+ rt-pcr in situ

Fanny Coulpier
http://www.transcriptome.ens.fr/sgdb/
Un peu d’histoire…
Ø1953 : Découverte de la structure en double hélice de l’ADN par James Dewey Watson,
(prix Nobel de physiologie ou médecine en 1962).
Ø 1956 : Découverte de l’ADN polymérase ADN dépendante (ADN pol I) par Arthur
Kornberg (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1959).
Ø 1970 : Co-découverte indépendante de l’ADN polymérase ARN dépendante par Temin
HM et Baltimore D (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1975).
Ø 1986 : Première publication publique sur la PCR par Kary Mullis (prix Nobel de chimie
en 1993).
Ø 1988 : Première PCR réalisé avec une ADN polymérase thermostable, provenant de
Thermus aquaticus, par Saiki RK.
Ø 1991 : Première détection du produit de PCR par sonde (sonde d’hydrolyse) par
Holland PM.
Ø 1992 : Invention de la PCR en temps réel par Higuchi R.
PCR:Polymerase Chain Reaction
Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités
d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie. L'ordre de grandeur à retenir est celui du
million de copies en quelques heures. C'est, généralement suffisant pour une utilisation ultérieure.
Techniques associées à la PCR
Ø PCR emboîtée ou PCR gigogne (Nested PCR)
Ø PCR en gradient de température
Ø PCR multiplexe
Ø PCR par essais (Touchdown PCR)
Ø PCR sur colonie (Colony PCR)
Ø RT-PCR (RT-PCR pour Reverse Transcriptase PCR)
Ø RT-PCR en une étape (single step RT-PCR)
Ø RT-PCR in situ (in situ RT-PCR)
Ø RT-PCR sur une cellule (single-cell RT-PCR)
Ø PCR quantitative (q-PCR pour quantitative PCR)
RT-PCR pour Reverse Transcriptase PCR
L'acronyme RT-PCR signifie Reverse Transcriptase PCR, soit une PCR après transcription inverse
d'un acide ribonucléique (ARN) en ADN complémentaire (ADNc). En réalité, il s'agit d'une PCR
"classique" réalisée sur un ADN complémentaire (ou ADNc), qui est une copie d'un ARN obtenue
par une transcription inverse.
La RT-PCR a été mise au point pour utiliser les ARN comme matrice d'amplification de la PCR.
Elle est certainement la méthode la plus sensible pour détecter (et éventuellement quantifier), les
ARN messagers au niveau d'un organe, d'un tissu ou d'une cellule. Dans ce but elle est souvent
réalisée in situ (cf. PCR in situ) c'est à dire sur du matériel biologique fixé. Elle est également
utilisée pour la construction de banques d'ADNc, le tri d'ARNm (Differencial Display RT-PCR) ainsi
que la construction de sondes d'ADN.
L'une des difficultés de cette méthode concerne la préparation des ARN qui peuvent être très
facilement dégradés et contaminés par de l'ADN génomique.
PCR en temps réel ou quantitative (PCR-Q)
ØLa PCR-Q
ØDéfinition
ØPCR-Q vs PCR classique
ØLe matériel
ØChimies de détection
ØQuantifications
ØPrincipe du Ct
ØNotion d’efficacité
ØQuantification Absolue / Relative
Ø Normalisation
ØBilan
ØAvantages / inconvénients
ØDomaine d’application
Définition
C’est une technique destinée à pouvoir quantifier la quantité d’un type d’ARN initialement
présent dans un échantillon.
La réaction en chaîne par polymérase en temps réel est une technologie ayant de nombreuses
applications, basée sur une réaction enzymologique, la PCR et sur la mesure en continue de
son produit. A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou d’amplicon est mesurée
grâce à un marqueur fluorescent.
L’obtention de la cinétique complète de la réaction de polymérisation permet d’obtenir une
quantification absolue ou relative de la quantité initiale d’ADN cible, ce qui était très difficile à
obtenir sans biais en PCR en point final.
Objectif principal de la plupart des biologistes, elle soulève de vives polémiques quant à
l’utilisation de calibrateur externe ou interne (gène de ménage).
