid pH 5.0
0.1 M Citric Acid
10 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
5 %(w/v) PEG 6000
79
G07
80
G08
81
82
83
84
85
86
G09
G10
G11
G12
H01
H02
87
H03
88
H04
89
90
91
92
93
94
95
96
H05
H06
H07
H08
H09
H10
H11
H12
0.1 M Na/K phosphate pH 6.2
0.1M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 5.0
0.1 M MES pH 5.0
0.1 M MES pH 5.0
0.1 M MES pH 5.0
0.2 M Magnesium
0.2 M Magnesium
0.2 M Magnesium
0.2 M Magnesium
sulfate
formate
nitrate
chloride
0.2 M Potassium dihydrogen
phosphate
phosphate
0.2 M Sodium dihydrogen
phosphate
phosphate
Final pH
6,0
6,0
6,0
6,0
5,0
5,0
5,0
5,0
20%(w/v) PEG 3350
20%(w/v) PEG 3350
0.1 M Sodium
0.1 M Sodium
0.1 M Sodium
0.1 M Sodium
0.1 M Sodium
0.1 M Sodium
acetate pH 4.6
acetate pH 4.6
acetate pH 4.6
acetate pH 4.6
acetate pH 4.5
acetate pH 4.5
30 %(w/v) PEG 2000 MME
8 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 4000
30 %(v/v) MPD
35 %(v/v) MPD
20 %(w/v) PEG 3000
20%(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 8000
0.1 M Phosphate-citrate pH 4.2
0.1 M phosphate/citrate pH 4.2
330
10 %(w/v) PEG 3000
20 %(w/v) PEG 1000
20 %(v/v) MPD
20 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
5 %(w/v) PEG 6000
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
Annexes
Composition de la « JCSG Core Suite II » (Qiagen)
Solution
1
2
3
4
Well
A01
A02
A03
A04
Salt
1.0 M Sodium citrate
Buffer
0.1 M CAPS pH 10.5
0.1 M CHES pH 9.5
0.1 M CHES pH 9.5
0.1 M CHES pH 9.5
0.1 M Bicine pH 9.0
0.1 M Bicine pH 9.0
5 A05
6 A06
7 A07
0.1 M Bicine pH 9.0
8 A08
9 A09
10 A10
0.1M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
11 A11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
0.1M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.0
0.1 M Tris pH 8.0
A12
B01
B02
B03
B04
B05
B06
B07
B08
B09
B10
0.2 M Lithium Acetate
23 B11
0.1M Imidazole pH 8.0
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.085 M Sodium HEPES pH 7.5
24 B12
0.6 M sodium dihydrogen
phosphate/0.6 M potassium
dihydrogen phosphate
25 C01
0.2 M Sodium fluoride
0.1M Na/K phosphate pH 6.2
26 C02
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
C03
C04
C05
C06
C07
C08
C09
C10
C11
C12
37 D01
38
39
40
41
42
D02
D03
D04
D05
D06
0.1 M Tris pH 7.0
0.1 M Tris pH 7.0
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1M Citrate pH 5.5
0.2 M Sodium nitrate
0.2 M Potassium sulfate
0.1M Tris pH 7.0
Precipitant
20%(w/v) PEG 8000
10%(w/v) PEG 8000
10%(w/v) PEG 20000 +
2%(v/v) 1,4-Dioxane
20%(w/v) PEG 550 MME
10%(w/v) PEG 6000
5%(w/v) PEG 8000 +
20%(v/v) PEG 300 +
10%(v/v) Glycerol
20%(w/v) PEG 2000 MME
20%(v/v) Ethanol
2.0 M Ammonium
8%(w/v) PEG 8000
40%(v/v) PEG 400
10%(w/v) PEG 8000
35%(v/v) MPD
20%(w/v) PEG 6000
20%(w/v) PEG 6000
20%(w/v) PEG 3350
40%(v/v) MPD
15%(v/v) Ethanol
70%(v/v) MPD
17%(w/v) PEG 4000 +
15%(v/v) Glycerol +
8.5%(v/v) Isopropanol
9,0
8,0
8,0
25%(v/v) Glycerol
27%(v/v) PEG 400 +
10%(v/v) Glycerol
2%(v/v) PEG 400 +
30%(v/v) PEG 400
50%(v/v) PEG 200
20%(w/v) PEG 3350
40%(v/v) PEG 300
20%(w/v) PEG 1000
10%(w/v) PEG 6000
10%(w/v) PEG 6000
40%(v/v) PEG 400
50%(v/v) PEG 200
25%(v/v) 1,2-Propanediol
+ 10%(v/v) Glycerol
20%(w/v) PEG 3350
50%(v/v) PEG 200
20%(w/v) PEG 3350
0.1MSodium citrate pH 5.5
40%(v/v) PEG 600
43 D07
