Le chromatogramme

La chromatographie
aspects généraux
ƒ Méthode de séparation et de quantification de composés
présents dans une phase homogène liquide ou gazeuse.
ƒ Le principe est basé sur les équilibres successifs des
composés présents entre 2 phases dont l’une est dite
stationnaire, emprisonnée dans la colonne et l’autre, dite
mobile qui se déplace en entraînant les substances.
L’entraînement différentiel des composés présents dans la
colonne conduit à leur séparation.
ƒ Intérêt: couplage avec des détecteurs très sensibles.
9 le chromatogramme permet d’obtenir des informations qualitatives
(temps de rétention d’un composé) et quantitative (surface ou
hauteur du pic chromatographique).
9 domaine de mesure: 10-3 – 10-9. Ordre du nanogramme.
Processus analytique
L’analyse de composés dans des matrices complexes (sang, urine,…)
nécessite souvent une optimisation de la séparation chromatographique.
ANALYSE
Préparation
d’échantillon
Séparation
?
Sélectivité
Détection
Résultats
Types de matrices
Nombre d’échantillons à traiter
Appareillage à disposition
Type de détection (UV, Fluo, NPD, MS)
Possibilité d’automatisation
La chromatographie: historique
ƒ La chromatographie La chromatographie(du grec
chroma: couleur et graphein: écrire) a été inventée par
le botaniste Mikhail Tswett au début du XXème siècle.
ƒ Une colonne de CaCO3 permet de séparer des
pigments végétaux (chlorophylles et xanthophylles).
Par adjonction de solvant, on obtient des bandes
colorées qui se déplacent le long de la colonne à des
vitesses propres.
ƒ Le Prix Nobel de chimie est attribué en 1952 aux
biochimistes Martin et Synge pour leur contribution au
développement de la chromatographie moderne.
Principe de base
¾ Le principe qui régit pratiquement toute
purification / séparation en chimie, se base sur la
(ré)partition d’une substance A (analyte) entre
deux phases
ƒ Cristallisation: partition phase liquide – phase
cristalline
ƒ Distillation: partition phase liquide – phase gazeuse
ƒ Sublimation: partition phase solide – phase gazeuse
ƒ Extraction: partition entre deux phases liquides non
miscibles (LLE) ou phase liquide – phase solide (SPE)
ƒ Chromatographie: partition phase stationnaire –
phase mobile.
Principe de séparation
¾ Si le composé B a une grande affinité pour la phase
stationnaire et le composé A une grande affinité pour la
phase mobile, le composé A aura tendance à être élué
plus rapidement. Son temps de rétention sera plus petit
que le temps de rétention de B.
¾ Cette différence d’affinité pour les deux phases est le
principe même de la chromatographie!
¾ Il existe diverses méthodes de chromatographie utilisées
quotidiennement par les chimistes, biologistes, etc.
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
GC
HPLC
CCM
EC
Etc…
Définitions
¾ La chromatographie est une technique dans laquelle les
constituants d’un mélange se séparent en fonction des vitesses
auxquelles ils sont entraînés à travers une phase stationnaire
par une phase mobile.
¾ La phase stationnaire est une phase qui reste en place, soit
dans une colonne, soit sur une surface plane.
¾ La phase mobile est une phase qui se déplace sur ou à travers
la phase stationnaire, entraînant l’analyte avec elle.
¾ L’élution est un processus au cours duquel les analytes sont
entraînés à travers une phase stationnaire par le mouvement
d’une phase mobile.
¾ Un chromatogramme est le graphique d’une fonction de la
concentration de l’analyte en fonction du temps d’élution (ou
temps de rétention).
Propriétés physico-chimiques
Chromatographie: partition phase stationnaire – phase mobile
En fonction des propriétés PHYSICO-CHIMIQUES
des molécules et surtout, en GC …
- Volatilité / Polarité
- Solubilité
- Hydrophobe / Hydrophile
- Acide / Base
Chromatographie en phase
gazeuse
¾ La chromatographie en phase gazeuse (GC) est
basée sur le partage de l’analyte entre une phase
gazeuse mobile et une phase liquide immobilisée
sur la surface d’un support inerte.
