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Interactions hôte-microbiotes : choyer ses bons microbes pour garder une santé de fer ! Nicolas Derome, département de Biologie, http://www.deromelab.org AGI-CRSAD 9/06/2016 [email protected] SOMMAIRE 1) Introduction / importance du microbiote 2) Thématique principale de recherche 3) Facteurs qui contrôlent le microbiote 4) Applications en apiculture 5) Perspectives 1) Microbiote ? •LeChez l’humain, le microbiote intestinal fournit microbiote intestinal joue un rôle central pour optimiser 000 gènes fonctionnels uniques la250 santé et la performance énergétique de son hôte : (noyau: ~ 20 000 genes) 1) synthétise des molécules indispensables : Nous… - vitamines, enzymes, métabolites, antimicrobiens… 2) assure des services essentiels : - stimulation et maturation du système immunitaire, détoxication, assimilation des nutriments, actions anti-inflammatoires… (Gill et al. 2006) Notre microbiote ! • La diversité des fonctions du microbiote dépend de différents facteurs biotiques et abiotiques : Organes Stades de développement Nutrition Stades de vie Salinité Polluants Température (Benson et al. PNAS 2010 ; blazer, EMBO 2006) Antibiotiques …etc… • La microflore intestinale est perçue comme un organe additionnel … mais c’est beaucoup plus ! Théorie de l’Holobionte Margulis, 1993 Théorie de l’Holobionte • Hôte + microbiote = une unité évolutive + Genotype = Phenotype Margulis, 1993; Bordenstein & Theis 2015 • Chez l’humain, l’essentiel du microbiote est transmis verticalement lors de l’accouchement (m. cutané) et par l’allaitement (m. intestinal) : Transmission directe De la communauté bactérienne pionnière : Lactobacilli, Bifidobacterium (Cho & blaser, EMBO 2012) Le microbiote évolue t’il au cours des stades de development de l’organisme hôte ? Ontogenèse du microbiote ? Ontogenèse du microbiote humain Mère Meconium Communauté pionnière jours Succession microbienne Communauté Mature Adapted from Koenig et al. PNAS (2011) Human Intestine Microbiota ontogeny Mother (mature community) Communité Meconium (first fecal community) Pionnière Succession microbienne Vers une Days mature communauté Adapted from Koenig et al. PNAS (2011) Rela ve abundance Mucus parent Reproductive parent mucus reproducteur à S1 Gammaproteobacteria Eggs Rela ve abundance oeufs Alphaproteobacteria 2 days after hatching 16 months Betaproteobacteria [Saprospirae] Rela ve abundance alevins S1 Control parent mucus Unknown Other Fr y Betaproteobacteria 6 days [Saprospirae] Cytophagia 15 months Alphaproteobacteria Betaproteobacteria Gammaproteobacteria Gammaproteobacteria Other Alphaproteobacteria Rela ve abundance alevins S2 Unknown Cytophagia Other Rela ve abundance eau stade oeuf Bacteroidia Water 120 days Gammaproteobacteria Fusobacteriia Other Betaproteobacteria 9 days Alphaproteobacteria Sphingobacteriia Bacteroidia Gammaproteobacteria Other Rela ve abundance eau S3 Rela ve abundance feaces ALL adults ALL mes 13 days Betaproteobacteria Alphaproteobacteria Gammaproteobacteria Other 96 days Reproductive parent mucus Bacteroidia Fusobacteriia Average adult gut microbiota Gammaproteobacteria Betaproteobacteria Clostridia 16 days Other Artemia nauplii 89 days 20 days 82 days 50 days 75 days 69 days 54 days 66 days Legend Betaproteobacteria Saprospirae Cytophagia Alphaproteobacteria Gammaproteobacteria Other Sphingobacteria Bacteroidia Unknown Thaumarchaeota Erysipelotrichi Clostridia Fusobacteria Epsilonbacteria Flavobacteria 4C0dBacilli Anaerolineae TM7 Actinobacteria Sylvain et al. in prep Adult mixed diet 2) Thématique de recherche générale • Comment la composition du microbiote et ses fonctions contribuent à la biologie de l’organime hôte ? • Comment affectent-ils la valeur adaptative (fitness) et la santé de l’hôte ? 