20%(w/v) PEG 1000
44 D08
10%(w/v) PEG 3000
45 D09
30%(v/v) PEG 400
46 D10
47 D11
48 D12
0.1 M MES pH 6.5
0.2 M Lithium sulfate monohydrate
12%(w/v) PEG 20000
20%(w/v) PEG 3350
331
final pH
7,0
7,0
Annexes
Composition de la « JCSG Core Suite II » (Qiagen)
Solution
49
50
51
52
53
Well
E01
E02
E03
E04
E05
Salt
Buffer
0.1 M Na/K phosphate pH 6.2
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
54 E06
0.2 M Zinc acetate
55 E07
0.2 M Zinc acetate
56 E08
0.1M Tris pH 7.0
57 E09
58 E10
59 E11
60 E12
61 F01
62 F02
63 F03
64
65
66
67
68
69
70
71
F04
F05
F06
F07
F08
F09
F10
F11
72 F12
0.1 M Citric acid pH 5.0
73 G01
74 G02
75 G03
76 G04
0.1M MES pH 5.5
77 G05
78 G06
79 G07
80 G08
81 G09
82 G10
83 G11
0.2 M Zinc acetate
84 G12
85
86
87
88
89
H01
H02
H03
H04
H05
90 H06
91 H07
92 H08
93 H09
94 H10
95 H11
96 H12
Precipitant 1
final pH
20%(w/v) PEG 1000
10%(v/v) MPD
6,0
20%(w/v) PEG 6000
6,0
10%(w/v) PEG 6000
6,0
5%(w/v) PEG 6000
6,0
25%(v/v) 1,2-Propanediol +
10%(v/v) Glycerol
40%(v/v) PEG 600
30%(v/v) PEG 600 +
10%(v/v) Glycerol
30%(w/v) PEG 4000
24%(w/v) PEG 1500 +
20%(v/v) Glycerol
40%(v/v) PEG 300
35%(v/v) MPD 10%(v/v)
Glycerol
40%(v/v) PEG 300
5%(w/v) PEG 1000
+50%(v/v) Ethylene glycol
30%(v/v) PEG 200
40%(v/v) Ethylene glycol
10%(v/v) MPD
5,0
5,0
5,0
5,0
20%(w/v) PEG 6000
5,0
5%(w/v) PEG 3000 +
10%(v/v) Glycerol
5%(v/v) Isopropanol
40%(v/v) PEG 400
1.0 M Hexanediol
1.6 M Ammonium sulfate +
20%(v/v) Glycerol
5.6%(w/v) PEG 4000 +
30%(v/v) Glycerol
30%(v/v) Glycerol +
14%(v/v) Isopropanol
20%(w/v) PEG 4000 +
20%(v/v) Glycerol
27%(v/v) MPD +
10%(v/v) Glycerol
10%(w/v) PEG 3000
20%(v/v) PEG 300 +
10% Glycerol
30%(v/v) PEG 400
30%(w/v) PEG 8000
20%(w/v) PEG 8000
10%(w/v) PEG 1000 +
10%(w/v) PEG 8000
25.5%(w/v) PEG 4000 +
15%(v/v) Glycerol
30%(w/v) PEG 1500
phosphate
332
35%(v/v) 1,4-Dioxane
10%(v/v) MPD
20%(w/v) PEG 6000
4,0
4,0
Annexes
Composition de la « JCSG Core Suite III» (Qiagen)
The JCSG Core Suite III Composition Table
Solution
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Well Salt
A01
A02
A03
A04
A05 0.2 M Sodium chloride
0.2 M di-Potassium hydrogen
A06
phosphate
0.2 M di-Sodium hydrogen
A07
phosphate
A08
A09
A10 0.2 M Ammonium sulfate
A11
12 A12
13 B01
14 B02
15 B03
16 B04
17
18
19
20
21
22
B05
B06
B07
B08
B09
B10
Buffer
0.1 M CAPS pH 10.5
0.1M CHES pH 9.5
0.1M CHES pH 9.5
CHES pH 9.5
0.1M CHES pH 9.5
20%(w/v) PEG 3350
0.1 M Bicine
0.1 M Bicine
0.1M CAPS pH 10.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
40%(v/v) MPD
5%(w/v) PEG 6000
30% (v/v) PEG 200
20%(w/v) PEG 1000
1.0 M di-Ammonium
hydrogen phosphate
20%(w/v) PEG 8000
20%(v/v) Glycerol
0.1 M Tris
0.1 M Tris
30%(w/v) PEG 4000
0.2 M di-Ammonium
hydrogen phosphate
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
28 C04
29
30
31
32
33 C09
10% (v/v) glycerol
0.1M HEPES pH 7.5
34 C10
35 C11
36 C12
0.1 M Tris pH 7.0
0.1 M Tris pH 7.0
0.1 M Tris pH 7.0
37 D01
0.2M Sodium chloride
23 B11
24
25
26
27
B12
C01
C02
C03
C05
C06
C07
C08
38 D02
39 D03
40 D04
0.4 M Potassium/Sodium
tartrate
42 D06
43 D07
44 D08
45 D09
46 D10
47 D11
48 D12
15%(v/v) Ethanol
10%(w/v) PEG 3000
40%(v/v) MPD
9,0
9,0
8,0
8,0
20%(w/v) PEG 3350
0.1 M HEPES
0.1 M HEPES
1.0 M Imidazole
41 D05
Final pH
20%(w/v) PEG 3350
