Les techniques chromatographiques

Présentation des outils du
laboratoire:
l ttechniques
les
h i
chromatographiques
h
t
hi
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
HAUTE PERFORMANCE (HPLC)
&
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
GAZEUSE (GC)
Emeline Houël – 04/06/2007
RAPPELS THEORIQUES
Q
y Principe de la CHROMATOGRAPHIE:
{
Technique d’analyse
d analyse pour séparer les constituants d
d’un
un mélange en
phase liquide ou gazeuse
{
Les molécules
L
lé l à séparer
é
sontt entrainées
t i é par un fl
fluide
id (liquide
(liq id ou gaz))
= phase mobile
{
Elles interagissent (ou pas) avec un support fixe (solide ou liquide
fixé) = phase stationnaire
Séparation <-> différence d’affinité des substances à analyser à l’égard
des deux phases.
RAPPELS THEORIQUES
Q
Mais aussi:
CCM &
Chromatographie
sur colonne
GPC / GPCHT:
HPLC:
CI:
GC:
Chromatographie par perméation de gel
Chromatographie liquide haute performance
Chromatographie ionique
Chromatographie en phase gazeuse
RAPPELS THEORIQUES
Q
y Résultats
Ré lt t obtenus:
bt
Sous la forme d’un CHROMATOGRAMME
= tracé représentatif de la concentration de chaque constituant
en fonction du temps
{
{
« Un pic = une molécule »
Exemple de chromatogramme GC
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
yP
Principe:
i i
{ Exploiter les interactions entre les solutés et deux phases
Pour séparer les solutés en
fonction de leurs affinités
{
{
Et les identifier et/ou les doser
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
y Appareillage:
A
ill
{
Injection:
Injecteur =
vanne haute
h
pression
i
(manuelle ou non)
à plusieurs voies
Ù
Chaine HPLC semi-preparative:
de l’ordre de 45 000 €
http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosart/
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
{
Beaucoup moins rétentif que le
C18 (généralement nécessite
un plus grand % d’eau en mode
phase inverse))
p
Colonnes:
Analytique: 15 cm x 4.6 mm x 5 µm
(450 €)
Semi-préparative: 25 cm x 21.2 mm
x 5 µm (2500 €)
Analytique: 15 cm x 4.6
4 6 mm x 5 µm
(510 €)
Semi-préparative: 25 cm x 21.2 mm
x 5 µm (2800 €)
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
{
Détecteurs:
Ù
UV (détecteur à barrette de diodes)
Indice de réfraction ( RID)
Ù Diffusion de lumière
Ù Viscosimétrie,
Vi
i é i conductivité,
d i i é él
électrochimique,
hi i
fl
fluorescence, RMN
RMN…
Ù
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
y E
Exemples
l d’
d’applications
li ti
{ Etude d’une tisane de Quassia amara
¤ Profil suivi à 245 nm
¤ Phase stationnaire C18
Time (min)
10,00
12,00
Bertani, S., Houël, E., Stien, D., Chevolot, L., Jullian, V., Garavito, G., Bourdy, G., Deharo, E.,
Simalikalactone D is responsible for the antimalarial properties of an amazonian traditional
remedy made with Quassia amara L. (Simaroubaceae), J. Ethnopharmacol., 108 (2006), 155-157
flow (mL/min)
1,00
1,00
1,00
% water
70
50
0
% ACN
30
50
100
curve
6
11
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
{
Dosage d’un
d un composé: exemple de la Simalikalactone D
1. Courbe de calibration
Aire du pic
0
137258
13933630
38926414
69117131
Droite de régression:
Quassine
Y=
Courbe de calibration
84000000
70000000
56000000
42000000
28000000
14000000
0
Aire du pic
Concentration (mg/mL)
0
0,0061
1,22
3 05
3,05
6,1
11611021,7856
0
1
2
3
4
Concentration
(mg/ml)5
6
7
X
SkD
Bertani, S., Houël, E., Bourdy, G., Stien, D., Landau, I., Deharo, E., Quassia amara L. (Simaroubaceae) leaf tea: effect of
the growing stage and dessication status on the antimalarial activity of a traditional preparation, J.