A l’exception de complexes protocoles utilisant des calibrateurs externes homologues
compétitifs, elle ne permet qu’une quantification relative.
PCR en temps réel versus PCR en point final
Le matériel
Le matériel
Une PCR sur le light Cycler
Chimies de détection
Ø Intercalant de l’ADN Î SYBER-green
Ø Quenching Î Sonde d’hydrolyse (taqman)
Le SYBRGreen
chimie non spécifique,
liaison à l’ADN double brin
La chimie « Syber-green
Limite de la technique SYBER-green® : risque de détection des dimères
d’oligonucléotides ou d’un produit PCR non spécifique:
Î contrôle lors de la mise au point par dépôt sur gel de la présence d’une
seule bande
Î contrôle à chaque réaction de la présence d’un seul produit PCR par
évaluation du Tm du produit PCR à l’aide de la courbe de fusion (contrôle qu’il
n’y a bien qu’un seul produit, avec le bon Tm)
La chimie Taqman
Molécule fluo. Reporter
Molécule fluo. Quencher
Excitation 488nm
Excitation 510nm
Émission 520nm
Émission 560nm
La chimie Taqman
Ø Nature des fluorochromes reporters :
- FAM : bleu
- VIC : vert
- NED : noir
- PET : rouge
Ø Avantages de la Q-PCR avec sondes :
- très spécifique (car cette PCR nécessite l’utilisation de deux amorces et
d’une ou plusieurs sondes spécifiques)
- possibilité de faire des multiplexes : plusieurs PCR dans le même
tube : détection de fluorochromes différents indicateurs de PCR différentes dans le
même tubeÎ quantification relative directe, meilleure normalisation.
Ø Limites : coût des sondes (surtout si nombreux gènes à différents à quantifier)
La quantification par PCR en temps réel
Bruit de fond
Le Ct(cycle threshold) ou Cp (crossing point)
Efficacité de la PCR
L’avènement de la PCR en temps réel a mis en exergue que l’efficacité d’une réaction
de PCR (généralement notée (E) n’était pas toujours égale à 100%. )
Si E=100%, à chaque cycle on a 2n.
Par contre si E # 100% on a alors (E+1)n
Cela signifie que sur l’ensemble des cycles considérés comme quantitatif tous les
brins matrices ne servent pas forcément à donner une copie complète de l’amplicon.
Deux phénomènes en sont les principales causes :
Ø Tous les brins matrices ne sont pas forcément liés par un complexe
amorce/polymérase lors de la phase d’hybridation.
Ø Toutes les synthèses ne sont pas forcément complètes, notamment si la phase
d’élongation est trop courte.
Cette efficacité est donc théoriquement inférieure ou égal à deux mais certaines
sources considèrent qu’elle est acceptable jusqu’à 2,3!
Calcul de l’efficacité de PCR
E+1 = 1.915
Exemples
La quantification
Quantification relative vs absolue
Dans le grande majorité des cas la PCR-Q consiste à comparer au moins 2
échantillons.
Un échantillon sert de référence et la quantification des autres sera faites
relativement à cette référence.
Si le nombre de molécule de la référence est connue alors une
quantité absolue pourra être assignée à chaque échantillon et l’unité pour être
un nombre de copies ou un nombre de molécules.
Si le nombre de molécules n’est pas connu on attribuera une valeur
arbitraire à la référence (1,100%...) et il sera possible d’assigner pour les autres
échantillons des valeurs relatives à cette référence.