0.1 M Tris pH 8.5
1.6 M Ammonium
Precipitant
30%(v/v) PEG 400
40% (v/v) PEG 600
50% (v/v) PEG 200
30%(w/v) PEG 3000
50%(v/v) PEG 400
0.1 M HEPES
0.1 M HEPES
0.1 M HEPES
0.1M Sodium cacodylate
pH 6.5
0.1M Tris pH 7.0
0.1M Sodium/Potassium
phosphate pH 6.2
0.1 M Sodium cacodylate
pH 6.5
333
30%(v/v) PEG 400
35%(v/v) 2-Ethoxyethanol
10%(v/v) Glycerol +
28%(v/v) PEG 400
40% (v/v) PEG 400
5% (w/v) PEG 3000 + 30%
(v/v) PEG 400
15%(v/v) Ethanol
35%(v/v) MPD
1.0 M Potassium/Sodium
tartrate
40%(v/v) MPD
20%(v/v) MPD
20%(w/v) PEG 6000
5%(w/v) PEG 6000
50% (v/v) PEG 200
35% (v/v) 2-Ethoxyethanol
7,0
7,0
7,0
7,0
7,0
7,0
Annexes
Composition de la « JCSG Core Suite III» (Qiagen)
Solution Well Salt
49 E01
50 E02
51 E03
52 E04
53 E05
54 E06
55 E07
56 E08
57 E09
58 E10
59 E11
60 E12
Buffer
pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
pH 6.5
pH 6.5
pH 6.5
pH 6.5
pH 6.5
pH 6.5
pH 6.5
61 F01
0.1M MES pH 6.0
62 F02
65 F05
66 F06
67 F07
68 F08
69 F09
70 F10
0.2 M Zinc acetate
0.2 M K-Sodium tartrate
0.1M Sodium citrate pH 5.5
0.1 M Sodium/Potassium
phosphate pH 6.2
0.1 M Sodium/Potassium
phosphate pH 6.2
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
71 F11
63 F03
64 F04
72 F12
73 G01
74 G02
75 G03
0.1M Tris pH 7.0
76 G04
77 G05
0.1M phosphate-citrate pH 4.2
0.2 M Calcium Chloride
dihydrate
78 G06
79 G07
80 G08
81 G09
82 G10 0.1 M Cadmium chloride
83 G11 0.2 M Sodium chloride
84 G12 2.0 M Sodium chloride
85 H01 2.0 M Sodium formate
86 H02 0.2 M Calcium chloride
87 H03 0.2 M Lithium sulfate
88 H04
89 H05 0.2 M Sodium chloride
90 H06
91 H07
92 H08
93 H09
94 H10
95 H11
96 H12
Precipitant
Final pH
10%(v/v) 1,4-Dioxane
14.4%(w/v) PEG 8000 +
20%(v/v) Glycerol
27% (v/v) MPD +
10% (v/v) Glycerol
16%(w/v) PEG 8000 +
20%(v/v) Glycerol
18%(w/v) PEG 8000
30%(w/v) PEG 8000
1.0 M Sodium Acetate
30%(v/v) MPD
1.4 M Sodium Acetate
40%(v/v) PEG 400 +
5% (w/v) PEG 3000
35%(v/v) MPD
10% (w/v) PEG 8000
25.5%(w/v) PEG 4000 +
15%(v/v) Glycerol
1.0 M Ammonium
40% (v/v) PEG 400
40% (v/v) PEG 300 +
5% (w/v) PEG 1000
40%(v/v) PEG 600
6,0
6,0
20%(w/v) PEG 3350
0.1 M Citric Acid
0.1 M Citric Acid
phosphate
phosphate
0.1 M Citric Acid
0.1 M Citric Acid
0.1 M Citric Acid
334
40%(v/v) MPD
30%(w/v) PEG 6000
16%(w/v) PEG 8000 +
20%(v/v) Glycerol
30%(v/v) PEG 400
30%(v/v) MPD
5,0
5,0
5,0
20%(v/v) Butanediol
35%(v/v) Glycerol
40%(v/v) MPD
10%(w/v) PEG 6000
30%(w/v) PEG 4000
30%(w/v) PEG 8000
4,0
4,0
4,0
Annexes
Composition de la « JCSG Core Suite IV» (Qiagen)
Solution
1 A01
Well
Salt
Buffer
0.1 M CAPS pH 10.5
2 A02
0.1 M Glycine pH 10.5
3 A03
4 A04
5 A05
6 A06
7 A07
8 A08
9 A09
10 A10
11 A11
12 A12
13 B01
14 B02
15 B03
16 B04
17 B05
18 B06
0.1M CAPS pH 10.5
0.1 M CHES pH 9.5
0.1 M CHES pH 9.5
0.1 M CHES pH 9.5
0.1 M CHES pH 9.5
0.1M CHES pH 9.5
0.1M CHES pH 9.5
0.1 M Bicine pH 9.0
0.1 M Bicine pH 9.0
0.1 M Bicine pH 9.0
0.1 M Bicine pH 8.5
0.1 M Bicine pH 9.0
0.1 M Bicine pH 8.5
0.1 M Bicine pH 8.5
0.1 M Bicine pH 9.0
0.1 M Tris pH 8.5
Precipitant
phosphate/0.8 M dipotassium
hydrogen phosphate
40%(v/v) MPD
10%(w/v) PEG 3000
1.0 M Sodium/Potassium tartrate
30%(v/v) PEG 400
15%(v/v) Ethanol
40%(v/v) PEG 300
40%(v/v) MPD
10%(w/v) PEG 6000
30%(w/v) PEG 6000
65%(v/v) MPD
19 B07
0.1M Tris pH 8.5