¾ La phase (liquide) immobilisée est le plus souvent
un polymère organique modifié (siloxane
R3SiO[SiR2O]nSiR3).
¾ Le gaz porteur est un gaz inerte, typiquement
l’hélium (He).
¾ La détection à la sortie de la colonne peut être de
plusieurs types (FID, NPD, ECD, MSD, etc…).
Aspects théoriques
¾ Chaque analyte a une affinité plus ou moins prononcée pour la phase
mobile et la phase stationnaire (propriétés physico-chimiques).
¾ Le coefficient de distribution d’un analyte A est défini comme la
constante d’équilibre (KA ou DA) entre la phase mobile et la phase
stationnaire (partage du soluté entre les 2 phases).
AMobile
AStationnaire
KA = CS / CM
¾ Le facteur de sélectivité (α) d’une colonne pour deux espèces A et B
est défini comme le rapport des coefficients de distribution KA et KB:
α = KA / KB
(≥ 1)
¾ Le facteur de capacité (k’) permet de comparer, pour un soluté donné,
différentes colonnes chromatographiques:
k’ = mS / mM (m:
masse du soluté dans chaque phase).
¾ De faibles valeurs de k’ indiquent que le composé est peu retenu.
Habituellement, on travaille avec des k’ compris entre 1 et 10.
Aspects théoriques
ƒ Nombre de plateaux théoriques (N)
Ce paramètre permet de définir
l’efficacité d’une colonne. Plus ce
nombre est grand (valeurs de l’ordre
de 100’000), plus la colonne est
efficace.
ƒ Afin de pouvoir comparer les
colonnes entre elles, on définit la
hauteur équivalente de plateaux
théoriques (H ou HEPT)
HEPT = H = L / N
L = longueur de la colonne
Aspects théoriques
• La résolution (Rs)
Ce paramètre représente la séparation entre 2 pics. Elle dépend de 3
facteurs:
- sélectivité α
- facteur de capacité k’ (doit être
compris entre 1 et 10)
- efficacité de la colonne N
Rs = 2 [(tr2 – tr1) / (w1 + w2)]
tr: le temps de rétention du composé
w: largeur du pic à mimi-hauteur
Plus Rs est grand, meilleure est la séparation.
A partir de Rs = 1.5 la séparation entre 2 composés est complète.
Résolution
GC: Appareillage
Helium
GC: l’injecteur
L'injecteur est logé dans un bloc
métallique dont la température est
régulée afin d'assurer une bonne
homogénéité thermique du
système. L'échantillon va être
introduit, à travers une pastille autoobturante appelée septum, par
l'intermédiaire d'une microseringue.
L'échantillon sera vaporisé et les
solutés traverseront l'injecteur à
travers un tube en verre (parfois
métallique) appelé liner (ou insert),
grâce au gaz porteur, jusqu'à la tête
de la colonne.
L’injecteur
liner
Split: injection d’une partie de l’échantillon
dans la colonne (1:10, par exemple).
Splitless: injection de la totalité de
l’échantillon dans la colonne (1 à 10 μl).
Split
Splitless
Colonne
Colonne capillaire
Support pour la
colonne capillaire
Injecteur
Détecteur
Silice greffée
recouverte d’une
couche de polyimide
Four GC
La silice greffée
(phase stationnaire)
Nombreuses colonnes capillaires
commercialisés:
- nature de la phase greffée (polarité)
- longueur de la colonne (10m à 60m)
- diamètre de la colonne capillaire
(0.18mm à 0.53 mm)
- diamètre de la couche greffée
(0.10μm à 1.50 μm)
Choix de la colonne (greffage) en
fonction des substances que l’on veut
analyser.
Attention !