Quantification absolue par gamme standard externe
Quantification relative
- pas besoin de courbe de standard
- calcul des résultats par comparaisons des Ct
- nécessité de définir :
un gène servant de contrôle endogène,
un échantillon de référence
le contrôle endogène :
- donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou
ADNc),
- est présent en quantité constante dans tous les
échantillons,
- normalise :
- les biais d’extraction et de contaminations par des
inhibiteurs (ADN)
- les variations d’éfficacité de transcription inverse
Quantification relative par
la différence des Ct
N= No (1+E)Ct
N=No 2ct
Inconnu
Témoin
No inc. = N / 2Ct
Notém = N / 2Ct
R= No inc/ Notém = 2Ct / 2Ct
R= 2 -(Ct – Ct)
Ct inc
ΔCt
Ct tem
Î R= 2-ΔCt
Î Quantité Relative
Quantification relative avec calcul de l’efficacité de la
PCR
Gamme du témoin
Gamme de l’échantillon
inconnu
⇒Calcul de la pente
médiane qui peut être
différent de 2
⇒ R= E-ΔCt
Courbe de fusion
Les sources de variabilité expérimentale
La normalisation
Afin de corriger ses variations expérimentales, une
normalisation est nécessaire:
Pour l’ADN génomique:
Ø une séquence spécifique du génome
Ø une séquence de l’ADN mitochondrial
Pour l’ARNm
Ø une séquence d’un transcrit « ubiquitaire »
Choix des séquences de normalisation
Pour le génome:
Ø pas de copies multiples
Ø Absence de polymorphisme
Ø Pas de séquences similaires
Choix des séquences de normalisation
Pour les ARNm Î Contrôle ARN endogène
Ø Le gène ubiquitaire= un mythe?
Ø L’ARN ribosomale= Ct trop élevés
Ø Les classiques: β-actine, GAPDH, HPRT, UBC, s14,
β2-microglobuline, TFIID.
Ø Normalisateur par rapport à un tissu spécifique: expl:
l’α-actine squelettique ou de la γ-actine pour les cellules
sanguines
Quantification relative: Normalisation (1)
R= No inc/ Notém
R= No inc/ Notém
Gène cible
Gène réf
Résultat brut
Normalisation par un
gène de référence
Rnorm= Rgène cible / Rgène réf
Résultat Normalisé
Quantification relative: Normalisation (2)
Rnorm= Rgène cible / Rgène réf
R= 2 -(Ct – Ct )
cible
X
2 -(Ct – Ct)
Réf
R = 2 –[ ΔCt cible - ΔCt ref]
Rnorm= 2- ΔΔCt
Quantification relative: Normalisation (3)
Si Calcul de l’efficacité:
Rnorm= Rgène cible / Rgène réf
Rnorm= E -(Ct – Ct ) X E -(Ct – Ct)
cible
Réf
Rnorm=E -ΔCt cible X E- ΔCtRéf
Sensibilité des méthodes de quantification
Avantages de la PCR en temps réel sur la PCR classique
ØRapidité
ØContrôle qualité du produit (courbe de fusion)
ØIdentification facile de la phase informative, très
courte (4-5 cycles)
ØMise en évidence des variations d’éfficacité
ØRésultats plus précis et plus fiable
Bilan de la PCR en temps réel
Avantages
ØPrécision
ØSpécificité
ØReproductibilité (réactifs optimisés)
ØSensibilité Î cellules unique, une copie
ØRapidité
ØCoût accessible
ØPas de contamination
ØQuantification absolue
Bilan de la PCR en temps réel
Contraintes ou plutôt des exigences
ØMettre au point le système PCR
ØChoisir une stratégie de Normalisation
ØMaîtriser les sources de variabilité
Domaines d’application de la PCR en temps réel
Détecter / Quantifier
Ø Expression de gènes : transcrits
Ø Détermination de niveaux d’expression ARNm
Ø Knock-Down de gènes (SiRNA)