20 B08
0.1M Tris pH 8.5
10%(v/v) Glycerol
21 B09
0.1 M Tris·HCl pH 8.5
30%(w/v) PEG 4000
22 B10
23 B11
30%(v/v) PEG 400
30%(w/v) PEG 4000
24 B12
25 C01
0.1 M Tris pH 8.5
26 C02
27 C03
28 C04
29 C05
30 C06
31 C07
32 C08
33 C09
34 C10
35 C11
36 C12
37 D01
38 D02
39 D03
40 D04
41 D05
42 D06
43 D07
0.2 M Zinc acetate
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.0
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
44 D08
0.1 M HEPES pH 7.5
45 D09
0.09 M HEPES pH 7.5
46 D10
0.085 M HEPES pH 7.5
47 D11
48 D12
0.1M HEPES pH 7.5
0.1M HEPES pH 7.5
335
12%(v/v) Glycerol
30%(v/v) PEG 400
25.5%(w/v) PEG 4000 +
15%(v/v) Glycerol
10%(w/v) PEG 8000
1.0 M Ammonium hydrogen
phosphate
5%(w/v) PEG 6000
65%(v/v) MPD
10%(w/v) PEG 6000
35%(v/v) MPD
50%(v/v) PEG 200
30%(v/v) MPD
20%(w/v) PEG 10000 +
1.26 M tri-Sodium citrate +
10%(v/v) Glycerol
1.7%(v/v) PEG 400
15%(v/v) Glycerol
30%(v/v) PEG 600 +
10%(v/v) Glycerol
20%(v/v) PEG 400
Final pH
9,0
9,0
9,0
9,0
9,0
9,0
8,0
8,0
8,0
8,0
+
Annexes
Composition de la « JCSG Core Suite IV» (Qiagen)
Solution
49 E01
Well
Salt
Buffer
0.1M Tris pH 7.0
50 E02
51 E03
52 E04
0.1M HEPES pH 7.5
Precipitant
10%(v/v) Glycerol
5%(w/v) PEG 3000 +
40%(v/v) MPD
3.6 M Sodium formate +
10%(v/v) Glycerol
40%(v/v) PEG 400
30%(w/v) PEG 3000
40%(v/v) PEG 600
30%(w/v) PEG 6000
0.1M Tris pH 7.0
54 E06
55 E07
56 E08
57 E09
58 E10
59 E11
60 E12
61 F01
0.1M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 7.0
0.1 M Tris pH 7.0
0.1 M HEPES pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M HEPES pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.0
62 F02
1 M Sodium chloride
63 F03
64 F04
65 F05
0.2 M Zinc acetate
0.1 M HEPES pH 7.0
30%(v/v) PEG 600 +
10%(v/v) Glycerol
45%(v/v) Glycerol
30%(v/v) Jeffamine M-600 pH 7.0
53 E05
66 F06
phosphate/ 0.1 M
potassium dihydrogen
phosphate
0.1 M MES pH 6.5
67 F07
0.16 M Zinc acetate
68 F08
69 F09
0.2 M Zinc acetate
70 F10
71 F11
0.1M MES pH 6.0
72 F12
73 G01
74 G02
75 G03
76 G04
77 G05
78 G06
79 G07
0.2 M Zinc acetate
0.2 M Zinc acetate
0.2 M Zinc acetate
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M MES pH 5.0
14.4%(w/v) PEG 8000 +
20%(v/v) Glycerol
20%(v/v) MPD
20%(w/v) PEG 3350
5%(w/v) PEG 1000 +
30%(v/v) PEG 600 + 5%(w/v) PEG
1000 + 10%(v/v) Glycerol
40%(v/v) MPD
20%(v/v) Butanediol
15%(v/v) Ethanol
30%(w/v) PEG 6000
40%(v/v) PEG 300
80 G08
30%(v/v) MPD
81 G09
0.01 M FeCl2
0.7 M Ammonium
10%(v/v) Jeffamine M-600
82 G10
83 G11
84 G12
85 H01
86 H02
30%(v/v) Glycerol
15%(v/v) Ethanol
87 H03
0.17 M Ammonium acetate 0.085 M Sodium acetate pH 4.6
88 H04
0.2 M Zinc acetate
89 H05
90 H06
91 H07
92 H08
93 H09
94 H10
95 H11
96 H12
0.1 M Citric Acid
336
Final pH
7,0
7,0
6,0
6,0
30%(w/v) PEG 4000
25.5%(w/v) PEG 4000 +
15%(v/v) Glycerol
20%(w/v) PEG 1000
1.0 M Ammonium hydrogen
phosphate
hydrogen phosphate
10%(v/v) Ethanol +
25%(v/v) Glycerol
hydrogen phosphate
30%(w/v) PEG 6000
30%(w/v) PEG 6000
4,0
4,0
Annexes
Composition de la « AmSO4 Suite » (Qiagen)
Number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
Well
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
A12
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
D12
Salt or Buffer
0.2 M di-Ammonium phosphate
0.2 M Cadmium chloride
