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Etude du transcriptome par hybridation sur puces à ADN Souche sauvage Souche mutante Contrôle de la quantité et de la qualité des ARN Marquage direct ou indirect des ARN Amplification des ARN et marquage Amplification des ARN m Bioanaliseur Agilent 2100 Technique de Miniaturisation d’une électrophorèse sur une puce Puce Bioanaliseur 2100 avec les électrodes permettant l’électrophorèse sur puces Principe de l’électrophorèse 1 : les échantillons migrent à travers les micros canaux depuis leur puit 2 :l’échantillon est injecté dans le canal de séparation 3 : les différents composants de l’échantillon sont séparés par électrophorèse 4 : les différents composants sont détectés par leur fluorescente et représentés en bandes (comme un gel d’électrophorèse) ou en électrophorégramme Quantification sur Bioanaliseur Agilent Intensité de fluorescence Avant 28S 18s 18S ARN de transfert Marqueur de taille ARN messagers Evaluation de la qualité de l’ARN par RIN: RNA Integrity Number Disponible sur le Bioanaliseur agilent 2100 La qualité de l’ARN est déterminée par: -Le rapport entre les 2 bandes 18s et 28s des ARN ribosomaux -Le tracé complet de l’électrophorégramme incluant la présence ou l’absence de produits de dégradations Division de électrophorégramme en 9 régions pour obtenir le calcul du RIN Obtention d’une échelle de 0 à 10: O : Dégradation total de l’ARN 10: ARN de grande qualité Échelle de 0 à 10 Validation faite pour les ARNs totaux de Mammifères à partir de 1300 échantillons Avantages: -Facilite interprétation de l’électrophorégramme -Permet une bonne comparaison des échantillons -Permet de contrôler la répétabilité des expériences et de choisir les échantillons pour les hybridations sur « puces à ADN ARNs utilisés pour le TP Souche sauvage: SEY 0.5 µg/µl rRNA Ratio [28S/18S]=1.7 Gain de fonction:Yrr1 0.4µg/µl rRNA Ratio [28S/18S]=1.7 Techniques de marquages: Marquages types d’ARN Qté d’ARN De départ Direct ARN total 10-20ug Indirect (amino-allyl) Indirect ARN total 5ug ARN amplifié 500ng (2µg aRNA) Marquage direct des ARN Totaux ARNtotal TTT Hexamères Transcriptase reverse + dUTP-CY Hydrolyse chimique par NaOH ADNc marqué Schéma du principe du marquage indirect ARN total Hexamère Oligo dT Transcriptase reverse + dUTP-Amino-Allyl Synthèse du brin d’ADNc Hydrolyse chimique Réaction de Couplage NHS- CY ADNc Marqué +Bicarbonate Principe d’amplification linéaire des ARN messagers Synthèse du 1er brin d’ADNc AAA TTT-T7 Reverse Transcriptase AAA TTT-T7 Rnase H Dégradation de l’ARN AAA TTT-T7 DNA polymérase Synthèse du 2nd brin d’ADNc AAA-T7 TTT-T7 RNA polymérase T7 Transcription in vitro + dUTP-AminoAllyl ==> Amplification des ARN AAA-T7 UUU UUU UUU TTT-T7 Dégradation de l’ADN ARN amplifiés Marquage de l’ARN amplifié par couplage avec NHS- CY ARN amplifiés marqués Dnase I UUU UUU UUU Marquage indirect d’ARN total de levure •Transcription inverse à partir de 5 µg d’ARN total • Hydrolyse des ARN •Purification des cibles (colonnes QuiaQuick de Quiagen) TP de lundi après midi •Couplage du NHS-ester Cy3/5 avec l'échantillon •Blocage et purification •Hybridation des lames •Pré-hybridiation des lames •Hybridation manuelle des puces à ADN sur la nuit TP de mardi matin •Rinçage des lames •Lecture des lames