Ø Validation des expériences de puces à ADN
ØGènes:
ØDiagnostic prénatal(anomalies chromosomiques, maladies génétiques
ØDiagnostics en oncologie (charge tumorale)
ØGénomes
ØRecherche de microorganismes (bactéries pathogènes,
charge virale)
ØCriblage des résistances antibiotiques
Champs d’application
Détecter/ Identifier
ØÉvénement d’insertion
ØTransgenèse
ØOGM
ØGénotypage
ØOncologie
ØPharmacogénétique (SNP)
ØEmpreintes génétiques
ØÉtudes phylogénétiques
Mise en place d’une manip de
PCR-Quantitative dans le cadre
de la validation de résultats
obtenue par puce à ADN
Étude du transcriptome de cellules de Schwann:
Comparaison de nerfs sciatiques de souris sauvages
versus souris knock-out (krox-20 ),dépourvues de
myélines
WT
-/Ratio
0.5< 1 <2
Ratio <0.5 gène 1 = 0.35
Î Plus exprimé chez le Wt
Ratio >2 gène 2 = 2.5
Î plus exprimé chez le
mutant
Préparation des échantillons
ØUtilisation si possible des mêmes ARN ayant servis pour les hybridations
ØSinon préparation d’ARN dans les mêmes conditions
ØRT pour obtenir l’ADN complémentaire simple brin
AAA
TTT
mutant (Inconnue)
AAA
TTT
WT (Référence)
RECHERCHE DES AMORCES DE PCR
1-Les critères généraux:
ØLongueur des oligonucléotides = 16 à 26 nt
ØLongueur de l’amplicon = 100 à 200 pb (efficacité)
ØTaux de GC = 40 à 70% ; teneur en GC et AT équilibrée en 3’ et 5’
Ø Tm des oligonucléotides ~ 60°C(hybridation et élongation à 60°C)
RECHERCHE DES AMORCES DE PCR
2-Les critères de séquences:
ØRépétitions de bases (G) <4 (efficacité de couplage)
ØÉviter les structures secondaires :
-intra amorce: épingle à cheveux
-inter amorce: complémentarité des 3’
Ø Polymorphisme: oligos dégénérés (N) et doubler la concentration pour
chaque site de dégénérescence.
RECHERCHE DES AMORCES DE PCR
3-Outils bioinformatiques
Sélection des amorces et sondes avec un logiciel dédié
En ligne
Primer 3
http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi
PCR-Sélection d’amorces
http://www.dsi.univparis5.fr/bio2/welcome.html
Commerciaux
Oligo 6.0
Primer Express
Primer Designer
Vérification de la spécificité par BLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Optimisation
Ø Choix d’une paire d’amorces:
tester plusieurs paires (mesure d’efficacité)
Ø Choix de la concentration des amorces
Ø Vérification de la spécificité:
PCR sur ADNg et ADNc
courbe de fusion et agarose
9 Effet « couple d’amorces » sur l’efficacité (1)
C4
C1
20
21
22
23
24
Pour un même gène les Ct diffèrent en fonction des couples d’amorces.
Î Calcul de l’efficacité de chaque couple et choisir le meilleur.
9 Effet « couple d’amorces » sur l’efficacité (2)
L’idéal est de calculer l’E pour tous les couples d’amorces.
Choisir les couples qui ont des E du même ordre de grandeur.
9 Effet
« concentration des amorces » sur l’efficacité
Î Choisir la concentration optimum, qui permet d’avoir la meilleure
efficacité
9 Récapitulatif
Ø On a choisi les meilleurs couples d’oligos et la meilleur concentration
pour:
Gènes cibles: Gène 1 et gènes 2
Gènes de références: β-actine ou GAPDH
Ø On a nos ADNc préparés après RT sur les ARNt pour:
ADNc Témoins: sauvage
ADNc Inconnu:mutant
9 Efficacités de la PCR avec nos amorces
Gène 1