0.2 M Cadmium sulfate
0.2 M Cesium chloride
0.2 M Cesium sulfate
0.2 M Ammonium bromide
0.2 M Lithium acetate
0.2 M Potassium bromide
0.2 M di-Potassium phosphate
0.2 M K/Na tartrate
0.2 M Sodium bromide
0.2 M di-Sodium phosphate
0.2 M Sodium iodide
0.2 M Sodium malonate
0.2 M di-Sodium tartate
337
Precipitant
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
Annexes
Composition de la « AmSO4 Suite » (Qiagen)
Number
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
Well
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9
E10
E11
E12
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
F12
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
G9
G10
G11
G12
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
Salt or Buffer
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M TRIS pH 8.0
0.1 M BICINE pH 9.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M TRIS pH 8.0
0.1 M BICINE pH 9.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M TRIS pH 8.0
0.1 M BICINE pH 9.0
0.1 M MES pH 6.0
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M TRIS pH 8.0
0.1 M BICINE pH 9.0
0.2 M Sodium chloride + 0.1 M
HEPES sodium salt pH 7.5
0.1 M MES sodium salt pH 6.5
338
Precipitant
0.8 M Ammonium
0.8 M Ammonium
0.8 M Ammonium
0.8 M Ammonium
0.8 M Ammonium
0.8 M Ammonium
1.6 M Ammonium
1.6 M Ammonium
1.6 M Ammonium
1.6 M Ammonium
1.6 M Ammonium
1.6 M Ammonium
2.4 M Ammonium
2.4 M Ammonium
2.4 M Ammonium
2.4 M Ammonium
2.4 M Ammonium
2.4 M Ammonium
3.2 M Ammonium
3.2 M Ammonium
3.2 M Ammonium
3.2 M Ammonium
3.2 M Ammonium
3.2 M Ammonium
0.5 M Ammonium
1.0 M Ammonium
1.0 M Ammonium
1.0 M Ammonium
1.0 M Ammonium
1.2 M Ammonium
1.5 M Ammonium
1.6 M Ammonium
1.6 M Ammonium
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
+ 1.0 M Lithium Sulfate
+ 2 %(w/v) PEG 400
+ 3 %(w/v) Isopropanol
+ 15 %(w/v) Glycerol
1.6 M Ammonium
1.8 M Ammonium
2.0 M Ammonium
2.0 M Ammonium
2.0 M Ammonium
2.0 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.2 M Ammonium
2.4 M Ammonium
3.0 M Ammonium
3.0 M Ammonium
3.5 M Ammonium
3.5 M Ammonium
3.5 M Ammonium
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
+ 2 %(w/v) PEG 1000
+ 5 %(w/v) PEG 400
+1 %(w/v) MPD
+ 1 %(w/v) MPD
Annexes
Composition de la « PEGs Suite » (Qiagen)
Number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
Well
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
A12
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
D12
Salt or Buffer
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
339
Precipitant
40 %(v/v) PEG 200
30 %(v/v) PEG 300
30 %(v/v) PEG 400
25 %(v/v) PEG 550 MME
25 %(w/v) PEG 1000
25 %(w/v) PEG 2000 MME
40 %(v/v) PEG 200
30 %(v/v) PEG 300
30 %(v/v) PEG 400
25 %(v/v) PEG 550 MME
25 %(w/v) PEG 1000
25 %(w/v) PEG 2000 MME
40 %(v/v) PEG 200
30 %(v/v) PEG 300
30 %(v/v) PEG 400
25 %(v/v) PEG 550 MME
25 %(w/v) PEG 1000
25 %(w/v) PEG 2000 MME
40 %(v/v) PEG 200
30 %(v/v) PEG 300
30 %(v/v) PEG 400
25 %(v/v) PEG 550 MME
25 %(w/v) PEG 1000
25 %(w/v) PEG 2000 MME
25 %(w/v) PEG 3000
25 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 6000
25 %(w/v) PEG 8000
20 %(w/v) PEG 10000
15 %(w/v) PEG 20000
25 %(w/v) PEG 3000
25 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 6000