Ethnopharmacol., (2007), 111, 40-42
Quassine
SkD
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
{
Etude d’extraits
d extraits de Vouacapoua americana (Wacapou)
80:20
90:10
95:5
98:2
99:1
¤ Profil suivi à 230 nm
¤ Phae mobile Hexane / Isopropanol
¤ Phase stationnaire PEG (mode NP)
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
{
Mise au point d
d’un
un protocole HPLC pour ll’étude
étude d
d’extraits
extraits
méthanoliques d’Eperua falcata (Wapa): influence de la
colonne
¤ Profil suivi à 245 nm
¤Mode
M d iisocratique
i
((100 % ACN)
¤ Phase stationnaire C18
¤ Profil suivi à 245 nm
¤ Phase
Ph
stationnaire
t ti
i PEG ((mode
d NP)
Time (min)
10,00
11 00
11,00
flow (mL/min)
1,00
1,00
1 00
1,00
% hexane % iProp
99
1
90
10
99
1
curve
6
11
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
Thèse Mariana Royer
{
Identification de composés: extraits d
d’Eperua
Eperua falcata (Wapa)
Catéchine = composé
majoritaire
j it i d
des extraits
t it
Chromatogramme de la
catéchine pure.
Chromatogramme de
l’extrait d’aubier de Wapa
au méthanol.
méthanol
Chromatogramme de
l’extrait de Wapa à l’acétate
d’éthyle
d
éthyle.
Chromatogramme
de l’extrait de
duramen externe de
Wapa au méthanol.
méthanol
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
y Principe:
P i i
{
Technique de séparation basée sur les interaction entre les
composés gazeux et la phase stationnaire
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
y Appareillage
A
ill
Phase mobile
= gaz vecteur (exemple Hélium)
Æ Élution
Colonne
= tube de silice qui contient la
phase stationnaire
I j t
Injecteur
Mass spectrometer
detector
Colonne et détecteur
Traitement
des données
GC/MS: de l’ordre de 70 000 €
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
y Détection:
{
Détecteurs universels
Ù
Ù
Catharomètre (ou détecteur à conductibilité thermique - DTC): tous
composés
é ((1 à 10 ng))
Détecteur à ionisation de flamme (FID): composés organiques (20 à 100 pg)
1. L
Les composés
é organiques
i
sont ionisés par la flamme
2. Les ions sont collectés
d
dans
l’él
l’électrode
t d
3. Obtention d’un courant
électrique
{
Détecteurs spécifiques: sensibilité pour certaines familles de
composés
Ù
Dé
Détecteur
à capture d’él
d’électrons: composés
é h
halogénés
l é é ((0,1 pg))
http://perso.orange.fr/sand4/CPG.htm
http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosart/
http://www.ac-nancy-metz.fr/
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
y Dét
Détection
ti
{ Détecteurs donnant des informations structurales
Ù
Ù
Infra-rouge (IR)
Spectrométrie de masse (MS)
g
g
AN024.SMS 30:450
MCounts
30:450
30
25
1A
20
15
10
5
0
10
GC/MS : Gas Chromatography/ Mass
Spectrometry
-GC
GC = séparation des molécules
volatiles
-MS = analyse des molécules
pour leur identification
20
30
Spectrum 1A
BP 161,0 (534543=100%) an024.sms
40
minutes
19.194 min. Scan: 1011 30:450 Ion: 51 us RIC: 3,471e+6 (BC)
161.0
534543
100%
105.1
413708
75%
119.1
367949
50%
204.0
193352
41.0
146721
25%
39.0
103847
43.1
66568
81.0
114898
79.2
42298
120.0
100821
95.1
33195
117.0
60693
162.0
93300
205.0
54444
0%
100
200
300
400
m/z
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
y Analyse
A l
d
de l’
l’espace d
de têt
tête (h
(headspace)
d
) par GC (HS/GC)
{
H d
Headspace
statique:
i
{
Préconcentration:
Ù Headspace dynamique (DHS) et méthode « purge & trap » (P&T)
Ù
SPME (Solid Phase Microextraction)
Pérès, C., Begnaud, F., Eveleigh, L., Berdagué, J.-L., Fast
Characterization of Foodstuff by Headspace Mass Spectrometry
(HS-MS), Trends in Analytical Chemistry, 22(11), 2003, 858-866.
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
y SPME/GC/MS (Solid Phase Micro Extraction)
Extraction des composés volatils contenus
dans une matrice solide ou liquide
Fibre q
qui p
piège
g les volatils
contenus dans l’espace de
tête (headspace)
FIBRE
SPME
GC
MS
= EXTRACTION
= SEPARATION
= IDENTIFICATION
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
y IInfluence
fl
de
d la
l quantité
tité ett d
du ttemps d’
d’extraction:
t ti
{ Analyse de volatils dans des feuilles
Scan Range: 1 - 2796 TimeRange: 0.00- 43.97 min.
Date: 05/04/2007 13:26
MCounts
AN115.SMS30:450
30:450
Scan Range: 1 - 2806 Time Range: 0.00 - 43.98 min.
Scan Range: 1 - 2841 TimeRange: 0.00- 43.98 min.