- stabilité du greffage (durée de vie
des colonnes, peut dépendre du
fabricant)
… etc
La séparation des molécules
50 °C
XXOS
SSOOXO
OXSSXSOO
SOXXXOX
T1
O XX S
OOO X SS
OOO XX SSS
OO XXXX S
300 °C
AUGMENTATION DE LA TEMPERATURE
INJECTEUR
O
OOO
OOO
OO
T2
XX
X
XX
XXXX
S
SS
SSS
S
T3
DETECTEUR
Abondance
Temps (min)
Le chromatogramme
Abondance
Caractéristique de la quantité de
substance initiallement présente dans
le volume qui a été injecté
Temps de rétention (min)
Temps que met la substance depuis
son introduction dans la colonne
(injection) jusqu’au moment où elle
arrive au détecteur
Pics chromatographiques
Pics chromatographiques
La migration dans la colonne
O
OOO
OOO
OO
XX
X
XX
XXXX
S
SS
SSS
S
DETECTEUR
La vitesse de migration des substances dans la colonne
capillaire dépend de leur volatilité et leur polarité
(interaction avec la phase stationnaire).
de là, dépend l’ordre d’arrivée au détecteur!
Volatilité et polarité
CH3
CH2CHCH3
N
O
C OCH3
O
NH2
C
O
Amphétamine
C9H13N
MW = 135
Cocaine
C17H21NO4
MW = 303
B.p. = 203 °C
B.p. = 98 °C
Molécule peu polaire
Molécule polaire
Analyse directe par GC-MS !
Il est nécessaire de dériver la molécule
pour l’analyse par GC-MS !
La détection
Détecteur les plus couramment utilisés:
- FID: Flame Ionization Detector
- TCD: Thermal Conductivity Detector
- ECD: Electron Capture Detector
- NPD: Nitrogen Phosphorous Detector (détecteur spécifique)
- MSD: Mass Spectrometer Detector (détecteur universel)
NPD
ECD
FID
FPD
PID
TCD
STABILITE du détecteur:
Reproductibilité des
injections!
MSD
La linéarité
LINEARITE du détecteur:
Zone de concentration dans laquelle le signal de détection est directement
proportionnel à la concentration en analyte (quantité injectée).
Signal / Abondance / Aire du pic
Saturation
Domaine de linéarité
LOQ
LOD
LOD: limite de détection
LOQ: limite de quantification
Quantité injectée (μl)
Concentration (μg/ml, ng/ml)
Sensibilité
Tropacocaïne
Cuscohygrine
NPD
FID
Norcocaïne
Sélectivité / Spécificité
NPD
MS
Quantité de substance détectée
OOO
OOOOOOO
OOOOOO
OOOO
2
X
XX
XXX
X
1
DETECTEUR
Abondance
L’aire sous le pic
chromatographique est
caractéristique de la concentration
de la substance dans l’échantillon
analysé
1
2
Temps rétention
La surface ou la hauteur du pic chromatographique est proportionnelle à la masse ou
à la concentration injectée. Il est ainsi possible, au moyen d’une courbe d’étalonnage,
de déterminer avec précision la quantité chromatographiée. En GC, l’injection n’étant
pas très reproductible, il est nécessaire d’utiliser un standard interne (SI). Le choix du
SI est très important car il doit se comporter comme le ou les produits à analyser et ne
doit pas interférer sur le chromatogramme.
Liner
L'intérêt du liner est de retenir les constituants non volatils de l'échantillon,
impropres par nature à la chromatographie.
Liner
Standard interne
- Composé organique ajouté à un mélange inconnu, à une concentration
connue.
- Utiliser pour déterminer la concentration d’un ou de plusieurs composés
dans un mélange inconnu.
- Le volume d’échantillon injecté n’a pas d’importance, contrairement à la
méthode de la courbe d’étalonnage.
- Trois conditions doivent être respectées pour pouvoir l’utiliser :
1) Le composé choisi doit être idéalement de structure chimique
similaire aux composés étudiés.
2) Le composé choisi comme standard interne doit être absent du
mélange inconnu, car s’il y est, sa concentration deviendra
inconnue.
3) Le pic du standard interne doit être bien séparé des autres pics
du mélange inconnu, sinon le calcul de sa surface sera inexact.
Références
La plupart des schémas et figures contenues dans cette présentation
sont tirées des ouvrages suivants:
- F. Rouessac et A. Rouessac: Analyse Chimique, Méthodes
et Techniques Instrumentales Modernes, Masson, 2ème édition, 303 p., 1994.
- G. Schwedt: Atlas de Poche des Méthodes d’Analyse, Flammarion, édition
française, 234 p., 1993.
- M.S. Klee: GC Inlets – An Introduction, Hewlett-Packard, 132 p., 1990.