25 %(w/v) PEG 8000
20 %(w/v) PEG 10000
15 %(w/v) PEG 20000
25 %(w/v) PEG 3000
25 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 6000
25 %(w/v) PEG 8000
20 %(w/v) PEG 10000
15 %(w/v) PEG 20000
25 %(w/v) PEG 3000
25 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 6000
25 %(w/v) PEG 8000
20 %(w/v) PEG 10000
15 %(w/v) PEG 20000
Annexes
Composition de la « PEGs Suite » (Qiagen)
Number
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
Well
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9
E10
E11
E12
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
F12
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
G9
G10
G11
G12
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
Salt or Buffer
0.2 M Sodium iodide
0.2 M Magnesium nitrate
0.2 M Lithium acetate
0.2 M Zinc acetate
0.2 M di-Sodium tartrate
0.2 M K/Na tartrate
0.2 M di-Sodium phosphate
0.2 M di-Potassium phosphate
0.2 M di-Ammonium phosphate
340
Precipitant
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
20 %(w/v) PEG 3350
Annexes
Composition de la « PEGs II Suite » (Qiagen)
Number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
Well
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
A12
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
D12
Salt 1
0.01 M Zinc sulfate
Buffer
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M BICINE pH 9.0
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M TRIS pH 8.5
341
Precipitant
15 %(w/v) PEG 400
15 %(w/v) PEG 400
15 %(w/v) PEG 400
15 %(w/v) PEG 400
25 %(w/v) PEG 400
25 %(w/v) PEG 400
28 %(w/v) PEG 400
30 %(w/v) PEG 400
30 %(w/v) PEG 400
30 %(w/v) PEG 400
30 %(w/v) PEG 400
30 %(w/v) PEG 400
30 %(w/v) PEG 550 MME
25 %(w/v) PEG 550 MME
25 %(w/v) PEG 1000
30 %(w/v) PEG 1000
15 %(w/v) PEG 1500
20 %(w/v) PEG 1500
30 %(w/v) PEG 1500
20 %(w/v) PEG 2000 MME
25 %(w/v) PEG 2000 MME
30 %(w/v) PEG 2000 MME
20 %(w/v) PEG 3000
30 %(w/v) PEG 3000
4 %(w/v) PEG 4000
8 %(w/v) PEG 4000
8 %(w/v) PEG 4000
10 %(w/v) PEG 4000
12 %(w/v) PEG 4000
12 %(w/v) PEG 4000
16 %(w/v) PEG 4000
16 %(w/v) PEG 4000
16 %(w/v) PEG 4000
18 %(w/v) PEG 4000
20 %(w/v) PEG 4000
20 %(w/v) PEG 4000
22 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
35 %(w/v) PEG 4000
Annexes
Composition de la « PEGs II Suite » (Qiagen)
Number
Well
49
E1
50
E2
51
E3
52
E4
0.1 M HEPES pH 7.5
53
E5
54
55
56
E6
E7
E8
57
E9
0.1 M HEPES pH 7.5
58
E10
59
E11
60
E12
61
F1
62
F2
63
F3
64
F4
65
66
F5
F6
67
F7
Salt 1
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.2 M Lithium sulfate + 0.1 M
0.1 M HEPES pH 7.5
Sodium acetate
F8
69
70
71
F9
F10
F11
72
F12
73
74
75
76
77
G1
G2
G3
G4
G5
78
G6
79
G7
80
81
82
83
G8
G9
G10
G11
84
G12
85
86
87
88
H1
H2
H3
H4
89
H5
90
91
92
H6
H7
H8
93
H9
94
H10
H11
96
H12
0.1 M MES pH 6.5
68
95
Buffer
0.1 M Sodium acetate-acetate pH 5.6
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.1 M MES pH 6.5
0.1 M TRIS pH 8.5
0.05 M Potassium chloride +
22 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 4000
25 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
30 %(w/v) PEG 4000
32 %(w/v) PEG 4000
+ 0.8 M Lithium chloride
25 %(w/v) PEG 5000 MME
30 %(w/v) PEG 5000 MME
3 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
12 %(w/v) PEG 6000