3) Trois exemples de facteurs controllant le microbiote 3-1) Stress physiologique 3-2) Transmission Verticale = Héritabilité 3-3) Transmission Horizontale = environnement, nutrition 3-1 Le stress physiologique affecte t’il la composition du microbiote ? HÔTE EN SANTÉ DYSBIOSE HOMÉOSTASIE DU MICROBIOME INTESTINAL RICHE EN NUTRIMENTS, ÉCOSYSTÈME STABLE opportunistIc = LE MICROBIOTE PRODUIT : Enzymes, Vitamines, Hormones, Molécules antimicrobiennes … = LE MICROBIOTE FAVORISE : Activation du système Immunitaire, Contrôle des agents pathogènes Conversion énergétique Kamada et al. Nat. Immunol. 2013 HÔTE EN SANTÉ STRESS AIGU = DYSBIOSE Opportunistic opportuniste strains Opportunistic strains Kamada et al. Nat. Immunol. 2013 L’hypoxie déclenche la dysbiose du microbiote cutané Probiontes - + Pathogènes Boutin et al. PLoS ONE 2013. Le Tambaqui migre des eaux neutres à acides L’eau acide déclenche une dysbiose des microbiotes cutané et intestinal T2_Water_6 T0_Mucus_8 T2_Water_2 T0_Mucus_9 T0_Mucus_1 T0_Mucus_2 T0_Mucus_16 T0_Mucus_15 T0_Mucus_14 T0_Mucus_3 T0_Mucus_10 Before Acidic exposure T2_Water_1 T2_Water_5 peau T1_Water_4 T2_Water_3 Food T2_Water_4 T0_Mucus_11 T0_Mucus_4 T0_Mucus_5 T0_Mucus_13 T0_Mucus_6 T0_Mucus_12 T0_Mucus_7 T0_Mucus_17 T1_Water_1 T1_Water_3 T1_Water_2 T0_Mucus_18 T0_Feces_2 T1_Feces_4 T1_Feces_3 T2_Feces_3 T1_Mucus_12 T1_Feces_1 Intestin T0_Feces_3 T1_Mucus_18 T1_Mucus_11 T1_Mucus_4 T2_Feces_6 T1_Feces_2 T1_Mucus_14 T1_Mucus_9 T1_Mucus_3 T2_Feces_1 T1_Mucus_5 T1_Mucus_6 T1_Mucus_10 T1_Mucus_1 T1_Feces_6 T1_Mucus_8 T1_Mucus_13 T2_Mucus_2 T0_Feces_5 T1_Feces_5 T2_Mucus_10 T1_Mucus_16 T1_Mucus_15 T2_Feces_5 T1_Mucus_2 After Acidic exposure T2_Mucus_8 T2_Mucus_6 T2_Mucus_11 T0_Feces_6 T2_Feces_4 T1_Mucus_7 T2_Mucus_18 T2_Mucus_12 T2_Mucus_17 T2_Mucus_5 T2_Feces_2 T2_Mucus_14 T2_Mucus_9 T2_Mucus_13 T2_Mucus_16 T2_Mucus_7 T2_Mucus_4 T2_Mucus_15 T0_Feces_4 T2_Mucus_1 T2_Mucus_3 Sylvain et al. accepté, Nature Report 3-2 Le microbiote est-il transmis verticalement ? • Le génotype de l’hôte compte t’il ? • Si oui, quelle est l’architecture génétique qui contrôle le recrutement des bactéries bénéfiques ? Transmission maternelle ? S. Gorshkov Le génotype de l’Hôte compte : • Des régions génétiques de l’hôte (QTLs) contrôlent l’abondance de souches bactériennes spécifiques. Methylobacterium : 30 à 99% du microbiote Cutané de l’Omble de fontaine. Synthétise des molécules antimicrobiennes. F2 progeny, 86 offspring PVE = 20 to 40% Boutin et al. PLoS One 2014 3-3 Le microbiote est-il transmis horizontalement ? • Un accès rapide à de nouvelles souches … est une opportunité … pour recruter de nouvelles FONCTIONS ! 4) Applications en apiculture – Comme la succession microbienne est … 1) Héritable = sélection génétique 2) Transmissible horizontalement = nutrition 4-1 Actions de candidats probiotiques ? Contexte : • (1) La nosémose est corrélée à une dysbiose du microbiote intestinal, • (2) Cette dysbiose implique une diminution importante de bactéries acidolactiques. Des candidats probiotiques améliorent-ils significativement la survie des abeilles en atténuant la dysbiose ? Li et al. 2012 4-1 Actions de candidats probiotiques ? • Objectif : isoler des symbiotes intestinaux de l’abeille pour tester leur propriétés bénéfiques sur la santé de l’hôte. • Modèle expérimental : groupes d’abeilles en cagettes, nourries au sirop. • Prédiction : Les candidats probiotiques améliorent significativement la survie des abeilles en cagettes. 4-1 Actions de candidats probiotiques ? Projet Agri-Innovation Quelle est l’ontogenèse du microbiote intestinal de l’abeille ? 28 jours Kwong & Moran Nat Rev 2016 4-1 Actions de candidats probiotiques ? • Protocole expérimental : Candidat Acetobacter Probiotique : Bacillus Bactocel® Levucel® Contrôle Sans Nosema 20x 20x 20x 20x 20x Avec Nosema 20x 20x 20x 20x 20x - Abeilles de 6 jours ; période de suivi : 28 jours (J1-J28) - 10 groupes, 20 cagettes / groupe ; 20 abeilles / cagette - Probiotiques ajoutés au sirop, 10+3 Cell/mL, J1 et J14 - Échantillonnages : J0, J7, J14, J24, J28 - 5 répliques / groupe / temps Rousseau, El Khoury,, Mercier, Derome, Giovenazzo, in prep 4-1 Actions de candidats probiotiques ? • Les candidats probiotiques améliorent significativement la survie des abeilles en cagettes ! 