Pente
-3.192
Efficacité 1+E
105%
2.05
Équation
N=No2.05Ct
Gène 2
-3.429
96%
1.96
N=No1.96Ct
GAPDH
-3.503
93%
1.93
N=No1.935Ct
Les efficacités sont correctes et similaires
Î On peut analyser et normaliser les résultats
9 Rappel des équations
R= No mut/ Nowt
R= No mut/ Nowt
Gène 1
GAPDH
Résultat brut
Normalisation par un
gène de référence
Rnorm= Rgène 1 / RGAPDH
Résultat Normalisé
9 Calcul du ratio pour le gène 1
WT
(Témoin)
Mutant
(inc)
E+1
Gène 1
23.58
20.88
2.05
Gène 2
28.75
29.79
1.96
GAPHD
22.34
22.01
1.93
Rnorm= Rgène 1 / RGAPDH
Rnorm= E -(Ct – Ct ) / E -(Ct – Ct)
Rnorm= 2.05 -(20.88 – 23.58 ) / 1.93 -(22.01 – 22.34)
Rnorm= 2.05-(-2.7) / 1.93 -(-0.33)
Rnorm= 6.66 / 1.24 = 5.49
Î Gène 1 est 5.49x plus exprimé chez le mutant Î gène réprimé par krox-20
9 Calcul du ratio pour le gène 2
WT
(Témoin)
Mutant
(inc)
E+1
Gène 1
23.58
20.88
2.05
Gène 2
28.75
29.79
1.96
GAPHD
22.34
22.01
1.93
Rnorm= Rgène 1 / RGAPDH
Rnorm= E -(Ct – Ct ) / E -(Ct – Ct)
Rnorm= 1.96 -(29.79 – 28.75 ) / 1.93 -(22.01 – 22.34)
Rnorm= 1.96-(1.04) / 1.93 -(-0.33)
Rnorm= 0.49 / 1.24 = 0.40
Î Gène 1 est 2.5x moins exprimé chez le mutant Î gène activé par krox-20
9 Ratios puce vs Ratios PCR-Q
Ratio
puce
Gène 1
2.5
Ratio
PCR-Q
5.9
Gène 2
0.35
0.4
Refaire la PCR-Q sur 3 extractions d’ARN indépendant et
tests avec d’autres contrôles.
, La validation par PCR-Q de résultats de puce à ADN
doit être compléter par des hybridations In Situ
Analyse d’échantillons alimentaires pour la
présences d’organismes génétiquement modifiés
Détection du soja Roundup Ready(tolérantes à
l’herbicide glyphosate ) dans 3 échantillons par
méthode PCR multiplexe
9 Les amorces et sondes
ØLes sondes Taqman de lectine et de RR sont marquées respectivement avec les
fluorochrome VIC et FAM qui ont une longueur d’onde démission différentes. (Il faut un
thermocylceur capable de détecter des fluorochromes multiples avec différentes longueurs
d’émission: hermocycleur ABI PRISM 7700)
FAM
VIC
Sonde Taqman
lectine
(Réf)
Sonde Taqman
RR
(cible)
ØLes amorces F/R pour la lectine et RR sont choisies comme décrit précédement
9 Préparation de la courbe standard
Ø Il faut posséder des échantillons de soja où l’on connaissent le % exacte de
soja RR
Ø Et de l’ADN de soja non transgénique en quantité constante
1-soja RR 0.1% + ADN 50ng
2-soja RR 0.5% + ADN 50ng
3-soja RR 1.2% + ADN 50ng
3-soja RR 5% + ADN 50ng
Gamme Standard
9 Préparation du mastermix
-Mix PCR:
Mastermix (Taqman)
Amorce Le-F
Amorce Le-R
Amorce-RR-F
Pour une réaction
Amorce RR-R
Sonde Le
Sonde RR
+ ADN Î échantillons (courbes standard )
+ échantillons inconnus à tester (A B et C)
9 Établissement de la courbe standard
0.1%
soja RR
Ct le
Ct RR
Î ΔCt1
0.5%
soja RR
Ct le
Ct RR Î ΔCt2
1.2%
soja RR
Ct le
Ct RR Î ΔCt3
5%
soja RR
Ct le
Ct RR Î ΔCt4
ΔCt
Courbe :
log(%) vs ΔCt
Log %
9 Calcul du ΔCt pour chaque échantillon
Échantillon A Î ΔCt = CtRR – CtLe
Échantillon B Î ΔCt = CtRR – CtLe
Échantillon C Î ΔCt = CtRR – CtLe
9 Estimation du % de soja RR présent dans les
échantillons
Échantillon A = 0.35% de soja RR
ΔCt
Echantillon B = 1.07% de soja RR
ΔCtA
ΔCtB
Echantillon C = 3% de soja RR
ΔCtC
-3
-2
-1.5
-1
0
0.1
1
2
1.5
3
Log %