15 %(w/v) PEG 6000
+ 5 %(w/v) Glycerol
15 %(w/v) PEG 6000
1.0 M Lithium chloride + 0.1
M Sodium acetate
Precipitant
8 %(w/v) PEG 4000
+ 0.8 M Lithium chloride
10 %(w/v) PEG 4000
10 %(w/v) PEG 4000
10 %(w/v) PEG 4000
10 %(w/v) PEG 4000
12 %(w/v) PEG 4000
15 %(w/v) PEG 4000
15 %(w/v) PEG 4000
16 %(w/v) PEG 4000
20 %(w/v) PEG 4000
20 %(w/v) PEG 4000
20 %(w/v) PEG 4000
20 %(w/v) PEG 4000
20 %(w/v) PEG 4000
+ 0.6 M Sodium chloride
20 %(w/v) PEG 4000
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M TRIS pH 8.5
16 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
25 %(w/v) PEG 6000
28 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
33 %(w/v) PEG 6000
2 %(w/v) PEG 8000
2 %(w/v) PEG 8000
4 %(w/v) PEG 8000
0.2 M Lithium chloride + 0.05
M Magnesium sulfate
8 %(w/v) PEG 8000
0.1 M TRIS pH 8.5
0.2 M Zinc acetate
0.1 M HEPES pH 7.5
0.05 M Magnesium acetate +
0.1 M HEPES pH 7.5
342
8 %(w/v) PEG 8000
10 %(w/v) PEG 8000
10 %(w/v) PEG 8000
10 %(w/v) PEG 8000
10 %(w/v) PEG 8000
10 %(w/v) PEG 8000 +
10 %(w/v) Ethylene Glycol
10 %(w/v) PEG 8000
+ 10 %(w/v) PEG 1000
Annexes
Composition de la « pH Clear Suite » (Qiagen)
Number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
Well
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
A12
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
D12
Buffer
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
Precipitant
5 %(w/v) PEG 6000
5 %(w/v) PEG 6000
5 %(w/v) PEG 6000
5 %(w/v) PEG 6000
5 %(w/v) PEG 6000
5 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
343
Final pH
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
Annexes
Composition de la « pH Clear Suite » (Qiagen)
Number
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
Well
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9
E10
E11
E12
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
F12
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
G9
G10
G11
G12
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
Buffer
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
Precipitant
0.8 M Ammonium
0.8 M Ammonium
0.8 M Ammonium
0.8 M Ammonium
0.8 M Ammonium
0.8 M Ammonium
1.6 M Ammonium
1.6 M Ammonium
1.6 M Ammonium
1.6 M Ammonium
1.6 M Ammonium
1.6 M Ammonium
2.4 M Ammonium
2.4 M Ammonium
2.4 M Ammonium
2.4 M Ammonium
2.4 M Ammonium
2.4 M Ammonium
3.2 M Ammonium
3.2 M Ammonium
3.2 M Ammonium
3.2 M Ammonium
3.2 M Ammonium
3.2 M Ammonium
10 %(v/v) MPD
10 %(v/v) MPD
10 %(v/v) MPD
10 %(v/v) MPD
10 %(v/v) MPD
10 %(v/v) MPD
20 %(v/v) MPD
20 %(v/v) MPD
20 %(v/v) MPD
20 %(v/v) MPD
20 %(v/v) MPD
20 %(v/v) MPD
40 %(v/v) MPD
40 %(v/v) MPD
40 %(v/v) MPD
40 %(v/v) MPD
40 %(v/v) MPD
40 %(v/v) MPD
65 %(v/v) MPD
65 %(v/v) MPD
65 %(v/v) MPD
65 %(v/v) MPD
65 %(v/v) MPD
65 %(v/v) MPD
344
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
sulfate
Final pH
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
Annexes
Composition de la « pH Clear II Suite » (Qiagen)
Number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
Well
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
A12
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
D12
Salt
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
1.0 M Lithium
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