25 Prophylaxie : 2,5x Curatif : x4 ! Nosema 20 Témoin neutre survie Témoin nosémose Probiotiques 15 Témoin Bactocell 10^3 Nosema + Bacto 10^3 Probiotiques + pathogène Témoin Acetobacter 10^3 10 Nosema + Aceto 10^3 Témoin Bacillus 10^3 Contrôle Nosema + Bacillus 10^3 5 Témoin Levucell 10^3 Pathogène Nosema + Levucell 10^3 0 0 -5 5 10 15 20 25 30 Rousseau, El Khoury,, Mercier, Derome, Giovenazzo, in prep 4-2 Activité fonctionnelle du microbiote intestinal Microbiote Nosema Abeille Probiotiques ? 4-2 Activité fonctionnelle du microbiote intestinal Séquençage du métatranscriptome 1) Dissection de l’intestin (postérieur au jabot) 2) Extraction de l’ARN total 3) Synthèse d’ADN complémentaire double brin 4) Préparation de la librairie 5) Séquençage (MiSeq, 2 x 300 pb) 6) Analyses bioinformatiques et statistiques 100 000 000 de séquences à traiter ! 4-2 Activité fonctionnelle du microbiote intestinal % gènes exprimés Abeilles émergentes : 5 -7 jours 109 Nb bactéries 106 103 J0 J4 Rep #1 Rep #2 Bouslama, El Khoury, Rousseau, Mercier, Giovenazzo, Derome in prep 4-2 Activité fonctionnelle du microbiote intestinal Symbiontes majeurs déjà documentés : = fermentation des sucres = dégradation de la pectine (pollen) fermentation des sucres résistance contre parasites = fermentation des sucres = cycle de Krebs (ATP, aérobie) à partir de sucres fermentés Activité : forte modérée Bouslama, El Khoury, Rousseau, Mercier, Giovenazzo, Derome in prep 4-2 Activité fonctionnelle du microbiote intestinal Agents pathogènes opportunistes majeurs déjà documentés : Activité : forte modérée Bouslama, El Khoury, Rousseau, Mercier, Giovenazzo, Derome in prep 4-2 Activité fonctionnelle du microbiote intestinal Acetobacter J14 J14 J24 Contrôle Acetobacter + Nosema Contrôle Nosema J14 J14 J24 J14 J14 J24 J14 J14 J24 % ACTIVITÉ 4-2 Activité fonctionnelle du microbiote intestinal Bacillus J14 J14 J24 Contrôle J14 J14 J24 Bacillus + Nosema J14 J14 J24 Contrôle Nosema J14 J14 J24 % ACTIVITÉ 4-3 interactions Nosema-microbiote Bouslama, El Khoury, Rousseau, Mercier, Giovenazzo, Derome in prep 5) Perspectives Où en sommes nous ? • La composition du microbiote cutané est contrôlée par le génotype de l’hôte. • Le microbiote évolue au cours des stades de développement de l’organisme hôte. • Le microbiote s’adapte aux différentes conditions écologiques. Quelles sont les functions microbiennes impliquées ? Où en sommes nous ? • Les communautés d’agents pathogènes et de souches bénéfiques forment des réseaux d’interactions complexes. • Le développement de probiotiques sur mesure est possible, en isolant des candidats à partir du microbiote de l’organisme hôte. • Le traitement de la nosémose avec des probiotiques endogènes est très prometteur. Perspectives - Améliorer la résistance aux maladies en modulant le microbiote ( = transplants de microbiotes sains et contrôle de son ontogenèse). - Intégrer les gènes de l’abeille qui contrôlent l’abondance de souches bactériennes bénéfiques dans les programmes de sélection génétique (Projet Génome Canada). - Remplacer les antibiotiques avec des probiotiques endogènes ( = innocuité et durabilité). Étudiants: Sébastien Boutin Martin Llewellyn Jeff Gauthier Bachar Cheaib Hamza Seghouani François-Étienne Sylvain Andrée Rousseau Sarah El Khoury Justine Létouneau Sidki Bouslama Camille Lavoie Pierre-Luc Mercier Remerciements… Collaborateurs: Céline Audet Louis Bernatchez Mathieu Castex Steve Charette Mélanie Dionne Pierre Giovenazzo Serge Higgins Frédéric Levesque Steve Leadbeater Christopher Sauvage Adalberto Val Le génotype de l’Hôte compte : • Structure taxonomique et diversité du microbiote cutané est basée Exclusion Mutuelle *** génétiquement in salmonids. Agent pathogène Probionte Brook charr, F2 progeny, n = 86 PCoA analysis (NMDS) Boutin et al. PLoS One 2014