Date: 05/04/2007 17:13
an118.sms 30:450
MCounts
10.0
Date: 05/04/2007 18:13
MCounts
an119.sms 30:450
30:450
30:450
7
1.5
6
7.5
5
1.0
4
5.0
3
0.5
2
2.5
1
0.0
0
0.0
18
19
20
21
22
23
24
25
26
100 mg - 15 minutes
27
18
19
20
21
22
23
24
25
26
minutes
27
18
19
20
21
22
23
24
25
26
minutes
27
minutes
Seg1, <nodescription>, Time: 0.00-44.00, EI-Auto-Full, 30-450 m/z
100 mg - 5 minutes
15/30 mg - 5 minutes
Stage Elodie Courtois, 2007
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
y IInfluence
fl
du
d choix
h i d
de lla fib
fibre:
{ Analyse des volatils d’un même échantillon d’écorce
MCounts
an003.sms 30:450
30:450
Fibre PDMS/DVB
4
3
2
PDMS
100µm
1
0
PDMS
30µm
PDMS
7 µm
PA
PDMS/
DVB
CAR/
DVB
CAR/
PDMS
CAR/
PDMS/
DVB
Semivolatils
apolaires
Composés
apolaires
de haut
PM
Semivolatils
polaires
Volatils,
amines,
composés
aromatiques
nitrés
Alcools et
composés
polaires
Gaz et
composés
de faible
poids
moléculaire
Volatils
et semivolatils :
arômes et
odeurs
an008.sms 30:450
MCounts
30:450
Fibre PDMS
4
volatils
3
2
1
0
an013.sms 30:450
MCounts
30:450
Fibre CAR/PDMS
4
Pillonel, L., Bosset, J.O., Rapid Preconcentration and Enrichment Techniques
for the Analysis of Food Volatile. A Review, Lebensmittel Wissenschaft, 35,
2002, 1-14.
3
2
1
0
10
20
30
40
minutes
Échelles identiques
Stage Elodie Courtois, 2007
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
y Influence du choix du programme de température
{ Comparaison de la séparation des sesquiterpènes d’un échantillon
d’écorce
MCounts
20
an017.sms 30:450
30:450
30°C (1 min) Æ 5°C/min Æ
150°C (5 min) Æ 5°C/min Æ
250°C
250
C
15
10
5
0
MCounts
an022.sms 30:450
30:450
10.0
3
30°C
((1 min)) Æ 5
5°C/min
/
Æ
150°C (7 min) Æ 7,5°C/min Æ
250°C
7.5
5.0
2.5
0.0
MCounts
an029.sms 30:450
30:450
30°C Æ 10°C/min Æ 100°C
(3 min) Æ 3°C/min
Æ 150°C
5
(4
4 min) Æ
7,5°C/min à 250°C
7.5
5.0
2.5
0.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
minutes
Stage Elodie Courtois, 2007
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
yE
Exemples
l d’
d’utilisation:
tili ti
{ Obtention de signatures chimiques d’écorces de bois par
SPME/GC/MS
an0 24 .sms 3 0:4 50
MC oun ts
30
30 :45 0
25
Vouacapoua americana (Caesalpiniaceae)
20
15
10
5
0
kC oun ts
7 00
an0 37 .sms 3 0:4 50
30 :45 0
6 00
5 00
Eperua falcata (Caesalpiniaceae)
4 00
3 00
2 00
1 00
0
MC oun ts
an0 49 .sms 3 0:4 50
30 :45 0
15
Duguetia surinamensis (Annonaceae)
10
5
0
kC oun ts
an0 61 .sms 3 0:4 50
30 :45 0
7 00
6 00
5 00
I
Iryanthera
th sagotiana
ti
(M i ti
(Myristicaceae)
)
4 00
3 00
2 00
1 00
0
kC oun ts
8 00
an0 68 .sms 3 0:4 50
30 :45 0
7 00
6 00
Gustavia hexapetala (Lecythidaceae)
5 00
4 00
3 00
2 00
1 00
0
10
20
30
40
m in ute s
Stage Elodie Courtois, 2007
Présentation
é
i d
des outils
il d
du llaboratoire:
b
i
les techniques chromatographiques
MERCI DE VOTRE ATTENTION !
Chromatographie
g p
en p
phase g
gazeuse ((GC))
y Principe
P i i de
d lla spectrométrie
t
ét i d
de masse
- Source d’ions: Bombardement des
y
molécules par des électrons qui vont
les ioniser
z
Source d'ions
-Φ0
+Φ0
Electrode en calotte
+Φ0
d
x
y
-Φ0
U+V
Quadripôle
Electrode en anneau
x
Détecteur
Ions piègés
Source
d'ions
y
z
Electrode en calotte
x
- filtres d’ions:
de type quadripôle ou trappe ionique Æ
ne vont laisser passer qu’un type d’ions
z
Détecteur