chloride
Buffer
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
0.1 M Citric acid
0.1 M Citric acid
0.1 M MES
0.1 M HEPES
0.1 M TRIS
0.1 M BICINE
345
Precipitant
10 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
10 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
20 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
30 %(w/v) PEG 6000
Final pH
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
Annexes
Composition de la « pH Clear II Suite » (Qiagen)
Number
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
Well
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9
E10
E11
E12
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
F12
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
G9
G10
G11
G12
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
Salt
Buffer
346
Precipitant
0.8 M Na/K phosphate
Final pH
5.0
5.6
6.3
6.9
7.5
8.2
5.0
5.6
6.3
6.9
7.5
8.2
5.0
5.6
6.3
6.9
7.5
8.2
5.0
5.6
6.3
6.9
7.5
8.2
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
7.0
7.0
7.0
7.0
7.0
7.0
Annexes
Composition de la « Low ionic » (Sigma-Aldrich)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
Solution de cristallisation
TRIS hydrochloride pH 8.5; 0.05M – Polyethylene glycol 3350 12% (v/v)
Glycine Sodium salt pH 9.0; 0.05M – Polyethylene glycol 3350 4% (v/v)
Sodium citrate pH 3; 0.05M – Polyethylene glycol 3350 4% (v/v)
Sodium citrate pH 4.5; 0.05M – Polyethylene glycol 3350 4% (v/v)
MES-Na pH 6.0; 0.05M – Polyethylene glycol 3350 4% (v/v)
BIS-TRIS hydrochloride pH 6.5; 0.05M – Polyethylene glycol 3350 4% (v/v)
Imidazol hydrochloride pH 7.0; 0.05M – Polyethylene glycol 3350 4% (v/v)
HEPES-Na pH 7.5; 0.05M – Polyethylene glycol 3350 4% (v/v)
347
Annexes
Abréviations utilisées
ADN : Acide désoxyribonucléique
ARN : Acide ribonucléique
BOG : β-octyl glucopyranoside
BSA : Albumine sérique bovine
CCP4 : Collaborative Computational Project n°4
DHA : l’Acide DocosaHexaènoïque
DMSO : diméthylsulfoxyde
DNS : acide –3,5-dinitrosalycilique
dNTP : Désoxyribonucléotides
DO : Densité optique
DTT : Dithiothréitol
EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique
ESRF : European Synchrotron Radiation Facility
HEPES : 4-(2-hydroxyéthyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
ITCHY : Incremental truncation for the creation of Hybrid enzyme libraries.
LiAc : Acétate de lithium
MES : 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
MAD : Multiwavelength Anomalous Diffraction
MIR : Multiple Isomorphous Replacement
MPD : (±)-2-Méthyl-2,4-Pentanediol
2M2B : 2-méthyl-2-butanol
PCR : Réaction de polymérisation en chaîne
PDB : Protein Data Bank
pNP : Para-nitrophénol
pNPB : Para-nitrophénolbutyrate
RACHITT : Random Chimeragenesis on Transient Template
RMSD : Root Mean Square Deviation.
RPR : Random Priming in vitro Recombination
RID : Random Deletion Mutagenesis
SIR : Single Isomorphous Replacement
SHIPREC : Sequence homology independant protein recombination
TAMM : Tetrakis(acetoxymercuri)méthane
349
Annexes
TCEP : Tris (2-carboxyethyl)phosphine
Tris : Trishydroxyméthylaminométhane
350

F - Le serveur des thèses en ligne de l`INSA de Toulouse

Transcription

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